JP2008504805A - 塩基配列タグの調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明を、実施例をあげて詳しく説明する。本明細書中で用いるすべての名前、短縮形は、当業者に良く知られている意味で用いられる。
本発明を実施するために、mRNAあるいは全RNAは当業者の良く知る標準的方法で調製することができる。例えば、さらに詳細にはSambrook J and Russel DW, ibid,らの方法がある。さらに、Carninci P et al. (Biotechniques 33 (2002) 306−309、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする)らは細胞質のmRNAフラクションを得る方法を開示している。細胞質mRNAの使用が好ましいとしても、本発明は、この方法に限定されるものではなく、他のいかなる方法によって調製されたmRNAやトータルRNAも同様に、本発明の実施に用いられる。
この実施例の目的のためには、完全長cDNAライブラリーは、Carninci P. and Hayashizaki Y., ibidらの方法(参照することにより本明細書に組み込まれるものとする)により作製された。このアプローチは、完全長cDNAのクローニングのためにCapトラッパー法を用いる。DNAフラグメントはWO 02/070720 A1(参照することにより本明細書に組み込まれるものとする)に開示されているように、pFLCファージ/ベクターシステムにクローニングされた。本発明を実施するために、ファージ溶液は7%DMSOを含むメディウムに保存され、−80℃で保管された。しかし、本発明は、前述の方法によるライブラリーの作製に限定されるものではなく、当業者が知るところの、他の完全長選択ライブラリーを作製する方法でもよい。
本発明の目的にために、RNAまたはmRNAのフラクションからcDNAを調製するには、実施例2に記載の方法に、オリゴdTプライマーを使って作製したcDNAからポリアデニル酸テールを除去するために必要な、以下のような改変を加えて行なう。オリゴdTストレッチに由来するシーケンスは、クラスIIs酵素であるGsuIを用いて、Shibata Y. et al., Biotechniques. 1042 to 1044, 1048−1049 (2001)(参照することにより本明細書に組み込まれるものとする)らの方法により除去される。
プライマーGsuI−T14(配列番号1):
5’−AGAGAGAGAGTCGGAGTTTTTTTTTTTTTTVN
5’−GAGAGAGAGACTCGAGACGGCATATCCTAGGTCCGACNNNNNN
5’−アダプターGSアダプターC GN5−up(配列番号3):
5’−GAGAGAGAGACTCGAGACGGCATATCCTAGGTCCGACGNNNNN 5’−アダプターGSアダプターC down (配列番号4):
5’− (p)GTCGGACCTAGGATATGCCGTCTCGAGTCTCTCTCTC
フェノール/クロロホルム 200μl
3’−アダプターGS 3’アダプターC up(配列番号5):
5’−(p)GTCGGACCTAGGAATTGCCGTG
3’−アダプターGS 3’アダプターC Blunt−down (配列番号6):
5’−GATCCACGGCAATTCCTAGGTCCGAC
前述のGSCタグを調製するために、cDNAフラグメントは、XmaJIの切断によってできた突出末端を用いてセルフライゲーションにより環状化される。分子間のライゲーションよりもセルフライゲーションが起こり易くするために、十分な容量の反応液(1 ng DNA/μl)を用いてこの工程を行うことが重要である。以下の反応溶液を用いる(十分な希釈を行なうために、必要であればcDNAのチューブを数本にわけてもよい)。
バッファー:1x TAEバッファー/EtBr+
実施:Mupid System, 50V, 150分
個々のGSCタグは、MmeIの切断によって出来たN2突出末端を使ってコンカテマーへ連結される。16種類の異なる突出末端がありえるが、たいていのサンプルの複雑性は異なるGSCタグのコンカテネーションを行なうのに十分である。しかし、場合によっては、コンカテネーションの工程の前に、GSCタグを平滑末端化するほうが良い時があり、この場合にはタグの長さが、短くなる。MmeI部位の平滑化の例は以下の通りである。
ゲル:0.8% SeaPlaque/1xTAE/EtBr+
バッファー:1x TAE buffer/EtBr+
実施:50V, 170分, 4°C
この実施例では、pGSCベクターを用いて本発明を実施するが、本発明は他のベクターを用いても実施することができる。GSCタグの平滑末端を利用するために、ベクターをHpaIで切断する。切断反応は以下の通り行なう。
実施例5で調製した精製コンカテマーを、実施例6で調製したベクターpGSC/HpaI/CIPに連結する。連結反応のために、下記の通りのDNA濃縮沈殿を行なう。
サンプル:5 ng/μl,2 μl
バクテリア:DH10B T1ファージ耐性 (Invitrogen),20 μl
大規模な塩基配列決定を行なう前に、GSCタグライブラリーのインサートサイズを確認することは有益である。GSCライブラリーのインサートサイズは以下の方法により確認できる。
この実施例で使われるオリゴヌクレオチドはInvitrogen社より入手し、10%ポリアクリルアミド、7M 尿素、1xTBEバッファーを使った電気泳動により精製される。
ビオチン化リンカーかPCRプライマーを使用した場合、反応性生物はストレプトアビジンとビオチンの相互作用を介して磁気ビーズに結合される。通常、Takara MAGNOTEX−SA (Takara社)を用いて、メーカーの維持に従って行なう。サンプル調製は以下の通り行なう。
タイターを確認後、バクテリアクローンを市販の釣菌器(Q−botとQ−pix,Genetics社)によって集め、384穴プレートに移す。形質転換された大腸菌クローンはDNAベクターを保持し、384穴プレートに移された後、96穴プレートで培養される。一晩培養後、プラスミドを、手で(Itoh M. et al., Nucleic Acids Res. 25 ,1997, 1315−1316)あるいは機械を用いて自動で(Itoh M. et al., Genome Res. 9 ,1999, 463−470)回収する。塩基配列決定は、RISAシーケンシングユニット(島津製作所製)あるいはパーキンエルマー−アプライドバイオシステムズ社のABI3700を用いて、Shibata K. et al., Genome Res.10 (2000)1757−1571(参照することにより本明細書に組み込まれるものとする)に記載されているような標準的な方法によって行なった。塩基配列決定は、もうひとつの方法として、クローニングベクターのフランキング部位からプライマーを使い、BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v1.1(アプライドバイオシステムズ社、カタログ番号4337449)とABI3700(アプライドバイオシステムズ社)を用いて、メーカーの指示に従って行なわれた。
M13リバースプライマー(配列番号7):
5’−CAGGAAACAGCTATGAC
M13 (−20)フォワードプライマー(配列番号8):
5’−GTAAAACGACGGCCAG
各々のシーケンスタグは、アライメントのための標準的ソフトウェアであるNCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)、アクセルリス社(http://www.accelrys.com/)のGenetic Computer Group(GSG)packageで入手できるFASTAや、類似のソフトウェアを用いて解析できる。これらのソフトウェアにより、シーケンスタグは単一のあるいは重複のないタグとして解析、アライメントされ、それらはさらにデータベース解析に用いることができる。
この実施例で得られた個別のタグは、一部あるいは全体の塩基配列が入手されたゲノム上の転写領域を同定するのに用いることができる。これらの解析は、NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)などの標準的ソフトウェアを用いてシーケンスタグをゲノム配列に並べて実行することができる。ヒトやラット、マウスのようなゲノムサイズが大きいものの場合には、コンカテマーより得られる元の塩基配列情報を拡げることが必要な場合もある。拡げられた塩基配列により、ゲノム上で活発に転写されている領域をさらに正確に同定することができる。
サンプルに含まれる同じ複数種のmRNAから得られるシーケンスタグや同じcDNAライブラリーの核酸フラグメントは、NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)のような標準ソフトウェアを用いて、重複のないシーケンスタグとして同定し解析することができる。すべての重複のないシーケンスタグを個々に数え、さらに同じサンプルから得られたすべてのタグ数に対する重複のないタグ数の割合を解析する。この個々のタグのすべてのタグ数に対する割合は、複数のmRNAやcDNAライブラリーの中の転写物の定量化を可能とする。このようにして得られたそれぞれのサンプルから得られた結果は、さらに他のサンプルから得られた結果と比べることにより、発現パターンの比較をすることができる。
ゲノム上にマッピングされた5’末端のシーケンスタグにより、制御配列を同定することが可能である。遺伝子では、通常、DNAの転写領域の5’末端上流が多くの制御因子を含んでおり、この因子が遺伝子の発現制御に使われている。これらの制御配列については、さらに、転写因子の結合領域に関する情報を含むデータベースを調査することにより機能的な解析をするこができる。公開されている転写因子の結合領域に関する情報やプロモーター解析の情報を含むデータベースには以下のようなものがある。
Transcription Regulatory Region Database (TRRD)
(http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/dbases/trrd4/)
TRANSFAC
(http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/)
TFSEARCH
(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)
Promoter Inspector (Genomatix Software (http://www.genomatix.de/)
Claims (45)
- 直鎖状の核酸分子の両端の領域に対応する塩基配列を含むDNAフラグメントを調製する方法であって、
a)核酸分子から直鎖状DNA分子を作る工程と、
b)認識部位の外側かつ直鎖状DNA分子内の部位を切断する制限エンドヌクレアーゼによる認識部位とクローニング部位とをもつリンカーを直鎖状DNA分子の両端に連結する工程と、
c)直鎖状DNA分子を、環状DNA分子を作るようにクローニング部位で閉じて環状化する工程と、
d)認識部位の外側の部位を切断する制限エンドヌクレアーゼにより環状DNA分子を切断し、直鎖状の核酸分子の両端を含むDNAフラグメントを切り出す工程と、
e)DNAフラグメントを回収する工程と
を含む方法。 - 直鎖状の核酸分子がRNAである請求項1に記載の方法。
- 直鎖状の核酸分子がmRNAである請求項2に記載の方法。
- 直鎖状の核酸分子がDNAである請求項1に記載の方法。
- 直鎖状の核酸分子がcDNAである請求項4に記載の方法。
- 直鎖状の核酸分子がゲノムDNAである請求項4に記載の方法。
- RNA分子から直鎖状DNA分子を作製する工程が、逆転写酵素とプライマーを用いてRNAから相補DNAを作製する工程を含む請求項2に記載の方法。
- ポリアデニル酸を持つRNAの逆転写反応のプライミングに用いられたオリゴdTのストレッチを除くために、プライマーがクラスIIS又はクラスIIIの認識サイトを含む請求項7に記載の方法。
- 直鎖状の核酸分子が、その3’末端にポリAテールを持たない請求項2に記載の方法。
- 直鎖状の核酸分子から直鎖状のDNA分子を作製する工程が、
a)一本鎖突出領域を含む二本鎖リンカーを調製する工程と、ここで、前記一本鎖突出領域は、RNAの3’末端塩基配列に相補的であり、
b)二本鎖リンカー突出末端とRNAの3’相補末端領域をハイブリダイズし、二本鎖リンカーにRNAの3’末端を結合する工程と、
c)逆転写酵素を用いてリンカーの遊離3’突出末端から逆転写反応を行なう工程と、
d)逆転写反応の生成物から直鎖状DNA分子を分離する工程と
を含む請求項9に記載の方法。 - RNAから作製された直鎖状のDNA分子が、RNA中のCap構造により濃縮される請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 濃縮が、Capトラッピング法、オリゴ−キャッピング法、あるいはRNAのCap構造に特異的に結合する物質を用いて行なわれる請求項11に記載の方法。
- 請求項3に記載の方法であって、直鎖状DNA分子から、ポリAテールと相補的な配列を除去する工程を含む方法。
- cDNAが完全長cDNAである請求項5に記載の方法。
- 認識部位の外側の部位を切断する制限酵素が、クラスIISまたはクラスIIG制限酵素であるGsuI、MmeI、BpmI、BsgIまたはそれらいずれかの酵素を含んだ混合物からなる群から選ばれる請求項1に記載の方法。
- 認識部位の外側の部位を切断する制限酵素が、クラスIII制限酵素であるEcoP15IまたはEcoP15Iを含む混合物である請求項1に記載の方法。
- リンカーが選択的結合をする物質に結合され、その結合を用いて濃縮することができる請求項1に記載の方法。
- 選択的結合をする物質が、ビオチン、ジゴキシゲニンからなる群から選ばれ、高親和性結合物質が、アビジン、ストレプトアビジン、アビジン若しくはストレプロアビジンの誘導体、抗ジゴキシゲニン抗体からなる群から選ばれる請求項17に記載の方法。
- 少なくともひとつのリンカーが、DNAフラグメントをラベルするために用いられる塩基配列要素を含む請求項1に記載の方法。
- ラベルが、4から12塩基の短い塩基配列からなる請求項19に記載の方法。
- ラベルが制限エンドヌクレアーゼまたはリコンビナーゼの認識部位を含む請求項19または20に記載の方法。
- 請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法であって、直鎖状のDNA分子を連結あるいは結合して環状DNA分子にする工程をさらに含む方法。
- 環状化工程が、ライゲーション反応あるいはリコンビナーゼによって行なわれる請求項1に記載の方法。
- 直鎖状DNAフラグメントが、エクソヌクレアーゼにより環状DNAから除去される請求項1に記載の方法。
- エクソヌクレアーゼが、エクソヌクレアーゼIII、エクソヌクレアーゼI、あるいはそれらの混合物である請求項24に記載の方法。
- 環状DNA分子を増幅する工程をさらに含む請求項1に記載の方法。
- 環状DNA分子の増幅が、ローリングサークル反応によって行なわれる請求項26に記載の方法。
- 増幅工程がランダムプライミングとPhi29DNAポリメラーゼを用いて行なわれる請求項26または27に記載の方法。
- 環状DNA分子が、認識部位の外側の部位を切断する一またはそれ以上の制限酵素によって切断される請求項1に記載の方法。
- 認識部位の外側の部位を切断する制限酵素が、クラスIISまたはクラスIIG制限酵素であるGsuI、MmeI、BpmI、BsgIまたはそれらいずれかの酵素を含んだ混合物からなる群から選ばれる請求項29に記載の方法。
- 認識部位の外側の部位を切断する制限酵素が、クラスIII制限酵素であるEcoP15IまたはEcoP15Iを含む混合物である請求項1に記載の方法。
- 制限酵素によって切り出され、環状化に使用されるクローニング部位と直鎖状DNA分子の両端の末端領域とを有するDNAフラグメントを、前記末端領域を持たない他のDNA分子から分離する請求項1に記載の方法。
- コンカテマーの調製方法であって、請求項1〜32のいずれか1項に記載のDNAフラグメントを互いにつなぎ合わせてコンカテマーを作製する方法。
- コンカテマーをベクターに結合する工程をさらに含む請求項33に記載の方法。
- ベクターがpGSCである請求項34に記載の方法。
- ベクターpGSC。
- 直鎖状核酸分子の末端塩基配列の情報を得るための方法であって、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法により、DNAフラグメントを調製する工程と、DNAフラグメントを互いに連結させてコンカテマーを作製する工程と、コンカテマーの塩基配列を決定して直鎖状核酸分子の末端塩基配列における情報を得る工程とを含む方法。
- DNAフラグメントが混合サンプルから調製される請求項1〜35及び37のいずれか1項に記載の方法。
- 混合サンプルにおけるDNAフラグメントの由来が、スペーサー中の短い特異的塩基配列であるラベルによって追跡可能である請求項38に記載の方法。
- 逆転写反応を進める方法であって、
a)RNAの3’末端領域の配列に相補的な一本鎖の突出領域を持った二本鎖リンカーを調製する工程と、
b)一本鎖突出領域をRNAの3’領域にハイブリダイズさせ、二本鎖リンカーをRNAの3’末端に連結させる工程と、
c)リンカーの3’ 突出末端から逆転写酵素により、RNAを鋳型として逆転写反応を行なう工程と
を含む方法。 - リンカーの突出領域がオリゴdT配列を含む請求項40に記載の方法。
- オリゴdTの突出領域の3’領域がブロックされている請求項40または41に記載の方法。
- RNAを分画するために、リンカーが選択的結合物質に結合されている請求項40〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 濃縮のために、リンカーを高親和性選択的結合物質に結合する工程をさらに含む請求項40〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項44に記載の方法であって、選択的結合物質がビオチンおよびジゴキシゲニンからなる群から選択され、高親和性選択的結合物質がアビジン、ストレプトアビジン、アビジンまたはストレプトアビジンの誘導体、及び抗ジゴキシゲニン抗体からなる群から選択される方法。
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