JP2008502604A

JP2008502604A - Methods for modulating cellular activity, including sphingosine kinase, substances for modulating, and sphingosine kinase variants

Info

Publication number: JP2008502604A
Application number: JP2007515736A
Authority: JP
Inventors: スチュアートエム．ピットソン; マシューアレクサンダーバダス; プーシャ; ポールエー．モレッティ; タマラルクレルク; キャサリンサザーランド
Original assignee: メドベットサイエンスピーティーワイ．リミティッド
Priority date: 2004-06-15
Filing date: 2005-06-15
Publication date: 2008-01-31
Also published as: WO2005123115A1; EP1765384A1; CA2569687A1; MXPA06014888A; WO2005123115A8; EP1765384A4

Abstract

本発明は一般的に、細胞活性を調整する方法およびそこで用いられる物質に関する。より詳しく述べると、本発明は、細胞膜に対するスフィンゴシンキナーゼの細胞内転位を調整することによって、細胞活性を調整する方法を提供する。関連する局面において、本発明は、その細胞内転位の調整を通してスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を調整する方法、およびそこで用いられる物質を提供する。本発明はなお、転位を受ける能力の消失または低減を示すスフィンゴシンキナーゼ変種、ならびにその機能的誘導体、相同体、および類似体にさらに拡大されるであろう。本発明の方法および分子は、とりわけ、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞機能的活性、および／または異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当なスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を特徴とする病態の処置および／または予防において有用である。本発明はさらに、スフィンゴシンキナーゼ細胞内転位を調整することができる物質を同定および／または設計するための方法を対象とする。The present invention relates generally to methods of modulating cellular activity and materials used therein. More specifically, the present invention provides a method of modulating cellular activity by modulating intracellular translocation of sphingosine kinase to the cell membrane. In a related aspect, the present invention provides methods for modulating sphingosine kinase-mediated signal transduction through modulation of its intracellular translocation and substances used therein. The present invention will still be further extended to sphingosine kinase variants that exhibit a loss or reduction in the ability to undergo transposition, and functional derivatives, homologues, and analogs thereof. The methods and molecules of the present invention provide, inter alia, abnormal, undesirable or otherwise inappropriate cellular functional activity, and / or abnormal, undesirable or otherwise inappropriate sphingosine kinase-mediated signal. It is useful in the treatment and / or prevention of pathological conditions characterized by transmission. The present invention is further directed to methods for identifying and / or designing agents capable of modulating sphingosine kinase intracellular translocation.

Description

発明の分野
本発明は一般的に、細胞活性を調整する方法およびそのために用いられる物質に関する。より詳しく述べると、本発明は、細胞膜に対するスフィンゴシンキナーゼの細胞内転位を調整することによって、細胞活性を調整する方法を提供する。関連する局面において、本発明は、その細胞内転位の調整を通してスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を調整する方法、およびそのために用いられる物質を提供する。本発明はなおさらに、転位を受ける能力の消失または低減を示すスフィンゴシンキナーゼ変種、ならびにその機能的誘導体、相同体、および類似体に及ぶ。本発明の方法および分子は、中でも異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞機能的活性、および／または異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当なスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を特徴とする病態の処置および／または予防において有用である。本発明はさらに、スフィンゴシンキナーゼの細胞内転位を調整することができる物質を同定および／または設計するための方法を対象とする。 The present invention relates generally to methods for modulating cellular activity and materials used therefor. More specifically, the present invention provides a method of modulating cellular activity by modulating intracellular translocation of sphingosine kinase to the cell membrane. In a related aspect, the present invention provides methods for modulating sphingosine kinase-mediated signaling through modulation of its intracellular translocation, and substances used therefor. The present invention still further extends to sphingosine kinase variants that exhibit a loss or reduction in the ability to undergo transposition, and functional derivatives, homologues, and analogs thereof. The methods and molecules of the present invention provide, among other things, abnormal, undesirable or otherwise inappropriate cellular functional activity, and / or abnormal, undesirable or otherwise inappropriate sphingosine kinase-mediated signaling. It is useful in the treatment and / or prevention of pathological conditions characterized by The present invention is further directed to methods for identifying and / or designing agents that can modulate the intracellular translocation of sphingosine kinase.

発明の背景
本明細書において著者らによって言及された刊行物の引用文献の詳細は、説明の末尾にアルファベット順に集めている。 BACKGROUND OF THE INVENTION Details of the citations of the publications referred to by author in this specification are collected alphabetically at the end of the description.

本明細書における任意の先行技術に対する言及は、先行技術がオーストラリアにおける共通の一般的知識の一部を形成するという認知、またはいかなる形態の示唆でもなく、かつ、そのように解釈すべきではない。 References to any prior art herein are not, and should not be construed, of the perception that the prior art forms part of common general knowledge in Australia or any form of suggestion.

スフィンゴシンキナーゼは、細胞生長、生存、分化、運動、および細胞骨格構築を含む、多様な範囲の細胞プロセスを調節する生物活性脂質であるスフィンゴシン-1-ホスフェート（S1P）の形成を触媒する（Pyne et al., 2000, Biochem. J. 349:385〜402；Spiegel et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:25851〜25854）。これらの細胞プロセスのいくつかは、S1P-特異的Gタンパク質共役受容体5個によって媒介される（Kluk et al., 2002, Biochim. Biophys. Acta. 1582:72〜80；Spiegel et al., 2002, Trends Cell. Biol. 12:236〜242）が、他の効果は細胞内S1Pによって制御されているようだ。 Sphingosine kinase catalyzes the formation of sphingosine-1-phosphate (S1P), a bioactive lipid that regulates a diverse range of cellular processes, including cell growth, survival, differentiation, motility, and cytoskeleton architecture (Pyne et al. al., 2000, Biochem. J. 349: 385-402; Spiegel et al., 2002, J. Biol. Chem. 277: 25851-25854). Some of these cellular processes are mediated by five S1P-specific G protein coupled receptors (Kluk et al., 2002, Biochim. Biophys. Acta. 1582: 72-80; Spiegel et al., 2002 , Trends Cell. Biol. 12: 236-242), but other effects appear to be controlled by intracellular S1P.

S1Pは、様々な細胞タイプにおいて分裂促進性であり、以下を含む広範囲の重要な調節経路を誘発する：イノシトール三燐酸非依存的経路による細胞内カルシウムの動員（Mattie, M. et al.(1994)J. Biol. Chem. 269, 3181〜3188）、ホスホリパーゼDの活性化（Desai et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 23122〜23128）、c-Jun N-ターミナルキナーゼ（JNK）の阻害（Cuvilliver et al. 1998, J Biol Chem 273, 2910〜2916）、カスパーゼの阻害（Cuvilliver et al. 1998、前記）、接着分子発現（Xia et al, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14196〜14201）、ならびにNF-κB（Xia et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:7996〜8003）および転写因子活性化タンパク質-1（AP-1）（Su et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 16512〜16517）のDNA結合活性の刺激。 S1P is mitogenic in various cell types and triggers a wide range of important regulatory pathways, including: intracellular calcium mobilization by an inositol triphosphate-independent pathway (Mattie, M. et al. (1994 ) J. Biol. Chem. 269, 3181-3188), activation of phospholipase D (Desai et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 23122-23128), c-Jun N-terminal kinase (JNK) Inhibition (Cuvilliver et al. 1998, J Biol Chem 273, 2910-2916), caspase inhibition (Cuvilliver et al. 1998, supra), adhesion molecule expression (Xia et al, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14196-14201), and NF-κB (Xia et al., 2002, J. Biol. Chem. 277: 7996-8003) and transcription factor activated protein-1 (AP-1) (Su et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 16512-16517).

細胞S1Pレベルは、スフィンゴシンキナーゼの活性によって大きく媒介され、S1Pリアーゼ（Van Veldhoven et al., 2000, Biochim Biophys Acta 1487, 128〜134）およびS1Pホスファターゼ（Mandala et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7859〜7964）活性によるその分解によってより低い程度に媒介される。細胞におけるS1Pの基礎レベルは一般的に低いが（Spiegel et al, 1998, Ann N Y Acad Sci 845, 11〜18）、細胞を様々な分裂促進物質に曝露すると急速かつ一過性に増加しうる。この反応は、サイトゾルにおけるスフィンゴシンキナーゼ活性が増加した直接の結果であり、スフィンゴシンキナーゼ阻害剤を加えることによって阻止することができる。これによって、スフィンゴシンキナーゼおよびその活性化は、細胞においてS1Pに帰因する観察された効果を媒介するための中心的な不可避の役割を果たす。しかし、現在のところ、スフィンゴシンキナーゼ活性化に至るメカニズムに関してはほとんど何もわかっていない。 Cellular S1P levels are largely mediated by the activity of sphingosine kinase, and S1P lyase (Van Veldhoven et al., 2000, Biochim Biophys Acta 1487, 128-134) and S1P phosphatase (Mandala et al., 2000, Proc. Natl. Acad Sci. USA 97, 7859-7964) mediated to a lesser extent by its degradation by activity. Although basal levels of S1P in cells are generally low (Spiegel et al, 1998, Ann N Y Acad Sci 845, 11-18), exposure of cells to various mitogens can increase rapidly and transiently. This reaction is a direct result of increased sphingosine kinase activity in the cytosol and can be blocked by adding a sphingosine kinase inhibitor. Thereby, sphingosine kinase and its activation play a central inevitable role in mediating the observed effects attributed to S1P in cells. However, little is currently known about the mechanism leading to sphingosine kinase activation.

スフィンゴシンキナーゼは、広く多様な細胞アゴニストによって非常に急速に活性化されうる。反応は細胞タイプによって異なるが、これらの刺激には、TNFα（Xia et al. 1998、前記；Pitson et al., 2000, Biochem. J. 350:429〜441）（図1）、血小板由来増殖因子（Olivera et al., 1993, Nature 365, 557〜560）、上皮細胞増殖因子（Meyer zu Heringdorf et al., 1998, EMBO J 17, 2830〜2838）、神経生長因子（Rius et al., 1997, FEBS Lett 417, 173〜176）、ビタミンD3（Kleuser et al., 1998, Cancer Res. 58, 1817〜1823）、ホルボルエステル（Pitson et al. 2000、前記；Buehrer et al. 1996）、アセチルコリン（ムスカリンアゴニスト）（Meyer zu Heringdorf et al., 1998、前記）、および免疫グロブリン受容体FcεR1（Choi et al., 1996, Nature 380, 634〜639）とFcγR1（Melendez et al., 1998, J Biol Chem 273, 9393〜9402）とのクロスリンクが含まれる。全ての場合において、このスフィンゴシンキナーゼ活性化は、反応のV_maxを増加させるが、基質親和性（K_m）は変化させないままである。 Sphingosine kinase can be activated very rapidly by a wide variety of cellular agonists. Although the response varies depending on the cell type, these stimuli include TNFα (Xia et al. 1998, supra; Pitson et al., 2000, Biochem. J. 350: 429-441) (FIG. 1), platelet-derived growth factor (Olivera et al., 1993, Nature 365, 557-560), epidermal growth factor (Meyer zu Heringdorf et al., 1998, EMBO J 17, 2830-2838), nerve growth factor (Rius et al., 1997, FEBS Lett 417, 173-176), vitamin D3 (Kleuser et al., 1998, Cancer Res. 58, 1817-1823), phorbol ester (Pitson et al. 2000, supra; Buehler et al. 1996), acetylcholine ( Muscarinic agonists (Meyer zu Heringdorf et al., 1998, supra), and immunoglobulin receptors FcεR1 (Choi et al., 1996, Nature 380, 634-639) and FcγR1 (Melendez et al., 1998, J Biol Chem 273, 9393-9402). In all cases, this sphingosine kinase activation increases the V _max of the reaction but leaves the substrate affinity (K _m ) unchanged.

二つのヒトスフィンゴシンキナーゼイソ型（1および2）が存在し、これらはその組織分布、発達的発現、触媒特性において、および多少その基質特異性において異なる（Pitson et al. 2000、前記；Liu et al., 2000, J. Biol. Chem. 275:19513〜19520）。多くの試験が、細胞増殖の増強およびアポトーシスの抑制におけるスフィンゴシンキナーゼ1の効果を示している（Olivera et al., 1999, J. Cell Biol. 147:545〜558；Xia et al., 2000, Curr. Biol. 10:1527〜1530；Edsall et al., 2001, J. Neurochem. 76:1573〜1584）。さらに、NIH3T3線維芽細胞におけるヒトスフィンゴシンキナーゼ1（hSK1）の過剰発現によって、トランスフォームした表現型およびヌードマウスにおける腫瘍形成能の獲得が起こり、このことは、この酵素の腫瘍形成能を証明している（Xia et al., 2000、前記）。より最近の研究は、乳房腫瘍細胞の生長および生存のエストロゲン依存的調節においてhSK1が関係していることを示している（Nava et al., 2002, Expt. Cell Res. 281:115〜127；Sukocheva et al., 2003, Mol. Endocrinol. 17:2002〜2012）が、他の研究は、多様なヒト固形腫瘍におけるhSK1 mRNAの上昇およびスフィンゴシンキナーゼ阻害剤によるインビボでの腫瘍生長の阻害を示している（French et al., 2003, Cancer Res. 63:5962〜5969）。 There are two human sphingosine kinase isoforms (1 and 2) that differ in their tissue distribution, developmental expression, catalytic properties, and somewhat in their substrate specificity (Pitson et al. 2000, supra; Liu et al , 2000, J. Biol. Chem. 275: 19513-19520). Many studies have shown the effect of sphingosine kinase 1 in enhancing cell proliferation and suppressing apoptosis (Olivera et al., 1999, J. Cell Biol. 147: 545-558; Xia et al., 2000, Curr Biol. 10: 1527-1530; Edsall et al., 2001, J. Neurochem. 76: 1573-1584). Furthermore, overexpression of human sphingosine kinase 1 (hSK1) in NIH3T3 fibroblasts resulted in the acquisition of a transformed phenotype and tumorigenic potential in nude mice, demonstrating the tumorigenic potential of this enzyme. (Xia et al., 2000, supra). More recent studies have shown that hSK1 is involved in estrogen-dependent regulation of breast tumor cell growth and survival (Nava et al., 2002, Expt. Cell Res. 281: 115-127; Sukocheva et al., 2003, Mol. Endocrinol. 17: 2002-2012), but other studies show elevated hSK1 mRNA and inhibition of tumor growth in vivo by sphingosine kinase inhibitors in a variety of human solid tumors (French et al., 2003, Cancer Res. 63: 5962-5969).

このように、細胞生長、生存、および腫瘍形成にhSK1が関係していることは現在では十分に確立されている。しかし、それによってhSK1がこれらの効果を生じるメカニズムはあまり明確ではない。最近の研究から、これがGタンパク質共役受容体とは無関係であること（Olivera et al, 2003, J. Biol. Chem. 278:46452〜46460）が示され、これらの効果が単に細胞内S1Pレベルおよび関連するがまだ同定されていない細胞内標的によって媒介されることを示唆している。これらの直接の標的は不明であるが、hSK1は、ERK1/2（Pitson et al. 2000, J. Biol. Chem. 275:33945〜33950；Shu et al., 2002, Mol. Cell Biol. 22:7758〜7768）、ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ（Osawa et al., 2001, J. Immunol. 167:173〜180）およびNF-κB（Xia et al., 2002、前記）の活性化、ならびにカスパーゼ活性化の阻害（Edsall et al., 2001、前記）のような多くの前増殖（pro-proliferative）および前生存（pro-survival）経路に関係している。 Thus, it is now well established that hSK1 is involved in cell growth, survival, and tumorigenesis. However, the mechanism by which hSK1 produces these effects is less clear. Recent studies have shown that this is unrelated to G protein-coupled receptors (Olivera et al, 2003, J. Biol. Chem. 278: 46452-46460), and these effects are simply expressed in intracellular S1P levels and This suggests that it is mediated by related but not yet identified intracellular targets. Although these direct targets are unknown, hSK1 is found to be ERK1 / 2 (Pitson et al. 2000, J. Biol. Chem. 275: 33945-33950; Shu et al., 2002, Mol. Cell Biol. 22: 7758-7768), activation of phosphatidylinositol-3-kinase (Osawa et al., 2001, J. Immunol. 167: 173-180) and NF-κB (Xia et al., 2002, supra), and caspase activity It has been implicated in many pro-proliferative and pro-survival pathways such as inhibition of oxidization (Edsall et al., 2001, supra).

したがって、先に詳述したように、広範な細胞活性のその調節という状況におけるスフィンゴシンキナーゼの中心的な役割は十分に確立されているが、それによってこれが起こる正確なメカニズムはごく部分的に決定されているに過ぎない。したがって、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の調節により細胞活性を調節する方法を開発するためのよりよい手段を提供するために、それらのメカニズムを解明することが現在必要である。 Thus, as detailed above, the central role of sphingosine kinase in the context of its regulation of a wide range of cellular activities is well established, but the exact mechanism by which this occurs is only partially determined. It ’s just that. Therefore, it is presently necessary to elucidate their mechanisms in order to provide a better means for developing methods of modulating cellular activity by regulating sphingosine kinase signaling pathways.

本発明に至る研究において、本発明者らは、スフィンゴシンキナーゼの活性化はその燐酸化によって誘導されるが、燐酸化されたスフィンゴシンキナーゼ分子の触媒活性のその後の増加は、スフィンゴシンキナーゼ媒介細胞機能を発生させる唯一の調節事象ではないことを意外にも決定した。むしろ、スフィンゴシンキナーゼの燐酸化による細胞内転位がこの点において重要であることが決定された。しかし、最も予想外に、特にスフィンゴシンの燐酸化がその内因性の触媒活性レベルを増加させるという事実に照らして、スフィンゴシンキナーゼ媒介細胞活性の調整は、スフィンゴシンキナーゼ分子の燐酸化状態に関係なく、単にスフィンゴシンキナーゼ分子の細胞内転位を調整することによって行うことができることが決定されている。なおさらに、転位メディエーターであるカルモジュリンに結合するスフィンゴシンキナーゼ分子の部位も同様に、現在では同定されて特徴が調べられている。これらの知見によって現在では、その燐酸化状態とは関係なく、その細胞内転位の調節に基づいてスフィンゴシンキナーゼ媒介細胞機能を調整する単純かつ能率化された方法を開発することが可能となった。したがって、これは望ましくないまたは不適当な細胞機能、特に新生物増殖のような不適当な細胞増殖を特徴とする病態を治療的または予防的に処置するための非常に有効な方法の開発を提供した。 In the study leading to the present invention, the inventors have shown that sphingosine kinase activation is induced by its phosphorylation, but the subsequent increase in the catalytic activity of the phosphorylated sphingosine kinase molecule results in sphingosine kinase-mediated cellular function. It was surprisingly determined that it was not the only regulatory event to occur. Rather, it was determined that intracellular translocation by phosphorylation of sphingosine kinase is important in this regard. However, most unexpectedly, especially in light of the fact that phosphorylation of sphingosine increases its endogenous catalytic activity level, the regulation of sphingosine kinase-mediated cellular activity is simply independent of the phosphorylation state of the sphingosine kinase molecule. It has been determined that this can be done by modulating intracellular translocation of sphingosine kinase molecules. Still further, the site of the sphingosine kinase molecule that binds to the translocation mediator calmodulin is now identified and characterized. These findings now make it possible to develop simple and streamlined methods to modulate sphingosine kinase-mediated cellular functions based on the regulation of their intracellular translocation, regardless of their phosphorylation status. This therefore provides the development of highly effective methods for therapeutically or prophylactically treating pathological conditions characterized by undesirable or inappropriate cellular function, especially inappropriate cellular proliferation such as neoplastic proliferation. did.

発明の概要
本明細書および以下の特許請求の範囲を通して、特に明記していなければ、「含む」という用語およびその変化形は、記載の整数もしくは段階、または整数もしくは段階の群を含むが、他の任意の整数もしくは段階、または整数もしくは段階の群を除外しないことを意味すると理解されるであろう。 SUMMARY OF THE INVENTION Throughout this specification and the following claims, the term “comprising” and variations thereof include the recited integer or step, or group of integers or steps, unless otherwise specified. It will be understood to mean not excluding any integer or step, or group of integers or steps.

本明細書は、本明細書において引用文献の後に紹介するプログラムPatentInバージョン3.1を用いて調製したヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報を含む。それぞれのヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、数値指標＜210＞の後に配列同定子（例えば、＜210＞1、＜210＞2等）によって配列表において同定される。各ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関して長さ、配列のタイプ（DNA、タンパク質等）、および起源生物はそれぞれ、数値指標領域＜211＞、＜212＞、および＜213＞に提供される情報によって示される。本明細書において言及したヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、指標SEQ ID NO：の後の配列同定子（例えば、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2等）によって同定される。本明細書において言及された配列同定子は、配列表における数値指標領域＜400＞の後に続く配列同定子（例えば、＜400＞1、＜400＞2等）において提供される情報と相関する。すなわち、明細書において詳述するSEQ ID NO：1は、配列表において＜400＞1として示される配列に相関する。 This specification contains nucleotide and amino acid sequence information prepared using the program PatentIn version 3.1, introduced after the cited references herein. Each nucleotide or amino acid sequence is identified in the sequence listing by a numerical identifier <210> followed by a sequence identifier (eg, <210> 1, <210> 2, etc.). The length, sequence type (DNA, protein, etc.) and source organism for each nucleotide or amino acid sequence are indicated by the information provided in the numerical indicator regions <211>, <212>, and <213>, respectively. Nucleotide and amino acid sequences referred to herein are identified by the sequence identifier after the indicator SEQ ID NO: (eg, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, etc.). The sequence identifier referred to herein correlates with information provided in the sequence identifier (eg, <400> 1, <400> 2, etc.) following the numerical index region <400> in the sequence listing. That is, SEQ ID NO: 1 detailed in the specification correlates with the sequence shown as <400> 1 in the sequence listing.

アミノ酸配列における特異的変異は、本明細書において「Xaa₁nXaa₂」として表され、式中Xaa₁は、変異前の最初のアミノ酸残基であり、nは残基番号およびXaa₂は変異体アミノ酸である。省略語「Xaa」は三文字または一文字アミノ酸コードであってもよい。一文字コードにおける変異は例えば、X₁nX₂で表され、式中X₁およびX₂はそれぞれ、Xaa₁およびXaa₂と同じである。変異およびヒトスフィンゴシンキナーゼタンパク質配列全般の双方において、ヒトスフィンゴシンキナーゼ1のアミノ酸残基は、SEQ ID NO：2のモチーフ

においてフェニルアラニン残基（F）を197番として番号が付けられる。 A specific mutation in an amino acid sequence is represented herein as “Xaa ₁ nXaa ₂ ”, where Xaa ₁ is the first amino acid residue before mutation, n is the residue number and Xaa ₂ is the mutant It is an amino acid. The abbreviation “Xaa” may be a three letter or single letter amino acid code. The mutation in the one-letter code is represented by, for example, X ₁ nX _2, where X ₁ and X ₂ are the same as Xaa ₁ and Xaa ₂ , respectively. In both the mutant and human sphingosine kinase protein sequences in general, the amino acid residue of human sphingosine kinase 1 is the motif of SEQ ID NO: 2.

Are numbered with the phenylalanine residue (F) numbered 197.

本発明の一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階がシグナル伝達をアップレギュレートし、該スフィンゴシン細胞膜局在をダウンレギュレートする段階がシグナル伝達をダウンレギュレートする、スフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整するために十分な時間および条件でスフィンゴシンキナーゼを物質の有効量に接触させる段階を含む、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を調整する方法を提供する。 One aspect of the present invention is a sphingosine kinase, wherein the step of up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates signal transduction, and the step of down-regulating sphingosine cell membrane localization down-regulates signal transduction. There is provided a method of modulating sphingosine kinase-mediated signal transduction comprising contacting sphingosine kinase with an effective amount of a substance for a time and under conditions sufficient to modulate subcellular localization.

本発明のもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階がシグナル伝達をアップレギュレートし、該スフィンゴシン細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が該シグナル伝達をダウンレギュレートする、ヒトスフィンゴシンキナーゼ1の細胞内局在を調整するために十分な時間および条件でヒトスフィンゴシンキナーゼ1を物質の有効量に接触させる段階を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ1媒介シグナル伝達を調整する方法を提供する。 Another aspect of the invention is that up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates signal transduction, and down-regulating sphingosine cell membrane localization down-regulates the signal transduction. Provided is a method for modulating human sphingosine kinase 1 mediated signaling comprising contacting human sphingosine kinase 1 with an effective amount of a substance for a time and under conditions sufficient to modulate subcellular localization of human sphingosine kinase 1 .

本発明のさらにもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階がシグナル伝達をアップレギュレートし、該スフィンゴシン細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が該シグナル伝達をダウンレギュレートする、ヒトスフィンゴシンキナーゼ2の細胞内局在を調整するために十分な時間および条件でヒトスフィンゴシンキナーゼ2を物質の有効量に接触させる段階を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ2媒介シグナル伝達を調整する方法を提供する。 Yet another aspect of the present invention is that up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates signal transduction, and down-regulating sphingosine cell membrane localization down-regulates the signal transduction. Providing a method of modulating human sphingosine kinase 2 mediated signaling comprising contacting human sphingosine kinase 2 with an effective amount of the substance for a time and under conditions sufficient to modulate the subcellular localization of human sphingosine kinase 2 To do.

本発明のさらにもう一つの局面において、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階がシグナル伝達をアップレギュレートし、該スフィンゴシン細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が該シグナル伝達をダウンレギュレートし、ここで物質が、スフィンゴシンキナーゼ燐酸化を調整することによって局在を調節する以外の手段によって機能する、ヒトスフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整するために十分な時間および条件でヒトスフィンゴシンキナーゼを物質の有効量に接触させる段階を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を調整する方法が提供される。 In yet another aspect of the invention, the step of upregulating sphingosine kinase cell membrane localization upregulates signal transduction, and the step of downregulating the sphingosine cell membrane localization downregulates the signal transduction. Where the substance functions by means other than modulating localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation, and human sphingosine kinase in sufficient time and conditions to modulate the subcellular localization of human sphingosine kinase A method is provided for modulating human sphingosine kinase mediated signaling comprising contacting an effective amount of a substance.

本発明のさらになおもう一つの局面は、相互作用を誘導またはアゴニスト作用する段階がスフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートし、該相互作用にアンタゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートし、ここで物質が、スフィンゴシンキナーゼ燐酸化を調整することによって局在を調節する以外の手段によって機能する、SEQ ID NO：2の残基191〜206位に対応する一つまたは複数のアミノ酸と転位因子との相互作用を調整するために十分な時間および条件でヒトスフィンゴシンキナーゼを物質の有効量に接触させる段階を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を調整する方法を提供する。 Yet another aspect of the invention is that the step of inducing or agonizing the interaction up-regulates sphingosine kinase cell membrane localization, and the step of antagonizing the interaction down-regulates sphingosine kinase cell membrane localization. One or more amino acids corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2, wherein the substance functions by means other than modulating localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation A method of modulating human sphingosine kinase-mediated signal transduction comprising contacting human sphingosine kinase with an effective amount of a substance for a time and under conditions sufficient to modulate the interaction between a transposable element and a transposable element.

本発明のなおさらにもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階が、細胞活性をアップレギュレートし、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が該細胞活性をダウンレギュレートする、スフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整するために十分な時間および条件で細胞を物質の有効量に接触させる段階を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ媒介細胞活性を調整する方法を対象とする。 Yet another aspect of the invention is that the step of up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates cell activity and the step of down-regulating sphingosine kinase cell membrane localization down-regulates the cell activity. It is directed to a method of modulating human sphingosine kinase mediated cellular activity comprising contacting the cell with an effective amount of a substance for a time and under conditions sufficient to modulate the subcellular localization of sphingosine kinase.

本発明のさらなる局面は、相互作用を誘導またはアゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートし、該相互作用にアンタゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートし、ここで物質が、スフィンゴシンキナーゼ燐酸化を調整することによって局在を調節する以外の手段によって機能する、SEQ ID NO：2の残基191〜206位に対応する一つまたは複数のアミノ酸と転位因子との相互作用を調整するために十分な時間および条件で細胞を物質の有効量に接触させる段階を含む、スフィンゴシンキナーゼ媒介細胞活性を調整する方法を提供する。 A further aspect of the invention is that the step of inducing or agonizing the interaction up-regulates sphingosine kinase cell membrane localization, and the step of antagonizing the interaction down-regulates sphingosine kinase cell membrane localization; Wherein the substance functions by means other than modulating localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation one or more amino acids and transposable elements corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2 There is provided a method of modulating sphingosine kinase mediated cellular activity comprising the step of contacting a cell with an effective amount of a substance for a time and under conditions sufficient to modulate an interaction with.

本発明のなおもう一つのさらなる局面は、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階が細胞活性をアップレギュレートし、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が該細胞活性をダウンレギュレートする、スフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整するために十分な時間および条件で哺乳動物に物質の有効量を投与する段階を含む、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当なスフィンゴシンキナーゼ媒介細胞活性を特徴とする、哺乳動物における病態の処置および／または予防のための方法を対象とする。 Yet another further aspect of the invention is that the step of up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates cell activity and the step of down-regulating sphingosine kinase cell membrane localization down-regulates the cell activity. Abnormal, undesirable or otherwise inappropriate sphingosine kinase comprising administering to a mammal an effective amount of the substance for a time and under conditions sufficient to modulate the subcellular localization of sphingosine kinase It is directed to a method for the treatment and / or prevention of disease states in mammals characterized by mediated cell activity.

本発明のさらにもう一つのさらなる局面は、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階がスフィンゴシンキナーゼ活性をアップレギュレートし、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が該スフィンゴシンキナーゼ活性をダウンレギュレートする、スフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整するために十分な時間および条件で哺乳動物に物質の有効量を投与する段階を含む、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当なスフィンゴシンキナーゼ機能的活性を特徴とする、哺乳動物における病態の処置および／または予防のための方法を対象とする。 Yet another further aspect of the invention is that the step of up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates sphingosine kinase activity and the step of down-regulating sphingosine kinase cell membrane localization reduces the sphingosine kinase activity. Abnormal, undesirable or otherwise inappropriate, comprising administering an effective amount of the substance to a mammal for a time and under conditions sufficient to regulate and regulate the subcellular localization of sphingosine kinase It is directed to methods for the treatment and / or prevention of disease states in mammals characterized by sphingosine kinase functional activity.

本発明のなおさらにもう一つのさらなる局面は、相互作用を誘導またはアゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ膜局在をアップレギュレートし、該相互作用にアンタゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートし、ここで物質が、スフィンゴシンキナーゼ燐酸化を調整することによって局在を調節する以外の手段によって機能する、SEQ ID NO：2の残基191〜206位に対応する一つまたは複数のアミノ酸と転位因子との相互作用を調整するために十分な時間および条件で哺乳動物に物質の有効量を投与する段階を含む、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当なスフィンゴシンキナーゼ媒介細胞活性を特徴とする、哺乳動物における病態の処置および／または予防のための方法を対象とする。 Yet another further aspect of the invention is that the step of inducing or agonizing the interaction up-regulates sphingosine kinase membrane localization and the step of antagonizing the interaction comprises sphingosine kinase cell membrane localization. One or more corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2, down-regulated, wherein the substance functions by means other than modulating localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation An abnormal, undesirable or otherwise inappropriate sphingosine kinase comprising administering an effective amount of the substance to a mammal for a time and under conditions sufficient to modulate the interaction of the amino acid with a translocation factor To a method for the treatment and / or prophylaxis of a disease state in a mammal characterized by mediated cell activity And

本発明のなおもう一つの局面は、相互作用を誘導またはアゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートし、該相互作用にアンタゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートし、ここで物質が、スフィンゴシンキナーゼ燐酸化を調整することによって局在を調節する以外の手段によって機能する、SEQ ID NO：2の残基191〜206位に対応する一つまたは複数のアミノ酸と転位因子との相互作用を調整するために十分な時間および条件で哺乳動物に物質の有効量を投与する段階を含む、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当なスフィンゴシンキナーゼ機能的活性を特徴とする、哺乳動物における病態の処置および／または予防のための方法を対象とする。 Yet another aspect of the invention is that the step of inducing or agonizing the interaction up-regulates sphingosine kinase cell membrane localization, and the step of antagonizing the interaction down-regulates sphingosine kinase cell membrane localization. One or more amino acids corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2, wherein the substance functions by means other than modulating localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation An abnormal, undesirable or otherwise inappropriate sphingosine kinase functional, comprising administering an effective amount of the substance to the mammal for a time and under conditions sufficient to modulate the interaction between the transposable element and the translocation factor It is directed to a method for the treatment and / or prevention of a disease state in a mammal characterized by activity.

本発明のもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が、本発明の細胞生長をダウンレギュレートする、スフィンゴシンキナーゼの細胞膜局在を調整するために十分な時間および条件で哺乳動物に物質の有効量を投与する段階を含む、哺乳動物における異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞生長を特徴とする病態の処置および／または予防のための方法を企図する。 Another aspect of the present invention is that the step of down-regulating sphingosine kinase cell membrane localization in a time and condition sufficient to modulate cell membrane localization of sphingosine kinase down-regulates cell growth of the present invention. Contemplates a method for the treatment and / or prevention of a pathological condition characterized by abnormal, undesirable or otherwise inappropriate cell growth in a mammal, comprising administering an effective amount of the substance to the mammal. To do.

なおもう一つの局面において、本発明は、相互作用にアンタゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートし、ここで物質が、スフィンゴシンキナーゼ燐酸化を調整することによって局在を調節する以外の手段によって機能する、SEQ ID NO：2の残基191〜206位に対応する一つまたは複数のアミノ酸と転位因子との相互作用にアンタゴニスト作用するために十分な時間および条件で哺乳動物に物質の有効量を投与する段階を含む、哺乳動物における異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞生長を特徴とする病態の処置および／または予防のための方法を企図する。 In yet another aspect, the invention provides that the step of antagonizing the interaction down-regulates sphingosine kinase cell membrane localization, wherein the substance modulates localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation In a mammal for a time and under conditions sufficient to antagonize the interaction of one or more amino acids corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2 with a transposable element that functions by means other than Methods are contemplated for the treatment and / or prevention of pathological conditions characterized by abnormal, undesirable or otherwise inappropriate cell growth in a mammal comprising administering an effective amount of the substance.

本発明のさらになおもう一つの局面は、物質がスフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整し、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階が、細胞活性をアップレギュレートして、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が、該細胞活性をダウンレギュレートする、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当なスフィンゴシンキナーゼ媒介細胞活性を特徴とする哺乳動物における病態を処置するための薬剤を製造するために、本明細書において先に定義した物質を用いることを企図する。 Yet another aspect of the present invention is that the step of regulating the intracellular localization of sphingosine kinase and up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates cellular activity, wherein sphingosine kinase cell membrane station A step of down-regulating presence to treat a condition in a mammal characterized by an abnormal, undesirable, or otherwise inappropriate sphingosine kinase-mediated cellular activity that down-regulates the cellular activity It is contemplated to use the substances previously defined herein for the manufacture of a medicament.

本発明のなおもう一つの局面は、物質がスフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整し、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階が、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達をアップレギュレートし、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が、該スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達をダウンレギュレートする、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当なスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を特徴とする、哺乳動物における病態を処置するための薬剤を製造するために、本明細書において先に定義した物質を用いることを企図する。 Yet another aspect of the invention is that the substance modulates the subcellular localization of sphingosine kinase and up-regulates sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates sphingosine kinase-mediated signaling, and the sphingosine kinase cell membrane Pathology in mammals characterized by abnormal, undesired or otherwise inappropriate sphingosine kinase-mediated signaling wherein down-regulating localization down-regulates the sphingosine kinase-mediated signaling It is contemplated to use the substances previously defined herein for the manufacture of a medicament for treating.

本発明のもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼまたはその機能的同等物もしくは誘導体を含む細胞またはその抽出物を、推定の物質に接触させる段階、および細胞膜局在に関連した変化した発現表現型を検出する段階を含む、スフィンゴシンキナーゼまたはその機能的同等物もしくは誘導体の細胞内局在を調整することができる物質を検出する方法を提供する。 Another aspect of the present invention is the step of contacting a cell containing sphingosine kinase or a functional equivalent or derivative thereof or an extract thereof with a putative substance and detecting an altered expression phenotype associated with cell membrane localization A method for detecting a substance capable of modulating the intracellular localization of sphingosine kinase or a functional equivalent or derivative thereof.

本発明のもう一つのさらなる局面は、野生型スフィンゴシンキナーゼ、またはスフィンゴシンキナーゼ変種の機能的誘導体、相同体、もしくは類似体と比較して転位能の消失または低減を示す、転位メディエーター結合部位を含むスフィンゴシンキナーゼ領域において変異を含む、スフィンゴシンキナーゼ変種を対象とする。 Another further aspect of the invention is a sphingosine comprising a translocation mediator binding site that exhibits loss or reduction of transposition ability compared to a wild-type sphingosine kinase, or a functional derivative, homologue, or analog of a sphingosine kinase variant. Sphingosine kinase variants that include mutations in the kinase region are of interest.

さらにもう一つのさらなる局面において、野生型スフィンゴシンキナーゼ、またはスフィンゴシンキナーゼ変種の機能的誘導体、相同体、もしくは類似体と比較して転位能の消失または低減を示す、アミノ酸191〜206位の単一または複数のアミノ酸置換および／または欠失を有するアミノ酸配列を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ変種が提供される。 In yet another further aspect, a single or amino acid at positions 191-206, showing loss or reduction of transposition ability compared to a wild-type sphingosine kinase, or a functional derivative, homologue, or analog of a sphingosine kinase variant Human sphingosine kinase variants comprising amino acid sequences having multiple amino acid substitutions and / or deletions are provided.

さらにもう一つの局面において、本発明は、本明細書において以降定義されるスフィンゴシンキナーゼ変種を発現するように改変されている、遺伝子改変動物に及ぶ。 In yet another aspect, the invention extends to a genetically modified animal that has been modified to express a sphingosine kinase variant as defined herein below.

本明細書を通して用いられる一文字および三文字省略語を表1に定義する。 The one-letter and three-letter abbreviations used throughout this specification are defined in Table 1.

（表１）一文字および三文字アミノ酸省略語

(Table 1) Single-letter and three-letter amino acid abbreviations

発明の詳細な説明
本発明は、部分的に、スフィンゴシンキナーゼ媒介細胞活性が、スフィンゴシンキナーゼのサイトゾルから細胞膜への転位によって調節されるという驚くべき決定に基づいて予測される。なおさらに、スフィンゴシンキナーゼの燐酸化は、それがスフィンゴシンキナーゼの触媒活性を増加させてその細胞内転位を行うという点において非常に重要な事象であるが、スフィンゴシンキナーゼの転位によって、その燐酸化状態に関係なく、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達事象によって媒介される細胞活性の調整が得られるであろうということが決定されている。最後に、スフィンゴシンキナーゼ転位因子結合部位自身の同定および特徴付けがなされている。これらの決定により現在では、異常なまたは望ましくない細胞活性および／またはスフィンゴシンキナーゼ機能的活性を特徴とする病態、特に新生物病態を処置するための治療および／または予防的方法の合理的設計が可能となる。さらに、スフィンゴシンキナーゼ転位を特異的に調整する物質の同定および／または設計が促進される。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention is predicted based in part on the surprising determination that sphingosine kinase-mediated cellular activity is regulated by translocation of sphingosine kinase from the cytosol to the cell membrane. Still further, the phosphorylation of sphingosine kinase is a very important event in that it increases the catalytic activity of sphingosine kinase and performs its intracellular translocation. Regardless, it has been determined that a modulation of cellular activity mediated by sphingosine kinase signaling events will be obtained. Finally, the sphingosine kinase translocation factor binding site itself has been identified and characterized. These decisions now allow the rational design of therapeutic and / or prophylactic methods for treating conditions characterized by abnormal or undesirable cellular activity and / or sphingosine kinase functional activity, particularly neoplastic conditions It becomes. Furthermore, the identification and / or design of substances that specifically modulate sphingosine kinase translocation is facilitated.

したがって、本発明の一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階がシグナル伝達をアップレギュレートし、該スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が、該シグナル伝達をダウンレギュレートする、スフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整するために十分な時間および条件でスフィンゴシンキナーゼを物質の有効量に接触させる段階を含む、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を調整する方法を提供する。 Accordingly, one aspect of the present invention is that the step of up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates signal transduction, and the step of down-regulating sphingosine kinase cell membrane localization down-regulates the signal transduction. There is provided a method of modulating sphingosine kinase-mediated signal transduction comprising contacting sphingosine kinase with an effective amount of a substance for a time and under conditions sufficient to modulate the subcellular localization of sphingosine kinase.

「スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達」という言及は、スフィンゴシンキナーゼ分子が機能的成分を形成するシグナル伝達経路に対する言及であると理解すべきである。この点において、スフィンゴシンキナーゼは、この経路の活性化の際のスフィンゴシン-1-ホスフェートの産生にとって中心となると考えられる。スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の調整は、シグナル伝達事象のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの双方を含む、例えば所定のシグナル伝達事象の誘導もしくは中止、または任意の所定のシグナル伝達事象のレベルもしくは程度の変化を含むと理解すべきである。 Reference to “sphingosine kinase mediated signaling” should be understood as a reference to the signaling pathway in which the sphingosine kinase molecule forms a functional component. In this regard, sphingosine kinase is thought to be central to the production of sphingosine-1-phosphate upon activation of this pathway. Modulation of sphingosine kinase-mediated signaling includes both up-regulation and down-regulation of signaling events, including induction or withdrawal of a given signaling event, or a change in the level or extent of any given signaling event Should be understood.

本発明に従って、スフィンゴシンキナーゼの細胞膜への転位のアンタゴニスト作用は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達事象の完了を阻止するが、スフィンゴシンキナーゼの細胞膜への転位のアゴニスト作用またはそうでなければ誘導は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を促進する。同様に、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達事象の程度またはレベルは、細胞膜に局在するスフィンゴシンキナーゼ分子の濃度を増加または減少させることによって調整することができると理解すべきである。したがって、シグナル伝達の調整は、シグナル伝達の開始または阻害と必ずしも等しい必要はないが、発生するスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達のレベルを調節するように設計してもよい。 In accordance with the present invention, antagonism of sphingosine kinase translocation to the cell membrane prevents the completion of sphingosine kinase mediated signaling events, while agonistic or otherwise induction of sphingosine kinase translocation to the cell membrane is sphingosine kinase mediated. Promotes signal transduction. Similarly, it should be understood that the extent or level of sphingosine kinase mediated signaling events can be adjusted by increasing or decreasing the concentration of sphingosine kinase molecules localized in the cell membrane. Thus, modulation of signal transduction need not necessarily be equal to the initiation or inhibition of signal transduction, but may be designed to modulate the level of sphingosine kinase mediated signal transduction that occurs.

「スフィンゴシンキナーゼ」という言及には、スフィンゴシンキナーゼタンパク質およびその誘導体、変異体、相同体、または類似体の全ての型に対する言及が含まれると理解すべきである。この点において、「スフィンゴシンキナーゼ」は、中でもスフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の活性化の際のスフィンゴシン-1-ホスフェートの産生に関係する分子であると理解すべきである。これには例えば、スフィンゴシンキナーゼの全てのタンパク質型、および例えばスフィンゴシンキナーゼmRNAの選択的スプライシングによって生じる任意のイソ型、またはスフィンゴシンキナーゼの対立遺伝子もしくは多型変種を含む、その機能的誘導体、変異体、相同体、または類似体が含まれる。 Reference to “sphingosine kinase” should be understood to include reference to all types of sphingosine kinase proteins and derivatives, variants, homologues or analogs thereof. In this regard, “sphingosine kinase” should be understood to be a molecule involved in the production of sphingosine-1-phosphate, among other things, upon activation of the sphingosine kinase signaling pathway. This includes, for example, all protein forms of sphingosine kinase, and any isoform resulting from, for example, alternative splicing of sphingosine kinase mRNA, or functional derivatives, variants thereof, including allelic or polymorphic variants of sphingosine kinase, Homologues or analogs are included.

本発明は、如何なる一つの理論または作用機序に限定されないが、二つのヒトスフィンゴシンキナーゼイソ型が存在し（1および2）、それらはその組織分布、発達的発現、触媒特性、および幾分その基質特異性が異なる（Pitson et al. 2000、前記；Liu et al., 2000、前記）。多くの研究から、細胞増殖の増強およびアポトーシスの抑制におけるスフィンゴシンキナーゼ1の効果が示されている（Olivera et al., 1999、前記；Xia et al., 2000、前記；Edsall et al., 2001、前記）。さらに、NIH3T3線維芽細胞におけるヒトスフィンゴシンキナーゼ1（hSK1）の過剰発現によって、トランスフォームした表現型およびヌードマウスにおける腫瘍形成能の獲得が起こることが示されており、この酵素の腫瘍形成能を証明している（Xia et al., 2000、前記）。より最近の研究から、乳房腫瘍細胞の生長および生存のエストロゲン依存的調節にhSK1が関係することが示されたが（Nava et al., 2002、前記；Sukocheva et al., 2003、前記）、他の研究は、多様なヒト固形腫瘍におけるhSK1 mRNAの上昇およびスフィンゴシンキナーゼ阻害剤によるインビボでの腫瘍生長の阻害を示した（French et al., 2003、前記）。 Although the present invention is not limited to any one theory or mechanism of action, there are two human sphingosine kinase isoforms (1 and 2) that have their tissue distribution, developmental expression, catalytic properties, and somewhat their Substrate specificity is different (Pitson et al. 2000, supra; Liu et al., 2000, supra). Many studies have shown the effect of sphingosine kinase 1 in enhancing cell proliferation and suppressing apoptosis (Olivera et al., 1999, supra; Xia et al., 2000, supra; Edsall et al., 2001, Said). Furthermore, overexpression of human sphingosine kinase 1 (hSK1) in NIH3T3 fibroblasts has been shown to result in the acquisition of tumorigenic potential in the transformed phenotype and nude mice, demonstrating the tumorigenic potential of this enzyme. (Xia et al., 2000, supra). More recent studies have shown that hSK1 is involved in estrogen-dependent regulation of breast tumor cell growth and survival (Nava et al., 2002, supra; Sukocheva et al., 2003, supra), etc. This study showed an increase in hSK1 mRNA and inhibition of tumor growth in vivo by sphingosine kinase inhibitors in a variety of human solid tumors (French et al., 2003, supra).

その「機能的」誘導体、変異体、相同体、または類似体という言及は、スフィンゴシンキナーゼの機能的活性の任意の一つまたは複数を示す分子に対する言及であると理解すべきである。 It should be understood that reference to a “functional” derivative, variant, homologue, or analog is a reference to a molecule that exhibits any one or more of the functional activities of sphingosine kinase.

好ましくは、スフィンゴシンキナーゼは、スフィンゴシンキナーゼ1または2であり、より好ましくはヒトスフィンゴシンキナーゼ1または2である。 Preferably, the sphingosine kinase is sphingosine kinase 1 or 2, more preferably human sphingosine kinase 1 or 2.

したがって、一つの好ましい態様において、本発明は、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階がシグナル伝達をアップレギュレートし、該スフィンゴシン細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が、該シグナル伝達をダウンレギュレートする、ヒトスフィンゴシンキナーゼ1の細胞内局在を調整するために十分な時間および条件でヒトスフィンゴシンキナーゼ1を物質の有効量に接触させる段階を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ1媒介シグナル伝達を調整する方法を提供する。 Thus, in one preferred embodiment, the present invention provides that the step of upregulating sphingosine kinase cell membrane localization upregulates signal transduction and the step of downregulating the sphingosine cell membrane localization downregulates the signal transduction. Regulates human sphingosine kinase 1 mediated signaling, including contacting human sphingosine kinase 1 with an effective amount of the substance for a time and under conditions sufficient to regulate the subcellular localization of human sphingosine kinase 1 to regulate Provide a method.

もう一つの好ましい態様において、本発明は、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階が、該シグナル伝達をアップレギュレートし、該スフィンゴシン細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が、該シグナル伝達をダウンレギュレートする、ヒトスフィンゴシンキナーゼ2の細胞内局在を調整するために十分な時間および条件でヒトスフィンゴシンキナーゼ2を物質の有効量に接触させる段階を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ2媒介シグナル伝達を調整する方法を提供する。 In another preferred embodiment, the invention provides that the step of up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates said signaling and the step of down-regulating said sphingosine cell membrane localization comprises said signaling. Modulate human sphingosine kinase 2 mediated signaling, including contacting human sphingosine kinase 2 with an effective amount of the substance for a time and under conditions sufficient to regulate the subcellular localization of human sphingosine kinase 2 to down-regulate Provide a way to do it.

本発明のスフィンゴシンキナーゼの「転位」および「局在」という言及（これらの用語は互換的に用いられる）は、触媒活性のレベルまたはその燐酸化の程度のような、本発明のスフィンゴシンキナーゼ分子の如何なる物理的または機能的特徴にも関係なく、この分子の細胞内の物理的な位置に対する言及であると理解すべきである。本明細書において先に詳述したように、本発明は、スフィンゴシンキナーゼの細胞膜への局在が、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達事象を完了するために、およびそれによって増殖のような細胞の機能的活性を行うために肝要であるという決定に基づいて予測される。本発明を如何なる一つの理論または作用様式に限定することなく、細胞を特定のアゴニストに曝露すると、スフィンゴシンキナーゼは、サイトゾルから細胞質膜に転位することが知られている（Pitson et al. 2003、前記；Rosenfeldt et al., 2001, FASEB J. 15:2649〜2659；Johnson et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:35257〜352621；Melendez et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:17255〜17262；Young et al., 2003, Cell Calcium 33:119〜128）。さらに、この転位はスフィンゴシンキナーゼのセリン225位での燐酸化に依存することが知られている。なおさらに、スフィンゴシンキナーゼの転位を促進する因子の結合にとって重要な領域の一つが、ヒトスフィンゴシンキナーゼ1の残基191〜206位、およびヒトスフィンゴシンキナーゼ2の対応する保存された領域に対応することが決定されている。特に、Phe 197およびLeu198は、この相互作用に対して重要に関係している。しかし、意外にも、この転位事象はスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達事象の生物学的転帰を行うために重要であること、およびさらにこれはアップレギュレートされたスフィンゴシンキナーゼ分子を転位させることによっても行うことができることが決定された。したがって、本発明は、スフィンゴシンキナーゼの燐酸化状態を検討または調整する必要なく、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を調節する手段を提供する。 References to “translocation” and “localization” of the sphingosine kinases of the present invention (these terms are used interchangeably) refer to the level of catalytic activity or the degree of phosphorylation of the sphingosine kinase molecule of the present invention. It should be understood that it is a reference to the physical location of this molecule in the cell, regardless of any physical or functional characteristics. As detailed hereinabove, the present invention suggests that the localization of sphingosine kinase to the plasma membrane is responsible for completing sphingosine kinase signaling events and thereby functional activity of cells such as proliferation. Predicted based on a decision that is critical to do. Without limiting the present invention to any one theory or mode of action, it is known that sphingosine kinase is translocated from the cytosol to the cytoplasmic membrane when cells are exposed to specific agonists (Pitson et al. 2003, Rosenfeldt et al., 2001, FASEB J. 15: 2649-2659; Johnson et al., 2002, J. Biol. Chem. 277: 35257-352621; Melendez et al., 2002, J. Biol. Chem. 277: 17255-17262; Young et al., 2003, Cell Calcium 33: 119-128). Furthermore, this rearrangement is known to depend on phosphorylation at the serine position 225 of sphingosine kinase. Still further, one of the regions important for binding of factors that promote sphingosine kinase translocation may correspond to residues 191-206 of human sphingosine kinase 1 and the corresponding conserved region of human sphingosine kinase 2. It has been decided. In particular, Phe 197 and Leu 198 are importantly related to this interaction. Surprisingly, however, this translocation event is important for carrying out the biological outcome of sphingosine kinase-mediated signaling events, and even this can be done by translocating an up-regulated sphingosine kinase molecule. It was decided that it was possible. Thus, the present invention provides a means to modulate sphingosine kinase-mediated signal transduction without having to examine or regulate the sphingosine kinase phosphorylation status.

したがって、好ましい態様において、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階が、シグナル伝達をアップレギュレートし、該スフィンゴシン細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が、該シグナル伝達をダウンレギュレートし、ここで物質が、スフィンゴシンキナーゼ燐酸化を調整することによって、局在を調節する以外の手段によって機能する、ヒトスフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整するために十分な時間および条件でヒトスフィンゴシンキナーゼを物質の有効量に接触させる段階を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を調整する方法が提供される。 Thus, in a preferred embodiment, the step of up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates signal transduction and the step of down-regulating said sphingosine cell membrane localization down-regulates said signal transduction, wherein Substance in a sufficient amount of time and conditions to regulate the subcellular localization of human sphingosine kinase, functioning by means other than regulating localization by regulating sphingosine kinase phosphorylation There is provided a method of modulating human sphingosine kinase mediated signaling comprising contacting with an effective amount of

より詳しくは、本発明は、相互作用を誘導またはアゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートし、該相互作用にアンタゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートし、ここで物質が、スフィンゴシンキナーゼ燐酸化を調整することによって局在を調節する以外の手段によって機能する、SEQ ID NO：2の残基191〜206位に対応する一つまたは複数のアミノ酸と転位因子との相互作用を調整するために十分な時間および条件でヒトスフィンゴシンキナーゼを物質の有効量に接触させる段階を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を調整する方法を提供する。 More particularly, the present invention provides that the step of inducing or agonizing an interaction up-regulates sphingosine kinase cell membrane localization, and the step of antagonizing the interaction down-regulates sphingosine kinase cell membrane localization. Wherein the substance functions by means other than modulating localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation, transposition with one or more amino acids corresponding to residues 191-206 of SEQ ID NO: 2 A method is provided for modulating human sphingosine kinase mediated signaling comprising contacting human sphingosine kinase with an effective amount of a substance for a time and under conditions sufficient to modulate interaction with a factor.

好ましくは、アミノ酸はPhe197またはLeu198の一つまたは双方である。 Preferably, the amino acid is one or both of Phe197 or Leu198.

これらの好ましい態様に従って、スフィンゴシンキナーゼは、スフィンゴシンキナーゼ1またはスフィンゴシンキナーゼ2である。 According to these preferred embodiments, the sphingosine kinase is sphingosine kinase 1 or sphingosine kinase 2.

スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達事象またはスフィンゴシンキナーゼ局在のいずれかを「調整する」という言及は、本発明のシグナル伝達または局在事象をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることに対する言及であると理解すべきである。この点においてアップレギュレートまたはダウンレギュレートするという言及には、本発明のシグナル伝達または局在事象を誘導または消失指せることに対する言及を含む他に、シグナル伝達または局在事象が起こるレベル、程度、または速度を増加または減少させることが含まれると理解すべきである。したがって、本発明の方法に従って利用される物質は、本発明の事象を誘導する、既に発生している事象にアゴニスト作用する、既存の事象にアンタゴニスト作用する、そのような事象の発生を完全に阻止する物質であってもよい。 It should be understood that reference to “modulate” either a sphingosine kinase signaling event or sphingosine kinase localization is a reference to upregulating or downregulating the signaling or localization event of the present invention. is there. Reference to up-regulating or down-regulating in this regard includes, in addition to reference to inducing or extinguishing the signaling or localization event of the present invention, the level, extent, Or it should be understood to include increasing or decreasing the speed. Thus, a substance utilized according to the method of the present invention induces an event of the present invention, agonists an already occurring event, antagonizes an existing event, and completely prevents the occurrence of such an event. It may be a substance.

したがって、「スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする」という言及は、以下に対する言及であると理解すべきである：
（i）スフィンゴシンキナーゼの細胞内細胞膜局在を誘導する、例えば細胞膜への局在を行う物質とスフィンゴシンキナーゼとの相互作用を誘導する；
（ii）既存の細胞膜局在事象をアップレギュレートする、増強する、またはそうでなければアゴニスト作用する、例えば細胞膜へのその局在を行う物質とスフィンゴシンキナーゼとの親和性を増加させる、またはそうでなければその相互作用を安定化させる。 Thus, reference to “upregulate sphingosine kinase cell membrane localization” should be understood as a reference to the following:
(I) Inducing intracellular plasma membrane localization of sphingosine kinase, for example, inducing an interaction between sphingosine kinase and a substance that localizes to the cell membrane;
(Ii) up-regulate, enhance, or otherwise agonistize an existing cell membrane localization event, eg, increase the affinity of a sphingosine kinase with a substance that performs its localization to the cell membrane, or so Otherwise it stabilizes the interaction.

逆に、「スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートする」とは、以下に対する言及であると理解すべきである：
（i）そうでなければサイトゾルから細胞膜へのスフィンゴシンキナーゼの転位に至るであろう、内因性の転位因子のような物質とスフィンゴシンキナーゼとの相互作用を阻止する。
（ii）例えばスフィンゴシンキナーゼの転位が無効となるようにまたはより有効でないように、スフィンゴシンキナーゼと転位物質との既存の相互作用にアンタゴニスト作用する。 Conversely, “downregulate sphingosine kinase cell membrane localization” should be understood as a reference to:
(I) Block the interaction of sphingosine kinase with substances such as endogenous transposable elements that would otherwise lead to the translocation of sphingosine kinase from the cytosol to the cell membrane.
(Ii) antagonize the existing interaction between sphingosine kinase and the translocation agent, eg, so that the transposition of sphingosine kinase is ineffective or less effective.

スフィンゴシンキナーゼの細胞膜局在の調整（アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかの意味において）は、部分的または完全であってもよいと理解すべきである。部分的調整は、所定の細胞において通常起こるであろうごく一部のスフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在事象が本発明の方法によって影響を受ける場合に起こるが、完全な調整は、全てのスフィンゴシンキナーゼ局在事象が調整される場合に起こる。 It should be understood that modulation of sphingosine kinase cell membrane localization (in the sense of either up-regulation or down-regulation) may be partial or complete. Partial adjustment occurs when only a small fraction of sphingosine kinase cell membrane localization events that would normally occur in a given cell are affected by the method of the present invention, but full adjustment does not affect all sphingosine kinase localization events. Occurs when adjusted.

スフィンゴシンキナーゼの細胞内局在の調整は、以下が含まれるがそれらに限定されるわけではない多数の技術の任意の一つによって行われてもよい：
（i）細胞膜と直接の相互作用、または通常膜の局在を促進するように作用するであろう中間分子との相互作用のいずれかを遮断するために、スフィンゴシンキナーゼと相互作用することによって、スフィンゴシンキナーゼの細胞膜への局在にアンタゴニスト作用するタンパク質様または非タンパク質様物質を細胞に導入する段階。
（ii）細胞膜と直接のもしくは物質による相互作用を促進するため、または通常膜の局在を促進するように作用するであろう中間分子（転位因子のような）との相互作用を促進するために、スフィンゴシンキナーゼと相互作用することによって、スフィンゴシンキナーゼの細胞膜への局在にアゴニスト作用するタンパク質様または非タンパク質様物質を細胞に導入する段階。
（iii）細胞膜局在特性を示すように設計されているスフィンゴシンキナーゼ分子変種を細胞に導入する段階。
（iv）（i）〜（iii）のいずれか一つに記述されるタンパク質様物質をコードする核酸分子を細胞に導入する段階。 Adjustment of the subcellular localization of sphingosine kinase may be performed by any one of a number of techniques including, but not limited to:
(I) by interacting with sphingosine kinase to block either direct interaction with the cell membrane or interaction with intermediate molecules that would normally act to promote membrane localization, Introducing into the cell a proteinaceous or non-proteinaceous substance that antagonizes the localization of sphingosine kinase to the cell membrane.
(Ii) To promote direct or substance interaction with the cell membrane, or to promote interactions with intermediate molecules (such as translocation factors) that would normally act to promote membrane localization. And a step of introducing into the cell a protein-like or non-proteinaceous substance that acts as an agonist on the localization of sphingosine kinase to the cell membrane by interacting with sphingosine kinase.
(Iii) introducing a sphingosine kinase molecular variant designed to exhibit cell membrane localization properties into the cell.
(Iv) A step of introducing a nucleic acid molecule encoding the proteinaceous substance described in any one of (i) to (iii) into a cell.

好ましくは、分子は残基191〜206位に対応する一つまたは複数のアミノ酸、および最も好ましくはPhe197またはLeu198と転位因子との相互作用を調整する。 Preferably, the molecule modulates the interaction of one or more amino acids corresponding to residues 191 to 206, and most preferably Phe197 or Leu198 with a transposable element.

「物質」という言及は、スフィンゴシンキナーゼの細胞膜への細胞内局在を調整（アップレギュレートまたはダウンレギュレート）する任意のタンパク質様または非タンパク質様分子、例えば先の（i）〜（iii）において詳述した分子に対する言及であると理解すべきである。本発明の物質は、任意のタンパク質様または非タンパク質様分子に連結、結合、またはそうでなければ会合してもよい。例えば、物質は、特異的組織へのターゲティングを許容する分子に会合してもよい。 Reference to “substance” refers to any proteinaceous or non-proteinaceous molecule that modulates (up-regulates or down-regulates) the intracellular localization of sphingosine kinase to the cell membrane, for example (i) to (iii) above It should be understood that this is a reference to the detailed molecule. The substances of the invention may be linked, bound or otherwise associated with any proteinaceous or non-proteinaceous molecule. For example, the substance may be associated with a molecule that allows targeting to specific tissues.

タンパク質様分子は、融合タンパク質を含む天然、組換え型、もしくは合成起源または例えば天然物スクリーニングの結果であってもよい。非タンパク質様分子は、例えば天然物スクリーニングのような天然起源に由来してもよく、または化学合成してもよい。例えば、本発明は、スフィンゴシンキナーゼ局在のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる転位因子の化学類似体を企図する。化学アゴニストは必ずしも転位因子に由来する必要はないが、特定の構造的類似性を共有してもよい。または、化学アゴニストは転位因子の特定の物理化学的特性を模倣またはアップレギュレートするように特異的に設計してもよい。例えば、アゴニストには、カルシウムレベルの上昇を誘導する物質、例えばイオノマイシンのようなカルシウムイオノフォアが含まれる。アンタゴニストは、スフィンゴシンキナーゼ局在を遮断、阻害、またはそうでなければ阻止することができる任意の化合物であってもよい。アンタゴニストには、スフィンゴシンキナーゼ、スフィンゴシンキナーゼの一部、または転位因子に対して特異的な抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体）が含まれる。アンタゴニストにはまた、SEQ ID NO：2の197位および198位で転位因子結合残基を発現して、それによって野生型スフィンゴシンキナーゼに対する細胞内転位因子の結合の競合的阻害剤として機能するように設計されたスフィンゴシンキナーゼペプチドが含まれる。アンタゴニストの他の例には、細胞内の遊離のカルシウムレベルを減少させる物質、例えばBAPTAもしくはMAPTAMのようなカルシウムキレート剤、またはカルモジュリンのアンタゴニストであるW7のような転位因子自身のアンタゴニストが含まれる。発現の調整は、抗原、RNA、リボソーム、DNAザイム、RNAアプタマー、または共抑制において用いるために適した分子を利用して行ってもよい。先の（i）〜（iv）において言及したタンパク質様および非タンパク質様分子は、本明細書において集合的に「調整物質」と呼ばれる。 The proteinaceous molecule may be of natural, recombinant, or synthetic origin, including the fusion protein or the result of, for example, natural product screening. Non-proteinaceous molecules may be derived from natural sources, such as natural product screening, or may be chemically synthesized. For example, the present invention contemplates chemical analogs of transposable elements that can act as agonists or antagonists of sphingosine kinase localization. A chemical agonist need not necessarily be derived from a transposable element, but may share certain structural similarities. Alternatively, chemical agonists may be specifically designed to mimic or up-regulate certain physicochemical properties of transposable elements. For example, agonists include substances that induce an increase in calcium levels, for example calcium ionophores such as ionomycin. An antagonist may be any compound that can block, inhibit, or otherwise block sphingosine kinase localization. Antagonists include sphingosine kinase, a portion of sphingosine kinase, or antibodies (monoclonal and polyclonal antibodies) specific for transposable elements. The antagonist also expresses transposable element binding residues at positions 197 and 198 of SEQ ID NO: 2, thereby functioning as a competitive inhibitor of intracellular transposable element binding to wild-type sphingosine kinase. Designed sphingosine kinase peptides are included. Other examples of antagonists include substances that reduce intracellular free calcium levels, eg calcium chelators such as BAPTA or MAPTAM, or antagonists of the translocation factor itself such as W7 which is an antagonist of calmodulin. Expression regulation may be performed using antigens, RNA, ribosomes, DNAzymes, RNA aptamers, or molecules suitable for use in co-suppression. The proteinaceous and non-proteinaceous molecules mentioned in (i)-(iv) above are collectively referred to herein as “modulators”.

「転位因子」という言及は、スフィンゴシンキナーゼに結合して、細胞膜へのその細胞内局在を促進する任意の分子に対する言及であると意図されると理解すべきである。例えば、カルモジュリン、カルミリン（calmyrin）、または他のカルモジュリン関連タンパク質を用いてもよい。 It should be understood that reference to “translocation factor” is intended to be a reference to any molecule that binds to sphingosine kinase and promotes its subcellular localization to the cell membrane. For example, calmodulin, calmyrin, or other calmodulin-related proteins may be used.

本明細書において先に定義した調整物質のスクリーニングは、スフィンゴシンキナーゼまたはその機能的同等物もしくは誘導体を発現する細胞を物質に接触させる段階、およびスフィンゴシンキナーゼの細胞膜への局在の調整に関してスクリーニングする段階が含まれるがそれらに限定されるわけではない、いくつかの適した方法の任意の一つによって行うことができる。これは、スフィンゴシンキナーゼの局在を直接分析することによって、または細胞増殖のような下流の事象を分析することによって行うことができる。そのような調整の検出は、ウェスタンブロッティング、電気泳動移動度シフトアッセイおよび／またはルシフェラーゼ、CAT、増殖アッセイ等のようなスフィンゴシンキナーゼ活性のレポーターの読み取りのような技術を利用して行うことができる。 Screening for modulators as defined herein above comprises contacting cells expressing sphingosine kinase or a functional equivalent or derivative thereof with the substance, and screening for modulation of sphingosine kinase localization in the cell membrane Can be performed by any one of several suitable methods, including but not limited to: This can be done by directly analyzing the localization of sphingosine kinase or by analyzing downstream events such as cell proliferation. Detection of such modulation can be performed using techniques such as Western blotting, electrophoretic mobility shift assays and / or reporter readings of sphingosine kinase activity such as luciferase, CAT, proliferation assays and the like.

スフィンゴシンキナーゼ遺伝子またはその機能的同等物もしくは誘導体は、試験の被験者である細胞において天然に存在してもよく、または試験の目的のための宿主細胞にトランスフェクトされていてもよいと理解すべきである。さらに、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子が細胞にトランスフェクトされる程度に、その分子は、全スフィンゴシンキナーゼ遺伝子を含んでもよく、またはスフィンゴシンキナーゼ発現産物の局在を調節する部分のような、遺伝子の一部を単に含んでもよい。 It should be understood that the sphingosine kinase gene or functional equivalent or derivative thereof may be naturally occurring in the cell being the subject of the test or may have been transfected into a host cell for the purpose of the test. is there. In addition, to the extent that the sphingosine kinase nucleic acid molecule is transfected into the cell, the molecule may contain the entire sphingosine kinase gene, or a portion of the gene, such as a portion that regulates the localization of the sphingosine kinase expression product. It may simply be included.

もう一つの例において、検出の主題は、スフィンゴシンキナーゼ自身よりむしろ、下流のスフィンゴシンキナーゼ調節標的（例えば、スフィンゴシン-1-ホスフェート）となりうる。さらにもう一つの例には、最小のレポーターにライゲーションしたスフィンゴシンキナーゼ局在関連結合部位が含まれる。もう一つの例において、スフィンゴシンキナーゼ局在の調整は、宿主細胞の増殖の調整に関するスクリーニングによって検出することができる。これは、スフィンゴシンキナーゼ局在の調整がそれ自体、検出の主題ではない間接的なシステムの例である。むしろ、細胞膜局在スフィンゴシンキナーゼがその発現を調節する分子の調整をモニターする。これらの方法は、合成、コンビナトリアル、化学、および天然物ライブラリを含むタンパク質様または非タンパク質様物質のような推定の調整物質のハイスループットスクリーニングを行うためのメカニズムを提供する。 In another example, the subject of detection can be a downstream sphingosine kinase regulatory target (eg, sphingosine-1-phosphate) rather than sphingosine kinase itself. Yet another example includes a sphingosine kinase localization-related binding site ligated to a minimal reporter. In another example, modulation of sphingosine kinase localization can be detected by screening for modulation of host cell proliferation. This is an example of an indirect system where modulation of sphingosine kinase localization is not itself a subject of detection. Rather, cell membrane-localized sphingosine kinase monitors the modulation of the molecule that regulates its expression. These methods provide a mechanism for performing high-throughput screening of putative modulators such as proteinaceous or non-proteinaceous materials including synthetic, combinatorial, chemical, and natural product libraries.

本発明の方法に従って利用される物質は、任意の適した形であってもよい。例えば、タンパク質様物質は、様々な程度にグリコシル化または非グリコシル化、燐酸化または脱燐酸化されてもよく、および／またはアミノ酸のようなタンパク質、脂質、糖質、または他のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に融合、連結、結合、またはそうでなければ会合した広範囲の他の分子を含んでもよい。同様に、本発明の非タンパク質様分子はまた任意の適した形であってもよい。本明細書に記述のタンパク質様および非タンパク質様物質はいずれも、他の任意のタンパク質様または非タンパク質様分子に連結、結合、またはそうでなければ会合してもよい。例えば、本発明の一つの態様において、物質は、特異的組織のような局在領域へのそのターゲティングを許容する分子に会合する。 The material utilized according to the method of the present invention may be in any suitable form. For example, proteinaceous materials may be glycosylated or non-glycosylated, phosphorylated or dephosphorylated to varying degrees, and / or proteins, lipids, carbohydrates, or other peptides, polypeptides such as amino acids Or a wide range of other molecules fused, linked, bound, or otherwise associated with the protein. Similarly, the non-proteinaceous molecules of the present invention may also be in any suitable form. Any of the proteinaceous and non-proteinaceous materials described herein may be linked, bound, or otherwise associated with any other proteinaceous or non-proteinaceous molecule. For example, in one embodiment of the invention, the substance is associated with a molecule that allows its targeting to a localized region, such as a specific tissue.

「発現」という用語は、核酸分子の転写および翻訳に対する言及である。「発現産物」という言及は、核酸分子の転写および翻訳から生成された産物に対する言及である。「調整」という言及は、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに対する言及であると理解すべきである。 The term “expression” is a reference to the transcription and translation of a nucleic acid molecule. Reference to “expression product” is a reference to a product generated from transcription and translation of a nucleic acid molecule. Reference to “adjustment” should be understood as a reference to up-regulation or down-regulation.

本明細書に記述の分子の「誘導体」（例えば、スフィンゴシンキナーゼまたは他のタンパク質様または非タンパク質様物質）には、天然または非天然起源からの断片、部分、一部、または変種が含まれる。非天然起源には、例えば組換え型または合成起源が含まれる。「組換え型起源」は、そこから本発明の分子が採取される細胞起源が遺伝子改変されていることを意味する。これは、例えばその特定の細胞起源による産生速度および容積を増加またはそうでなければ増強するために起こってもよい。部分または断片には、例えば分子の活性領域が含まれる。誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失、または置換に由来してもよい。アミノ酸挿入誘導体には、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合体と共に、単一または複数のアミノ酸の配列内挿入が含まれる。挿入アミノ酸配列変種は、一つまたは複数のアミノ酸残基がタンパク質における既定の部位に導入されている変種であるが、得られた産物の適したスクリーニングによってランダム挿入も同様に可能である。欠失変種は、配列からの一つまたは複数のアミノ酸の除去を特徴とする。置換アミノ酸変種は、配列における少なくとも一つの残基が除去されて、その場に異なる残基が挿入されている変種である。アミノ酸配列に対する付加には、先に詳述したように、他のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質との融合体が含まれる。 “Derivatives” (eg, sphingosine kinase or other proteinaceous or nonproteinaceous material) of the molecules described herein include fragments, portions, parts, or variants from natural or non-natural sources. Non-natural sources include, for example, recombinant or synthetic sources. “Recombinant origin” means that the cellular origin from which the molecule of the invention is taken has been genetically modified. This may occur, for example, to increase or otherwise enhance the production rate and volume due to that particular cellular origin. The part or fragment includes, for example, the active region of the molecule. Derivatives may be derived from amino acid insertions, deletions, or substitutions. Amino acid insertional derivatives include intrasequence insertions of single or multiple amino acids, along with amino and / or carboxyl terminal fusions. An inserted amino acid sequence variant is a variant in which one or more amino acid residues are introduced at a pre-determined site in the protein, but random insertion is equally possible by appropriate screening of the resulting products. Deletion variants are characterized by the removal of one or more amino acids from the sequence. A substituted amino acid variant is a variant in which at least one residue in the sequence has been removed and a different residue inserted in its place. Additions to amino acid sequences include fusions with other peptides, polypeptides, or proteins, as detailed above.

誘導体にはまた、ペプチド、ポリペプチド、または他のタンパク質様もしくは非タンパク質様分子に融合した完全なタンパク質の特定のエピトープまたは一部を有する断片が含まれる。例えば、スフィンゴシンキナーゼまたはその誘導体を、細胞膜局在を促進するために、アミノ酸10個のlckタンパク質チロシンキナーゼ二重アシル化モチーフのような分子に融合してもよい。本明細書において企図される分子の類似体には、側鎖への改変、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質合成の際に非天然アミノ酸および／またはその誘導体を組み入れること、ならびにクロスリンク剤およびタンパク質様分子またはその類似体に対してコンフォメーション上の拘束を与える他の方法を用いることが含まれるがそれらに限定されるわけではない。 Derivatives also include fragments having specific epitopes or portions of the complete protein fused to peptides, polypeptides, or other proteinaceous or non-proteinaceous molecules. For example, sphingosine kinase or a derivative thereof may be fused to a molecule such as a 10 amino acid lck protein tyrosine kinase double acylation motif to promote cell membrane localization. Analogs of molecules contemplated herein include side chain modifications, incorporation of unnatural amino acids and / or derivatives thereof during peptide, polypeptide, or protein synthesis, and crosslinkers and protein-like This includes, but is not limited to, using other methods that provide conformational constraints on the molecule or analog thereof.

本発明の方法に従って利用してもよい核酸配列の誘導体も同様に、単一または複数のヌクレオチド置換、欠失、および／または付加に由来してもよい。本発明において利用される核酸分子の誘導体には、オリゴヌクレオチド、PCRプライマー、アンチセンス分子、核酸分子の共抑制および融合において用いるために適した分子が含まれる。核酸配列の誘導体にはまた、縮重変種が含まれる。 Derivatives of nucleic acid sequences that may be utilized in accordance with the methods of the present invention may also be derived from single or multiple nucleotide substitutions, deletions, and / or additions. Nucleic acid molecule derivatives utilized in the present invention include oligonucleotides, PCR primers, antisense molecules, molecules suitable for use in co-suppression and fusion of nucleic acid molecules. Nucleic acid sequence derivatives also include degenerate variants.

スフィンゴシンキナーゼの「変種」は、変種であるそのスフィンゴシンキナーゼの型の機能的活性の少なくともいくつかを示す分子を意味すると理解すべきである。変種は、如何なる形であってもよく、天然または非天然であってもよい。変異体分子は、改変された機能的活性を示す分子である。 A “variant” of a sphingosine kinase should be understood to mean a molecule that exhibits at least some of the functional activities of that variant sphingosine kinase type. The variant may be in any form, natural or non-natural. Variant molecules are molecules that exhibit altered functional activity.

「相同体」とは、分子が、本発明の方法に従って処置される種以外の種に由来することを意味する。 “Homolog” means that the molecule is derived from a species other than the species to be treated according to the methods of the invention.

化学および機能的同等物は、機能的同等物が、化学合成された、または天然物スクリーニングのようなスクリーニングプロセスを通して同定された分子のような任意の起源に由来してもよい、本発明の分子の任意の一つまたは複数の機能的活性を示す分子であると理解すべきである。例えば、化学または機能的同等物は、コンビナトリアルケミストリー、組換え型ライブラリのハイスループットスクリーニング、または天然物スクリーニングの結果のような周知の方法を利用して設計および／または同定することができる。これらの方法はまた、本発明の方法において有用である任意の調整物質をスクリーニングするために利用してもよい。 A chemical and functional equivalent is a molecule of the invention in which the functional equivalent may be derived from any source, such as a molecule that has been chemically synthesized or identified through a screening process such as natural product screening. It should be understood that the molecule exhibits any one or more functional activities. For example, chemical or functional equivalents can be designed and / or identified utilizing well-known methods such as combinatorial chemistry, high-throughput screening of recombinant libraries, or natural product screening results. These methods may also be utilized to screen for any modulators that are useful in the methods of the invention.

例えば、多数の特異的親基置換を有する有機分子を用いる低分子有機分子を含むライブラリをスクリーニングしてもよい。一般的な合成スキームは公表された方法に従ってもよい（例えば、Bunin et al.(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708〜4712；De Witt et al.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6909〜6913）。簡単に説明すると、それぞれの連続的合成段階において、複数の異なる選択された置換基の一つを、選択されたサブセットの試験管のアレイのそれぞれに加えて、試験管サブセットの選択は、ライブラリを作製するために用いられる異なる置換基の考えられる全ての順列を作製するように行われる。一つの適した順列戦略は、米国特許第5,763,263号に概要される。 For example, a library containing small organic molecules using organic molecules with a large number of specific parent group substitutions may be screened. General synthetic schemes may follow published methods (eg, Bunin et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4708-4712; De Witt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6909-6913). Briefly, in each successive synthesis step, one of a plurality of different selected substituents is added to each of the selected subset of the tube arrays, and the selection of the tube subsets comprises This is done to create all possible permutations of the different substituents used to make. One suitable permutation strategy is outlined in US Pat. No. 5,763,263.

生物活性化合物を検索するためにランダム有機分子のコンビナトリアルケミストリーを用いることに現在、広い関心がある（例えば、米国特許第5,763,263号を言及されたい）。このタイプのライブラリをスクリーニングすることによって発見されたリガンドは、天然のリガンドを模倣するもしくは遮断するために、または生物学的標的の天然に存在するリガンドと干渉するために有用である可能性がある。本発明の状況において、例えばそれらをスフィンゴシンキナーゼ転位アゴニストまたはアンタゴニストを開発するための開始点として用いてもよい。スフィンゴシンキナーゼまたはその関連する部分は、本発明に従って、様々な固相または液相合成法によって形成された組み合わせライブラリにおいて用いてもよい（例えば、米国特許第5,763,263号およびそこに引用されている引用文献を言及されたい）。米国特許第5,753,187号に開示されている技術を用いることによって、何百万もの新しい化学および／または生物化合物が、数週間未満でルーチンとしてスクリーニングされる可能性がある。同定された多数の化合物の中で、適当な生物活性を示す化合物のみをさらに分析する。 There is currently wide interest in using combinatorial chemistry of random organic molecules to search for bioactive compounds (see, eg, US Pat. No. 5,763,263). Ligands discovered by screening this type of library may be useful to mimic or block natural ligands or to interfere with naturally occurring ligands of biological targets . In the context of the present invention, for example, they may be used as a starting point for developing sphingosine kinase translocation agonists or antagonists. Sphingosine kinase or related portions thereof may be used in accordance with the present invention in combinatorial libraries formed by various solid or liquid phase synthesis methods (eg, US Pat. No. 5,763,263 and references cited therein). Please mention). Millions of new chemical and / or biological compounds can be routinely screened in less than a few weeks by using the technology disclosed in US Pat. No. 5,753,187. Of the large number of identified compounds, only those compounds that exhibit the appropriate biological activity are further analyzed.

ハイスループットライブラリスクリーニング法に関して、生体分子、高分子複合体、または細胞のような選択された生体物質と特異的に相互作用することができるオリゴマーまたは低分子ライブラリ化合物を、先に記述した方法のような広範な周知の方法から当業者によって容易に選択されるコンビナトリアルライブラリ装置を利用してスクリーニングする。そのような方法において、ライブラリのそれぞれのメンバーを、選択された物質との特異的相互作用能に関してスクリーニングする。方法を実践するために、生物学的物質を化合物を含む試験管に採取して、各試験管において個々のライブラリ化合物と相互作用させる。相互作用は、望ましい相互作用の有無をモニターするために用いることができる検出可能なシグナルを産生するように設計される。好ましくは、生物学的物質は、水溶液に存在して、望ましい相互作用に応じてさらなる条件を適合させる。検出は、例えば、基質の検出のための任意の周知の機能的または非機能的に基づく方法によって行ってもよい。 For high-throughput library screening methods, oligomeric or small molecule library compounds that can specifically interact with selected biological materials such as biomolecules, macromolecular complexes, or cells, like the methods described above. Screening is performed using a combinatorial library apparatus that is easily selected by those skilled in the art from a wide variety of well-known methods. In such a method, each member of the library is screened for the ability to specifically interact with the selected substance. To practice the method, biological material is collected in test tubes containing compounds and interacted with individual library compounds in each test tube. The interaction is designed to produce a detectable signal that can be used to monitor the presence or absence of the desired interaction. Preferably, the biological material is present in an aqueous solution to adapt further conditions depending on the desired interaction. Detection may be performed, for example, by any well-known functional or non-functional based method for substrate detection.

本明細書において企図されるスフィンゴシンキナーゼの「類似体」またはアゴニストもしくはアンタゴニスト物質には、側鎖に対する改変、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質合成の際の非天然アミノ酸および／または誘導体の組み入れ、ならびにクロスリンク剤および類似体にコンフォメーション上の拘束を与える他の方法の利用が含まれるがそれらに限定されるわけではない。そのような改変がとりうる特異的な型は、本発明の分子がタンパク質様または非タンパク質様であるか否かに依存するであろう。特定の改変の性質および／または適格性は、当業者によってルーチンとして決定することができる。 As contemplated herein, “analogues” or agonist or antagonist substances of sphingosine kinase include modifications to side chains, incorporation of unnatural amino acids and / or derivatives during peptide, polypeptide, or protein synthesis, and cross-linking. This includes, but is not limited to, the use of other methods of imparting conformational constraints to linking agents and analogs. The specific type that such modifications can take will depend on whether the molecule of the invention is proteinaceous or non-proteinaceous. The nature and / or eligibility of a particular modification can be routinely determined by one skilled in the art.

例えば、本発明によって企図される側鎖改変の例には、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化後のNaBH4による還元；メチルアセチミデートによるアミド化；無水酢酸によるアシル化；シアネートによるアミノ基のカルバモイル化；2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；ならびにピリドキサル-5-燐酸によるリジンのピリドキシル化の後にNaBH₄による還元が含まれる。 For example, examples of side chain modifications contemplated by the present invention include reduction with NaBH4 after reductive alkylation by reaction with an aldehyde; amidation with methyl acetylimidate; acylation with acetic anhydride; Carbamoylation; trinitrobenzylation of amino groups with 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS); acylation of amino groups with succinic anhydride and tetrahydrophthalic anhydride; and pyridoxyl of lysine with pyridoxal-5-phosphate Reduction with NaBH ₄ is included after conversion.

アルギニン残基のグアニジン基は、2,3-ブタジエン、フェニルグリオキサルおよびグリオキサルのような試薬との複素環縮合産物の形成によって改変してもよい。 The guanidine group of arginine residues may be modified by formation of heterocyclic condensation products with reagents such as 2,3-butadiene, phenylglyoxal and glyoxal.

カルボキシル基は、O-アシルイソウレア形成によるカルボジイミド活性化後の例えば対応するアミドへの誘導体化によって改変してもよい。 The carboxyl group may be modified, for example, by derivatization to the corresponding amide after carbodiimide activation by O-acylisourea formation.

スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；4-クロロ水銀安息香酸、4-クロロ水銀フェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール、および他の水銀剤を用いる水銀誘導体の形成；アルカリpHでのシアネートによるカルバモイル化、のような方法によって改変してもよい。 Sulfhydryl groups are carboxymethylated with iodoacetic acid or iodoacetamide; performic acid oxidation to cysteic acid; formation of mixed disulfides with other thiol compounds; reaction with maleimide, maleic anhydride or other substituted maleimides; Formation of mercury derivatives using mercury benzoic acid, 4-chloromercury phenylsulfonic acid, phenylmercury chloride, 2-chloromercury-4-nitrophenol, and other mercury agents; carbamoylation with cyanate at alkaline pH, etc. It may be modified by the method.

トリプトファン残基は、例えば、N-ブロモスクシニミドによる酸化、または2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドまたはハロゲン化スルフェニルによるインドール環のアルキル化によって改変してもよい。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化によって改変して3-ニトロチロシン誘導体を形成してもよい。 Tryptophan residues may be modified, for example, by oxidation with N-bromosuccinimide, or alkylation of the indole ring with 2-hydroxy-5-nitrobenzyl bromide or halogenated sulfenyl. On the other hand, tyrosine residues may be modified by nitration with tetranitromethane to form 3-nitrotyrosine derivatives.

ヒスチジン残基のイミダゾール環の改変は、ヨード酢酸誘導体のアルキル化またはジエチルピロカーボネートによるN-カルボエトキシル化によって行ってもよい。 Modification of the imidazole ring of the histidine residue may be accomplished by alkylation of iodoacetic acid derivatives or N-carboethoxylation with diethylpyrocarbonate.

タンパク質合成の際に非天然アミノ酸および誘導体を組み入れる例には、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニン、および／またはアミノ酸のD-異性体を用いることが含まれるがそれらに限定されるわけではない。本明細書において企図される非天然アミノ酸の一覧を表1に示す。 Examples of incorporating unnatural amino acids and derivatives during protein synthesis include norleucine, 4-aminobutyric acid, 4-amino-3-hydroxy-5-phenylpentanoic acid, 6-aminohexanoic acid, t-butylglycine, norvaline, Including, but not limited to using phenylglycine, ornithine, sarcosine, 4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoic acid, 2-thienylalanine, and / or the D-isomer of an amino acid. . A list of unnatural amino acids contemplated herein is shown in Table 1.

3Dコンフォメーションを安定化させるために、例えばn＝1〜n＝6の(CH2)_nスペーサー基を有する二機能イミドエステル、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシニミドエステル、およびN-ヒドロキシスクシニミドのようなアミノ反応部分ともう一つの基特異的反応部分とを通常含むヘテロ二機能試薬のような、ホモ二機能クロスリンク剤を用いてクロスリンク剤を用いることができる。 In order to stabilize the 3D conformation, for example, bifunctional imide esters, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters and N-hydroxysuccinimides having (CH2) _n spacer groups of n = 1 to n = 6 A crosslinker can be used using a homobifunctional crosslinker, such as a heterobifunctional reagent that typically includes an amino reactive moiety such as and another group specific reactive moiety.

本発明は、任意の一つの理論または作用様式に限定されないが、部位特異的変異誘発、タンパク質分解、およびペプチド相互作用分析を利用して、ヒトスフィンゴシンキナーゼ（SEQ ID NO：2）の191〜206位の領域に及ぶ残基が、細胞質から細胞質膜へのスフィンゴシンキナーゼの転位の誘導に関係しているスフィンゴシンキナーゼ部位の一つであることが決定された。特に、ヒトスフィンゴシンキナーゼ1の残基Phe197およびLeu198は、この相互作用において重要に関係していることが決定されている。なおさらに、ヒトスフィンゴシンキナーゼ2分子の対応するおよび保存された領域が、対応する機能的活性を示すことも決定されている。ヒトスフィンゴシンキナーゼ1の変異型（Phe197AlaおよびLeu198Gln）を用いて、hSK1燐酸化および触媒的活性化はこれらの変異体分子において不変のままであるが、hSK1のアゴニストによる細胞質から細胞質膜への転位は消失することが示されている。 The present invention is not limited to any one theory or mode of action, but utilizes site-directed mutagenesis, proteolysis, and peptide interaction analysis to 191-206 of human sphingosine kinase (SEQ ID NO: 2). The residue spanning the region was determined to be one of the sphingosine kinase sites involved in the induction of sphingosine kinase translocation from the cytoplasm to the cytoplasmic membrane. In particular, residues Phe197 and Leu198 of human sphingosine kinase 1 have been determined to be importantly involved in this interaction. Still further, it has also been determined that the corresponding and conserved regions of the human sphingosine kinase 2 molecule exhibit corresponding functional activity. Using mutant forms of human sphingosine kinase 1 (Phe197Ala and Leu198Gln), hSK1 phosphorylation and catalytic activation remain unchanged in these mutant molecules, but translocation from the cytoplasm to the cytoplasmic membrane by hSK1 agonists It has been shown to disappear.

スフィンゴシンキナーゼは、細胞内シグナル伝達経路の機能にとって中心的な分子であることから、本発明の方法は、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達によって調節または制御される細胞活性を調整する手段を提供する。例えば、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路は、炎症、細胞のトランスフォーメーション、アポトーシス、細胞増殖、サイトカイン、ケモカイン、eNOSのような炎症メディエーターの産生のアップレギュレーション、および接着分子発現のアップレギュレーションに至る活性のような細胞活性を調節することが知られている。アップレギュレーションは、例えば、腫瘍壊死因子αおよびインターロイキン1、エンドトキシンのような炎症性サイトカイン、酸化または改変脂質、放射線または組織損傷を含む多くの刺激によって誘導される可能性がある。この点において、「細胞活性を調整する」という言及は、一つまたは複数のケモカイン産生、サイトカイン産生または細胞増殖のような、しかしこれらに限定されないスフィンゴシンキナーゼシグナル伝達に従って細胞が行うことができる活性の任意の一つまたは複数をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることに対する言及である。好ましい方法は、スフィンゴシンキナーゼ活性をダウンレギュレートし、それによって望ましくない細胞活性をダウンレギュレートすることであり、最も好ましくは望ましくない細胞増殖をダウンレギュレートすることであるが、本発明はそれにもかかわらず、特定の状況において望ましい可能性がある細胞活性をアップレギュレートすることを含むと理解すべきである。 Since sphingosine kinase is a central molecule for the function of intracellular signaling pathways, the methods of the present invention provide a means of modulating cellular activity that is regulated or controlled by sphingosine kinase signaling. For example, sphingosine kinase signaling pathways such as activity leading to inflammation, cell transformation, apoptosis, cell proliferation, upregulation of production of inflammatory mediators such as cytokines, chemokines, eNOS, and upregulation of adhesion molecule expression It is known to modulate cellular activity. Upregulation can be induced by a number of stimuli including, for example, tumor necrosis factor alpha and interleukin 1, inflammatory cytokines such as endotoxin, oxidized or modified lipids, radiation or tissue damage. In this regard, reference to “modulate cell activity” refers to an activity that a cell can perform according to sphingosine kinase signaling, such as, but not limited to, one or more chemokine production, cytokine production or cell proliferation. A reference to up-regulating or down-regulating any one or more. A preferred method is to down-regulate sphingosine kinase activity and thereby down-regulate unwanted cell activity, most preferably down-regulate unwanted cell proliferation, although the present invention also Regardless, it should be understood to include upregulating cellular activity that may be desirable in certain situations.

したがって、本発明のさらにもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階が、細胞活性をアップレギュレートし、スフィンゴシン細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が、該細胞活性をダウンレギュレートする、ヒトスフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整するために十分な時間および条件で細胞を物質の有効量に接触させる段階を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ媒介細胞活性を調整する方法を提供する。 Accordingly, yet another aspect of the present invention is that the step of up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates cell activity and the step of down-regulating sphingosine cell membrane localization reduces the cell activity. A method of modulating human sphingosine kinase mediated cellular activity comprising the step of contacting a cell with an effective amount of a substance for a time and under conditions sufficient to regulate the subcellular localization of human sphingosine kinase to regulate.

好ましくは、物質は、スフィンゴシンキナーゼ燐酸化を調整することによって局在を調節する以外の手段によって機能する。 Preferably, the substance functions by means other than modulating localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation.

より好ましくは、本発明は、相互作用を誘導またはアゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートし、該相互作用にアンタゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートし、ここで物質が、スフィンゴシンキナーゼ燐酸化を調整することによって、局在を調節する以外の手段によって機能する、SEQ ID NO：2の残基191〜206位に対応する一つまたは複数のアミノ酸と転位因子との相互作用を調整するために十分な時間および条件で細胞を物質の有効量に接触させる段階を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ媒介細胞活性を調整する方法を提供する。 More preferably, the present invention provides that the step of inducing or agonizing the interaction up-regulates sphingosine kinase cell membrane localization, and the step of antagonizing the interaction down-regulates sphingosine kinase cell membrane localization. Wherein the substance functions by means other than modulating localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation, and one or more amino acids corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2 A method is provided for modulating human sphingosine kinase mediated cellular activity comprising contacting a cell with an effective amount of a substance for a time and under conditions sufficient to modulate an interaction with a translocation factor.

より好ましくは、アミノ酸は、Phe197またはLeu198の一つまたは双方であり、スフィンゴシンキナーゼは、ヒトスフィンゴシンキナーゼ1またはスフィンゴシンキナーゼ2である。 More preferably, the amino acid is one or both of Phe197 or Leu198, and the sphingosine kinase is human sphingosine kinase 1 or sphingosine kinase 2.

これらの態様に従って、細胞活性は好ましくは細胞生長であり、さらにより好ましくは新生物細胞の生長である。 According to these embodiments, the cellular activity is preferably cell growth, and even more preferably neoplastic cell growth.

最も好ましくは、新生物細胞生長は、スフィンゴシンキナーゼの細胞膜への転位にアンタゴニスト作用するまたはそうでなければダウンレギュレートすることによってダウンレギュレートされる。 Most preferably, neoplastic cell growth is downregulated by antagonizing or otherwise downregulating the translocation of sphingosine kinase to the cell membrane.

本発明のこの好ましい局面は任意の一つの理論または作用様式に限定されないが、スフィンゴシンキナーゼの腫瘍形成活性は、その異常な過剰発現に特に関連していることが決定されている。「過剰発現」とは、所定の細胞タイプに関して正常な生理的条件で発現されたレベルより高い機能的レベルへの細胞内スフィンゴシンキナーゼのアップレギュレーション、または任意の機能性レベルへのスフィンゴシンキナーゼレベルのアップレギュレーションを意味するが、アップレギュレーション事象は、本発明の細胞において天然に存在する生理学の効果のために起こった増加よりむしろ人工的に行われた事象である。しかし、それによってアップレギュレーションが行われる手段は、生理的経路を模倣するように求める人工的手段、例えばホルモンまたは他の刺激分子を導入することであってもよいと理解すべきである。したがって、本発明の状況において「発現する」という用語は、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の転写および翻訳の概念に限定されないと意図される。むしろ、この用語は、細胞において特定の時点で正常な生理的条件で見いだされるスフィンゴシンキナーゼのより高い機能的レベルの確立である転帰に対する言及である（すなわち、この用語には、スフィンゴシンキナーゼレベルの天然に存在しない増加およびスフィンゴシンキナーゼの細胞内濃度自身の単なる増加とは反対の既存のスフィンゴシンキナーゼ濃度の活性レベルの増加が含まれる）。 Although this preferred aspect of the invention is not limited to any one theory or mode of action, it has been determined that the oncogenic activity of sphingosine kinase is particularly associated with its abnormal overexpression. “Overexpression” means up-regulation of intracellular sphingosine kinase to a functional level higher than that expressed under normal physiological conditions for a given cell type, or upregulation of sphingosine kinase level to any functional level By upregulation, an upregulation event is an artificially generated event rather than an increase that occurs due to the naturally occurring physiological effects in the cells of the invention. However, it should be understood that the means by which up-regulation takes place may be the introduction of artificial means that seek to mimic physiological pathways, such as hormones or other stimulatory molecules. Thus, the term “expressed” in the context of the present invention is not intended to be limited to the concept of transcription and translation of the sphingosine kinase gene. Rather, the term is a reference to an outcome that is the establishment of a higher functional level of sphingosine kinase found in cells at normal physiological conditions at a particular time (i.e., the term includes the natural level of sphingosine kinase level). Increase in activity levels of existing sphingosine kinase concentrations, as opposed to increases that are not present and mere increases in the intracellular concentration of sphingosine kinase itself).

本発明は任意の一つの理論または作用様式に限定されないが、脂質キナーゼであるスフィンゴシンキナーゼによって刺激されたシグナル伝達カスケードが、腫瘍形成において主要な役割を果たすことは公知である。具体的には、細胞における過剰発現によるスフィンゴシンキナーゼの構成的活性化は、細胞のトランスフォーメーションおよび腫瘍の形成を引き起こし、それによって野生型ヒト脂質キナーゼがそれ自身発癌性であることを示している。さらに、スフィンゴシンキナーゼはまたRas誘導トランスフォーメーションにも関係しているが、v-Src誘導トランスフォーメーションには関係していない。最後に、スフィンゴシンキナーゼ阻害剤を用いてスフィンゴシンキナーゼ活性を阻害すると、スフィンゴシンキナーゼを過剰発現する細胞のみならず、Rasトランスフォーム細胞においてもトランスフォーメーションを逆転させる。この点において、細胞の生長を「調整する」という言及は、細胞の生長をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることに対する言及であると理解すべきである。より具体的には、「ダウンレギュレートする」という言及は、細胞の生長の一つまたは複数の局面を阻止、低減、またはそうでなければ阻害すること（細胞のアポトーシスを誘導する、またはそうでなければ細胞を殺すことを含む）に対する言及であると理解すべきであるが、「アップレギュレートする」という言及は、逆の意味を有すると理解すべきであり、新生物細胞の形成／細胞のトランスフォーメーション（すなわち、正常な細胞の新生物細胞への変換）の誘導が含まれる。細胞の「生長」という言及は、その最も広い意味において、細胞分裂／増殖の全ての局面に対する言及が含まれると理解すべきである。 Although the present invention is not limited to any one theory or mode of action, it is known that the signaling cascade stimulated by the lipid kinase sphingosine kinase plays a major role in tumorigenesis. Specifically, constitutive activation of sphingosine kinase by overexpression in cells causes cell transformation and tumor formation, indicating that wild-type human lipid kinase is itself carcinogenic. Furthermore, sphingosine kinase is also involved in Ras-induced transformation but not in v-Src-induced transformation. Finally, inhibition of sphingosine kinase activity using a sphingosine kinase inhibitor reverses transformation not only in cells that overexpress sphingosine kinase but also in Ras transformed cells. In this regard, reference to “modulate” cell growth should be understood as a reference to up-regulating or down-regulating cell growth. More specifically, reference to “down-regulate” refers to preventing, reducing, or otherwise inhibiting one or more aspects of cell growth (inducing or otherwise inducing cell apoptosis). Reference to “up-regulate” should be understood to have the opposite meaning, neoplastic cell formation / cell Induction of transformation (ie, conversion of normal cells to neoplastic cells). It should be understood that reference to “growth” of a cell, in its broadest sense, includes reference to all aspects of cell division / proliferation.

本発明の状況において「細胞」に対する言及は、その起源にかかわらず、任意の型またはタイプの細胞に対する言及であると理解すべきである。例えば、細胞は、天然に存在する細胞であってもよく、または凍結／解凍されている、インビトロもしくはインビボのいずれかで遺伝的、生化学的、もしくはそうでなければ改変されている細胞（例えば、異なる二つの細胞タイプの融合の結果である細胞を含む）のようなインビトロまたはインビボのいずれかで操作、改変、もしくはそうでなければ処置されてもよい。「新生物細胞」は、制御されていない増殖を示す細胞を意味する。新生物細胞は、良性細胞または悪性細胞であってもよい。好ましくは、細胞は悪性である。一つの特定の態様において、新生物細胞は、乳腺（乳房）、大腸、胃、肺、脳、骨、食道、または膵臓に由来する悪性細胞のような、その増殖が固形腫瘍を形成するであろう悪性細胞である。 In the context of the present invention, reference to “cell” should be understood as a reference to any type or type of cell, regardless of its origin. For example, the cell may be a naturally occurring cell, or a cell that has been frozen / thawed, either genetically, biochemically or otherwise modified either in vitro or in vivo (eg, May be manipulated, modified, or otherwise treated either in vitro or in vivo, including cells that are the result of fusion of two different cell types. "Neoplastic cell" means a cell that exhibits uncontrolled proliferation. Neoplastic cells may be benign cells or malignant cells. Preferably the cell is malignant. In one particular embodiment, the neoplastic cell is such that its growth forms a solid tumor, such as a malignant cell derived from the mammary gland (breast), large intestine, stomach, lung, brain, bone, esophagus, or pancreas. It is a waxy malignant cell.

好ましくは新生物細胞は、大腸、胃、肺、脳、骨、食道、膵臓、乳腺（乳房）、卵巣、または子宮に由来する悪性細胞である。 Preferably the neoplastic cell is a malignant cell derived from the large intestine, stomach, lung, brain, bone, esophagus, pancreas, mammary gland (breast), ovary, or uterus.

本発明の方法に従って処置される細胞はエクスビボまたはインビボに存在してもよいと理解すべきである。「エクスビボ」とは、その生長の調整がインビトロで得られる細胞が被験者の体から除去されていることを意味する。例えば、細胞は、スフィンゴシンキナーゼ活性をアップレギュレートすることによって不死化される非新生物細胞であってもよい。本発明の好ましい局面に従って、細胞は、インビボに存在する悪性細胞のような（大腸癌または乳癌のような）新生物細胞であってもよく、その生長のダウンレギュレーションは、スフィンゴシンキナーゼ機能的活性のレベルをダウンレギュレートするために、本発明の方法をインビボで適用することによって得られるであろう。同様に、悪性結腸直腸細胞のようなインビボに存在する特異的細胞タイプについて言及する場合、この細胞は患者の結腸直腸領域に存在してもよいと理解すべきである。結腸直腸原発悪性疾患が転移すれば、被験者の結腸直腸細胞は、患者の体のもう一つの領域に存在してもよい。例えば、これは、例えば肝臓、リンパ節、または骨に存在する二次腫瘍（転位）の一部を形成してもよい。 It should be understood that cells treated according to the methods of the invention may be present ex vivo or in vivo. “Ex vivo” means that cells whose growth regulation is obtained in vitro have been removed from the subject's body. For example, the cell may be a non-neoplastic cell that is immortalized by upregulating sphingosine kinase activity. In accordance with a preferred aspect of the present invention, the cell may be a neoplastic cell (such as colon cancer or breast cancer), such as a malignant cell present in vivo, whose growth down-regulation is associated with sphingosine kinase functional activity. In order to down-regulate levels, it will be obtained by applying the method of the invention in vivo. Similarly, when referring to specific cell types present in vivo, such as malignant colorectal cells, it should be understood that the cells may be present in the colorectal region of the patient. If the primary colorectal malignancy metastasizes, the subject's colorectal cells may be present in another region of the patient's body. For example, it may form part of a secondary tumor (translocation), eg present in the liver, lymph nodes, or bone.

好ましい方法は、例えば癌の治療的処置として新生物細胞の増殖をダウンレギュレートするが、同様に細胞の生長をアップレギュレートすることが望ましい可能性がある。例えば、インビトロで細胞の集団を不死化する、インビトロでの長期使用を促進する、または例えば皮膚のような組織のインビトロ生長を促進することが望ましい可能性がある。もう一つの例において、低血清条件での生長能のような、より選好性の低い生長条件に細胞株を適合させることが有用となる可能性がある。 A preferred method, for example, downregulates neoplastic cell proliferation as a therapeutic treatment for cancer, but it may be desirable to upregulate cell growth as well. For example, it may be desirable to immortalize a population of cells in vitro, promote long-term use in vitro, or promote in vitro growth of tissues such as skin. In another example, it may be useful to adapt the cell line to less preferred growth conditions, such as the ability to grow under low serum conditions.

本発明のさらなる局面は、疾患状態の処置および／または予防に関連して本発明を用いることに関する。本発明は、他の任意の理論または作用様式に限定されないが、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路によって調節される広範囲の細胞機能活性により、スフィンゴシンキナーゼ機能の調節は、健康および病的状態の生理的プロセスの双方のあらゆる局面の肝要な成分となる。したがって、本発明の方法は、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路を通して調節される異常なまたはそうでなければ望ましくない細胞機能的活性を調整するための貴重なツールを提供する。 A further aspect of the invention relates to the use of the invention in connection with the treatment and / or prevention of disease states. The present invention is not limited to any other theory or mode of action, but due to the wide range of cellular functional activities regulated by the sphingosine kinase signaling pathway, the regulation of sphingosine kinase function is a physiological process of health and pathology. It is a vital component of both aspects of both. Thus, the methods of the present invention provide a valuable tool for modulating abnormal or otherwise undesirable cellular functional activities that are regulated through the sphingosine kinase signaling pathway.

したがって、本発明のさらにもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階が、細胞活性をアップレギュレートし、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が該細胞活性をダウンレギュレートする、スフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整するために十分な時間および条件で哺乳動物に物質の有効量を投与する段階を含む、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当なスフィンゴシンキナーゼ媒介細胞活性を特徴とする、哺乳動物における病態の処置および／または予防のための方法を対象とする。 Therefore, yet another aspect of the present invention is that the step of up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates cell activity and the step of down-regulating sphingosine kinase cell membrane localization reduces the cell activity. Abnormal, undesirable or otherwise inappropriate, comprising administering an effective amount of the substance to a mammal for a time and under conditions sufficient to regulate and regulate the subcellular localization of sphingosine kinase It is directed to methods for the treatment and / or prevention of disease states in mammals characterized by sphingosine kinase-mediated cellular activity.

本発明のなおもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階が、スフィンゴシンキナーゼ活性をアップレギュレートし、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が該スフィンゴシンキナーゼ活性をダウンレギュレートする、スフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整するために十分な時間および条件で哺乳動物に物質の有効量を投与する段階を含む、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当なスフィンゴシンキナーゼ機能的活性を特徴とする、哺乳動物における病態の処置および／または予防のための方法を対象とする。 Yet another aspect of the present invention is that the step of up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates sphingosine kinase activity and the step of down-regulating sphingosine kinase cell membrane localization reduces the sphingosine kinase activity. Abnormal, undesirable or otherwise inappropriate, comprising administering an effective amount of the substance to a mammal for a time and under conditions sufficient to regulate and regulate the subcellular localization of sphingosine kinase It is directed to methods for the treatment and / or prevention of disease states in mammals characterized by sphingosine kinase functional activity.

したがって、好ましい態様において、本発明は、相互作用を誘導またはアゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ膜局在をアップレギュレートし、該相互作用にアンタゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートし、ここで物質が、スフィンゴシンキナーゼ燐酸化を調整することによって局在を調節する以外の手段によって機能する、SEQ ID NO：2の残基191〜206位に対応する一つまたは複数のアミノ酸と転位因子との相互作用を調整するために十分な時間および条件で哺乳動物に物質の有効量を投与する段階を含む、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当なスフィンゴシンキナーゼ媒介細胞活性を特徴とする、哺乳動物における病態の処置および／または予防のための方法を対象とする。 Accordingly, in a preferred embodiment, the present invention provides that the step of inducing or agonizing an interaction up-regulates sphingosine kinase membrane localization and the step of antagonizing the interaction down-regulates sphingosine kinase cell membrane localization. One or more amino acids corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2, wherein the substance functions by means other than modulating localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation An abnormal, undesirable, or otherwise inappropriate sphingosine kinase-mediated cell comprising administering an effective amount of the substance to a mammal for a time and under conditions sufficient to modulate the interaction between the transposable element and the translocation factor A method for the treatment and / or prevention of a disease state in a mammal characterized by activity And

本発明のさらにもう一つの態様は、相互作用を誘導またはアゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ膜局在をアップレギュレートし、該相互作用にアンタゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートし、ここで物質が、スフィンゴシンキナーゼ燐酸化を調整することによって局在を調節する以外の手段によって機能する、SEQ ID NO：2の残基191〜206位に対応する一つまたは複数のアミノ酸と転位因子との相互作用を調整するために十分な時間および条件で哺乳動物に物質の有効量を投与する段階を含む、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当なスフィンゴシンキナーゼ機能的活性を特徴とする、哺乳動物における病態の処置および／または予防のための方法を対象とする。 Yet another embodiment of the present invention provides that the step of inducing or agonizing the interaction up-regulates sphingosine kinase membrane localization, and the step of antagonizing the interaction down-regulates sphingosine kinase cell membrane localization. One or more amino acids corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2, wherein the substance functions by means other than modulating localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation An abnormal, undesirable or otherwise inappropriate sphingosine kinase functional, comprising administering an effective amount of the substance to the mammal for a time and under conditions sufficient to modulate the interaction between the transposable element and the translocation factor It is directed to a method for the treatment and / or prevention of a disease state in a mammal characterized by activity.

より好ましくは、アミノ酸はPhe197またはLeu198の一つまたは双方であり、スフィンゴシンキナーゼはヒトスフィンゴシンキナーゼ1またはスフィンゴシンキナーゼ2である。 More preferably, the amino acid is one or both of Phe197 or Leu198 and the sphingosine kinase is human sphingosine kinase 1 or sphingosine kinase 2.

「異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な」細胞活性という言及は、過活動細胞活性、それが望ましくないという点において不適当である生理的な通常の細胞活性、または不十分な細胞活性に対する言及であると理解すべきである。この定義は、「異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な」スフィンゴシンキナーゼ活性に関連して同様に適用される。例えば、腫瘍細胞の生長の際のTNF産生は、細胞の増殖を支持し、新生物細胞に抗アポトーシス特徴を提供することが示されている。したがって、細胞が新生物である程度に、細胞増殖の促進および抗アポトーシス特徴がダウンレギュレートされることが望ましい。同様に、リウマチ性関節炎、アテローム性動脈硬化症、喘息、自己免疫疾患、および炎症性腸症候群のような炎症を特徴とする疾患は、接着分子のような炎症性メディエータの合成および分泌に至る、TNFのようなサイトカインによる細胞の活性化を伴うことが知られている。そのような状況において、そのような活性をダウンレギュレートすることも同様に望ましい。他の状況において、細胞増殖を刺激するためにスフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在にアゴニスト作用する、またはそうでなければそれらを誘導することが望ましい可能性がある。 Reference to “abnormal, undesirable or otherwise inappropriate” cellular activity refers to overactive cellular activity, physiological normal cellular activity that is inappropriate in that it is undesirable, or insufficient It should be understood as a reference to cellular activity. This definition applies equally to sphingosine kinase activity, which is “abnormal, undesirable, or otherwise inappropriate”. For example, TNF production during tumor cell growth has been shown to support cell growth and provide anti-apoptotic features to neoplastic cells. Thus, to the extent that cells are neoplastic, it is desirable that the promotion of cell proliferation and anti-apoptotic features be down-regulated. Similarly, diseases characterized by inflammation such as rheumatoid arthritis, atherosclerosis, asthma, autoimmune disease, and inflammatory bowel syndrome lead to the synthesis and secretion of inflammatory mediators such as adhesion molecules, It is known to accompany cell activation by cytokines such as TNF. In such situations, it is equally desirable to down-regulate such activity. In other situations, it may be desirable to agonist or otherwise induce sphingosine kinase cell membrane localization to stimulate cell proliferation.

先に詳述したように、本発明は任意の一つの理論または作用様式に限定されることなく、スフィンゴシンキナーゼの構成的活性化は、細胞のトランスフォーメーションおよび腫瘍の発達を引き起こし、それによってスフィンゴシンキナーゼ自身が発癌性であることを示している。しかし、スフィンゴシンキナーゼの阻害はまた、本発明の細胞が、Ras誘導トランスフォーメーションのような、特定の無関係な腫瘍遺伝子によってトランスフォームされている新生物細胞の増殖をダウンレギュレートするために有効である。したがって、本発明の方法は、大腸、胃、肺、乳腺（乳房）、脳、骨、食道、および膵臓の固形腫瘍に関連した悪性疾患、および特にRasトランスフォーム細胞の増殖によって生じた腫瘍、またはエストロゲン依存的乳房細胞腫瘍のような、原発および二次悪性疾患の処置において用いるために特に有用であるが、決してそれらに限定されない。好ましい方法は、スフィンゴシンキナーゼの細胞膜局在を阻害することによって、被験者における制御されていない細胞増殖をダウンレギュレートすることであるが、細胞生長のアップレギュレーションも同様に、創傷治癒、血管新生、または他の治癒プロセスの促進のような、特定の状況において望ましい可能性がある。 As detailed above, the present invention is not limited to any one theory or mode of action, and the constitutive activation of sphingosine kinase causes cellular transformation and tumor development, thereby causing sphingosine kinase. It shows that it is carcinogenic. However, inhibition of sphingosine kinase is also effective for down-regulating the growth of neoplastic cells in which the cells of the invention are transformed by certain unrelated oncogenes, such as Ras-induced transformation. . Thus, the methods of the present invention can be used to treat malignancies associated with solid tumors of the large intestine, stomach, lung, mammary gland (breast), brain, bone, esophagus, and pancreas, and in particular tumors caused by proliferation of Ras transform cells, It is particularly useful for use in the treatment of primary and secondary malignancies, such as, but not limited to, estrogen-dependent breast cell tumors. A preferred method is to down-regulate unregulated cell growth in a subject by inhibiting sphingosine kinase cell membrane localization, but cell growth up-regulation is likewise wound healing, angiogenesis, or It may be desirable in certain situations, such as promoting other healing processes.

したがって、本発明は、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が本発明の細胞生長をダウンレギュレートする、スフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整するために十分な時間および条件で哺乳動物に物質の有効量を投与する段階を含む、哺乳動物における異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞生長を特徴とする病態の処置および／または予防のための方法を企図する。 Accordingly, the present invention provides a mammal with a time and condition sufficient to modulate the subcellular localization of sphingosine kinase, wherein the step of downregulating sphingosine kinase cell membrane localization downregulates cell growth of the present invention. Methods are contemplated for the treatment and / or prevention of pathological conditions characterized by abnormal, undesirable or otherwise inappropriate cell growth in a mammal comprising administering an effective amount of the substance.

好ましくは、本発明は、相互作用にアンタゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートし、ここで物質が、スフィンゴシンキナーゼ燐酸化を調整することによって局在を調節する以外の手段によって機能する、SEQ ID NO：2の残基191〜206位に対応する一つまたは複数のアミノ酸と転位因子との相互作用にアンタゴニスト作用するために十分な時間および条件で哺乳動物に物質の有効量を投与する段階を含む、哺乳動物における異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当な細胞生長を特徴とする、哺乳動物における病態の処置および／または予防のための方法を対象とする。 Preferably, the invention provides that the step of antagonizing the interaction down-regulates sphingosine kinase cell membrane localization, wherein the substance is other than by modulating localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation. An effective amount of a substance in a mammal in a time and under conditions sufficient to function and to antagonize the interaction of a translocation factor with one or more amino acids corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2. Is directed to a method for the treatment and / or prevention of a pathological condition in a mammal characterized by abnormal, undesirable or otherwise inappropriate cell growth in the mammal comprising the step of administering

好ましくは制御されていない細胞増殖は、腫瘍遺伝子のアップレギュレーションによる、またはスフィンゴシンキナーゼ過剰発現腫瘍遺伝子活性による細胞のトランスフォーメーションによって引き起こされる。 Preferably unregulated cell proliferation is caused by cell transformation by up-regulation of oncogenes or by sphingosine kinase overexpressing oncogene activity.

さらにより好ましくは、細胞は、大腸、胃、肺、脳、骨、食道、膵臓、乳腺（乳房）、卵巣、または子宮の固形腫瘍を形成する悪性細胞である。 Even more preferably, the cell is a malignant cell that forms a solid tumor of the large intestine, stomach, lung, brain, bone, esophagus, pancreas, mammary gland (breast), ovary, or uterus.

本発明のこの局面の最も好ましい態様は、好ましくは、本発明の増殖が低減、遅滞、またはそうでなければ阻害されることを促進する。「低減、遅滞、またはそうでなければ阻害」という言及は、細胞増殖の部分的または完全な阻害を誘導または促進することに対する言及であると理解すべきである。阻害は、直接または間接的なメカニズムで起こってもよく、これには、細胞のアポトーシスまたは他の殺細胞メカニズムの誘導が含まれる。 The most preferred embodiment of this aspect of the present invention preferably promotes that the growth of the present invention is reduced, retarded or otherwise inhibited. Reference to “reduction, delay, or otherwise inhibition” should be understood as a reference to inducing or promoting partial or complete inhibition of cell proliferation. Inhibition may occur by direct or indirect mechanisms, including induction of cellular apoptosis or other cell killing mechanisms.

処置または予防の被験者は一般的に、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲された野生動物（例えばキツネ、シカ）のような、しかしこれらに限定されない哺乳動物である。好ましくは、哺乳動物はヒトまたは霊長類である。最も好ましくは、哺乳動物はヒトである。 Subjects for treatment or prevention are generally humans, primates, livestock animals (eg sheep, cows, horses, donkeys, pigs), companion animals (eg dogs, cats), laboratory animals (eg mice, rabbits, Rats, guinea pigs, hamsters), mammals such as but not limited to captive wild animals (eg foxes, deer). Preferably the mammal is a human or primate. Most preferably, the mammal is a human.

「有効量」は、望ましい反応を得るために、または処置される特定の病態の発症もしくは病態の発症を遅らせる、進行を阻害する、もしくは全く停止させるために少なくとも部分的に必要な量を意味する。量は、処置される個体の健康および身体的条件、処置される個体の分類群、望ましい保護の程度、組成物の処方、医学的状態の評価、および他の関連因子に応じて変化する。量は、ルーチンの試験を通して決定することができる比較的広い範囲に入るであろう。 “Effective amount” means an amount that is at least partially necessary to obtain the desired response, or to delay the onset of, or inhibit the progression of, or stop the onset of the particular condition being treated . The amount will vary depending on the health and physical condition of the individual being treated, the taxonomic group of the individual being treated, the degree of protection desired, the formulation of the composition, the assessment of the medical condition, and other relevant factors. The amount will fall in a relatively broad range that can be determined through routine trials.

本明細書における「処置」および「予防」という言及は、その最も広い状況において考慮すべきである。「処置」という用語は、完全に回復するまで被験者が処置されることを必ずしも暗示しない。同様に、「予防」は、被験者が最終的に疾患状態に罹らないことを必ずしも意味しない。したがって、処置および予防には、特定の病態の症状の改善、または特定の病態の発症のリスクの阻止もしくはそうでなければ低減が含まれる。「予防」という用語は、特定の病態の重症度または発症の低減と見なしてもよい。「処置」はまた、既存の病態の重症度を低減させてもよい。 Reference herein to “treatment” and “prevention” should be considered in its broadest context. The term “treatment” does not necessarily imply that a subject is treated until complete recovery. Similarly, “prevention” does not necessarily mean that the subject will not eventually contract a disease state. Thus, treatment and prevention includes ameliorating the symptoms of a particular condition or preventing or otherwise reducing the risk of developing a particular condition. The term “prevention” may be considered as reducing the severity or onset of a particular condition. “Treatment” may also reduce the severity of an existing condition.

本発明はさらに、癌の処置における細胞障害剤または放射線療法のような被験者の病態の処置に関連して有用となる可能性がある他の物質、薬物、または処置を哺乳動物を供すると共に物質を投与するような、併用治療を企図する。 The present invention further provides other substances, drugs, or treatments that may be useful in connection with the treatment of a subject's condition, such as cytotoxic agents or radiotherapy in the treatment of cancer, as well as providing mammals with substances. Contemplated combination therapy, such as administration.

薬学的組成物の形での調整物質の投与は、任意の通常の手段によって行ってもよい。薬学的組成物の調整物質は、特定の症例に応じた量で投与される場合に治療活性を示すと企図される。変化は、例えば、選択されたヒトまたは動物、および調整物質に依存する。広範囲の用量が適用可能となる可能性がある。患者を考慮して、例えば約0.1 mg〜約1 mg/kg体重/日の調整物質を投与してもよい。投与レジメは、最適な治療反応を提供するように適合させてもよい。例えば、いくつかの分割用量を毎日、毎週、毎月、もしくは他の適した期間投与してもよく、または状況の緊急性に応じて、用量を比例して低減させてもよい。 Administration of the modulatory substance in the form of a pharmaceutical composition may be performed by any conventional means. A modulator of a pharmaceutical composition is contemplated to exhibit therapeutic activity when administered in an amount depending on the particular case. The change depends, for example, on the selected human or animal and the modulator. A wide range of doses may be applicable. Considering the patient, for example, about 0.1 mg to about 1 mg / kg body weight / day of a regulator may be administered. Dosage regimes may be adapted to provide the optimum therapeutic response. For example, several divided doses may be administered daily, weekly, monthly, or other suitable period, or the dose may be reduced proportionally depending on the urgency of the situation.

調整物質は、経口、静脈内（水溶性の場合）、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内、もしくは坐剤経路または埋め込み（例えば、徐放性分子を用いて）のような通常の方法で投与してもよい。調整物質は、酸付加塩または亜鉛、鉄等との金属錯体（本出願の目的に関して塩であると見なされる）のような薬学的に許容される非毒性の塩の形で投与してもよい。そのような酸付加塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等である。活性成分が錠剤型で投与される場合、錠剤は、トラガカント、コーンスターチ、またはゼラチンのような結合剤；アルギン酸のような崩壊剤；およびステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤を含んでもよい。 Modifiers can be prepared by conventional methods such as oral, intravenous (if water soluble), intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intradermal, or suppository route or implantation (eg, using sustained release molecules). It may be administered. Modulators may be administered in the form of acid addition salts or pharmaceutically acceptable non-toxic salts such as metal complexes with zinc, iron, etc. (which are considered salts for the purposes of this application). . Examples of such acid addition salts are hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, maleate, acetate, citrate, benzoate, succinate, malate, ascorbic acid Salt, tartrate, etc. When the active ingredient is administered in tablet form, the tablet may contain a binder such as tragacanth, corn starch, or gelatin; a disintegrant, such as alginic acid; and a lubricant, such as magnesium stearate.

投与経路には、呼吸器、気管内、鼻咽喉内、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼内、髄腔内、小脳内、鼻腔内、注入、経口、直腸内、IVドリップパッチによって、およびインプラントが含まれるがそれらに限定されるわけではない。 The routes of administration include respiratory, intratracheal, intranasal throat, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intracranial, intradermal, intramuscular, intraocular, intrathecal, intracerebellar, intranasal, infusion, oral, rectal Including, but not limited to, IV drip patches and implants.

これらの方法に従って、本発明に従って定義される物質は、一つまたは複数の他の化合物または分子と共に同時投与してもよい。「同時投与する」とは、同じもしくは異なる経路によって同じ製剤もしくは異なる二つの製剤を同時投与すること、または同じもしくは異なる経路によって連続投与することを意味する。例えば、本発明の物質は、その効果を増強するためにアゴニスト作用物質と共に投与してもよい。「連続的」投与とは、二つのタイプの分子の投与のあいだの数秒、数分、数時間、または数日の時間差を意味する。これらの分子は、任意の順序で投与してもよい。 In accordance with these methods, a substance defined according to the present invention may be co-administered with one or more other compounds or molecules. “Co-administer” means co-administering the same formulation or two different formulations by the same or different routes, or sequentially administering by the same or different routes. For example, the substance of the present invention may be administered with an agonistic agent to enhance its effect. By “sequential” administration is meant a time difference of seconds, minutes, hours or days between the administration of the two types of molecules. These molecules may be administered in any order.

本発明のもう一つの局面は、物質がスフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整する、およびスフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階が、細胞活性をアップレギュレートし、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が、該細胞活性をダウンレギュレートする、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当なスフィンゴシンキナーゼ媒介細胞活性を特徴とする、哺乳動物における病態の処置のための薬剤を製造するために、本明細書において先に定義した物質を用いることを企図する。 Another aspect of the present invention is that the substance modulates the subcellular localization of sphingosine kinase and upregulates sphingosine kinase cell membrane localization upregulates cellular activity and increases sphingosine kinase cell membrane localization. Agent for the treatment of a pathological condition in a mammal characterized by abnormal, undesirable or otherwise inappropriate sphingosine kinase mediated cellular activity, wherein the downregulating step downregulates the cellular activity It is contemplated to use the materials previously defined herein to produce

本発明のさらにもう一つの局面は、物質がスフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整する、およびスフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をアップレギュレートする段階が、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達をアップレギュレートし、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートする段階が、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達をダウンレギュレートする、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適当なスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を特徴とする、哺乳動物における病態の処置のための薬剤を製造するために、本明細書において先に定義した物質を用いることを企図する。 Yet another aspect of the invention is that the step of modulating the sphingosine kinase subcellular localization and up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates sphingosine kinase-mediated signaling, wherein sphingosine kinase Pathology in mammals characterized by abnormal, undesired or otherwise inappropriate sphingosine kinase-mediated signaling, wherein the step of down-regulating cell membrane localization down-regulates sphingosine kinase-mediated signaling It is contemplated to use the substances previously defined herein for the manufacture of a medicament for the treatment of

より詳しくは、物質は、転位因子とSEQ ID NO：2の残基191〜206位、最も詳しくはPhe197またはLeu198に対応する一つまたは複数のアミノ酸との相互作用を調整し、相互作用を誘導またはアゴニスト作用する段階が、スフィンゴシン細胞膜局在をアップレギュレートし、アンタゴニスト作用する段階が、スフィンゴシンキナーゼ細胞膜局在をダウンレギュレートする。 More specifically, the substance modulates the interaction between the transposable element and one or more amino acids corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2, most particularly Phe197 or Leu198, and induces the interaction Alternatively, agonistic steps up-regulate sphingosine cell membrane localization, and antagonistic steps down-regulate sphingosine kinase cell membrane localization.

好ましくは、物質は、スフィンゴシンキナーゼ燐酸化を調整することによって、局在を調節する以外の手段によって機能する。 Preferably, the substance functions by means other than modulating localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation.

より好ましくは、スフィンゴシンキナーゼは、ヒトスフィンゴシンキナーゼ1または2である。 More preferably, the sphingosine kinase is human sphingosine kinase 1 or 2.

さらにより好ましくは、細胞活性は細胞増殖である。 Even more preferably, the cell activity is cell proliferation.

最も好ましくは、細胞増殖は新生物細胞増殖であり、増殖がダウンレギュレートされる。 Most preferably, the cell proliferation is neoplastic cell proliferation and proliferation is downregulated.

なおもう一つのさらなる局面において、本発明は、一つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤と共に、本明細書において先に定義した調整物質を含む薬学的組成物を企図する。これらの物質は、活性成分と呼ばれる。 In yet another further aspect, the present invention contemplates a pharmaceutical composition comprising a modulator as defined herein above together with one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents. . These substances are called active ingredients.

注射用用途に適した薬学剤形には、滅菌水溶液（水溶性の場合）もしくは分散液、および滅菌注射用溶液もしくは分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれ、または局所適用に適したクリームもしくは他の剤形であってもよい。これは製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、その適した混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体となりうる。例えばレシチンのようなコーティングを用いることによって、分散液の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサル等によって得ることができる。多くの場合、等張剤、糖または塩化ナトリウムを含めることが望ましいであろう。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において用いることによって得ることができる。 Pharmaceutical dosage forms suitable for injectable use include sterile aqueous solutions (where water soluble) or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion or suitable for topical application It may be a cream or other dosage form. It must be stable at the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like), suitable mixtures thereof, and vegetable oils. The proper fluidity can be maintained, for example, by using a coating such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersions, and by using surfactants. Prevention of the action of microorganisms can be obtained by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be desirable to include isotonic agents, sugars or sodium chloride. Prolonged absorption of the injectable compositions can be brought about by using in the composition an agent which delays absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin.

適した注射用溶液は、適当な溶媒において必要な量の活性化合物を先に列挙した様々な他の成分と共に組み入れた後、必要に応じて濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、基礎分散培地と先に列挙した必要な他の成分とを含む滅菌溶媒に組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、予め濾過滅菌されたその溶液から活性成分プラスさらなる望ましい成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。 Suitable injectable solutions are prepared by incorporating the required amount of the active compound in a suitable solvent with the various other ingredients listed above and then filter sterilizing as necessary. Generally, dispersions are prepared by incorporating various sterilized active ingredients into a sterile solvent that contains a basic dispersion medium and the required other ingredients listed above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred method of preparation is the vacuum and lyophilization technique, which produces a powder of the active ingredient plus further desired ingredients from the pre-filter sterilized solution.

活性成分が適切に保護されている場合、それらを、例えば不活性希釈剤もしくは他の同化可能な食用担体と共に経口投与してもよく、硬もしくは軟シェルゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤に圧縮してもよく、または食事の食物に直接組み入れてもよい。経口治療的投与の場合、活性化合物を、賦形剤と共に組み入れて、摂取可能な錠剤、口腔内錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウェーハ等の剤形で用いてもよい。そのような組成物および調製物は、活性化合物を重量で少なくとも1％含まなければならない。組成物および調製物の百分率は、当然変化してもよく、簡便に、単位重量の約5〜約80％の範囲であってもよい。そのような治療的に有用な組成物における活性化合物の量は、適した用量が得られる量である。本発明に従う好ましい組成物または調製物は、経口投与単位剤形が、活性化合物の約0.1μg〜2000 mgを含むように調製される。 If the active ingredients are adequately protected, they may be administered orally, for example with an inert diluent or other assimilable edible carrier, enclosed in hard or soft shell gelatin capsules, It may be compressed or incorporated directly into the dietary food. For oral therapeutic administration, the active compound is incorporated with excipients and used in dosage forms such as ingestible tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc. May be. Such compositions and preparations should contain at least 1% by weight of active compound. The percentages of the compositions and preparations may of course vary and may conveniently range from about 5 to about 80% of the unit weight. The amount of active compound in such therapeutically useful compositions is such that a suitable dosage will be obtained. Preferred compositions or preparations according to the present invention are prepared so that an oral dosage unit form contains between about 0.1 μg and 2000 mg of active compound.

錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等はまた、本明細書において後に記載した成分を含んでもよい：ゴム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンのような結合剤；燐酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；および蔗糖、乳糖、もしくはサッカリンのような甘味料を加えてもよく、またはペパーミント、冬緑油、もしくはサクランボ香料のような着香料を加えてもよい。単位投与剤形がカプセル剤である場合、これは先のタイプの材料の他に液体担体を含んでもよい。様々な他の材料は、コーティングとして存在してもよく、またはそうでなければ投与単位の物理的形状を改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤を、シェラック、糖、または双方によってコーティングしてもよい。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、甘味料としての蔗糖、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素、およびサクランボまたはオレンジ香料のような着香料を含んでもよい。当然、任意の単位投与剤形を調製するために用いられる如何なる材料も、薬学的に純粋でなければならず、用いられる量において実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物は、徐放性調製物および製剤に組み入れてもよい。 Tablets, troches, pills, capsules, etc. may also contain the ingredients described later herein: binders such as gum, acacia, corn starch, or gelatin; excipients such as dicalcium phosphate Disintegrants such as corn starch, potato starch, alginic acid, etc .; lubricants such as magnesium stearate; and sweeteners such as sucrose, lactose, or saccharin, or peppermint, winter green oil, or cherries A fragrance such as a fragrance may be added. Where the unit dosage form is a capsule, it may contain a liquid carrier in addition to the previous type of material. Various other materials may be present as coatings or otherwise present to modify the physical shape of the dosage unit. For instance, tablets, pills, or capsules may be coated with shellac, sugar or both. A syrup or elixir may contain the active compound, sucrose as a sweetening agent, methyl and propylparabens as preservatives, a dye and flavoring such as cherry or orange flavor. Of course, any material used to prepare any unit dosage form must be pharmaceutically pure and substantially non-toxic in the amounts employed. In addition, the active compound may be incorporated into sustained-release preparations and formulations.

薬学的組成物はまた、調整物質をコードする核酸分子を有する、標的細胞をトランスフェクトすることができるベクターのような遺伝子分子を含んでもよい。ベクターは、例えばウイルスベクターであってもよい。 The pharmaceutical composition may also comprise a gene molecule such as a vector capable of transfecting a target cell with a nucleic acid molecule encoding a modulator. The vector may be a viral vector, for example.

本発明のなおもう一つの局面は、本発明の方法において用いる場合、本明細書において先に定義した物質に関する。 Yet another aspect of the invention relates to a material as defined herein before when used in the method of the invention.

本発明はまた、スフィンゴシンキナーゼの細胞内局在を調整する物質、特にSEQ ID NO：2の残基191位〜206位に対応する一つまたは複数のアミノ酸、特にPhe197またはLeu198と相互作用する、またはそれ自身相互作用する転位因子の相互作用にアゴニスト作用する、またはアンタゴニスト作用する物質のスクリーニング法を含むと理解すべきである。 The present invention also interacts with a substance that modulates the subcellular localization of sphingosine kinase, particularly one or more amino acids corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2, in particular Phe197 or Leu198, It should also be understood to include screening methods for substances that act or antagonize the interaction of transposable elements that interact with themselves.

本明細書において先に定義した調整物質のスクリーニングは、スフィンゴシンキナーゼと転位メディエーター（カルモジュリンのような）とを含む細胞を物質に接触させる段階、ならびにスフィンゴシンキナーゼ局在の調整またはNF-κBのような下流のスフィンゴシンキナーゼ細胞標的の活性もしくは発現の調整に関してスクリーニングする段階、が含まれるがそれらに限定されるわけではないいくつかの適した方法の任意の一つによって行うことができる。これは、転移のメディエーターのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために特に有用である。本発明の方法はまた。それ自身、スフィンゴシンキナーゼに結合して、細胞膜へのその転位を誘導する分子のスクリーニングにとっても有用である。そのような調整の検出は、ウェスタンブロッティング、電気泳動移動度シフトアッセイ、および／またはルシフェラーゼ、CAT等のようなスフィンゴシンキナーゼ活性のレポーターの読み取りのような技術を利用して行うことができる。 Screening for modulators as defined herein above involves contacting a cell comprising sphingosine kinase and a translocation mediator (such as calmodulin) with the substance, as well as modulating sphingosine kinase localization or NF-κB Screening for modulation of downstream sphingosine kinase cell target activity or expression can be performed by any one of several suitable methods, including but not limited to. This is particularly useful for screening for agonists or antagonists of mediators of metastasis. The method of the present invention is also. As such, it is also useful for screening molecules that bind to sphingosine kinase and induce its translocation to the cell membrane. Detection of such modulation can be done using techniques such as Western blotting, electrophoretic mobility shift assays, and / or reading reporters of sphingosine kinase activity such as luciferase, CAT, and the like.

スフィンゴシンキナーゼまたは転位のメディエーターは、試験の被験者である細胞において天然に存在してもよく、またはそれらをコードする遺伝子を試験の目的のために宿主細胞にトランスフェクトしていてもよいと理解すべきである。さらに、天然に存在するまたはトランスフェクトされた遺伝子は構成的に発現されてもよい−それによって中でもスフィンゴシンキナーゼ転位をダウンレギュレートする物質のスクリーニングにとって有用なモデルを提供する、または遺伝子は活性化を必要としてもよく−それによって特定の刺激条件でスフィンゴシンキナーゼ転位を調整する物質のスクリーニングにとって有用なモデルを提供する。さらに、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子が細胞にトランスフェクトされている程度に、その分子は、スフィンゴシンキナーゼの全遺伝子を含んでもよく、またはSEQ ID NO：2の残基191〜206位のアミノ酸を含む部分のような、遺伝子の一部を単に含んでもよい。 It should be understood that sphingosine kinases or translocation mediators may be naturally present in the cell being tested, or the genes encoding them may be transfected into the host cell for testing purposes. It is. In addition, naturally occurring or transfected genes may be constitutively expressed-thereby providing a useful model for screening for substances that, among other things, down-regulate sphingosine kinase translocation, or genes that activate May be needed-thereby providing a useful model for screening for substances that modulate sphingosine kinase translocation under specific stimulation conditions. In addition, to the extent that the sphingosine kinase nucleic acid molecule has been transfected into the cell, the molecule may comprise the entire gene of sphingosine kinase, or a portion of the amino acid sequence comprising residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2. It may simply contain part of the gene.

もう一つの例において、検出の主題は、スフィンゴシンキナーゼ自身よりむしろ、NF-κBのような下流のスフィンゴシンキナーゼ調節標的となりうる。なおもう一つの例には、最小のレポーターにライゲーションしたスフィンゴシンキナーゼ結合部位が含まれる。例えば、スフィンゴシンキナーゼ転位の調整は、適当に刺激された細胞の下流のシグナル伝達成分の調整に関するスクリーニングによって検出することができる。スクリーニングシステムの主題である細胞が新生物細胞である場合、例えば、スフィンゴシンキナーゼ転位の調整は、その細胞の増殖の中止に関してスクリーニングすることによって検出されうる。 In another example, the subject of detection can be a downstream sphingosine kinase regulatory target, such as NF-κB, rather than sphingosine kinase itself. Yet another example includes a sphingosine kinase binding site ligated to a minimal reporter. For example, modulation of sphingosine kinase translocation can be detected by screening for modulation of signaling components downstream of appropriately stimulated cells. If the cell that is the subject of the screening system is a neoplastic cell, for example, modulation of sphingosine kinase translocation can be detected by screening for the cessation of growth of the cell.

適した物質はまた、コンビナトリアルケミストリーまたは組換え型ライブラリのハイスループットスクリーニング、または以下の天然物スクリーニングのような周知の方法を利用して同定および／または設計してもよい。 Suitable materials may also be identified and / or designed utilizing well-known methods such as high-throughput screening of combinatorial chemistry or recombinant libraries, or natural product screening below.

例えば、多数の特異的親基置換を有する有機分子が用いられる低分子有機分子を含むライブラリを、スクリーニングしてもよい。一般的な合成スキームは、公表された方法に従ってもよい（例えば、Bunin BA et al.(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4708〜4712；De Witt SH, et al.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6909〜6913）。簡単に説明すると、それぞれの連続的な合成段階において、複数の異なる選択された置換基の一つを、ライブラリを作製するために用いた異なる置換基の起こりうる全ての順列が作製されるように試験管サブセットが選択される、選択された試験管サブセットのアレイのそれぞれに加える。一つの適した順列戦略を米国特許第5,763,263号に概要する。 For example, a library containing small molecule organic molecules in which organic molecules with multiple specific parent group substitutions are used may be screened. General synthetic schemes may follow published methods (eg, Bunin BA et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 4708-4712; De Witt SH, et al. (1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6909-6913). Briefly, in each successive synthesis step, one of a plurality of different selected substituents is created so that all possible permutations of the different substituents used to create the library are created. A test tube subset is selected and added to each of the selected array of test tube subsets. One suitable permutation strategy is outlined in US Pat. No. 5,763,263.

現在、生物活性化合物を検索するために、ランダム有機分子のコンビナトリアルライブラリを用いることに広く関心が高まっている（例えば、米国特許第5,763,263号を参照されたい）。このタイプのライブラリのスクリーニングによって発見されたリガンドは、天然のリガンドを模倣もしくは遮断するために、または生物学的標的の天然に存在するリガンドと干渉するために有用となる可能性がある。本発明の状況において、例えば、それらはより強力な薬理学効果のような特性を示すスフィンゴシンキナーゼ転位アゴニストまたはアンタゴニストを開発するための開始点として用いてもよい。スフィンゴシンキナーゼまたはその機能的部分および／または転位因子は、本発明に従って様々な固相または液相合成法によって形成されたコンビナトリアルライブラリにおいて用いてもよい（例えば、米国特許第5,763,263号およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）。米国特許第5,753,187号に開示されるような技術を用いることによって、何百万個もの新規化学および／または生物化合物が日常的に、数週間以内にスクリーニングされる可能性がある。同定された多数の化合物の中で、適当な生物活性を示す化合物のみをさらに分析する。 Currently, there is widespread interest in using combinatorial libraries of random organic molecules to search for bioactive compounds (see, eg, US Pat. No. 5,763,263). Ligands discovered by screening this type of library may be useful to mimic or block natural ligands or to interfere with naturally occurring ligands of biological targets. In the context of the present invention, for example, they may be used as a starting point for developing sphingosine kinase translocation agonists or antagonists that exhibit properties such as more potent pharmacological effects. Sphingosine kinase or functional parts thereof and / or transposable elements may be used in combinatorial libraries formed by various solid phase or liquid phase synthesis methods according to the present invention (see, eg, US Pat. No. 5,763,263 and cited therein). See references). By using techniques such as those disclosed in US Pat. No. 5,753,187, millions of new chemical and / or biological compounds can be routinely screened within a few weeks. Of the large number of identified compounds, only those compounds that exhibit the appropriate biological activity are further analyzed.

ハイスループットスクリーニング法に関して、生体分子、高分子複合体、または細胞のような、選択された生物学的物質と特異的に相互作用することができるオリゴマーまたは低分子ライブラリ化合物を、上記の方法のような広範な周知の方法から当業者によって容易に選択されるコンビナトリアルライブラリ装置を利用してスクリーニングする。そのような方法において、ライブラリのそれぞれのメンバーを、選択された物質との特異的相互作用能に関してスクリーニングする。方法の実践において、生物学的物質を化合物を含む試験に加えて、各試験管において個々のライブラリ化合物と相互作用させる。相互作用は、所望の相互作用の有無をモニターするために用いることができる検出可能なシグナルを産生するように設計される。好ましくは、生物学的物質は、水溶液に存在し、所望の相互作用に応じてさらなる条件が適合される。検出は、例えば物質を検出するための任意の周知の機能的または非機能的に基づく方法によって行ってもよい。 For high-throughput screening methods, oligomeric or small molecule library compounds that can specifically interact with selected biological substances, such as biomolecules, macromolecular complexes, or cells, as described above. Screening is performed using a combinatorial library apparatus that is easily selected by those skilled in the art from a wide variety of well-known methods. In such a method, each member of the library is screened for the ability to specifically interact with the selected substance. In the practice of the method, biological material is added to the test containing the compound and interacts with the individual library compound in each test tube. The interaction is designed to produce a detectable signal that can be used to monitor the presence or absence of the desired interaction. Preferably, the biological material is present in an aqueous solution and further conditions are adapted depending on the desired interaction. The detection may be performed by any well-known functional or non-functional method for detecting a substance, for example.

したがって、本発明のもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼまたはその機能的同等物もしくは誘導体を含む細胞またはその抽出物を、推定の物質に接触させる段階、および細胞膜局在に関連した発現表現型の変化を検出する段階を含む、スフィンゴシンキナーゼまたはその機能的同等物もしくは誘導体の細胞内局在を調整することができる物質を検出する方法を提供する。 Accordingly, another aspect of the present invention is the step of contacting a cell containing sphingosine kinase or a functional equivalent or derivative thereof or an extract thereof with a putative agent, and an expression phenotype change associated with cell membrane localization. A method for detecting a substance capable of modulating the intracellular localization of sphingosine kinase or a functional equivalent or derivative thereof is provided.

「スフィンゴシンキナーゼ」という言及は、スフィンゴシンキナーゼ発現産物、または細胞膜局在領域もしくはSEQ ID NO：2のアミノ酸191〜206位によって定義される領域である転位因子と相互作用する領域のようなスフィンゴシンキナーゼの一部もしくは断片、のいずれかに対する言及であると理解すべきである。この点において、スフィンゴシンキナーゼ発現産物は、細胞において発現される。細胞は、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子をトランスフェクトした宿主細胞であってもよく、またはスフィンゴシンキナーゼ遺伝子を本来含む細胞であってもよい。「その抽出物」という言及は、無細胞転写系に対する言及であると理解すべきである。 Reference to “sphingosine kinase” refers to a sphingosine kinase such as a sphingosine kinase expression product, or a region that interacts with a translocation factor that is a cell membrane localization region or a region defined by amino acids 191 to 206 of SEQ ID NO: 2. It should be understood as a reference to either part or fragment. In this regard, the sphingosine kinase expression product is expressed in the cell. The cell may be a host cell transfected with a sphingosine kinase nucleic acid molecule or may be a cell that naturally contains a sphingosine kinase gene. Reference to “the extract” should be understood as a reference to a cell-free transcription system.

「細胞膜局在に関連した発現表現型の変化」を検出するという言及は、スフィンゴシンキナーゼの細胞内局在の調整に関連した細胞変化の検出として理解すべきである。これらは、例えば細胞内変化、または増殖レベルの変化のような細胞外で観察されうる変化として検出されてもよい。 Reference to detecting “changes in expression phenotype associated with cell membrane localization” should be understood as detecting cellular changes associated with modulation of the subcellular localization of sphingosine kinase. These may be detected as intracellular changes or changes that can be observed extracellularly, such as changes in proliferation levels.

本発明のさらにもう一つの局面は、本明細書において定義されたスクリーニング法に従って同定された物質および本発明の方法において用いられる物質を対象とする。物質は、SEQ ID NO：2のアミノ酸191〜206位のアミノ酸によって定義される領域の全てもしくは一部、および特にヒトスフィンゴシンキナーゼのPhe197および／またはLeu198、または対応する領域に結合するモノクローナル抗体に及ぶと理解すべきである。 Yet another aspect of the invention is directed to substances identified according to the screening methods defined herein and substances used in the methods of the invention. The substance covers all or part of the region defined by amino acids 191 to 206 of SEQ ID NO: 2, and in particular monoclonal antibodies that bind to human sphingosine kinase Phe197 and / or Leu198, or the corresponding region Should be understood.

本発明のなおさらなる局面は、野生型スフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシンキナーゼ変種の機能的誘導体、相同体、もしくは類似体と比較して転移能の消失または低減を示す、その領域が転位メディエーター結合部位を含むスフィンゴシンキナーゼの領域において変異を含むスフィンゴシンキナーゼ変種を対象とする。 A still further aspect of the invention is a sphingosine whose region comprises a translocation mediator binding site that exhibits loss or reduction of metastatic potential compared to a functional derivative, homologue, or analog of a wild type sphingosine kinase or sphingosine kinase variant. Sphingosine kinase variants containing mutations in the kinase domain are targeted.

本発明はまた、既存の転位メディエータ結合部位の変異の性質またはさらなるそのような部位の組み込みにより、増強されたまたはアップレギュレートされた活性を示す変種にも及ぶ。 The invention also extends to variants that exhibit enhanced or up-regulated activity due to the nature of mutations in existing translocation mediator binding sites or further incorporation of such sites.

「変異」という言及は、スフィンゴシンキナーゼが転位を受ける能力を調整する、天然に存在するまたは天然に存在しない、任意の変化、変更、または他の改変に対する言及であると理解すべきである。調整は、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションであってもよい。本発明は好ましくは、活性化能の消失を示す変種を対象とするが、本発明は、転位能の改善を示す変種の作製にも及ぶと理解すべきである。この状況において「機能的」誘導体、相同体、または類似体に対する言及は、定義された転位能の調整を示す本発明の分子に対する言及であると理解すべきである。 Reference to “mutation” should be understood as a reference to any change, alteration, or other modification that occurs naturally or non-naturally, which modulates the ability of sphingosine kinase to undergo transposition. The adjustment may be up regulation or down regulation. The present invention is preferably directed to variants that exhibit a loss of activation ability, but it should be understood that the invention extends to the production of variants that exhibit improved transposition ability. In this context, references to “functional” derivatives, homologues or analogues should be understood to be references to molecules of the invention that exhibit a defined modulation of transposition ability.

変化、変更、または他の改変は、構造的改変（スフィンゴシンキナーゼ分子の二次、三次、または四次構造の変更のような）、分子改変（スフィンゴシンキナーゼタンパク質からの一つまたは複数のアミノ酸の付加、置換、または欠失のような）、または化学改変が含まれるがそれらに限定されるわけではない任意の形であってもよい。本発明の改変はまた、タンパク質様もしくは非タンパク質様分子とスフィンゴシンキナーゼタンパク質との融合体、連結、もしくは結合、またはスフィンゴシンキナーゼタンパク質をコードする核酸分子に及ぶと理解すべきである。同様に、本発明の変異はスフィンゴシンキナーゼ発現産物によって発現されることが必要であるが、変異の作製は、野生型スフィンゴシンキナーゼタンパク質を変異させること、スフィンゴシンキナーゼ変種を合成すること、または変異した核酸分子の発現産物がスフィンゴシンキナーゼタンパク質変種であるように野生型スフィンゴシンキナーゼタンパク質をコードする核酸分子を改変すること、を含む任意の適した手段によって得てもよいと理解すべきである。好ましくは、変異は、単一または複数のアミノ酸配列の置換、付加、および／または欠失である。 Changes, alterations, or other modifications can be structural alterations (such as changes in the secondary, tertiary, or quaternary structure of the sphingosine kinase molecule), molecular alterations (addition of one or more amino acids from the sphingosine kinase protein) , Substitutions, or deletions), or any form including but not limited to chemical modification. It should be understood that the modifications of the invention also extend to fusions, linkages, or binding of proteinaceous or non-proteinaceous molecules and sphingosine kinase proteins, or nucleic acid molecules encoding sphingosine kinase proteins. Similarly, while the mutations of the present invention need to be expressed by sphingosine kinase expression products, the generation of mutations can be accomplished by mutating wild-type sphingosine kinase proteins, synthesizing sphingosine kinase variants, or mutated nucleic acids. It should be understood that the nucleic acid molecule encoding the wild type sphingosine kinase protein may be obtained by any suitable means, including modifying the expression product of the molecule to be a sphingosine kinase protein variant. Preferably, the mutation is a substitution, addition and / or deletion of a single or multiple amino acid sequence.

この好ましい態様に従って、野生型スフィンゴシンキナーゼ、またはスフィンゴシンキナーゼ変種の機能的誘導体、相同体、もしくは類似体と比較して転移能の消失または低減を示す、アミノ酸191〜206位の単一または複数のアミノ酸置換および／または欠失を有するアミノ酸配列を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ変種が提供される。 In accordance with this preferred embodiment, the single or multiple amino acids at amino acids 191-206 exhibit loss or reduction in metastatic potential compared to a wild-type sphingosine kinase, or a functional derivative, homologue, or analog of a sphingosine kinase variant. Human sphingosine kinase variants comprising amino acid sequences having substitutions and / or deletions are provided.

好ましくは、アミノ酸はアミノ酸Phe197および／またはLeu198であり、さらにより好ましくは置換はPhe197Alaおよび／またはLeu198Gln置換である。 Preferably, the amino acid is the amino acid Phe197 and / or Leu198, and even more preferably the substitution is a Phe197Ala and / or Leu198Gln substitution.

本発明に関して、「野生型」スフィンゴシンキナーゼという言及は、所定の集団におけるほとんどの個体によって発現されるスフィンゴシンキナーゼの型に対する言及である。スフィンゴシンキナーゼの一つより多い野生型が存在する可能性があり（例えば対立遺伝子またはイソ型変種により）、野生型スフィンゴシンキナーゼ分子によって示される転位能のレベルまたは程度は、一定範囲のレベルに入る可能性がある。しかし、「野生型」には、転位されることができないスフィンゴシンキナーゼの天然に存在する型に対する言及は含まれないと理解すべきである。スフィンゴシンキナーゼのそのような変種型は、実際に、本発明の状況においてスフィンゴシンキナーゼの天然に存在する変異型を構成する可能性がある。 In the context of the present invention, reference to “wild type” sphingosine kinase is a reference to the type of sphingosine kinase that is expressed by most individuals in a given population. There may be more than one wild type of sphingosine kinase (eg, due to an allelic or isotype variant) and the level or degree of transposition ability exhibited by the wild type sphingosine kinase molecule can fall within a range of levels. There is sex. However, it should be understood that “wild type” does not include a reference to a naturally occurring form of sphingosine kinase that cannot be translocated. Such variant forms of sphingosine kinase may indeed constitute naturally occurring variants of sphingosine kinase in the context of the present invention.

本明細書において先に定義した「物質」という言及は、本明細書において定義されたスフィンゴシンキナーゼ変種に対する言及が含まれると理解すべきである。 It should be understood that reference to “substance” as defined herein above includes reference to a sphingosine kinase variant as defined herein.

さらにもう一つの局面において、本発明は、本明細書において先に定義したスフィンゴシンキナーゼ変種を発現するように改変されている遺伝子改変動物に及ぶ。 In yet another aspect, the invention extends to a genetically modified animal that has been modified to express a sphingosine kinase variant as defined herein above.

本発明は、以下の非制限的な実施例を参照して記述される。 The invention will be described with reference to the following non-limiting examples.

実施例1
スフィンゴシンキナーゼ1燐酸化および細胞質膜への転位はその腫瘍形成能を媒介する
細胞培養、トランスフェクション、および細胞の分画
ヒト胎児腎（HEK293T）細胞およびNIH3T3線維芽細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において培養して、既に記述されているように（Pitson et al., 2000、前記）回収した。HEK293T細胞に関して燐酸カルシウム沈殿法を用いて、およびNIH3T3細胞に関してリポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いて、安定かつ一過性のトランスフェクションを行った。安定なトランスフェクタントをG418抵抗性に関して選択して、単一のトランスフェクトした細胞からの個々のクローンの選択および伝幡によって生じる可能性がある表現型のアーチファクトを回避するためにプールした。細胞下分画に関して、既に記述されているように（Pitson et al. 2003, EMBO J. 22:5491〜5500）細胞溶解物の後核上清をサイトゾルと膜分画に分離した。 Example 1
Cell culture, transfection, and cell fractionation of sphingosine kinase 1 phosphorylation and translocation to the cytoplasmic membrane mediate its tumorigenic potential Human embryonic kidney (HEK293T) cells and NIH3T3 fibroblasts were treated with Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) ) And harvested as previously described (Pitson et al., 2000, supra). Stable and transient transfections were performed using calcium phosphate precipitation for HEK293T cells and Lipofectamine 2000 (Invitrogen) for NIH3T3 cells. Stable transfectants were selected for G418 resistance and pooled to avoid phenotypic artifacts that could be caused by selection and transmission of individual clones from a single transfected cell. For subcellular fractionation, the post-nuclear supernatant of the cell lysate was separated into the cytosol and membrane fraction as previously described (Pitson et al. 2003, EMBO J. 22: 5491-5500).

抗体
M2抗FLAG抗体は、Sigmaから、抗H-Rasポリクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnologyから、およびHRP-共役抗マウスおよび抗ウサギIgGはPierceから得た。抗hSK1および抗ホスホ-hSK1抗体は既に記述されている（Pitson et al. 2003、前記）。 antibody
M2 anti-FLAG antibody was obtained from Sigma, anti-H-Ras polyclonal antibody from Santa Cruz Biotechnology, and HRP-conjugated anti-mouse and anti-rabbit IgG from Pierce. Anti-hSK1 and anti-phospho-hSK1 antibodies have already been described (Pitson et al. 2003, supra).

スフィンゴシンキナーゼアッセイ
スフィンゴシンキナーゼアッセイは、既に記述されているように（Pitson et al. 2000、前記）、基質としてD-エリスロ-スフィンゴシン（Biomol, Plymouth Meeting, PA）および[γ³²P]ATP（Geneworks, Adelaide, South Australia）を用いて決定した。スフィンゴシンキナーゼ活性の単位（U）は、1 pmol S1P/分を産生するために必要な酵素量であると定義される。 Sphingosine Kinase Assay The sphingosine kinase assay was performed as described previously (Pitson et al. 2000, supra) with D-erythro-sphingosine (Biomol, Plymouth Meeting, PA) and [γ ³² P] ATP (Geneworks, Adelaide, South Australia). The unit of sphingosine kinase activity (U) is defined as the amount of enzyme required to produce 1 pmol S1P / min.

Lck-hSK1構築物の作製
Lckタンパク質チロシンキナーゼのアミノ酸10個のN-末端二重アシル化モチーフ（MGCGCSSHPE）は、細胞質膜にタンパク質をターゲティングするために十分であることが示されている（Zlatkine et al., 1997, J. Cell Sci. 110:673〜679）。このように、Lck-hSK1キメラは、鋳型DNAとしてpcDNA3-hSK1（Pitson et al. 2000、前記）を用いて、オリゴヌクレオチドプライマー

およびSP6によるPCRによって産生した。得られた産物をEcoRIによる消化によってpcDNA3（Invitrogen）にクローニングした。制限分析によって方向性を決定して、シークエンシングによってFLAGタグLck-hSK1 cDNA配列の完全性を確認した。FLAGタグLck-hSK1^S225Aキメラを作製するために、pcDNA3-hSK1^S225Aの野生型5'末端を表すKpnI-PmlI断片（Pitson et al. 2003、前記）を、Lck二重アシル化モチーフを含む150 bpのKpnI-PmlI pcDNA3-Lck-hSK1 DNA断片に置換した。 Preparation of Lck-hSK1 construct
The 10 amino acid N-terminal double acylation motif (MGCGCSSHPE) of Lck protein tyrosine kinase has been shown to be sufficient to target proteins to the cytoplasmic membrane (Zlatkine et al., 1997, J. Cell Sci. 110: 673-679). Thus, Lck-hSK1 chimera uses pcDNA3-hSK1 (Pitson et al. 2000, supra) as template DNA and oligonucleotide primer.

And produced by PCR with SP6. The resulting product was cloned into pcDNA3 (Invitrogen) by digestion with EcoRI. Directionality was determined by restriction analysis, and the integrity of the FLAG-tagged Lck-hSK1 cDNA sequence was confirmed by sequencing. To create a FLAG-tagged Lck-hSK1 ^S225A chimera, a KpnI-PmlI fragment (Pitson et al. 2003, supra) representing the wild-type 5 ′ end of pcDNA3-hSK1 ^S225A was cloned ^into the 150 bp containing the Lck double acylation motif. Of KpnI-PmlI pcDNA3-Lck-hSK1 DNA fragment.

免疫蛍光
安定にトランスフェクトしたNIH3T3細胞をフィブロネクチンコーティング8ウェルガラスチャンバースライド（Nalge Nunc International）に細胞1×10⁴個/ウェルで播種して、24時間インキュベートした。細胞を4％パラホルムアルデヒドのPBS溶液によって10分間固定して、0.1％トライトンX-100のPBS溶液によって透過性にして、3％BSAおよび0.1％トライトンX-100を含むPBSにおいてM2抗FLAG抗体と共に1時間インキュベートした。FITC共役抗マウスIgGによって免疫複合体を検出した。蛍光顕微鏡検査は、蛍光励起フィルター（494 nm）を備えたOlympus BX-51顕微鏡において行い、Cool Snap FX電荷カップリング装置カメラ（Photometrics, Phoenix, AZ）に獲得した。 Immunofluorescence Stably transfected NIH3T3 cells were seeded at 1 × 10 ⁴ cells / well in fibronectin-coated 8-well glass chamber slides (Nalge Nunc International) and incubated for 24 hours. Cells were fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 10 minutes, permeabilized with 0.1% Triton X-100 in PBS, and with M2 anti-FLAG antibody in PBS containing 3% BSA and 0.1% Triton X-100 Incubated for 1 hour. Immune complexes were detected by FITC-conjugated anti-mouse IgG. Fluorescence microscopy was performed on an Olympus BX-51 microscope equipped with a fluorescence excitation filter (494 nm) and acquired on a Cool Snap FX charge coupling device camera (Photometrics, Phoenix, AZ).

S1Pレベル
細胞内および細胞外S1Pレベルの双方を決定するために、細胞を燐酸塩を含まないDMEMにおいて1時間インキュベートした後、[³²P]オルトホスフェート（0.2 mCi/ml）を含む新鮮な燐酸塩を含まないDMEMによって代謝的に標識して、37℃で4時間インキュベートした。細胞外S1P放出を決定するために、培地を除去して、1,000×gで遠心して、上清2.5 mlをクロロホルム2.5 ml、メタノール2.5 mlおよび濃HCl 20μlに加えた。有機相を真空下で乾燥させて、クロロホルムに浮遊させて、S1Pをシリカゲル60上でのTLCによって1-ブタノール／エタノール／酢酸／水（8：2：1：2、v/v）によって分解した。濃HCl 25μlを含むメタノール400μlに採取することによって細胞内S1Pレベルを決定した。クロロホルム400μl、KCl 400μl、および3 M NaOH 40μlを加えることによって、脂質をアルカリ条件で抽出した。これらの条件でS1Pを含む水相を、濃HCl 50μlを加えることによって酸性にして、クロロホルム400μlによって再度抽出した。有機相を真空下で乾燥させて、クロロホルムに浮遊させて、上記のようにTLCによってS1Pを分解した。 S1P levels To determine both intracellular and extracellular S1P levels, cells were incubated in DMEM without phosphate for 1 hour followed by fresh phosphate containing [ ³² P] orthophosphate (0.2 mCi / ml) Metabolically labeled with DMEM without, and incubated at 37 ° C. for 4 hours. To determine extracellular S1P release, the medium was removed, centrifuged at 1,000 × g, and 2.5 ml of supernatant was added to 2.5 ml chloroform, 2.5 ml methanol, and 20 μl concentrated HCl. The organic phase was dried under vacuum, suspended in chloroform, and S1P was decomposed by 1-butanol / ethanol / acetic acid / water (8: 2: 1: 2, v / v) by TLC on silica gel 60 . Intracellular S1P levels were determined by taking in 400 μl of methanol containing 25 μl of concentrated HCl. Lipids were extracted in alkaline conditions by adding 400 μl chloroform, 400 μl KCl, and 40 μl 3 M NaOH. Under these conditions, the aqueous phase containing S1P was acidified by adding 50 μl of concentrated HCl and extracted again with 400 μl of chloroform. The organic phase was dried under vacuum, suspended in chloroform and S1P decomposed by TLC as described above.

細胞生長、ブロモデオキシウリジンの取り込み、およびアポトーシス核の染色
細胞生長に関するアッセイは、既に記述されているように（Xia et al., 2000、前記）、48ウェルプレート（細胞2500個/ウェル）において5％または1％FCSを含む培地または無血清培地（0.1％BSAを含む）において細胞をインキュベートすることによって行った。細胞数はチアゾリルブルー（MTT）アッセイを用いて表記の時間で決定した。新生DNAへのブロモデオキシウリジン（BrdU）取り込みを、細胞増殖の測定として用いた。細胞を、フィブロネクチンをコーティングした8ウェルガラスチャンバースライド（Nalge Nunc International）に1×10⁴個/ウェルで播種して、2％FCSを含むDMEMにおいて24時間生長させた。細胞を10 μM BrdUと共に3時間インキュベートした後、固定して、製造元のプロトコールに従って抗BrdU-FLUOS抗体（Roche）を用いてその取り込みに関して染色した。BrdU取り込み陽性の細胞をOlympus BX-51蛍光顕微鏡によって可視化して、一カ所につき細胞少なくとも300個を採点した。アポトーシスは、細胞をメタノールにおいて1μg/ml DAPI（4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）によって室温で15分間染色することによって評価した。アポトーシス細胞を、蛍光顕微鏡を用いて縮合および断片化核によって同定して、総細胞の百分率として表記した。一カ所につき最小で細胞300個を採点した。 Cell growth, bromodeoxyuridine incorporation, and staining of apoptotic nuclei Assays for cell growth were performed in 48-well plates (2500 cells / well) as previously described (Xia et al., 2000, supra). This was done by incubating the cells in media containing% or 1% FCS or serum-free media (containing 0.1% BSA). Cell numbers were determined at the indicated times using a thiazolyl blue (MTT) assay. Bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation into nascent DNA was used as a measure of cell proliferation. Cells were seeded at 1 × 10 ⁴ cells / well in 8-well glass chamber slides coated with fibronectin (Nalge Nunc International) and grown for 24 hours in DMEM containing 2% FCS. Cells were incubated with 10 μM BrdU for 3 hours, then fixed and stained for their uptake using anti-BrdU-FLUOS antibody (Roche) according to the manufacturer's protocol. BrdU uptake-positive cells were visualized with an Olympus BX-51 fluorescence microscope and at least 300 cells were scored per site. Apoptosis was assessed by staining the cells with 1 μg / ml DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole) in methanol for 15 minutes at room temperature. Apoptotic cells were identified by condensation and fragmentation nuclei using a fluorescence microscope and expressed as a percentage of total cells. A minimum of 300 cells were scored per site.

結果
hSK1の燐酸化は、細胞増殖の増強および生存にとって必要である
野生型hSK1の過剰発現は、細胞増殖および生存を有意に増強した（Olivera et al, 1999、前記；Xia et al., 2000、前記；Edsall et al., 2001、上記；Sukocheva et al., 2003、前記；Olivera et al, 2003、前記）。しかし、それによってこれが起こる正確な分子メカニズムは不明である。これらの効果は、hSK1の触媒活性に依存し、これらはスフィンゴシンキナーゼ阻害剤であるN,N-ジメチルスフィンゴシンによって遮断され（Olivera et al, 1999、前記；Xia et al., 2000、前記；Edsall et al., 2001、前記）、Gタンパク質共役S1P受容体とは無関係であるように思われる（Olivera et al, 1999、前記；Olivera et al, 2003、前記）。このように、増強された生長および生存は、まだ同定されていない細胞内標的に及ぼすS1Pの作用によるように思われる。今日まで、細胞における総S1Pレベルの増加は、過剰発現されたhSK1の高い内因性の触媒活性（Pitson et al. 2000、前記）の結果として、これらの生物効果を誘導するために十分であると見なされている（Olivera et al, 1999、前記；Xia et al., 2000、前記；Edsall et al., 2001、前記；Nava et al., 2002、前記；Sukocheva et al., 2003、前記）。最近の知見から、Ser225でのhSK1の燐酸化によって、その触媒活性化および細胞膜への転位が起こることが示されている（Pitson et al. 2003、前記）。 result
Phosphorylation of hSK1 is required for enhanced cell proliferation and survival Overexpression of wild-type hSK1 significantly enhanced cell proliferation and survival (Olivera et al, 1999, supra; Xia et al., 2000, supra) Edsall et al., 2001, supra; Sukocheva et al., 2003, supra; Olivera et al, 2003, supra). However, the exact molecular mechanism by which this occurs is unknown. These effects depend on the catalytic activity of hSK1, which is blocked by the sphingosine kinase inhibitor N, N-dimethylsphingosine (Olivera et al, 1999, supra; Xia et al., 2000, supra; Edsall et al. al., 2001, supra), appears to be independent of G protein-coupled S1P receptors (Olivera et al, 1999, supra; Olivera et al, 2003, supra). Thus, enhanced growth and survival appears to be due to the action of S1P on intracellular targets that have not yet been identified. To date, increases in total S1P levels in cells are sufficient to induce these biological effects as a result of the high endogenous catalytic activity of overexpressed hSK1 (Pitson et al. 2000, supra). (Olivera et al, 1999, supra; Xia et al., 2000, supra; Edsall et al., 2001, supra; Nava et al., 2002, supra; Sukocheva et al., 2003, supra). Recent findings indicate that phosphorylation of hSK1 at Ser225 causes its catalytic activation and translocation to the cell membrane (Pitson et al. 2003, supra).

hSK1の燐酸化が、増殖および生存において重要であるか否かを調べるために、非活性化hSK1^S225A変異体がこれらのプロセスを促進するか否かを調べた。野生型hSK1の過剰発現は、1％および5％血清のいずれかを含む培地におけるNIH3T3細胞の生長を顕著に増強したのみならず、血清の非存在下での生存および生長能をこれらの細胞に付与した（図1A〜C）。しかし対照的に、hSK1^S225Aを過剰発現する細胞は、そのような生長の増強または血清非依存性を示さなかった（図1A〜C）。これは、トランスフェクトされたタンパク質の類似のレベルを発現して、同等の総スフィンゴシンキナーゼ活性を有する細胞であるにもかかわらずである（図1D）。類似の結果はまた、HEK293T細胞についても認められた。 In order to investigate whether phosphorylation of hSK1 is important in growth and survival, it was investigated whether non-activated hSK1 ^S225A mutants promote these processes. Overexpression of wild-type hSK1 not only significantly enhanced the growth of NIH3T3 cells in media containing either 1% or 5% serum, but also provided these cells with survival and growth potential in the absence of serum. (Figures 1A-C). However, in contrast, cells overexpressing hSK1 ^S225A did not show such growth enhancement or serum independence (FIGS. 1A-C). This is despite the cells expressing similar levels of transfected protein and having comparable total sphingosine kinase activity (FIG. 1D). Similar results were also observed for HEK293T cells.

これまでの研究から、野生型hSK1の過剰発現からの生長速度の増加が細胞増殖の増加およびアポトーシスの低減の双方の組み合わせに起因することが示された（Olivera et al, 1999、前記；Edsall et al., 2001、前記；Olivera et al, 2003、前記）。これらの試験と一致して、新生DNAへのBrdU取り込みによる細胞増殖のアッセイから、野生型hSK1の過剰発現が細胞増殖の増加において有意な効果を有することが示された（図1E）。しかし、対照的に、hSK1^S225Aを過剰発現する細胞は、そのような増殖の増強を示さず、対照細胞と類似のBrdU取り込みを示した（図1E）。同様に、野生型hSK1の過剰発現は、核の濃縮および断片化によって測定したところ、血清枯渇誘導アポトーシスを劇的に低減させた（図1F）。しかし、この場合もhSK1^S225Aの過剰発現は顕著に異なる結果を示し、細胞にアポトーシスに対するそのような保護を提供しなかった（図1F）。したがって、野生型hSK1と全く対照的に、非燐酸化hSK1^S225A変異体の過剰発現は、双方のトランスフェクト細胞が類似の細胞スフィンゴシンキナーゼ活性を産生するにもかかわらず、増殖を増加させず、アポトーシスに対しても保護しない。このように、hSK1の燐酸化は、増殖の増強および生存に関して認められた効果にとって必須であり、これらの効果に至るシグナル伝達プロセスにとって重要である酵素の定量的変化を示唆している。 Previous studies have shown that increased growth rates from overexpression of wild-type hSK1 are due to a combination of both increased cell proliferation and reduced apoptosis (Olivera et al, 1999, supra; Edsall et al. al., 2001, supra; Olivera et al, 2003, supra). Consistent with these studies, assay of cell proliferation by BrdU incorporation into nascent DNA showed that overexpression of wild type hSK1 had a significant effect on increasing cell proliferation (FIG. 1E). However, in contrast, cells overexpressing hSK1 ^S225A did not show such enhanced proliferation and showed similar BrdU incorporation as control cells (FIG. 1E). Similarly, overexpression of wild-type hSK1 dramatically reduced serum deprivation-induced apoptosis as measured by nuclear enrichment and fragmentation (FIG. 1F). However, again ^{overexpression} of hSK1 ^S225A showed markedly different results and did not provide cells with such protection against apoptosis (FIG. 1F). Thus, in stark contrast to wild-type hSK1, overexpression of the unphosphorylated hSK1 ^S225A mutant did not increase proliferation and apoptosis even though both transfected cells produced similar cellular sphingosine kinase activity We do not protect against. Thus, phosphorylation of hSK1 is essential for the observed effects on enhanced proliferation and survival, suggesting quantitative changes in the enzyme that are important for the signaling process leading to these effects.

hSK1の細胞質膜局在は、hSK1燐酸化とは無関係に細胞増殖および生存を増強する
hSK1は、特定のアゴニストに細胞を曝露すると、細胞質から細胞質膜に転位することは十分に確立されている（Pitson et al. 2003、前記；Rosenfeldt et al., 2001、前記；Johnson et al., 2002；Melendez et al., 2002、前記；Young et al, 2003, Cell Calcium 33:119〜128）。この転位は、Ser225位でのhSK1の燐酸化に依存することが示されている（Pitson et al. 2003、前記）。増殖および生存の増強も同様に、hSKのSer225位の燐酸化に依存する。これらの生物効果に及ぼす細胞質膜へのhSK1局在の役割を調べた。細胞質膜局在hSK1タンパク質は、野生型hSK1およびhSK1^S225AのN-末端にアミノ酸10個のLckタンパク質チロシンキナーゼ二重アシル化モチーフを加えることによって作製され、それぞれ、Lck-hSK1およびLck-hSK1^S225Aを産生する。NIH3T3細胞におけるこれらのタンパク質の過剰発現によって、hSK1およびhSK1^S225Aの過剰発現に関して認められた場合よりわずかにより低い細胞スフィンゴシンキナーゼ活性が生成された（図1D）。このモチーフがタンパク質を細胞質膜にターゲティングするために十分であることを示したこれまでの研究と一致して（Zlatkine et al., 1997、前記）、Lck-hSK1およびLck-hSK1^S225Aタンパク質ならびにスフィンゴシンキナーゼ活性の膜分画への実質的な局在（図2A）が観察された。さらなる免疫蛍光分析（図2B）は、細胞質膜へのLck-hSK1およびLck-hSK1^S225Aの明確な局在を示したが、初期の報告（Pitson et al. 2003、前記）と一致して、hSK1およびhSK1^S225Aはサイトゾルに存在した。 Cytoplasmic membrane localization of hSK1 enhances cell proliferation and survival independent of hSK1 phosphorylation
hSK1 is well established to translocate from the cytoplasm to the cytoplasmic membrane when cells are exposed to certain agonists (Pitson et al. 2003, supra; Rosenfeldt et al., 2001, supra; Johnson et al., 2002; Melendez et al., 2002, supra; Young et al, 2003, Cell Calcium 33: 119-128). This rearrangement has been shown to depend on phosphorylation of hSK1 at Ser225 (Pitson et al. 2003, supra). Increased proliferation and survival are also dependent on phosphorylation at the Ser225 position of hSK. The role of hSK1 localization in the cytoplasmic membrane on these biological effects was investigated. The cytoplasmic membrane-localized hSK1 protein was made by adding a 10 amino acid Lck protein tyrosine kinase double acylation motif to the N-terminus of wild-type hSK1 and hSK1 ^S225A , and the Lck-hSK1 and Lck-hSK1 ^S225A , respectively. Produce. Overexpression of these proteins in NIH3T3 cells produced slightly lower cellular sphingosine kinase activity than was observed for hSK1 and hSK1 ^S225A overexpression (FIG. 1D). Consistent with previous studies that showed that this motif is sufficient to target proteins to the cytoplasmic membrane (Zlatkine et al., 1997, supra), Lck-hSK1 and Lck-hSK1 ^S225A proteins and sphingosine kinase Substantial localization of the active membrane fraction (FIG. 2A) was observed. Further immunofluorescence analysis (Figure 2B) showed a clear localization of Lck-hSK1 and Lck-hSK1 ^S225A to the cytoplasmic membrane, but consistent with earlier reports (Pitson et al. 2003, supra) And hSK1 ^S225A was present in the cytosol.

野生型hSK1と同様に、Lck-hSK1の過剰発現はNIH3T3細胞の生長を顕著に増強し、同様にこれらの細胞に血清の非存在下での生存および生長能を付与した（図1A〜C）。しかし、hSK1^S225Aとは全く対照的に、Lck-hSK1^S225Aの過剰発現も同様に血清枯渇条件での生存と共に生長の増強を付与した（図1A〜C）。これらの細胞のさらなる試験から、野生型hSK1と同様に、Lck-hSK1および非燐酸化Lck-hSK1^S225Aがいずれも、細胞増殖の増強および血清枯渇誘導アポトーシスの低減を通して細胞生長を増加させることが示された（図1E、F）。したがって、細胞質膜へのhSK1の局在は、酵素の燐酸化状態とは無関係に、細胞増殖を増強して、アポトーシスに対して保護するために十分である。したがって、hSK1の燐酸化は、触媒活性の関連する増加の結果としてよりむしろ、細胞質膜へのhSK1の転位の誘導を通してこれらの観察された生物学的効果を媒介する。 Similar to wild-type hSK1, overexpression of Lck-hSK1 markedly enhanced the growth of NIH3T3 cells, as well as conferring these cells to survive and grow in the absence of serum (FIGS. 1A-C) . However, in stark contrast to the hSKl ^S225A, imparted with enhanced growth with survival in overexpression likewise serum deprivation conditions Lck-hSKl ^S225A (Figure 1A-C). Further studies of these cells show that, like wild-type hSK1, both Lck-hSK1 and non-phosphorylated Lck-hSK1 ^S225A increase cell growth through enhanced cell proliferation and reduced serum starvation-induced apoptosis. (Fig. 1E, F). Thus, localization of hSK1 to the cytoplasmic membrane is sufficient to enhance cell proliferation and protect against apoptosis, regardless of the phosphorylation state of the enzyme. Thus, phosphorylation of hSK1 mediates these observed biological effects through induction of hSK1 translocation to the cytoplasmic membrane, rather than as a result of a related increase in catalytic activity.

hSK1の燐酸化誘導細胞質膜局在は、細胞のトランスフォーメーションを媒介する
hSK1のSer225燐酸化は、細胞増殖および生存を増強するためにその効果にとって必須であることが確立されていることから、細胞のトランスフォーメーションに及ぼすその効果を調べた。既に記述されているように（Xia et al., 2000、前記）、野生型hSK1は、NIH3T3細胞にトランスフェクトした場合に、軟寒天におけるコロニー形成によってアッセイしたところ、かなりのトランスフォーム活性を示した（図3）。しかし対照的に、類似のレベルおよびhSK1^S225Aの触媒活性の過剰発現によって、これらの細胞におけるトランスフォーメーションは顕著により少なくなった（図3）。特に、hSK1^S225Aを発現するこれらの細胞は、野生型hSK1によるNIH3T3細胞のトランスフォーメーションにとって必要であることが既に示されている活性よりかなり高いスフィンゴシンキナーゼ活性を有した（Xia et al., 2000、前記）。したがって、増殖および生存の増強の状況と同様に、これらの実験は、細胞のトランスフォーメーションの原因であるのは、スフィンゴシンキナーゼ活性のレベルの上昇ではないことを証明しており、その代わりにタンパク質の燐酸化された活性化状態のもう一つの局面がこれらの効果の原因であることを示している。腫瘍遺伝子H-Ras（V12-Ras）によるNIH3T3細胞のトランスフォーメーションは、触媒的に不活性なドミナントネガティブ型のhSK1によって遮断されることが既に証明されており、hSK1がRas誘導細胞トランスフォーメーションに強く関係していることを示している（Xia et al., 2000、前記）。顕著に、非燐酸化hSK1^S225Aも同様にRas-誘導細胞トランスフォーメーションを遮断し、この経路におけるhSK1活性化の必要条件をさらに確認する（図3）。したがって、この意味において、hSK1^S225Aは、完全な触媒活性を有するにもかかわらず、タンパク質のドミナントネガティブ型として明らかに作用する。 Phosphorylation-induced cytoplasmic membrane localization of hSK1 mediates cell transformation
Since Ser225 phosphorylation of hSK1 has been established to be essential for its effect to enhance cell proliferation and survival, its effect on cell transformation was investigated. As already described (Xia et al., 2000, supra), wild-type hSK1 showed considerable transforming activity when transfected into NIH3T3 cells and assayed by colony formation in soft agar. (Figure 3). In contrast, however, similar levels and overexpression of hSK1 ^S225A catalytic activity resulted in significantly less transformation in these cells (FIG. 3). In particular, these cells expressing hSK1 ^S225A had significantly higher sphingosine kinase activity than that already shown to be necessary for transformation of NIH3T3 cells by wild type hSK1 (Xia et al., 2000, Said). Thus, as well as the situation of enhanced proliferation and survival, these experiments demonstrate that it is not the increased level of sphingosine kinase activity that is responsible for cellular transformation, but instead of protein It is shown that another aspect of the phosphorylated activation state is responsible for these effects. The transformation of NIH3T3 cells by the oncogene H-Ras (V12-Ras) has already been shown to be blocked by the catalytically inactive dominant negative form of hSK1, and hSK1 is highly resistant to Ras-induced cell transformation. (Xia et al., 2000, supra). Notably, ^{unphosphorylated} hSK1 ^S225A similarly blocks Ras-induced cell transformation, further confirming the requirement for hSK1 activation in this pathway (FIG. 3). Thus, in this sense, hSK1 ^S225A clearly acts as a dominant negative form of the protein despite having full catalytic activity.

細胞のトランスフォーメーションに及ぼすhSK1の細胞質膜局在の効果を調べた。野生型hSK1と同様に、NIH3T3細胞におけるLck-hSK1およびLck-hSK1^S225Aの双方の過剰発現によって、軟寒天において活発なコロニーの形成が起こった（図3）。空のベクター対照細胞においてもいくつかのバックグラウンドコロニーが観察されたが、Lck-hSK1およびLck-hSK1^S225A過剰発現細胞は、20〜30倍多いコロニーを形成し、それらは大きさもかなりより大きかった。実際に、Lck-hSK1およびLck-hSK1^S225Aの過剰発現によって形成されたコロニーは、野生型hSK1を過剰発現する細胞において観察されたコロニーより大きく、より多数であった（図3）。このように、hSK1の細胞質膜への局在は、酵素の燐酸化状態とは無関係に細胞のトランスフォーメーションを増強するために十分である。 The effect of hSK1 cytoplasmic membrane localization on cell transformation was investigated. Similar to wild type hSK1, overexpression of both Lck-hSK1 and Lck-hSK1 ^S225A in NIH3T3 cells resulted in active colony formation in soft agar (FIG. 3). Some background colonies were also observed in empty vector control cells, but Lck-hSK1 and Lck-hSK1 ^S225A overexpressing cells formed 20-30 times more colonies, which were much larger in size . Indeed, colonies formed by overexpression of Lck-hSK1 and Lck-hSK1 ^S225A were larger and more numerous than those observed in cells overexpressing wild type hSK1 (FIG. 3). Thus, localization of hSK1 to the cytoplasmic membrane is sufficient to enhance cell transformation regardless of the phosphorylation state of the enzyme.

hSK1の燐酸化および細胞質膜局在はS1P産生を増強する
hSK1の基質であるスフィンゴシンは細胞膜のあいだに急速に拡散することができるが、細胞質膜に主に見いだされる（Slife et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:10371〜10377）。したがって、hSK1の細胞膜への局在に関して観察された劇的な生物効果の一つの可能性があるメカニズムは、S1P産生の増強である。Lck-hSK1および非燐酸化Lck-hSK1S225Aの双方の過剰発現によって、細胞内S1Pの類似の増加および培地へのS1P放出の増強が起こり、これは野生型hSK1またはhSK1S225Aのいずれかに関して観察された値より実質的に大きかった（図4）。 Phosphorylation and cytoplasmic membrane localization of hSK1 enhances S1P production
Sphingosine, a substrate for hSK1, can diffuse rapidly between cell membranes, but is found primarily in the cytoplasmic membrane (Slife et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 10371-10377). Thus, one possible mechanism for the dramatic biological effects observed with respect to hSK1 localization in the cell membrane is enhanced S1P production. Overexpression of both Lck-hSK1 and non-phosphorylated Lck-hSK1S225A resulted in a similar increase in intracellular S1P and enhanced release of S1P into the medium, which was observed for either wild-type hSK1 or hSK1S225A It was substantially larger (Figure 4).

当業者は、本明細書に記述の本発明が具体的に記述された以外の変動および改変を受けることを認識するであろう。本発明にはそのような全ての変動および改変が含まれると理解すべきである。本発明にはまた、本明細書において個々にまたは集合的に言及されたまたは示された段階、特徴、組成物の全て、および該段階または特徴の任意の二つまたはそれより多い任意の全ての組み合わせが含まれる。 Those skilled in the art will recognize that the invention described herein is subject to variations and modifications other than those specifically described. It should be understood that the invention includes all such variations and modifications. The invention also includes all of the steps, features, compositions mentioned or shown individually or collectively herein, and any two or more of any of the steps or features. A combination is included.

実施例2
スフィンゴシンキナーゼのカルモジュリン結合部位およびスフィンゴシンキナーゼの細胞質膜へのアゴニスト依存的転位におけるその役割
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト胎児腎細胞（HEK293T）を、10％仔ウシ胎児血清（JRH Biosciences）、2 mMグルタミン、0.2％（w/v）重炭酸ナトリウム、ペニシリン（1.2 mg/ml）、およびストレプトマイシン（1.6 mg/ml）を含むダルベッコ改変イーグル培地（JRH Biosciences, Lenexa, KS）において培養した。細胞を燐酸カルシウム沈殿法を用いて一過性にトランスフェクトして、回収し、既に記述されているように（Pitson et al. 2000、前記）超音波によって溶解した。細胞ホモジネートにおけるタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いてクーマシーブリリアントブルー試薬（Sigma）によって決定した。 Example 2
The calmodulin binding site of sphingosine kinase and its role in agonist-dependent translocation of sphingosine kinase to the cytoplasmic membrane Materials and methods Cell culture and transfection Human fetal kidney cells (HEK293T), 10% fetal calf serum (JRH Biosciences), 2 Cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (JRH Biosciences, Lenexa, KS) containing mM glutamine, 0.2% (w / v) sodium bicarbonate, penicillin (1.2 mg / ml), and streptomycin (1.6 mg / ml). Cells were transiently transfected using calcium phosphate precipitation, harvested and lysed by ultrasound as previously described (Pitson et al. 2000, supra). The protein concentration in the cell homogenate was determined by Coomassie Brilliant Blue reagent (Sigma) using bovine serum albumin as a standard.

スフィンゴシンキナーゼアッセイ
スフィンゴシンキナーゼ活性は、既に記述されているように（Roberts et al., Anal. Biochem 331, 122〜129）D-エリスロ-スフィンゴシン（Biomol, Plymouth Meeting, PA）および[γ³²P]ATPを基質として用いてルーチンとして決定した。スフィンゴシンキナーゼ活性の単位（U）は、1 pmol S1P/分を産生するために必要な酵素の量として定義される。 Sphingosine kinase assay Sphingosine kinase activity was determined as described previously (Roberts et al., Anal. Biochem 331, 122-129) D-erythro-sphingosine (Biomol, Plymouth Meeting, PA) and [γ ³² P] ATP. As a substrate and determined as a routine. The unit of sphingosine kinase activity (U) is defined as the amount of enzyme required to produce 1 pmol S1P / min.

カルモジュリン結合アッセイ
スフィンゴシンキナーゼのCa²⁺/CaM結合を評価するためのアッセイを、既に詳述されているように（Pitson et al. 2002, J. Biol. Chem. 277, 49545〜49553）行った。簡単に説明すると、先に記述したように、野生型または変異体hSK1もしくはhSK2を過剰発現するHEK293T細胞を回収して溶解した。細胞溶解物を遠心して（13000×g、4℃で15分）細胞の破片を除去した。上清の少量を、50 mMトリス/HCl（pH 7.4）、5 mM CaCl₂、100 mM NaCl、10％（w/v）グリセロール、0.05％（w/v）トライトンX-100、1 mMジチオスレイトール、1.5 mM Na₃VO₄、7.5 mM NaF、およびプロテアーゼ阻害剤（Complete（商標）、Roche）からなる結合緩衝液によって予め平衡にしたCaM-セファロース4B（Amersham Biosciences）を含む試験管に加えて、絶えず攪拌しながら4℃で30分間インキュベートした。CaM-セファロース4Bビーズを遠心（5000×g、4℃で5分）によって沈降させて、結合緩衝液によって2回洗浄した。結合したhSK1またはhSK2をSDS-PAGEによって分解して、FLAGエピトープによるウェスタンブロッティングによって可視化した。セファロースCL-4B（Amersham Biosciences）を、CaM-セファロース4Bに対する非特異的結合の対照として用いた。 Calmodulin binding assay Assays for assessing Ca2 ⁺ / CaM binding of sphingosine kinase were performed as previously described (Pitson et al. 2002, J. Biol. Chem. 277, 49545-49553). Briefly, HEK293T cells overexpressing wild type or mutant hSK1 or hSK2 were harvested and lysed as described above. Cell lysates were centrifuged (13000 × g, 15 minutes at 4 ° C.) to remove cell debris. A small amount of supernatant was added to 50 mM Tris / HCl (pH 7.4), 5 mM CaCl ₂ , 100 mM NaCl, 10% (w / v) glycerol, 0.05% (w / v) Triton X-100, 1 mM dithiothrei In addition to a tube containing CaM-Sepharose 4B (Amersham Biosciences) pre-equilibrated with a binding buffer consisting of Toll, 1.5 mM Na ₃ VO ₄ , 7.5 mM NaF, and a protease inhibitor (Complete ™, Roche) Incubated for 30 minutes at 4 ° C. with constant stirring. CaM-Sepharose 4B beads were sedimented by centrifugation (5000 × g, 5 minutes at 4 ° C.) and washed twice with binding buffer. Bound hSK1 or hSK2 was resolved by SDS-PAGE and visualized by Western blotting with the FLAG epitope. Sepharose CL-4B (Amersham Biosciences) was used as a control for non-specific binding to CaM-Sepharose 4B.

スフィンゴシンキナーゼ変異体の構築
hSK1 cDNA（Genbankアクセッション番号AF200328）を、3'末端でFLAGエピトープタグをつけて、既に記述されているように（Pitson et al. 2000、前記）、pALTER部位特異的変異誘発ベクター（Promega Corp., Annandale, Australia）にサブクローニングした。一本鎖DNAを調製して、製造元のプロトコールに詳述されているように、これをオリゴヌクレオチド特異的変異誘発の鋳型として用いた。点突然変異体構築物を作製するために用いた変異誘発オリゴヌクレオチドは以下の通りであった：

。所望の改変が取り込まれていることを確認するために、変異体をシークエンシングして、その後cDNAを、HEK293T細胞への一過性のトランスフェクションのためにpcDNA3（Invitrogen, San Diego, CA）にサブクローニングした。 Construction of sphingosine kinase mutants
hSK1 cDNA (Genbank accession number AF200328) was tagged with a FLAG epitope tag at the 3 ′ end, as previously described (Pitson et al. 2000, supra), pALTER site-directed mutagenesis vector (Promega Corp. , Annandale, Australia). Single stranded DNA was prepared and used as a template for oligonucleotide-specific mutagenesis as detailed in the manufacturer's protocol. The mutagenic oligonucleotides used to make the point mutant constructs were as follows:

. To confirm that the desired modification has been incorporated, the mutant is sequenced and then the cDNA is transferred to pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) for transient transfection into HEK293T cells. Subcloned.

野生型hSK1に関して既に記述されている方法（Pitson et al. 2003、前記）を用いて、hSK1^F197A/L198QをN-末端でeGFPによってタグをつけた。プライマー、5'-

を用いるQuikChange変異誘発（Stratagene）によって、pcDNA3（Roberts et al., 2004、前記）においてhSK2 cDNAからhSK2^V327A/L328Qを作製して、所望の改変が組み入れられていることを確認するためにシークエンシングした。 HSK1 ^{F197A / L198Q} was tagged with eGFP at the N-terminus using the method already described for wild-type hSK1 (Pitson et al. 2003, supra). Primer, 5'-

Make ^{hSK2 V327A / L328Q} from hSK2 cDNA in pcDNA3 (Roberts et al., 2004, supra) by QuikChange mutagenesis (Stratagene) using Sequencing to confirm that the desired modification is incorporated did.

GSTペプチドの作製およびプルダウン分析
hSK1の推定のCaM結合（PCB）領域を含むペプチドをコードする配列を、以下のプライマー：PCB1

によってhSK1 cDNAからPCR増幅した。次に、産物をEcoRIによって消化して、pGEX2Tにクローニングした。これらのpGEX2Tベクターによって形質転換した大腸菌JM109の培養物を、100 mg/Lアンピシリンを含むルリアブロスにおいて振とうさせながら37℃で終夜生長させた。次に、培養物を同じ培地で1：10に希釈して、OD₆₀₀が約0.6に達するまで、振とうさせながら37℃で1時間生長させた。GST-PCBペプチドの発現を、IPTGを最終濃度1 mMで加えることによって誘導して、培養物をさらに3時間インキュベートした。細胞を6000×gで4℃で15分の遠心によって回収して、150 mM NaCl、1％トライトンX-100、1 mM EDTA、およびプロテアーゼ阻害剤を含む50 mMトリス/HCl、pH 7.4において超音波（3×30秒、5ワットのパルス）によって溶解した。20000×gで4℃で30分間の遠心によって溶解物を透明にした後、グルタチオン-セファロース（Amersham Biosciences）を加えて、混合物を絶えず攪拌しながら4℃で1時間インキュベートした。この後、グルタチオン-セファロースを冷PBSによって3回洗浄して、GST-ペプチドを、50 mMトリス/HCl、pH 8.5において20 mMグルタチオンによって4℃で10分間溶出した。CaM-セファロースおよびGST-ペプチド融合タンパク質のプルダウン分析を、各精製GST-ペプチドまたはGST単独約1μgを用いて先に記述したように行った。CaM-セファロースに対するペプチドの結合を、抗GST抗体を用いて検出した。 Generation and pull-down analysis of GST peptides
The sequence encoding the peptide containing the putative CaM binding (PCB) region of hSK1 is the following primer: PCB1

PCR amplification from hSK1 cDNA. The product was then digested with EcoRI and cloned into pGEX2T. Cultures of E. coli JM109 transformed with these pGEX2T vectors were grown overnight at 37 ° C. with shaking in Luria broth containing 100 mg / L ampicillin. The culture was then diluted 1:10 with the same medium and grown at 37 ° C. for 1 hour with shaking until the OD ₆₀₀ reached approximately 0.6. GST-PCB peptide expression was induced by adding IPTG at a final concentration of 1 mM and the cultures were incubated for an additional 3 hours. Cells were harvested by centrifugation at 6000 × g for 15 minutes at 4 ° C. and sonicated in 50 mM Tris / HCl, pH 7.4 containing 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, and protease inhibitors (3 x 30 seconds, 5 watt pulse). After clearing the lysate by centrifugation at 20000 × g for 30 minutes at 4 ° C., glutathione-sepharose (Amersham Biosciences) was added and the mixture was incubated for 1 hour at 4 ° C. with constant stirring. After this, glutathione-sepharose was washed 3 times with cold PBS and GST-peptide was eluted with 20 mM glutathione at 4 ° C. for 10 minutes in 50 mM Tris / HCl, pH 8.5. Pull-down analysis of CaM-Sepharose and GST-peptide fusion proteins was performed as described above using about 1 μg of each purified GST-peptide or GST alone. Binding of the peptide to CaM-Sepharose was detected using an anti-GST antibody.

限定的タンパク質分解およびN-末端シークエンシング
既に記述されているように（Pitson et al. 2002、前記）、Sf9細胞から組換え型hSK1を作製して精製した。精製ウシCaM（Sigma）の3倍モル過剰量の存在下または非存在下で、100 mMトリス/HCl、pH 8.5においてトリプシン（Roche）2 ngまたは5 ngを加えることによって、このhSK1（15μlにおいて1.5μg）の限定的タンパク質分解を行った。次に、混合物を37℃で60分間インキュベートした後、100 mM 4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフルオリド（Roche）1.5 μlを加えることによって停止させて、37℃でさらに5分間インキュベートした。チプチック（typtic）切断産物をSDS-PAGEによって分解してPVDFメンブレンに転写した。メンブレンのクーマシー染色後、CaMの存在下で保護されたバンドを切り出して、オーストラリアプロテオーム分析施設において、Applied Biosystems 494 Prociseタンパク質シークエンシングシステムを用いて、そのN-末端配列を自動Edman分解6サイクルによって決定した。 Limited proteolysis and N-terminal sequencing Recombinant hSK1 was generated and purified from Sf9 cells as previously described (Pitson et al. 2002, supra). This hSK1 (1.5 in 15 μl) was added by adding 2 ng or 5 ng trypsin (Roche) in 100 mM Tris / HCl, pH 8.5, in the presence or absence of a 3-fold molar excess of purified bovine CaM (Sigma). μg) of limited proteolysis. The mixture was then incubated at 37 ° C. for 60 minutes, then stopped by adding 1.5 μl of 100 mM 4- (2-aminoethyl) -benzenesulfonyl fluoride (Roche) and incubated at 37 ° C. for an additional 5 minutes. . The typtic cleavage product was resolved by SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane. After Coomassie staining of the membrane, the protected band is excised in the presence of CaM and its N-terminal sequence determined by automated Edman degradation 6 cycles using the Applied Biosystems 494 Procise protein sequencing system at the Australian Proteome Analysis Facility did.

ウェスタンブロッティング
12％アクリルアミドゲルを用いて細胞溶解物にSDS-PAGEを行った。タンパク質をニトロセルロースにブロットして、メンブレンを5％スキムミルク粉末および0.1％（w/v）トライトンX-100を含むPBSにおいて4℃で終夜ブロックした。細胞溶解物におけるhSK1発現レベルを、モノクローナル抗体M2抗FLAG抗体（Sigma）によって溶解物の一連の希釈に対して定量して、増強化学発光キット（ECL、Amersham Biosciences）を用いて免疫複合体をHRP抗マウス（Pierce）IgGによって検出した。 Western blotting
SDS-PAGE was performed on cell lysates using a 12% acrylamide gel. Proteins were blotted onto nitrocellulose and membranes were blocked overnight at 4 ° C. in PBS containing 5% skim milk powder and 0.1% (w / v) Triton X-100. The level of hSK1 expression in the cell lysate is quantified against a series of dilutions of lysate with the monoclonal antibody M2 anti-FLAG antibody (Sigma) and the immunocomplex is HRPed using an enhanced chemiluminescence kit (ECL, Amersham Biosciences). Detection was by anti-mouse (Pierce) IgG.

酵母2ハイブリッドスクリーニング
Matchmaker Gal4 2ハイブリッドシステム3（Clontech）を用いて、製造元の説明書に従って酵母2ハイブリッドスクリーニングを行った。完全長のhSK1 cDNA（Genbankアクセッション番号AF200328）をpGBKT7（Clontech）にGal4 DNA結合ドメインとインフレームでクローニングした。おとり構築物を、pACT2（Clontech）においてヒト白血病cDNAライブラリと共に酵母株AH107に形質転換した。独立したクローン全体で1×10⁶個をスクリーニングした。 Yeast two hybrid screening
Yeast two-hybrid screening was performed using Matchmaker Gal4 2 hybrid system 3 (Clontech) according to the manufacturer's instructions. Full length hSK1 cDNA (Genbank accession number AF200328) was cloned in frame with Gal4 DNA binding domain into pGBKT7 (Clontech). The decoy construct was transformed into yeast strain AH107 together with a human leukemia cDNA library in pACT2 (Clontech). A total of 1 × 10 ⁶ independent clones were screened.

GST-カルミリンの作製
完全長のカルミリンをコードする配列を、プライマー

によって酵母2ハイブリッドスクリーニングから得られたpACT2-カルミリンからPCR増幅した。次に産物をBamHIおよびXhoIによって消化して、pGEX4T2にクローニングした。GST-カルミリンの作製は、先に記述したように大腸菌BL21において行った。 Preparation of GST-calmylin

PCR amplified from pACT2-carmillin obtained from yeast two-hybrid screening. The product was then digested with BamHI and XhoI and cloned into pGEX4T2. Production of GST-carmillin was performed in E. coli BL21 as previously described.

結果
hSK1における予想CaM-結合部位の変異誘発
hSK1とCaMとの相互作用における誘発Ca²⁺/CaM結合部位の可能性がある役割を調べるために、hSK1の部位特異的変異を行った。特に、この変異誘発はこれらのモチーフ内で保存された疎水性残基に集中しており、それらを構造的に保存された親水性残基に交換する。PCB2は、Leu153からGlnへの変異（hSK1^L153Q）によってターゲティングされ、PCB1およびPCB2はいずれもLeu147からGlnへの変異（hSK1^L147Q）によってターゲティングされ、PCB3は、Leu187からGlnへの変異（hSK1^L187Q）およびLeu200からGlnへの変異（hSK1^L200Q）によってターゲティングされ、ならびにPCB4はPhe303からHisへの変異（hSK1^F303H）によってターゲティングされた。hSK1のこれらのバージョンをHEK293T細胞において発現させて、CaM-セファロースに対するその結合能および保持された全体的なタンパク質の折り畳みの測定値としてその触媒活性を分析した。これらのhSK1変異体は全て少なくとも何らかの触媒活性を保持したが、いくぶん驚いたことに、5個全てが野生型hSK1と類似の効率でCaMに結合した（図6）。このことは、hSK1のこれらの予想されたCa²⁺/CaM結合領域がCaM結合に関係していない可能性があることを示唆した。これらの推定のCa²⁺/CaM結合領域内での他の保存された疎水性残基のさらなる変異誘発（すなわち、Leu134からGluおよびVal290からAsn）は、触媒的に不活性なhSK1タンパク質を生じ、したがって変異がこれらのタンパク質の全体的な折り畳みの破壊を引き起こした可能性のためにさらに分析しなかった。 result
Mutagenesis of a predicted CaM-binding site in hSK1
To investigate the possible role of the induced Ca ²⁺ / CaM binding site in the interaction between hSK1 and CaM, a site-specific mutation of hSK1 was performed. In particular, this mutagenesis is concentrated on hydrophobic residues conserved within these motifs, replacing them with structurally conserved hydrophilic residues. ^PCB2 is targeted by a Leu153 to Gln mutation (hSK1 ^L153Q ), both PCB1 and ^PCB2 are targeted by a Leu147 to Gln mutation (hSK1 ^L147Q ), and PCB3 is a Leu187 to Gln mutation (hSK1 ^L187Q ) And Leu200 to Gln mutation (hSK1 ^L200Q ), and PCB4 was targeted to Phe303 to His mutation (hSK1 ^F303H ). These versions of hSK1 were expressed in HEK293T cells and analyzed for their catalytic activity as a measure of their binding ability to CaM-Sepharose and the overall protein folding retained. All of these hSK1 mutants retained at least some catalytic activity, but somewhat surprisingly, all five bound to CaM with similar efficiency as wild-type hSK1 (FIG. 6). This suggested that these predicted Ca ²⁺ / CaM binding regions of hSK1 may not be related to CaM binding. Further mutagenesis (ie Leu134 to Glu and Val290 to Asn) of other conserved hydrophobic residues within these putative Ca ²⁺ / CaM binding regions results in catalytically inactive hSK1 protein Therefore, the mutation was not further analyzed due to the possibility of causing disruption of the overall folding of these proteins.

hSK1におけるCaM-結合部位の直接同定
変異誘発実験により、配列分析から予想されたhSK1のCa²⁺/CaM結合部位は、CaM結合の原因ではないことが示唆されたことから、hSK1におけるCaM結合領域を直接同定するためにさらなる実験を行った。これは最初、精製組換え型hSK1の限定的タンパク質分解を用いて行い、CaMの存在下で保護されたhSK1における切断部位を同定した。精製組換え型hSK1のトリプシンによる限定的タンパク質分解は、大きさが約9 kDa〜32 kDaに及ぶいくつかの検出可能な切断産物を生じた（図7A）。しかし、この限定的タンパク質分解の際にCaMを含めることによって、17〜22 kDaの範囲の多数のhSK1-由来産物が失われ、より大きいhSK1-由来ポリペプチドの蓄積が起こった（図7A）。CaMの存在下で限定的タンパク質分解の際に生成されなかった最も顕著な二つのポリペプチドは、おおよその分子量21および22 kDaを有した（図7A）。これらのポリペプチドは無傷の組換え型hSK1のこの末端に存在するHis-タグを保持していたこと、およびhSK1の中心領域内の少なくとも二つのトリプシン切断部位に非常に近位の結合CaMの存在によりおそらく生成されなかったことから（図7B）、hSK1のC-末端断片を表す。このように、CaMによって保護されたこれらの切断部位を同定するために、二つのペプチドのN-末端シークエンシングを行った。得られた配列

は、二つの保護されたトリプシン切断部位がArg192/Phe193およびArg198/Leu199に存在することを示している。 Direct identification of the CaM-binding site in hSK1 Mutagenesis experiments suggested that the Ca2 ⁺ / CaM binding site of hSK1 predicted from sequence analysis was not responsible for CaM binding. Further experiments were performed to directly identify. This was first done using limited proteolysis of purified recombinant hSK1 to identify cleavage sites in hSK1 that were protected in the presence of CaM. Limited proteolysis of purified recombinant hSK1 with trypsin resulted in several detectable cleavage products ranging in size from about 9 kDa to 32 kDa (FIG. 7A). However, inclusion of CaM during this limited proteolysis resulted in the loss of numerous hSK1-derived products ranging from 17-22 kDa, resulting in greater accumulation of hSK1-derived polypeptides (FIG. 7A). The two most prominent polypeptides that were not produced upon limited proteolysis in the presence of CaM had approximate molecular weights of 21 and 22 kDa (FIG. 7A). These polypeptides retained the His-tag present at this end of intact recombinant hSK1, and the presence of binding CaM very proximal to at least two trypsin cleavage sites in the central region of hSK1 Probably represents the C-terminal fragment of hSK1 (Figure 7B). Thus, N-terminal sequencing of the two peptides was performed to identify these cleavage sites protected by CaM. Obtained sequence

Shows that two protected trypsin cleavage sites are present in Arg192 / Phe193 and Arg198 / Leu199.

hSK1における可能性があるCaM結合部位をさらに解明するために、本発明者らは、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）に融合させたhSK1のPCB1/2、PCB3、およびPCB4領域に基づいてアミノ酸30個のペプチドとCaMとの相互作用を調べた。三つのペプチドをインフレームでGSTに融合させて、大腸菌において発現させて精製した後、CaM-セファロースとの結合能に関して評価した。限定的タンパク質分解を用いて先に得られた結果と一致して、PCB3ペプチドを含む融合タンパク質のみが、CaMとの会合を示した（図8）。併せると、これらのデータは、PCB3がhSK1のCaM結合領域であることを強く示している。 To further elucidate potential CaM binding sites in hSK1, we have determined that amino acids 30 based on the PCB1 / 2, PCB3, and PCB4 regions of hSK1 fused to glutathione-S-transferase (GST). The interaction between individual peptides and CaM was investigated. Three peptides were fused in-frame to GST, expressed in E. coli and purified, and then evaluated for binding ability to CaM-Sepharose. Consistent with the results obtained previously using limited proteolysis, only the fusion protein containing the PCB3 peptide showed association with CaM (FIG. 8). Taken together, these data strongly indicate that PCB3 is the CaM binding region of hSK1.

CaM結合欠損hSK1変異体の作製
PCB3内のLeu187またはLeu200のいずれの変異も、hSK1のCaMとの結合を変化させなかったが（図6）、限定的タンパク質分解およびペプチド結合試験から得られた結果は、この会合にとって肝要である可能性があるこの領域における他の残基をさらに調べるための起動力となった。このように、本発明者らは、Leu194からGln（hSK1^L194Q）、Phe197からAla（hSK1^F197A）およびLeu198からGln（hSK1^L198Q）を含む、PCB3内のいくつかの個々の疎水性残基において変異を含むhSK1のバージョンを作製した。この場合もこれらのバージョンのhSK1をHEK293T細胞において発現させて、そのCaM結合能に関して分析した。結果（図9）は、三つ全てがCaM-セファロースに会合するように思われたが、それらは、野生型hSK1と比較して効率が幾分低減していたことを示した（図9）。これは、三つの変種タンパク質の全てが少なくとも何らかの触媒活性を保持しているにもかかわらず、変異が全体的なタンパク質の折り畳みに影響を及ぼしていなかったことを示唆している。これらの知見に照らして、Phe197からAlaおよびLeu198からGlnへの変異の双方を含むhSK1のバージョン（hSK1^F197A/L198Q）を作製して、再度CaMとの会合能を調べた。これらの二つの変異はhSK1のCaMに対する結合を完全に消失させた（図5）。さらに、このhSK1二重変異体は、かなりの触媒活性を保持して、この場合も、CaMとの会合能における欠損がタンパク質の全体的な折り畳みにおける破壊の結果ではないことを示した。このように、これらの結果は、hSK1のCaM結合領域がhSK1のPCB3領域（残基191〜206位）内に存在すること、およびPhe197およびLeu198がhSK1とCaMとの相互作用に決定的に関係していることを確固として確立する。 Generation of CaM binding deficient hSK1 mutant
None of the Leu187 or Leu200 mutations in PCB3 altered the binding of hSK1 to CaM (Figure 6), but the results from limited proteolysis and peptide binding studies are critical to this association. It was an incentive to investigate further possible residues in this region. Thus, we have mutated in several individual hydrophobic residues within ^PCB3 , including Leu194 to Gln (hSK1 ^L194Q ), Phe197 to Ala (hSK1 ^F197A ) and Leu198 to Gln (hSK1 ^L198Q ). A version of hSK1 was prepared. Again, these versions of hSK1 were expressed in HEK293T cells and analyzed for their CaM binding ability. The results (Figure 9) all seemed to be associated with CaM-Sepharose, but they showed some reduction in efficiency compared to wild type hSK1 (Figure 9). . This suggests that the mutation did not affect the overall protein folding even though all three variant proteins retained at least some catalytic activity. In light of these findings, a version of hSK1 (hSK1 ^{F197A / L198Q} ) containing both Phe197 to Ala and Leu198 to Gln mutations was prepared and examined for its ability to associate with CaM again. These two mutations completely abolished hSK1 binding to CaM (FIG. 5). Furthermore, this hSK1 double mutant retained significant catalytic activity, again indicating that a defect in the ability to associate with CaM was not the result of disruption in the overall folding of the protein. Thus, these results are critically related to the presence of the CaSK binding region of hSK1 within the PCB3 region of hSK1 (residues 191 to 206), and Phe197 and Leu198 to the interaction of hSK1 with CaM. Establish what you are doing.

hSK1のCaM結合部位の特徴をさらに調べるために、CaM結合における疎水性残基の決定的な関係の他に、塩基性残基のそのような集合体は、一般的にCaMとその標的との相互作用の静電気的安定化において一般的に関係していることから（Vetter et al., 2003、前記）、PCB3のN-末端に向けて塩基性領域をターゲティングした。したがって、Arg185およびArg186の双方でAlaを含むhSK1のバージョン（hSK1^R185A/R186A）を作製して、CaM-セファロースとのその会合能を調べた。これまでの分析および他のCaM結合部位との比較に基づいて（Vetter et al., 2003、前記）、幾分驚いたことに、hSK1^R185A/R186Aは、CaMとの結合能を保持し（図9）、これらの塩基性残基がこの相互作用にとって必要ではないことを示した。 To further characterize the CaM binding site of hSK1, in addition to the critical relationship of hydrophobic residues in CaM binding, such aggregates of basic residues are generally associated with CaM and its target. Because of its general relevance in electrostatic stabilization of interactions (Vetter et al., 2003, supra), the basic region was targeted towards the N-terminus of PCB3. Therefore, a version of hSK1 (hSK1 ^{R185A / R186A} ) containing Ala in both Arg185 and Arg186 was prepared and examined for its ability to associate with CaM-Sepharose. Somewhat surprisingly based on previous analysis and comparison with other CaM binding sites (Vetter et al., 2003, supra), hSK1 ^{R185A / R186A} retains the ability to bind CaM (Fig. 9), indicating that these basic residues are not required for this interaction.

CaM結合はhSK1およびhSK2のあいだで保存されている
hSK2のCaMとの結合能を調べた過去の試験はなかったが、配列分析により、同定されたhSK1のCaM結合部位がこのタンパク質において高度に保存されていることを示した（図5）。このように、CaMが同様にhSK2に結合することができるか否かの問題を調べた。実際に、hSK1と同様にhSK2もCaMと会合することが見いだされた（図10A）。hSK2とCaMとのこの相互作用は、Ca²⁺の存在下で増強されたが、hSK1の状況とは異なり、hSK2に対するアポカルモジュリンのかなりの結合がCa²⁺の非存在下で観察された（図10A）。 CaM binding is conserved between hSK1 and hSK2.
Although there were no previous studies examining the ability of hSK2 to bind to CaM, sequence analysis indicated that the identified hSK1 CaM binding site is highly conserved in this protein (FIG. 5). Thus, the question of whether CaM can bind to hSK2 as well was investigated. In fact, hSK2 was found to associate with CaM as well as hSK1 (FIG. 10A). This interaction between hSK2 and CaM was enhanced in the presence of Ca ²⁺ , but unlike the situation with hSK1, significant binding of apocalmodulin to hSK2 was observed in the absence of Ca ²⁺ ( Figure 10A).

hSK2はCaMと相互作用するが、Ca²⁺/CaMを組換え型hSK2の酵素アッセイに加えると、hSK1の状況と同様に（Pitson et al. 2000、前記）、Ca²⁺/CaMが、インビトロでのhSK2の触媒活性を変化させないことが示された（データは示していない）。このように、CaMとhSK2とのこの相互作用の生理的役割はまだ決定されていない。 hSK2 interacts with CaM, but when Ca ²⁺ / CaM is added to the recombinant hSK2 enzyme assay, similar to the situation of hSK1 (Pitson et al. 2000, supra), Ca ²⁺ / CaM It was shown not to change the catalytic activity of hSK2 at the same time (data not shown). Thus, the physiological role of this interaction between CaM and hSK2 has not yet been determined.

CaM結合欠損hSK2バージョンを作製するために、hSK1のCaM結合にとって重要であるタンパク質について保存されたこのタンパク質における残基について変異誘発を行った。hSK2のこのバージョン（hSK2^V327A/L328Q）を、HEK293T細胞において発現させて、そのCaM-セファロースとの結合能および保持された全体的なタンパク質折り畳みの測定としての触媒活性の双方に関して分析した。hSK1に関する知見と一致して、このhSK2変異体は高い触媒活性を保持したが、CaMとは相互作用しなかった（図10）。このように、これらの試験は、hSK1およびhSK2がCaMと会合するのみならず、双方の酵素が高度に保存された結合部位を通して会合することを確固として確立する。 To generate a CaM binding-deficient hSK2 version, mutagenesis was performed on residues in this protein that were conserved for proteins that are important for CaM binding of hSK1. This version of hSK2 (hSK2 ^{V327A / L328Q} ) was expressed in HEK293T cells and analyzed for both its ability to bind CaM-Sepharose and catalytic activity as a measure of retained overall protein folding. Consistent with the findings for hSK1, this hSK2 mutant retained high catalytic activity but did not interact with CaM (FIG. 10). Thus, these tests firmly establish that not only hSK1 and hSK2 associate with CaM, but also that both enzymes associate through a highly conserved binding site.

スフィンゴシンキナーゼ調節におけるCaM結合部位の役割
Ser225での燐酸化を通してのhSK1の活性化および特にその細胞質膜へのその後の転位は、この酵素による腫瘍形成シグナル伝達において重要な段階であることが確立されている。現在の試験におけるCaM結合部位の同定およびCaM結合欠損hSK1バージョンの作製によって、hSK1の細胞局在におけるCaMの直接的な役割をさらに試験することが可能となった。このように、hSK1の十分に確立されたホルボルエステルによる細胞質膜への転位にCaMが関係しているか否かを調べた。野生型hSK1およびhSK1^F197A/L198Qを、eGFPとの融合タンパク質としてHEK293T細胞において発現させて、ホルボル12-ミリステート13-アセテート（PMA）に細胞を曝露した後にその局在を調べた。この処置後に、野生型hSK1のサイトゾルから細胞質膜への局在の急激なシフトが観察された（図11A）。しかし、全く対照的に、PMAに反応したhSK^F197A/L198Qの再分布は認められず（図11A）、このプロセスにおけるCaM結合部位にとっての重要な役割を強く示している。 Role of CaM binding site in sphingosine kinase regulation
Activation of hSK1 through phosphorylation at Ser225 and in particular its subsequent translocation to the cytoplasmic membrane has been established to be an important step in oncogenic signaling by this enzyme. Identification of the CaM binding site and the creation of a CaM binding-deficient hSK1 version in the current study made it possible to further test the direct role of CaM in the cellular localization of hSK1. Thus, it was examined whether CaM is involved in the translocation of hSK1 to the cytoplasmic membrane by well-established phorbol esters. Wild-type hSK1 and hSK1 ^{F197A / L198Q} were expressed in HEK293T cells as fusion proteins with eGFP and their localization was examined after exposing the cells to phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). After this treatment, a rapid shift in the localization of wild type hSK1 from the cytosol to the cytoplasmic membrane was observed (FIG. 11A). However, in sharp contrast, no ^{redistribution} of hSK ^{F197A / L198Q} in response to PMA was observed (FIG. 11A), strongly indicating an important role for the CaM binding site in this process.

次に、CaM結合部位に対する変異が、このプロセスにおける間接的な効果によって転位を阻害しているのではないことを確実にするために、PMAおよび腫瘍壊死因子-α（TNF-α）に対する細胞曝露に反応したhSK1^F197A/L198Qの燐酸化および活性化を調べた。実際に、PMAおよびTNFαの双方による細胞の処置によって、野生型hSK1に関して観察された場合と同等のhSK1^F197A/L198Qの燐酸化の増強および触媒活性の増強が起こったことから、これは当てはまらないことが見いだされた（図7B）。これは、CaM結合がhSK1の燐酸化および触媒活性化に関係していないことを証明しており、CaM結合部位の変異によるhSK1の転位の破壊が、この部位でのタンパク質-タンパク質相互作用を直接変化させることによって起こることを示唆している。 Second, cell exposure to PMA and tumor necrosis factor-α (TNF-α) to ensure that mutations to the CaM binding site are not inhibiting translocation by indirect effects in this process The phosphorylation and activation of hSK1 ^{F197A / L198Q} in response to In fact, this is not the case because treatment of cells with both PMA and TNFα ^resulted in enhanced phosphorylation and enhanced catalytic activity of hSK1 ^{F197A / L198Q} similar to that observed for wild-type hSK1. Was found (Fig. 7B). This demonstrates that CaM binding is not involved in hSK1 phosphorylation and catalytic activation, and disruption of hSK1 translocation due to mutations in the CaM binding site directly leads to protein-protein interactions at this site. It suggests what happens by changing.

CaMはhSK1の転位を媒介するか
先に概要した試験は、そのアゴニスト誘導転位にhSK1のCaM結合部位が関係していることを強く意味している。しかし、遊離の細胞カルシウムの増加によって、CaMが、サイトゾルから細胞質膜ではなくて核に主に転位することから、このプロセスにおけるCaMの実際の役割はあまり明確ではない（Chin et al., 2000, Trends Cell Biol. 10, 322〜328）。 Does CaM mediate hSK1 translocation? The studies outlined above strongly implicate the CaM binding site of hSK1 in its agonist-induced translocation. However, the actual role of CaM in this process is less clear, as the increase in free cellular calcium primarily translocates CaM from the cytosol to the nucleus rather than the cytoplasmic membrane (Chin et al., 2000 , Trends Cell Biol. 10, 322-328).

酵母の2ハイブリッド技術を用いて、CaM関連タンパク質であるカルミリン（C1B1、カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質1としても知られる）が、hSK1相互作用タンパク質として同定されている。この22 kDaミリストイル化Ca²⁺結合タンパク質は、CaM（56％）およびカルシニューリンB（58％）とかなりのアミノ酸配列類似性を有する。カルミリンは、調べたほとんどの組織および細胞に広く分布する（Shock et al., 1999, Biochem. J.342, 729〜735）。これはいくつかの他のタンパク質と相互作用することが知られており、これらの多様なタンパク質相互作用を通して広い機能を有し、タンパク質キナーゼPlk2およびFAKの活性（Naik et al., 2003, Blood 102, 3629〜3636；Ma et al., 2003, Mol. Cancer Res. 1, 376〜384）、Pax3の転写活性（Hollenbach et al., 2002, Biochim. Biophys. Acta 1574, 321〜328）、ならびに血小板におけるα_IIbインテグリンシグナル伝達の調節（Tsuboi, S., 2002, J. Biol. Chem. 277, 1919〜1923）を調節すると思われる。しかし、本研究の状況において最も重要なことは、カルミリンがCa²⁺依存的に細胞質膜に会合することが知られているCa²⁺-ミリストイルスイッチタンパク質ファミリーのメンバーである点である（Meyer et al., 1999, Nat. Cell Biol.1, E93〜E95）。Ca²⁺の非存在下では、これらのミリストイル化タンパク質は、その脂肪酸を疎水性腔に封鎖する。Ca²⁺の結合によってタンパク質において大きいコンフォメーションの変化が起こって、ミリストイル基の押出が起こり、これを膜と相互作用するために利用できる。 Using the yeast two-hybrid technology, the CaM-related protein carmilin (also known as C1B1, calcium and integrin-binding protein 1) has been identified as an hSK1 interacting protein. This 22 kDa myristoylated Ca ²⁺ binding protein has significant amino acid sequence similarity with CaM (56%) and calcineurin B (58%). Carmylin is widely distributed in most tissues and cells examined (Shock et al., 1999, Biochem. J.342, 729-735). It is known to interact with several other proteins and has a wide range of functions through these diverse protein interactions and the activity of protein kinases Plk2 and FAK (Naik et al., 2003, Blood 102 , 3629-3636; Ma et al., 2003, Mol. Cancer Res. 1, 376-384), Pax3 transcriptional activity (Hollenbach et al., 2002, Biochim. Biophys. Acta 1574, 321-328), and platelets It appears to regulate the regulation of α _IIb integrin signaling in Tsuboi (Tsuboi, S., 2002, J. Biol. Chem. 277, 1919-1923). However, what is most important in the context of this study, Karumirin is Ca ²⁺ dependent manner Ca is known to associate with the cell membrane ²⁺ - a point is a member of myristoyl switch protein family (Meyer et al., 1999, Nat. Cell Biol. 1, E93-E95). In the absence of Ca ²⁺ , these myristoylated proteins sequester their fatty acids in hydrophobic cavities. Binding of Ca ²⁺ causes a large conformational change in the protein, leading to the extrusion of myristoyl groups, which can be used to interact with the membrane.

組換え型GST-カルミリンが産生されており、抗カルミリン抗体を作製するために用いられている。これらの試薬を用いて、カルミリンとhSK1およびhSK2の双方の相互作用が確認されており、これらの相互作用は、CaMに関して認められた作用と同等にCa²⁺によって増強されることが示されている（図8）。カルミリンおよびCaMは、有意な配列類似性を共有することから、そしていずれもCa²⁺依存的にhSK1に結合することから、CaM結合欠損変異体hSK1^F197A/L198Qを用いて、双方のタンパク質が同じ部位でhSK1に結合するか否かに関して分析を行った。CaM結合に関して観察されたように、hSK1^F197A/L198Qも同様にカルミリンに結合することができず（図13）、CaMおよびカルミリンの双方が類似のメカニズムでhSK1と相互作用することを示している。 Recombinant GST-carmillin has been produced and used to generate anti-carmillin antibodies. Using these reagents, the interaction of both carmillin and hSK1 and hSK2 has been confirmed and these interactions have been shown to be enhanced by Ca ²⁺ as well as the observed effects on CaM. (Figure 8). Since carmilin and CaM share significant sequence similarity and both bind to hSK1 in a Ca ²⁺ dependent manner, both proteins are identical using the CaM binding deficient mutant hSK1 ^{F197A / L198Q.} Analysis was performed as to whether or not it binds to hSK1 at the site. As observed for CaM binding, hSK1 ^{F197A / L198Q} is similarly unable to bind to carmillin (FIG. 13), indicating that both CaM and carmillin interact with hSK1 by a similar mechanism.

参考文献

References

hSK1の燐酸化および細胞質膜局在が細胞増殖を増強することのグラフ表示である。野生型hSK1（白丸）、hSK1^S225A（黒三角）、Lck-hSK1（黒丸）、およびLck-hSK1^S225A（黒四角）または空のベクター（白四角）をコードするプラスミドを安定にトランスフェクトしたNIH3T3細胞の、A、無血清培地（0.1％BSAを含む）；B、1％FCSを含む培地；またはC、5％FCSにおける5日間の生長。D、これらの細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ活性、およびそのFLAGエピトープを通してウェスタンブロットによって決定した様々なhSK1構築物のタンパク質発現。E、新生DNAへのBrdU取り込みによって測定したこれらの細胞の細胞増殖。F、核濃縮および断片化によって測定したこれらの細胞の血清枯渇によって誘導されたアポトーシス。データは3回の独立した実験を表す。FIG. 5 is a graphical representation of hSK1 phosphorylation and cytoplasmic membrane localization enhancing cell proliferation. NIH3T3 cells stably transfected with plasmids encoding wild-type hSK1 (white circles), hSK1 ^S225A (black triangles), Lck-hSK1 (black circles), and Lck-hSK1 ^S225A (black squares) or the empty vector (white squares) A, serum-free medium (containing 0.1% BSA); B, medium containing 1% FCS; or C, 5 days growth in 5% FCS. D, sphingosine kinase activity in these cells, and protein expression of various hSK1 constructs determined by Western blot through its FLAG epitope. E, Cell proliferation of these cells measured by BrdU incorporation into nascent DNA. Apoptosis induced by serum depletion of these cells measured by F, nuclear enrichment and fragmentation. Data represent 3 independent experiments. Lck N-末端モチーフによる細胞質膜へのhSK1の局在の画像。A、野生型hSK1、hSK1^S225A、Lck-hSK1、およびLck-hSK1^S225Aを安定にトランスフェクトしたNIH3T3細胞からの溶解物を、サイトゾルおよび膜に分画して、抗FLAGによるウェスタンブロットによってプロービングした。データは、独立した3回の実験の代表である。B、同じ安定にトランスフェクトしたNIH3T3細胞の蛍光顕微鏡写真。画像は、3回の独立した実験において認められた細胞の＞50％の代表である。Image of localization of hSK1 to the cytoplasmic membrane by Lck N-terminal motif. Lysates from NIH3T3 cells stably transfected with A, wild type hSK1, hSK1 ^S225A , Lck-hSK1, and Lck-hSK1 ^S225A were fractionated into cytosol and membrane and probed by Western blot with anti-FLAG. . Data are representative of 3 independent experiments. B, Fluorescence micrograph of the same stably transfected NIH3T3 cells. Images are representative of> 50% of cells seen in 3 independent experiments. hSK1の燐酸化および細胞質膜局在がトランスフォーメーションに至ることの画像である。A、空のベクター、または野生型hSK1もしくはhSK1^S225Aを単独でまたは活性化変異体H-Ras（V12-Ras）をコードするプラスミドと同時トランスフェクトしたNIH3T3細胞を、軟寒天において培養した。3週間後に形成されたコロニーを既に記述されているように（Xia et al., 2000、前記）MTT染色によって可視化した。B、軟寒天におけるコロニー形成の定量。データは3回の独立した実験からの平均値（±SD）である。Image of hSK1 phosphorylation and cytoplasmic membrane localization leading to transformation. NIH3T3 cells co-transfected with A, empty vector, or wild type hSK1 or hSK1 ^S225A alone or with a plasmid encoding the activating mutant H-Ras (V12-Ras) were cultured in soft agar. Colonies formed after 3 weeks were visualized by MTT staining as previously described (Xia et al., 2000, supra). B, Quantification of colony formation in soft agar. Data are mean values (± SD) from three independent experiments. hSK1の燐酸化および細胞質膜局在が細胞内および細胞外スフィンゴシン-1-ホスフェートレベルの増加に至ることのグラフ表示である。細胞内および細胞外S1Pレベルは、空のベクター、または野生型hSK1、hSK1^S225A、Lck-hSK1、およびLck-hSK1^S225Aをコードするプラスミドを安定にトランスフェクトしたNIH3T3細胞において決定した。データは3回の独立した実験の平均値（±SD）である。2 is a graphical representation of hSK1 phosphorylation and cytoplasmic membrane localization leading to increased intracellular and extracellular sphingosine-1-phosphate levels. Intracellular and extracellular S1P levels were determined in NIH3T3 cells stably transfected with empty vectors or plasmids encoding wild type hSK1, hSK1 ^S225A , Lck-hSK1, and Lck-hSK1 ^S225A . Data are mean values (± SD) from three independent experiments. hSK1（SEQ ID NO：2）の推定のCaM結合領域の分析の概略図である。四角で囲んだ残基は、可能性があるCaM結合領域であると予想される残基である。下線の残基は、GST-融合タンパク質に組み入れられたhSK1の領域を構成する。三角は、限定的タンパク質分解の際にCaMの存在によって保護されたhSK1におけるトリプシン切断部位の位置を示す。FIG. 6 is a schematic diagram of analysis of the putative CaM binding region of hSK1 (SEQ ID NO: 2). Residues boxed are those residues that are predicted to be potential CaM binding regions. Underlined residues constitute the region of hSK1 incorporated into the GST-fusion protein. Triangles indicate the position of the trypsin cleavage site in hSK1 protected by the presence of CaM during limited proteolysis. hSK1の予想CaM結合領域の部位特異的変異誘発の概略図である。A、様々なhSK1変異体（ロード）を発現するHEK293T細胞からの抽出物を用いて、CaM-セファロース（CaM）に対するhSK1変異体の選択的結合を調べた。結合したhSK1タンパク質を、そのFLAGエピトープを通してウェスタンブロッティングによって可視化した。セファロース4Bビーズに対する如何なる非特異的結合も説明するために、セファロースCL-4B（CL4B）に対する結合を対照として用いた。B、hSK1変異体の相対的触媒活性。FIG. 4 is a schematic diagram of site-directed mutagenesis of the predicted CaM binding region of hSK1. A, Selective binding of hSK1 mutants to CaM-Sepharose (CaM) was examined using extracts from HEK293T cells expressing various hSK1 mutants (load). Bound hSK1 protein was visualized by Western blotting through its FLAG epitope. To account for any non-specific binding to Sepharose 4B beads, binding to Sepharose CL-4B (CL4B) was used as a control. B, relative catalytic activity of hSK1 mutant. hSK1の限定的なタンパク質分解がCaMによってトリプシン切断部位の保護を明らかにすることを示す画像である。A、組換え型hSK1単独、精製CaM単独、または双方のタンパク質の限定的タンパク質分解から生成されたトリプシンペプチドのクーマシー染色ゲル。B、C-末端HisタグhSK1の限定的トリプシン分解の抗His抗体のウェスタンブロット。FIG. 6 is an image showing that limited proteolysis of hSK1 reveals protection of the trypsin cleavage site by CaM. A, Coomassie stained gel of tryptic peptides generated from limited proteolysis of recombinant hSK1 alone, purified CaM alone, or both proteins. B, Western blot of anti-His antibody with limited trypsin degradation of C-terminal His-tag hSK1. hSK1-由来ペプチドとCaMとの会合を示す画像である。hSK1由来ペプチドのCaM-セファロース（CaM）に対する選択的結合を、大腸菌において産生されたGST-ペプチド融合タンパク質（ロード）を用いて調べた。結合した融合タンパク質を、抗GST抗体によるウェスタンブロッティングを用いて可視化した。セファロース4Bビーズに対する非特異的結合を説明するために、セファロースCL-4B（CL4B）に対する結合を対照として用いた。It is an image which shows the association of hSK1-derived peptide and CaM. The selective binding of hSK1-derived peptides to CaM-Sepharose (CaM) was examined using GST-peptide fusion protein (Load) produced in E. coli. Bound fusion protein was visualized using Western blotting with anti-GST antibody. To account for non-specific binding to Sepharose 4B beads, binding to Sepharose CL-4B (CL4B) was used as a control. hSK1のPCB3の部位特異的変異誘発の機能的転帰を示す概略図である。A、様々なhSK1変異体（ロード）を発現するHEK293T細胞からの抽出物を用いて、CaM-セファロース（CaM）に対するhSK1変異体の選択的結合を調べた。結合したhSK1タンパク質をそのFLAGエピトープを通してウェスタンブロッティングによって可視化した。セファロース4Bビーズに対する非特異的結合を説明するために、セファロースCL-4B（CL4B）に対する結合を対照として用いた。B、hSK1変異体の相対的触媒活性。FIG. 2 is a schematic showing the functional outcome of site-directed mutagenesis of hSK1 PCB3. A, Selective binding of hSK1 mutants to CaM-Sepharose (CaM) was examined using extracts from HEK293T cells expressing various hSK1 mutants (load). Bound hSK1 protein was visualized by Western blotting through its FLAG epitope. To account for non-specific binding to Sepharose 4B beads, binding to Sepharose CL-4B (CL4B) was used as a control. B, relative catalytic activity of hSK1 mutant. hSK2がhSK1に関して保存された結合部位を通してCaMに会合することを示す概略図である。A、hSK1またはhSK2（ロード）のいずれかを発現するHEK293T細胞からの抽出物を用いて、5 mM CaCl₂または5 mM EGTAの存在下で、hSK1およびhSK2とCaM-セファロース（CaM）との会合を調べた。結合したhSK1またはhSK2をそのFLAGエピトープによるウェスタンブロッティングによって可視化した。セファロース4Bビーズに対する非特異的結合を説明するために、セファロースCL-4B（CL4B）に対する結合を対照として用いた。B、hSK2型を発現するHEK293T細胞からの抽出物を用いて、hSK2のV327/L328Q変異によるCaM-セファロース結合の消失を調べた。C、hSK2変異体の相対的触媒活性。FIG. 2 is a schematic showing that hSK2 associates with CaM through a conserved binding site for hSK1. Association of hSK1 and hSK2 with CaM-Sepharose (CaM) in the presence of 5 mM CaCl ₂ or 5 mM EGTA using extracts from HEK293T cells expressing either A, hSK1 or hSK2 (load) I investigated. Bound hSK1 or hSK2 was visualized by Western blotting with its FLAG epitope. To account for non-specific binding to Sepharose 4B beads, binding to Sepharose CL-4B (CL4B) was used as a control. B, The loss of CaM-Sepharose binding due to the V327 / L328Q mutation of hSK2 was examined using an extract from HEK293T cells expressing hSK2 type. C, relative catalytic activity of hSK2 mutant. hSK1 CaM-結合部位の変異がhSK1のアゴニストによる細胞質膜への転位を消失させることを示す概略図である。A、PMA（10 ng/ml）の存在下または非存在下で野生型hSK1-GFPまたはhSK1^F197A/L198Q-GFPのいずれかを30分間トランスフェクトしたHEK293T細胞の蛍光顕微鏡写真。画像は、2回の独立した実験において観察された細胞の＞50％の代表である。一過性にトランスフェクトしたHEK293T細胞におけるhSK1の燐酸化（B）および活性化（C）を、ホスホhSK1特異的ポリクローナル抗体（抗p-hSK1）を用いるウェスタンブロットおよび野生型hSK1またはhSK1^F197A/L198Qを過剰発現する細胞をTNFα（1 ng/ml）またはPMA（10 ng/ml）によって30分間処置した後のスフィンゴシンキナーゼ酵素アッセイによって追跡した。総hSK1レベルをFLAGエピトープを通して決定した。FIG. 3 is a schematic diagram showing that a mutation in the hSK1 CaM-binding site eliminates translocation to the cytoplasmic membrane by an agonist of hSK1. A, Fluorescence micrograph of HEK293T cells transfected with either wild type hSK1-GFP or hSK1 ^{F197A / L198Q-} GFP for 30 minutes in the presence or absence of PMA (10 ng / ml). Images are representative of> 50% of the cells observed in two independent experiments. Phosphorylation (B) and activation (C) of hSK1 in transiently transfected HEK293T cells, Western blot using phospho hSK1 specific polyclonal antibody (anti-p-hSK1) and wild type hSK1 or hSK1 ^{F197A / L198Q} Overexpressing cells were followed by sphingosine kinase enzyme assay after 30 min treatment with TNFα (1 ng / ml) or PMA (10 ng / ml). Total hSK1 levels were determined through the FLAG epitope. カルミリンがカルシウム依存的にhSK1に会合することを示す画像である。hSK1と、グルタチオン-セファロースに結合したGST-カルミリンとの会合をhSK1（ロード）を発現するHEK293T細胞からの抽出物を用いて5 mM CaCl₂または5 mM EGTAの存在下で試験した。It is an image showing that carmillin associates with hSK1 in a calcium-dependent manner. The association of hSK1 with glutathione-sepharose-bound GST-carmillin was tested using extracts from HEK293T cells expressing hSK1 (load) in the presence of 5 mM CaCl ₂ or 5 mM EGTA. hSK1 CaM-結合部位の変異がカルミリン結合を消失させることを示す画像である。そのカルミリンとの会合にhSK1のCaM-結合部位が関係していることを、グルタチオン-セファロースに結合したGST-カルミリン、および野生型hSK1またはhSK1^F197A/L198Q（ロード）のいずれかを発現するHEK293T細胞からの抽出物を用いて評価した。結合したhSK1を、FLAGエピトープによるウェスタンブロッティングによって可視化した。非特異的結合を説明するために、GST単独を対照として用いた。It is an image which shows that the mutation of hSK1 CaM-binding site lose | disappears a carmilin binding. HEK293T cells expressing GST-carmillin bound to glutathione-sepharose and either wild type hSK1 or hSK1 ^{F197A / L198Q} (load) that hSK1's CaM-binding site is involved in its association with carmillin Evaluation was made using extracts from Bound hSK1 was visualized by Western blotting with the FLAG epitope. To account for nonspecific binding, GST alone was used as a control.

Claims

Up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates signal transduction, and down-regulating the sphingosine kinase cell membrane localization down-regulates the signal transduction, wherein the substance is sphingosine Contacting the sphingosine kinase with an effective amount of the substance for a time and under conditions sufficient to modulate the subcellular localization of the sphingosine kinase, which functions by means other than by regulating localization by modulating kinase phosphorylation A method of modulating sphingosine kinase mediated signaling comprising steps.

Up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates cell activity and down-regulating the sphingosine kinase cell membrane localization down-regulates the cell activity, wherein the substance is sphingosine Contacting the cell with an effective amount of the substance for a time and under conditions sufficient to modulate the subcellular localization of sphingosine kinase, which functions by means other than modulating localization by modulating kinase phosphorylation , A method of modulating sphingosine kinase mediated cellular activity.

Up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates cell activity and down-regulating sphingosine kinase cell membrane localization down-regulates the cell activity, wherein the substance is sphingosine kinase phosphate Administering to the mammal an effective amount of the substance for a time and under conditions sufficient to modulate the subcellular localization of sphingosine kinase, which functions by means other than modulating localization by modulating localization; A method for the treatment and / or prophylaxis of a disease state in a mammal, wherein the disease state is characterized by abnormal, undesirable or otherwise inappropriate sphingosine kinase mediated cellular activity.

Up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates sphingosine kinase activity, and down-regulating sphingosine kinase cell membrane localization down-regulates the sphingosine kinase activity, wherein the substance is sphingosine Administering an effective amount of the substance to the mammal for a time and under conditions sufficient to modulate the subcellular localization of sphingosine kinase, which functions by means other than modulating localization by modulating kinase phosphorylation. A method for the treatment and / or prevention of a pathological condition in a mammal, wherein the pathological condition is characterized by abnormal, undesirable or otherwise inappropriate sphingosine kinase functional activity.

The step in which the substance modulates the interaction between one or more amino acids corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2 and a translocation factor and induces or agonists the interaction is a sphingosine kinase cell membrane 5. The method of any one of claims 1-4, wherein the step of upregulating localization and antagonizing the interaction downregulates sphingosine kinase cell membrane localization.

6. The method of claim 5, wherein the amino acid is one or both of Phe197 or Leu198.

The method according to claim 5 or 6, wherein the sphingosine kinase is human sphingosine kinase 1.

The method according to claim 5 or 6, wherein the sphingosine kinase is human sphingosine kinase 2.

The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the modulation of intracellular sphingosine kinase localization is up-regulation of cell membrane localization.

The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the modulation of intracellular sphingosine kinase localization is down-regulation of cell membrane localization.

The method according to claim 2, wherein the cellular activity is induced by TNF, and the modulation of intracellular sphingosine kinase localization is down-regulation of cell membrane localization.

12. The method of claim 11, wherein the TNF-induced cellular activity is a TNF-induced proliferation and / or anti-apoptotic feature.

3. The method according to claim 2, wherein the cellular activity is production of an inflammatory mediator, and adjustment of intracellular sphingosine kinase localization is down-regulation of cell membrane localization.

14. The method of claim 13, wherein the inflammatory mediator is adhesion molecule expression.

5. The method according to claim 3 or 4, wherein the pathological condition is undesirable cell growth and cell membrane localization of sphingosine kinase is downregulated.

16. The method of claim 15, wherein the undesirable cell growth is uncontrolled growth.

17. The method of claim 16, wherein the uncontrolled growth is a neoplastic condition.

18. The method of claim 17, wherein the neoplastic condition is a malignant neoplasm.

19. The method of claim 18, wherein the malignant neoplasm is a solid tumor.

20. The method of claim 19, wherein the solid tumor is a colon, stomach, lung, brain, bone, esophagus, pancreas, breast, ovary, or uterine tumor.

The method according to claim 3 or 4, wherein the pathological condition is an inflammatory pathological condition, and cell membrane localization of sphingosine kinase is down-regulated.

24. The method of claim 21, wherein the inflammatory condition is rheumatoid arthritis, atherosclerosis, autoimmune disease, or inflammatory bowel disease.

Modulation of intracellular sphingosine kinase localization is an upregulation of cell membrane localization, wherein the upregulation is obtained by introducing a sphingosine kinase translocation factor or a nucleic acid encoding a sphingosine kinase translocation factor into a cell Item 10. The method according to any one of Items 1 to 9.

24. The method of claim 23, wherein the translocation factor is calmodulin.

24. The method of claim 23, wherein the translocation factor is calmyrin.

Modulation of intracellular sphingosine kinase localization is up-regulation of cell membrane localization, which introduces protein-like or non-protein-like molecules into cells that function as agonists of the interaction between sphingosine kinase and translocation factor The method according to any one of claims 1 to 9, which is obtained by:

27. The method of claim 26, wherein the agonist induces an increase in calcium levels.

28. The method of claim 27, wherein the agonist is a calcium ionophore.

30. The method of claim 28, wherein the agonist is ionomycin.

Transcription and / or translation of either a sphingosine kinase translocation factor or a molecule that acts as an agonist on the interaction of a sphingosine kinase with a translocation factor is the regulation of subcellular localization is up-regulation of cell membrane localization 10. The method according to any one of claims 1 to 9, which is obtained by introducing into a cell a molecule that up-regulates.

Modulation of intracellular sphingosine kinase localization is down-regulation of cell membrane localization, which introduces into the cell a protein-like or non-protein-like molecule that functions as an antagonist of the interaction between sphingosine kinase and a translocation factor 21. A method according to any one of claims 1-8 or 10-20, obtained by

32. The method of claim 31, wherein the antagonist is an antibody.

35. The method of claim 32, wherein the antibody is directed to a region of sphingosine kinase comprising residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2.

32. The method of claim 31, wherein the antagonist is a non-functional sphingosine kinase variant that competitively inhibits binding of a transposable element to wild-type sphingosine kinase.

35. The method of claim 34, wherein the non-functional variant is a peptide comprising a region corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2.

36. The method of claim 35, wherein the non-functional variant comprises a region corresponding to residues 197 and 198 of SEQ ID NO: 2.

32. The method of claim 31, wherein the antagonist acts to reduce free calcium levels in the cell.

38. The method of claim 37, wherein the antagonist is a calcium chelator.

40. The method of claim 38, wherein the calcium chelator is BAPTA or MAPTAM.

Modulation of intracellular sphingosine kinase localization is down-regulation of cell membrane localization, wherein the down-regulation is obtained by introducing into the cell a nucleic acid molecule that encodes an antagonist of the interaction between sphingosine kinase and a translocation factor. 21. A method according to any one of claims 1-8 or 10-20.

Modulation of intracellular sphingosine kinase localization is down-regulation of cell membrane localization, which down-regulates molecules that up-regulate transcription and / or translation of antagonists of the interaction between sphingosine kinase and translocation factor 21. A method according to any one of claims 1-8 or 10-20, obtained by introduction.

The step of regulating the intracellular localization of sphingosine kinase and up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates cell activity and down-regulating sphingosine kinase cell membrane localization Down-regulate where the substance functions by means other than modulating localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation and the pathology is abnormal, undesirable or otherwise inappropriate sphingosine Use of the substance in the manufacture of a medicament for treating a disease state in a mammal characterized by kinase-mediated cellular activity.

The step of regulating the intracellular localization of sphingosine kinase and up-regulating sphingosine kinase cell membrane localization up-regulates sphingosine kinase activity and down-regulating sphingosine kinase cell membrane localization. Down-regulate activity, where the substance functions by means other than modulating localization by modulating sphingosine kinase phosphorylation and the pathology is abnormal, undesirable or otherwise inappropriate Use of the substance in the manufacture of a medicament for treating a disease state in a mammal, characterized by a unique sphingosine kinase functional activity.

The step in which the substance modulates the interaction between one or more amino acids corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2 and a translocation factor and induces or agonists the interaction is a sphingosine kinase cell membrane Use of the substance in the manufacture of a medicament for treatment, wherein the step of upregulating localization and antagonizing the interaction downregulates sphingosine kinase cell membrane localization.

45. Use according to claim 44, wherein the amino acid is one or both of Phe197 or Leu198.

46. Use according to claim 44 or 45, wherein the sphingosine kinase is human sphingosine kinase 1.

46. Use according to claim 44 or 45, wherein the sphingosine kinase is human sphingosine kinase 2.

48. Use according to any one of claims 44 to 47, wherein the modulation of intracellular sphingosine kinase localization is upregulation of cell membrane localization.

48. Use according to any one of claims 44 to 47, wherein the modulation of intracellular sphingosine kinase localization is down-regulation of cell membrane localization.

45. Use according to claim 43 or 44, wherein the pathology is undesirable cell growth and the cell membrane localization of sphingosine kinase is downregulated.

51. Use according to claim 50, wherein the undesirable cell growth is uncontrolled growth.

52. Use according to claim 51, wherein the uncontrolled proliferation is a neoplastic condition.

53. Use according to claim 52, wherein the neoplastic condition is a malignant neoplasm.

54. Use according to claim 53, wherein the malignant neoplasm is a solid tumor.

55. The use of claim 54, wherein the solid tumor is a colon, stomach, lung, brain, bone, esophagus, pancreas, breast, ovary, or uterine tumor.

45. Use according to claim 43 or 44, wherein the condition is an inflammatory condition and the cell membrane localization of sphingosine kinase is down-regulated.

57. Use according to claim 56, wherein the inflammatory condition is rheumatoid arthritis, atherosclerosis, autoimmune disease, or inflammatory bowel disease.

The regulation of intracellular sphingosine kinase localization is an upregulation of cell membrane localization, wherein the upregulation is obtained by introducing a sphingosine kinase translocation factor or a nucleic acid encoding a sphingosine kinase translocation factor into a cell. Use according to any one of 42 to 48.

59. Use according to claim 58, wherein the translocation factor is calmodulin.

59. Use according to claim 58, wherein the translocation factor is carmilin.

Modulation of intracellular sphingosine kinase localization is up-regulation of cell membrane localization, which introduces protein-like or non-protein-like molecules into cells that function as agonists of the interaction between sphingosine kinase and translocation factor 49. Use according to any one of claims 42 to 48, obtained by:

64. The method of claim 61, wherein the agonist induces an increase in calcium levels.

64. Use according to claim 62, wherein the agonist is a calcium ionophore.

64. Use according to claim 63, wherein the agonist is ionomycin.

Transcription and / or translation of either a sphingosine kinase translocation factor or a molecule that acts as an agonist on the interaction of a sphingosine kinase with a translocation factor is the regulation of subcellular localization is up-regulation of cell membrane localization 49. Use according to any one of claims 42 to 48, obtained by introducing into a cell a molecule that upregulates.

Modulation of intracellular sphingosine kinase localization is down-regulation of cell membrane localization, which introduces into the cell a protein-like or non-protein-like molecule that functions as an antagonist of the interaction between sphingosine kinase and a translocation factor 58. Use according to any one of claims 42 to 47 or 49 to 57, obtained by

68. Use according to claim 66, wherein the antagonist is an antibody.

58. The method of claim 57, wherein the antibody is directed to a region of sphingosine kinase comprising residues 191-206 of SEQ ID NO: 2.

68. Use according to claim 67, wherein the antagonist is a non-functional sphingosine kinase variant that competitively inhibits binding of the transposable element to wild-type sphingosine kinase.

70. Use according to claim 69, wherein the non-functional variant is a peptide comprising a region corresponding to residues 191 to 206 of SEQ ID NO: 2.

71. Use according to claim 70, wherein the non-functional variant comprises a region corresponding to residues 197 and 198 of SEQ ID NO: 2.

72. Use according to claim 71, wherein the antagonist acts to reduce intracellular free calcium levels.

73. Use according to claim 72, wherein the antagonist is a calcium chelator.

74. Use according to claim 73, wherein the calcium chelator is BAPTA or MAPTAM.

Modulation of intracellular sphingosine kinase localization is down-regulation of cell membrane localization, wherein the down-regulation is obtained by introducing into the cell a nucleic acid molecule that encodes an antagonist of the interaction between sphingosine kinase and a translocation factor. 58. Use according to any one of claims 42 to 47 or 49 to 57.

Modulation of intracellular sphingosine kinase localization is down-regulation of cell membrane localization, which down-regulates molecules that up-regulate transcription and / or translation of antagonists of the interaction between sphingosine kinase and translocation factor 58. Use according to any one of claims 42 to 47 or 49 to 57, obtained by introduction.

A pharmaceutical composition comprising a modulator as defined herein above together with one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents.

Sphingosine kinase or its function, comprising contacting a cell containing sphingosine kinase or a functional equivalent or derivative thereof or an extract thereof with a putative substance and detecting a change in expression phenotype associated with cell membrane localization Of detecting a substance capable of adjusting the intracellular localization of a chemical equivalent or derivative.

Isolated, showing a loss or reduction in transposition ability compared to a functional derivative, homologue, or analog of a wild-type sphingosine kinase or sphingosine kinase variant, including mutations in the region of sphingosine kinase containing the translocation mediator binding site Sphingosine kinase variant.

80. The variant of claim 79, comprising an amino acid sequence having single or multiple amino acid substitutions and / or deletions at amino acids 191-206.

81. A variant according to claim 80, wherein the amino acid is the amino acid Phe197 and / or Leu198.

92. The variant of claim 81, wherein the substitution is a Phe197Ala and / or Leu198Gln substitution.

83. An isolated nucleic acid molecule encoding a variant according to any one of claims 79-82.