JP2008255021A - 混合酸無水物の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】カルボン酸類及びアミンを含む第１溶液と、ハロゲン化物を含む第２溶液とを反応させて混合酸無水物を製造する方法において、反応を容器に制御できる手段を提供する。
【解決手段】本混合酸無水物の製造方法は、第１溶液を第１微小流路に流通させる第１ステップと、第２溶液を第２微小流路に流通させる第２ステップと、第１微小流路から流出された第１溶液と第２微小流路から流出された第２溶液とを接触させて第３微小流路に流通させて混合酸無水物を生成する第３ステップと、を含む。
【選択図】なし

Description

本発明は、カルボン酸類及びアミンを含む第１溶液と、ハロゲン化物を含む第２溶液とを反応させて混合酸無水物を製造する方法に関する。

カルボン酸類とハロゲン化物を反応させて混合酸無水物を得る方法は、反応性が高くかつ激しい発熱を伴うため、−２０℃以下の環境で行う必要があり、また、反応の制御が難しい（例えば、特許文献１から特許文献３）。

一方、キャピラリーなどで実現される微小流路（マイクロチャネル）を利用して、化学的操作や電気的操作、機械的操作が行われている。例えば、物質の分析や、物質の合成、微生物の培養、電気泳動、電気浸透などにおいて微小流路が利用されており、少量の試料に基づいて所望の結果が得られるという利点がある。

特開平６−６５１３８号公報 特開平９−１０４６４２号公報 特開２００６−１０４１３０号公報

ペプチド合成などのアシル化反応において、酸無水物を用いる手法は、その反応性の高さから利用価値が高い。しかし、前述されたように、反応の制御が難しいことから、近年では、水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤が多用されている。また、酸無水物の反応性が高いことから、アシル化反応においても収率を向上させることが困難であった。

本発明はかかる事情に鑑みてなされたものであり、カルボン酸類及びアミンを含む第１溶液と、ハロゲン化物を含む第２溶液とを反応させて混合酸無水物を製造する方法において、反応を容器に制御できる手段を提供することを目的とする。

(1) 本発明は、カルボン酸類及びアミンを含む第１溶液と、ハロゲン化物を含む第２溶液とを反応させて混合酸無水物を製造する方法であって、第１溶液を第１微小流路に流通させる第１ステップと、第２溶液を第２微小流路に流通させる第２ステップと、第１微小流路から流出された第１溶液と第２微小流路から流出された第２溶液とを接触させながら第３微小流路に流通させて混合酸無水物を生成する第３ステップと、を含む。

第１ステップにおいて第１微小流路を流出された第１溶液と、第２ステップにおいて第２微小流路を流出された第２溶液とが、第３微小流路において接触されることにより混合酸無水物の生成が穏やかに進行する。また、第３微小流路において、溶液の体積に対する接触面積を上げることができるので、放熱性が高められる。

(2) 上記第３微小流路において、第１溶液と第２溶液とを層流としてもよい。これにより、第１溶液と第２溶液との界面において混合酸無水物が生成されるので、反応の制御が一層容易となる。

(3) 上記第３微小流路において、第１溶液と第２溶液との界面を第３微小流路の壁面と非接触としてもよい。これにより、混合酸無水物の生成過程における副産物が第３微小流路の壁面に付着することを抑制できる。

(4) 上記第１微小流路、上記第２微小流路、及び上記第３微小流路における流路方向と直交する断面の最大寸法は、それぞれ１０μｍ〜２ｍｍであることが好ましい。

(5) 上記第１流路における第１溶液の流量、及び上記第２流路における第２溶液の流量は、それぞれ毎分１０μＬ〜１０ｍＬであることが好ましい。

(6) 上記第１溶液におけるカルボン酸類の濃度、及び上記第２溶液におけるハロゲン化物の濃度は、それぞれ０．０５〜２ｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。

(7) 本発明にかかるアシル化方法は、上記混合酸無水物の製造方法により得られた混合酸無水物とアミン類とを第４微小流路に流通させてアシル化反応を行うものである。これにより、混合酸無水物の反応の制御が容易となり、また、アシル化物の収率を高めることができる。

本発明に係る混合酸無水物の製造方法によれば、第１ステップにおいて第１微小流路を流出された第１溶液と、第２ステップにおいて第２微小流路を流出された第２溶液とが、第３微小流路において接触することにより混合酸無水物の生成が穏やかに進行するので、混合酸無水物の反応の制御が容易である。さらに、第３微小流路において、溶液の体積に対する接触面積を上げることができるので、放熱性が高められ、環境温度を高くすることができる。

以下に、本発明の好ましい実施形態が説明される。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様が変更されてもよいことは言うまでもない。

本発明に係る混合酸無水物の製造方法は、主に３つのステップからなるが、これら以外のステップが含まれることを除くものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲で、さらに他のステップが後述される各ステップの前後に実施されてもよい。以下、本混合酸無水物の製造方法の主要な３つのステップについて説明する。

第１ステップでは、カルボン酸類及びアミンを含む第１溶液が第１微小流路に流通される。第１溶液に含まれるカルボン酸類として、例えば、Ｎ−保護アミノ酸、末端のカルボキシル基のみが遊離された保護ペプチド、酢酸、脂肪酸などがあげられる。第１溶液に含まれるアミンとして、例えば、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジイソプロピルエチルアミン、トリメチルアミン、その他の３級アミンがあげられる。第１溶液に含まれる溶媒として、例えば、無水テトラヒドロフランがあげられるが、無水溶媒であれば、その他の不活性溶媒を使用することができる。

第１溶液におけるカルボン酸類の濃度は、０．０５〜２．０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．５〜１．０ｍｏｌ／Ｌである。カルボン酸類の濃度が上記範囲より高ければ、反応の際に副生される塩によって第３微小流路の閉塞が生じるおそれがあり、カルボン酸類の濃度が上記範囲より低ければ、反応速度が極端に低下する。

第１溶液におけるアミンの濃度は、カルボン酸類に対してモル比で１等量が好ましい。絶対濃度でいえば、第１溶液におけるアミンの濃度は、０．０５〜２．０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．３〜０．８ｍｏｌ／Ｌである。アミンの濃度が上記範囲を逸脱するとラセミ化の危険が生じうる。

第１微小流路として、例えば、所定の長さのキャピラリーを用いることができる。キャピラリーの中空形状は特に限定されず、その断面が円、楕円、多角形などであってもよい。キャピラリーの中空は、その断面、つまりキャピラリー内を溶液が流通する方向（流路方向）と直交する断面の形状において最大となる寸法（最大寸法）が、１０μｍ〜２ｍｍであることが好ましく、より好ましくは５００μｍ〜１．５ｍｍであり、特に好ましくは約１．０ｍｍである。ここで、最大寸法とは、キャピラリーの断面形状が円であれば直径をさし、多角形であれば最大長さとなる対角線をさす。最大寸法が上記範囲より小さければ、第１溶液の流量が十分に確保できず、混合酸無水物の生成量が少なくなり、実用性に欠ける。また、第１溶液中の析出物などによって第１微小流路がつまって流通性が悪くなるなどの不具合が生じやすい。最大寸法が上記範囲より大きければ、混合酸無水物の反応を制御しにくくなる。キャピラリーの長さは、特に限定されない。なお、キャピラリーに代えて、ガラス板やシリコン板などに形成された微小溝を第１微小流路として用いることができる。

第１流路における第１溶液の流量は、毎分１０μＬ〜１０ｍＬであることが好ましく、さらに好ましくは毎分１００μＬ〜５ｍＬであり、特に好ましくは毎分１〜２ｍＬである。第１溶液の流量が上記範囲より小さければ、混合酸無水物の生成量が少なくなり、実用性に欠ける。第１溶液の流量が上記範囲より大きければ、混合酸無水物の反応を制御しにくくなる。第１溶液の流量は、第１流路となるキャピラリーをシリンジポンプやギヤポンプに連結することにより制御することができる。

第２ステップでは、ハロゲン化物を含む第２溶液が第２微小流路に流通される。第２溶液に含まれるハロゲン化物として、例えば、ハロゲン化炭酸物、ハロゲン化リン酸物などがあげられる。第２溶液に含まれる溶媒として、例えば、無水テトラヒドロフランがあげられるが、無水溶媒であれば、その他の不活性溶媒を使用することができる。

第２溶液におけるハロゲン化物の濃度は、カルボン酸類に対してモル比で１等量が好ましい。絶対濃度でいえば、０．０５〜２．０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．１〜１．０ｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．３〜０．８ｍｏｌ／Ｌである。ハロゲン化物の濃度が上記範囲より高ければ、反応の際に副生される塩によって第３微小流路の閉塞が生じるおそれがあり、上記範囲より低ければ、反応速度が極端に低下する。

第２微小流路として、例えば、第１微小流路で示されたような所定の長さのキャピラリーを用いることができる。このキャピラリーの詳細についての説明は、第１微小流路と同様であるので省略される。

第２流路における第２溶液の流量は、毎分１０μＬ〜１０ｍＬであることが好ましく、さらに好ましくは、毎分１００μＬ〜１．０ｍＬであり、特に好ましくは、毎分３００〜８００μＬである。第２溶液の流量が上記範囲より小さければ、混合酸無水物の生成量が少なくなり、実用性に欠ける。第２溶液の流量が上記範囲より大きければ、混合酸無水物の反応を制御しにくくなる。第２溶液の流量は、第２流路となるキャピラリーをシリンジポンプやギヤポンプに連結することにより制御することができる。

第３ステップでは、第１微小流路から流出された第１溶液と第２微小流路から流出された第２溶液とを接触させて第３微小流路に流通される。

第３微小流路として、例えば、第１微小流路で示されたような所定の長さのキャピラリーを用いることができる。このキャピラリーの詳細についての説明は、第１微小流路と同様であるので省略される。第３微小流路としてのキャピラリーは、第１微小流路としてのキャピラリー及び第２微小流路としてのキャピラリーと連結される。この連結は、後述されるジョイントによって行われてもよい。

第３流路における第１溶液及び第２溶液の流量は、毎分１０μＬ〜１０ｍＬであることが好ましく、さらに好ましくは、毎分１００μＬ〜１．０ｍＬであり、特に好ましくは、毎分３００〜８００μＬである。なお、第１溶液及び第２溶液は、第３流路において混合酸無水物を生成するので、第１流路における第１溶液及び第２溶液と混合酸無水物とが明確に区別されなくてもよい。つまり、第３流路における第１溶液及び第２溶液の流量は、第３流路における混合酸無水物の流量として把握されてもよい。第１溶液及び第２溶液の流量が上記範囲より小さければ、混合酸無水物の生成量が少なくなり、実用性に欠ける。第１溶液及び第２溶液の流量が上記範囲より大きければ、混合酸無水物の反応を制御しにくくなる。第１溶液及び第２溶液の流量は、第１流路及び第２流路において第１溶液の流量及び第２溶液の流量がそれぞれ制御されることによって制御される。

第３微小流路において、第１溶液と第２溶液とが層流として流通されることが好ましい。これにより、第１溶液と第２溶液との界面において混合酸無水物が生成されるので、反応の制御が一層容易となる。このような層流は、第３微小流路としてのキャピラリーを、第１微小流路としてのキャピラリー及び第２微小流路としてのキャピラリーと連結するジョイントによって実現することができる。

図１は、前述された層流を実現するジョイント１０の一例を示す図である。図１に示されるように、ジョイント１０は、概ねＴ字形状をなすジョイント本体１１と、第１微小流路としてのキャピラリーが接続される第１コネクタ部１２と、第２微小流路としてのキャピラリーが接続される第２コネクタ部１３と、第３微小流路としてのキャピラリーが接続される第３コネクタ部１４とからなる。なお、第１コネクタ部１２、第２コネクタ部１３、及び第３コネクタ部１４は、各微小流路を形成するキャピラリーの一部であってもよい。

第１コネクタ部１２は、キャピラリーが接続可能な径の管体であり、ジョイント本体１１において流路と直交する方向（図１における上側）に設けられている。第２コネクタ部１３は、ジョイント本体１１から外部へ露出する端部が、キャピラリーが接続可能な径の管体であり、ジョイント本体１１の内側へ挿入される端部が小径とされている。この小径部１５は、ジョイント本体１１において第１コネクタ部１２から液体が流出される交差位置付近から、ジョイント本体１１において第３コネクタ部１４が設けられる側（図１における右側）へ延出されている。小径部１５は、第３コネクタ部１４内における中心付近に位置されている。

第３コネクタ部１４は、キャピラリーが接続可能な径の管体であり、ジョイント本体１１において、第２コネクタ部１３との関係で流路が直線的に連続する位置（図１における右側）に設けられている。第３コネクタ部１４には、第２コネクタ部１３の小径部１５が内挿されている。第３コネクタ部１４と小径部１５との間には液体が流通可能な隙間が形成されている。

このように構成されたジョイント１０において、第１溶液は、第１コネクタ部１２からジョイント本体１１の内部へ流入し、さらに第３コネクタ部１４へ流入する。なお、第２コネクタ部１３の小径部１５の開口が第３コネクタ部１４内にあるので、ジョイント本体１１の内部へ流入した第１溶液が第２コネクタ部１３へ流入することはない。

第２溶液は、第２コネクタ部１３の小径部１５から第３コネクタ部１４の内部へ直接に流入する。第３コネクタ部１４において、小径部１５の開口より上流側で第１溶液が流入しているので、その第１溶液の流れの中心に第２溶液が流れ込む。これにより、第１溶液と第２溶液とが層流として接触する。また、第１溶液と第２溶液との界面が、第３微小流路の壁面と非接触となる。これにより、混合酸無水物の生成過程における副産物が第３微小流路の壁面に付着することを抑制できる。この副産物として、例えば、Ｎ−メチルモルホリン塩酸塩や、アミンの塩酸塩があげらえる。

第３微小流路における混合酸無水物の生成は、−１０〜１５℃の範囲で行うことが好ましい。より好ましくは−５〜１０℃であり、特に好ましくは約５℃である。反応温度が上記範囲を逸脱した場合、反応の暴走により過剰な発熱が生じ、保護基の脱離等の副反応が生じる。

第３微小流路を、さらにジョイントを介して第４微小流路と接続し、第３微小流路から流出される混合酸無水物に対してアミノ酸等の溶液を加えてアシル化反応を連続して行うようにしてもよい。これにより、混合酸無水物の反応の制御が容易となり、また、アシル化物の収率を高めることができる。第４微小流路として、例えば、第１微小流路で示されたような所定の長さのキャピラリーを用いることができる。このキャピラリーの詳細についての説明は、第１微小流路と同様であるので省略される。アシル化に用いるアミン類として、例えば、アンモニア、１級アミン、２級アミン、Ｎ−無保護のアミノ酸、Ｎ−無保護のペプチド、ガングリオシドなどがあげられる。なお、第４微小流路において、アシル化に代えてアミド化を行うようにしてもよい。

第４微小流路におけるアシル化反応は、−５〜１０℃の範囲で行うことが好ましい。より好ましくは−５〜５℃であり、特に好ましくは約５℃である。反応温度が上記範囲を逸脱した場合、不均化による目的外のアシル化物、例えばＩＢＣＦ等が反応した生成物などが生成するおそれがある。

このように、本発明に係る混合酸無水物の製造方法によれば、第１ステップにおいて第１微小流路を流出された第１溶液と、第２ステップにおいて第２微小流路を流出された第２溶液とが、第３微小流路において接触することにより混合酸無水物の生成が穏やかに進行するので、混合酸無水物の反応の制御が容易である。また、第３微小流路において、溶液の体積に対する接触面積を上げることができるので、放熱性が高められ、環境温度を高くすることができる。

以下に、本発明の実施例が説明される。実施例は、本発明の一実施形態であり、本発明が実施例に記載されたものに限定されないことは言うまでもない。

〔実施例１〕
Ｎ末端側がＢｏｃ化された４−ベンジルヒドロキシプロリン（Boc-Hyp(Bzl)-OH、ＭＷ＝３２１．３７、ペプチド研究所）７．５mmol（２．４ｇ）を、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ、東京化成工業）７．５mmol（８２５μＬ）を加えたＴＨＦ（和光純薬、脱水、安定剤不含）溶液５ｍＬに溶解させ、マイクロシリンジ（HAMILTON、１０ｍＬ）に入れた。次に、クロロギ酸イソブチル（ＩＢＣＦ、東京化成工業）９７３μＬを溶解させたＴＨＦ溶液５ｍＬを別のマイクロシリンジ（HAMILTON、１０ｍＬ）に入れた。

Boc-Hyp(Bzl)-OH溶液の入ったマイクロシリンジと５５０ｍｍのテフロン（登録商標）チューブ（1/16”×0.5 mm、ジーエルサイエンス）とを繋ぎ、そのテフロン（登録商標）チューブをジョイントと連結した。ＩＢＣＦ溶液の入ったマイクロシリンジを、４３０ｍｍのキャピラリー（シリカキャピラリーチューブ、内径０．３２０ｍｍ、外径０．４５０ｍｍ、ジーエルサイエンス）が先端に付けられた４００ｍｍのテフロン（登録商標）チューブ（1/16”×0.5 mm）に繋ぎ、キャピラリー側をジョイントに接続した。ジョイントには、長さを調節したテフロン（登録商標）チューブ（1/16”×1.0 mm、ジーエルサイエンス）をさらに接続し、末端をナスフラスコに繋いだ。このナスフラスコにＣ末端側がＢｚｌ化されたグリシン（H-Gly-OBzl・Tos-OH、ＭＷ＝３３７．３９、ペプチド研究所）７．５mmol（２．５３ｇ）と、ＮＭＭ７．５mmol（８２５μＬ）を溶解させたＴＨＦ溶液５ｍＬとを加えた。

ナスフラスコ内の溶液を氷冷下で撹拌しながら、５００μＬ／分の流速に設定されたシリンジポンプ（kdScientific）を用いて、Boc-Hyp(Bzl)-OH溶液及びＩＢＣＦ溶液を５℃の環境温度で、それぞれテフロン（登録商標）チューブ内を流通させた。１時間後にナスフラスコを氷浴から外して室温に戻し、さらにナスフラスコ内の溶液を１時間撹拌した。

得られたＴＨＦ溶液をエバポレータで減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチル（和光純薬）に再溶解させ、蒸留水で１回洗浄を行った。酢酸エチル層に硫酸マグネシウム（和光純薬、無水硫酸マグネシウム）３ｇを添加して、１時間乾燥した。硫酸マグネシウムをろ過にて取り除き、酢酸エチル溶液をエバポレータで減圧濃縮してから、真空ポンプで真空乾燥を行い、ヒドロキシプロリン・グリシンペプチド（Boc-Hyp(Bzl)-Gly-OBzl、ＭＷ＝４６８．５４）を３．３ｇを得た。収率は９４％であった。

〔実施例２〕
混合酸無水物調製にＮ末端側がＢｏｃ化されたプロリン（Boc-Pro、ＭＷ＝２１５．２）を使用した以外は実施例１と同様の操作を行い、プロリン・グリシンのジペプチド（Boc-Pro-Gly-OBzl、ＭＷ＝３６２．４）を２．５ｇ得た。収率は９２％であった。

〔実施例３〕
アシル化を受ける試薬としてカルボキシル基をベンジル化したプロリンのトルエンスルホン酸塩（H-Pro-OBzl・Tos、ＭＷ＝３６０．５）を使用した以外は実施例１と同様の試薬を用いて、同様の操作を行い、Boc-Pro-Pro-OBzl（ＭＷ＝４０２．５）を２．７ｇ得た。収率は９１％であった。

〔実施例４〕
アシル化を受ける試薬としてベンジルアルコール（ＭＷ＝１０８．１）を使用した以外は実施例１と同様の試薬を用いて、同様の操作を行い、Boc-Pro-OBzl（ＭＷ＝３０５．４）を２．１ｇ得た。収率は９１％であった。

〔実施例５〕
実施例１で使用した反応系に、更にジョイントを連結し、そのジョイントに１０ｍのＰＴＦＥ製マイクロキャピラリー（1/16”×1.0 mm）を連結した。つまり、２つのジョイントにより２段に連結された反応系を作製した。この反応系を用いて、実施例１で用いた試薬を、各導入孔から実施例１で用いたシリンジポンプを用い送液し、０℃にて反応を行った。その結果、Boc-Hyp(Bzl)-Gly-OBzlを３．２ｇ得た。収率は９０％であった。

いずれの実施例においても、従来における反応の環境温度である−２０℃より高い環境温度で混合酸無水物の生成を行うことができた。また、フラスコ内で混合酸無水物を生成してペプチド合成する従来の手法における収率が約７０％程度であることから、いずれの実施例においても、従来より高い収率で目的物を得ることができた。

図１は、ジョイント１０の構成を示す概略図である。

符号の説明

１０・・・ジョイント

Claims (7)

1. カルボン酸類及びアミンを含む第１溶液と、ハロゲン化物を含む第２溶液とを反応させて混合酸無水物を製造する方法であって、
   第１溶液を第１微小流路に流通させる第１ステップと、
   第２溶液を第２微小流路に流通させる第２ステップと、
   第１微小流路から流出された第１溶液と第２微小流路から流出された第２溶液とを接触させながら第３微小流路に流通させて混合酸無水物を生成する第３ステップと、を含む混合酸無水物の製造方法。
2. 上記第３微小流路において、第１溶液と第２溶液とを層流とする請求項１に記載の混合酸無水物の製造方法。
3. 上記第３微小流路において、第１溶液と第２溶液との界面を第３微小流路の壁面と非接触とする請求項２に記載の混合酸無水物の製造方法。
4. 上記第１微小流路、上記第２微小流路、及び上記第３微小流路における流路方向と直交する断面の最大寸法が、それぞれ１０μｍ〜２ｍｍである請求項１から３のいずれかに記載の混合酸無水物の製造方法。
5. 上記第１流路における第１溶液の流量、及び上記第２流路における第２溶液の流量が、それぞれ毎分１０μＬ〜１０ｍＬである請求項１から４のいずれかに記載の混合酸無水物の製造方法。
6. 上記第１溶液におけるカルボン酸類の濃度、及び上記第２溶液におけるハロゲン化物の濃度が、それぞれ０．０５〜２ｍｏｌ／Ｌである請求項１から５のいずれかに記載の混合酸無水物の製造方法。
7. 請求項１から６のいずれかに記載の混合酸無水物の製造方法により得られた混合酸無水物とアミン類とを第４微小流路に流通させてアシル化反応を行うアシル化方法。

Images