CN115820824A - 一种植物全基因组rna-染色质互作的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物全基因组RNA‑染色质互作的检测方法，该方法包括固定RNA与染色质的互作状态，制备双链接头，依次得到细胞核、染色质DNA片段、RNA/接头/DNA嵌合体、RNA‑DNA双链复合体；Tn5转座酶片段化切割双链复合体；PCR扩增形成DNA文库。本发明将Tn5转座酶应用于原有的RADICL‑seq方法中，成功对RNA‑DNA复合体进行剪切建库，大大简化了流程，将实验步骤至少减少了一半，实验周期从4‑5天缩短到了3天，产生的DNA文库片段大小介于250bp‑400bp之间，增加了最终有效的RNA/DNA片段对的长度，从而极大地提高了后续生物信息学分析时比对到植物基因组上的效率，为植物全基因组RNA‑染色质互作的检测提供了有效的手段。

Description

一种植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法。

背景技术

以前人们认为，RNA在基于DNA模板构建蛋白质方面主要起中介作用，只有核糖体RNA是个例外。然而，大规模基因组测序与转录组测序导致了一个重大发现——在动植物基因组中发现了大量长度大于200-nt的非编码RNA(又称lncRNAs)。多个长链非编码RNA已经被发现在X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程中发挥重要的作用。如何系统评估lncRNAs的作用，获得长链非编码RNA对染色质组成、调节以及基因表达调控的重要功能，尤其是这些非编码RNA在人类疾病和作物抗逆高产中的作用，是生命科学与现代农业基础理论研究和基础应用研究的热点问题。

现有技术中，有一些技术可用于定位某个RNA在染色质上的互作，比如ChIRP、CHART和RAP-DNA。它们利用互补序列(探针)捕获特定的RNA，然后进行高通量测序，找出某个RNA靶向的染色质，但是这些方法每次只能研究一个已知的RNA，不能研究全基因组范围上全部的RNA-染色质相互作用。为了解决检测通量的问题，到目前为止，人们发明了至少四种无偏差地检测全部染色质-RNA相互作用的技术——GRID-seq，MARGI，ChAR-seq和RADICL-seq。它们在基因组范围内的广泛应用将帮助我们了解非编码RNA在调节基因组活性上的基本作用。

以具有代表性的GRID-seq为例，GRID-seq在2017年由来自加州大学的付向东研究团队发明，方法首先设计特殊的接头，一端是单链RNA，另一端是双链DNA；用DSG和甲醛固定RNA-DNA相互作用，提取细胞核；然后用AluI进行酶切将基因组DNA切成片段；加入接头，接头的RNA与要捕获的RNA连接；反转录，扩增连接的RNA；去除游离的接头；接头DNA与要捕获的DNA连接；用链霉亲和素磁珠捕获DNA；从磁珠释放ssDNA，合成dsDNA，使用MmeI，将接头上设计好的酶切位点切开；跑胶，得到两个DNA片段，85bp的是连接了RNA和DNA的接头，65bp的是只连接了RNA或者DNA的接头，通过进一步的高通量测序与后续生信分析，能发现特异RNA-染色质相互作用。

2019年，一项被称为RADICL-seq的技术(nature communication)被开发出来，用于在动物细胞中对每个RNA进行全面的定位，同时捕获与RNA靶向的所有基因组区域，以绘制细胞核内RNA与染色质的相互作用的图谱。从技术原理上看，RADICL-seq与已有的GRID-seq相比基本的建库思路类似，但是在技术上也有所不同。

首先，在接头的设计上，与GRID-seq不同，RADICL-seq是两条单链DNA接头序列，其中长的接头序列(50-nt)预先进行5’腺苷化的处理，然后与生物素化的短的接头序列(23-nt)退火形成双链的接头；其次，RADICL-seq剪切基因组DNA使用的是DNA酶I，由于DNA酶I剪切会产生突出末端，剪切之后使用T4 DNA聚合酶和Klenow片段进行补平；再次，GRID-seq在对反转录产生的RNA-DNA嵌合体的处理上先进行单链DNA释放，以此为模版合成双链DNA，最后用限制性内切酶MmeI酶切，分别产生了20bp的RNA端和20bp的DNA端配对的片段信息，不同的是，在RADICL-seq中，由于接头中设计了EcoP15I的识别位点，对反转录产生的RNA-DNA嵌合体进行EcoP15I的酶切，分别往RNA链和DNA链端产生了27bp的配对序列(信号)，比GRID-seq的信号序列多了7bp,这种改变内切酶造成的序列信号变长极大地改善了后续分析过程中基因组比对唯一性的比率，数据显示，在动物细胞中，唯一比对率从14％(GRID-seq)提高到了45％(RADICL-seq)，大大提高了RNA-DNA配对信号的分辨率。

以上RNA-染色质互作技术都是基于动物细胞开发的。动物普遍都是二倍体，与动物相比，植物的基因组要更加庞大复杂，植物在进化历程中往往经历了多倍化(polyploidy)或全基因组加倍(whole genome duplication,WGD)事件，使基因组内的所有基因都发生重复。一方面，多倍化为生物进化提供了原始的遗传材料，被认为是进化的加速器。另一方面，多倍化也使植物基因组中频繁出现的相同或对称的DNA序列片段(重复序列，占整个植物基因组的10％～85％)更加复杂化，造成植物基因组学和功能基因组学的研究的难度。例如，RADICL-seq中短片段读长的有效序列(27bp)在多倍体植物中往往造成极低的唯一比对率，至今也没有成功的在植物中进行RADICL-seq分析的报道。多倍体植物广泛存在于自然界中，如棉花、小麦、油菜。植物，特别是多倍体植物高度重复的序列及复杂的基因组结构造成了动物体系中开发的RNA-染色质互作技术并不能有效应用于植物中的分析。

发明内容

本发明克服现有RADICL-seq技术在植物中应用的缺陷和不足，提供了一种在植物中，特别是多倍体植物中研究RNA与染色质互作的方法，促进表观遗传调控研究中新技术新手段的发展。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法，该方法包括：

(一)对植物组织进行甲醛交联处理，固定细胞核内RNA与染色质的互作状态；

(二)合成长短不同的两条单链DNA接头引物，对短接头引物进行生物素标记，对长接头引物进行5’端腺苷化处理，再将5’腺苷化的长接头引物与生物素化的短接头引物进行退火，制备生成双链接头；

(三)提取植物组织的细胞核，利用DNA酶I剪切染色质，将染色质片段化；再使用DNA聚合酶和Klenow片段对DNA酶I剪切后产生的DNA突出末端进行补平；然后，使用Klenow酶对平末端的染色质DNA片段进行3’端加腺苷酸处理，得到3’末端带腺苷酸的染色质DNA片段；最后使用RNA酶H消化，用以去除基因转录的RNA产物原位与染色质结合的背景；

(四)将步骤(二)产生的双链接头加入至步骤(三)生成的染色质DNA片段中，利用RNA连接酶使双链接头中长接头引物的5’端与RNA的3’端发生连接，再利用DNA连接酶使双链接头的另一端与片段化的染色质DNA发生连接，得到RNA/接头/DNA嵌合体；

(五)以双链接头的短接头作为反转录引物，以RNA/接头/DNA嵌合体中的RNA链为模版，利用反转录酶进行反转录，合成完整的RNA-DNA双链复合体；

(六)将链霉亲和素磁珠与RNA-DNA双链复合体进行孵育，得到与链霉亲和素磁珠连接的RNA-DNA双链复合体；

(七)利用Tn5转座酶对与链霉亲和素磁珠连接的RNA-DNA双链复合体进行片段化切割，纯化后，得到片段化的RNA/接头/DNA产物；

(八)利用PCR法对片段化的RNA/接头/DNA产物进行扩增，得到扩增产物，形成DNA文库；

(九)对DNA文库进行高通量测序和后续的生物信息学分析，得到RNA与染色质DNA互作的结果。

上文所述的“RNA/接头/DNA嵌合体”是指接头两端分别连接RNA和染色质DNA片段后所形成的序列；“RNA-DNA双链复合体”是指与接头一端连接的RNA序列反转录为cDNA序列后，接头一端与RNA/DNA二聚体连接，另一端与双链DNA连接所形成的复合序列；“片段化的RNA/接头/DNA产物”是指Tn5转座酶将接头两端序列切割后所剩下的仍然与接头/磁珠连接的那部分序列，与接头、磁珠所组成的复合产物，复合产物中既包含接头和磁珠，也包含与接头两端连接的部分DNA序列(图1)。

基因表达调控在多细胞生物的生长和发育中起关键作用。长链非编码RNA在X染色体沉默，基因组印记，染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程中发挥重要的作用，是基因表达调控重要的因素。本发明涉及一种在植物全基因组范围内研究RNA和染色质相互作用的方法(Genome-wide RNA and DNA Interaction Study(GRADIS)sequencing)，简称GRADIS-seq。本发明公开了GRADIS-seq技术的原理及其具体操作流程。GRADIS-seq技术创造性地将Tn5切割RNA/DNA复合体的特性应用于原有的动物中开发的RNA和染色质互作技术(RNA And DNA Interacting Complexes Ligated and sequenced,RADICL-seq)，从而无论是在操作流程的简洁性还是产生数据的灵敏度和分辨率上，都产生了实质性的更佳的效果。具体表现为：将实验流程和试剂至少简化了50％，并将RNA和染色质互作技术普遍的4-5天的实验周期缩短到了3天。更重要地，增加了产生的文库片段大小，从而提高了RNA-DNA对的有效长度，提高了后续比对到全基因组上的唯一比对率。该技术从二倍体动物细胞建立的RADICL-seq而来，引入了新的Tn5切割特性，从而产生了适用于复杂植物基因组的RNA和染色质互作方法。GRADIS-seq技术将为动植物全基因组范围内RNA与染色质互作的研究提供的一种广泛的应用策略。

进一步地，步骤(二)中，所述5’腺苷化的长接头引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示(即：5′-/5Phos/CTGCTGCTCCTTCCCTTTCCCCTTTTGGTCCGACGGTCCAAGTCAGCAGT-3′)，生物素化的短接头引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示(即：5′-/5Phos/CTGCTGACT/ibiodT/GGACCGTCGGACC-3′)。

接头引物退火完成后，双链接头的特征为：5’端有26-nt的突出末端并且腺苷化，3’端有一个突出的胸腺嘧啶核苷酸(T)，从而与步骤(3)中产生的3’末端带A的染色质DNA片段可以进行TA连接。

步骤(二)的具体步骤为：

(a)长链接头5'腺苷酸化：使用DNA5'腺苷酸化试剂盒对长链接头引物进行5'腺苷酸化反应；

(b)接头退火：向步骤(a)的产物中加入生物素标记的短链接头引物；

退火条件为：PCR仪器使用热盖,75℃15min,60℃10min,50℃10min,40℃10min,25℃30min；

(c)接头纯化：利用尺寸排除色谱柱对步骤(b)的产物进行纯化，得到接头溶液。

其中，长链接头引物的浓度为100μM，反应体系中加入长链接头引物的浓度为100pmol；短链接头引物的浓度为100μM，反应体系中加入短链接头引物的浓度为100pmol。

进一步地，所述尺寸排除色谱柱为BioRad columns,MICRO BIO-SPIN 6,Cat.No7326200。

进一步地，步骤(三)的具体步骤为：

(A)DNA酶I剪切染色质：将植物细胞核重悬在DNA酶I消化缓冲液中，随后加入RNA酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和DNA酶I进行消化处理；

(B)产物纯化：步骤(A)反应结束后，加入EDTA和SDS，终止DNA酶I消化，再立即离心收集细胞核；将细胞核重悬于无核酸酶水中，并加入AMPure XP磁珠，室温孵育后，使用磁力架分离磁珠，用乙醇洗涤，干燥后，得到纯化的磁珠-细胞核沉淀；

(C)染色质末端补平：将纯化的磁珠-细胞核沉淀重悬于末端补平反应缓冲液中，加入RNA酶抑制剂、T4 DNA聚合酶和Klenow片段进行孵育；

(D)染色质末端加腺苷酸：向步骤(C)得到的产物中加入SDS终止末端补平反应；再离心，重悬于末端加腺苷酸反应缓冲液中，加入RNA酶抑制剂，Klenow片段37℃下进行孵育；

(E)RNA酶H消化：向步骤(D)得到的产物中加RNA酶H，并在37℃下再孵育，用以去除基因转录的RNA产物原位与染色质结合的背景；反应结束后，通过添加SDS终止反应，最终得到磁珠-细胞核混合物；

其中，DNase I消化缓冲液的配方为：10mM pH 8Tris，15mM NaCl，10mM CaCl₂，5mMMnCl₂；所述DNA酶I为progema公司的DNase I RQ；所述末端补平反应缓冲液的配方为：50mMTris-HCl,10mM MgCl₂,1mM ATP,10mM DTT,0.25mM dNTPs,0.5％Triton,pH 7.5；所述末端加腺苷酸反应缓冲液的配方为：50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，1mM DTT，0.5mMdATP，0.5％Triton X-100，pH 7.9。

进一步地，步骤(四)的具体步骤为：

(i)纯化产物：步骤(E)获得的磁珠-细胞核混合物离心重悬在ddH₂O中；为了去除可溶性RNA，将含有聚乙二醇PEG8000的NaCl添加到混合物中，在室温下孵育；用磁性架收集磁珠，用80％乙醇洗涤一次，并重悬于ddH₂O中；

(ii)接头与RNA连接：将步骤(i)完成后的产物重新悬浮在水中，加入10×T4RNA连接酶缓冲液，步骤(2)得到的双链接头，RNA酶抑制剂和T4 RNA连接酶2截短型；在20℃下孵育过夜，使得接头5’突出末端连接到RNA分子的3′-OH；

(iii)纯化产物：步骤(ii)完成后的产物加入SDS终止反应，离心、重悬在ddH₂O中；再加入含PEG的NaCl，在室温下孵育；然后用磁性架收集珠子，用80％乙醇洗涤一次，重悬在ddH₂O中；随后将产物干燥；

(iv)接头与临近DNA连接；将步骤(iii)完成的产物重悬在含有ATP，T4 DNA连接酶的T4 DNA ligase buffer中，室温孵育；

进一步地，步骤(五)的具体步骤为：

(I)提取RNA/接头/DNA嵌合体：将步骤(iv)的产物离心，去上清，重悬于ddH2O,同时加入SDS,EDTA,NaCl，氧钒核糖核苷复合物(RVC).在65℃下过夜，进行解交联；用氯仿抽提，使用Phase Lock Gel(PLG)，上清用糖蓝掺杂共沉淀剂GlycoBlue(Invitrogen)、醋酸钠和异丙醇在-20℃沉淀，再离心；最后用ddH2O溶解沉淀，并用Nanodrop微量分光光度计进行核酸定量；

(II)RNA/接头/DNA嵌合体的反转录：对步骤(I)得到的产物使用逆转录酶进行反转录反应；逆转录反应中，逆转录酶以RNA/接头/DNA嵌合体中双链接头的短链作为反转录引物，以嵌合体中的RNA为模版进行反转录，合成完整不带突出末端的双链RNA-DNA复合体；反转录反应的条件为25℃ 5分钟，50℃ 60分钟，85℃ 2分钟。

进一步地，步骤(六)的具体步骤为：用链霉亲和素磁珠纯化RNA-DNA双链复合体：将步骤(五)所述的RNA-DNA双链复合体加入清洗后的链霉亲和素磁珠中，在室温下旋转孵育30～40分钟，将RNA-DNA双链复合体结合到链霉亲和素磁珠上，清洗除杂后，得到与链霉亲和素磁珠连接的RNA-DNA双链复合体；

所述链霉亲和素磁珠的浓度为10mg/ml，其中每毫克磁珠能结合500-3500pmol生物素化的DNA片段；所述链霉亲和素磁珠的用量为20-50μl，与RNA-DNA双链复合体的质量比约为20:1-50:1。

进一步地，所述链霉亲和素磁珠的预清洗方法为：用含有5μl 200mM RVC的500μl1×WB缓冲液洗链霉亲和素磁珠2次，再用含有5μl 200mM RVC的500μl 2×WB缓冲液洗1次，最后重悬于150μl 2×WB缓冲液中；

所述1×WB缓冲液的配方为：5mM Tris-HCl，pH 7.5，0.5mM EDTA，1M NaCl，0.02％Tween-20；所述2×WB缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，2M NaCl，0.04％Tween-20；

所述清洗除杂的方法为：用含5μl 200mM RVC的500μl 1×WB缓冲液洗涤2次，再用含5μl 200mM RVC的500μl 10mM Tris洗涤两次去除未结合上的其他杂质RNA或者DNA。

进一步地，步骤(七)的具体步骤为：

1)Tn5转座酶切割建库：将步骤(六)获得的与链霉亲和素磁珠连接的RNA-DNA双链复合体重悬在Tn5片段化缓冲液中，加入Tn5转座酶，并在37℃下切割0.5～1小时；

2)清洗片段化产物：将步骤1)的产物用含200mM RVC的1×WB缓冲液清洗，再用含200mM RVC的10mM Tris清洗，最后将磁珠重悬于水中，得到片段化的RNA/接头/DNA产物。

进一步地，所述Tn5片段化缓冲液的配方为pH 7.6 10mM Tris-Cl，5mM MgCl₂，9％PEG8000，0.85mM ATP；

所述1×WB缓冲液的配方为：5mM Tris-HCl，pH 7.5，0.5mM EDTA，1M NaCl，0.02％Tween-20；所述2×WB缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，2M NaCl，0.04％Tween-20；所述RVC的浓度为200mM；所述Tris的浓度为10mM。

进一步地，步骤(八)的具体步骤为：

(1)补平片段化产物：将步骤(七)片段化的RNA/接头/DNA产物在DNA聚合酶作用下进行补平；

(2)PCR扩增：将缺口补平后的片段化产物进行PCR扩增，得到片段化扩增产物。

进一步地，步骤(1)的反应体系为：5μl 10×扩增缓冲液，3μl 100mM MgSO₄，7μl10mM dNTP混合物，1μl Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶；反应条件为72℃下延伸15分钟；

步骤(2)的扩增反应体系为：步骤(1)的产物(50μl)，4μl引物N701，4μl引物N501，10μl 5×TAB，2μl TAE；反应程序为：72℃ 10min，98℃ 30s；98℃ 30s，60℃ 30s，72℃30s,18-20个循环，72℃ 5min；

所述引物N701的碱基序列如SEQ ID NO.3所示(即：5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAAGGCGA GTCTCGTGGGCTCGG-3′)；所述引物N501的碱基序列如SEQ ID NO.4所示(即：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCTCGTCGGCAGCGTC-3′)。

转座酶切割RNA-DNA复合体后，同时将转座酶携带的转座子接头分别连接到“RNA片段-接头-DNA片段”结构的两端，从而形成“转座子接头-RNA片段-接头-DNA片段-转座子接头”的结构。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明将Tn5转座酶能够切割RNA/DNA复合体的特性应用于原有的RADICL-seq方法中，成功对RADICL-seq方法中反转录产生的RNA-DNA复合体进行剪切建库，从而大大简化了RADICL-seq流程，将实验步骤至少减少了一半，实验周期从4-5天缩短到了3天，并且产生的DNA文库片段大小介于250bp-400bp之间，增加了最终有效的RNA/DNA片段对的长度，从而极大地提高了后续生物信息学分析时比对到植物基因组上的效率。

附图说明

图1为本发明植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法GRADIS-seq的原理图；展示关键流程和“RNA/接头/DNA嵌合体”，“RNA-DNA双链复合体”以及“片段化的RNA/接头/DNA产物”的结构特征。

图2为实施例1和对比例1提供的GRADIS-seq法与原有RADICL-seq法的流程比较图。

图3为实施例1提供的GRADIS-seq法中GRADIS建库结果的毛细管电泳图。

图4为实施例1提供的GRADIS-seq法测序结果展示RNA/DNA对的长度及分布情况。

图5为实施例1中展示棉花叶片GRADIS文库在基因组上的比对效果与将GRADIS文库人为剪切到RADICL文库RNA/DNA序列长度(27bp)大小后比对效果的统计结果图。

图6为实施例1中GRADIS建库结果测序结果举例1，显示了相应的接头序列的位置(下划线)、左右两侧RNA/DNA序列信息以及基因组比对结果；同时显示了当DNA序列人工剪切到只有RADICL-seq的27bp时，在基因组范围仍然是唯一比对，但是相应的RNA序列人工剪切到只有RADICL-seq的27bp时，RNA序列由唯一比对变成了多重比对。

图7为实施例1中GRADIS建库结果测序结果举例2，显示了相应的接头序列的位置(下划线)、左右两侧RNA/DNA序列信息以及基因组比对结果。同时显示了当序列人工剪切到只有RADICL-seq的27bp时，DNA序列和RNA序列在基因组中均出现了多重比对。

具体实施方式

以下结合说明书附图附表和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为常规的市购试剂和耗材。

本发明提供的植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法简称GRADIS-seq法(图1)。

实施例1 GRADIS-seq法实验流程的建立

陆地棉是异源四倍体植物，基因组大小为2.5G，基因组大部分(>60％)由重复序列组成，是到目前为止已测序的双子叶植物中重复序列比例最高的物种。以棉花叶片为实验材料，进行以下GRADIS-seq操作。

从流程上看，GRADIS-seq不需要重复的纯化操作，大大减少了每个步骤样品的损耗，不需要复杂的建库操作，大大简化了RNA-染色质互作研究(图1，图2)。

具体步骤如下：

第一天：

接头制备：

(1)将接头长链(5′-/5Phos/CTGCTGCTCCTTCCCTTTCCCCTTTTGGTCCGACGGTCCAAGTCAGCAGT-3′)用ddH₂O稀释成浓度100μM。取1μl(100pmol)接头，用DNA 5'腺苷酸化试剂盒(例如NEB的5′DNA Adenylation Kit，货号E2610S)，按照试剂盒说明书进行腺苷化反应。65℃反应2h,85℃2min终止反应。

(2)加入等摩尔量100pmol(1μl 100uM)生物素标记的接头短链(5′-/5Phos/CTGCTGACT/ibiodT/GGACCGTCGGACC-3′)，通过以下PCR程序退火形成双链DNA接头：热盖,75℃15min,60℃10min,50℃10min,40℃10min,25℃30min。

(3)加入10μl ddH₂O调整接头溶液体积到30μl。使用尺寸排除色谱柱(BioRadcolumns,MICRO BIO-SPIN 6,Cat.No 7326200)纯化接头；将色谱柱在121℃下高压灭菌20-30分钟以进行灭菌。混匀，取下吸头和盖子，放入2ml管中，排空柱子；1000g离心2分钟；将色谱柱放入新的1.5ml管中；加入接头溶液；1000g离心4分钟收集)；最后能得到～25μl的纯化后的接头溶液。将接头保存于-20℃待用。

细胞固定和细胞核提取：

(4)将1克植物组织在两管25ml固定缓冲液(含1％甲醛，10mM Tris pH 8.0，10mMKCl，1mM EDTA)中抽真空固定10分钟。固定后，将2.5ml 2M甘氨酸加入每个管中，在真空下再停止交联5分钟。使用无菌水洗3次。

(5)按照文献所述方法(Tao X,Feng S,Zhao T,Guan X.Efficient chromatinprofiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag.Plant Methods.2020Aug 31；16:120.doi:10.1186/s13007-020-00664-8.PMID:32884577；PMCID:PMC7460760.)分离完整的细胞核。

染色质消化、末端补平、加A及RNase H处理：

(6)用500μl DNase I消化缓冲液(10mM Tris pH 8，15mM NaCl，10mM CaCl₂，5mMMnCl₂)包含2μl RNase抑制剂和2μl蛋白酶抑制剂cocktail，重悬～50μl体积的细胞核(300×g离心)，然后加入1μl DNase I RQ(progema)，37℃消化10min。

(7)加入30μl 0.5M EDTA，25μl 10％SDS，SDS终浓度为0.5％，终止DNase I消化，然后立即以300x g离心3分钟收集细胞核。

(8)将细胞核重悬于150μl nuclease-free水中，并用两倍体积(300μl)的AMPureXP磁珠进行纯化。

(9)室温孵育5分钟后，使用磁力架分离珠子，用500μl 80％乙醇洗涤两次，干燥5分钟。

(10)将纯化的磁珠-细胞核沉淀重悬于200μl 1×T4 DNA连接酶反应缓冲液(50mMTris-HCl,10mM MgCl₂,1mM ATP,10mM DTT,pH 7.5@25℃,NEB)中，其中含有2μl RNaseOut,0.25mM dNTPs,0.5％Triton,0.075U/μl(共15U)T4 DNA聚合酶(Yesen),6μl(共30U)Klenow片段(M0210S,neb,5u/μl),然后室温(25度)孵育1小时。

(11)加入5μl 10％SDS终止末端补平反应。

(12)磁珠-细胞核混合物300×g离心3分钟；重悬于200μl 1×NEBuffer 2(50mMNaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT，pH 7.9@25℃，NEB)中，其中含有1μlRNaseOut、0.5mM dATP、0.5％Triton X-100和0.375U/μl(共75U)Klenow(exo-)(NEB，M0212S，5u/μl)，然后在37℃下孵育1h。

(13)加入0.122U/μl(总共30.5U)RNase H(Yesen)，并在37℃下再孵育40分钟。通过添加5μl 10％SDS终止反应。

接头与RNA连接:

(14)磁珠-核混合物以300g离心30秒，然后重悬在200μl H2O中。为了去除可溶性RNA，将165μl 20％聚乙二醇(PEG8000)的2.5M NaCl添加到混合物中，然后在室温下孵育5分钟。用磁性架收集珠子，用80％乙醇洗涤一次，并重悬于200μl H₂O中。该纯化步骤重复一次。

(15)第二次乙醇洗涤后，将干燥的磁珠-核混合物重新悬浮在38μl H₂O，6μl 10×T4 RNA连接酶缓冲液，10μl(20pmol)预腺苷酸化和生物素化接头，2μlRNaseOut(ThermoFisher Scientific)和4μl(共800U)T4 RNA连接酶2，truncated KQ(NEB，200,000units/ml，共2000u)。将混合物在20℃下孵育过夜，将预腺苷酸化接头连接到RNA分子的3′-OH(总共60μl)。

第二天：

(16)加入5μl 10％SDS终止反应，然后将磁珠-细胞核混合物以300×g离心3分钟，并重悬在200μl ddH₂O中。

(17)为了去除多余的未连接接头，将165μl 20％PEG的2.5M NaCl加入到混合物中，然后将反应在室温下孵育5分钟。然后用磁性架收集珠子，用80％乙醇洗涤一次，然后重重悬在200μl ddH₂O中。该纯化步骤重复一次。磁珠-细胞核混合物干燥5分钟。

接头与DNA近端连接:

(18)原位邻近连接是通过将干燥的磁珠-核混合物重悬在含有ATP，4U/μl(总共2000U，5μl)T4 DNA连接酶(New England Biolabs，400,000units/ml，共20,000U，50μl)的500μl 1×T4 DNA ligase buffer中，室温孵育4小时。

解交联：

(19)300x g离心，去上清，重悬于230μl ddH₂O,同时加30μl 10％SDS,10μl 0.5MEDTA,30μl 5M NaCl，3μl 200mM RVC.在65℃下过夜，进行解交联。

第三天：

RNA/接头/DNA嵌合体提取纯化：

(20)RNA-DNA嵌合体用300μl氯仿抽提，使用gel-lock，上清用1μl GlycoBlue(Ambion)、30μl 3M醋酸钠，pH 5.2和300μl异丙醇在-20℃沉淀1小时，然后14,000g 4℃离心10分钟。用20μl H₂O洗脱DNA，并用nanodrop进行定量。

RNA/接头/DNA嵌合体反转录：

(21)由于逆转录酶可以使用DNA序列作为聚合的引物，因此接头的双链区域的短链部分作为反转录反应的引物。将样品浓缩至终体积20μl后，将连接到接头上的RNA进行反转录。反应条件为：25℃ 5分钟，50℃ 60分钟，85℃ 2分钟。反应结束后加水130μl至体积为150μl。从而，RNA/接头/DNA嵌合体生成了完整的双链RNA-DNA复合体。

生物素-链霉亲和素纯化生物素化的双链RNA-DNA复合体(从该步骤开始，GRADIS-seq与原有的RADICL-seq流程有本质的不同)：

(22)将20μl的链霉亲和素磁珠用含有5μl 200mM RVC的500μl 1x WB缓冲液(5mMTris-HCl，pH 7.5，0.5mM EDTA，1M NaCl，0.02％Tween-20)洗2次，用含有5μl 200mM RVC的500μl 2x WB缓冲液洗1次，最后重悬于150μl 2×WB缓冲液中。

(23)将步骤(21)的产物，即150μl生物素化的双链RNA-DNA复合体加入步骤(22)清洗后的链霉亲和素磁珠中，在室温下旋转孵育30分钟(杂交炉常温旋转)，将生物素化的双链RNA-DNA复合体连接到链霉亲和素磁珠上，未结合上的RNA或DNA杂质用500μl 1×WB缓冲液(5μl 200mM RVC)洗涤2次，再用500μl 10mM Tris缓冲液(5μl 200mM RVC)洗涤两次。

Tn5片段化切割：

(24)将步骤(23)的产物，即结合着生物素化RNA-DNA复合体的链霉亲和素磁珠，用50μl Tn5片段化缓冲液(10mM Tris-Cl(pH 7.6)、5mM MgCl₂、9％PEG8000、0.85mM ATP)重悬，加0.5μl Tn5转座酶(4pmol)，并在37℃下切割1小时。得到片段化RNA-接头-DNA产物。

(25)将步骤(24)的产物，即结合着片段化RNA-接头-DNA产物的链霉亲和素磁珠，用500μl 1×WB buffer(含5μl 200mM RVC)洗2次，用500μl 10mM Tris缓冲液(含5μl200mM RVC)洗2次，最后将磁珠重悬于34μl水。

PCR建库与目的片段纯化：

(26)将34μl结合着片段化RNA-接头-DNA产物的磁珠转移到PCR管中，加入5μl 10x扩增缓冲液，3μl MgSO₄(100mM),7μl dNTP混合物(10mM)，1μl Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶。在72℃下延伸15分钟。然后，加入4μl引物N501(5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCTCGTCGGCAGCGTC-3′)，4μl引物N701(5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAAGGCGAGTCTCGTGGGCTCGG-3′),10μl 5x TAB，2μl TAE(Vazyme)，混匀，加上100μl石蜡油封层。设置PCR程序：72℃ 10分钟，98℃ 30秒；然后98℃ 30秒,60℃ 30秒,72℃30秒,18-20个循环，然后72℃ 5分钟。

(27)PCR后，通过离心去除珠子并收集上清液。

(28)凝胶电泳检测建库效果，如有有条带，加DNA纯化磁珠回收。如果条带不明显，可酌情增加1-2个cycle。

(29)文库的质量检测，上机测序。

以棉花叶片为材料进行以上GRADIS操作，文库质检结果表明，峰大小主要集中在250bp-400bp的DNA文库(图3)。得到的文库qbit检测浓度为40ng/μl,qPCR浓度为13nM,表明建库成功。

对比例1 RADICL-seq的实验流程

从流程上看，已经报道的RADICL-seq流程从实验流程看比GRADIS-seq更加繁琐，所需试剂耗材也更加复杂，整个实验流程耗时长。为了更好地与GRADIS-seq比较，对比例也总结了RADICL-seq流程(图2)。

具体步骤如下：

从接头制备到反转录，即步骤(1)到(21)，与实施例1中所述相同。

cDNA第二链合成

(22)将步骤(21)产生的双链RNA-DNA复合体，转化为双链DNA。步骤(21)产生的20μl反转录产物中加入30μl 5×第二链合成缓冲液(Thermo Fisher Scientific)，3μl 10mMdNTPs(Thermo Fisher Scientific),3μl RNase H(2U/μl,Thermo Fisher Scientific),4μl大肠杆菌DNA聚合酶I(New England Biolabs),1μl大肠杆菌连接酶(New EnglandBiolabs),加水89μl至最终体积为150μl。16℃孵育2h。

(23)加入10μl 0.5M EDTA停止反应。

目的片段纯化

(24)用核苷酸去除试剂盒(Qiagen)对样品进行纯化，在样品中加入1.6ml缓冲液PNI，最终在50μl H₂O中洗脱。

(25)使用真空浓缩仪将样品体积浓缩到8μl。

Hairpin连接只与RNA连接的接头

(26)对样品进行发夹连接(5′-/5Phos/GGCCCTCCAAAAGGAGGGCA-3′)；将只与RNA连接的接头连接，从而防止后续实验中与测序接头的连接。将100pmol的发夹接头与10μl的2×Quick ligase缓冲液(New England Biolabs)、8μl的样品和1μl的Quick ligase(NewEngland Biolabs)混合。室温下反应15分钟。

目的片段纯化

(27)然后用DNA Clean&Concentrator-5试剂盒(Zymo)按照厂家说明书进行纯化。用50μl水洗脱。

(28)使用真空浓缩仪将样品体积浓缩到30μl。

EcoP15I酶切

(29)使用Qubit dsDNA High Sensitivity Kit(Invitrogen)试剂盒检测样品浓度。

(30)根据步骤(29)测得的浓度，每1.5μg DNA加入10U EcoP15I，5μl NEBuffer3.1(New England Biolabs)，5μl 10×ATP，0.5μl 10mM sinefungin(Calbiochem),加水至最终体积为50μl。37℃酶切过夜。

目的片段纯化

(31)用核苷酸去除试剂盒(Qiagen)对样品进行纯化，在样品中加入1.3ml缓冲液PNI，最终在50μl H₂O中洗脱。

(32)使用真空浓缩仪将样品体积浓缩到20μl。

末端补平及加A

(33)步骤(32)的产物加入6.5μl 10×reaction buffer,3μl End Prep EnzymeMix from NEB Next Ultra End-Repair/dA-Tailing Module(New England Biolabs)进行补平和末端加A,加入水至最终体积65μl，20℃反应30min，然后65℃反应30min。

测序接头制备

(34)Y-型测序接头正向(5′-/5Phos/GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3′)和反向序列(5′-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3′)在1×NEBuffer 2(New EnglandBiolabs)中退火，退火条件为：热盖,75℃15min,60℃10min,50℃10min,40℃10min,25℃30min。

目的片段连测序接头

(35)采用NEB Next Ultra Ligation Module试剂盒将目的片段连测序接头，步骤(33)的产物中加入20pmol步骤(34)产生的Y-型测序接头，20℃连接15分钟。

(36)使用真空浓缩仪将样品体积浓缩到40μl。

目的片段纯化

(37)将20μl的链霉亲和素磁珠用含有5μl 200mM RVC的500μl 1x WB缓冲液(5mMTris-HCl，pH 7.5，0.5mM EDTA，1M NaCl，0.02％Tween-20)洗2次，用含有5μl 200mM RVC的500μl 2x WB缓冲液洗1次，最后重悬于40μl 2×WB缓冲液中。

(38)将40μl步骤(36)的产物加入步骤(37)清洗后的链霉亲和素磁珠中，在室温下旋转孵育30分钟(杂交炉常温旋转)，将生物素化的目的片段连接到链霉亲和素磁珠上，未结合上的RNA或DNA杂质用500μl 1×WB缓冲液(5μl 200mM RVC)洗涤2次，再用500μl 10mMTris缓冲液(5μl 200mM RVC)洗涤两次。最后磁珠重悬在30μl 10mM Tris缓冲液中。

PCR循环数检测

(39)使用Phusion High Fidelity PCR Kit(Thermo Fisher Scientific)试剂盒检测需要的PCR循环数。反应体系为：FW引物(5′-AATGATACGGCG ACCACCGAGATCT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′；Invitrogen),Index RV引物(5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATBBBBBBCTCGGCATTCCTGCTGAACCGC TCTTCCGATCT-3′；Invitrogen),其中BBBBBB是多个文库构建时候6个核苷酸的barcode序列),and 4μl步骤(38)的产物；PCR条件为：98℃ 30s,98℃ 10s,65℃ 15s,72℃ 15s，8,11或14个循环。

(40)8,11和14个循环后，各取出10μl产物，用6％polyacrylamide gel(Invitrogen)检测条带浓度和大小。电泳条件为145V，60min。RNA–DNA复合体的大小为225-bp。确定可以看到225-bp目的条带的最低的PCR循环个数为最终PCR循环个数。

PCR建库与目的片段纯化

(41)步骤(40)确定了最低的PCR循环个数后，将步骤(38)的产物进行PCR。

(42)用6％polyacrylamide gel(Invitrogen)检测条带浓度和大小。电泳条件为145V，60min。

(43)切胶回收225-bp目的条带。

(44)使用High Sensitivity DNA Bioanalyzer Kit(Agilent)试剂盒检测文库浓度，使用qPCR检测文库有效浓度

(45)上机测序。

我们以棉花叶片为材料进行以上RADICL操作，在步骤(39)PCR进行到25个循环后仍然没有看到目的条带。分析RADICL实验在棉花叶片中失败的原因，很可能是多次纯化步骤，包括步骤(24)(27)(31)，造成目的片段回收效率不高，大大降低了体系中目的片段的浓度，从而造成PCR失败；还有一个可能是过夜的酶切操作(步骤30)延长了操作时间，增加了体系中RNA或DNA降解的风险。最后，RADICL操作中大量纯化试剂盒和建库试剂盒的使用，增加了实验成本，仍然没有取得很好的效果。

实施例2 GRADIS文库高通量测序与生信息学分析

我们对实施例1所建文库进行了二代测序(Illumina PE150平台)。后续的生物信息学分析得到了分别与接头序列相连的RNA序列信息和DNA序列信息。得到了27,004个有效的序列，这些有效序列的共同特征为：序列能够找到完整的接头序列信息，接头序列两端分别具有RNA和DNA序列信息。

我们首先统计了接头序列两侧RNA/DNA序列的长度及分布情况。由于原有RADICL-seq得到的RNA/DNA序列长度为固定分别为27bp，因此我们将27bp作为总结序列长度分布的分类界限。从结果可以看出，长度大于等于27bp以上的RNA和DNA序列分别占了17,910(66％)和16,122(60％)(图4)。我们的GRADIS流程大大增加了RNA/DNA序列对的长度。

接着，为了验证增加的RNA/DNA序列的长度可以提高在植物、特别是重复序列高，基因组信息复杂的多倍体中的比对效率。我们对序列在基因组上的唯一比对率进行了分析。结果表明，总共16,122个长度在27bp以上(包括27bp)DNA序列中，有10,388个比对到了棉花基因组上(比对率64.43％)，其中7,829个是唯一比对，占总DNA序列的48.6％。

同时，为了比较GRADIS与原有的RADICL的差异，我们对GRADIS产生的RNA/DNA序列长度进行了人工的切除，只保留了接头附近27bp的序列，来模拟类似于RADICL-seq的效果。结果表明，总共16,122个27bp长度的DNA序列有11462个比对到了棉花基因组上(比对率71.09％)，其中5,562个是唯一比对，占总DNA序列的34.5％(图5)。GRADIS比人工模拟的RADICL(即剪切过的GRADIS)唯一比对率提高了14.1％。

因此，本发明的GRADIS流程可以产生比已有RADICL流程更长的序列信息，从而达到更佳的基因组比对分辨率。

为了更加直观地展示基因组比对分辨率的在GRADIS-seq与RADICL-seq的差异，图6，图7举例展示了具体序列的比对结果，展示了序列名称，序列信息(下划线的字母表示接头序列，接头序列的左右两侧分别为RNA和DNA序列)，RNA序列比对结果和DNA序列比对结果。其中，图6展示的某一从GRADIS-seq得到的序列，当DNA序列人工剪切到只有RADICL-seq的27bp时，在基因组范围仍然是唯一比对，但是相应的RNA序列人工剪切到只有RADICL-seq的27bp时，RNA序列由唯一比对变成了多重比对。这说明，剪切到只有RADICL-seq的长度时，虽然与RNA互作的DNA序列仍然是唯一的，但是RNA则出现了模糊不清的两种可能。而图7展示某一从GRADIS-seq得到的序列，当序列人工剪切到只有RADICL-seq的27bp时，DNA序列和RNA序列在基因组中均出现了多重比对。

因此，综上得出结论，GRADIS-seq得到的RNA/DNA序列长度分辨率比RADICL-seq高，这在棉花等多倍体作物的复杂基因组中造成的差异十分明显。我们的GRADIS-seq流程提供了适用于复杂植物基因组的RNA和染色质互作方法，将为动植物全基因组范围内RNA与染色质互作的研究提供的一种广泛的应用策略。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgctgctcc ttccctttcc ccttttggtc cgacggtcca agtcagcagt 50

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgctgactt ggaccgtcgg acc 23

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagcagaag acggcatacg agattaaggc gagtctcgtg ggctcgg 47

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agatcgctcg tcggcagcgt c 51

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggccctccaa aaggagggca 20

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatcggaaga gcgtcgtgta gggaaagagt gt 32

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tct 33

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 9

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caagcagaag acggcatacg agatbbbbbb ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga 60

tct 63

Claims (9)

1.一种植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法，其特征在于，包括：

(一)对植物组织进行甲醛交联处理，固定细胞核内RNA与染色质的互作状态；

(二)合成长短不同的两条单链DNA接头引物，对短接头引物进行生物素标记，对长接头引物进行5’端腺苷化处理，再将5’腺苷化的长接头引物与生物素化的短接头引物进行退火，制备生成双链接头；

(三)提取植物组织的细胞核，利用DNA酶I剪切染色质，将染色质片段化；再使用DNA聚合酶和Klenow片段对DNA酶I剪切后产生的DNA突出末端进行补平；然后，使用Klenow酶对平末端的染色质DNA片段进行3’端加腺苷酸处理，得到3’末端带腺苷酸的染色质DNA片段；最后使用RNA酶H消化，用以去除基因转录的RNA产物原位与染色质结合的背景；

(四)将步骤(二)产生的双链接头加入至步骤(三)生成的染色质DNA片段中，利用RNA连接酶使双链接头中长接头引物的5’端与RNA的3’端发生连接，再利用DNA连接酶使双链接头的另一端与片段化的染色质DNA发生连接，得到RNA/接头/DNA嵌合体；

(五)以双链接头的短接头作为反转录引物，以RNA/接头/DNA嵌合体中的RNA链为模版，利用反转录酶进行反转录，合成完整的RNA-DNA双链复合体；

(六)将链霉亲和素磁珠与RNA-DNA双链复合体进行孵育，得到与链霉亲和素磁珠连接的RNA-DNA双链复合体；

(七)利用Tn5转座酶对与链霉亲和素磁珠连接的RNA-DNA双链复合体进行片段化切割，纯化后，得到片段化的RNA/接头/DNA产物；

(八)利用PCR法对片段化的RNA/接头/DNA产物进行扩增，得到扩增产物，形成DNA文库；

(九)对DNA文库进行高通量测序和后续的生物信息学分析，得到RNA与染色质DNA互作的结果。

2.如权利要求1所述的植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法，其特征在于，步骤(二)中，所述5’腺苷化的长接头引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，生物素化的短接头引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；

步骤(二)的具体步骤为：

(a)长链接头5'腺苷酸化：使用DNA 5'腺苷酸化试剂盒对长链接头引物进行5'腺苷酸化反应；

(b)接头退火：向步骤(a)的产物中加入生物素标记的短链接头引物；

退火条件为：PCR仪器使用热盖,75℃15min,60℃10min,50℃10min,40℃10min,25℃30min；

(c)接头纯化：利用尺寸排除色谱柱对步骤(b)的产物进行纯化，得到接头溶液。

3.如权利要求1所述的植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法，其特征在于，步骤(三)的具体步骤为：

(A)DNA酶I剪切染色质：将植物细胞核重悬在DNA酶I消化缓冲液中，随后加入RNA酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和DNA酶I进行消化处理；

(B)产物纯化：步骤(A)反应结束后，加入EDTA和SDS，终止DNA酶I消化，再立即离心收集细胞核；将细胞核重悬于无核酸酶水中，并加入AMPure XP磁珠，室温孵育后，使用磁力架分离磁珠，用乙醇洗涤，干燥后，得到纯化的磁珠-细胞核沉淀；

(C)染色质末端补平：将纯化的磁珠-细胞核沉淀重悬于末端补平反应缓冲液中，加入RNA酶抑制剂、T4 DNA聚合酶和Klenow片段进行孵育；

(D)染色质末端加腺苷酸：向步骤(C)得到的产物中加入SDS终止末端补平反应；再离心，重悬于末端加腺苷酸反应缓冲液中，加入RNA酶抑制剂，Klenow片段37℃下进行孵育；

(E)RNA酶H消化：向步骤(D)得到的产物中加入RNA酶H，并在37℃下再孵育，用以去除基因转录的RNA产物原位与染色质结合的背景；反应结束后，通过添加SDS终止反应，最终得到磁珠-细胞核混合物；

步骤(四)的具体步骤为：

(i)纯化产物：步骤(E)获得的磁珠-细胞核混合物离心重悬在ddH₂O中；为了去除可溶性RNA，将含有聚乙二醇PEG8000的NaCl添加到混合物中，在室温下孵育；用磁性架收集磁珠，用80％乙醇洗涤一次，并重悬于ddH₂O中；

(ii)接头与RNA连接：将步骤(i)完成后的产物重新悬浮在水中，加入10×T4 RNA连接酶缓冲液，步骤(二)得到的双链接头，RNA酶抑制剂和T4 RNA连接酶2截短型；在20℃下孵育过夜，使得接头5’突出末端连接到RNA 分子的3′-OH；

(iii)纯化产物：步骤(ii)完成后的产物加入SDS终止反应，离心、重悬在ddH₂O中；再加入含PEG的NaCl溶液，在室温下孵育；然后用磁性架收集珠子，用80％乙醇洗涤一次，重悬在ddH₂O中；随后将产物干燥；

(iv)接头与临近DNA连接；将步骤(iii)完成的产物重悬在含有ATP，T4 DNA连接酶的T4DNA连接酶缓冲液中，室温孵育；

步骤(五)的具体步骤为：

(I)提取RNA/接头/DNA嵌合体：将步骤(iv)的产物离心，去上清，重悬于ddH₂O,同时加入SDS,EDTA,NaCl，氧钒核糖核苷复合物在65℃下过夜，进行解交联；用氯仿抽提，使用PhaseLock Gel(PLG)，上清用糖蓝掺杂共沉淀剂GlycoBlue、醋酸钠和异丙醇在-20℃沉淀，再离心；最后用ddH₂O溶解沉淀，并用Nanodrop微量分光光度计进行核酸定量；

(II)RNA/接头/DNA嵌合体的反转录：对步骤(I)得到的产物使用逆转录酶进行反转录反应；逆转录反应中，逆转录酶以RNA/接头/DNA嵌合体中双链接头的短链作为反转录引物，以嵌合体中的RNA为模版进行反转录，合成完整不带突出末端的双链RNA-DNA复合体；反转录反应的条件为25℃5分钟，50℃60分钟，85℃2分钟。

4.如权利要求1所述的植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法，其特征在于，步骤(六)的具体步骤为：用链霉亲和素磁珠纯化RNA-DNA双链复合体，将步骤(五)所述的RNA-DNA双链复合体加入预清洗后的链霉亲和素磁珠中，在室温下旋转孵育30～40分钟，将RNA-DNA双链复合体结合到链霉亲和素磁珠上，清洗除杂后，得到与链霉亲和素磁珠连接的RNA-DNA双链复合体；

所述链霉亲和素磁珠的浓度为10mg/ml，其中每毫克磁珠能结合500-3500pmol生物素化的DNA片段；所述链霉亲和素磁珠的用量为20-50μl，与RNA-DNA双链复合体的质量比约为20:1-50:1。

5.如权利要求4所述的植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法，其特征在于，

所述链霉亲和素磁珠的预清洗方法为：用含有氧钒核糖核苷复合物的1×WB缓冲液洗链霉亲和素磁珠2次，再用含有氧钒核糖核苷复合物的2×WB缓冲液洗1次，最后重悬于2×WB缓冲液中；

所述清洗除杂的方法为：用含有氧钒核糖核苷复合物的1×WB缓冲液洗涤2次，再用含RVC的Tris缓冲液洗涤两次去除未结合上的其他杂质RNA或者DNA。

所述1×WB缓冲液的配方为：5mM Tris-HCl，pH 7.5，0.5mM EDTA，1M NaCl，0.02％Tween-20；所述2×WB缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，2M NaCl，0.04％Tween-20。

6.如权利要求1所述的植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法，其特征在于，步骤(七)的具体步骤为：

1)Tn5转座酶切割建库：将步骤(六)获得的与链霉亲和素磁珠连接的RNA-DNA双链复合体重悬在Tn5片段化缓冲液中，加入Tn5转座酶，并在37℃下切割0.5-1h；

2)清洗片段化产物：将步骤1)的产物用含氧钒核糖核苷复合物的1×WB缓冲液清洗，再用含氧钒核糖核苷复合物的Tris缓冲液清洗，最后将磁珠重悬于水中，得到片段化的RNA/接头/DNA产物；

所述1×WB缓冲液的配方为：5mM Tris-HCl，pH 7.5，0.5mM EDTA，1M NaCl，0.02％Tween-20。

7.如权利要求6所述的植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法，其特征在于，所述Tn5片段化缓冲液的配方为pH 7.6 10mM Tris-Cl，5mM MgCl₂，9％PEG8000，0.85mM ATP。

8.如权利要求1所述的植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法，其特征在于，步骤(八)的具体步骤为：

(1)补平片段化产物：将步骤(七)片段化的RNA/接头/DNA产物在DNA聚合酶作用下进行补平；

(2)PCR扩增：将缺口补平后的片段化产物进行PCR扩增，得到片段化扩增产物。

9.如权利要求8所述的植物全基因组RNA-染色质互作的检测方法，其特征在于，步骤(1)的反应体系为：5μl 10×扩增缓冲液，3μl 100mM MgSO₄，7μl 10mM dNTP混合物，1μlBst 2.0 WarmStart DNA聚合酶；反应条件为72℃下延伸15分钟；

步骤(2)的扩增反应体系为：步骤(1)的产物(50μl)，4μl引物N701，4μl引物N501，10μl5×TAB，2μl TAE；反应程序为：72℃10min，98℃30s；98℃30s，60℃30s，72℃30s,18-20个循环，72℃5min；

所述引物N701的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；所述引物N501的碱基序列如SEQ IDNO.4所示。

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