JP2008304369A - Device and method for preparing sample for mass spectrometry - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、質量分析用の試料の調製装置及びその調製方法に関する。 The present invention relates to an apparatus for preparing a sample for mass spectrometry and a method for preparing the same.
近年、種々の分析方法によるタンパク質やヌクレオチドなどの生体分子の解析が進められている。例えば、タンパク質などの同定や構造解析等において、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）などの質量分析は有用な方法の一つである。 In recent years, analysis of biomolecules such as proteins and nucleotides by various analysis methods has been advanced. For example, mass spectrometry such as matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF / MS) is one of useful methods for identification of proteins and structural analysis.
質量分析用の試料を調製するには、例えば、分析対象を含む試料液をマニュアルピペットで数μｌ分取して試料プレート上に塗布したり、あるいは、液体クロマトグラフを用いて試料液中の分析対象を分離精製したのち試料プレート上に塗布したりすることにより行われている。 In order to prepare a sample for mass spectrometry, for example, several μl of a sample solution containing an analysis target is dispensed with a manual pipette and applied on a sample plate, or analysis in a sample solution using a liquid chromatograph This is done by separating and purifying the object and then applying it on a sample plate.
具体的には、例えば、分析対象を親水性溶媒に溶解した試料液を、疎水性領域を有する基板上に点状塗布（ブロッティング）したのちこれを乾燥させることにより試料液を濃縮し、濃縮した試料液をＭＡＬＤＩターゲットプレート上に載せて試料を調製するものがある（特許文献１）。また、ナノ高速液体クロマトグラフを用いて試料液中の分析対象を十分に濃縮することにより、試料プレート上に微少量の試料液をブロッティングして試料を調製するものもある（特許文献２）。 Specifically, for example, a sample solution in which an analysis target is dissolved in a hydrophilic solvent is spot-coated (blotted) on a substrate having a hydrophobic region, and then dried to concentrate and concentrate the sample solution. A sample is prepared by placing a sample solution on a MALDI target plate (Patent Document 1). In addition, there is a sample that prepares a sample by blotting a small amount of sample solution on a sample plate by sufficiently concentrating the analysis target in the sample solution using a nano high performance liquid chromatograph (Patent Document 2).
生体分子の分析を行う場合、分析対象とされる生体分子は、試料液中に微少量しか含まれていないことが多い。そのため、質量分析用の試料を調製するにあたり、質量分析での検出限界を確保するには、試料液中の分析対象をできる限り濃縮して試料プレート上に保持させる必要がある。しかしながら、上述した特許文献１では、試料プレート上での試料液の拡大を抑制して分析対象の濃縮を図っているものの、試料プレート上に供給可能な試料液の量はせいぜい１．５〜２．５μｌ程度である。このため、分析対象が低濃度の試料液に対しては、検出限界以上の分析対象をプレート上にブロッティングすることができなかった。 When analyzing a biomolecule, the biomolecule to be analyzed is often contained in a very small amount in the sample liquid. Therefore, in preparing a sample for mass spectrometry, it is necessary to concentrate the analysis target in the sample solution as much as possible and hold it on the sample plate in order to ensure the detection limit in mass spectrometry. However, in Patent Document 1 described above, although the concentration of the analysis target is attempted by suppressing the expansion of the sample liquid on the sample plate, the amount of the sample liquid that can be supplied onto the sample plate is 1.5-2 at most. About 5 μl. For this reason, for a sample solution having a low concentration of analysis target, the analysis target exceeding the detection limit could not be blotted on the plate.
また、特許文献２のように、ナノ高速液体クロマトグラフを用いることにより試料プレート上への試料液の供給を微少量にすることは可能であるが、装置が非常に高価なため、一般的な手法であるとは言えなかった。 In addition, as in Patent Document 2, it is possible to make the supply of the sample liquid onto the sample plate very small by using a nano high-performance liquid chromatograph, but the apparatus is very expensive, It could not be said to be a method.
そこで、本発明は、分析対象を簡易にかつ十分に濃縮して試料プレート上に塗布できる質量分析用の試料の調製装置及びその調製方法、質量分析装置、質量分析方法並びにタンパク質分析方法を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention provides a sample preparation device for mass spectrometry that can easily and sufficiently concentrate an analysis target and apply it on a sample plate, a method for preparing the same, a mass spectrometry device, a mass spectrometry method, and a protein analysis method. For the purpose.
本発明によれば、1又は２以上の分析対象を含む質量分析用の試料の調製装置であって、前記分析対象を含有する試料液が供給される試料プレートと、前記試料プレート上の所定部位に前記試料液を供給するとき前記所定部位に形成される前記試料液の液滴を維持しながら当該液滴に前記試料液を供給する試料液供給手段と、前記所定部位に形成される前記液滴中の溶媒を蒸発させる蒸発手段と、を備える装置が提供される。 According to the present invention, there is provided an apparatus for preparing a sample for mass spectrometry including one or more analysis objects, a sample plate to which a sample liquid containing the analysis object is supplied, and a predetermined portion on the sample plate A sample liquid supply means for supplying the sample liquid to the liquid droplet while maintaining the liquid droplet of the sample liquid formed at the predetermined area when the sample liquid is supplied to the liquid; and the liquid formed at the predetermined area And an evaporating means for evaporating the solvent in the droplet.
本発明において、前記試料液供給手段は、前記試料プレート上に形成される前記液滴に接触しながら前記試料液を前記液滴に供給する手段としてもよい。また、前記試料液供給手段は、前記液滴に接触させる部位の高さを前記試料液の供給量に応じて調節可能であるものとしてもよい。さらに、前記試料液供給手段は、先端部がテーパ状であるものとしてもよい。 In the present invention, the sample liquid supply means may be means for supplying the sample liquid to the droplets while being in contact with the droplets formed on the sample plate. Further, the sample liquid supply means may be capable of adjusting the height of a portion in contact with the droplet according to the supply amount of the sample liquid. Further, the sample liquid supply means may have a tapered tip.
本発明において、前記液滴に対し非酸化性雰囲気を形成する非酸化性雰囲気形成手段、を備え、前記試料液供給手段は、前記非酸化性雰囲気形成手段により前記液滴を非酸化性雰囲気に曝した状態で前記試料液を前記試料プレート上に供給する手段であってもよい。 In the present invention, a non-oxidizing atmosphere forming means for forming a non-oxidizing atmosphere for the droplets is provided, and the sample liquid supply means converts the droplets into a non-oxidizing atmosphere by the non-oxidizing atmosphere forming means. It may be a means for supplying the sample solution onto the sample plate in an exposed state.
また、本発明において、前記所定部位への前記試料液の供給量が４μｌ以上であるものとしてもよい。また、前記所定部位への前記試料液の供給速度が０．１μｌ／ｍｉｎ以上５μｌ／ｍｉｎ以下であるものとすることもできる。 In the present invention, the supply amount of the sample solution to the predetermined part may be 4 μl or more. Moreover, the supply rate of the sample solution to the predetermined part may be 0.1 μl / min or more and 5 μl / min or less.
さらに、本発明において、前記蒸発手段は、前記試料プレートを加熱することで前記溶媒を蒸発させる手段としてもよい。 Furthermore, in the present invention, the evaporation means may be means for evaporating the solvent by heating the sample plate.
本発明において、前記試料液供給手段の前段に配置され、前記分析対象を含む１又は２以上の画分に分離した溶出液として溶出可能な分離手段、を備え、前記試料液供給手段は、前記溶出液を前記試料プレート上に供給する手段であるものとしてもよい。このとき、前記分離手段は、前記試料中の分析対象を分離可能な固相を有するカラムであり、カラム容量が０．１μｌ以上４μｌ以下であるものとすることもできる。また、前記カラムに連続的又は断続的に組成が変化する移動相を供給可能な移動相供給手段、を備えるものとしてもよい。さらに、前記試料供給手段は、前記カラムから溶出される溶出液を前記試料プレート上の２以上の液体供給部位に供給する手段としてもよい。 In the present invention, the sample liquid supply means includes a separation means that is disposed in the front stage of the sample liquid supply means and can be eluted as an eluate separated into one or two or more fractions including the analysis target. It may be a means for supplying the eluate onto the sample plate. At this time, the separation means is a column having a solid phase capable of separating the analysis target in the sample, and the column volume may be 0.1 μl or more and 4 μl or less. Moreover, it is good also as providing the mobile phase supply means which can supply the mobile phase in which a composition changes to the said column continuously or intermittently. Furthermore, the sample supply means may be means for supplying the eluate eluted from the column to two or more liquid supply sites on the sample plate.
本発明において、前記分析対象は、タンパク質であるものとしてもよい。また、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析用であるものとしてもよい。 In the present invention, the analysis target may be a protein. Further, it may be used for matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry.
また、本発明において、前記試料プレートは、液体不透過性としてもよい。また、前記試料プレートは、セラミックスプレートとしてもよい。 In the present invention, the sample plate may be liquid impermeable. The sample plate may be a ceramic plate.
本発明によれば、上記いずれかに記載の本発明の質量分析用の試料の調製装置を備える質量分析装置が提供される。 According to the present invention, there is provided a mass spectrometer comprising any one of the above-described sample preparation apparatuses for mass spectrometry of the present invention.
また、本発明によれば、1又は２以上の分析対象を含む質量分析用の試料の調製方法であって、前記分析対象を含有する試料液を試料プレートの所定部位に供給するとき、前記所定部位に形成される前記試料液の液滴を維持しながら当該液滴に前記試料液を供給しつつ前記液滴中の溶媒を蒸発させる試料供給工程、を備える、方法が提供される。本発明において、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析用であるものとしてもよい。 In addition, according to the present invention, there is provided a method for preparing a sample for mass spectrometry including one or two or more analysis objects, wherein the sample liquid containing the analysis object is supplied to a predetermined part of a sample plate. There is provided a method comprising: a sample supplying step of evaporating a solvent in the droplet while supplying the sample solution to the droplet while maintaining the droplet of the sample solution formed on a site. In the present invention, matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry may be used.
本発明によれば、上記いずれかに記載の本発明の質量分析用の試料の調製装置により調製した試料を用いて質量分析を行う、質量分析方法が提供される。 According to the present invention, there is provided a mass spectrometry method for performing mass spectrometry using a sample prepared by any of the above-described sample preparation apparatuses for mass spectrometry of the present invention.
また、本発明によれば、上記いずれかに記載の本発明の質量分析用の試料の調製装置により調製した試料を用いてタンパク質の分析を行う、タンパク質分析方法が提供される。 In addition, according to the present invention, there is provided a protein analysis method in which protein analysis is performed using a sample prepared by any of the above-described sample preparation apparatuses for mass spectrometry of the present invention.
本発明によれば、分析対象を含む試料液を試料プレート上に供給するにあたり、試料プレート上に形成される液滴を維持した状態で当該液滴に試料液を供給しながら液滴中の溶媒を蒸発させる。これにより、試料プレートと試料液との接触面積を小さくし且つ試料プレート上で液滴が広がるのを抑制しながら試料液をその場で連続的に濃縮できる。また、試料プレート上に大量の試料液の供給が可能になる。したがって、試料プレート上の試料液の供給部位に分析対象を簡易にかつ十分に濃縮できる。 According to the present invention, when supplying the sample liquid including the analysis target onto the sample plate, the solvent in the droplet is supplied while supplying the sample liquid to the liquid droplet while maintaining the liquid droplet formed on the sample plate. Evaporate. Thereby, the sample liquid can be continuously concentrated on the spot while reducing the contact area between the sample plate and the sample liquid and suppressing the spread of the droplets on the sample plate. In addition, a large amount of sample solution can be supplied onto the sample plate. Therefore, the analysis target can be easily and sufficiently concentrated at the sample liquid supply site on the sample plate.
また、液滴の状態を維持しながらその場で連続的に濃縮するため、試料液の供給部位における複数回の試料液の供給操作及び濃縮操作を回避できる。さらに、連続的に試料液を供給しつつその場で濃縮可能であるため、カラムなどの分離手段から連続的に溶出される溶出液を容易に濃縮できる。 Further, since the liquid is continuously concentrated on the spot while maintaining the state of the liquid droplets, a plurality of sample liquid supply operations and concentration operations at the sample liquid supply site can be avoided. Furthermore, since the sample solution can be concentrated in-situ while being continuously supplied, the eluate continuously eluted from the separation means such as a column can be easily concentrated.
本発明によれば、質量分析用の試料の調製装置及びその調製方法、質量分析装置、質量分析方法並びにタンパク質分析方法が提供される。以下、本発明の実施の形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本発明の調製装置の概略の一例を示す図であり、図２は、試料プレート上に試料液を供給する様子を示す図である。また、図３は、試料液供給手段及び非酸化性雰囲気形成手段の構成の概略を示す図である。なお、図に示される形態は、本発明の好ましい形態の説明のために示すものであり、本発明を限定するものではない。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the sample preparation apparatus for mass spectrometry, its preparation method, a mass spectrometer, a mass spectrometry method, and a protein analysis method are provided. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings as appropriate. FIG. 1 is a diagram showing an example of an outline of the preparation apparatus of the present invention, and FIG. 2 is a diagram showing how a sample solution is supplied onto a sample plate. FIG. 3 is a diagram showing an outline of the configuration of the sample solution supply means and the non-oxidizing atmosphere forming means. In addition, the form shown by the figure is shown for description of the preferable form of this invention, and does not limit this invention.
（調製装置）
本発明の調製装置は、質量分析用の試料を調製するものである。本調製装置により調製された試料を用いる質量分析の手法としては、試料プレート上に塗布された分析対象を分析可能であれば、分析対象をイオン化するためのイオン化法や、イオン化した分析対象の分析方法等の種類は特に限定しない。分析対象がタンパク質などの生体分子である場合、各種手法のうち、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）と飛行時間型（ＴＯＦ）とを組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳが好ましい。
(Preparation equipment)
The preparation apparatus of the present invention prepares a sample for mass spectrometry. As a method of mass spectrometry using the sample prepared by this preparation apparatus, if the analysis target coated on the sample plate can be analyzed, an ionization method for ionizing the analysis target or analysis of the ionized analysis target is performed. The type of method is not particularly limited. When the analysis target is a biomolecule such as a protein, MALDI-TOF / MS in which matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) and time-of-flight (TOF) are combined is preferable among various methods.
本調製装置の一例である図１の調製装置１０は、分析対象を含有する試料液が供給される試料プレート２０と、試料プレート２０上の液体供給部位２２に試料液を供給する試料液供給手段３０と、液体供給部位２２に形成される液滴中の溶媒を蒸発させる蒸発手段４０と、を備えている。 The preparation apparatus 10 of FIG. 1 which is an example of the preparation apparatus includes a sample plate 20 to which a sample liquid containing an analysis target is supplied, and a sample liquid supply means for supplying the sample liquid to a liquid supply site 22 on the sample plate 20. 30 and evaporation means 40 for evaporating the solvent in the droplets formed in the liquid supply region 22.
（試料プレート）
試料プレート２０は、質量分析の手法に応じて各種形態を採ることができる。その形状も特に限定せず、例えば、方形状であってもよいし円形状であってもよい。試料プレート表面には、試料液が供給される領域としての液体供給部位２２が明示されていることが好ましい。試料プレート２０上に複数の液体供給部位２２を備える場合、これらの液体供給部位２２は、それぞれ固有の位置情報が付与された状態で一定形態を保持して配置されていることが好ましい。本形態における試料プレート２０は、円形の凹状のスリットで区画された複数の液体供給部位２２を有し、この液体供給部位２２がマトリックス状に配置されている。また、各液体供給部位２２には、それぞれ固有の位置情報として番号が付与されており、試料プレート２０上における位置が特定されている。
(Sample plate)
The sample plate 20 can take various forms according to the mass spectrometry technique. The shape is not particularly limited, and may be, for example, a square shape or a circular shape. It is preferable that a liquid supply portion 22 as a region to which the sample liquid is supplied is clearly shown on the surface of the sample plate. In the case where a plurality of liquid supply parts 22 are provided on the sample plate 20, it is preferable that these liquid supply parts 22 are arranged so as to maintain a certain form in a state where unique position information is given. The sample plate 20 in this embodiment has a plurality of liquid supply portions 22 partitioned by circular concave slits, and the liquid supply portions 22 are arranged in a matrix. Each liquid supply region 22 is assigned a number as unique position information, and the position on the sample plate 20 is specified.
試料プレート２０は、液体不透過性であることが好ましい。液体不透過性であることにより、試料プレート２０上に供給された試料液が試料プレート内部に浸透しないため、試料プレート２０上の試料液に液滴の形状を維持させることが容易になる。なお、試料プレート２０全体が液体不透過性材料で構成されていてもよいし、試料プレート２０の表層のみが液体不透過性材料で構成されていてもよい。 The sample plate 20 is preferably liquid impermeable. The liquid impermeability prevents the sample liquid supplied on the sample plate 20 from penetrating into the sample plate, so that it is easy to maintain the droplet shape in the sample liquid on the sample plate 20. Note that the entire sample plate 20 may be made of a liquid impermeable material, or only the surface layer of the sample plate 20 may be made of a liquid impermeable material.
質量分析としてＭＡＬＤＩを適用する場合、試料プレート２０は、質量分析において再現性が得られる程度の導電性を有する材料により構成されていることが好ましい。このような材料としては、例えば、金、ステンレス鋼などの金属性材料や、ポリアセチレンやジアセチレン重合体などの導電性プラスチック材料、炭化ケイ素、グラファイトなどの導電性セラミックス材料などが挙げられる。なお、試料プレート２０全体が導電性材料で構成されていてもよいが、試料プレート２０の表層のみが導電性材料で構成されていてもよい。 When applying MALDI as mass spectrometry, it is preferable that the sample plate 20 is comprised with the material which has the electroconductivity of the grade which can obtain reproducibility in mass spectrometry. Examples of such materials include metallic materials such as gold and stainless steel, conductive plastic materials such as polyacetylene and diacetylene polymers, and conductive ceramic materials such as silicon carbide and graphite. The entire sample plate 20 may be made of a conductive material, but only the surface layer of the sample plate 20 may be made of a conductive material.
このような導電性材料のうち、導電性セラミックス材料で構成されていることが好ましい。セラミックス材料を用いることにより、質量分析の際の分析対象の分解能が向上する。また、試料プレート２０上に供給された試料液中の溶媒を適度に蒸発させることができる。より好ましくは、グラファイトであり、さらに好ましくは、ガラス状炭素又は熱分解炭素による表面処理層を有するグラファイトである。こうしたグラファイトによれば、グラファイトの離脱が抑制されるとともに、導電性や繰り返し使用性に優れている。このようなガラス状炭素による表面処理層を有するグラファイトとしては、例えば、ＶＧＩ（イビデン株式会社の黒鉛製品）として入手することができ、熱分解炭素による表面処理層を有するグラファイトとしては、パイロカーブ（イビデン株式会社の黒鉛製品）として入手することができる。 Among such conductive materials, it is preferable that the conductive material is composed of a conductive ceramic material. By using a ceramic material, the resolution of the analysis target in mass spectrometry is improved. In addition, the solvent in the sample solution supplied onto the sample plate 20 can be appropriately evaporated. More preferred is graphite, and still more preferred is graphite having a surface treatment layer of glassy carbon or pyrolytic carbon. According to such graphite, the detachment of graphite is suppressed, and the conductivity and reusability are excellent. Such graphite having a surface-treated layer made of glassy carbon can be obtained, for example, as VGI (graphite product of Ibiden Co., Ltd.), and graphite having a surface-treated layer made of pyrolytic carbon can be obtained from pyrocurve (Ibiden). It can be obtained as graphite products).
（分析対象）
本発明における分析対象としては、特に限定しないで種々の生体分子や有機化合物などを用いることができる。特に、タンパク質、核酸、糖類、脂質などの生体分子は、試料液中に微少量しか含まれていないことが多く濃縮の必要性が高いため、本調製装置による試料の調製が好ましい。本発明の分析対象となる生体分子は特に限定せず、動物、植物、微生物、ウイルス等の各種の生物体由来の天然分子であってもよいし、これらを人工的に改変した分子であってもよい。また、生物体から採取した分子のみならず、本来その分子の存在する生物体以外の生物において人工的に生産させた分子であってもよいし、生物体外で人工的に化学合成又は酵素等によって合成した分子であってもよい。
(Analysis target)
The analysis target in the present invention is not particularly limited, and various biomolecules and organic compounds can be used. In particular, biomolecules such as proteins, nucleic acids, saccharides, lipids and the like are often contained in a sample solution in a very small amount, and the necessity for concentration is high. Therefore, sample preparation using this preparation apparatus is preferable. The biomolecules to be analyzed in the present invention are not particularly limited, and may be natural molecules derived from various organisms such as animals, plants, microorganisms, viruses, and the like, and these are artificially modified molecules. Also good. Moreover, it may be a molecule artificially produced in an organism other than the organism in which the molecule originally exists, or may be artificially synthesized outside the organism by chemical synthesis or enzyme, etc. It may be a synthesized molecule.
生体分子のうち、本調製装置による試料の調製に用いる生体分子はタンパク質であることが好ましい。ここでいうタンパク質とは、任意のサイズ、構造又は機能を有するタンパク質、ポリペプチド及びオリゴペプチドを含む。タンパク質としては、例えば、各種タンパク質、酵素、抗原、抗体、レクチン又は細胞膜レセプターなどが挙げられる。 Of the biomolecules, the biomolecule used for sample preparation by the preparation apparatus is preferably a protein. As used herein, proteins include proteins, polypeptides, and oligopeptides having any size, structure, or function. Examples of the protein include various proteins, enzymes, antigens, antibodies, lectins, and cell membrane receptors.
分析対象は、各種溶媒に溶解された試料液として本調製装置による試料の調製に用いられる。分析対象の溶解に用いる溶媒は特に限定せず、分析対象等に応じて適宜選択できる。 The analysis target is used for sample preparation by the present preparation device as a sample solution dissolved in various solvents. The solvent used for dissolving the analysis target is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the analysis target.
（試料液供給手段）
試料液供給手段３０は、分析対象が溶媒に溶解された試料液を試料プレート２０上の所定部位（液体供給部位２２）に供給するものである。本形態の試料液供給手段３０は、図２に示すように、内部に流路が形成された本体部３２と、本体部３２に設けられ試料液を排出する排液口３４と、を備える。
(Sample solution supply means)
The sample solution supply means 30 supplies a sample solution in which an analysis target is dissolved in a solvent to a predetermined portion (liquid supply portion 22) on the sample plate 20. As shown in FIG. 2, the sample solution supply means 30 of this embodiment includes a main body portion 32 having a flow path formed therein, and a drain port 34 provided in the main body portion 32 for discharging the sample solution.
試料液供給手段３０は、試料プレート２０上の液体供給部位２２に形成された液滴９０の状態を維持したまま当該液滴９０に試料液を供給可能であることが好ましい。こうすることで、試料プレート上での試料液の拡大を抑制することができ、試料液と試料プレート２０との接触面積（スポット面積）をできる限り小さくすることができる。そのための形態は特に限定しない。例えば、本体部３２は、その外形を円筒状、テーパ状等とすることができる。好ましくは、本体部３２の先端部のうち試料プレート２０に対向する位置に排液口３４を設け、この排液口３４に向かって本体部３２の先端部が先細りした外形を有するものである。また、本体部３２内部の流路の形状等についても特に限定せず、例えば、流路の上流側と下流側とを同じ内径にしてもよいし異なる内径にしてもよい。好ましくは、排液口３４に向かって流路が先細りした形状を有するものである。 The sample liquid supply means 30 is preferably capable of supplying the sample liquid to the liquid droplet 90 while maintaining the state of the liquid droplet 90 formed at the liquid supply portion 22 on the sample plate 20. By doing so, the expansion of the sample liquid on the sample plate can be suppressed, and the contact area (spot area) between the sample liquid and the sample plate 20 can be made as small as possible. The form for that is not specifically limited. For example, the main body 32 can have a cylindrical shape, a tapered shape, or the like. Preferably, a drainage port 34 is provided at a position facing the sample plate 20 in the front end portion of the main body portion 32, and the front end portion of the main body portion 32 tapers toward the drainage port 34. Further, the shape of the flow path inside the main body 32 is not particularly limited, and for example, the upstream side and the downstream side of the flow path may have the same inner diameter or different inner diameters. Preferably, the flow path has a tapered shape toward the drain port 34.
試料液供給手段３０の長さや外径、内径の大きさは特に限定しない。好ましくは、排液口３２の外径が５０μｍ以下であり、より好ましくは、３０μｍ以下である。また、排液口３４の内径は、２０μｍ以下であるのが好ましく、１０μｍ以下であるのがより好ましい。こうすることで、試料液供給手段３０の先端部に形成される液滴をできるだけ小さくして試料液と試料プレート２０との接触面積を小さくすることができる。このような材料としては、例えば、ＰｉｃｏＴｉｐ（Ｎｅｗ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社）として入手できる。なお、試料液供給手段３０のうち、排液口３２以外の部位の外径や内径の大きさは特に限定しない。
The length, outer diameter, and inner diameter of the sample liquid supply means 30 are not particularly limited. Preferably, the outer diameter of the drain port 32 is 50 μm or less, and more preferably 30 μm or less. In addition, the inner diameter of the drain port 34 is preferably 20 μm or less, and more preferably 10 μm or less. By doing so, the droplet formed at the tip of the sample solution supply means 30 can be made as small as possible to reduce the contact area between the sample solution and the sample plate 20. As such a material, for example, PicoTip (New)
It can be obtained as Objective). It should be noted that the outer diameter and the inner diameter of the part other than the drainage port 32 in the sample liquid supply means 30 are not particularly limited.
試料プレート２０上の液滴に対して試料液を供給するとき、図２に示すように、試料液供給手段３０を液滴に接触した状態で行うことが好ましい。こうすることで、試料プレート２０上の液滴に対して試料液を、液滴の状態を維持したまま確実に供給できる。好ましくは、試料液供給手段３０の先端部に排液口３４を設け、排液口３４を液滴に接触させて試料液を供給する。このとき、予め試料プレート２０上に形成した液滴に試料液を供給してもよいが、好ましくは、試料液供給手段３０の排液口３４から試料液を試料プレート２０上に供給して液滴を形成し、この液滴に連続して試料液を供給する。こうすることで、試料液供給手段３０の先端部を液滴に接触させた状態を容易にかつ正確に形成することができる。 When the sample liquid is supplied to the droplets on the sample plate 20, it is preferable that the sample liquid supply means 30 is in contact with the droplets as shown in FIG. By doing so, the sample liquid can be reliably supplied to the droplets on the sample plate 20 while maintaining the state of the droplets. Preferably, a drain port 34 is provided at the tip of the sample liquid supply means 30, and the sample liquid is supplied by bringing the drain port 34 into contact with the droplets. At this time, the sample liquid may be supplied to the droplets previously formed on the sample plate 20, but preferably the sample liquid is supplied onto the sample plate 20 from the drain port 34 of the sample liquid supply means 30. A droplet is formed, and a sample liquid is continuously supplied to the droplet. By doing so, it is possible to easily and accurately form a state in which the tip of the sample liquid supply means 30 is in contact with the droplet.
試料プレート２０に対する試料液供給手段３０の位置は特に限定しないが、試料プレート２０表面から排液口３４までの高さが、排液口３４で形成される液滴の直径未満の距離（例えば、数百マイクロメートル）になるよう設定することが好ましい。これにより、排液口３４で形成される液滴を試料プレート２０表面に確実に接触させることができる。より好ましくは、試料プレート２０表面から排液口３４までの高さを液滴の半径程度の距離に設定する。また、試料液供給手段３０は、試料プレート２０上の１の液体供給部位２２に試料液を供給する間、試料プレート２０表面に対して一定の高さに保持されることが好ましい。 The position of the sample liquid supply means 30 with respect to the sample plate 20 is not particularly limited, but the distance from the surface of the sample plate 20 to the drain port 34 is less than the diameter of the droplet formed at the drain port 34 (for example, It is preferable to set it to be several hundred micrometers. Thereby, the droplet formed at the drain port 34 can be brought into contact with the surface of the sample plate 20 with certainty. More preferably, the height from the surface of the sample plate 20 to the drain port 34 is set to a distance that is about the radius of the droplet. The sample liquid supply means 30 is preferably held at a certain height with respect to the surface of the sample plate 20 while supplying the sample liquid to one liquid supply portion 22 on the sample plate 20.
先端部を液滴に接触させながら試料液を供給する場合、試料液供給手段３０は、液滴に接触させる部位の高さを試料液の供給量に応じて調節可能に構成されているものが好ましい。こうすることで、液滴の隆起の状態に応じた高さから試料液の供給が可能になるため、液滴の広がりを効果的に抑制できる。具体的には、例えば、液滴に接触する部位の高さは、試料液の供給量が多いほど試料プレート２０表面から離間させる傾向になるように調節してもよい。また、試料プレート２０上において液滴の形成と試料液の供給とを連続して行い試料液を蒸発させる一連の過程において、排液口３４を含む先端部の高さを調節可能としてもよい。 When supplying the sample liquid while bringing the tip portion into contact with the liquid droplet, the sample liquid supply means 30 is configured to be able to adjust the height of the part in contact with the liquid droplet according to the supply amount of the sample liquid. preferable. By doing so, it becomes possible to supply the sample liquid from a height corresponding to the state of the bulge of the liquid droplet, so that the expansion of the liquid droplet can be effectively suppressed. Specifically, for example, the height of the part in contact with the droplet may be adjusted so that the higher the supply amount of the sample liquid, the more the sample liquid 20 tends to be separated from the surface of the sample plate 20. Further, the height of the tip including the drain port 34 may be adjustable in a series of processes in which droplet formation and sample liquid supply are continuously performed on the sample plate 20 to evaporate the sample liquid.
高さを調節可能にするための形態は特に限定せず、例えば、試料液供給手段３０の先端部を試料プレート２０表面に対して垂直方向に移動可能に構成してもよい。本形態では、図１に示すように、試料プレート２０の側部近傍に立設し、試料液供給手段３０を保持可能な保持手段５０を備える。保持手段５０には、試料プレート２０表面に平行に延びるアーム５２が試料プレート２０表面からの高さを調節可能に取り付けられている。したがって、試料液供給手段３０をアーム５２に取り付けることにより、試料液供給手段３０の先端部の高さを上下方向にスライド調節できる。 The form for adjusting the height is not particularly limited, and for example, the tip of the sample liquid supply means 30 may be configured to be movable in the direction perpendicular to the surface of the sample plate 20. In the present embodiment, as shown in FIG. 1, a holding unit 50 is provided which is erected in the vicinity of the side portion of the sample plate 20 and can hold the sample liquid supply unit 30. An arm 52 extending parallel to the surface of the sample plate 20 is attached to the holding means 50 so that the height from the surface of the sample plate 20 can be adjusted. Therefore, by attaching the sample solution supply means 30 to the arm 52, the height of the tip of the sample solution supply means 30 can be adjusted by sliding in the vertical direction.
試料液供給手段３０から試料プレート２０上の液滴６０に試料液を供給するとき、プレート２０上の１の液体供給部位２２表面に液滴を維持する限り、試料液を断続的に供給してもよいし連続的に供給してもよいが、連続的に供給することが好ましい。連続的に供給する場合、その供給速度は特に限定しないが、試料液の供給量と液滴中の溶媒の蒸発量とが同等か又は蒸発量の方が多くなるように設定することが好ましい。これにより、液滴への試料液の供給時にプレート２０上の液滴が拡大してスポット面積が大きくなることを抑制できる。具体的には、試料液の供給速度が０．１μｌ／ｍｉｎ以上５．０μｌ／ｍｉｎ以下であることが好ましい。０．１μｌ／ｍｉｎ未満だと、試料液の供給に多くの時間を要し、試料プレート２０上に載置した分析対象が大気中の酸素によって酸化されてしまうおそれがある。また、５．０μｌ／ｍｉｎを超えると、試料プレート２０上に液滴の状態を維持させにくくなる。より好ましくは、０．５μｌ／ｍｉｎ以上２．０μｌ／ｍｉｎ以下である。 When the sample liquid is supplied from the sample liquid supply means 30 to the droplet 60 on the sample plate 20, the sample liquid is intermittently supplied as long as the droplet is maintained on the surface of one liquid supply portion 22 on the plate 20. However, it is preferable to supply continuously. In the case of continuous supply, the supply speed is not particularly limited, but it is preferable to set the supply amount of the sample liquid and the evaporation amount of the solvent in the droplets to be equal to each other or to increase the evaporation amount. Thereby, it is possible to suppress an increase in the spot area due to the expansion of the droplet on the plate 20 when the sample liquid is supplied to the droplet. Specifically, the supply rate of the sample solution is preferably 0.1 μl / min or more and 5.0 μl / min or less. If it is less than 0.1 μl / min, it takes a long time to supply the sample solution, and the analysis target placed on the sample plate 20 may be oxidized by oxygen in the atmosphere. On the other hand, if it exceeds 5.0 μl / min, it is difficult to maintain the droplet state on the sample plate 20. More preferably, it is 0.5 μl / min or more and 2.0 μl / min or less.
試料液供給手段３０を構成する材質は特に限定しない。例えば、ステンレスやヒューズドシリカ、ガラス、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）などを用いることができる。このうち、ヒューズドシリカが好ましい。 The material constituting the sample solution supply means 30 is not particularly limited. For example, stainless steel, fused silica, glass, polyether ether ketone (PEEK), or the like can be used. Of these, fused silica is preferred.
なお、試料プレート上に試料液を供給する際は、カメラ等で試料プレート上への供給状態をモニタすることにより液滴の状態を確認しながら行ってもよい。 In addition, when supplying a sample liquid on a sample plate, you may carry out, confirming the state of a droplet by monitoring the supply state on a sample plate with a camera etc. FIG.
（非酸化性雰囲気形成手段）
試料液供給手段３０によって試料プレート２０上に試料液を供給するとき、試料プレート２０上の液滴を非酸化性雰囲気に曝した状態で行ってもよい。こうすることで、液滴中の分析対象が大気中の酸素によって酸化されるのを防ぐことができる。液滴を非酸化性雰囲気下におくには、例えば、ヘリウムガスやアルゴンガスなどの不活性ガス、窒素ガスや炭酸ガスなどの酸素分圧が低いガスなどを用いることができる。好ましくは、ヘリウムガスである。
(Non-oxidizing atmosphere forming means)
When the sample solution is supplied onto the sample plate 20 by the sample solution supply means 30, the droplets on the sample plate 20 may be exposed in a non-oxidizing atmosphere. By doing so, it is possible to prevent the analysis target in the droplet from being oxidized by oxygen in the atmosphere. In order to place the droplets in a non-oxidizing atmosphere, for example, an inert gas such as helium gas or argon gas, or a gas having a low oxygen partial pressure such as nitrogen gas or carbon dioxide gas can be used. Preferably, helium gas is used.
非酸化性雰囲気形成手段９５の形態は特に限定しない。例えば、試料プレート２０のうち少なくとも液体供給部位２２を覆うキャビティを設け当該キャビティを非酸化性雰囲気にしてもよい。あるいは、キャビティを設けずに液滴に対して外部から非酸化性ガスを送気するものであってもよい。好ましくは、キャビティを設けずに非酸化性ガスを送気する。こうすれば、キャビティを形成するケーシング等によって液滴が遮蔽されることがないため、液滴を視認可能な状態を確実に維持したまま液滴周辺に非酸化性雰囲気を形成できる。 The form of the non-oxidizing atmosphere forming means 95 is not particularly limited. For example, a cavity that covers at least the liquid supply site 22 in the sample plate 20 may be provided, and the cavity may be in a non-oxidizing atmosphere. Alternatively, a non-oxidizing gas may be supplied from the outside to the droplet without providing a cavity. Preferably, a non-oxidizing gas is supplied without providing a cavity. By doing so, since the droplets are not shielded by the casing or the like forming the cavity, it is possible to form a non-oxidizing atmosphere around the droplets while maintaining the state where the droplets can be visually recognized.
液滴に非酸化性ガスを送気するための形態は特に限定しない。例えば、ノズル状体を介して図示しないガス供給源から非酸化性ガスを送気してもよい。ノズルを用いて送気する場合、送気方向や通気孔の位置などは特に限定しない。例えば、試料プレート２０に試料液を供給する方向とは別の方向から送気してもよいが、試料プレート２０への試料液の供給方向とほぼ同じ方向から送気することが好ましい。 The form for supplying the non-oxidizing gas to the droplet is not particularly limited. For example, non-oxidizing gas may be supplied from a gas supply source (not shown) through a nozzle-like body. When air is supplied using a nozzle, the direction of air supply and the position of the vent holes are not particularly limited. For example, air may be supplied from a direction different from the direction in which the sample liquid is supplied to the sample plate 20, but it is preferable to supply air from substantially the same direction as the direction in which the sample liquid is supplied to the sample plate 20.
試料液の供給方向とほぼ同じ方向から送気する場合、ノズルは、試料液供給手段３０の本体部３２に平行に配置してもよいが、本体部３２に対して同軸上に配置することが好ましい。例えば、図３の非酸化性雰囲気形成手段９５は、非酸化性ガスを供給する図示しないガス供給源と、ガス供給源からのガスを内部に導入可能なガス導入部を有する筒状のノズル本体９６と、ノズル本体９６の内部に形成され試料液供給手段３０の本体部３２の外径よりも大きな内径を有する通気孔９７と、を備える。すなわち、ノズル本体９６は、その内部（通気孔９７）に試料液供給手段３０を挿入可能になっており、試料液供給手段３０の挿入時には、試料液供給手段３０の外縁とノズル本体９６の内面との間に生じる空間を介して、ガス供給源からの非酸化性ガスを液滴に送気可能になっている。こうすることで、非酸化性ガスは、試料液供給手段３０の排液口３４の外縁全体から排出されるため、液滴に対してガスを確実にかつ万遍なく供給することができる。 When air is supplied from substantially the same direction as the sample liquid supply direction, the nozzle may be arranged in parallel to the main body portion 32 of the sample liquid supply means 30, but may be arranged coaxially with respect to the main body portion 32. preferable. For example, the non-oxidizing atmosphere forming means 95 in FIG. 3 includes a cylindrical nozzle body having a gas supply source (not shown) that supplies a non-oxidizing gas and a gas introduction part that can introduce gas from the gas supply source into the inside. 96 and a vent hole 97 formed inside the nozzle main body 96 and having an inner diameter larger than the outer diameter of the main body portion 32 of the sample liquid supply means 30. That is, the sample body 96 can be inserted into the nozzle body 96 (the vent hole 97). When the sample solution supply means 30 is inserted, the outer edge of the sample solution supply means 30 and the inner surface of the nozzle body 96 are inserted. The non-oxidizing gas from the gas supply source can be supplied to the droplets through the space formed between the two. By doing so, since the non-oxidizing gas is discharged from the entire outer edge of the drain port 34 of the sample liquid supply means 30, the gas can be reliably and uniformly supplied to the droplets.
ノズル本体９６と試料液供給手段３０の本体部３２とが同軸上に配置されている場合、排液口３４は、通気孔９７から突出していることが好ましい。こうすれば、試料液供給手段３０から排出される液滴がノズル本体９６に接触するのを防止することができ、これにより、液滴が拡大することを抑止できる。 When the nozzle main body 96 and the main body portion 32 of the sample liquid supply means 30 are arranged coaxially, it is preferable that the liquid discharge port 34 protrudes from the vent hole 97. In this way, it is possible to prevent the liquid droplets discharged from the sample liquid supply means 30 from coming into contact with the nozzle main body 96, thereby suppressing the expansion of the liquid droplets.
（蒸発手段）
蒸発手段４０は、試料液供給手段３０から試料プレート２０上に供給している試料液によって試料プレート２０上に形成されつつある液滴中の溶媒を積極的に蒸発させることにより、分析対象をその場で濃縮するものである。すなわち、試料液供給手段３０による液滴への試料液の供給動作に並行して当該液滴中の溶媒を蒸発させるものである。蒸発手段４０の形態は特に限定せず、溶媒の蒸発方法に応じて適宜設定することができる。蒸発方法としては、例えば、減圧や加熱、送風、又はこれらの組み合わせなど種々の方法を採用することができる。好ましくは、加熱による蒸発である。加熱によれば、試料プレート上に形成される液滴の形状を崩壊させることなく液滴中の溶媒を容易に蒸発できる。
(Evaporation means)
The evaporation means 40 positively evaporates the solvent in the droplets being formed on the sample plate 20 by the sample liquid supplied from the sample liquid supply means 30 onto the sample plate 20, so that It concentrates on the spot. That is, the solvent in the droplets is evaporated in parallel with the operation of supplying the sample solution to the droplets by the sample solution supply means 30. The form of the evaporating means 40 is not particularly limited, and can be appropriately set according to the method for evaporating the solvent. As the evaporation method, for example, various methods such as reduced pressure, heating, air blowing, or a combination thereof can be adopted. Preferably, it is evaporation by heating. By heating, the solvent in the droplet can be easily evaporated without collapsing the shape of the droplet formed on the sample plate.
加熱による蒸発の場合、蒸発手段４０は、試料プレート２０上の液滴中の溶媒を直接的又は間接的に加熱する加熱部４２を備えるものとしてもよい。加熱部４２の形態は特に限定せず、例えば、試料プレート２０の少なくとも表面を高温環境下に曝す形態であってもよいし、試料プレート２０を加熱する形態であってもよい。好ましくは、試料プレート２０を加熱するものである。こうすることで、液滴中の溶媒のうち試料プレート２０に接触する部位での蒸発を促進することができ、試料プレート上での液滴の広がりを効果的に抑制できる。また、試料液の供給量と蒸発量との調節も容易である。 In the case of evaporation by heating, the evaporation means 40 may include a heating unit 42 that directly or indirectly heats the solvent in the droplets on the sample plate 20. The form of the heating unit 42 is not particularly limited. For example, at least the surface of the sample plate 20 may be exposed to a high temperature environment, or the sample plate 20 may be heated. Preferably, the sample plate 20 is heated. By doing so, evaporation at a portion of the solvent in the droplet that contacts the sample plate 20 can be promoted, and the spread of the droplet on the sample plate can be effectively suppressed. In addition, it is easy to adjust the amount of sample solution supplied and the amount of evaporation.
試料プレート２０を加熱するための形態は特に限定せず、当業者が通常用いる手段を適宜採用することができる。例えば、図１に示すように、加熱部４２がヒーティングプレートにより構成されるものとしてもよい。図１の形態では、試料プレート２０をヒーティングプレート上に載置し、試料プレート２０を底面から加熱しながら試料液の供給を行う。 The form for heating the sample plate 20 is not particularly limited, and means normally used by those skilled in the art can be appropriately employed. For example, as shown in FIG. 1, the heating unit 42 may be configured by a heating plate. In the form of FIG. 1, the sample plate 20 is placed on the heating plate, and the sample liquid is supplied while heating the sample plate 20 from the bottom surface.
蒸発手段４０は、試料液供給手段３０によって供給される試料液が、試料プレート２０上で一定期間液滴形状を維持できる程度に試料液中の溶媒を蒸発させる手段であることが好ましい。換言すれば、試料プレート２０上で試料液中の溶媒を瞬時に蒸発させない程度に蒸発させる手段であることが好ましい。試料プレート２０上に供給される試料液に液滴を形成させることなく蒸発させると、分析対象が瞬時に膜化して試料プレート２０から剥離してしまうからである。試料プレート２０上で液滴形状を維持するように、試料液を供給しつつその液滴中の溶媒を蒸発させることで、試料プレート２０上の一定領域に確実に一度に供給すべき試料液中の分析対象を担持させることができる。 The evaporation means 40 is preferably means for evaporating the solvent in the sample liquid to such an extent that the sample liquid supplied by the sample liquid supply means 30 can maintain the droplet shape on the sample plate 20 for a certain period of time. In other words, a means for evaporating the solvent in the sample solution on the sample plate 20 to an extent that does not evaporate instantaneously is preferable. This is because if the sample liquid supplied on the sample plate 20 is evaporated without forming droplets, the analysis target instantly becomes a film and is peeled off from the sample plate 20. By evaporating the solvent in the droplet while supplying the sample liquid so as to maintain the droplet shape on the sample plate 20, the sample liquid is surely supplied to a certain region on the sample plate 20 at one time. Can be supported.
試料プレート２０の加熱により液滴中の溶媒を当該液滴形状を維持できる程度に蒸発させる場合、試料プレート２０表面の温度は、試料液の供給速度、溶媒や分析対象の種類などに応じて適宜設定できる。例えば、溶媒としてアセトニトリル水溶液を用いた場合、試料プレートの表面温度を６５℃以上７５℃以下としてもよい。 When the solvent in the droplets is evaporated to the extent that the shape of the droplets can be maintained by heating the sample plate 20, the temperature of the surface of the sample plate 20 is appropriately determined according to the supply speed of the sample solution, the type of the solvent and the analysis target, etc. Can be set. For example, when an acetonitrile aqueous solution is used as the solvent, the surface temperature of the sample plate may be 65 ° C. or higher and 75 ° C. or lower.
本調製装置１０では、蒸発手段４０により試料プレート２０上の液滴中の溶媒を蒸発させながら当該液滴に試料液を供給する。このため、１の液体供給部位２２に対して大量の試料液を供給できる。試料液の供給量は特に限定しないが、１の液体供給部位２２に対して４μｌ以上であることが好ましい。４μｌ以上であれば、試料液中の分析対象が微少量であっても、質量分析での検出限界を確保するのに十分な量の分析対象をプレート上に保持させることができる。より好ましくは、５μｌ以上である。 In the preparation apparatus 10, the sample liquid is supplied to the droplets while the evaporation unit 40 evaporates the solvent in the droplets on the sample plate 20. For this reason, a large amount of sample liquid can be supplied to one liquid supply portion 22. A supply amount of the sample liquid is not particularly limited, but is preferably 4 μl or more with respect to one liquid supply portion 22. If the amount is 4 μl or more, even if the amount of the analysis target in the sample solution is very small, a sufficient amount of the target for analysis can be held on the plate to ensure the detection limit in mass spectrometry. More preferably, it is 5 μl or more.
本調製装置１０では、試料プレート２０への試料液の供給と試料プレート２０上の液滴中の溶媒の蒸発とを並行して行うため、分析対象をその場で連続的に濃縮できる。したがって、液体供給部位２２における複数回の試料液の供給操作及び濃縮操作を回避できる。また、試料プレート２０上で液滴の状態を維持し続けることによって試料液を１スポットに集約して供給可能なため、試料プレート２０と試料液との接触面積を最小限にすることができる。また、液滴中の溶媒の蒸発に伴い分析対象を均一の濃度で試料プレート２０上に保持できる。特に、ＭＡＬＤＩでは、分析対象のイオン化に用いるレーザ光は、その照射径がプレート上の液体供給部位２２の広がりに対して非常に小さい。本調製装置１０によれば、分析対象が試料プレート２０上に均一に保持されることから、１の液体供給部位２２のいずれかにレーザ光を照射すれば、分析対象を確実にイオン化できる。 In the present preparation apparatus 10, the supply of the sample solution to the sample plate 20 and the evaporation of the solvent in the droplets on the sample plate 20 are performed in parallel, so that the analysis target can be continuously concentrated on the spot. Therefore, a plurality of sample liquid supply operations and concentration operations in the liquid supply region 22 can be avoided. In addition, since the sample liquid can be collected and supplied in one spot by continuing to maintain the droplet state on the sample plate 20, the contact area between the sample plate 20 and the sample liquid can be minimized. Further, the analysis target can be held on the sample plate 20 at a uniform concentration as the solvent in the droplets evaporates. In particular, in MALDI, the laser beam used for ionization of the analysis target has a very small irradiation diameter relative to the spread of the liquid supply site 22 on the plate. According to the present preparation apparatus 10, the analysis target is uniformly held on the sample plate 20, so that the analysis target can be reliably ionized by irradiating one of the liquid supply portions 22 with laser light.
（分離手段）
本調製装置１０は、試料液供給手段の前段に配置され、分析対象を含む１又は２以上の画分に分離した溶出液として溶出可能な分離手段６０を備えるものとしてもよい。分離手段６０を備えることにより、試料液中の分析対象の精製及び濃縮が可能になるため、試料プレート２０上への供給液量を低減できる。また、分析対象を高純度に濃縮できる。分離手段６０としては特に限定しないが、例えば、等速電気泳動、キャピラリー電気泳動などの電気泳動や、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー等が挙げられる。このうち、分析対象の特性に合致した分離モードを選択可能な点や、装置が簡易な点などにおいて液体クロマトグラフィーによる分離が好ましく、試料中の分析対象を分離可能な固相を有するカラムによる分離がより好ましい。本調製装置１０においては、試料液供給手段３０から試料プレート２０上に連続的に試料液を供給しつつその場で濃縮可能なため、カラムから連続的に溶出される溶出液を容易に濃縮できる。
(Separation means)
The present preparation apparatus 10 may be provided with a separating means 60 that is arranged in front of the sample liquid supply means and can be eluted as an eluate separated into one or more fractions including the analysis target. Since the separation means 60 is provided, it is possible to purify and concentrate the analysis target in the sample liquid, so that the amount of liquid supplied onto the sample plate 20 can be reduced. Moreover, the analysis object can be concentrated with high purity. The separation means 60 is not particularly limited, and examples thereof include electrophoresis such as isotachophoresis and capillary electrophoresis, and various chromatographies such as reverse phase chromatography and affinity chromatography. Of these, separation by liquid chromatography is preferable in that a separation mode that matches the characteristics of the analysis target can be selected and the apparatus is simple, and separation by a column having a solid phase that can separate the analysis target in the sample. Is more preferable. In the present preparation apparatus 10, since the sample liquid can be concentrated on the spot while continuously supplying the sample liquid from the sample liquid supply means 30 onto the sample plate 20, the eluate continuously eluted from the column can be easily concentrated. .
分離手段６０としてカラムを用いる場合、カラムの種類としては、分析対象を他の成分から分離可能なものであれば特に限定せず、分子排除クロマトグラフィー用、アフィニティクロマトグラフィー用、逆相クロマトグラフィー用など、従来公知の種々のカラムを使用できる。カラムに充填する固相の種類も特に限定しない。例えば、逆相クロマトグラフィーの場合、ブチル基（Ｃ４）、オクチル基（Ｃ８）、オクタデシル基（Ｃ１８）等をシリカゲルに結合させた充填剤を用いることができる。 When a column is used as the separation means 60, the type of column is not particularly limited as long as the analysis target can be separated from other components. For molecular exclusion chromatography, affinity chromatography, and reverse phase chromatography For example, various conventionally known columns can be used. The kind of solid phase packed in the column is not particularly limited. For example, in the case of reverse phase chromatography, a filler in which a butyl group (C4), an octyl group (C8), an octadecyl group (C18), or the like is bonded to silica gel can be used.
カラムは、その容量が０．１μｌ以上４μｌ以下であるのが好ましい。０．１μｌ以上であれば、質量分析の検出限界を確保するのに十分な量の分析対象をカラム中に保持できる。また、４μｌ以下であれば、カラムから溶出される溶出液を、試料プレート上の１の液体供給部位にのみ供給するのに適した液量にすることができる。より好ましくは、０．３μｌ以上０．５μｌ以下である。また、カラムの内径や長さは特に限定しないが、カラム内径が０．１ｍｍ以上０．５ｍｍ以下であることが好ましく、０．２ｍｍ以上０．４ｍｍ以下であることがより好ましい。また、カラム長さは、１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であることが好ましく、３ｍｍ以上７ｍｍ以下であることがより好ましい。 The column preferably has a volume of 0.1 μl or more and 4 μl or less. When the amount is 0.1 μl or more, a sufficient amount of the analysis target can be retained in the column to ensure the detection limit of mass spectrometry. Moreover, if it is 4 microliters or less, it can be set as the liquid quantity suitable for supplying the eluate eluted from a column only to one liquid supply site | part on a sample plate. More preferably, it is 0.3 μl or more and 0.5 μl or less. The inner diameter and length of the column are not particularly limited, but the inner diameter of the column is preferably 0.1 mm or more and 0.5 mm or less, and more preferably 0.2 mm or more and 0.4 mm or less. Further, the column length is preferably 1 mm or more and 10 mm or less, and more preferably 3 mm or more and 7 mm or less.
（移動相供給手段）
本調製装置１０が分離手段６０としてカラムを備える場合、カラムに移動相を供給する移動相供給手段７０を備えるものとしてもよい。移動相供給手段７０の形態は特に限定せず、例えば、従来公知の各種液体クロマトグラフィー用のポンプを用いることができる。例えば、アイソクラテックポンプ、高圧グラジエントポンプなど種々のポンプを用いることができる。また、送液のための構成も特に限定せず、例えば、ペリスタルティックポンプ、ギアポンプ、シリンジポンプ等を用いることができる。これらのうち、脈流のない高精度かつ微量の送液を行うためには、シリンジポンプが好ましい。
(Mobile phase supply means)
When the preparation apparatus 10 includes a column as the separation unit 60, the preparation apparatus 10 may include a mobile phase supply unit 70 that supplies a mobile phase to the column. The form of the mobile phase supply means 70 is not particularly limited, and for example, conventionally known various liquid chromatography pumps can be used. For example, various pumps such as an isocratic pump and a high-pressure gradient pump can be used. Moreover, the structure for liquid feeding is not specifically limited, For example, a peristaltic pump, a gear pump, a syringe pump, etc. can be used. Among these, a syringe pump is preferable in order to perform high-accuracy and minute amount liquid feeding without pulsating flow.
移動相供給手段７０は、一定組成の移動相をカラムに供給するものでもよいが、カラムに連続的又は断続的に組成が変化する移動相を供給可能なものが好ましい。これにより、分析対象のグラジエント分析やステップワイズ溶出が可能になり、２以上の成分からなる分析対象に対しても、各成分を効率よく分離できる。 The mobile phase supply means 70 may supply a mobile phase having a constant composition to the column, but is preferably capable of supplying a mobile phase whose composition changes continuously or intermittently to the column. Thereby, gradient analysis and stepwise elution of an analysis object are attained, and each component can be efficiently separated even for an analysis object composed of two or more components.
カラムからの溶出液を試料プレート上に供給する場合、試料液供給手段３０は、当該溶出液を試料プレート上の２以上の液体供給部位２２に供給してもよい。こうすれば、分離手段６０によって分離された分析対象をその分離パターンに対応して個々に解析できる。特に、断続的に組成が変化する移動相を移動相供給手段７０からカラムに供給する場合、カラムからの溶出液は、移動相ごとに異なる液体供給部位２２に供給することが好ましい。 When supplying the eluate from the column onto the sample plate, the sample solution supply means 30 may supply the eluate to two or more liquid supply sites 22 on the sample plate. If it carries out like this, the analysis object isolate | separated by the isolation | separation means 60 can be analyzed individually corresponding to the separation pattern. In particular, when a mobile phase whose composition changes intermittently is supplied from the mobile phase supply means 70 to the column, the eluate from the column is preferably supplied to a different liquid supply site 22 for each mobile phase.
本調製装置１０は、装置内に試料液を導入する試料液導入部８０を備えるものとしてもよい。試料液導入部８０の形態は特に限定せず、従来公知の各種液体クロマトグラフィー用のマニュアル式インジェクタやオート式インジェクタなどを用いることができる。試料液導入部８０には、試料液を計量するためのサンプルループ８２が取り付けられていてもよい。また、試料液導入部８０の前段に移動相供給手段７０を設けた場合、サンプルループ８２への送液の許否によって流路を切り替え可能なバルブを有するものとしてもよい。 The preparation apparatus 10 may include a sample liquid introduction unit 80 that introduces a sample liquid into the apparatus. The form of the sample liquid introduction part 80 is not particularly limited, and a conventionally known manual injector or an automatic injector for various liquid chromatography can be used. A sample loop 82 for measuring the sample solution may be attached to the sample solution introduction unit 80. Further, when the mobile phase supply means 70 is provided in the front stage of the sample liquid introduction unit 80, a valve that can switch the flow path depending on whether or not the liquid feeding to the sample loop 82 is permitted may be provided.
（試料の調製方法）
本発明の質量分析用の試料の調製方法は、分析対象を含有する試料液を試料プレートの所定部位に供給するとき、所定部位に形成される試料液の液滴を維持しながら当該液滴に試料液を供給しつつ液滴中の溶媒を蒸発させる試料供給工程を備えるものである。当該試料供給工程を行うために用いる装置は特に限定しないが、例えば、上述した本発明の調製装置１０を用いることができる。この場合、本調製方法には、既に説明した本発明の調製装置における構成や形態などをそのまま適用できる。したがって、本調製方法における試料供給工程には、上記各種形態の本発明の調製装置により質量分析用の試料を調製するための各種工程が含まれる。
(Sample preparation method)
According to the method for preparing a sample for mass spectrometry of the present invention, when a sample liquid containing an analysis target is supplied to a predetermined portion of a sample plate, the droplet of the sample liquid formed at the predetermined portion is maintained while the sample liquid is maintained. A sample supply step of evaporating the solvent in the droplet while supplying the sample solution is provided. Although the apparatus used in order to perform the said sample supply process is not specifically limited, For example, the preparation apparatus 10 of this invention mentioned above can be used. In this case, the configuration or form of the preparation apparatus of the present invention already described can be applied to the present preparation method as it is. Therefore, the sample supply step in the present preparation method includes various steps for preparing a sample for mass spectrometry using the preparation apparatus of the present invention in various forms described above.
一例として、図１の調製装置１０を用いた質量分析用の試料の調製方法について説明する。まず、分析対象を含む所定量の試料液（例えば、１００μｌ）を試料液導入部８０に導入し、分離手段６０（例えば、カラム）に分析対象を保持させる。続いて、所定量（例えば、５μｌ）の移動相（例えば、アセトニトリル水溶液）を移動相供給手段７０から分離手段６０に送液し、分離手段６０から溶出した溶出液を試料液供給手段３０から試料プレート２０上の液体供給部位２２に供給する。このとき、本調製方法では、液体供給部位２２に形成される試料液の液滴を維持しながら試料液を液体供給部位２２に供給しつつ、この液滴中の溶媒を、例えば、加熱によって蒸発させながら行う。すなわち、試料プレート２０上の液滴に試料液を供給しながら液滴中の溶媒を蒸発させる。その結果、試料プレート２０上での液滴の広がりを抑制しながら試料液を大量に供給でき、分析対象をその場で高度に濃縮できる。 As an example, a method for preparing a sample for mass spectrometry using the preparation apparatus 10 of FIG. 1 will be described. First, a predetermined amount of sample liquid (for example, 100 μl) including the analysis target is introduced into the sample liquid introduction unit 80, and the analysis target is held in the separation means 60 (for example, a column). Subsequently, a predetermined amount (for example, 5 μl) of a mobile phase (for example, acetonitrile aqueous solution) is sent from the mobile phase supply means 70 to the separation means 60, and the eluate eluted from the separation means 60 is sampled from the sample liquid supply means 30. Supply to the liquid supply site 22 on the plate 20. At this time, in this preparation method, the sample liquid is supplied to the liquid supply portion 22 while maintaining the droplet of the sample liquid formed in the liquid supply portion 22, and the solvent in the droplet is evaporated by heating, for example. To do. That is, the solvent in the droplet is evaporated while supplying the sample liquid to the droplet on the sample plate 20. As a result, a large amount of sample liquid can be supplied while suppressing the spread of droplets on the sample plate 20, and the analysis target can be highly concentrated on the spot.
なお、本形態の調製装置１０によりステップワイズ溶出を行うには、例えば、移動相供給手段７０から分離手段６０としてのカラムに供給する移動相（例えば、アセトニトリル水溶液）の組成を変化させてもよい。このとき、溶出液を供給する液体供給部位２２の位置は、移動相ごとに異なる位置とすることが好ましい。 In order to perform stepwise elution with the preparation apparatus 10 of the present embodiment, for example, the composition of the mobile phase (for example, acetonitrile aqueous solution) supplied from the mobile phase supply means 70 to the column as the separation means 60 may be changed. . At this time, the position of the liquid supply site 22 for supplying the eluate is preferably different for each mobile phase.
本調製方法により調製された試料は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ用の試料に用いることができる。ＭＡＬＤＩに用いるマトリックスを分析対象に供給する方法は特に限定しない。例えば、マトリックスを含まない試料液を用いて試料液供給工程を行ったのち液体供給部位にマトリックス溶液を供給してもよい。あるいは、試料液とマトリックスとを混合した混合溶液を用いて試料液供給工程を行ってもよい。 The sample prepared by this preparation method can be used as a sample for MALDI-TOF / MS. A method for supplying a matrix used for MALDI to an analysis target is not particularly limited. For example, the matrix solution may be supplied to the liquid supply site after performing the sample solution supply process using the sample solution not containing the matrix. Or you may perform a sample liquid supply process using the mixed solution which mixed the sample liquid and the matrix.
（質量分析装置）
本発明の質量分析装置は、上述した本発明の質量分析用の試料の調製装置１０を備えることができる。すなわち、本質量分析装置は、本発明の質量分析用の試料の調製装置１０により調製された試料を用いて質量分析を行う。本質量分析装置における質量分析用の試料の調製装置１０には、既に説明した本発明の調製装置１０における構成や形態などをそのまま適用できる。したがって、本質量分析装置によれば、分析対象が試料プレート上の所定部位に高度に濃縮して塗布された試料を用いた質量分析が可能であることから、分析対象が希薄な試料液に対しても、検出限界を十分に確保できる。
(Mass spectrometer)
The mass spectrometer of the present invention can include the above-described sample preparation apparatus 10 for mass spectrometry of the present invention. That is, this mass spectrometer performs mass spectrometry using the sample prepared by the sample preparation apparatus 10 for mass spectrometry of the present invention. The already described configuration and form of the preparation apparatus 10 of the present invention can be applied as it is to the sample preparation apparatus 10 for mass spectrometry in the present mass spectrometer. Therefore, according to the present mass spectrometer, mass analysis using a sample that is highly concentrated and applied to a predetermined site on the sample plate is possible. However, a sufficient detection limit can be secured.
（質量分析方法）
本発明の質量分析方法は、上述した質量分析用の試料の調製装置１０により調製した試料を用いて質量分析を行うものである。本質量分析方法には、既に説明した本発明の調製装置１０における構成や形態などをそのまま適用することができる。したがって、本質量分析方法には、上記各種形態の本発明の調製装置１０により質量分析用の試料を調製するための各種工程が含まれる。
(Mass spectrometry method)
The mass spectrometry method of the present invention performs mass spectrometry using the sample prepared by the above-described sample preparation apparatus 10 for mass spectrometry. The configuration and form of the preparation apparatus 10 of the present invention already described can be applied to this mass spectrometry method as it is. Accordingly, the present mass spectrometry method includes various steps for preparing a sample for mass spectrometry using the preparation apparatus 10 of the present invention in the above-described various forms.
（タンパク質分析方法）
本発明のタンパク質分析方法は、上述の質量分析用の試料の調製装置１０により調製した試料を用いてタンパク質の分析を行うものである。本タンパク質分析方法には、既に説明した本発明の調製装置における構成や形態などをそのまま適用することができる。したがって、本タンパク質分析方法には、上記各種形態の本発明の調製装置により質量分析用の試料を調製するための各種工程が含まれる。本タンパク質分析方法によれば、高度に濃縮した試料による質量分析が可能であることから、分析対象となるタンパク質が微少量の場合にも、検出限界を十分に確保できる。
(Protein analysis method)
The protein analysis method of the present invention performs protein analysis using the sample prepared by the sample preparation apparatus 10 for mass spectrometry described above. For the present protein analysis method, the configuration and form of the preparation apparatus of the present invention described above can be applied as they are. Therefore, the present protein analysis method includes various steps for preparing a sample for mass spectrometry using the preparation apparatus of the present invention in various forms described above. According to the present protein analysis method, mass analysis using a highly concentrated sample is possible, so that a sufficient detection limit can be secured even when the amount of protein to be analyzed is very small.
本分析方法を行う場合、分析対象は、質量分析で分析可能な分子量や得られる情報内容等を考慮して、各種の分解酵素等で適宜低分子化した上で試料プレート上に供給してもよい。こうすることにより、タンパク質の分解パターンについて解析できるとともに、質量分析の精度が向上し、タンパク質の同定あるいはタンパク質の配列決定を容易化できる。 When performing this analysis method, the analysis target may be supplied on the sample plate after appropriately reducing the molecular weight with various degrading enzymes in consideration of the molecular weight that can be analyzed by mass spectrometry and the information content obtained. Good. By doing so, the degradation pattern of the protein can be analyzed, the accuracy of mass spectrometry can be improved, and protein identification or protein sequencing can be facilitated.
以下、本発明を具体例を挙げて説明するが、本発明は以下に例示する具体例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described with specific examples. However, the present invention is not limited to the specific examples illustrated below.
本実施例では、試料プレート２０として、パイロカーブ（イビデン株式会社製）のプレートを用いた。すなわち、パイロカーブプレートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置（ＡＢＩ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＳＴＲ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ型質量分析計）の金属製プレートと同じ大きさに調製し、これを試料プレート２０とした。 In this example, a pyrocurve (Ibiden Co., Ltd.) plate was used as the sample plate 20. That is, a pyrocurve plate was prepared in the same size as a metal plate of a MALDI-TOF / MS apparatus (ABI Voyager DE-STR MALDI TOF type mass spectrometer).
質量分析用の試料の調製は、図１に示す調製装置１０により行った。具体的には、分離手段６０としてのカラムは、内径０．３ｍｍ、長さ５ｍｍ、カートリッジ容積が０．３６μｌのＯＤＳ（Ｃ１８）プレカラムカートリッジ（ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ／Ｄｉｏｎｅｘ）をプレカラムホルダーＨＤ１（ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ／Ｄｉｏｎｅｘ）に入れたものを用いた。プレカラムホルダーの両端には、フェラル、ナットを介して内径３０μｍのＰＥＥＫチューブを取り付けた。また、カラムは、その上流部をＰＥＥＫチューブを介して６ポート２ポジションインジェクタ（Ｖａｌｃｏ社）に接続し、下流部をＰＥＥＫチューブ、ユニオン（Ｐｉｃｏ Ｃｌｅａｒ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社製）を介して試料液供給手段３０に接続した。試料液導入部８０としてのサンプルインジェクタは、サンプルインジェクション用のポートと送液受け入れ用のポートとを有し、１００μｌのサンプルループ８２が取り付けられたものを用いた。サンプルインジェクション用のポートには、シリンジスリーブを取り付け、サンプル注入用のシリンジの挿入に対応させた。試料液供給手段３０には、内径３０μｌ、先端内径１０μｌのシリカチップ（Ｐｉｃｏ Ｔｉｐ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社製、製品番号：ＦＳ３６０−２０−１０−Ｎ）を用いた。また、移動相供給手段７０としては、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ社製、５５−２１１１）を用いた。 The sample for mass spectrometry was prepared by the preparation apparatus 10 shown in FIG. Specifically, the column as the separation means 60 is an ODS (C18) precolumn cartridge (LC Packings / Dionex) having an inner diameter of 0.3 mm, a length of 5 mm, and a cartridge volume of 0.36 μl, and a precolumn holder HD1 (LC Packings / Dionex). ) Was used. PEEK tubes with an inner diameter of 30 μm were attached to both ends of the precolumn holder via ferrules and nuts. Further, the column is connected to a 6-port 2-position injector (Valco) via the PEEK tube at the upstream portion, and the sample solution supply means via the PEEK tube and union (Pico Clear, New Objective) at the downstream portion. 30. The sample injector serving as the sample solution introduction unit 80 was a sample injector having a sample injection port and a solution receiving port, to which a 100 μl sample loop 82 was attached. A syringe sleeve was attached to the sample injection port to accommodate insertion of a sample injection syringe. As the sample solution supply means 30, a silica chip (Pico Tip, manufactured by New Objective, product number: FS360-20-10-N) having an inner diameter of 30 μl and a tip inner diameter of 10 μl was used. Moreover, as the mobile phase supply means 70, a syringe pump (Harvard, 55-2111) was used.
分析対象としては、還元カルボキシメチル化リゾチーム（鶏タンパク質）をトリプシンで消化したものを用いた。これを１ｐｍｏｌ／５μｌの濃度で含む溶液を試料液とした。 As an analysis target, reduced carboxymethylated lysozyme (chicken protein) digested with trypsin was used. A solution containing this at a concentration of 1 pmol / 5 μl was used as a sample solution.
質量分析用の試料の調製は、まず、分析対象を含む試料液１００μｌをサンプルインジェクタのサンプルループに注入し、バルブを切り替えたのちシリンジポンプをオンにし、０．１％ＴＦＡ水溶液を流速１０μｌ／ｍｉｎで１０分間カラムに送液し、分析対象をカラムに吸着させた。その後、０．１％ＴＦＡ水溶液で１分間カラムを洗浄し、シリンジポンプをオフにした。なお、この作業中によりカラム下流へ流れる溶液は、マイクロチューブにて適宜回収した。 In preparing a sample for mass spectrometry, first, 100 μl of a sample solution containing an analysis target is injected into a sample loop of a sample injector, a valve is switched, a syringe pump is turned on, and a 0.1% TFA aqueous solution is flowed at a flow rate of 10 μl / min. Was sent to the column for 10 minutes to adsorb the analyte to the column. Thereafter, the column was washed with 0.1% TFA aqueous solution for 1 minute, and the syringe pump was turned off. The solution flowing downstream of the column during this operation was appropriately collected with a microtube.
続いて、試料プレート２０を蒸発手段４０としてのヒーティングプレートの上に載置し、シリカチップの先端を試料プレート２０の最初のターゲットに合わせ、保持手段５０としてのスタンドにシリカチップを固定した。このとき、Ｘ軸方向及びＹ軸方向の位置は、ターゲットの中心点に合わせ、垂直方向（Ｚ軸方向）の位置は、試料プレートに触れるか否かの位置（０．１〜０．２ｍｍ）に調節した。ヒーティングプレートの加熱温度を８０−８５℃にセットして５分間加熱することにより試料プレート２０の表面温度を７０℃にし、その後、シリンジポンプのインジェクタに７０％アセトニトリル水溶液（０．１％ＴＦＡ）を５μｌ注入し、バルブを切り替え、シリンジポンプをオンにした。このときの流速は、１μｌ／ｍｉｎとした。 Subsequently, the sample plate 20 was placed on the heating plate as the evaporation means 40, the tip of the silica chip was aligned with the first target of the sample plate 20, and the silica chip was fixed to the stand as the holding means 50. At this time, the positions in the X-axis direction and the Y-axis direction are aligned with the center point of the target, and the position in the vertical direction (Z-axis direction) is a position whether or not to touch the sample plate (0.1 to 0.2 mm). Adjusted. The heating temperature of the heating plate is set to 80-85 ° C. and heated for 5 minutes to bring the surface temperature of the sample plate 20 to 70 ° C., and then 70% acetonitrile aqueous solution (0.1% TFA) is added to the syringe pump injector. Was injected, the valve was switched, and the syringe pump was turned on. The flow rate at this time was 1 μl / min.
カラムから溶出した溶出液５μｌをシリカチップを介して加熱中の試料プレート上の１の液体供給部位２２に供給した。具体的には、まず、シリカチップの先端部から溶出液の液滴が離れる前にこの液滴を試料プレート２０表面に接触させ、液滴を試料プレート２０表面に形成した。続いて、この液滴に対し、シリカチップの先端部を液滴に接触させたまま、かつ試料プレート上の液滴を維持しながら溶出液を供給した。また、液滴への溶出液の供給時には、試料プレート２０をヒーティングプレートで加熱することにより、液滴中の溶媒を蒸発させながら行った。なお、試料プレート２０への供給状態は、モニタで監視しながら行った。 5 μl of the eluate eluted from the column was supplied to one liquid supply site 22 on the heating sample plate through a silica chip. Specifically, first, before the elution liquid droplets separated from the tip of the silica chip, the liquid droplets were brought into contact with the surface of the sample plate 20 to form the liquid droplets on the surface of the sample plate 20. Subsequently, the eluent was supplied to the droplet while keeping the tip of the silica chip in contact with the droplet and maintaining the droplet on the sample plate. In addition, when the eluate was supplied to the droplets, the sample plate 20 was heated by a heating plate while evaporating the solvent in the droplets. The supply state to the sample plate 20 was performed while monitoring with a monitor.
カラムからの溶出液５μｌを試料プレート上の１の液体供給部位２２に供給したのちシリンジポンプをオフにし、液滴中の溶媒を完全に蒸発して試料プレート２０上に分析対象を保持させた。この分析対象に対しマトリックス溶液０．５μｌを上載せして乾燥させた後、レーザ強度９００で質量分析を行った。なお、マトリックス溶液としては、α−シアノ−４−ヒドロキシケイヒ皮酸（ＣＨＣＡ）溶液を用いた。質量分析の結果を図４に示す。 After supplying 5 μl of the eluate from the column to one liquid supply site 22 on the sample plate, the syringe pump was turned off, and the solvent in the droplets was completely evaporated to hold the analyte on the sample plate 20. After 0.5 μl of a matrix solution was placed on the analysis target and dried, mass analysis was performed at a laser intensity of 900. As the matrix solution, an α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) solution was used. The results of mass spectrometry are shown in FIG.
図４に示すように、本分析対象において、分子量イオンを検出することができた。また、バックグラウンドノイズも良好であった。 As shown in FIG. 4, molecular weight ions could be detected in this analysis target. The background noise was also good.
実施例２では、移動相として５％、１０％、１５％及び２０％の各アセトニトリル水溶液（０．１％ＴＦＡ）を用いてステップワイズ溶出を行った以外は実施例１と同様にして行った。すなわち、実施例１でシリンジポンプのインジェクタに７０％アセトニトリル水溶液（０．１％ＴＦＡ）を注入した代わりに５％アセトニトリル水溶液（０．１％ＴＦＡ）を５μｌ注入し、カラムから溶出される溶出液５μｌを試料プレート上の１の液体供給部位に供給した。続いて、１０％、１５％及び２０％の各アセトニトリル水溶液（０．１％ＴＦＡ）についてもそれぞれ液体供給部位の位置を変えて同じ作業を繰り返した。 Example 2 was carried out in the same manner as Example 1 except that stepwise elution was performed using 5%, 10%, 15% and 20% acetonitrile aqueous solutions (0.1% TFA) as the mobile phase. . That is, instead of injecting 70% acetonitrile aqueous solution (0.1% TFA) into the syringe pump injector in Example 1, 5 μl of 5% acetonitrile aqueous solution (0.1% TFA) was injected, and the eluate eluted from the column. 5 μl was supplied to one liquid supply site on the sample plate. Subsequently, for the 10%, 15%, and 20% acetonitrile aqueous solutions (0.1% TFA), the same operation was repeated by changing the position of the liquid supply site.
ステップワイズ溶出における質量分析の結果を図５に示す。図５に示すように、各移動相による溶出液を用いた試料で分子量イオンを検出することができた。また、バックグラウンドノイズも良好であった。 The results of mass spectrometry in stepwise elution are shown in FIG. As shown in FIG. 5, molecular weight ions could be detected from the sample using the eluate of each mobile phase. The background noise was also good.
実施例３では、アルブミン（シグマ製、フラクション５）のトリプシン消化物を０．１ｐｍｏｌ／５μｌで含む溶液を試料液とし、移動相として５％、１０％、１５％、２０％及び２５％の各アセトニトリル水溶液（０．１％ＴＦＡ）を用いてステップワイズ溶出を行った以外は実施例１と同様にして行った。その結果を図６に示す。図６に示すように、各移動相による溶出液を用いた試料で分子量イオンを検出することができた。また、バックグラウンドノイズも良好であった。 In Example 3, a solution containing a trypsin digest of albumin (manufactured by Sigma, fraction 5) at 0.1 pmol / 5 μl was used as a sample solution, and 5%, 10%, 15%, 20% and 25% were used as mobile phases. The same procedure as in Example 1 was performed except that stepwise elution was performed using an aqueous acetonitrile solution (0.1% TFA). The result is shown in FIG. As shown in FIG. 6, molecular weight ions could be detected in the sample using the eluate from each mobile phase. The background noise was also good.
１０ 調製装置、２０ 試料プレート、２２ 液体供給部位、３０ 試料液供給手段、３２ 本体部、３４ 排液口、４０ 蒸発手段、４２ 加熱部、５０ 保持手段、５２ アーム、６０ 分離手段、７０ 移動相供給手段、８０ 試料液導入部、９０ 液滴、９５ 非酸化性雰囲気形成手段、９６ ノズル本体、９７ 通気孔 DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Preparation apparatus, 20 Sample plate, 22 Liquid supply site, 30 Sample liquid supply means, 32 Main body part, 34 Drain outlet, 40 Evaporating means, 42 Heating part, 50 Holding means, 52 Arm, 60 Separation means, 70 Mobile phase Supply means, 80 sample liquid introduction part, 90 droplet, 95 non-oxidizing atmosphere forming means, 96 nozzle body, 97 vent
Claims (21)
前記分析対象を含有する試料液が供給される試料プレートと、
前記試料プレート上の所定部位に前記試料液を供給するとき前記所定部位に形成される前記試料液の液滴を維持しながら当該液滴に前記試料液を供給する試料液供給手段と、
前記所定部位に形成される前記液滴中の溶媒を蒸発させる蒸発手段と、
を備える装置。 An apparatus for preparing a sample for mass spectrometry including one or more analytes,
A sample plate to which a sample solution containing the analysis target is supplied;
Sample liquid supply means for supplying the sample liquid to the droplet while maintaining the droplet of the sample liquid formed at the predetermined portion when supplying the sample liquid to the predetermined portion on the sample plate;
Evaporating means for evaporating the solvent in the droplets formed at the predetermined site;
A device comprising:
前記試料液供給手段は、前記非酸化性雰囲気形成手段により前記液滴を非酸化性雰囲気に曝した状態で前記試料液を前記試料プレート上に供給する手段である、請求項１〜４のいずれかに記載の装置。 A non-oxidizing atmosphere forming means for forming a non-oxidizing atmosphere for the droplets,
The sample liquid supply means is means for supplying the sample liquid onto the sample plate in a state where the droplets are exposed to the non-oxidizing atmosphere by the non-oxidizing atmosphere forming means. A device according to the above.
前記試料液供給手段は、前記溶出液を前記試料プレート上に供給する手段である、請求項１〜８のいずれかに記載の装置。 A separation means that is arranged upstream of the sample liquid supply means and can be eluted as an eluate separated into one or more fractions containing the analysis target;
The apparatus according to any one of claims 1 to 8, wherein the sample liquid supply means is means for supplying the eluate onto the sample plate.
前記分析対象を含有する試料液を試料プレートの所定部位に供給するとき、前記所定部位に形成される前記試料液の液滴を維持しながら当該液滴に前記試料液を供給しつつ前記液滴中の溶媒を蒸発させる試料供給工程、
を備える、方法。 A method for preparing a sample for mass spectrometry including one or more analytes,
When supplying the sample liquid containing the analysis target to a predetermined part of the sample plate, the liquid droplet is supplied to the liquid droplet while maintaining the liquid droplet of the sample liquid formed at the predetermined part. A sample supply step for evaporating the solvent therein,
A method comprising:
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