JP2008308690A - Poly (ethylene glycol) functional derivative and method of producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ポリ（エチレングリコール）の機能性誘導体、ならびにその製造方法および精製方法に関する。 The present invention relates to a functional derivative of poly (ethylene glycol), and a production method and purification method thereof.
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）（あるいはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）として知られる）は、エチレンオキシドの繰り返しサブユニットから成るポリマーである。これは非毒性であるため、下剤などの臨床的局面、および練り歯磨き中の分散剤のような消費者向け日用品において、広く用いられている。近年、医学者達は、結合した生体分子の半減期が増大するように、ＰＥＧの活性化誘導体を様々な生体分子と結合させるのに利用してきた。それ以来、研究者達は活性化ＰＥＧ誘導体の開発を行っており、Ｈａｒｒｉｓらは、１つのプロピオン酸またはブタン酸部分を有し、その２つの末端の各々にメトキシ基およびスクシンイミジル活性エステル（−ＣＯ２−ＮＨＳ）が別々に結合している、ＰＥＧ酸の活性エステルを開示した（米国特許第５，６７２，６６２号）。Ｓｅｄａｇｈａｔ−ＨｅｒａｔｉらはＰｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，４３，３５−４１（１９９９）において、メトキシポリ（オキシエチレン）プロピオン酸の合成におけるアクリロニトリルの使用を記載した。 Poly (ethylene glycol) (PEG) (also known as poly (ethylene oxide) (PEO)) is a polymer composed of repeating subunits of ethylene oxide. Because it is non-toxic, it is widely used in clinical aspects such as laxatives and consumer products such as dispersants in toothpaste. In recent years, medical scientists have used activated derivatives of PEG to bind various biomolecules so that the half-life of the bound biomolecules is increased. Since then, researchers have been developing activated PEG derivatives, Harris et al. Have one propionic acid or butanoic acid moiety, and each of its two ends has a methoxy group and a succinimidyl active ester (-CO An active ester of PEG acid has been disclosed (US Pat. No. 5,672,662) in which 2- NHS) is attached separately. Sedaghat-Herati et al., In Polymer Bulletin, 43, 35-41 (1999), described the use of acrylonitrile in the synthesis of methoxypoly (oxyethylene) propionic acid.
前記した背景の観点から、本発明の目的は、従来型でないＰＥＧ機能性誘導体およびその製造方法を提供することである。 In view of the above background, an object of the present invention is to provide a non-conventional PEG functional derivative and a method for producing the same.
したがって、本発明は、１つの態様において、単離され実質的に精製されたＰＥＧ−酸であり、下記の構造： Accordingly, the present invention, in one aspect, is an isolated and substantially purified PEG-acid having the structure:
（Ｉ） Ｒ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）ｋ−ＣＯＯＨ
を有し、
(I) R-PEG- (CH 2) k -COOH
Have
式中、ｋは１〜５であり、Ｒは水素、ヒドロキシル基、メトキシ基、または他のアルコキシ基であり、ＰＥＧは一般式（ＩＩ）： In the formula, k is 1 to 5, R is hydrogen, hydroxyl group, methoxy group, or other alkoxy group, and PEG is represented by the general formula (II):
（ＩＩ） −Ｃ２Ｈ４Ｏ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−
で表され、
(II) -C 2 H 4 O- (C 2 H 4 O) n -
Represented by
式中、ｎは４４〜４０００である。 In the formula, n is 44 to 4000.
本発明の好ましい実施形態において、単離され実質的に精製されたＰＥＧ−酸の純度は９５％〜１００％の範囲である。別の好ましい実施形態において、ＰＥＧ−酸は、純度が９５％〜１００％の範囲の固形である。 In a preferred embodiment of the invention, the purity of the isolated and substantially purified PEG-acid ranges from 95% to 100%. In another preferred embodiment, the PEG-acid is a solid with a purity ranging from 95% to 100%.
本発明の別の態様によれば、単離され実質的に精製されたＰＥＧ−ニトリルが提供され、下記の構造： According to another aspect of the present invention, there is provided an isolated and substantially purified PEG-nitrile having the structure:
（ＩＩＩ） Ｒ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）ｋ−ＣＮ
で表され、
(III) R-PEG- (CH 2) k -CN
Represented by
式中、ｋは１〜５であり、Ｒは水素、ヒドロキシル基、メトキシ基、または他のアルコキシ基であり、ＰＥＧは前述の式（ＩＩ）で表される。 In the formula, k is 1 to 5, R is hydrogen, a hydroxyl group, a methoxy group, or another alkoxy group, and PEG is represented by the above formula (II).
好ましい実施形態において、単離され実質的に精製されたＰＥＧ−ニトリルの純度は９５％〜１００％の範囲である。最も好ましい実施形態において、ＰＥＧ−ニトリルは、純度が９５％〜１００％の範囲の固形である。 In a preferred embodiment, the purity of the isolated and substantially purified PEG-nitrile ranges from 95% to 100%. In the most preferred embodiment, the PEG-nitrile is a solid with a purity ranging from 95% to 100%.
本発明の別の態様によれば、単離され実質的に精製された前述の式（Ｉ）のＰＥＧ−酸を調製する方法が提供され、これには、ヒドロキシル−ＰＥＧをクロロスルホナートと反応させてＰＥＧ−スルホナートエステルを形成させる段階と、続いてＰＥＧ−スルホナートエステルを金属シアン化物と反応させてＰＥＧ−ニトリルを形成させる段階とが含まれる。ＰＥＧ−ニトリルは次にＰＥＧ−酸へ加水分解され、生成するＰＥＧ−酸は純度が９５％〜１００％の範囲の固形である。 In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a process for preparing an isolated and substantially purified PEG-acid of the aforementioned formula (I), which comprises reacting hydroxyl-PEG with chlorosulfonate. And forming a PEG-nitrile ester, followed by reacting the PEG-sulfonate ester with a metal cyanide to form a PEG-nitrile. The PEG-nitrile is then hydrolyzed to PEG-acid and the resulting PEG-acid is a solid with a purity ranging from 95% to 100%.
好ましい実施形態において、クロロスルホナートは、塩化メシル、塩化トリフルオロメタンスルホニル（塩化トリフリック）、および塩化トシルから選択される。 In a preferred embodiment, the chlorosulfonate is selected from mesyl chloride, trifluoromethanesulfonyl chloride (triflic chloride), and tosyl chloride.
上記方法の変法において、加水分解の工程はさらに、ＰＥＧ−ニトリルを無機酸で加水分解してＰＥＧ−アミドを形成させる工程と、続いてＰＥＧ−アミドをアルカリでもう１回加水分解する工程から成る。好ましい実施形態において、酸は塩酸であり、アルカリは水酸化カリウムである。 In a variation of the above method, the hydrolysis step further comprises a step of hydrolyzing PEG-nitrile with an inorganic acid to form PEG-amide, followed by another hydrolysis of PEG-amide with alkali once more. Become. In a preferred embodiment, the acid is hydrochloric acid and the alkali is potassium hydroxide.
上記方法の別の実施において、ＰＥＧ−酸を水透析（ｗａｔｅｒ ｄｉａｌｙｓｉｓ）により精製するさらなる工程が提供される。 In another implementation of the above method, a further step is provided for purifying the PEG-acid by water dialysis.
上記方法の最も好ましい実施において、ジクロロメタン中に溶解したヒドロキシル−メトキシ−ＰＥＧを、トリエチルアミンおよび塩化メシルと共に氷浴中アルゴンガス下で混合する。このようにして得られるメトキシ−ＰＥＧ−メシラートを次に、ジメチルスルホキシド中に溶解したシアン化カリウムと共にアルゴンガス下で混合し、得られるメトキシ−ＰＥＧ−ニトリルを、乾燥シリカゲルを充填した濾過カラムで精製する。精製されたメトキシ−ＰＥＧ−ニトリルを塩酸と反応させてメトキシ−ＰＥＧ−アミドを得る。このメトキシ−ＰＥＧ−アミドは水透析により精製される。その後、精製されたメトキシ−ＰＥＧ−アミドを水酸化カリウムと反応させ、続けて酸性化し、メトキシ−ＰＥＧ−酸の形成に至る。最後に、メトキシ−ＰＥＧ−酸を別の水透析プロセスにより精製し、凍結乾燥してメトキシ−ＰＥＧ−酸の精製固体を得る。 In the most preferred practice of the above method, hydroxyl-methoxy-PEG dissolved in dichloromethane is mixed with triethylamine and mesyl chloride in an ice bath under argon gas. The methoxy-PEG-mesylate thus obtained is then mixed under argon gas with potassium cyanide dissolved in dimethyl sulfoxide and the resulting methoxy-PEG-nitrile is purified on a filtration column packed with dry silica gel. The purified methoxy-PEG-nitrile is reacted with hydrochloric acid to give methoxy-PEG-amide. This methoxy-PEG-amide is purified by water dialysis. The purified methoxy-PEG-amide is then reacted with potassium hydroxide and subsequently acidified, leading to the formation of methoxy-PEG-acid. Finally, the methoxy-PEG-acid is purified by another water dialysis process and lyophilized to give a purified solid of methoxy-PEG-acid.
本発明のさらなる態様において、ヒドロキシル−ＰＥＧをクロロスルホナートと反応させてＰＥＧ−スルホナートエステルを形成させる段階と、ＰＥＧ−スルホナートエステルを金属シアン化物と反応させてＰＥＧ−ニトリルを形成させる段階とを含む、単離され実質的に精製された式（ＩＩＩ）のＰＥＧ−ニトリルを調製する方法が提供される。生成したＰＥＧ−ニトリルは、純度が９５％〜１００％の範囲の固体である。 In a further embodiment of the invention, reacting hydroxyl-PEG with chlorosulfonate to form PEG-sulfonate ester; reacting PEG-sulfonate ester with metal cyanide to form PEG-nitrile; A process for preparing an isolated and substantially purified PEG-nitrile of formula (III) is provided. The PEG-nitrile produced is a solid with a purity ranging from 95% to 100%.
好ましい実施形態において、クロロスルホナートは、塩化メシル、塩化トリフルオロメタンスルホニル（塩化トリフリック）、および塩化トシルから選択される。 In a preferred embodiment, the chlorosulfonate is selected from mesyl chloride, trifluoromethanesulfonyl chloride (triflic chloride), and tosyl chloride.
上記方法の別の実施において、ＰＥＧ−ニトリルをカラム濾過により精製するさらなる工程が提供される。 In another implementation of the above method, a further step of purifying the PEG-nitrile by column filtration is provided.
上記方法の最も好ましい実施において、ジクロロメタン中に溶解したヒドロキシル−メトキシ−ＰＥＧを、トリエチルアミンおよび塩化メシルと共に氷浴中アルゴンガス下で混合する。このようにして得られるメトキシ−ＰＥＧ−メシラートを次に、ジメチルスルホキシド中に溶解したシアン化カリウムと共にアルゴンガス下で混合し、得られるメトキシ−ＰＥＧ−ニトリルを、まず乾燥シリカゲルを充填した濾過カラムで精製し、続いて冷却ジエチルエーテル中で沈殿させてメトキシ−ＰＥＧ−ニトリルの精製固体を得る。 In the most preferred practice of the above method, hydroxyl-methoxy-PEG dissolved in dichloromethane is mixed with triethylamine and mesyl chloride in an ice bath under argon gas. The methoxy-PEG-mesylate thus obtained is then mixed with potassium cyanide dissolved in dimethyl sulfoxide under argon gas, and the resulting methoxy-PEG-nitrile is first purified on a filtration column packed with dry silica gel. Subsequent precipitation in cold diethyl ether yields a purified solid of methoxy-PEG-nitrile.
本発明のさらに別の態様によれば、ヒドロキシル−ＰＥＧをクロロスルホナートと反応させてＰＥＧ−スルホナートエステルを形成させる段階と、ＰＥＧ−スルホナートエステルを金属シアン化物と反応させてＰＥＧ−ニトリルを形成させる段階と、ＰＥＧ−ニトリルを加水分解してＰＥＧ−酸を形成させる段階と、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）の存在下で、ＰＥＧ−酸をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とカップリングさせてＰＥＧ−スクシンイミジルエステルを形成させる段階とを伴う、単離され実質的に精製されたＰＥＧ−スクシンイミジルエステルの調製方法が提供される。 According to yet another aspect of the present invention, hydroxyl-PEG is reacted with chlorosulfonate to form PEG-sulfonate ester, and PEG-sulfonate ester is reacted with metal cyanide to form PEG-nitrile. PEG-acid in the presence of N- (3-dimethylaminopropyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC), hydrolyzing PEG-nitrile to form PEG-acid There is provided a process for the preparation of an isolated and substantially purified PEG-succinimidyl ester, comprising the step of coupling to N-hydroxysuccinimide (NHS) to form a PEG-succinimidyl ester.
好ましい実施形態において、クロロスルホナートは、塩化メシル、塩化トリフルオロメタンスルホニル（塩化トリフリック）、および塩化トシルから選択される。 In a preferred embodiment, the chlorosulfonate is selected from mesyl chloride, trifluoromethanesulfonyl chloride (triflic chloride), and tosyl chloride.
上記方法の変法において、加水分解の工程は、ＰＥＧ−ニトリルを無機酸で加水分解してＰＥＧ−アミドを形成させる工程と、続いてＰＥＧ−アミドをアルカリでもう１回加水分解し、続けて酸性化する工程とを含む。好ましい実施形態において、酸は塩酸であり、アルカリは水酸化カリウムである。 In a variation of the above method, the hydrolysis step comprises hydrolyzing PEG-nitrile with an inorganic acid to form PEG-amide, followed by another hydrolysis of PEG-amide with alkali followed by An acidifying step. In a preferred embodiment, the acid is hydrochloric acid and the alkali is potassium hydroxide.
上記方法の別の実施において、ジエチルエーテルを用いる沈殿によりＰＥＧ−スクシンイミジルエステルを精製するさらなる工程が提供される。この工程において、ＰＥＧ−スクシンイミジルエステルを冷却エチルエーテル中で粗製混合物から沈殿させ、得られる沈殿物を濾過し、室温にて４８時間真空乾燥させる。 In another implementation of the above method, a further step of purifying the PEG-succinimidyl ester by precipitation with diethyl ether is provided. In this step, PEG-succinimidyl ester is precipitated from the crude mixture in cold ethyl ether and the resulting precipitate is filtered and vacuum dried at room temperature for 48 hours.
本発明には多くの利点がある。例えば、精製されたＰＥＧ−酸およびＰＥＧ−ニトリルは両方とも安定な化合物であり、そのためこれら２つのＰＥＧ誘導体を貯蔵するために不活性な環境を必要としない。 The present invention has many advantages. For example, purified PEG-acid and PEG-nitrile are both stable compounds, and therefore do not require an inert environment to store these two PEG derivatives.
本発明の別の利点は、精製されたＰＥＧ−酸が、タンパク質などの他の生体分子とのｉｎ ｓｉｔｕでのペグ化に容易に適用できることである。したがって、活性化ＰＥＧ−スクシンイミジルエステルの単離は必要とされない。 Another advantage of the present invention is that purified PEG-acid can be readily applied to in situ pegylation with other biomolecules such as proteins. Therefore, isolation of activated PEG-succinimidyl ester is not required.
本明細書および請求項において用いられる「含む」とは、次に続く要素を含むが他のものを排除しないことを意味する。前述のように、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、ポリ（エチエンオキシド）またはポリ（オキシエチレン）と同義であり（両方ともＰＥＯと略される）、エチレンオキシドの繰り返し単位から成る共通の構造（ＩＶ）を有するポリマーである。 “Including” as used in the specification and claims means including the following elements, but not excluding others. As mentioned above, poly (ethylene glycol) (PEG) is synonymous with poly (ethylene oxide) or poly (oxyethylene) (both abbreviated as PEO) and has a common structure consisting of repeating units of ethylene oxide. It is a polymer having (IV).
（ＩＶ） ＨＯ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−Ｈ (IV) HO— (C 2 H 4 O) n —H
一般に、用語ＰＥＧは様々な文脈において用いることができる。例えば、ＰＥＧ−酸のような化学名の一部として用いられる場合、ＰＥＧは前述の式（ＩＩ）： In general, the term PEG can be used in various contexts. For example, when used as part of a chemical name such as PEG-acid, PEG is represented by the formula (II) described above:
（ＩＩ） −Ｃ２Ｈ４Ｏ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−
により示される。
(II) -C 2 H 4 O- (C 2 H 4 O) n -
Indicated by.
一方で、ＰＥＧ−ＣＯＯＨなどの化学式の一部としては、ＰＥＧは（Ｖ）の構造： On the other hand, as part of a chemical formula such as PEG-COOH, PEG has the structure of (V):
（Ｖ） −（Ｃ２Ｈ４−Ｏ）ｎ−
により示される。
(V) - (C 2 H 4 -O) n -
Indicated by.
ＰＥＧのＣ末端において、官能基または官能基の組合せをそこへ結合させることができ、その結果「キャッピングされたＰＥＧ（ｃａｐｐｅｄ−ＰＥＧ）」となる。例えば、メトキシ基（ＣＨ３Ｏ−）をＰＥＧのＣ末端へ付加すると、メトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）が形成され、下記の化学式（ＶＩ）： At the C-terminus of PEG, a functional group or combination of functional groups can be attached thereto, resulting in a “capped-PEG”. For example, when a methoxy group (CH 3 O—) is added to the C-terminus of PEG, methoxy-PEG (mPEG) is formed and has the following chemical formula (VI):
（ＶＩ） ＣＨ３Ｏ−（Ｃ２Ｈ４−Ｏ）ｎ−Ｃ２Ｈ４−ＯＨ
によって表される。
(VI) CH 3 O- (C 2 H 4 -O) n -C 2 H 4 -OH
Represented by
用語「シアニド」とは、α、β不飽和有機シアニドなどの有機シアニド、ならびにシアン化カリウム（ＫＣＮ）などの金属シアン化物を指す。本明細書において表される「ＧＭＰ準拠化学品」は、現行の適正製造基準の指針のもとで調製される化学品に合わせて精製される。「ＵＳＰグレード化学品」とは、米国薬局方および国民薬品集（２００６年）のＵＳＰ２９−ＮＦ２４版の対応する試験要求を満たす化学品を指す。 The term “cyanide” refers to organic cyanides such as α, β unsaturated organic cyanides, as well as metal cyanides such as potassium cyanide (KCN). “GMP compliant chemicals” as expressed herein are purified to chemicals prepared under current good manufacturing practice guidelines. “USP Grade Chemicals” refers to chemicals that meet the corresponding testing requirements of the USP29-NF24 version of the US Pharmacopoeia and National Medicinal Products (2006).
本発明の１つの実施形態において、前述の式（Ｉ）により表される、得られた、単離され実質的に精製されたＰＥＧ−酸は、ＧＭＰ準拠およびＵＳＰグレードであり、存在する検出可能な金属が５ｐｐｍ以下である。ＰＥＧ−酸の固体は外観上白色である。 In one embodiment of the invention, the resulting isolated and substantially purified PEG-acid represented by the aforementioned formula (I) is GMP compliant and USP grade and present detectable New metal is 5 ppm or less. The solid of PEG-acid is white in appearance.
本発明の別の実施形態において、前述の式（ＩＩＩ）で表される、単離され実質的に精製されたＰＥＧ−ニトリルは、ＧＭＰ準拠およびＵＳＰグレードであり、その中に存在する検出可能な金属が５ｐｐｍ以下である。青白色のＰＥＧ−ニトリル固体の融点は４９℃〜５０．７℃である。 In another embodiment of the present invention, the isolated and substantially purified PEG-nitrile represented by the aforementioned formula (III) is GMP compliant and USP grade and detectable in it The metal is 5 ppm or less. The melting point of the pale white PEG-nitrile solid is 49 ° C to 50.7 ° C.
本発明は下記の実施例によりさらに明らかにされ、この実施例は本発明を限定することを意図しない。 The invention will be further clarified by the following examples, which are not intended to limit the invention.
実施例１ Example 1
ｍＰＥＧ−メシラートを出発原料として用いるｍＰＥＧ−ニトリルの調製方法 Method for preparing mPEG-nitrile using mPEG-mesylate as starting material
ｍＰＥＧ−メシラートの製造および精製 Production and purification of mPEG-mesylate
この方法の第１工程において、１ｇのヒドロキシル−ｍＰＥＧ（平均分子量５０００、Ｆｌｕｋａ）を０．１９ｇの塩化メシル（ＭｓＣｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させることにより、ｍＰＥＧ−メシラートが製造される。２ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ、分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）に溶解したヒドロキシル−ｍＰＥＧを、最初に０．１４ｍＬのトリエチルアミン（分析試薬級 ９９％以上、Ｍｅｒｃｋ）と共に氷浴中アルゴン下で１時間混合および撹拌する。その後、ＭｓＣｌをこの混合物に３０分かけてゆっくりと添加し、さらに２時間連続して撹拌する。この混合物を室温でさらに２２〜２４時間撹拌する。 In the first step of the process, mPEG-mesylate is prepared by reacting 1 g of hydroxyl-mPEG (average molecular weight 5000, Fluka) with 0.19 g of mesyl chloride (MsCl, Aldrich). Hydroxyl-mPEG dissolved in 2 mL dichloromethane (DCM, analytical reagent grade 99% or higher, Tedia) was first mixed with 0.14 mL triethylamine (analytical reagent grade 99% or higher, Merck) for 1 hour under argon in an ice bath. And stir. MsCl is then slowly added to the mixture over 30 minutes and stirred continuously for another 2 hours. The mixture is stirred at room temperature for a further 22-24 hours.
次に、撹拌した混合物を吸引濾過し、沈殿物を捨て、乾燥シリカゲル（１０ｇ、７０〜１２０メッシュ）を充填したカラムに濾液を通す。カラム中に保持されているｍＰＥＧ−メシラートを完全に溶出させるために、約２５ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ、分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）を濾過カラムに加える。前述の濾過および溶出の工程を、すべての塩化メシル残渣が除去されてしまうまで、少なくとも２回繰り返す。得られるｍＰＥＧ−メシラート溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮し、２００ｍＬの冷却ジエチルエーテル（分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）中でさらに精製する。次に、精製された生成物を濾過し、４８時間真空乾燥する。 The stirred mixture is then filtered with suction, the precipitate is discarded and the filtrate is passed through a column packed with dry silica gel (10 g, 70-120 mesh). To completely elute the mPEG-mesylate retained in the column, add approximately 25 mL of dichloromethane (DCM, analytical reagent grade 99% or higher, Tedia) to the filtration column. The filtration and elution steps described above are repeated at least twice until all the mesyl chloride residue has been removed. The resulting mPEG-mesylate solution is concentrated on a rotary evaporator and further purified in 200 mL of cold diethyl ether (analytical reagent grade 99%, Tedia). The purified product is then filtered and vacuum dried for 48 hours.
ｍＰＥＧ−ニトリルの製造および精製 Production and purification of mPEG-nitrile
続いて、約１ｇの精製されたｍＰＥＧ−メシラートを、５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）に溶解した０．０３ｇのシアン化カリウム（ＫＣＮ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させる。反応混合物を３２〜３５℃の温度で４８時間アルゴンガス流下で撹拌し、ｍＰＥＧ−ニトリルを形成させる。次に粗製混合物を、乾燥シリカゲルを充填した濾過カラムに通す。濾液を収集し、次にカラム中に保持されているｍＰＥＧニトリルを完全に溶出させるために、ＤＣＭをカラム中に加える。メシル酸カリウムなどの不純物がすべて除去されるまで、この濾過プロセスを繰り返す。次に精製されたｍＰＥＧ−ニトリルの濾液を冷却ジエチルエーテル中で沈殿させ、ｍＰＥＧ−ニトリルの固体生成物を得る。 Subsequently, about 1 g of purified mPEG-mesylate is reacted with 0.03 g of potassium cyanide (KCN, Aldrich) dissolved in 5 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO, analytical reagent grade 99% or higher, Tedia). The reaction mixture is stirred at a temperature of 32-35 ° C. for 48 hours under a stream of argon gas to form mPEG-nitrile. The crude mixture is then passed through a filtration column packed with dry silica gel. The filtrate is collected and then DCM is added into the column to completely elute the mPEG nitrile retained in the column. This filtration process is repeated until all impurities such as potassium mesylate are removed. The purified mPEG-nitrile filtrate is then precipitated in cold diethyl ether to give a solid product of mPEG-nitrile.
精製したｍＰＥＧ−ニトリルは、１Ｈ−ＮＭＲによる特性決定を行い、ＮＭＲスペクトル（図１ａ）は２．７ｐｐｍ（ニトリル基に隣接するプロトンに相当、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、３．２４ｐｐｍ（メトキシ基に相当、ＣＨ３Ｏ−）、および３．５１ｐｐｍ（ポリマー骨格に相当）においてピークを示す。さらに置換度はＮＭＲ分光法により約９５％〜１００％と決定される。 The purified mPEG-nitrile was characterized by 1 H-NMR and the NMR spectrum (FIG. 1 a) was 2.7 ppm (corresponding to the proton adjacent to the nitrile group, —OCH 2 CH 2 CN), 3.24 ppm (methoxy) Corresponding to the group, CH 3 O—), and 3.51 ppm (corresponding to the polymer backbone). Further, the degree of substitution is determined to be about 95% to 100% by NMR spectroscopy.
実施例２ Example 2
ｍＰＥＧ−メシラートを出発原料として用いるｍＰＥＧ−酸の調製方法 Method for preparing mPEG-acid using mPEG-mesylate as starting material
ｍＰＥＧ−メシラートの製造および精製 Production and purification of mPEG-mesylate
この方法の第１工程において、１ｇのヒドロキシル−ｍＰＥＧ（平均分子量５０００、Ｆｌｕｋａ）を０．１９ｇの塩化メシル（ＭｓＣｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させることにより、ｍＰＥＧ−メシラートが製造される。２ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ、分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）に溶解したヒドロキシル−ｍＰＥＧを、最初に０．１４ｍＬのトリエチルアミン（分析試薬級 ９９％以上、Ｍｅｒｃｋ）と共に氷浴中アルゴン下で１時間混合および撹拌する。その後、ＭｓＣｌをこの混合物に３０分かけてゆっくりと添加し、さらに２時間連続して撹拌する。この混合物を室温でさらに２２〜２４時間撹拌する。 In the first step of the process, mPEG-mesylate is prepared by reacting 1 g of hydroxyl-mPEG (average molecular weight 5000, Fluka) with 0.19 g of mesyl chloride (MsCl, Aldrich). Hydroxyl-mPEG dissolved in 2 mL dichloromethane (DCM, analytical reagent grade 99% or higher, Tedia) was first mixed with 0.14 mL triethylamine (analytical reagent grade 99% or higher, Merck) for 1 hour under argon in an ice bath. And stir. MsCl is then slowly added to the mixture over 30 minutes and stirred continuously for another 2 hours. The mixture is stirred at room temperature for a further 22-24 hours.
次に、撹拌した混合物を吸引濾過し、沈殿物を捨て、乾燥シリカゲル（１０ｇ、７０〜１２０メッシュ）を充填したカラムに濾液を通す。カラム中に保持されているｍＰＥＧ−メシラートを完全に溶出させるために、約２５ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ、分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）を濾過カラムに加える。前述の濾過および溶出の工程を、すべての塩化メシル残渣が除去されてしまうまで、少なくとも２回繰り返す。得られるｍＰＥＧ−メシラート溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮し、２００ｍＬの冷却ジエチルエーテル（分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）中でさらに精製する。次に、精製された生成物を濾過し、４８時間真空乾燥する。 The stirred mixture is then filtered with suction, the precipitate is discarded and the filtrate is passed through a column packed with dry silica gel (10 g, 70-120 mesh). To completely elute the mPEG-mesylate retained in the column, add approximately 25 mL of dichloromethane (DCM, analytical reagent grade 99% or higher, Tedia) to the filtration column. The filtration and elution steps described above are repeated at least twice until all the mesyl chloride residue has been removed. The resulting mPEG-mesylate solution is concentrated on a rotary evaporator and further purified in 200 mL of cold diethyl ether (analytical reagent grade 99%, Tedia). The purified product is then filtered and vacuum dried for 48 hours.
ｍＰＥＧ−ニトリルの製造および精製 Production and purification of mPEG-nitrile
続いて、約１ｇの精製されたｍＰＥＧ−メシラートを、５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）に溶解した０．０３ｇのシアン化カリウム（ＫＣＮ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させる。反応混合物を３２〜３５℃の温度で４８時間アルゴンガス流下で撹拌し、ｍＰＥＧ−ニトリルを形成させる。次に粗製混合物を、乾燥シリカゲルを充填した濾過カラムに通す。濾液を収集し、次にカラム中に保持されているｍＰＥＧニトリルを完全に溶出させるために、ＤＣＭをカラム中に加える。メシル酸カリウムなどの不純物がすべて除去されるまで、この濾過プロセスを繰り返す。次に精製されたｍＰＥＧ−ニトリルの濾液を冷却ジエチルエーテル中で沈殿させ、ｍＰＥＧ−ニトリルの固体生成物を得る。 Subsequently, about 1 g of purified mPEG-mesylate is reacted with 0.03 g of potassium cyanide (KCN, Aldrich) dissolved in 5 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO, analytical reagent grade 99% or higher, Tedia). The reaction mixture is stirred at a temperature of 32-35 ° C. for 48 hours under a stream of argon gas to form mPEG-nitrile. The crude mixture is then passed through a filtration column packed with dry silica gel. The filtrate is collected and then DCM is added into the column to completely elute the mPEG nitrile retained in the column. This filtration process is repeated until all impurities such as potassium mesylate are removed. The purified mPEG-nitrile filtrate is then precipitated in cold diethyl ether to give a solid product of mPEG-nitrile.
精製したｍＰＥＧ−ニトリルは、１Ｈ−ＮＭＲによる特性決定を行い、ＮＭＲスペクトル（図１ａ）は２．７ｐｐｍ（ニトリル基に隣接するプロトンに相当、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、３．２４ｐｐｍ（メトキシ基に相当、ＣＨ３Ｏ−）、および３．５１ｐｐｍ（ポリマー骨格に相当）においてピークを示す。さらに置換度はＮＭＲ分光法により約９５％〜１００％と決定される。 The purified mPEG-nitrile was characterized by 1 H-NMR and the NMR spectrum (FIG. 1 a) was 2.7 ppm (corresponding to the proton adjacent to the nitrile group, —OCH 2 CH 2 CN), 3.24 ppm (methoxy) Corresponding to the group, CH 3 O—), and 3.51 ppm (corresponding to the polymer backbone). Further, the degree of substitution is determined to be about 95% to 100% by NMR spectroscopy.
ｍＰＥＧ−アミドの製造および精製 Production and purification of mPEG-amide
次の工程において、１ｇの精製したｍＰＥＧ−ニトリルを４ｍＬの塩酸（ＨＣｌ、１２Ｍ、ＢＤＨ Ｃｏｍｐａｎｙ）により加水分解してｍＰＥＧ−アミドを形成させる。この酸加水分解反応は、米国特許第５，６７２，６６２号およびＳｅｄａｇｈａｔ−ＨｅｒａｔｉらによるＰｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，４３，３５−４１（１９９９）において過去に開示されており、その中で、最初にｍＰＥＧ−ニトリルを室温で４４時間撹拌しながら濃ＨＣｌに溶解させ、続いて３．５ｇの水酸化カリウム（ＫＯＨ、ＢＤＨ Ｃｏｍｐａｎｙ）のペレットを、氷浴下で撹拌混合物に添加する。その結果、得られる溶液のｐＨはＨＣｌ（２〜６Ｍ）を用いて３〜４に調整される。上記の反応において、生成する塩化カリウム（ＫＣｌ）を、透析により（１０００カットオフ膜）室温で３日間かけて、毎日水を交換しながら除去する。ＫＣｌの除去の完了は、透析した水の伝導度が透析に用いられる水の伝導度と等しくなることにより分かる。ＫＣｌの除去であるにもかかわらず、透析のプロセスはｍＰＥＧ−アミドを精製するのにも役立つ。 In the next step, 1 g of purified mPEG-nitrile is hydrolyzed with 4 mL of hydrochloric acid (HCl, 12M, BDH Company) to form mPEG-amide. This acid hydrolysis reaction has been previously disclosed in US Pat. No. 5,672,662 and Polymer Bulletin, 43, 35-41 (1999) by Sedaghat-Herati et al., Among which first mPEG-nitrile. Is dissolved in concentrated HCl with stirring at room temperature for 44 hours, followed by the addition of 3.5 g of potassium hydroxide (KOH, BDH Company) pellets to the stirred mixture under an ice bath. As a result, the pH of the resulting solution is adjusted to 3-4 using HCl (2-6M). In the above reaction, the produced potassium chloride (KCl) is removed by dialysis (1000 cut-off membrane) at room temperature for 3 days with daily water changes. Completion of KCl removal is seen by the conductivity of the dialyzed water being equal to the conductivity of the water used for dialysis. Despite the removal of KCl, the dialysis process also helps to purify mPEG-amide.
ｍＰＥＧ−酸の製造および精製 Production and purification of mPEG-acid
次に精製したｍＰＥＧ−アミドは、撹拌下室温で７２時間、１．７ｇのＫＯＨペレットによりもう１回加水分解を受け、ｍＰＥＧ−酸の対応するカルボン酸塩を形成する。その後、ＨＣｌ（２〜６Ｍ）を氷浴中の混合物に添加し、その結果得られるｐＨを３〜４に戻すように調整する。前述のｍＰＥＧ−アミド合成と類似して、生成する塩化カリウム（ＫＣｌ）塩および塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）塩を除去するために透析プロセスが利用され、このプロセスにおいて、氷冷した混合物を室温にて３日間、毎日水を交換しながら透析する（１０００カットオフ膜）。透析した水の伝導度が透析に用いられる水の伝導度と一致すると、塩の除去は完了する。得られる精製ｍＰＥＧ−酸を次に３日間凍結乾燥し、ｍＰＥＧ−酸の精製固体を得る。 The purified mPEG-amide is then subjected to another hydrolysis with 1.7 g KOH pellets for 72 hours at room temperature under stirring to form the corresponding carboxylate salt of mPEG-acid. HCl (2-6M) is then added to the mixture in the ice bath and the resulting pH is adjusted back to 3-4. Similar to the mPEG-amide synthesis described above, a dialysis process was utilized to remove the resulting potassium chloride (KCl) and ammonium chloride (NH 4 Cl) salts, in which the ice-cooled mixture was brought to room temperature. Dialyze (1000 cut-off membrane) with daily water changes for 3 days. Salt removal is complete when the dialyzed water conductivity matches the conductivity of the water used for dialysis. The resulting purified mPEG-acid is then lyophilized for 3 days to give a purified solid of mPEG-acid.
精製したｍＰＥＧ−酸を１Ｈ−ＮＭＲ分光法により同定し、ＮＭＲスペクトル（図２ａ）は２．４ｐｐｍ（酸性基に隣接するプロトンに相当、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）、３．２４ｐｐｍ（メトキシ基に相当、ＣＨ３Ｏ−）、および３．５１ｐｐｍ（ポリマー骨格に相当）においてピークを示す。さらに置換度はＮＭＲ分光法により約９５％〜１００％と決定される。 The purified mPEG-acid was identified by 1 H-NMR spectroscopy and the NMR spectrum (FIG. 2a) was 2.4 ppm (corresponding to the proton adjacent to the acidic group, —OCH 2 CH 2 COOH), 3.24 ppm (methoxy group). Corresponding to CH 3 O—) and 3.51 ppm (corresponding to the polymer backbone). Further, the degree of substitution is determined to be about 95% to 100% by NMR spectroscopy.
実施例３ Example 3
ｍＰＥＧ−メシラートを出発原料として用いるｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオン酸エステル（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）の調製方法 Method for preparing mPEG succinimidyl propionate (mPEG-SPA) using mPEG-mesylate as starting material
ｍＰＥＧ−メシラートの製造および精製 Production and purification of mPEG-mesylate
この方法の第１工程において、１ｇのヒドロキシル−ｍＰＥＧ（平均分子量５０００、Ｆｌｕｋａ）を０．１９ｇの塩化メシル（ＭｓＣｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させることにより、ｍＰＥＧ−メシラートが製造される。２ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ、分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）に溶解したヒドロキシル−ｍＰＥＧを、最初に０．１４ｍＬのトリエチルアミン（分析試薬級 ９９％以上、Ｍｅｒｃｋ）と共に氷浴中アルゴン下で１時間混合および撹拌する。その後、ＭｓＣｌをこの混合物に３０分かけてゆっくりと添加し、さらに２時間連続して撹拌する。この混合物を室温でさらに２２〜２４時間撹拌する。 In the first step of the process, mPEG-mesylate is prepared by reacting 1 g of hydroxyl-mPEG (average molecular weight 5000, Fluka) with 0.19 g of mesyl chloride (MsCl, Aldrich). Hydroxyl-mPEG dissolved in 2 mL dichloromethane (DCM, analytical reagent grade 99% or higher, Tedia) was first mixed with 0.14 mL triethylamine (analytical reagent grade 99% or higher, Merck) for 1 hour under argon in an ice bath. And stir. MsCl is then slowly added to the mixture over 30 minutes and stirred continuously for another 2 hours. The mixture is stirred at room temperature for a further 22-24 hours.
次に、撹拌した混合物を吸引濾過し、沈殿物を捨て、乾燥シリカゲル（１０ｇ、７０〜１２０メッシュ）を充填したカラムに濾液を通す。カラム中に保持されているｍＰＥＧ−メシラートを完全に溶出させるために、約２５ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ、分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）を濾過カラムに加える。前述の濾過および溶出の工程を、すべての塩化メシル残渣が除去されてしまうまで、少なくとも２回繰り返す。得られるｍＰＥＧ−メシラート溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮し、２００ｍＬの冷却ジエチルエーテル（分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）中でさらに精製する。次に、精製された生成物を濾過し、４８時間真空乾燥する。 The stirred mixture is then filtered with suction, the precipitate is discarded and the filtrate is passed through a column packed with dry silica gel (10 g, 70-120 mesh). To completely elute the mPEG-mesylate retained in the column, add approximately 25 mL of dichloromethane (DCM, analytical reagent grade 99% or higher, Tedia) to the filtration column. The filtration and elution steps described above are repeated at least twice until all the mesyl chloride residue has been removed. The resulting mPEG-mesylate solution is concentrated on a rotary evaporator and further purified in 200 mL of cold diethyl ether (analytical reagent grade 99%, Tedia). The purified product is then filtered and vacuum dried for 48 hours.
ｍＰＥＧ−ニトリルの製造および精製 Production and purification of mPEG-nitrile
続いて、約１ｇの精製されたｍＰＥＧ−メシラートを、５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）に溶解した０．０３ｇのシアン化カリウム（ＫＣＮ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させる。反応混合物を３２〜３５℃の温度で４８時間アルゴンガス流下で撹拌し、ｍＰＥＧ−ニトリルを形成させる。次に粗製混合物を、乾燥シリカゲルを充填した濾過カラムに通す。濾液を収集し、次にカラム中に保持されているｍＰＥＧニトリルを完全に溶出させるために、ＤＣＭをカラム中に加える。メシル酸カリウムなどの不純物がすべて除去されるまで、この濾過プロセスを繰り返す。次に精製されたｍＰＥＧ−ニトリルの濾液を冷却ジエチルエーテル中で沈殿させ、ｍＰＥＧ−ニトリルの固体生成物を得る。 Subsequently, about 1 g of purified mPEG-mesylate is reacted with 0.03 g of potassium cyanide (KCN, Aldrich) dissolved in 5 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO, analytical reagent grade 99% or higher, Tedia). The reaction mixture is stirred at a temperature of 32-35 ° C. for 48 hours under a stream of argon gas to form mPEG-nitrile. The crude mixture is then passed through a filtration column packed with dry silica gel. The filtrate is collected and then DCM is added into the column to completely elute the mPEG nitrile retained in the column. This filtration process is repeated until all impurities such as potassium mesylate are removed. The purified mPEG-nitrile filtrate is then precipitated in cold diethyl ether to give a solid product of mPEG-nitrile.
精製したｍＰＥＧ−ニトリルは、１Ｈ−ＮＭＲによる特性決定を行い、ＮＭＲスペクトル（図１ａ）は２．７ｐｐｍ（ニトリル基に隣接するプロトンに相当、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、３．２４ｐｐｍ（メトキシ基に相当、ＣＨ３Ｏ−）、および３．５１ｐｐｍ（ポリマー骨格に相当）においてピークを示す。さらに置換度はＮＭＲ分光法により約９５％〜１００％と決定される。 The purified mPEG-nitrile was characterized by 1 H-NMR and the NMR spectrum (FIG. 1 a) was 2.7 ppm (corresponding to the proton adjacent to the nitrile group, —OCH 2 CH 2 CN), 3.24 ppm (methoxy) It corresponds to group, CH 3 O-), and shows a peak at 3.51 ppm (equivalent to the polymer backbone). Further, the degree of substitution is determined to be about 95% to 100% by NMR spectroscopy.
ｍＰＥＧ−アミドの製造および精製 Production and purification of mPEG-amide
次の工程において、１ｇの精製したｍＰＥＧ−ニトリルを４〜５ｍＬの塩酸（ＨＣｌ、１２Ｍ、ＢＤＨ Ｃｏｍｐａｎｙ）により加水分解してｍＰＥＧ−アミドを形成させる。この酸加水分解反応は、米国特許第５，６７２，６６２号およびＳｅｄａｇｈａｔ−ＨｅｒａｔｉらによるＰｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，４３，３５−４１（１９９９）において過去に開示されており、その中で、最初にｍＰＥＧ−ニトリルを室温で４４時間撹拌しながら濃ＨＣｌに溶解させ、続いて３．５ｇの水酸化カリウム（ＫＯＨ、ＢＤＨ Ｃｏｍｐａｎｙ）のペレットを、氷浴下で撹拌混合物に添加する。その結果、得られる溶液のｐＨはＨＣｌ（２〜６Ｍ）を用いて３〜４に調整される。上記の反応において、生成する塩化カリウム（ＫＣｌ）を、透析により（１０００カットオフ膜）室温で３日間かけて、毎日水を交換しながら除去する。ＫＣｌの除去の完了は、透析した水の伝導度が透析に用いられる水の伝導度と等しくなることにより分かる。ＫＣｌの除去であるにもかかわらず、透析のプロセスはｍＰＥＧ−アミドを精製するのにも役立つ。 In the next step, 1 g of purified mPEG-nitrile is hydrolyzed with 4-5 mL of hydrochloric acid (HCl, 12M, BDH Company) to form mPEG-amide. This acid hydrolysis reaction has been previously disclosed in US Pat. No. 5,672,662 and Polymer Bulletin, 43, 35-41 (1999) by Sedaghat-Herati et al., Among which first mPEG-nitrile. Is dissolved in concentrated HCl with stirring at room temperature for 44 hours, followed by the addition of 3.5 g of potassium hydroxide (KOH, BDH Company) pellets to the stirred mixture under an ice bath. As a result, the pH of the resulting solution is adjusted to 3-4 using HCl (2-6M). In the above reaction, the produced potassium chloride (KCl) is removed by dialysis (1000 cut-off membrane) at room temperature for 3 days with daily water changes. Completion of KCl removal is seen by the conductivity of the dialyzed water being equal to the conductivity of the water used for dialysis. Despite the removal of KCl, the dialysis process also helps to purify mPEG-amide.
ｍＰＥＧ−酸の製造および精製 Production and purification of mPEG-acid
次に精製したｍＰＥＧ−アミドは、撹拌下室温で７２時間、１．７ｇのＫＯＨペレットによりもう１回加水分解を受け、ｍＰＥＧ−酸の対応するカルボン酸塩を形成する。その後、ＨＣｌ（２〜６Ｍ）を氷浴中の混合物に添加し、その結果得られるｐＨを３〜４に戻すように調整する。前述のｍＰＥＧ−アミド合成と類似して、生成する塩化カリウム（ＫＣｌ）塩および塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）塩を除去するために透析プロセスが利用され、このプロセスにおいて、氷冷した混合物を室温にて３日間、毎日水を交換しながら透析する（１０００カットオフ膜）。透析した水の伝導度が透析に用いられる水の伝導度と一致すると、塩の除去は完了する。得られる精製ｍＰＥＧ−酸を次に３日間凍結乾燥し、ｍＰＥＧ−酸の精製固体を得る。 The purified mPEG-amide is then subjected to another hydrolysis with 1.7 g KOH pellets for 72 hours at room temperature under stirring to form the corresponding carboxylate salt of mPEG-acid. HCl (2-6M) is then added to the mixture in the ice bath and the resulting pH is adjusted back to 3-4. Similar to the mPEG-amide synthesis described above, a dialysis process was utilized to remove the resulting potassium chloride (KCl) and ammonium chloride (NH 4 Cl) salts, in which the ice-cooled mixture was brought to room temperature. Dialyze (1000 cut-off membrane) with daily water changes for 3 days. Salt removal is complete when the dialyzed water conductivity matches the conductivity of the water used for dialysis. The resulting purified mPEG-acid is then lyophilized for 3 days to give a purified solid of mPEG-acid.
精製したｍＰＥＧ−酸を１Ｈ−ＮＭＲ分光法により同定し、ＮＭＲスペクトル（図２ａ）は２．４３ｐｐｍ（酸性基に隣接するプロトンに相当、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）、３．２４ｐｐｍ（メトキシ基に相当、ＣＨ３Ｏ−）、および３．５１ｐｐｍ（ポリマー骨格に相当）においてピークを示す。さらに置換度はＮＭＲ分光法により約９５％〜１００％と決定される。 The purified mPEG-acid was identified by 1 H-NMR spectroscopy, and the NMR spectrum (FIG. 2a) was 2.43 ppm (corresponding to the proton adjacent to the acidic group, —OCH 2 CH 2 COOH), 3.24 ppm (methoxy group). Corresponding to CH 3 O—) and 3.51 ppm (corresponding to the polymer backbone). Further, the degree of substitution is determined to be about 95% to 100% by NMR spectroscopy.
ｍＰＥＧ−ＳＰＡの製造および精製 Production and purification of mPEG-SPA
最終工程において、０．０６ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１ｇの精製ｍＰＥＧ−酸および７ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ、分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）の混合物に添加し、反応混合物を０℃の低温に保つ。０．５ｍＬのＤＣＭ中の０．１ｇの１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、Ａｌｄｒｉｃｈ）をゆっくり添加し、混合物を室温で２４時間アルゴン下で撹拌する。得られる溶液を吸引濾過するとすぐ、濾液を冷却ジエチルエーテルにより沈殿させ、得られる沈殿物を濾過し室温で４８時間真空乾燥する。ｍＰＥＧ−ＳＰＡの最終生成物を、アルミホイル中でおよそ−２０℃で貯蔵する。 In the final step, 0.06 g N-hydroxysuccinimide (NHS, Aldrich) is added to a mixture of 1 g purified mPEG-acid and 7 mL dichloromethane (DCM, analytical reagent grade 99%, Tedia) and the reaction mixture is Keep at a low temperature of 0 ° C. Slowly add 0.1 g of 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, Aldrich) in 0.5 mL of DCM and stir the mixture at room temperature for 24 hours under argon. As soon as the resulting solution is suction filtered, the filtrate is precipitated with cold diethyl ether, the resulting precipitate is filtered and vacuum dried at room temperature for 48 hours. The final product of mPEG-SPA is stored at approximately −20 ° C. in aluminum foil.
実施例４ Example 4
ｍＰＥＧ−トシラートを出発原料として用いるｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオン酸エステル（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）の調製方法 Method for the preparation of mPEG succinimidyl propionate (mPEG-SPA) using mPEG-tosylate as starting material
ｍＰＥＧ−トシラートの製造および精製 Production and purification of mPEG-tosylate
この方法の第１工程において、１ｇのヒドロキシル−ｍＰＥＧ（平均分子量５０００、Ｆｌｕｋａ）を０．１９ｇの塩化トシル（ＴｓＣｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させることにより、ｍＰＥＧ−トシラートが製造される。２ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ、分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）に溶解したヒドロキシル−ｍＰＥＧを、最初に０．１４ｍＬのトリエチルアミン（分析試薬級 ９９％以上、Ｍｅｒｃｋ）と共に氷浴中アルゴン下で１時間混合および撹拌する。その後、ＴｓＣｌをこの混合物に３０分かけてゆっくりと添加し、さらに２時間連続して撹拌する。この混合物を室温でさらに２２〜２４時間撹拌する。 In the first step of the process, mPEG-tosylate is prepared by reacting 1 g of hydroxyl-mPEG (average molecular weight 5000, Fluka) with 0.19 g of tosyl chloride (TsCl, Aldrich). Hydroxyl-mPEG dissolved in 2 mL dichloromethane (DCM, analytical reagent grade 99% or higher, Tedia) was first mixed with 0.14 mL triethylamine (analytical reagent grade 99% or higher, Merck) for 1 hour under argon in an ice bath. And stir. TsCl is then slowly added to the mixture over 30 minutes and stirred continuously for another 2 hours. The mixture is stirred at room temperature for a further 22-24 hours.
次に、撹拌した混合物を吸引濾過し、沈殿物を捨て、乾燥シリカゲル（１０ｇ、７０〜１２０メッシュ）を充填したカラムに濾液を通す。カラム中に保持されているｍＰＥＧ−トシラートを完全に溶出させるために、約２５ｍＬのＤＣＭを濾過カラムに加える。前述の濾過および溶出の工程を、すべての塩化トシル残渣が除去されてしまうまで、少なくとも２回繰り返す。得られるｍＰＥＧ−トシラート溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮し、２００ｍＬの冷却ジエチルエーテル（分析試薬等級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）中でさらに精製する。次に、精製された生成物を濾過し、４８時間真空乾燥する。 The stirred mixture is then filtered with suction, the precipitate is discarded and the filtrate is passed through a column packed with dry silica gel (10 g, 70-120 mesh). To completely elute the mPEG-tosylate retained in the column, add approximately 25 mL DCM to the filtration column. The filtration and elution steps described above are repeated at least twice until all tosyl chloride residues have been removed. The resulting mPEG-tosylate solution is concentrated on a rotary evaporator and further purified in 200 mL of chilled diethyl ether (analytical reagent grade 99%, Tedia). The purified product is then filtered and vacuum dried for 48 hours.
ｍＰＥＧ−ニトリルの製造および精製 Production and purification of mPEG-nitrile
続いて、約１ｇの精製されたｍＰＥＧ−トシラートを、４〜５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）に溶解した０．０３ｇのシアン化カリウム（ＫＣＮ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させる。反応混合物を３２〜３５℃の温度で４８時間アルゴンガス流下で撹拌し、ｍＰＥＧ−ニトリルを形成させる。次に粗製混合物を、乾燥シリカゲルを充填した濾過カラムに通す。濾液を収集し、次にカラム中に保持されているｍＰＥＧニトリルを完全に溶出させるために、ベンゼンをカラム中に加える。メシル酸カリウムなどの不純物がすべて除去されるまで、この濾過プロセスを繰り返す。次に精製されたｍＰＥＧ−ニトリルの濾液を冷却ジエチルエーテル中で沈殿させ、ｍＰＥＧ−ニトリルの固体生成物を得る。 Subsequently, about 1 g of purified mPEG-tosylate is reacted with 0.03 g of potassium cyanide (KCN, Aldrich) dissolved in 4-5 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO, analytical reagent grade 99%, Tedia). The reaction mixture is stirred at a temperature of 32-35 ° C. for 48 hours under a stream of argon gas to form mPEG-nitrile. The crude mixture is then passed through a filtration column packed with dry silica gel. The filtrate is collected and then benzene is added into the column to completely elute the mPEG nitrile retained in the column. This filtration process is repeated until all impurities such as potassium mesylate are removed. The purified mPEG-nitrile filtrate is then precipitated in cold diethyl ether to give a solid product of mPEG-nitrile.
精製したｍＰＥＧ−ニトリルは、１Ｈ−ＮＭＲによる特性決定を行い、ＮＭＲスペクトル（図１ａ）は２．７ｐｐｍ（ニトリル基に隣接するプロトンに相当、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、３．２４ｐｐｍ（メトキシ基に相当、ＣＨ３Ｏ−）、および３．５１ｐｐｍ（ポリマー骨格に相当）においてピークを示す。さらに置換度はＮＭＲ分光法により約９５％〜１００％と決定される。 The purified mPEG-nitrile was characterized by 1 H-NMR and the NMR spectrum (FIG. 1 a) was 2.7 ppm (corresponding to the proton adjacent to the nitrile group, —OCH 2 CH 2 CN), 3.24 ppm (methoxy) Corresponding to the group, CH 3 O—), and 3.51 ppm (corresponding to the polymer backbone). Further, the degree of substitution is determined to be about 95% to 100% by NMR spectroscopy.
ｍＰＥＧ−アミドの製造および精製 Production and purification of mPEG-amide
次の工程において、１ｇの精製したｍＰＥＧ−ニトリルを４〜５ｍＬの塩酸（ＨＣｌ、１２Ｍ、ＢＤＨ Ｃｏｍｐａｎｙ）により加水分解してｍＰＥＧ−アミドを形成させる。この酸加水分解反応は、米国特許第５，６７２，６６２号およびＳｅｄａｇｈａｔ−ＨｅｒａｔｉらによるＰｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，４３，３５−４１（１９９９）において過去に開示されており、その中で、最初にｍＰＥＧ−ニトリルを室温で４４時間撹拌しながら濃ＨＣｌに溶解させ、続いて３．５ｇの水酸化カリウム（ＫＯＨ、ＢＤＨ Ｃｏｍｐａｎｙ）のペレットを、氷浴下で撹拌混合物に添加する。その結果、得られる溶液のｐＨはＨＣｌ（２〜６Ｍ）を用いて３〜４に調整される。上記の反応において、生成する塩化カリウム（ＫＣｌ）を、透析により（１０００カットオフ膜）室温で３日間かけて、毎日水を交換しながら除去する。ＫＣｌの除去の完了は、透析した水の伝導度が透析に用いられる水の伝導度と等しくなることにより分かる。ＫＣｌの除去であるにもかかわらず、透析のプロセスはｍＰＥＧ−アミドを精製するのにも役立つ。 In the next step, 1 g of purified mPEG-nitrile is hydrolyzed with 4-5 mL of hydrochloric acid (HCl, 12M, BDH Company) to form mPEG-amide. This acid hydrolysis reaction has been previously disclosed in US Pat. No. 5,672,662 and Polymer Bulletin, 43, 35-41 (1999) by Sedaghat-Herati et al., Among which first mPEG-nitrile. Is dissolved in concentrated HCl with stirring at room temperature for 44 hours, followed by the addition of 3.5 g of potassium hydroxide (KOH, BDH Company) pellets to the stirred mixture under an ice bath. As a result, the pH of the resulting solution is adjusted to 3-4 using HCl (2-6M). In the above reaction, the produced potassium chloride (KCl) is removed by dialysis (1000 cut-off membrane) at room temperature for 3 days with daily water changes. Completion of KCl removal is seen by the conductivity of the dialyzed water being equal to the conductivity of the water used for dialysis. Despite the removal of KCl, the dialysis process also helps to purify mPEG-amide.
ｍＰＥＧ−酸の製造および精製 Production and purification of mPEG-acid
次に精製したｍＰＥＧ−アミドは、撹拌下室温で７２時間、１．７ｇのＫＯＨペレットによりもう１回加水分解を受け、ｍＰＥＧ−酸の対応するカルボン酸塩を形成する。その後、ＨＣｌ（２〜６Ｍ）を氷浴中の混合物に添加し、その結果得られるｐＨを３〜４に戻すように調整する。前述のｍＰＥＧ−アミド合成と類似して、生成する塩化カリウム（ＫＣｌ）塩および塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）塩を除去するために透析プロセスが利用され、このプロセスにおいて、氷冷した混合物を室温にて３日間、毎日水を交換しながら透析する（１０００カットオフ膜）。透析した水の伝導度が透析に用いられる水の伝導度と一致すると、塩の除去は完了する。得られる精製ｍＰＥＧ−酸を次に３日間凍結乾燥し、ｍＰＥＧ−酸の精製固体を得る。 The purified mPEG-amide is then subjected to another hydrolysis with 1.7 g KOH pellets for 72 hours at room temperature under stirring to form the corresponding carboxylate salt of mPEG-acid. HCl (2-6M) is then added to the mixture in the ice bath and the resulting pH is adjusted back to 3-4. Similar to the mPEG-amide synthesis described above, a dialysis process was utilized to remove the resulting potassium chloride (KCl) and ammonium chloride (NH 4 Cl) salts, in which the ice-cooled mixture was brought to room temperature. Dialyze (1000 cut-off membrane) with daily water changes for 3 days. Salt removal is complete when the dialyzed water conductivity matches the conductivity of the water used for dialysis. The resulting purified mPEG-acid is then lyophilized for 3 days to give a purified solid of mPEG-acid.
精製したｍＰＥＧ−酸を１Ｈ−ＮＭＲ分光法により同定し、ＮＭＲスペクトル（図２ａ）は２．４ｐｐｍ（酸性基に隣接するプロトンに相当、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）、３．２４ｐｐｍ（メトキシ基に相当、ＣＨ３Ｏ−）、および３．５１ｐｐｍ（ポリマー骨格に相当）においてピークを示す。さらに置換度はＮＭＲ分光法により約９５％〜１００％と決定される。 The purified mPEG-acid was identified by 1 H-NMR spectroscopy and the NMR spectrum (FIG. 2a) was 2.4 ppm (corresponding to the proton adjacent to the acidic group, —OCH 2 CH 2 COOH), 3.24 ppm (methoxy group). Corresponding to CH 3 O—) and 3.51 ppm (corresponding to the polymer backbone). Further, the degree of substitution is determined to be about 95% to 100% by NMR spectroscopy.
ｍＰＥＧ−ＳＰＡの製造および精製 Production and purification of mPEG-SPA
最終工程において、０．０６ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１ｇの精製ｍＰＥＧ−酸および７ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ、分析試薬級 ９９％以上、Ｔｅｄｉａ）の混合物に添加し、反応混合物を０℃の低温に保つ。０．５ｍＬのＤＣＭ中の０．１ｇの１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、Ａｌｄｒｉｃｈ）をゆっくり添加し、混合物を室温で２４時間アルゴン下で撹拌する。得られる溶液を吸引濾過するとすぐ、濾液を冷却ジエチルエーテルにより沈殿させ、得られる沈殿物を濾過し室温で４８時間真空乾燥する。ｍＰＥＧ−ＳＰＡの最終生成物を、アルミホイル中でおよそ−２０℃で貯蔵する。 In the final step, 0.06 g N-hydroxysuccinimide (NHS, Aldrich) is added to a mixture of 1 g purified mPEG-acid and 7 mL dichloromethane (DCM, analytical reagent grade 99%, Tedia) and the reaction mixture is Keep at a low temperature of 0 ° C. Slowly add 0.1 g of 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, Aldrich) in 0.5 mL of DCM and stir the mixture at room temperature for 24 hours under argon. As soon as the resulting solution is suction filtered, the filtrate is precipitated with cold diethyl ether, the resulting precipitate is filtered and vacuum dried at room temperature for 48 hours. The final product of mPEG-SPA is stored at approximately −20 ° C. in aluminum foil.
本発明の好ましい実施形態はこのように完全に説明される。この説明は特定の実施形態に言及しているが、本発明がこれらの具体的な詳細を変更して実施しうることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は本明細書において明記される実施形態に限定されると解釈すべきではない。 The preferred embodiment of the present invention is thus fully described. While this description refers to particular embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that the present invention may be practiced with these specific details varied. Accordingly, the present invention should not be construed as limited to the embodiments set forth herein.
例えば、ヒドロキシル−ＰＥＧから得られるスルホナートエステルは、第１の置換反応において良好な脱離基として用いられるが、この反応は求核置換であるため、ヒドロキシル官能基をヒドロキシル−ＰＥＧから置換することのできるハロゲン化物などのいずれの脱離基も適用することができる。シアン化カリウムまたはシアン化ナトリウムなどの金属シアン化物はＰＥＧ−ニトリルの製造に関与するが、ＰＥＧ−ニトリルは、α，β−不飽和有機シアン化物を用いてヒドロキシル−ＰＥＧから直接合成することができ、そのためこの合成経路は代替として用いることができる。ＰＥＧ−酸またはＰＥＧ−ニトリルの精製において、酸化アルミニウムを充填したカラムなどの他の精製カラムもまた利用することができる。 For example, sulfonate esters obtained from hydroxyl-PEG are used as good leaving groups in the first substitution reaction, but this reaction is a nucleophilic substitution, so that the hydroxyl functional group can be substituted from hydroxyl-PEG. Any leaving group such as a halide that can be applied is applicable. Metal cyanides such as potassium cyanide or sodium cyanide are involved in the production of PEG-nitriles, but PEG-nitriles can be synthesized directly from hydroxyl-PEG using α, β-unsaturated organic cyanides and thus This synthetic route can be used as an alternative. In the purification of PEG-acid or PEG-nitrile, other purification columns such as columns packed with aluminum oxide can also be utilized.
さらに、ｍＰＥＧ−メシラートまたはｍＰＥＧ−トシラートの精製における溶出剤としてのジクロロメタンの代替として、ベンゼンを使用することができる。また、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）を、ｍＰＥＧ−酸からのｍＰＥＧ−ＳＰＡの製造の最終工程において、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の代替として使用することができる。 In addition, benzene can be used as an alternative to dichloromethane as an eluent in the purification of mPEG-mesylate or mPEG-tosylate. N- (3-dimethylaminopropyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) is also used as an alternative to 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) in the final step of the production of mPEG-SPA from mPEG-acid. Can be used as
Claims (27)
（Ｉ） Ｒ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）ｋ−ＣＯＯＨ
［式中：
ｋは１〜５であり、
Ｒは水素、ヒドロキシル基、メトキシ基、および他のアルコキシ基から成る群より選択され、
ＰＥＧは一般式（ＩＩ）：
（ＩＩ） −Ｃ２Ｈ４Ｏ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−
（式中、ｎは４４ないし４０００の数を意味する）
で示される］
で示される、単離かつ実質的に精製されたＰＥＧ−酸。 Formula (I):
(I) R-PEG- (CH 2) k -COOH
[Where:
k is 1 to 5,
R is selected from the group consisting of hydrogen, hydroxyl group, methoxy group, and other alkoxy groups;
PEG is represented by the general formula (II):
(II) -C 2 H 4 O- (C 2 H 4 O) n -
(Where n means a number from 44 to 4000)
Indicated by]
An isolated and substantially purified PEG-acid represented by
（ＩＩＩ） Ｒ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）ｋ−ＣＮ
［式中：
ｋは１〜５であり、
Ｒは水素、ヒドロキシル基、メトキシ基、および他のアルコキシ基から成る群より選択され、
ＰＥＧは前記一般式（ＩＩ）で表される］
で示される、単離かつ実質的に精製されたＰＥＧ−ニトリル。 Formula (III):
(III) R-PEG- (CH 2) k -CN
[Where:
k is 1 to 5,
R is selected from the group consisting of hydrogen, hydroxyl group, methoxy group, and other alkoxy groups;
PEG is represented by the general formula (II)]
An isolated and substantially purified PEG-nitrile represented by
ｂ）該ＰＥＧ−スルホナートエステルを金属シアン化物と反応させてＰＥＧ−ニトリルを形成させる工程と、
ｃ）該ＰＥＧ−ニトリルを該ＰＥＧ−酸へ加水分解する工程と
を含み、該ＰＥＧ−酸が該式（Ｉ）で表され、該ＰＥＧが該一般式（ＩＩ）で表される、単離かつ実質的に精製されたＰＥＧ−酸の調製方法。 a) reacting hydroxyl-PEG with chlorosulfonate to form a PEG-sulfonate ester;
b) reacting the PEG-sulfonate ester with a metal cyanide to form PEG-nitrile;
c) hydrolyzing the PEG-nitrile to the PEG-acid, wherein the PEG-acid is represented by the formula (I) and the PEG is represented by the general formula (II) And a process for the preparation of substantially purified PEG-acid.
ｄ）該ＰＥＧ−ニトリルを無機酸で加水分解してＰＥＧ−アミドを形成させる工程と、
ｅ）該ＰＥＧ−アミドをアルカリで加水分解し、続いて無機酸で酸性化して該ＰＥＧ−酸を形成させる工程と
をさらに含む、請求項７記載の方法。 The step (c) is d) hydrolyzing the PEG-nitrile with an inorganic acid to form a PEG-amide;
8. The method of claim 7, further comprising: e) hydrolyzing the PEG-amide with an alkali followed by acidification with an inorganic acid to form the PEG-acid.
ｂ）ジメチルスルホキシドに溶解したシアン化カリウムを、該メトキシ−ＰＥＧ−メシラートと共にアルゴンガス下で混合してメトキシ−ＰＥＧ−ニトリルを得、該メトキシ−ＰＥＧ−ニトリルを乾燥シリカゲルを充填した濾過カラムで精製する工程と、
ｃ）該精製されたメトキシ−ＰＥＧ−ニトリルを塩酸と反応させてメトキシ−ＰＥＧ−アミドを得、該メトキシ−ＰＥＧ−アミドを水透析により精製する工程と、
ｄ）該精製されたメトキシ−ＰＥＧ−アミドを水酸化カリウムと反応させ、続いて塩酸により酸性化してメトキシ−ＰＥＧ−酸を得る工程と、
ｅ）該メトキシ−ＰＥＧ−酸を水透析により精製する工程と、
ｆ）該精製されたメトキシ−ＰＥＧ−酸を凍結乾燥してその精製されたメトキシ−ＰＥＧ−酸の固体を得る工程と
を含む、請求項７記載の方法。 a) mixing hydroxyl-methoxy-PEG dissolved in dichloromethane with triethylamine and mesyl chloride in an ice bath under argon gas to obtain methoxy-PEG-mesylate;
b) A step of mixing potassium cyanide dissolved in dimethyl sulfoxide with the methoxy-PEG-mesylate under argon gas to obtain methoxy-PEG-nitrile, and purifying the methoxy-PEG-nitrile on a filtration column packed with dry silica gel. When,
c) reacting the purified methoxy-PEG-nitrile with hydrochloric acid to obtain methoxy-PEG-amide, and purifying the methoxy-PEG-amide by water dialysis;
d) reacting the purified methoxy-PEG-amide with potassium hydroxide followed by acidification with hydrochloric acid to give methoxy-PEG-acid;
e) purifying the methoxy-PEG-acid by water dialysis;
f) lyophilizing the purified methoxy-PEG-acid to obtain the purified methoxy-PEG-acid solid.
ｂ）該ＰＥＧ−スルホナートエステルを金属シアン化物と反応させて該ＰＥＧ−ニトリルを形成させる工程と
を含み、そのＰＥＧ−ニトリルが該式（ＩＩＩ）で表され、該ＰＥＧが該一般式（ＩＩ）で表される、単離かつ実質的に精製されたＰＥＧ−ニトリルの調製方法。 a) reacting hydroxyl-PEG with chlorosulfonate to form a PEG-sulfonate ester;
b) reacting the PEG-sulfonate ester with a metal cyanide to form the PEG-nitrile, wherein the PEG-nitrile is represented by the formula (III) and the PEG is represented by the general formula (II) A process for the preparation of an isolated and substantially purified PEG-nitrile represented by
ｂ）ジメチルスルホキシドに溶解したシアン化カリウムを、該メトキシ−ＰＥＧ−メシラートと共にアルゴンガス下で混合してメトキシ−ＰＥＧ−ニトリルを得る工程と、
ｃ）該メトキシ−ＰＥＧ−ニトリルを、乾燥シリカゲルを充填した濾過カラムで精製する工程と、
ｄ）その精製されたメトキシ−ＰＥＧ−ニトリルを冷却ジエチルエーテル中で沈殿させてその精製されたメトキシ−ＰＥＧ−ニトリルの固体を得る工程と
を含む、請求項１５記載の方法。 a) mixing hydroxyl-methoxy-PEG dissolved in dichloromethane with triethylamine and mesyl chloride in an ice bath under argon gas to obtain methoxy-PEG-mesylate;
b) mixing potassium cyanide dissolved in dimethyl sulfoxide with the methoxy-PEG-mesylate under argon gas to obtain methoxy-PEG-nitrile;
c) purifying the methoxy-PEG-nitrile with a filtration column packed with dry silica gel;
and d) precipitating the purified methoxy-PEG-nitrile in chilled diethyl ether to obtain a solid of the purified methoxy-PEG-nitrile.
ｂ）該ＰＥＧ−スルホナートエステルを金属シアン化物と反応させてＰＥＧ−ニトリルを形成させる工程と、
ｃ）該ＰＥＧ−ニトリルを該ＰＥＧ−酸へ加水分解する工程と、
ｄ）ジクロロメタンの存在下で、該ＰＥＧ−酸をＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドと反応させて、ＰＥＧ−ＳＰＡを形成させる工程と
を含み、該ＰＥＧが該一般式（ＩＩ）で表されるところの、
単離かつ実質的に精製されたＰＥＧスクシンイミジルプロピオン酸エステル（ＰＥＧ−ＳＰＡ）の調製方法。 a) reacting hydroxyl-PEG with chlorosulfonate to form a PEG-sulfonate ester;
b) reacting the PEG-sulfonate ester with a metal cyanide to form PEG-nitrile;
c) hydrolyzing the PEG-nitrile to the PEG-acid;
d) reacting the PEG-acid with N-hydroxysuccinimide and 1,3-dicyclohexylcarbodiimide in the presence of dichloromethane to form PEG-SPA, wherein the PEG is represented by the general formula (II) Where represented,
Process for the preparation of isolated and substantially purified PEG succinimidyl propionate (PEG-SPA).
ｅ）該ＰＥＧ−ニトリルを無機酸で加水分解してＰＥＧ−アミドを形成させる工程と、 ｆ）該ＰＥＧ−アミドをアルカリで加水分解し、続いて無機酸で酸性化して該ＰＥＧ−酸を形成させる工程と
をさらに含む、請求項２１記載の方法。 The step (c)
e) hydrolyzing the PEG-nitrile with an inorganic acid to form PEG-amide; f) hydrolyzing the PEG-amide with alkali followed by acidification with an inorganic acid to form the PEG-acid The method of claim 21, further comprising:
ｂ）ジメチルスルホキシドに溶解したシアン化カリウムを、該メトキシ−ＰＥＧ−メシラートとアルゴンガス下で混合してメトキシ−ＰＥＧ−ニトリルを得る工程と、
ｃ）該メトキシ−ＰＥＧ−ニトリルを、乾燥シリカゲルを充填した濾過カラムで精製する工程と、
ｄ）該精製されたメトキシ−ＰＥＧ−ニトリルを塩酸と反応させて、メトキシ−ＰＥＧ−アミドを得る工程と、
ｅ）該メトキシ−ＰＥＧ−アミドを水透析により精製する工程と、
ｆ）該精製されたメトキシ−ＰＥＧ−アミドを水酸化カリウムと反応させ、続いて塩酸で酸性化してメトキシ−ＰＥＧ−酸を得る工程と、
ｇ）該メトキシ−ＰＥＧ−酸を水透析により精製する工程と、
ｈ）ジクロロメタンの存在下で、該精製されたメトキシ−ＰＥＧ−酸をＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドと混合し、それらの混合物を０℃に維持する工程と、
ｉ）ジクロロメタンの存在下、アルゴンガスの下で、工程（ｈ）で得られる該冷却混合物を１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドと反応させてメトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡを得る工程と、
ｊ）該メトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡを濾過カラムにより精製する工程と、
ｋ）該精製されたメトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡを冷却ジエチルエーテル中で沈殿させてその精製されたメトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡの固体を得る工程と
を含む、請求項２１記載の方法。 a) mixing hydroxyl-methoxy-PEG dissolved in dichloromethane with triethylamine and tosyl chloride in an ice bath under argon gas to obtain methoxy-PEG-mesylate;
b) mixing potassium cyanide dissolved in dimethyl sulfoxide with the methoxy-PEG-mesylate under argon gas to obtain methoxy-PEG-nitrile;
c) purifying the methoxy-PEG-nitrile with a filtration column packed with dry silica gel;
d) reacting the purified methoxy-PEG-nitrile with hydrochloric acid to obtain methoxy-PEG-amide;
e) purifying the methoxy-PEG-amide by water dialysis;
f) reacting the purified methoxy-PEG-amide with potassium hydroxide followed by acidification with hydrochloric acid to give methoxy-PEG-acid;
g) purifying the methoxy-PEG-acid by water dialysis;
h) mixing the purified methoxy-PEG-acid with N-hydroxysuccinimide and 1,3-dicyclohexylcarbodiimide in the presence of dichloromethane and maintaining the mixture at 0 ° C .;
i) reacting the cooled mixture obtained in step (h) with 1,3-dicyclohexylcarbodiimide in the presence of dichloromethane under argon gas to obtain methoxy-PEG-SPA;
j) purifying the methoxy-PEG-SPA through a filtration column;
and k) precipitating the purified methoxy-PEG-SPA in cold diethyl ether to obtain the purified methoxy-PEG-SPA solid.
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