JP2008245526A - Method for reinforcing expression of gene participating in saponin biosynthesis system by irradiation of light - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To improve a saponin-producing ability of a plant. <P>SOLUTION: This method for promoting the expression of the squalene epoxidase gene of a plant comprises irradiating the plant with light containing a wavelength component in a wavelength region of 435 to 480 nm. Thus, a reaction for converting squalene into 2,3-oxidosqualene with squalene epoxidase can be promoted to efficiently produce the metabolite of the 2,3-oxidosqualene, such as saponin. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、植物に光を照射することを含む、サポニン生合成系に関与する遺伝子の発現を増強する方法、サポニン生合成系の中間生成物である2,3-オキシドスクアレンまたはその代謝物の生産能を向上させる方法、2,3-オキシドスクアレンまたはその代謝物の製造方法などに関する。   The present invention relates to a method for enhancing the expression of a gene involved in the saponin biosynthesis system, including irradiating light to a plant, 2,3-oxidesqualene, which is an intermediate product of the saponin biosynthesis system, or a metabolite thereof. The present invention relates to a method for improving productivity and a method for producing 2,3-oxidesqualene or a metabolite thereof.

植物は太陽光のエネルギーを利用して光合成を行い、これによって合成された炭素骨格から多種多様な物質を生産し、それらを人類は活用している。太陽光のうち、特定の波長の光（400~700 nm）が光合成に利用される。光合成に利用される光は主として葉緑体中の光合成色素（クロロフィル）により吸収されるが、過剰の光は植物にとって有害である。この種の光障害を緩和するために、緑葉中に光を吸収する別の色素を蓄積することが知られている。   Plants use the energy of sunlight to perform photosynthesis and produce a wide variety of substances from the synthesized carbon skeleton, which are used by mankind. Among sunlight, light with a specific wavelength (400 to 700 nm) is used for photosynthesis. The light used for photosynthesis is absorbed primarily by photosynthetic pigments (chlorophylls) in the chloroplast, but excess light is harmful to plants. In order to alleviate this type of light damage, it is known to accumulate other pigments that absorb light in the green leaves.

サポニンは、多種類の植物に見いだされている配糖体の一種であり、去痰作用、抗炎症作用などを有することが知られている。サポニンは、その構造から、ステロイドサポニンとトリテルペノイドサポニンとに大別される。トリテルペノイドサポニンは、植物において、メバロンサンを原料として、スクアレン、2,3-オキシドスクアレン、トリテルペンを経る生合成経路により合成されることが知られている。この生合成経路において、スクアレンを2,3-オキシドスクアレンに変換する反応が律速段階だと考えられている（非特許文献１：Ikuro Abe, Tsuyoshi Abe, Weiwei Lou, Takayoshi Masuoka, Hiroshi Noguchi, Biochemical and Biophysical Research Communications 352 (2007) 259-263）。このスクアレンを2,3-オキシドスクアレンに変換する反応には、スクアレンエポキシダーゼが関与していることが知られている（非特許文献１）。
Ikuro Abe, Tsuyoshi Abe, Weiwei Lou, Takayoshi Masuoka, Hiroshi Noguchi, Biochemical and Biophysical Research Communications 352 (2007) 259-263 Saponin is a kind of glycoside found in many types of plants, and is known to have expectorant action, anti-inflammatory action, and the like. Saponins are roughly classified into steroid saponins and triterpenoid saponins according to their structures. Triterpenoid saponins are known to be synthesized in plants by biosynthetic pathways using squalene, 2,3-oxidesqualene, and triterpenes using mevalonsan as a raw material. In this biosynthetic pathway, the reaction to convert squalene to 2,3-oxide squalene is considered to be the rate-limiting step (Non-patent document 1: Ikuro Abe, Tsuyoshi Abe, Weiwei Lou, Takayoshi Masuoka, Hiroshi Noguchi, Biochemical and Biophysical Research Communications 352 (2007) 259-263). It is known that squalene epoxidase is involved in the reaction for converting squalene to 2,3-oxide squalene (Non-patent Document 1).
Ikuro Abe, Tsuyoshi Abe, Weiwei Lou, Takayoshi Masuoka, Hiroshi Noguchi, Biochemical and Biophysical Research Communications 352 (2007) 259-263

上記状況において、植物から抽出したサポニンを単離・精製することによりサポニンを製造する方法は広く行われているが、植物に含まれるサポニンは微量であるため、大量の植物が必要であるという問題があった。そこで、植物のサポニン生成能を向上させる方法が強く望まれていた。   In the above situation, a method for producing saponin by isolating and purifying saponin extracted from a plant is widely used. However, since the amount of saponin contained in the plant is very small, a large amount of plant is necessary. was there. Therefore, a method for improving the saponin production ability of plants has been strongly desired.

本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、植物に光を照射することにより、植物のスクアレンエポキシダーゼ遺伝子の発現が促進されることを見出した。本発明者らは、この知見に基づいて、さらに検討を行い、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
（１） 植物に光を照射することを含む、植物のスクアレンエポキシダーゼ遺伝子の発現促進方法；
（２） 光が、435nm〜480nmの波長領域内の波長成分を含む、上記（１）記載の方法；
（３） 435nm〜480nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である、上記（２）記載の方法；
（４） 480nm〜3000nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、1μmol m-2s-1以下であり、200nm〜435nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、1μmol m-2s-1以下である、上記（３）記載の方法；
（５） 光が、445nm〜455nmの波長領域内の波長成分を含む、上記（１）記載の方法；
（６） 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である、上記（５）記載の方法；
（７） 455nm〜3000nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、10μmol m-2s-1以下であり、200nm〜445nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、10μmol m-2s-1以下である、上記（６）記載の方法；
（８） 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜200μmol m-2s-1の範囲内であり、光の照射時間が1日以上である、上記（６）または（７）記載の方法；
（９） 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、200μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内であり、光の照射時間が1時間〜14日である、上記（６）または（７）記載の方法；
（１０） スクアレンエポキシダーゼ遺伝子が、以下の（a）〜（f）からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法：
（a）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（b）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（e）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（f）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１１） スクアレンエポキシダーゼ遺伝子が、配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、上記（１０）記載の方法；
（１２） 植物が、双子葉植物綱の植物である、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法；
（１３） 植物に光を照射することを含む、2,3-オキシドスクアレンまたはその代謝物の製造方法；
（１４） 2,3-オキシドスクアレンの製造方法である上記（１３）記載の製造方法；
（１５） 2,3-オキシドスクアレンの代謝物の製造方法である上記（１３）記載の製造方法；
（１６） 2,3-オキシドスクアレンの代謝物が、トリテルペンおよびサポニンからなる群から選択される、上記（１５）記載の製造方法；
（１７） 2,3-オキシドスクアレンの代謝物がトリテルペノイドサポニンである、上記（１６）記載の製造方法；
（１８） 光が、435nm〜480nmの波長領域内の波長成分を含む、上記（１３）〜（１７）のいずれかに記載の製造方法；
（１９） 435nm〜480nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である、上記（１８）記載の製造方法；
（２０） 480nm〜3000nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、1μmol m-2s-1以下であり、200nm〜435nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、1μmol m-2s-1以下である、上記（１９）記載の製造方法；
（２１） 光が、445nm〜455nmの波長領域内の波長成分を含む、上記（１３）〜（１７）のいずれかに記載の製造方法；
（２２） 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である、上記（２１）記載の製造方法；
（２３） 455nm〜3000nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、10μmol m-2s-1以下であり、200nm〜445nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、10μmol m-2s-1以下である、上記（２２）記載の製造方法；
（２４） 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜200μmol m-2s-1の範囲内であり、光の照射時間が1日以上である、上記（２２）または（２３）記載の製造方法；
（２５） 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、200μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内であり、光の照射時間が1時間〜14日である、上記（２２）または（２３）記載の製造方法；
（２６） スクアレンエポキシダーゼ遺伝子が、以下の（a）〜（f）からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、上記（１３）〜（２５）のいずれかに記載の製造方法：
（a）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（b）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（e）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（f）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２７） スクアレンエポキシダーゼ遺伝子が、配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、上記（２６）記載の製造方法；
（２８） 植物が、双子葉植物綱の植物である、上記（１３）〜（２７）のいずれかに記載の製造方法；
（２９） 植物に光を照射することを含む、2,3-オキシドスクアレンまたはその代謝物の生産能を向上させる方法；
（３０） 2,3-オキシドスクアレンの生産能を向上させる方法である上記（２９）記載の方法；
（３１） 2,3-オキシドスクアレンの代謝物の生産能を向上させる方法である上記（２９記載の方法；
（３２） 2,3-オキシドスクアレンの代謝物が、トリテルペンおよびサポニンからなる群から選択される、上記（３１）記載の方法；
（３３） 2,3-オキシドスクアレンの代謝物がトリテルペノイドサポニンである、上記（３２）記載の製造方法；
（３４） 光が、435nm〜480nmの波長領域内の波長成分を含む、上記（２９）〜（３３）のいずれかに記載の方法；
（３５） 435nm〜480nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である、上記（３４）記載の方法；
（３６） 480nm〜3000nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、1μmol m-2s-1以下であり、200nm〜435nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、1μmol m-2s-1以下である、上記（３５）記載の方法；
（３７） 光が、445nm〜455nmの波長領域内の波長成分を含む、上記（２９）〜（３３）のいずれかに記載の方法；
（３８） 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である、上記（３７）記載の方法；
（３９） 455nm〜3000nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、10μmol m-2s-1以下であり、200nm〜445nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、10μmol m-2s-1以下である、上記（３８）記載の方法；
（４０） 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜200μmol m-2s-1の範囲内であり、光の照射時間が1日以上である、上記（３８）または（３９）記載の方法；
（４１） 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、200μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内であり、光の照射時間が1時間〜14日である、上記（３８）または（３９）記載の方法；
（４２） スクアレンエポキシダーゼ遺伝子が、以下の（a）〜（f）からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、上記（２９）〜（４１）のいずれかに記載の方法：
（a）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（b）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（e）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（f）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４３） スクアレンエポキシダーゼ遺伝子が、配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、上記（４２）記載の方法；
（４４） 植物が、双子葉植物綱の植物である、上記（２９）〜（４３）のいずれかに記載の方法
などを提供する。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the expression of a plant squalene epoxidase gene is promoted by irradiating the plant with light. Based on this finding, the present inventors have further studied and have completed the present invention. That is, the present invention
(1) A method for promoting the expression of a plant squalene epoxidase gene, comprising irradiating the plant with light;
(2) The method according to (1) above, wherein the light contains a wavelength component in the wavelength region of 435 nm to 480 nm;
(3) photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 435nm~480nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1, the method (2) described;
(4) The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 480 nm to 3000 nm is 1 μmol m −2 s −1 or less, and the photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 200 nm to 435 nm is 1 μmol m −2. The method according to (3) above, which is s −1 or less;
(5) The method according to (1) above, wherein the light comprises a wavelength component in a wavelength region of 445 nm to 455 nm;
(6) photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 445nm~455nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1, (5) The method according;
(7) The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 455 nm to 3000 nm is 10 μmol m −2 s −1 or less, and the photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 200 nm to 445 nm is 10 μmol m −2. The method according to (6) above, which is s −1 or less;
(8) photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 445nm~455nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~200μmol m -2 s -1, the irradiation time of the light is at least one day And the method according to (6) or (7) above;
(9) The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 445 nm to 455 nm is in the range of 200 μmol m −2 s −1 to 300 μmol m −2 s −1 , and the light irradiation time is 1 hour to 14 days. The method according to (6) or (7) above,
(10) The method according to any one of (1) to (9) above, wherein the squalene epoxidase gene contains a polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (f):
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) a polynucleotide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and encoding a protein having squalene epoxidase activity;
(D) a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having squalene epoxidase activity;
(E) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under a highly stringent condition and encodes a protein having squalene epoxidase activity; and (f) It encodes a protein having a squalene epoxidase activity that hybridizes with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 under highly stringent conditions. A polynucleotide to:
(11) The method according to (10) above, wherein the squalene epoxidase gene contains a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
(12) The method according to any one of (1) to (11) above, wherein the plant is a dicotyledonous plant.
(13) A method for producing 2,3-oxidesqualene or a metabolite thereof, comprising irradiating a plant with light;
(14) The production method according to the above (13), which is a production method of 2,3-oxide squalene;
(15) The production method according to the above (13), which is a production method of a metabolite of 2,3-oxidesqualene;
(16) The production method according to (15), wherein the metabolite of 2,3-oxidesqualene is selected from the group consisting of triterpenes and saponins;
(17) The production method according to the above (16), wherein the metabolite of 2,3-oxidesqualene is a triterpenoid saponin;
(18) The production method according to any one of (13) to (17), wherein the light contains a wavelength component in a wavelength region of 435 nm to 480 nm;
(19) photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 435nm~480nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1, the production method of the above (18), wherein;
(20) The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 480 nm to 3000 nm is 1 μmol m −2 s −1 or less, and the photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 200 nm to 435 nm is 1 μmol m −2. The production method according to (19), which is s −1 or less;
(21) The production method according to any one of (13) to (17), wherein the light contains a wavelength component in a wavelength region of 445 nm to 455 nm;
(22) photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 445nm~455nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1, the production method of the above (21), wherein;
(23) The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 455 nm to 3000 nm is 10 μmol m −2 s −1 or less, and the photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 200 nm to 445 nm is 10 μmol m −2. s <-1> or less, the manufacturing method of the said (22) description;
(24) photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 445nm~455nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~200μmol m -2 s -1, the irradiation time of the light is at least one day And the production method according to the above (22) or (23);
(25) The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 445 nm to 455 nm is in the range of 200 μmol m −2 s −1 to 300 μmol m −2 s −1 , and the light irradiation time is 1 hour to 14 days. The production method according to (22) or (23) above,
(26) The production method according to any one of (13) to (25), wherein the squalene epoxidase gene contains a polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (f):
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and has squalene epoxidase activity A polynucleotide encoding the protein;
(D) a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having squalene epoxidase activity;
(E) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under a highly stringent condition and encodes a protein having squalene epoxidase activity; and (f) It encodes a protein having a squalene epoxidase activity that hybridizes with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 under highly stringent conditions. A polynucleotide to:
(27) The production method according to the above (26), wherein the squalene epoxidase gene contains a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(28) The production method according to any one of (13) to (27), wherein the plant is a dicotyledonous plant.
(29) A method for improving the ability to produce 2,3-oxidesqualene or a metabolite thereof, comprising irradiating a plant with light;
(30) The method according to (29) above, which is a method for improving the production ability of 2,3-oxidesqualene;
(31) The above (29), which is a method for improving the ability to produce a metabolite of 2,3-oxidesqualene;
(32) The method according to (31) above, wherein the metabolite of 2,3-oxidesqualene is selected from the group consisting of triterpenes and saponins;
(33) The production method according to the above (32), wherein the metabolite of 2,3-oxidesqualene is a triterpenoid saponin;
(34) The method according to any one of (29) to (33) above, wherein the light comprises a wavelength component in a wavelength region of 435 nm to 480 nm;
(35) photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 435nm~480nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1, the (34), wherein the method;
(36) The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 480 nm to 3000 nm is 1 μmol m −2 s −1 or less, and the photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 200 nm to 435 nm is 1 μmol m −2. The method according to (35) above, which is s −1 or less;
(37) The method according to any one of (29) to (33) above, wherein the light comprises a wavelength component in a wavelength region of 445 nm to 455 nm;
(38) photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 445nm~455nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1, the (37), wherein the method;
(39) The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 455 nm to 3000 nm is 10 μmol m −2 s −1 or less, and the photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 200 nm to 445 nm is 10 μmol m −2. The method according to (38), which is s −1 or less;
(40) photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 445nm~455nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~200μmol m -2 s -1, the irradiation time of the light is at least one day The method according to (38) or (39) above;
(41) The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 445 nm to 455 nm is in the range of 200 μmol m −2 s −1 to 300 μmol m −2 s −1 , and the light irradiation time is 1 hour to 14 days. The method according to (38) or (39) above,
(42) The method according to any one of (29) to (41) above, wherein the squalene epoxidase gene contains a polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (f):
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and has squalene epoxidase activity A polynucleotide encoding the protein;
(D) a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having squalene epoxidase activity;
(E) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under a highly stringent condition and encodes a protein having squalene epoxidase activity; and (f) It encodes a protein having a squalene epoxidase activity that hybridizes with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 under highly stringent conditions. A polynucleotide to:
(43) The method according to (42) above, wherein the squalene epoxidase gene contains a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(44) The method according to any one of (29) to (43) above, wherein the plant is a dicotyledonous plant.

本発明によれば、スクアレンエポキシダーゼ遺伝子の発現を促進させることができるので、スクアレンエポキシダーゼによるスクアレンから2,3-オキシドスクアレンへの変換反応を促進させることにより、2,3-オキシドスクアレンおよびその代謝物の生産能を向上させることができる。よって、本発明は、2,3-オキシドスクアレンまたはその代謝物の効率的な製造に利用することができる。   According to the present invention, since the expression of the squalene epoxidase gene can be promoted, by promoting the conversion reaction from squalene to 2,3-oxide squalene by squalene epoxidase, 2,3-oxide squalene and its The ability to produce metabolites can be improved. Therefore, the present invention can be used for efficient production of 2,3-oxide squalene or a metabolite thereof.

本明細書において、「代謝」には、同化（合成）および異化（分解）のいずれも含まれる。
スクワレンエポキシダーゼは、スクワレンモノオキシゲナーゼとも呼ばれ、酵素番号EC 1.14.99.7で表される酵素である。
以下、本発明を、その実施態様に基づいて詳細に説明する。 In the present specification, “metabolism” includes both assimilation (synthesis) and catabolism (decomposition).
Squalene epoxidase is also called squalene monooxygenase, and is an enzyme represented by enzyme number EC 1.14.99.7.
Hereinafter, the present invention will be described in detail based on the embodiments.

１．本発明で使用される植物
本発明で使用される植物としては、スクアレンエポキシダーゼ遺伝子を有する植物であればよく、特に制限はない。スクアレンエポキシダーゼ遺伝子を有する植物としては、例えば、チョウセンニンジン(Panax Binseng)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana )、ワタ(Gossypium indicum )、アサ(Cannabis sativa )、アブラナ(Brassica campestris )、カブラ(Brassica campestris )、キャベツ(Brassica oleracea )、ダイコン(Raphanus sativus )、セイヨウカボチャ(Cucurbita Pepo )、カボチャ(Cucurbita moschata )、キウリ(Cucumis sativus )、メロン(Cucumis Melo )、スイカ(Citrullus Battich )、オランダイチゴ(Fragaria chiloensis )、アラスカエンドウ(Pisum sativum Alaska )、アズキ(Phaseolus angularis )、ナンキンマメ(Arachis hypogaea )、ダイズ(Glycine max )、インゲンマメ(Phaseolusvulgaris )、ソラマメ(Vicia Faba )、エンドウ(Pisum sativum )、ミカン(Citrus deliciosa )、ブドウ(Vitis vinifera )、ゴマ(Sesamum indicum )、サツマイモ(Ipomoea Batatas )、ナス(Solanum melongena )、ジャガイモ(Solanum tuberosum )、トマト(Lycopersicon esculentum )、トウガラシ(Capsicum annuum )、タバコ(Nicotiana tabacum )、ツクバネアサガオ(Petunia hybrida )、ヒマワリ(Helianthus annuus )、ゴボウ(Arctium Lappa )、キク(Chrysanthemum morifolium )またはホウレンソウ(Spinacia oleracea )などの双子葉植物；イネ(Oryza sativa )、コムギ(Triticum aestivum )、オオムギ(Hordeum vulgare )、トウモロコシ(Zea mays )、エンバク(Avena sativa )、ヒエ(Panicum Crus-galli L. var. frumentaceum )、モロコシ(Sorghum bicolor )、アワ(Setaria italica )、キビ(Panicum miliaceum )、チューリップ(Tulipa Gesneriana )、サトイモ(Colocasia antiquorum )、アオウキクサ(Lemna paucicostata )またはサトウキビ(Saccharum officinarum )などの単子葉植物などが挙げられ、チョウセンニンジン、シロイヌナズナなどの双子葉植物が好ましく、さらにチョウセンニンジン、シロイヌナズナが好ましい。
また、本発明で用いられる植物としては、スクアレンエポキシダーゼによってスクアレンから変換される2,3-オキシドスクアレンを代謝して、トリテルペンおよび／またはサポニンを生合成する経路を含むものが好ましい。このような植物としては、ミシマサイコ (Bupleurum scorzonerifolium)、チョウセンニンジン (Panax Ginseng)、オンジ (Polygalae radix)、キキョウ (Platycodon grandiflorum) などが挙げられる。 1. Plant used in the present invention The plant used in the present invention is not particularly limited as long as it is a plant having a squalene epoxidase gene. Plants having a squalene epoxidase gene include, for example, ginseng (Panax Binseng), Arabidopsis thaliana, cotton (Gossypium indicum), Asa (Cannabis sativa), rape (Brassica campestris), beech (Brassica campestris), (Brassica oleracea), Japanese radish (Raphanus sativus), Atlantic pumpkin (Cucurbita Pepo), Pumpkin (Cucurbita moschata), Cucumber (Cucumis sativus), Melon (Cucumis Melo), Watermelon (Citrullus Battich), Dutch strawberry (Fragaria chilo) Peas (Pisum sativum Alaska), Azuki (Phaseolus angularis), peanuts (Arachis hypogaea), soybeans (Glycine max), kidney beans (Phaseolusvulgaris), broad bean (Vicia Faba), peas (Pisum sativum), citrus (Citrus) Vitis vinifera), sesame (Sesamum indicum), sweet potato (Ipomoea Batatas), eggplant (Solanum melongena), di Potato (Solanum tuberosum), tomato (Lycopersicon esculentum), capsicum (Capsicum annuum), tobacco (Nicotiana tabacum), sunflower (Petunia hybrida), sunflower (Helianthus annuus), burdock (Arctium Lappamori sap) Dicotyledonous plants such as (Spinacia oleracea); rice (Oryza sativa), wheat (Triticum aestivum), barley (Hordeum vulgare), maize (Zea mays), oat (Avena sativa), Japanese maize (Panicum Crus-galli L. var. frumentaceum), sorghum (Sorghum bicolor), millet (Setaria italica), millet (Panicum miliaceum), tulip (Tulipa Gesneriana), taro (Colocasia antiquorum), duckweed (Lemna paucicostata) Dicotyledonous plants such as ginseng and Arabidopsis are preferred, and ginseng and siloi Nunazuna is preferred.
In addition, the plant used in the present invention preferably contains a pathway that metabolizes 2,3-oxide squalene converted from squalene by squalene epoxidase to biosynthesize triterpenes and / or saponins. Examples of such a plant include Bleuleurus scorzonerifolium, Panax Ginseng, Polygalae radix, and Platycodon grandiflorum.

２．本発明で使用される光および光源
（１）本発明で使用される光
本発明で使用される光としては、植物のスクアレンエポキシダーゼ遺伝子の発現を促進できるものであればよく、特に制限はない。スクアレンエポキシダーゼ遺伝子の発現促進効率の観点からは、好ましくは約435nm〜約480nmの波長領域内、より好ましくは約440nm〜約460nmの波長領域内、特に好ましくは約445nm〜約455nmの波長領域内、特に好ましくは約450nmの波長の波長成分を含む光が挙げられる。
光量子束密度としては、植物のスクアレンエポキシダーゼ遺伝子の発現を促進できる光量子束密度であればよく、特に制限はない。スクアレンエポキシダーゼ遺伝子の発現促進効率の観点からは、上記波長領域または波長の波長成分の光量子束密度は、好ましくは50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内、さらに好ましくは50μmol m-2s-1〜200μmol m-2s-1または200μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である。
上記の通り、光量子束密度の高い光を用いることによりスクアレンエポキシダーゼ遺伝子の発現促進効率を高めることができるが、過剰な光は、植物に、光合成能の低下、組織傷害（クロロフィルの分解などによる葉の漂白など）などの障害を与える可能性がある。そこで、200nm〜445nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度は、200μmol m-2s-1以下であるのが好ましく、さらに100μmol m-2s-1以下であるのが好ましく、特に50μmol m-2s-1以下であるのが好ましく、とりわけ10μmol m-2s-1以下であるのが好ましい。455nm〜3000nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度は、200μmol m-2s-1以下であるのが好ましく、さらに100μmol m-2s-1以下であるのが好ましく、特に50μmol m-2s-1以下であるのが好ましく、とりわけ10μmol m-2s-1以下であるのが好ましい。
また、人工光源を用いる場合には、なるべくスクアレンエポキシダーゼ遺伝子の発現促進効率の高い波長成分の光のみを用いるのが、エネルギー効率の観点からは好ましい。そこで、455nm〜3000nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度は、50μmol m-2s-1以下であるのが好ましく、さらに10μmol m-2s-1以下であるのが好ましく、特に5μmol m-2s-1以下であるのが好ましく、とりわけ1μmol m-2s-1以下であるのが好ましい。200nm〜445nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度は、50μmol m-2s-1以下であるのが好ましく、さらに10μmol m-2s-1以下であるのが好ましく、特に5μmol m-2s-1以下であるのが好ましく、とりわけ1μmol m-2s-1以下であるのが好ましい。
光照射時間は、照射する光の光量子束密度によっても異なるが、植物のスクアレンエポキシダーゼ遺伝子の発現を促進できる光照射時間であればよく、特に制限はないが、連続照射であるのが好ましい。スクアレンエポキシダーゼ遺伝子の発現促進効率の観点からは、光量子束密度が50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である場合には、光照射時間は、通常１時間以上、好ましくは６時間〜８週間、より好ましくは１２時間〜６週間、さらに好ましくは２４時間から４週間程度である。光量子束密度が50μmol m-2s-1〜200μmol m-2s-1の範囲内である場合には、光照射時間は、通常１日以上、好ましくは１日〜８週間、より好ましくは１．５日〜６週間、さらに好ましくは２日から４週間程度である。光量子束密度が200μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である場合には、光照射時間は、通常１時間〜１４日、好ましくは２時間〜１０日、より好ましくは６時間〜１週間、さらに好ましくは１２時間から４日間程度である。 2. Light and light source used in the present invention (1) Light used in the present invention The light used in the present invention is not particularly limited as long as it can promote the expression of a plant squalene epoxidase gene. . From the viewpoint of the efficiency of promoting the expression of the squalene epoxidase gene, it is preferably within the wavelength region of about 435 nm to about 480 nm, more preferably within the wavelength region of about 440 nm to about 460 nm, and particularly preferably within the wavelength region of about 445 nm to about 455 nm. Particularly preferred is light containing a wavelength component having a wavelength of about 450 nm.
The photon flux density is not particularly limited as long as it is a photon flux density that can promote the expression of a plant squalene epoxidase gene. From the viewpoint of enhanced expression efficiency of squalene epoxidase gene, photon flux density of the wavelength components of the wavelength range or wavelengths, preferably in the range of 50μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1, more preferably is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~200μmol m -2 s -1 or 200μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1.
As described above, squalene epoxidase gene expression promotion efficiency can be increased by using light with a high photon flux density, but excessive light is caused by reduced photosynthetic ability, tissue damage (degradation of chlorophyll, etc.) in plants. Such as leaf bleaching). Therefore, photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 200nm~445nm is preferably equal to or less than 200 [mu] mol m -2 s -1, and even preferred in addition 100 [mu] mol m -2 s -1 or less, in particular 50 [mu] mol m It is preferably −2 s −1 or less, more preferably 10 μmol m −2 s −1 or less. Photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 455nm~3000nm is preferably equal to or less than 200 [mu] mol m -2 s -1, is preferably less further 100 [mu] mol m -2 s -1, in particular 50 [mu] mol m -2 It is preferably s −1 or less, more preferably 10 μmol m −2 s −1 or less.
Moreover, when using an artificial light source, it is preferable from the viewpoint of energy efficiency to use only light having a wavelength component with a high expression promoting efficiency of the squalene epoxidase gene as much as possible. Therefore, the photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 455 nm to 3000 nm is preferably 50 μmol m −2 s −1 or less, more preferably 10 μmol m −2 s −1 or less, particularly 5 μmol m. It is preferably −2 s −1 or less, more preferably 1 μmol m −2 s −1 or less. The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 200 nm to 445 nm is preferably 50 μmol m −2 s −1 or less, more preferably 10 μmol m −2 s −1 or less, particularly 5 μmol m −2. It is preferably s −1 or less, more preferably 1 μmol m −2 s −1 or less.
The light irradiation time varies depending on the photon flux density of the light to be irradiated, but may be any light irradiation time that can promote the expression of the plant squalene epoxidase gene, and is not particularly limited, but continuous irradiation is preferable. From the viewpoint of enhanced expression efficiency of squalene epoxidase gene, when photon flux density is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1 , the light irradiation time is usually 1 hour or more It is preferably 6 hours to 8 weeks, more preferably 12 hours to 6 weeks, and even more preferably about 24 hours to 4 weeks. When photon flux density is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~200μmol m -2 s -1 , the light irradiation time is usually 1 or more days, 8 weeks preferably one day, more preferably 1 .5 days to 6 weeks, more preferably about 2 days to 4 weeks. When the photon flux density is in the range of 200 μmol m −2 s −1 to 300 μmol m −2 s −1 , the light irradiation time is usually 1 hour to 14 days, preferably 2 hours to 10 days, more preferably Is 6 hours to 1 week, more preferably 12 hours to 4 days.

（２）光源
本発明で用いられる光源としては、上記のような光の照射に用いることができるものであればよく、特に制限はない。例えば、LED、蛍光灯、放電ランプ（例、水銀灯、キセノンランプなど）、さらに、回折格子、プリズムなどとの組み合わせにより取り出された特定の波長の光などを適宜用いることができる。過剰な光による植物の障害（光合成能の低下、組織傷害など）を抑制するために200nm〜445nmの波長領域内の波長成分または455nm〜3000nmの波長領域内の波長成分を減少させるためには、所望の波長選択性を有するフィルター（例、色ガラスフィルター、ゼラチンフィルター、干渉フィルターなど）を使用することができる。また、LEDやレーザーは、不要な波長領域の波長成分を含まず、かつ、好ましい光量子束密度を有する光を得るために好ましく用いることができる。 (2) Light source The light source used in the present invention is not particularly limited as long as it can be used for light irradiation as described above. For example, light of a specific wavelength extracted by a combination with an LED, a fluorescent lamp, a discharge lamp (eg, a mercury lamp, a xenon lamp, etc.), a diffraction grating, a prism, or the like can be used as appropriate. To reduce the wavelength component in the wavelength region of 200 nm to 445 nm or the wavelength component in the wavelength region of 455 nm to 3000 nm in order to suppress plant damage (decreased photosynthetic ability, tissue damage, etc.) due to excessive light, A filter having a desired wavelength selectivity (eg, a color glass filter, a gelatin filter, an interference filter, etc.) can be used. Further, the LED and the laser can be preferably used in order to obtain light having a preferable photon flux density without containing a wavelength component in an unnecessary wavelength region.

３．スクワレンエポキシダーゼ遺伝子
本発明において発現が促進されるスクワレンエポキシダーゼ遺伝子としては、まず、（a）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する遺伝子、および（b）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子が挙げられる。本発明において発現が促進されるスクワレンエポキシダーゼ遺伝子は、上記のシロイヌナズナ由来のスクワレンエポキシダーゼをコードする遺伝子に限定されるものではなく、上記のスクワレンエポキシダーゼと機能的に同等なタンパク質をコードする、シロイヌナズナまたは他の植物由来の、他の遺伝子を含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、（c）配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質などが挙げられる。
このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個（1〜数個）、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつスクワレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつスクワレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、スクワレンエポキシダーゼ活性は、例えばIkuro Abe, Tsuyoshi Abe, Weiwei Lou, Takayoshi Masuoka, Hiroshi Noguchi, Biochemical and Biophysical Research Communications 352 (2007) 259-263に記載の方法で評価することができる。 3. Squalene epoxidase gene As the squalene epoxidase gene whose expression is promoted in the present invention, first, (a) a gene containing a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and (b) an amino acid of SEQ ID NO: 2 Examples thereof include a gene containing a polynucleotide encoding a protein consisting of a sequence. The squalene epoxidase gene whose expression is promoted in the present invention is not limited to the gene encoding squalene epoxidase derived from the Arabidopsis thaliana, and encodes a protein functionally equivalent to the squalene epoxidase described above. Contains other genes from Arabidopsis or other plants. Examples of the functionally equivalent protein include (c) an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and squalene epoxidase Examples thereof include proteins having activity.
As such a protein, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, 1 to 100, 1 to 90, 1 to 80, 1 to 70, 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40, 1-39, 1-38, 1-37, 1-36, 1-35, 1-34, 1-33, 1-32, 1-31, 1-3 30, 1-29, 1-28, 1-27, 1-26, 1-25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21, 1-21 20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1- 10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6 (1 to several), 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1 Examples thereof include a protein having an amino acid sequence in which one amino acid residue is deleted, substituted, inserted and / or added and having squalene epoxidase activity. In general, the smaller the number of amino acid residue deletions, substitutions, insertions and / or additions, the better. Such proteins include (d) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, about 60% or more, about 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% More than 89%, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, A protein having an amino acid sequence having 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, 99.9% or more and having squalene epoxidase activity Is mentioned. In general, the larger the homology value, the better.
The squalene epoxidase activity can be evaluated by the method described in, for example, Ikuro Abe, Tsuyoshi Abe, Weiwei Lou, Takayoshi Masuoka, Hiroshi Noguchi, Biochemical and Biophysical Research Communications 352 (2007) 259-263.

また、本発明において発現が促進されるスクワレンエポキシダーゼ遺伝子には、(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクワレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子；及び(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクワレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子も含まれる。
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNA）」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、DNA）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド(例えば、DNA)が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、DNA）を検出することができる。
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。 In addition, the squalene epoxidase gene whose expression is promoted in the present invention is (e) hybridized under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1, and squalene. A gene comprising a polynucleotide encoding a protein having epoxidase activity; and (f) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a string Also included are genes containing a polynucleotide that encodes a protein that hybridizes under mild conditions and has squalene epoxidase activity.
Here, the “polynucleotide (DNA) that hybridizes under stringent conditions” encodes a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A polynucleotide (for example, DNA) obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, or the like using all or part of the polynucleotide as a probe. As a hybridization method, for example, a method described in Molecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 can be used.
As used herein, the “stringent conditions” may be any of low stringency conditions, moderate stringency conditions, and high stringency conditions. “Low stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C. The “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C. “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. Under these conditions, it can be expected that a polynucleotide having high homology (eg, DNA) can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect hybridization stringency. Those skilled in the art will select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency.
In addition, when using a commercially available kit for hybridization, Alkphos Direct Labeling Reagents (made by Amersham Pharmacia) can be used, for example. In this case, follow the protocol supplied with the kit, incubate with the labeled probe overnight, and then wash the membrane with a primary wash buffer containing 0.1% (w / v) SDS at 55 ° C. , Hybridized polynucleotides (eg, DNA) can be detected.
Other polynucleotides that can be hybridized are approximately 60% of the polynucleotide that encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, when calculated using homology search software such as FASTA and BLAST using default parameters. About 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7% or more 99.8% or more and 99.9% or more of the polynucleotide having the identity.
The identity of the amino acid sequence and base sequence is determined by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 90) by Carlin and Arthur. 5873, 1993). Programs called BLASTN and BLASTX based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al: J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). When analyzing a base sequence using BLASTN, parameters are set to, for example, score = 100 and wordlength = 12. In addition, when an amino acid sequence is analyzed using BLASTX, the parameters are, for example, score = 50 and wordlength = 3. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used.

４．スクアレン、2,3-オキシドスクアレンおよびその代謝物
スクアレンとは、下記式

Figure 2008245526
で表される、動植物、酵母など真核生物に広く存在する非環式トリテルペンの一種である。
2,3-オキシドスクアレンは、スクアレン2,3-オキシド、2,3-エポキシスクアレン、スクアレン2,3-オキシド、スクアレン2,3-エポキシドとも呼ばれる。スクアレンエポキシダーゼにより分子状酸素がスクアレンに付加して生成し、トリテルペンの前駆体となる。
2,3-オキシドスクアレンは、トリテルペンを経てサポニンに代謝されうる。すなわち、2,3-オキシドスクアレンの代謝物には、トリテルペンおよびサポニンが含まれる（図１）。例えば、チョウセンニンジンにおいては、メバロン酸から生合成されたスクアレンがスクアレンエポキシダーゼにより2,3-オキシドスクアレンに変換され、さらにトリテルペンを経てサポニンが生合成されることが報告されている（Lee M-H, Jeong J-H, Seo J-W, Shin C-G, et al: Plant Cell Physiology 45(8), 976-984 (2004)）。この生合成経路においては、スクアレンが2,3-オキシドスクアレンに変換される反応が律速段階となっている（図２）。
トリテルペンとは、炭素数３０のテルペン炭化水素、アルコールなどの総称であり、トリテルペノイドともいう。2,3-オキシドスクアレンから誘導されるトリテルペンとしては、シクロアルテノール、ダンマランジオール、β−アミリンなどが挙げられる。
サポニンとは、ステロイドやトリテルペノイドを非糖部とする配糖体の総称であり、ステロイドサポニンとトリテルペノイドサポニンとに大別される。トリテルペノイドサポニンとしては、ダンマランジオールから誘導されるダンマラン型サポニン、β−アミリンから誘導されるオレアナン型サポニンなどが挙げられる。 4). Squalene, 2,3-oxidesqualene and its metabolites
Figure 2008245526
 It is a kind of acyclic triterpene widely present in eukaryotes such as animals and plants and yeast.
2,3-oxide squalene is also called squalene 2,3-oxide, 2,3-epoxysqualene, squalene 2,3-oxide, squalene 2,3-epoxide. Molecular oxygen is generated by addition of squalene by squalene epoxidase and becomes a precursor of triterpene.
2,3-oxide squalene can be metabolized to saponins via triterpenes. That is, 2,3-oxidesqualene metabolites include triterpenes and saponins (FIG. 1). For example, in ginseng, it has been reported that squalene biosynthesized from mevalonic acid is converted to 2,3-oxide squalene by squalene epoxidase, and saponin is biosynthesized via triterpene (Lee MH, Jeong JH, Seo JW, Shin CG, et al: Plant Cell Physiology 45 (8), 976-984 (2004)). In this biosynthetic pathway, the reaction in which squalene is converted to 2,3-oxidesqualene is the rate-limiting step (FIG. 2).
Triterpene is a general term for terpene hydrocarbons, alcohols, and the like having 30 carbon atoms, and is also referred to as a triterpenoid. Examples of triterpenes derived from 2,3-oxide squalene include cycloartenol, dammarane diol, β-amylin and the like.
Saponin is a general term for glycosides having steroids and triterpenoids as non-sugar parts, and is broadly classified into steroid saponins and triterpenoid saponins. Examples of the triterpenoid saponins include dammaran saponins derived from dammaran diol, oleanane saponins derived from β-amylin, and the like.

５．2,3-オキシドスクアレンまたはその代謝物の製造方法
本発明の2,3-オキシドスクアレンまたはその代謝物の製造方法（「本発明の製造方法」と略記することがある）は、上記した植物体に、上記した方法により光を照射して2,3-オキシドスクアレンまたはその代謝物の生産能を向上させ、2,3-オキシドスクアレンの含有量を増加させた植物体を原材料とする。
上記植物体から、植物体の破砕物をアルコール抽出する方法などの公知の方法により、粗抽出物を調製する。抽出には、植物体全体を用いてもよいが、好ましくは2,3-オキシドスクアレンまたはその代謝物の含有量が多い組織（例、根、葉など）を用いる。植物体を乾燥して粉末にしたものを用いてもよい。
抽出用のアルコール（溶液）としては、含水アルコールを使用してもよく、含水低級アルコールが好ましく使用される。低級アルコールとしては、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｉ−ブチルアルコール、ｓ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール等の炭素数１〜６のアルコールが用いられる。抽出に用いられるアルコールの濃度は、使用するアルコールによっても異なるが、通常は２５％以上であり、好ましくは３５〜９０％、より好ましくは５０〜７５％である。
抽出は、植物における有効成分の抽出において一般に用いられる方法によって行うことができる。具体的には、抽出は、例えば、抽出液中に植物体の破砕物を放置するだけでもよいが、例えば還流下や超音波下等で行なこともできる。光による変性を避けるため、抽出は暗所で行なうのが好ましい。抽出時の温度は、抽出液中のアルコールの種類および割合によっても異なるが、抽出は、通常、抽出液が凍らない温度以上で１５０℃以下、好ましくは抽出液が凍らない温度以上で１００℃以下、より好ましくは０℃以上９０℃以下、特に好ましくは４℃以上７０℃以下の温度で行われる。
得られた抽出液は、抽出に用いた植物体を取り除くために濾過を行うのが好ましい。濾過方法としては、例えば遠心濾過、吸引濾過等が用いられる。この様にして得られた抽出液の濃縮方法としては、例えば減圧濃縮方法等の公知の濃縮方法が用いられ、好ましくは例えばロータリーバキュームエバポレーターを用いた濃縮方法が用いられる。
抽出した2,3-オキシドスクアレンまたはその代謝物は、通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて精製することができる。 5. Method for producing 2,3-oxide squalene or a metabolite thereof The method for producing 2,3-oxide squalene or a metabolite thereof according to the present invention (may be abbreviated as “the production method of the present invention”) is described above. The plant body is irradiated with light by the above-described method to improve the production ability of 2,3-oxide squalene or a metabolite thereof, and the plant body having an increased content of 2,3-oxide squalene is used as a raw material.
A crude extract is prepared from the plant body by a known method such as a method of extracting a crushed material of the plant body with alcohol. The whole plant may be used for extraction, but preferably a tissue (eg, root, leaf, etc.) with a high content of 2,3-oxide squalene or its metabolite is used. You may use what dried the plant body into the powder.
As the alcohol (solution) for extraction, a hydrous alcohol may be used, and a hydrous lower alcohol is preferably used. Examples of the lower alcohol include alcohols having 1 to 6 carbon atoms such as methyl alcohol, ethyl alcohol, propyl alcohol, isopropyl alcohol, n-butyl alcohol, i-butyl alcohol, s-butyl alcohol, t-butyl alcohol. . The concentration of alcohol used for extraction varies depending on the alcohol used, but is usually 25% or more, preferably 35 to 90%, more preferably 50 to 75%.
The extraction can be performed by a method generally used in extraction of active ingredients in plants. Specifically, for example, extraction may be performed by simply leaving a crushed plant body in the extract, but it can also be performed under reflux or ultrasonic waves, for example. In order to avoid denaturation by light, extraction is preferably performed in the dark. Although the temperature at the time of extraction varies depending on the type and proportion of alcohol in the extract, the extraction is usually at a temperature not lower than the temperature at which the extract does not freeze and not higher than 150 ° C., preferably not lower than the temperature at which the extract does not freeze and not higher than 100 ° C. More preferably, it is carried out at a temperature of 0 ° C. or higher and 90 ° C. or lower, particularly preferably 4 ° C. or higher and 70 ° C. or lower.
The obtained extract is preferably filtered to remove the plant used for extraction. As a filtration method, for example, centrifugal filtration, suction filtration or the like is used. As a concentration method of the extract thus obtained, a known concentration method such as a vacuum concentration method is used, and a concentration method using, for example, a rotary vacuum evaporator is preferably used.
The extracted 2,3-oxide squalene or a metabolite thereof can be purified by a combination of usual purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like.

なお、本発明において、詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、モレキュラー・クローニング第３版、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987-1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法などの公知の方法により、または市販のキットの取扱い説明書に記載の方法により行うことができる。   In the present invention, unless otherwise specified, detailed experimental procedures are described in Molecular Cloning 3rd Edition, Ausbel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley and Sons (1987-1997). ), Glover DM and Hames BD, DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995), etc. It can be performed by the method described in the instruction manual.

１．実験植物：当研究室で継代されているモデル植物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の野生系統Columbia (Col) を用いた。
２．生育条件：人工気象機 (Biotron NC220, NKsystem) を用い，22℃，湿度40-60％，MS培地（後述）において以下の3種の光条件下で育てた植物を用いた。 1. Experimental plant: The wild strain Columbia (Col) of the model plant Arabidopsis thaliana that has been passaged in our laboratory was used.
2. Growth conditions: Plants grown under the following three light conditions in an MS medium (described later) using an artificial weather machine (Biotron NC220, NKsystem) at 22 ° C, humidity 40-60%.

（1）100 μmol m-2 s-1の白色蛍光灯で3週間育てた植物 (「対象」実験植物)
（2）100 μmol m-2 s-1の白色蛍光灯で1週間生育させた後、110 μmol m-2 s-1の青色LEDの光（光源から50 cmの距離）を2週間照射した植物 (「青色２週」実験植物)
（3）100 μmol m-2 s-1の白色蛍光灯で1週間生育させた後、240 μmol m-2 s-1の青色LEDの光（光源から15 cmの距離）を2日間照射した植物 (「青色２日」実験植物) (1) Plant grown for 3 weeks in 100 μmol m -2 s -1 white fluorescent lamp ("target" experimental plant)
(2) Plants that were grown for 1 week with a 100 μmol m -2 s -1 white fluorescent lamp and then irradiated with 110 μmol m -2 s -1 blue LED light (distance 50 cm from the light source) for 2 weeks ("Blue 2 weeks" experimental plant)
(3) Plants that were grown for 1 week in a 100 µmol m -2 s -1 white fluorescent lamp and then irradiated with 240 µmol m -2 s -1 blue LED light (at a distance of 15 cm from the light source) for 2 days ("Blue 2 days" experimental plant)

種子の滅菌・播種：1.5-mlチューブに種子を分注し、70％ エタノール 1 mlを加え、1分間振盪した。遠心し、上清を捨て、滅菌溶液（0.25％ 次亜塩素酸，0.1％ Tween 20） 1 mlを加えて、10-15分振盪した。クリーンベンチ内で軽く遠心し、上清を捨て、純水1 mlを加えて洗浄した。洗浄を5回繰り返し、純水1 mlを加えた状態でアルミホイルに包み、4℃で約1週間春化処理を行った。再び、クリーンベンチ内で軽く遠心し、上清を捨て、別にオートクレーブ処理（121℃，20分）した0.3％ アガロース溶液1 mlに懸濁した。ピペットのチップに取りシャーレに播種した。   Seed sterilization / seeding: Seeds were dispensed into 1.5-ml tubes, and 1 ml of 70% ethanol was added and shaken for 1 minute. The supernatant was discarded, 1 ml of a sterilized solution (0.25% hypochlorous acid, 0.1% Tween 20) was added, and the mixture was shaken for 10-15 minutes. Centrifuge lightly in a clean bench, discard the supernatant, and wash with 1 ml of pure water. The washing was repeated 5 times, wrapped in aluminum foil with 1 ml of pure water, and subjected to vernalization at 4 ° C for about 1 week. Again, light centrifugation was performed in a clean bench, the supernatant was discarded, and the suspension was suspended in 1 ml of a 0.3% agarose solution that had been autoclaved (121 ° C., 20 minutes). A pipette tip was taken and seeded in a petri dish.

３．無菌培地の調製：
ムラシゲ・スクーグ培地 (MS培地)

Figure 2008245526
純水により 1,000 ml（2N KOHでpH 5.8に調製）
培地溶液を調製後オートクレーブ処理(121℃ 20分)し、約50℃程度まで冷やしてからシャーレに分注した。 3. Preparation of sterile medium:
Murashige-Skoog medium (MS medium)
Figure 2008245526
 1,000 ml with pure water (adjusted to pH 5.8 with 2N KOH)
After the medium solution was prepared, it was autoclaved (121 ° C., 20 minutes), cooled to about 50 ° C. and then dispensed into a petri dish.

1000Xビタミンストック

Figure 2008245526
調製後、4℃で遮光保存した。 1000X vitamin stock
Figure 2008245526
 After preparation, it was stored in the dark at 4 ° C.

４．オリゴマイクロアレイ：シロイヌナズナ葉50 mgよりRNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) を用い、標準プロトコールに従って全 RNAを回収した。全RNA 15 μgを初期量とし、One-Cycle cDNA Synthesis Kit (AFFYMETRIX) を用いてcDNA合成を行った。GeneChip Sample Cleanup Module (AFFYMETRIX) を用いてcDNAを精製後、GeneChip IVT Labeling Kit (AFFYMETRIX) を用いてビオチン標識されたcRNAを合成した。GeneChip Sample Cleanup Module (AFFYMETRIX) を用いてcRNAを精製した。cDNA合成からの作業手順はGene Chip Expression Analysis Technical Manualに従って行った。引き続き、GeneChip Arabidpsis ATH1 Genome Array (AFFYMETRIX) に対し標準プロトコルに従って16時間ハイブリダイズを行った。FLUIDICS STATION 450 (AFFYMETRIX) を用いて49 Format用のプログラムにより自動で洗浄と染色を行い、Affymetrix GeneChip Scanner 3000 (AFFYMETRIX) によりデータの取り込みを行った。シグナルの数値化および補正にはGeneChip Operating Software (AFFYMETRIX) を用い、その後の解析にはExcel (Microsoft) を使用した。 4). Oligo microarray: Total RNA was collected from 50 mg of Arabidopsis leaves using RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) according to the standard protocol. CDNA synthesis was performed using 15 μg of total RNA as an initial amount using the One-Cycle cDNA Synthesis Kit (AFFYMETRIX). After purification of cDNA using GeneChip Sample Cleanup Module (AFFYMETRIX), biotin-labeled cRNA was synthesized using GeneChip IVT Labeling Kit (AFFYMETRIX). CRNA was purified using GeneChip Sample Cleanup Module (AFFYMETRIX). The procedure from cDNA synthesis was performed according to the Gene Chip Expression Analysis Technical Manual. Subsequently, hybridization with GeneChip Arabidpsis ATH1 Genome Array (AFFYMETRIX) was performed for 16 hours according to a standard protocol. Using FLUIDICS STATION 450 (AFFYMETRIX), washing and staining were automatically performed by a program for 49 Format, and data was captured by Affymetrix GeneChip Scanner 3000 (AFFYMETRIX). GeneChip Operating Software (AFFYMETRIX) was used for signal quantification and correction, and Excel (Microsoft) was used for subsequent analysis.

５．結果
上記４．オリゴマイクロアレイを用いた解析の結果、スクアレンエポキシダーゼ遺伝子（遺伝子番号 _At5g24150（配列番号：１）、酵素番号 1.14.99.7、）の発現が、「対象」と比較して、「青色２週」および「青色２日」のいずれにおいても、2倍以上増大していた。 5. Result 4. As a result of the analysis using the oligo microarray, the expression of the squalene epoxidase gene (gene number _At5g24150 (SEQ ID NO: 1), enzyme number 1.14.99.7) was compared with the “subject” as compared to “blue two weeks” and “ In both of “blue 2 days”, it increased more than twice.

本発明によれば、スクアレンエポキシダーゼ遺伝子の発現を促進させることができるので、スクアレンエポキシダーゼによるスクアレンから2,3-オキシドスクアレンへの変換反応を促進させることにより、2,3-オキシドスクアレンおよびその代謝物の生産能を向上させることができる。よって、本発明は、2,3-オキシドスクアレンまたはその代謝物の効率的な製造に利用することができる。   According to the present invention, since the expression of the squalene epoxidase gene can be promoted, by promoting the conversion reaction from squalene to 2,3-oxide squalene by squalene epoxidase, 2,3-oxide squalene and its The ability to produce metabolites can be improved. Therefore, the present invention can be used for efficient production of 2,3-oxide squalene or a metabolite thereof.

メバロン酸からサポニンが生合成される経路を模式的に示した概略図である。It is the schematic which showed typically the pathway by which saponin is biosynthesized from mevalonic acid. チョウセンニンジンにおけるメバロン酸からサポニンが生合成される経路を模式的に示した概略図である（Lee M-H, Jeong J-H, Seo J-W, Shin C-G, et al: Plant Cell Physiology 45(8), 976-984 (2004)に記載の経路図を一部改変）。Schematic diagram showing the pathway of biosynthesis of saponin from mevalonic acid in ginseng (Lee MH, Jeong JH, Seo JW, Shin CG, et al: Plant Cell Physiology 45 (8), 976-984 (The route map described in (2004) is partially modified).

［配列番号：１］
シロイヌナズナのスクアレンエポキシダーゼ（酵素番号 1.14.99.7）をコードするcDNAの塩基配列を示す。
［配列番号：２］
シロイヌナズナのスクアレンエポキシダーゼ（酵素番号 1.14.99.7）のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２］
シロイヌナズナのスクアレンエポキシダーゼ（酵素番号 1.14.99.7）をコードする遺伝子（遺伝子番号 At5g24150）の塩基配列を示す。 [SEQ ID NO: 1]
This shows the base sequence of cDNA encoding Arabidopsis squalene epoxidase (enzyme number 1.14.99.7).
[SEQ ID NO: 2]
The amino acid sequence of squalene epoxidase (enzyme number 1.14.99.7) of Arabidopsis thaliana is shown.
[SEQ ID NO: 2]
This shows the base sequence of the gene (gene number At5g24150) encoding Arabidopsis squalene epoxidase (enzyme number 1.14.99.7).

Claims (44)

植物に光を照射することを含む、植物のスクアレンエポキシダーゼ遺伝子の発現促進方法。 A method for promoting the expression of a squalene epoxidase gene in a plant, comprising irradiating the plant with light. 光が、435nm〜480nmの波長領域内の波長成分を含む、請求項１記載の方法。 The method of claim 1, wherein the light comprises a wavelength component in the wavelength region of 435 nm to 480 nm. 435nm〜480nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である、請求項２記載の方法。 Photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 435nm~480nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1, method of claim 2 wherein. 480nm〜3000nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、1μmol m-2s-1以下であり、200nm〜435nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、1μmol m-2s-1以下である、請求項３記載の方法。 The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 480 nm to 3000 nm is 1 μmol m −2 s −1 or less, and the photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 200 nm to 435 nm is 1 μmol m −2 s −1. The method of claim 3, wherein: 光が、445nm〜455nmの波長領域内の波長成分を含む、請求項１記載の方法。 The method of claim 1, wherein the light comprises a wavelength component in a wavelength region of 445 nm to 455 nm. 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である、請求項５記載の方法。 Photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 445nm~455nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1, The method of claim 5, wherein. 455nm〜3000nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、10μmol m-2s-1以下であり、200nm〜445nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、10μmol m-2s-1以下である、請求項６記載の方法。 The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 455 nm to 3000 nm is 10 μmol m −2 s −1 or less, and the photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 200 nm to 445 nm is 10 μmol m −2 s −1. The method of claim 6, wherein: 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜200μmol m-2s-1の範囲内であり、光の照射時間が1日以上である、請求項６または７記載の方法。 Photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 445nm~455nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~200μmol m -2 s -1, the irradiation time of the light is more than 1 day, claim The method according to 6 or 7. 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、200μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内であり、光の照射時間が1時間〜14日である、請求項６または７記載の方法。 The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 445 nm to 455 nm is in the range of 200 μmol m −2 s −1 to 300 μmol m −2 s −1 , and the light irradiation time is 1 hour to 14 days. The method according to claim 6 or 7. スクアレンエポキシダーゼ遺伝子が、以下の（a）〜（f）からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法：
（a）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（b）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（e）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（f）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the squalene epoxidase gene contains a polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (f):
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) a polynucleotide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and encoding a protein having squalene epoxidase activity;
(D) a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having squalene epoxidase activity;
(E) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under a highly stringent condition and encodes a protein having squalene epoxidase activity; and (f) It encodes a protein having a squalene epoxidase activity that hybridizes with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 under highly stringent conditions. Polynucleotide. スクアレンエポキシダーゼ遺伝子が、配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、請求項１０記載の方法。 The method according to claim 10, wherein the squalene epoxidase gene contains a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. 植物が、双子葉植物綱の植物である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the plant is a dicotyledonous plant. 植物に光を照射することを含む、2,3-オキシドスクアレンまたはその代謝物の製造方法。 A method for producing 2,3-oxide squalene or a metabolite thereof, comprising irradiating a plant with light. 2,3-オキシドスクアレンの製造方法である請求項１３記載の製造方法。 The production method according to claim 13, which is a production method of 2,3-oxide squalene. 2,3-オキシドスクアレンの代謝物の製造方法である請求項１３記載の製造方法。 14. The method according to claim 13, which is a method for producing a metabolite of 2,3-oxide squalene. 2,3-オキシドスクアレンの代謝物が、トリテルペンおよびサポニンからなる群から選択される、請求項１５記載の製造方法。 The production method according to claim 15, wherein the metabolite of 2,3-oxidesqualene is selected from the group consisting of triterpenes and saponins. 2,3-オキシドスクアレンの代謝物がトリテルペノイドサポニンである、請求項１６記載の製造方法。 The method according to claim 16, wherein the metabolite of 2,3-oxidesqualene is a triterpenoid saponin. 光が、435nm〜480nmの波長領域内の波長成分を含む、請求項１３〜１７のいずれかに記載の製造方法。 The manufacturing method according to any one of claims 13 to 17, wherein the light includes a wavelength component in a wavelength region of 435 nm to 480 nm. 435nm〜480nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である、請求項１８記載の製造方法。 Photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 435nm~480nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1, a manufacturing method of claim 18, wherein. 480nm〜3000nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、10μmol m-2s-1以下であり、200nm〜435nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、10μmol m-2s-1以下である、請求項１９記載の製造方法。 The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 480 nm to 3000 nm is 10 μmol m −2 s −1 or less, and the photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 200 nm to 435 nm is 10 μmol m −2 s −1. The manufacturing method of Claim 19 which is the following. 光が、445nm〜455nmの波長領域内の波長成分を含む、請求項１３〜１７のいずれかに記載の製造方法。 The production method according to claim 13, wherein the light includes a wavelength component in a wavelength region of 445 nm to 455 nm. 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である、請求項２１記載の製造方法。 Photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 445nm~455nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1, a manufacturing method of claim 21, wherein. 455nm〜3000nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、1μmol m-2s-1以下であり、200nm〜445nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、1μmol m-2s-1以下である、請求項２２記載の製造方法。 The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 455 nm to 3000 nm is 1 μmol m −2 s −1 or less, and the photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 200 nm to 445 nm is 1 μmol m −2 s −1. The manufacturing method of Claim 22 which is the following. 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜200μmol m-2s-1の範囲内であり、光の照射時間が1日以上である、請求項２２または２３記載の製造方法。 Photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 445nm~455nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~200μmol m -2 s -1, the irradiation time of the light is more than 1 day, claim 24. The production method according to 22 or 23. 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、200μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内であり、光の照射時間が1時間〜14日である、請求項２２または２３記載の製造方法。 The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 445 nm to 455 nm is in the range of 200 μmol m −2 s −1 to 300 μmol m −2 s −1 , and the light irradiation time is 1 hour to 14 days, The manufacturing method according to claim 22 or 23. スクアレンエポキシダーゼ遺伝子が、以下の（a）〜（f）からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、請求項１３〜２５のいずれかに記載の製造方法：
（a）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（b）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（e）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（f）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 The production method according to any one of claims 13 to 25, wherein the squalene epoxidase gene contains a polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (f):
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and has squalene epoxidase activity A polynucleotide encoding the protein;
(D) a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having squalene epoxidase activity;
(E) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under a highly stringent condition and encodes a protein having squalene epoxidase activity; and (f) It encodes a protein having a squalene epoxidase activity that hybridizes with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 under highly stringent conditions. Polynucleotide. スクアレンエポキシダーゼ遺伝子が、配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、請求項２６記載の製造方法。 27. The production method according to claim 26, wherein the squalene epoxidase gene contains a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. 植物が、双子葉植物綱の植物である、請求項１３〜２７のいずれかに記載の製造方法。 The production method according to any one of claims 13 to 27, wherein the plant is a dicotyledonous plant. 植物に光を照射することを含む、2,3-オキシドスクアレンまたはその代謝物の生産能を向上させる方法。 A method for improving the ability to produce 2,3-oxidesqualene or a metabolite thereof, comprising irradiating a plant with light. 2,3-オキシドスクアレンの生産能を向上させる方法である請求項２９記載の方法。 30. The method according to claim 29, which is a method for improving the production ability of 2,3-oxide squalene. 2,3-オキシドスクアレンの代謝物の生産能を向上させる方法である請求項２９記載の方法。 30. The method according to claim 29, which is a method for improving the ability to produce a metabolite of 2,3-oxide squalene. 2,3-オキシドスクアレンの代謝物が、トリテルペンおよびサポニンからなる群から選択される、請求項３１記載の方法。 32. The method of claim 31, wherein the 2,3-oxide squalene metabolite is selected from the group consisting of triterpenes and saponins. 2,3-オキシドスクアレンの代謝物がトリテルペノイドサポニンである、請求項３２記載の製造方法。 The production method according to claim 32, wherein the metabolite of 2,3-oxidesqualene is a triterpenoid saponin. 光が、435nm〜480nmの波長領域内の波長成分を含む、請求項２９〜３３のいずれかに記載の方法。 34. A method according to any of claims 29 to 33, wherein the light comprises a wavelength component in the wavelength region of 435nm to 480nm. 435nm〜480nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である、請求項３４記載の方法。 Photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 435nm~480nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1, method of claim 34, wherein. 480nm〜3000nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、10μmol m-2s-1以下であり、200nm〜435nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、10μmol m-2s-1以下である、請求項３５記載の方法。 The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 480 nm to 3000 nm is 10 μmol m −2 s −1 or less, and the photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 200 nm to 435 nm is 10 μmol m −2 s −1. 36. The method of claim 35, wherein: 光が、445nm〜455nmの波長領域内の波長成分を含む、請求項２９〜３３のいずれかに記載の方法。 34. A method according to any of claims 29 to 33, wherein the light comprises a wavelength component in the wavelength region of 445nm to 455nm. 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内である、請求項３７記載の方法。 Photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 445nm~455nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~300μmol m -2 s -1, 38. The method of claim 37. 455nm〜3000nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、1μmol m-2s-1以下であり、200nm〜445nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、1μmol m-2s-1以下である、請求項３８記載の方法。 The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 455 nm to 3000 nm is 1 μmol m −2 s −1 or less, and the photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 200 nm to 445 nm is 1 μmol m −2 s −1. 40. The method of claim 38, wherein: 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、50μmol m-2s-1〜200μmol m-2s-1の範囲内であり、光の照射時間が1日以上である、請求項３８または３９記載の方法。 Photon flux density of the wavelength component in the wavelength range of 445nm~455nm is in the range of 50μmol m -2 s -1 ~200μmol m -2 s -1, the irradiation time of the light is more than 1 day, claim 40. The method according to 38 or 39. 445nm〜455nmの波長領域内の波長成分の光量子束密度が、200μmol m-2s-1〜300μmol m-2s-1の範囲内であり、光の照射時間が1時間〜14日である、請求項３８または３９記載の方法。 The photon flux density of the wavelength component in the wavelength region of 445 nm to 455 nm is in the range of 200 μmol m −2 s −1 to 300 μmol m −2 s −1 , and the light irradiation time is 1 hour to 14 days. 40. A method according to claim 38 or 39. スクアレンエポキシダーゼ遺伝子が、以下の（a）〜（f）からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、請求項２９〜４１のいずれかに記載の方法：
（a）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（b）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（e）配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（f）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスクアレンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 The method according to any one of claims 29 to 41, wherein the squalene epoxidase gene contains a polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (f):
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and has squalene epoxidase activity A polynucleotide encoding the protein;
(D) a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having squalene epoxidase activity;
(E) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under a highly stringent condition and encodes a protein having squalene epoxidase activity; and (f) It encodes a protein having a squalene epoxidase activity that hybridizes with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 under highly stringent conditions. Polynucleotide. スクアレンエポキシダーゼ遺伝子が、配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、請求項４２記載の方法。 43. The method according to claim 42, wherein the squalene epoxidase gene contains a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. 植物が、双子葉植物綱の植物である、請求項２９〜４３のいずれかに記載の方法。 44. The method according to any of claims 29 to 43, wherein the plant is a dicotyledonous plant.
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