JP2008247818A - Micro rna controlling duplication of hepatitis c virus - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide treatment or prophylaxis of C-type chronic hepatitis excellent in effect and having high safety. <P>SOLUTION: A therapeutic or prophylactic pharmaceutical composition of C-type chronic hepatitis comprises a micro RNA controlling duplication of hepatitis C virus (HCV). The micro RNA comprises, particularly, miR-199a<SP>*</SP>, miR-182 or miR-136 or its mutant. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、Ｃ型慢性肝炎の治療または予防に関する。詳細には、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製を抑制するマイクロＲＮＡを用いるＣ型慢性肝炎の治療または予防に関する。   The present invention relates to the treatment or prevention of chronic hepatitis C. Specifically, the present invention relates to the treatment or prevention of chronic hepatitis C using microRNAs that suppress hepatitis C virus (HCV) replication.

Ｃ型慢性肝炎の治療はインターフェロンとリバビリン併用療法が標準的であるが、日本人に多く見られるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の遺伝子型１ｂの高ウイルス量である患者ではこの治療の奏効率は３０−４０％程度に落ち込むため、再発や長期にわたる炎症の結果発癌するなどの問題が発生している。またインターフェロンは多様な副作用があり、６５歳以上の高齢者に投与する場合には注意が必要となっている。そのためＣ型慢性肝炎の治療に現在タンパク分解酵素阻害剤や免疫抑制剤などが新たな治療法として候補に挙がっているが臨床治験の段階であり、予想される効果からこれらの薬剤単独で使用されず、インターフェロンと併用になる。そのため副作用の少ない薬剤の開発が望まれている。   Interferon and ribavirin combination therapy is standard for the treatment of chronic hepatitis C. In patients with high viral load of genotype 1b of hepatitis C virus (HCV), which is common in Japanese, the response rate of this treatment is Since it drops to about 30-40%, there are problems such as carcinogenesis as a result of recurrence and long-term inflammation. Interferon has various side effects, and caution is required when it is administered to elderly people over 65 years old. Therefore, proteolytic enzyme inhibitors and immunosuppressive agents are currently candidates for the treatment of chronic hepatitis C, but they are in clinical trials and are used alone because of their expected effects. First, it is used in combination with interferon. Therefore, development of a drug with few side effects is desired.

近年、ＲＮＡ干渉の技術を利用してＨＣＶに相補的な塩基配列を持ったｓｉＲＮＡを作成し、これを用いてＨＣＶの複製の抑制が試みられている（非特許文献１等参照）。しかしながらｓｉＲＮＡは外来遺伝子であるため、治療に利用した場合の安全性に問題がある。
Wang Y et al. GASTROENTEROLOGY 2006; 130:883-892 In recent years, siRNA having a base sequence complementary to HCV has been prepared using the technology of RNA interference, and attempts have been made to suppress replication of HCV using this (see Non-Patent Document 1, etc.). However, since siRNA is a foreign gene, there is a problem in safety when used for treatment.
Wang Y et al. GASTROENTEROLOGY 2006; 130: 883-892

効果が優れ、しかも安全性の高いＣ型慢性肝炎の治療または予防を提供することが本発明の課題であった。   It was an object of the present invention to provide treatment or prevention of chronic hepatitis C with excellent effects and high safety.

本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、ＨＣＶをターゲットとするマイクロＲＮＡを用いることにより、効率的にＨＣＶの複製を抑制でき、さらにＨＣＶ感染も抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。   The inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above-mentioned problems, and found that by using microRNA targeting HCV, it is possible to efficiently suppress HCV replication and further suppress HCV infection. It came to complete.

すなわち、本発明は、
（１）Ｃ型肝炎ウイルスの複製を抑制するマイクロＲＮＡを含む、Ｃ型慢性肝炎の治療または予防用医薬組成物；ならびに
（２）マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１３６、ならびにそれらの変異体からなる群から選択される１種またはそれ以上のものである、（１）記載の医薬組成物
を提供するものである。 That is, the present invention
(1) A pharmaceutical composition for treating or preventing chronic hepatitis C, comprising microRNA that suppresses replication of hepatitis C virus; and (2) microRNA is miR-199a * , miR-182, miR-136. And a pharmaceutical composition according to (1), which is one or more selected from the group consisting of variants thereof.

本発明によれば、マイクロＲＮＡを用いて効率的にＨＣＶの複製を抑制でき、さらにＨＣＶ感染も抑制できるので、効果が優れ、しかも安全性の高いＣ型慢性肝炎の治療または予防を行うことができる。   According to the present invention, HCV replication can be efficiently suppressed using microRNA, and further, HCV infection can also be suppressed. Therefore, it is possible to treat or prevent chronic hepatitis C with excellent effects and high safety. it can.

マイクロＲＮＡはｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡ干渉の機構により作用するものである。しかし、ｓｉＲＮＡは外来遺伝子であるため、安全性に問題が残る。一方、マイクロＲＮＡは内因性であるため、それが由来する生物に投与した場合に安全性が高いと考えられる。種々の疾病の原因となる遺伝子に対して、アンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡを用いてその複製を抑制することにより、疾病を治療または予防する試みは多くある。しかしながら、マイクロＲＮＡを用いてＨＣＶの複製を抑制することにより、Ｃ型慢性肝炎を治療または予防することは、本発明により初めてなされたことである。   Similar to siRNA, microRNA acts by the mechanism of RNA interference. However, since siRNA is a foreign gene, a problem remains in safety. On the other hand, since microRNA is endogenous, it is considered to be highly safe when administered to the organism from which it is derived. There are many attempts to treat or prevent diseases by suppressing the replication of genes causing various diseases using antisense oligonucleotides or siRNAs. However, treatment or prevention of chronic hepatitis C by suppressing HCV replication using microRNA is the first to be accomplished by the present invention.

付言するが、マイクロＲＮＡのＨＣＶに対する作用としては、本発明のマイクロＲＮＡのＨＣＶ以外のものについてＨＣＶ増殖促進作用が知られていたが（ＷＯ２００５／１０７８１６；Science, 309, 1577 (2005)）、マイクロＲＮＡのＨＣＶ複製抑制作用については全く知られていなかった。   In addition, as the action of microRNA on HCV, the microRNA of the present invention other than HCV has been known to promote HCV proliferation (WO 2005/107816; Science, 309, 1577 (2005)). The inhibitory effect of RNA on HCV replication was not known at all.

かくして、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を抑制するマイクロＲＮＡを含む、Ｃ型慢性肝炎の治療または予防用医薬組成物を提供するものである。   Thus, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing chronic hepatitis C, comprising microRNA that suppresses replication of hepatitis C virus.

本発明の医薬組成物により治療または予防可能なＨＣＶはヒトＨＣＶ（本明細書において、単に「ＨＣＶ」という）であり、その遺伝子型は、マイクロＲＮＡがターゲットとする配列が類似のものであれば、いずれの遺伝子型であってもよい。好ましい遺伝子型は１ｂおよび２ａである。   HCV that can be treated or prevented by the pharmaceutical composition of the present invention is human HCV (herein simply referred to as “HCV”), and its genotype is similar to the sequence targeted by the microRNA. Any genotype may be used. Preferred genotypes are 1b and 2a.

本発明の医薬組成物の有効成分として用いられるマイクロＲＮＡは、ＨＣＶ中のヌクレオチド配列をターゲットとし、ＨＣＶの複製を抑制するものであればいずれのマイクロＲＮＡであってもよい。本発明者らは、かかるマイクロＲＮＡのうち好ましいものとしてｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１３６を見出した。 The microRNA used as the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention may be any microRNA that targets the nucleotide sequence in HCV and suppresses HCV replication. The present inventors have found miR-199a * , miR-182 and miR-136 as preferred among such microRNAs.

ｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１８２、およびｍｉＲ−１３６のヌクレオチド配列は公知であり、それぞれ、ＵＡＣＡＧＵＡＧＵＣＵＧＣＡＣＡＵＵＧＧＵＵ（配列番号：１）、ＵＵＵＧＧＣＡＡＵＧＧＵＡＧＡＡＣＵＣＡＣＡ（配列番号：２）、およびＡＣＵＣＣＡＵＵＵＧＵＵＵＵＧＡＵＧＡＵＧＧＡ（配列番号：３）である。 The nucleotide sequences of miR-199a * , miR-182, and miR-136 are known and are UACAGUAUGUCUGCACAUGUGUU (SEQ ID NO: 1), UUUGGCAUUGGUAGAACUCACA (SEQ ID NO: 2), and ACUCCAUUUGUUUGAUGAUGAGAUGAGAUGAGAUGAGAUGAGAUGAGAUGAGAUGA

参考のため、これら３つのマイクロＲＮＡのＨＣＶ中のターゲット部位を図１に示す。後述する実施例では、ＨＣＶの複製を観察できるレプリコン細胞としてＨＣＶの遺伝子型１ｂ型のＣｏｎ１、ならびに遺伝子型２ａ型のＪＦＨ１を用いた。Ｃｏｎ１では、そのinternal ribosomal entry site (IRES)領域の５’ＵＴＲ中、ＮＳ５領域中およびＮＳ３領域中にそれぞれｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１３６のターゲット部位があり、ＪＦＨ１においても同様である。 For reference, the target sites in HCV of these three microRNAs are shown in FIG. In Examples described later, HCV genotype 1b type Con1 and genotype 2a type JFH1 were used as replicon cells capable of observing HCV replication. Con1 has miR-199a * , miR-182 and miR-136 target sites in the 5′UTR, NS5 region, and NS3 region of its internal ribosomal entry site (IRES) region, respectively, and the same applies to JFH1. is there.

さらに本発明者らは、これらのマイクロＲＮＡの変異体についてもＨＣＶ複製抑制効果を認めた。したがって、本発明の医薬組成物において、有効成分たるマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１３６、ならびにそれらの変異体のいずれかであってもよい。本発明の医薬組成物において、ＨＣＶの複製を抑制するマイクロＲＮＡまたはその変異体を１種だけ用いてもよく、２種以上用いてもよい。 Furthermore, the present inventors have recognized the effect of inhibiting HCV replication for these microRNA mutants. Therefore, in the pharmaceutical composition of the present invention, the microRNA as an active ingredient may be any of miR-199a * , miR-182, miR-136, and variants thereof. In the pharmaceutical composition of the present invention, only one kind of microRNA or its variant that suppresses HCV replication may be used, or two or more kinds thereof may be used.

本発明のマイクロＲＮＡの変異体とは、本来のマイクロＲＮＡと比較して、数個まで、例えば７個まで、６個まで、好ましくは５個まで、４個まで、さらに好ましくは３個まで、２個まで、あるいは１個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されたＲＮＡであって、ＨＣＶ複製抑制作用のあるものをいう。   The variants of the microRNA of the present invention are up to several, for example, up to 7, up to 6, preferably up to 5, up to 4, more preferably up to 3, compared to the original microRNA. RNA having up to 2, or 1 nucleotide substitutions, deletions, insertions or additions and having HCV replication inhibitory activity.

本発明の医薬組成物は、通常の製薬に用いられる方法により、種々の剤形として製造することができる。本発明の医薬組成物の好ましい剤形は液体であり、注射または輸液可能な剤形が特に好ましい。液体の本発明の医薬組成物を製造するには、担体として、例えば注射用水、生理食塩水、リンゲル液などの公知の液体担体を用いることができる。マイクロＲＮＡをそのまま、あるいは適当なベクターに挿入したものを、液体担体に溶解あるいは懸濁することにより液体の本発明の医薬組成物を得ることができるが、これらの担体に限定されない。マイクロＲＮＡを挿入することのできるベクターとしては、pSilencer H1-puro（applied biosystem社）、BLOCK-iTTMPol II miR RNAi Expression Vector（Invitrogen社）などが挙げられるが、これらのベクターに限定されない。マイクロＲＮＡをベクターに挿入して細胞や組織に導入する方法は当業者に公知である。また例えば、肝細胞特異的に発現しているタンパクのレセプターを利用して臓器特異的に投与することもできる。具体的には、あるタンパクの抗原提示部分をマイクロＲＮＡに付加しておき、レセプターがそのタンパクを細胞に取り込むことを利用して、肝細胞特異的にマイクロＲＮＡを投与することができる。しかし、マイクロＲＮＡの投与方法はこれらの方法に限定されない。本発明の医薬組成物を投与するには、上記のような方法のほか、肝臓付近への注射、静脈注射、輸液などにより行うことができるが、これらの方法に限定されない。マイクロＲＮＡの投与量は、治療あるいは予防すべきＣ型慢性肝炎の重さ、ＨＣＶの種類（遺伝子型など）、対象の健康状態、年齢、体重などの種々の要因に応じて調節することができる。投与頻度も上記のごとき種々の要因に応じて変更することができ、例えば、１日１回〜数回、あるいは数日に１回投与してもよい。 The pharmaceutical composition of the present invention can be produced as various dosage forms by a method used in ordinary pharmacy. A preferred dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is a liquid, and an injectable or infusible dosage form is particularly preferred. For producing the liquid pharmaceutical composition of the present invention, a known liquid carrier such as water for injection, physiological saline, Ringer's solution and the like can be used as the carrier. A liquid pharmaceutical composition of the present invention can be obtained by dissolving or suspending a microRNA as it is or inserted into an appropriate vector in a liquid carrier, but is not limited to these carriers. Examples of a vector into which microRNA can be inserted include pSilencer H1-puro (applied biosystem), BLOCK-iT ™ Pol II miR RNAi Expression Vector (Invitrogen), and the like, but are not limited thereto. Methods for inserting microRNA into a vector and introducing it into a cell or tissue are known to those skilled in the art. In addition, for example, it can be administered in an organ-specific manner using a receptor for a protein expressed specifically in a hepatocyte. Specifically, the microRNA can be administered in a hepatocyte-specific manner by utilizing the fact that an antigen-presenting portion of a certain protein is added to the microRNA and the receptor takes the protein into the cell. However, the administration method of microRNA is not limited to these methods. In addition to the methods described above, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by injection near the liver, intravenous injection, infusion, etc., but is not limited to these methods. The dose of microRNA can be adjusted according to various factors such as the weight of chronic hepatitis C to be treated or prevented, the type of HCV (genotype, etc.), the health condition, age, and weight of the subject. . The administration frequency can also be changed according to various factors as described above. For example, the administration frequency may be once to several times a day or once every several days.

本発明の医薬組成物は、インターフェロンやリバビリンなどの他のＨＣＶ治療剤とともに用いられてもよい。   The pharmaceutical composition of the present invention may be used together with other HCV therapeutic agents such as interferon and ribavirin.

さらに本発明は、Ｃ型慢性肝炎の治療または予防方法であって、ＨＣＶの複製を抑制するマイクロＲＮＡまたはその変異体を対象に投与することを特徴とする方法を提供する。ＨＣＶの複製を抑制するマイクロＲＮＡまたはその変異体、ならびに投与量などについては上述のとおりである。   Furthermore, the present invention provides a method for treating or preventing chronic hepatitis C, comprising administering to a subject a microRNA that suppresses HCV replication or a variant thereof. The microRNA that suppresses replication of HCV or a mutant thereof, and the dosage are as described above.

さらに本発明は、Ｃ型慢性肝炎の治療または予防のための医薬を製造するための、ＨＣＶの複製を抑制するマイクロＲＮＡまたはその変異体の使用を提供する。   Furthermore, the present invention provides the use of a microRNA that suppresses HCV replication or a variant thereof for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of chronic hepatitis C.

以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。   The present invention will be described in more detail and specifically below with reference to examples, but the examples are not intended to limit the present invention.

遺伝子型１ｂのＨＣＶの複製を観察できるレプリコン細胞Ｃｏｎ１、および遺伝子型２ａのＨＣＶの複製を観察できるレプリコン細胞ＪＦＨ１に、それぞれのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１９９ａ＊）を発現ベクター（pSilencer H1-puro）を用いて過剰発現させ、マイクロＲＮＡの発現を変化させないコントロールベクターを導入したものとＨＣＶ ＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲを用いて比較した。結果を図２に示す。いずれの遺伝子型でも、マイクロＲＮＡを過剰発現させるとレプリコンの量が減少し、ｍｉＲ−１３６およびｍｉＲ−１９９ａ＊を用いた場合にレプリコンの量の減少が顕著であった。これらの結果より、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１９９ａ＊はＨＣＶの複製を抑制することがわかった。 Expression of respective microRNAs (miR-136, miR-182 and miR-199a * ) in the replicon cell Con1, which can observe HCV replication of genotype 1b, and the replicon cell JFH1, which can observe HCV replication of genotype 2a The amount of HCV RNA was compared with that introduced with a control vector that was overexpressed using a vector (pSilencer H1-puro) and did not change the expression of microRNA, using real-time PCR. The results are shown in FIG. In all genotypes, the amount of replicon decreased when microRNA was overexpressed, and the amount of replicon decreased significantly when miR-136 and miR-199a * were used. From these results, it was found that miR-136, miR-182 and miR-199a * inhibit HCV replication.

マイクロＲＮＡの機能を特異的に抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いて、レプリコンの減少がマイクロＲＮＡの発現に起因しているかどうかを検証した。図３に結果を示す。ｍｉＲ−１９９ａ＊を特異的に機能抑制するＡＳＯ ｍｉＲ−１９９ａ＊（ＡＡＣＣＡＡＵＧＵＧＣＡＧＡＣＵＡＣＵＧＵＡ、配列番号：４、すべての塩基の２’−Ｏをメチル化）、およびｍｉＲ−１３６を特異的に機能抑制するＡＳＯ ｍｉＲ−１３６（ＵＣＣＡＵＣＡＵＣＡＡＡＡＣＡＡＡＵＧＧＡＧＵ、配列番号：５、すべての塩基の２’−Ｏをメチル化）を導入すると、遺伝子型１ｂの細胞ではレプリコンは減少しなかった。遺伝子型２ａの細胞にＡＳＯ ｍｉＲ−１９９ａ＊を導入した場合にはレプリコンの減少が若干抑制された。これらの結果から、レプリコンの減少がマイクロＲＮＡの発現に起因していることがわかった。 Antisense oligonucleotide (ASO) that specifically suppresses the function of microRNA was used to verify whether the decrease in replicon was caused by the expression of microRNA. The results are shown in FIG. ASO miR-199a * that specifically suppresses miR-199a * (AACCAAUUGUGCAGACUACUGUA, SEQ ID NO: 4, methylation of 2′-O of all bases), and ASO miR that specifically suppresses miR-136 When -136 (UCCAUCAUCAAAAACAAUGGAGU, SEQ ID NO: 5, methylation of 2′-O of all bases) was introduced, the replicon was not decreased in genotype 1b cells. When ASO miR-199a * was introduced into cells of genotype 2a, the decrease in replicon was somewhat suppressed. From these results, it was found that the reduction in replicon was caused by the expression of microRNA.

マイクロＲＮＡは単一のマイクロＲＮＡで多数の遺伝子を制御する可能性がある。今回のレプリコンが減少した事はマイクロＲＮＡが直接レプリコンと結合してレプリコンを減少させたものか、別の遺伝子を活性化しその結果レプリコンを減少させたのかを検証するために、レプリコンの塩基配列に変異を作成しマイクロＲＮＡがレプリコン上のターゲット配列を認識できなくするようにし、それをルシフェラーゼに結合させたものを作成した。図４に示すようにＨＣＶのｍｉＲ−１９９ａ＊のターゲット領域のセンス鎖の３’側を２個または４個変異させた（上段の配列の−で示す部分）。変異配列（４１）の場合には野生型３’末端のｇｔをａｃに変異させ、変異配列（５１）の場合には野生型３’末端のｃｔｇｔをｔｇａｃに変異させた。 MicroRNAs can control multiple genes with a single microRNA. In order to verify whether the microRNA was directly bound to the replicon and reduced the replicon, or activated another gene and consequently reduced the replicon, the base sequence of the replicon was reduced. A mutation was made to prevent the microRNA from recognizing the target sequence on the replicon, and it was conjugated to luciferase. As shown in FIG. 4, 2 or 4 mutations were made on the 3 ′ side of the sense strand of the target region of miR-199a * of HCV (the portion indicated by − in the upper sequence). In the case of the mutant sequence (41), gt at the wild type 3 ′ end was mutated to ac, and in the case of the mutant sequence (51), ctgt at the wild type 3 ′ end was mutated to tgac.

結果を図４に示す。野生株の場合ｍｉＲ−１９９ａ＊を過剰発現するとレプリコン上のターゲット配列を認識しレプリコンの活性が低下し、その結果ルシフェラーゼ活性がコントロールベクターを導入したものに比較して低下した。ターゲット領域を変異させたものはマイクロＲＮＡがターゲット領域を認識しないためにルシフェラーゼ活性は低下しないか、少ししか低下しなかった。したがって、個々のマイクロＲＮＡは直接レプリコンと結合してレプリコンを減少させたことがわかった。 The results are shown in FIG. In the case of the wild type, when miR-199a * was overexpressed, the target sequence on the replicon was recognized and the replicon activity was reduced. In the case where the target region was mutated, the microRNA did not recognize the target region, so that the luciferase activity did not decrease or only slightly decreased. Thus, it was found that individual microRNAs directly bound to the replicon and reduced the replicon.

本発明のマイクロＲＮＡの変異体（図５）を作成し、それらがＨＣＶの複製を抑制するかどうかを調べた。ｍｉＲ−１３６の変異体は３塩基変異のｍｉＲ−１３６ ｍ１（ＡＧＡＧＧＵＵＵＵＧＵＵＵＵＧＡＵＧＡＴＴ、配列番号：６）および５塩基変異のｍｉＲ−１３６ ｍ２（ＡＧＡＧＣＡＵＵＵＧＵＵＵＵＧＡＵＧＡＴＴ、配列番号：７）であり、ｍｉＲ−１９９ａ＊の変異体は３塩基変異のｍｉＲ−１９９ａ＊ ｍ１（ＵＵＧＵＣＡＡＧＵＣＵＧＣＡＣＡＵＵＧＴＴ、配列番号：８）および５塩基変異のｍｉＲ−１９９ａ＊ ｍ２（ＵＵＧＵＧＵＡＧＵＣＵＧＣＡＣＡＵＵＧＴＴ、配列番号：９）であった。これらの変異体の末尾にＴＴが付加されているが、塩基の安定性を考慮したものである。 Mutants of the microRNA of the present invention (FIG. 5) were prepared and examined whether they suppressed HCV replication. The mutants of miR-136 are the three-base mutation miR-136 m1 (AGAGGUUUUGUUUGAUGUTT, SEQ ID NO: 6) and the five-base mutation miR-136 m2 (AGAGCAUUGUUUUGAUGUTT, SEQ ID NO: 7), and the mutant of miR-199a * Were three base mutations miR-199a * m1 (UUGUCAAGUCUGCACAUGUGTT, SEQ ID NO: 8) and five base mutations miR-199a * m2 (UUGUGUAGUUCUGCACAUUGTT, SEQ ID NO: 9). TT is added to the end of these mutants, taking into account the stability of the base.

結果を図６に示す。ｍｉＲ−１３６ ｍ１およびｍｉＲ−１３６ ｍ２は、いずれの遺伝子型のＨＣＶにおいてもその複製を抑制した。ｍｉＲ−１９９ａ＊ ｍ１およびｍｉＲ−１９９ａ＊ ｍ２は遺伝子型２ａのＨＣＶにおいてその複製を抑制したが、遺伝子型１ｂのＨＣＶにおいては複製を有意に抑制しなかった。またこれらの領域はウイルスの複製に重要で遺伝子型を超えて保存されている部位なため、この領域を標的として遺伝子療法を行った場合、耐性株が発生する可能性は低いと予想される。 The results are shown in FIG. miR-136 m1 and miR-136 m2 suppressed their replication in any genotype of HCV. miR-199a * m1 and miR-199a * m2 suppressed replication in genotype 2a HCV, but did not significantly suppress replication in genotype 1b HCV. In addition, since these regions are important for virus replication and are conserved across genotypes, it is expected that resistant strains are unlikely to occur when gene therapy is performed targeting this region.

不死化した肝細胞ＨｕＳ／Ｅ２（Hussein H. Aly., et al. Journal of Hepatology (2007) Vol 46, 26-36参照）を用いて、ＨＣＶを含んだヒト血清を用いて感染実験を行なった。非特異的マイクロＲＮＡとしてはapplied biosystemsのSilencer（登録商標）Negative Control #1 siRNA No.4611を用いた。あらかじめｍｉＲ−１９９ａ＊を過剰発現させておくと遺伝子型１ｂ、２ａ両者とも感染抑制効果が得られた。あらかじめｍｉＲ−１３６を過剰発現させておいた場合にも、遺伝子型１ｂ、２ａ両者とも感染抑制効果が得られた。結果を図７に示す。これらの結果から、ｍｉＲ−１９９ａ＊にはＨＣＶ感染予防効果があることがわかった。 Using immortalized hepatocytes HuS / E2 (see Hussein H. Aly., Et al. Journal of Hepatology (2007) Vol 46, 26-36), infection experiments were performed using human serum containing HCV. . Silencer (registered trademark) Negative Control # 1 siRNA No.4611 from applied biosystems was used as non-specific microRNA. When miR-199a * was overexpressed in advance, infection suppression effect was obtained for both genotypes 1b and 2a. Even when miR-136 was overexpressed in advance, both genotypes 1b and 2a were effective in inhibiting infection. The results are shown in FIG. From these results, it was found that miR-199a * has an effect of preventing HCV infection.

本発明は、医薬品の分野、特にＣ型慢性肝炎の治療または予防用の医薬品の分野、ならびに医学・薬学の研究分野等に幅広く利用することができる。   The present invention can be widely used in the field of pharmaceuticals, in particular, in the field of pharmaceuticals for the treatment or prevention of chronic hepatitis C, and in the field of medical / pharmaceutical research.

図１は、ＨＣＶの複製を観察できるレプリコン細胞の構造と、レプリコン細胞の塩基配列のマイクロＲＮＡのターゲット領域を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing the structure of a replicon cell in which HCV replication can be observed and the target region of a microRNA of the base sequence of the replicon cell. 図２は、遺伝子型１ｂおよび２ａのＨＣＶに対するｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１９９ａ＊の複製抑制効果を調べた結果を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the results of examining the replication inhibitory effect of miR-136, miR-182 and miR-199a * on HCV genotypes 1b and 2a. 図３は、マイクロＲＮＡの機能を特異的に抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いて、レプリコンの減少がマイクロＲＮＡの発現に起因しているかどうかを調べた結果を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing the results of examining whether or not the decrease in replicon is caused by the expression of microRNA, using an antisense oligonucleotide (ASO) that specifically suppresses the function of microRNA. 図４は、ｍｉＲ−１９９ａ＊が直接ターゲット領域に作用してＨＣＶの複製を抑制するかどうかを調べた結果を示す図である。４１および５１は変異させたターゲット領域を示す。FIG. 4 shows the results of examining whether miR-199a * acts directly on the target region to suppress HCV replication. 41 and 51 show the mutated target regions. 図５は、本発明の変異マイクロＲＮＡの配列を示す図である。FIG. 5 shows the sequence of the mutant microRNA of the present invention. 図６は、本発明の変異マイクロＲＮＡのＨＣＶ複製抑制効果を調べた結果を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing the results of examining the HCV replication inhibitory effect of the mutant microRNA of the present invention. 図７は、不死化肝細胞における本発明のマイクロＲＮＡのｄｅ ｎｏｖｏ感染抑制効果を調べた結果を示す図である。FIG. 7 shows the results of examining the de novo infection inhibitory effect of the microRNA of the present invention on immortalized hepatocytes.

Claims (2)

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製を抑制するマイクロＲＮＡを含む、Ｃ型慢性肝炎の治療または予防用医薬組成物。   A pharmaceutical composition for treating or preventing chronic hepatitis C, comprising microRNA that suppresses replication of hepatitis C virus (HCV). マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１３６、ならびにそれらの変異体からなる群から選択される１種またはそれ以上のものである、請求項１記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the microRNA is one or more selected from the group consisting of miR-199a * , miR-182, miR-136, and variants thereof.
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