JP2008241704A - New stress biomarker and its application - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法や、ストレスの判定方法やストレス診断用キットに関する。 The present invention relates to a screening method for a stress suppressing substance or a stress enhancing substance, a stress determination method, and a stress diagnostic kit.
厚生労働省の平成１４年国民栄養調査結果によると、普段の生活でストレスを感じている人は、男性で７６．９％、女性で８４．２％にも上る。一般的にストレスの要因には、物理的（寒冷、放射線、騒音）、化学的（薬物、ビタミン不足、Ｏ２欠乏）、生物的（細菌感染）なもの以外に、環境やライフサイクルの変化、仕事・家庭の問題や複雑な人間関係なども含まれている。ストレスは様々な病気の原因となり、例えば、ストレスが原因で発症したと考えられる消化性潰瘍、すなわちストレス性潰瘍などは大きな社会問題となっている。 According to the Ministry of Health, Labor and Welfare's 2002 National Nutrition Survey, 76.9% of men and 84.2% of women feel stressed in their daily lives. In general, stress factors include physical (cold, radiation, noise), chemical (drug, vitamin deficiency, O 2 deficiency) and biological (bacterial infection), as well as changes in the environment and life cycle, It includes work / family issues and complex relationships. Stress causes various illnesses. For example, peptic ulcer that is thought to have developed due to stress, that is, stress ulcer, has become a major social problem.
生体におけるストレスを測定する方法としては、例えば、新規ストレスタンパク質ｐ２０の抗体を用いたストレスタンパク質ｐ２０の測定方法や（例えば、特許文献１参照）、ヒト老化マーカー及びストレスマーカーを認識するＡｓｐ１５１がβＤ体であるαＡクリスタリンに対して特異的な抗体を提供し、この抗体を組織・細胞に適用して、人の老化又は人のストレスのマーカーを検出するための方法や（例えば、特許文献２参照）、哺乳動物の血液中に存在するトリプトファンの濃度の変化率を指標にストレスを測定することを特徴とする測定方法（例えば、特許文献３参照）や、一定の個体のストレス量の指示要素として遊離の唾液中の副腎皮質ホルモンの量を用いてその視床下部−副腎の系における活性を測定することにより一定の哺乳類動物におけるストレスの量を測定するための方法（例えば、特許文献４参照）等が知られている。 As a method for measuring stress in a living body, for example, a method for measuring stress protein p20 using an antibody of novel stress protein p20 (see, for example, Patent Document 1), Asp 151 that recognizes a human aging marker and a stress marker is βD A method for detecting a marker of human aging or human stress by providing an antibody specific to αA crystallin, which is a body, and applying the antibody to tissues or cells (see, for example, Patent Document 2) ), A measuring method characterized by measuring stress using the rate of change in the concentration of tryptophan present in the blood of mammals as an indicator (for example, see Patent Document 3), and as an indicator of the stress amount of a certain individual By measuring the activity in the hypothalamic-adrenal system using the amount of adrenal cortex hormone in free saliva The method for determining the amount of stress in the milk such animals (e.g., see Patent Document 4), and the like.
アポリポタンパク質Ｈは、血清アポリポタンパク質の一種であり、β２−グリコプロテイン１ともいわれている。原発性糸球体疾患、閉塞性腎障害などの腎障害において、尿中クレアチニン量と相関的に尿中アポリポタンパク質Ｈが増加する（例えば、非特許文献１参照）。 Apolipoprotein H is a kind of serum apolipoprotein and is also referred to as β2-glycoprotein 1. In renal disorders such as primary glomerular disease and obstructive nephropathy, urinary apolipoprotein H increases in correlation with urinary creatinine level (see, for example, Non-Patent Document 1).
フェチュインは血清中の糖タンパク質であり、ＡとＢの２タイプがあり、フェチュインＢがフェチュインβに相当する（例えば、非特許文献２参照）。フェチュインＢはフェチュインＡとホモロジーを有するが、アミノ酸配列には違いがみられる。フェチュインＡはヒト、ヒツジ、ウシ、げっ歯類で確認されており、フェチュインＢはヒトとげっ歯類で確認されている（例えば、非特許文献３参照）。フェチュインは骨形成を調節するタンパク質であり、不要な骨の石灰化を抑制する働きを持つ。フェチュインの血清中ｍＲＮＡ発現量は、ヒトにおいては女性のほうが高いという報告がある（例えば、非特許文献４参照）。 Fetuin is a glycoprotein in serum, and there are two types, A and B, and fetuin B corresponds to fetuin β (see, for example, Non-Patent Document 2). Fetuin B has homology with fetuin A, but there are differences in amino acid sequence. Fetuin A has been confirmed in humans, sheep, cows, and rodents, and fetuin B has been confirmed in humans and rodents (see, for example, Non-Patent Document 3). Fetuin is a protein that regulates bone formation and acts to suppress unwanted bone mineralization. There is a report that fetuin's serum mRNA expression level is higher in women than in humans (see, for example, Non-Patent Document 4).
アクチンβは、筋肉の収縮性タンパク質であり、哺乳類では６種のアイソアクチンがあり、α（骨格筋型）、β（一般細胞）、γ（平滑筋、細胞）と区別される（例えば、非特許文献５参照）。外傷などによる細胞傷害で血中に遊離したアクチンは、ビタミンＤ結合タンパク質に補足される（例えば、非特許文献６参照）。 Actin β is a muscle contractile protein, and in mammals, there are six types of isoactins, which are distinguished from α (skeletal muscle type), β (general cells), and γ (smooth muscle, cells) (for example, non-actin). Patent Document 5). Actin released into the blood due to cell injury due to trauma or the like is supplemented by vitamin D-binding protein (see, for example, Non-Patent Document 6).
エノラーゼは解糖系の酵素であり「２−ホスホグリセリン酸⇔ホスホエノールピルビン酸」の可逆反応を触媒する。エノラーゼはα，β，γの３種類のサブユニットの組合せから成る二量体構造をもつ。αは主に細胞、βは主に筋肉、γは主に神経に存在するサブユニットである。このうちαγ及びγγ型のエノラーゼは主に神経細胞や軸索突起に存在するため、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）と呼ばれている（例えば、非特許文献７参照）。ＮＳＥは神経内分泌腫瘍や肺がん、特に肺小細胞がんの腫瘍マーカーとして広く用いられている（例えば、非特許文献８参照）。 Enolase is a glycolytic enzyme that catalyzes the reversible reaction of “2-phosphoglycerate-phosphoenolpyruvate”. Enolase has a dimeric structure composed of a combination of three subunits, α, β, and γ. α is mainly a cell, β is mainly a muscle, and γ is a subunit mainly present in a nerve. Of these, αγ and γγ-type enolases are mainly present in nerve cells and axons, and are therefore referred to as nerve-specific enolase (NSE) (see, for example, Non-Patent Document 7). NSE is widely used as a tumor marker for neuroendocrine tumors and lung cancer, particularly small cell lung cancer (see Non-Patent Document 8, for example).
本発明の課題は、新規なストレスバイオマーカーを利用したストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法や、ストレスの判定方法や、ストレス診断用キットを提供することにある。 An object of the present invention is to provide a screening method for a stress suppressor or stress enhancer using a novel stress biomarker, a stress determination method, and a stress diagnostic kit.
本発明者らは、先にストレスに関与する有効なバイオマーカーを探索するため、ストレス発症前後において、二次元電気泳動（以下、２−Ｄともいう。）法により血液中の発現タンパク質の解析を行い、ストレス発症後の２−Ｄ像には、ストレス発症前の２−Ｄ像とは、異なるスポット群の発現を確認した。このスポット群は、ｐＨ６．０〜７．０、分子量４０〜５５ｋＤａ付近に数種類見出され、これらのスポットのうち２つをクレアチンキナーゼと同定している（特願２００６−２５７１５２）。また、等電点５．０〜６．２、分子量３０〜６０ｋＤａに現れるスポットのうちアポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、ハプトグロビン、及びビタミンＤ結合タンパク質プリカーサーを同定している（特願２００７−１８１６４）。さらに、別のバイオマーカーを探索するため、鋭意研究を重ねたところストレス発症後にその発現量の増減が見られる新たなスポット群を等電点３．５〜８．０、分子量３５〜５０ｋＤａ付近に見い出し、アポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、及びエノラーゼβと同定して、本発明を完成するに至った。 In order to search for an effective biomarker related to stress, the present inventors previously analyzed the expressed protein in blood by two-dimensional electrophoresis (hereinafter also referred to as 2-D) before and after stress onset. In the 2-D image after the onset of stress, expression of a spot group different from the 2-D image before the onset of stress was confirmed. Several types of this spot group are found in the vicinity of pH 6.0 to 7.0 and molecular weight of 40 to 55 kDa, and two of these spots are identified as creatine kinase (Japanese Patent Application No. 2006-257152). In addition, apolipoprotein E, apolipoprotein A-IV, haptoglobin, and vitamin D-binding protein precursor have been identified among spots appearing at an isoelectric point of 5.0 to 6.2 and a molecular weight of 30 to 60 kDa (Japanese Patent Application No. 2007- 18164). Furthermore, in order to search for another biomarker, as a result of extensive research, a new spot group in which the expression level is increased or decreased after onset of stress is found at an isoelectric point of 3.5 to 8.0 and a molecular weight of 35 to 50 kDa. As a result, they were identified as apolipoprotein H, fetuin β, actin β, and enolase β, and the present invention was completed.
すなわち本発明は、（１）非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清を二次元電気泳動に供試して、ストレスを負荷する前後にその発現量が変化するタンパク質であるアクチンβ、エノラーゼβ、アポリポタンパク質Ｈ及びフェチュインβの４種のタンパク質のうちのいずれか１種以上を検出し、被験物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とするストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法や、（２）非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清からアポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、及びエノラーゼβのいずれか１種以上のタンパク質、又はこれらのいずれかに特異的に結合する抗体を検出し、被験物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とするストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法に関する。 That is, the present invention is (1) administering a test substance to a non-human mammal before or after stress is applied, and subjecting the serum of the non-human mammal administered with the test substance to two-dimensional electrophoresis, When detecting any one or more of the four proteins, actin β, enolase β, apolipoprotein H, and fetuin β, whose expression levels change before and after stress is applied and do not administer the test substance A screening method for stress-suppressing substances or stress-enhancing substances characterized by comparison and evaluation with (2) a test substance is administered to a non-human mammal before or after stress is applied, and the test substance is administered Any one or more proteins of apolipoprotein H, fetuin β, actin β, and enolase β from the serum of a non-human mammal Or detecting an antibody which specifically binds to any of these, a screening method of stress inhibitor or stress enhancers and comparing and evaluating the case without administration of the test substance.
また本発明は、（３）哺乳動物から採取した血清を二次元電気泳動に供試して、ストレスを負荷する前後にその発現量が変化するタンパク質であるアクチンβ及びエノラーゼβ、アポリポタンパク質Ｈ及びフェチュインβの４種のタンパク質のうちのいずれか１種以上を検出し、健常な哺乳動物から採取した血清の場合と比較・評価することを特徴とするストレスの判定方法や、（４）哺乳動物から採取した血清中のアポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、及びエノラーゼβのいずれか１種以上のタンパク質、又はこれらのいずれかに特異的に結合する抗体を検出し、健常な哺乳動物から採取した血清の場合と比較・評価することを特徴とするストレスの判定方法に関する。 The present invention also provides (3) actin β and enolase β, apolipoprotein H, and fetuin, which are proteins whose expression levels change before and after stress is applied to two-dimensional electrophoresis using serum collected from a mammal. a method for determining stress, wherein any one or more of the four proteins of β are detected and compared with the case of serum collected from a healthy mammal, or (4) from a mammal The apolipoprotein H, fetuin β, actin β, and enolase β in the collected serum were detected from one or more proteins, or an antibody that specifically binds to any of these, and collected from a healthy mammal The present invention relates to a stress determination method characterized by comparing and evaluating with serum.
さらに本発明は、（５）アポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、及びエノラーゼβのうちのいずれか１種以上のタンパク質、若しくはこれらのいずれかに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とするストレス診断用キットに関する。 Furthermore, the present invention provides (5) an antibody that specifically binds to any one or more of apolipoprotein H, fetuin β, actin β, and enolase β, or any of these, or a label thereof It is related with the kit for stress diagnosis characterized by having provided.
本発明のストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法によれば、ストレスを負荷させて被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清を二次元電気泳動に供試して、等電点３．５〜８．０、分子量３５〜５０ｋＤａ付近に現れるスポットを検出することにより行うため、従来のように試験動物を殺すことなく、ストレス抑制物質又はストレス増強物質をスクリーニングすることができる。上記ストレス抑制物質はストレス治療剤として有用であり、ストレス増強物質はストレス発症の機構を解明する上で有用である可能性がある。 According to the screening method for a stress-suppressing substance or stress-enhancing substance of the present invention, a serum of a non-human mammal to which a test substance is administered after stress is applied to two-dimensional electrophoresis, and an isoelectric point of 3.5 to Since it is performed by detecting a spot appearing in the vicinity of 8.0 and a molecular weight of 35 to 50 kDa, it is possible to screen for a stress suppressor or stress enhancer without killing the test animal as in the prior art. The stress suppressor is useful as a stress therapeutic agent, and the stress enhancer may be useful in elucidating the mechanism of stress onset.
また、本発明の判定方法によれば、ストレスを発症した際に血液中に発現する新規ストレスバイオマーカー又はそれに対する抗体を検出することで、非侵襲的にストレスの判定が可能であるため、簡便かつ迅速に実験動物やペット、ヒト等のストレスを検出することができ、前記新規ストレスバイオマーカーを含有するストレス診断用キットは、汎用性に富み、高精度かつ高感度でストレスを判定することができる。 In addition, according to the determination method of the present invention, it is possible to determine stress in a noninvasive manner by detecting a novel stress biomarker that is expressed in the blood when stress develops or an antibody thereto. The stress diagnostic kit containing the novel stress biomarker can detect stress in laboratory animals, pets, humans, etc. quickly and is versatile, and can determine stress with high accuracy and high sensitivity. it can.
本発明のストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法としては、非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清を二次元電気泳動に供試して、ストレスを負荷する前後にその発現量が変化するタンパク質であるアクチンβ、エノラーゼβ、アポリポタンパク質Ｈ及びフェチュインβの４種のタンパク質のうちのいずれか１種以上を検出し、被験物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とするストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法（以下、スクリーニング方法［１］ともいう。）や、非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清からアポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、及びエノラーゼβのいずれか１種以上のタンパク質、又は、アポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、及びエノラーゼβのいずれかに特異的に結合する抗体を検出し、被験物質を投与しない場合と比較・評価する方法（以下、スクリーニング方法［２］ともいう。）であれば特に制限されず、上記非ヒト哺乳動物としては、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、サル等を挙げることができる。上記ストレスを負荷する方法としては、水浸法、拘束法、水浸拘束法、床電撃法等の公知のストレス負荷方法を挙げることができる。また、上記被験物質としては、ペプチド、タンパク質、核酸、合成化合物、微生物発酵物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物、動物細胞抽出物等を挙げることができる。なお、本発明において、血清には、便宜上血漿も含まれる。 As a screening method for a stress-suppressing substance or stress-enhancing substance of the present invention, a test substance is administered to a non-human mammal before or after stress is applied, and the serum of the non-human mammal to which the test substance is administered is used. Dimensional electrophoresis is used to detect any one or more of the four proteins, actin β, enolase β, apolipoprotein H, and fetuin β, whose expression levels change before and after stress is applied. In addition, a stress-reducing substance or stress-enhancing substance screening method (hereinafter also referred to as screening method [1]) characterized in that it is compared / evaluated with the case where no test substance is administered, or stress is applied to a non-human mammal. A test substance is administered before, after or simultaneously with the loading, and the apolipoprotein is obtained from the serum of the non-human mammal to which the test substance is administered. Detecting one or more proteins of protein H, fetuin β, actin β, and enolase β, or an antibody that specifically binds to any of apolipoprotein H, fetuin β, actin β, and enolase β, The non-human mammal is not particularly limited as long as it is a method for comparison / evaluation with the case where the test substance is not administered (hereinafter also referred to as screening method [2]). Examples of the non-human mammal include dogs, cats, rabbits, rats, mice, Examples include monkeys. Examples of the method for applying the stress include known stress loading methods such as a water immersion method, a restraint method, a water immersion restraint method, and a floor electric shock method. Examples of the test substance include peptides, proteins, nucleic acids, synthetic compounds, microbial fermentation products, marine organism extracts, plant extracts, prokaryotic cell extracts, eukaryotic single cell extracts, animal cell extracts, and the like. it can. In the present invention, serum includes plasma for convenience.
本発明における二次元電気泳動法としては、例えば等電点と分子量というタンパク質の有する２つの物性面から分離を行う方法であれば特に制限されるものではなく、一般的には、まずキャピラリーゲルや市販のストリップゲルなどを分離媒体として等電点電気泳動を行い、泳動を終了したゲルを第２の平面状のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（slab gel）に載せ、等電点電気泳動の展開方向に対して直角の方向に電気泳動することにより行うことができ、より好適には文献（J. Korean Med. Sci., 18(4) 505 2003 ； Electrophoresis, 23(15), 2513 2002）記載の方法や、（Tonge R., Shaw J., Middleton B., Rowlinson R., Rayner S., Young J., Pognan F., Hawkins E., Currie I. and Davison M. :Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics, 1(3), 377-396 (2001)）記載の方法や、下記実施例による方法を挙げることができる。下記実施例に記載した方法が、ストレス負荷後に変化するタンパク質の増減を視覚できるため、被験物質を投与しない場合との比較・評価の点から好ましい。 The two-dimensional electrophoresis method in the present invention is not particularly limited as long as it is a method that separates from two physical properties of proteins such as an isoelectric point and a molecular weight. Isoelectric focusing is performed using a commercially available strip gel or the like as a separation medium, and the gel after the electrophoresis is placed on a second planar SDS-polyacrylamide gel (slab gel) in the developing direction of isoelectric focusing. The method described in the document (J. Korean Med. Sci., 18 (4) 505 2003; Electrophoresis, 23 (15), 2513 2002) is more preferable. (Tonge R., Shaw J., Middleton B., Rowlinson R., Rayner S., Young J., Pognan F., Hawkins E., Currie I. and Davison M .: Validation and development of fluorescence two- dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology.Proteomics, 1 (3), 377-396 (2001)) and the methods according to the following examples. The methods described in the following examples are preferable from the viewpoint of comparison / evaluation with the case where the test substance is not administered because the increase / decrease of the protein that changes after stress loading can be visually observed.
上記スクリーニング方法［１］における好ましい態様として、マウス等の非ヒト哺乳動物に、水浸拘束法によりストレスを負荷する前後又は同時に、被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清を二次元電気泳動に供試して、ストレスを負荷する前後にその発現量が増加するタンパク質であるアクチンβ及びエノラーゼβ、ストレスを負荷する前後にその発現量が減少するタンパク質であるアポリポタンパク質Ｈ及びフェチュインβの４種のタンパク質のうちのいずれか１種以上を検出し、被験物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とするストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法を挙げることができ、この方法において、被験物質を投与しない場合と比較して、被験物質を投与した場合に、アポリポタンパク質Ｈ及び／又はフェチュインβが減少し、あるいは、アクチンβ及び／又はエノラーゼβが増加したとき、被験物質はストレス増強物質と評価され、他方、被験物質を投与しない場合と比較して、被験物質を投与した場合に、アポリポタンパク質Ｈ及び／又はフェチュインβの減少が抑制され、あるいは、アクチンβ及び／又はエノラーゼβの増加が抑制されたとき、被験物質はストレス抑制物質と評価される。なお、スポットの種類の減少やスポットの検出量の減少及び増大の判定は、例えばクマシーブルー等の染色液やＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の蛍光物質にてスポットを視覚化することで容易に行うことができ、また前記スポットを切り出し、トリプシン等のプロテアーゼで消化し抽出された成分を質量分析等により直接定量し、その増減を判定することにより行うこともできる。 In a preferred embodiment of the screening method [1], a test substance is administered to a non-human mammal such as a mouse before or after stress is applied by the water immersion restraint method, and the non-human mammal to which the test substance is administered is administered. Serum is subjected to two-dimensional electrophoresis, and actin β and enolase β are proteins whose expression level increases before and after stress is applied, and apolipoprotein H is a protein whose expression level decreases before and after stress is applied. And a screening method for a stress suppressor or stress enhancer, characterized in that any one or more of the four proteins of fetuin β is detected and compared with the case where no test substance is administered. In this method, when the test substance is administered compared to the case where the test substance is not administered. When apolipoprotein H and / or fetuin β is decreased or actin β and / or enolase β is increased, the test substance is evaluated as a stress enhancer, whereas the test substance is compared with the case where no test substance is administered. When the substance is administered, the decrease in apolipoprotein H and / or fetuin β is suppressed, or the increase in actin β and / or enolase β is suppressed, the test substance is evaluated as a stress suppressor. In addition, it is easy to determine the decrease in the type of spot and the decrease and increase in the detected amount of the spot by visualizing the spot with a staining solution such as Coomassie blue or a fluorescent substance such as Cy2, Cy3, or Cy5. Alternatively, the spot can be cut out, and the components extracted by digestion with a protease such as trypsin can be directly quantified by mass spectrometry or the like, and the increase / decrease can be determined.
また、アポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、及びエノラーゼβとして同定されていることから、上記スクリーニング方法［２］のように、例えばストレスを負荷させた非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物から、アポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、及びエノラーゼβのうちのいずれか一種以上のタンパク質、又はこれらのいずれかに特異的に結合する抗体を検出することにより、ストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニングすることも可能であり、スクリーニング方法［２］において、マウス等の非ヒト哺乳動物に水浸拘束法によりストレスを負荷する場合、被験物質を投与しない場合と比較して、被験物質を投与した場合に、アポリポタンパク質Ｈ及び／若しくはフェチュインβの検出量、又はアポリポタンパク質Ｈ及び／若しくはフェチュインβに特異的に結合する抗体の検出量が増大し、あるいは、アクチンβ及び／若しくはエノラーゼβの検出量、又はアクチンβ及び／若しくはエノラーゼβに特異的に結合する抗体の検出量が減少したとき、被験物質はストレス抑制物質と評価される。他方、被験物質を投与しない場合と比較して、被験物質を投与した場合に、アポリポタンパク質Ｈ及び／若しくはフェチュインβの検出量、又はアポリポタンパク質Ｈ及び／若しくはフェチュインβに特異的に結合する抗体の検出量が減少し、あるいは、アクチンβ及び／若しくはエノラーゼβの検出量、又はアクチンβ及び／若しくはエノラーゼβに特異的に結合する抗体の検出量が増大した場合、被験物質はストレス増強物質と評価される。 Further, since it is identified as apolipoprotein H, fetuin β, actin β, and enolase β, the test substance is administered to a non-human mammal loaded with stress, for example, as in the above screening method [2], An antibody that specifically binds to any one or more of apolipoprotein H, fetuin β, actin β, and enolase β, or any of these proteins is detected from a non-human mammal administered with the test substance. It is also possible to screen for a stress suppressor or stress enhancer, and in the screening method [2], when stress is applied to a non-human mammal such as a mouse by a water immersion restraint method, the test substance is not administered. Compared to the case, when the test substance is administered, apolipoprotein H and / or Alternatively, the detection amount of fetuin β or the detection amount of an antibody that specifically binds to apolipoprotein H and / or fetuin β is increased, or the detection amount of actin β and / or enolase β, or actin β and / or When the detected amount of an antibody that specifically binds to enolase β decreases, the test substance is evaluated as a stress suppressor. On the other hand, the amount of apolipoprotein H and / or fetuin β detected or the amount of an antibody that specifically binds to apolipoprotein H and / or fetuin β when the test substance is administered, compared to the case where the test substance is not administered. The test substance is evaluated as a stress potentiator when the detection level decreases or the detection level of actin β and / or enolase β or the detection level of an antibody that specifically binds to actin β and / or enolase β increases. Is done.
アポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、又はエノラーゼβ、あるいはこれらのいずれかのタンパク質に特異的に結合する抗体の検出方法としては特に制限されないが、具体的には、抗原と抗体の結合反応を利用した免疫学的検出法等を好適に挙げることができる。例えば、アポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、又はエノラーゼβの検出方法としては、標識した抗アポリポタンパク質Ｈモノクローナル抗体、標識した抗フェチュインβモノクローナル抗体、標識した抗アクチンβモノクローナル抗体、又は標識した抗エノラーゼβモノクローナル抗体を用い、また、アポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、又はエノラーゼβに特異的に結合する抗体の検出方法としては、標識又はペプチドタグ化したアポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、又はエノラーゼβを用いて、例えばイムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法等の免疫学的検出法を挙げることができる。標識物質としては、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。 The method for detecting an antibody that specifically binds to apolipoprotein H, fetuin β, actin β, or enolase β, or any of these proteins is not particularly limited. Specifically, the antigen-antibody binding reaction is performed. Preferred examples include immunological detection methods that have been used. For example, as a method for detecting apolipoprotein H, fetuin β, actin β, or enolase β, a labeled anti-apolipoprotein H monoclonal antibody, a labeled anti-fetuin β monoclonal antibody, a labeled anti-actin β monoclonal antibody, or a labeled anti-antibody As a method for detecting an antibody that specifically binds to apolipoprotein H, fetuin β, actin β, or enolase β using an enolase β monoclonal antibody, labeled or peptide-tagged apolipoprotein H, fetuin β, actin β Or, enolase β can be used to list immunological detection methods such as immunochromatography and ELISA. Specific examples of the labeling substance include enzymes such as alkaline phosphatase and HRP, Fc regions of antibodies, fluorescent substances such as GFP, and peptide tags include epitope tags such as HA, FLAG, and Myc, Specific examples of conventionally known peptide tags such as affinity tags such as GST, maltose-binding protein, biotinylated peptide, oligohistidine and the like can be exemplified.
本発明のストレスの判定方法としては、哺乳動物から採取した血清を二次元電気泳動に供試して、ストレスを負荷する前後にその発現量が変化するタンパク質であるアクチンβ及びエノラーゼβ、アポリポタンパク質Ｈ及びフェチュインβの４種のタンパク質のうちのいずれか１種以上を検出し、健常な哺乳動物から採取した血清の場合と比較・評価する方法（以下、ストレス判定方法［１］ともいう。）や、哺乳動物から採取した血清中のアポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、及びエノラーゼβのいずれか１種以上のタンパク質、又はこれらのいずれかに特異的に結合する抗体を検出し、健常な哺乳動物から採取した血清の場合と比較・評価する方法（以下、ストレス判定方法［２］ともいう。）であれば特に制限されず、上記哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、サル等を挙げることができる。また、ストレス判定方法［１］やストレス判定方法［２］において、二次元電気泳動を実施したり、アポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、又はエノラーゼβの検出、あるいは、アポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、又はエノラーゼβに特異的に結合する抗体を検出するには、上述した方法を用いることができる。また、本発明に用いる比較対象試料としての健常な哺乳動物の血清は、ストレスが負荷されていない健常な哺乳動物の血清を使用することができる。 As a method for determining stress of the present invention, serum collected from a mammal is subjected to two-dimensional electrophoresis, and actin β, enolase β, and apolipoprotein H, which are proteins whose expression levels change before and after stress is applied. And one or more of the four proteins of fetuin β are detected and compared with the case of serum collected from a healthy mammal (hereinafter also referred to as stress determination method [1]), Detecting apolipoprotein H, fetuin β, actin β, and enolase β in serum collected from mammals, or antibodies that specifically bind to any of these proteins, There is no particular limitation as long as it is a method for comparison / evaluation with serum collected from animals (hereinafter also referred to as stress determination method [2]). Mammals can include humans, dogs, cats, rabbits, rats, mice, and monkeys. In the stress determination method [1] and stress determination method [2], two-dimensional electrophoresis is performed, apolipoprotein H, fetuin β, actin β, or enolase β is detected, or apolipoprotein H, fetuin β In order to detect an antibody that specifically binds to actin β or enolase β, the above-described method can be used. Moreover, the serum of the healthy mammal which is not stressed can be used for the serum of the healthy mammal as a comparison object sample used for this invention.
例えば、ジョギングが得意でない人にとってはジョギングはストレスになることから、
かかるジョギングによるストレスの場合、上記ストレス判定方法［１］において、健常な哺乳動物から採取した血清の場合と比較して、アクチンβ及び／又はアポリポタンパク質Ｈの検出量が増加しているとき、評価対象の哺乳動物はストレスと判定されることになる。また、上記ストレス判定方法［１］において、健常な哺乳動物から採取した血清の場合と比較して、フェチュインβの検出量が減少しているとき、評価対象の哺乳動物はストレスと判定されることになる。
For example, jogging can be stressful for people who are not good at jogging,
In the case of stress due to jogging, evaluation is performed when the amount of detected actin β and / or apolipoprotein H is increased in the stress determination method [1] as compared to serum collected from a healthy mammal. The subject mammal will be determined to be stressed. In addition, in the stress determination method [1], when the detected amount of fetuin β is reduced as compared to the case of serum collected from a healthy mammal, the mammal to be evaluated is determined to be stressed. become.
同様に、ジョギングによるストレスの場合、上記ストレス判定方法［２］において、健常な哺乳動物から採取した血清の場合と比較して、フェチュインβ、あるいはフェチュインβに特異的に結合する抗体の検出量が減少したとき、評価対象の哺乳動物はストレスと判定されることになる。また、上記ストレス判定方法［２］において、アクチンβ及び／又はアポリポタンパク質Ｈ、あるいは、アクチンβ及び／又はアポリポタンパク質Ｈに特異的に結合する抗体の検出量が増加したとき、評価対象の哺乳動物はストレスと判定されることになる。 Similarly, in the case of stress due to jogging, in the stress determination method [2], compared to the case of serum collected from a healthy mammal, the detected amount of fetuin β or an antibody that specifically binds to fetuin β is higher. When decreased, the mammal to be evaluated is determined to be stressed. In addition, in the stress determination method [2], when the detected amount of actin β and / or apolipoprotein H or an antibody that specifically binds to actin β and / or apolipoprotein H increases, the mammal to be evaluated Will be judged as stress.
本発明のストレスの判定方法を用いると、例えばストレスに起因する、胃潰瘍、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎等の消化器系疾患、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、不整脈等の心血管系の疾患、筋肉疲労、慢性関節リウマチ、腰痛症、片頭痛、緊張性頭痛等の筋骨格系の疾患、気管支喘息、過呼吸症候群等の呼吸器系の疾患、種々の糖尿病合併症、脳神経疾患などを早期に発見することができる。 Using the stress determination method of the present invention, for example, gastrointestinal diseases such as gastric ulcer, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, cardiovascular such as hypertension, angina pectoris, myocardial infarction, arrhythmia caused by stress Diseases, muscle fatigue, rheumatoid arthritis, low back pain, migraine, musculoskeletal diseases such as tension headache, bronchial asthma, respiratory diseases such as hyperventilation syndrome, various diabetic complications, cranial nerve diseases Can be detected early.
本発明のストレス診断用キットとしては、アポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、及びエノラーゼβのうちのいずれか１種以上のタンパク質、若しくはアポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、及びエノラーゼβのうちのいずれか１種以上のタンパク質のいずれかに特異的に結合する抗体、又は、それらタンパク質や抗体の標識物を備えたキットであれば特に制限されず、本発明のストレス診断用キットは、ヒト、ペット等のストレス性疾患、例えばストレスに起因する、胃潰瘍、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎等の消化器系疾患、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、不整脈等の心血管系の疾患、筋肉疲労、慢性関節リウマチ、腰痛症、片頭痛、緊張性頭痛等の筋骨格系の疾患、気管支喘息、過呼吸症候群等の呼吸器系の疾患、種々の糖尿病合併症、脳神経疾患などの早期発見用検査キットとして有用である。 The stress diagnosis kit of the present invention includes one or more proteins of apolipoprotein H, fetuin β, actin β, and enolase β, or apolipoprotein H, fetuin β, actin β, and enolase β. There is no particular limitation as long as it is an antibody that specifically binds to any one or more of these proteins, or a kit comprising a label of these proteins or antibodies, and the stress diagnostic kit of the present invention is a human , Pets and other stress-related diseases, such as gastric ulcers, irritable bowel syndrome, ulcerative colitis and other gastrointestinal diseases, cardiovascular diseases such as hypertension, angina, myocardial infarction, arrhythmia Muscular skeletal diseases such as muscle fatigue, rheumatoid arthritis, low back pain, migraine, tension headache, bronchial asthma, hyperventilation syndrome Patients, is useful as various diabetic complications, test kits early detection of such brain diseases.
本発明に使用するアポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、又はエノラーゼβ等に特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記アポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、又はエノラーゼβを抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。 Antibodies that specifically bind to apolipoprotein H, fetuin β, actin β, enolase β, etc. used in the present invention are immunospecific such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, humanized antibodies, etc. Specific antibodies, which can be prepared by conventional methods using the above-mentioned apolipoprotein H, fetuin β, actin β, or enolase β as an antigen, among which monoclonal antibodies are specific. This is more preferable.
アポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、又はエノラーゼβに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該アポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβ、若しくはエノラーゼβ、これらのエピトープを含む断片、又は、該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL
ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
An antibody against apolipoprotein H, fetuin β, actin β, or enolase β can be obtained by using conventional protocols to an animal (preferably non-human) to the apolipoprotein H, fetuin β, actin β, or enolase β, and their epitopes. For example, for the preparation of monoclonal antibodies, the hybridoma method (Nature 256) is used, which results in antibodies produced by continuous cell line cultures. , 495-497, 1975), trioma method, human B cell hybridoma method (Immunology Today 4, 72, 1983) and EBV-hybridoma method (MONOCLONAL).
ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985) can be used.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
（試験動物の調整）
［水浸拘束試験］
１週間の予備飼育を行った７週齢のSprague-Dawley（ＳＤ）雄性ラット（体重１５０ｇ〜１８０ｇ）を用い、７日間飼料および水を自由に摂取させ、１日１回生理食塩水を経口投与した。２４時間の絶食後、ストレスケージに動物を入れ、剣状突起の高さまで水に浸した。０．５時間、１時間及び５時間の水浸拘束後、動物をエーテル致死させた。また、絶食後に水浸拘束せずケージに入れ、水浸拘束と同じ時間を経過させたものを対照とした。
(Adjustment of test animals)
[Water immersion restraint test]
Using 7-week-old Sprague-Dawley (SD) male rats (body weight: 150 to 180 g) that had been preliminarily raised for 1 week, they were allowed to freely feed and water for 7 days, and saline was orally administered once a day. did. After a 24-hour fast, animals were placed in a stress cage and immersed in water to the level of the xiphoid process. After 0.5 hour, 1 hour, and 5 hour water immersion restraints, the animals were killed in ether. Moreover, it put into the cage without water immersion restraint after fasting, and let it be the same time as water immersion restraint.
［採血］
ストレス負荷前は２４時間の絶食前にエーテル麻酔し尾静脈より採血を行った。また、ストレス負荷後は各時間の水浸拘束後にエーテル麻酔し、心臓より採血を行った。得られた血液を室温で１時間静置した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分）し、その上清を血清として−４０℃で保管した。
[Blood collection]
Before stress loading, ether was anesthetized before fasting for 24 hours, and blood was collected from the tail vein. In addition, after stress loading, ether anesthesia was performed after water immersion restraint for each hour, and blood was collected from the heart. The obtained blood was allowed to stand at room temperature for 1 hour, then centrifuged (3000 rpm, 15 minutes), and the supernatant was stored as serum at −40 ° C.
（ストレスバイオマーカーの同定）
［二次元電気泳動法（２−Ｄ）］
二次元電気泳動は、Tonge R., Shaw J., Middleton B., Rowlinson R., Rayner S., Young J., Pognan F., Hawkins E., Currie I. and Davison M. : Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics, 1(3),377-396 (2001)記載の方法に準じて行った。水浸拘束試験によって得られた血清をMultiple Affinity Removal Spin Cartridge, 0.45 mL Ms-3 (Mouse)（Agilent Technologies）で処理し、サンプル溶解液（４％ CHAPS、７Ｍ Urea、２Ｍ Thiourea）に溶解させた。なお、対象群の等量混合物をストレス負荷０時間のサンプルとした。ストレスバイオマーカー解析用のサンプルについては、各サンプルをＣｙ３あるいはＣｙ５（GE Healthcare社製）で標識し、全サンプルの等量混合物はＣｙ２（GE Healthcare社製）で標識した。３種の標識サンプルを混合し、混合サンプルと等量の２×等電点電気泳動用サンプルバッファー（４％ CHAPS、２％ DTT、７Ｍ Urea、２Ｍ Thiourea）を加え、膨潤用バッファー（２％ CHAPS、０．００２％ Bromophenol blue、１％ DTT、７Ｍ Urea、２Ｍ Thiourea）にて終容量４５０μＬとなるように調製した。ＩＰＧバッファー（ｐＨ３−１０ ＮＬ）（GE Healthcare社製）を０．５％加え、ｐＨ３−１０ ＮＬのImmobilineドライストリップ（GE Healthcare社製）で等電点電気泳動をおこなった。等電点電気泳動が完了したImmobilineドライストリップは平衡化した後、ゲル濃度１０％で調製したアクリルアミドゲルにアプライし、二次元目の電気泳動を行った。電気泳動後のゲルの画像イメージはTyphoon 9400 imager（GE Healthcare社製）にて読み込み、画像はDecyderソフトウェア（GE Healthcare社製）で解析した。
(Identification of stress biomarkers)
[Two-dimensional electrophoresis (2-D)]
Two-dimensional electrophoresis is performed by Tonge R., Shaw J., Middleton B., Rowlinson R., Rayner S., Young J., Pognan F., Hawkins E., Currie I. and Davison M .: Validation and development of This was carried out according to the method described in fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics, 1 (3), 377-396 (2001). Serum obtained by water immersion restraint test was treated with Multiple Affinity Removal Spin Cartridge, 0.45 mL Ms-3 (Mouse) (Agilent Technologies) and dissolved in sample lysate (4% CHAPS, 7M Urea, 2M Thiourea). . In addition, the equal amount mixture of the subject group was used as a sample with a stress load of 0 hour. For samples for stress biomarker analysis, each sample was labeled with Cy3 or Cy5 (GE Healthcare), and an equal mixture of all samples was labeled with Cy2 (GE Healthcare). Mix 3 kinds of labeled samples, add 2 × isoelectric focusing sample buffer (4% CHAPS, 2% DTT, 7M Urea, 2M Thiourea) in the same amount as the mixed sample, and add swelling buffer (2% CHAPS). 0.002% Bromophenol blue, 1% DTT, 7M Urea, 2M Thiourea) to a final volume of 450 μL. IPG buffer (pH 3-10 NL) (manufactured by GE Healthcare) was added in an amount of 0.5%, and isoelectric focusing was carried out using a pH 3-10 NL Immobiline dry strip (manufactured by GE Healthcare). Immobiline dry strips that had been subjected to isoelectric focusing were equilibrated, and then applied to an acrylamide gel prepared at a gel concentration of 10%, followed by second-dimensional electrophoresis. The image of the gel after electrophoresis was read with Typhoon 9400 imager (GE Healthcare), and the image was analyzed with Decyder software (GE Healthcare).
ストレスバイオマーカー解析用ゲルでストレス負荷前後のスポットを比較し、ストレス負荷後のｐＨ３．５〜８．０付近、分子量３５〜５０ｋＤａ付近に現れた４スポットのタンパク質を同定用ゲルより以下の方法で解析した。 Compare the spots before and after stress loading with the stress biomarker analysis gel, and use the following method to identify the 4 spots of protein that appeared at pH around 3.5 to 8.0 and molecular weight around 35 to 50 kDa after stress loading. Analyzed.
タンパク質同定用のゲルのサンプルは、ストレス負荷後の全サンプルの等量混合物５００μｇに対して、等容量の２×等電点電気泳動用サンプルバッファーを加え、膨潤用バッファーで４５０μＬに調整した。ＩＰＧバッファー（ｐＨ３−１０ ＮＬ）を０．５％加え、等電点電気泳動と二次元目の電気泳動を行い（図１）、ストレス負荷後にのみ現れたスポットを同定用ゲルよりPicker（GE Healthcare社製）で切り出し、トリプシンでゲル内消化を行ったのちZip-Tip（ミリポア社製）で精製を行い、マトリックスと混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＡＳ（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight / MassSpectrometry；マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間型質量分析法）（Bruker Daltonics K.K.社製）により分解成分の分子量を測定した。次に、分解成分の分子量を基に、Mascotデータベースで、Database1：NCBInr、Peptide Mass Tolerance：±０．１〜１．０Ｄａ、Fragment Mass Tolerance：±０．５〜１．０Ｄａ、Max Missed Clevages：１の検索条件によりコンビネーションサーチを行い、切り出したスポットの成分を同定した。ｐＨ３．５〜８．０付近、分子量３５〜５０ｋＤａ付近に確認された４スポットは、それぞれアポリポタンパク質Ｈ（図中Ａ及びＢ）、フェチュインβ（図中Ｃ）、アクチンβ（図中Ｄ）と同定された。 The sample of the gel for protein identification was adjusted to 450 μL with a swelling buffer by adding an equal volume of 2 × isoelectric focusing sample buffer to 500 μg of an equal mixture of all samples after stress loading. Add 0.5% IPG buffer (pH 3-10 NL), perform isoelectric focusing and second-dimensional electrophoresis (Fig. 1), and pick spots that appear only after stress loading from the gel for identification (GE Healthcare And then digested in gel with trypsin, purified with Zip-Tip (Millipore), mixed with matrix, MALDI-TOF / MAS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight / MassSpectrometry) The molecular weight of the decomposition component was measured by matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (manufactured by Bruker Daltonics KK). Next, based on the molecular weight of the decomposition component, in the Mascot database, Database1: NCBInr, Peptide Mass Tolerance: ± 0.1-1.0 Da, Fragment Mass Tolerance: ± 0.5-1.0 Da, Max Missed Clevages: 1 A combination search was performed under the above search conditions, and the components of the cut-out spot were identified. Four spots confirmed at around pH 3.5 to 8.0 and around molecular weight 35 to 50 kDa are apolipoprotein H (A and B in the figure), fetuin β (C in the figure), and actin β (D in the figure), respectively. Identified.
また、上記画像解析結果から、アポリポタンパク質Ｈと同定されたスポットＡはストレス時間とともに徐々に減少し、０時間と比較すると５時間後には約８１％となった（図２）。スポットＢも同様に５時間後に７９％となり（図３）、アポリポタンパク質Ｈは、ストレス負荷により減少するタンパク質であることが認められた。また、フェチュインβと同定されたスポットＣは、７６％まで減少し（図４）、アポリポタンパク質Ｈと同様、ストレス負荷により減少するタンパク質であることが明らかとなった。一方、アクチンβと同定されたスポットＤは水浸拘束ストレス負荷５時間までに２３０％に増加し（図５）、ストレス負荷により増加するタンパク質であることが明らかとなった。このことから、ある動作の前後のアポリポタンパク質Ｈ、フェチュインβ、アクチンβを測定することで、その動作が対象個体にとってストレスとなっているか否かが判定できることが明らかとなった。 Further, from the above image analysis results, the spot A identified as apolipoprotein H gradually decreased with the stress time, and became about 81% after 5 hours compared to 0 hours (FIG. 2). Similarly, spot B was 79% after 5 hours (FIG. 3), and it was confirmed that apolipoprotein H is a protein that decreases with stress. In addition, the spot C identified as fetuin β decreased to 76% (FIG. 4), and it was revealed that, like apolipoprotein H, it is a protein that decreases with stress load. On the other hand, the spot D identified as actin β increased to 230% by 5 hours of water immersion restraint stress load (FIG. 5), and was found to be a protein that increases with stress load. From this, it was clarified that by measuring apolipoprotein H, fetuin β, and actin β before and after a certain action, it can be determined whether or not the action is a stress for the target individual.
（試験動物の調製）
［水浸拘束試験］
１週間の予備飼育を行った７週齢のＳＤ（Sprague-Dawley）雄性ラット（体重１５０ｇ〜１８０ｇ）を用い、７日間飼料および水を自由に摂取させ、１日１回生理食塩水を経口投与した。２４時間の絶食後、ストレスケージに動物を入れ、剣状突起の高さまで水に浸し、１０時間の水浸拘束を行った。
(Preparation of test animals)
[Water immersion restraint test]
Using 7-week-old SD (Sprague-Dawley) male rats (body weight: 150 to 180 g) that had been preliminarily raised for 1 week, they were allowed to freely feed and water for 7 days, and saline was orally administered once a day. did. After fasting for 24 hours, the animals were placed in a stress cage, immersed in water up to the level of the xiphoid process, and restrained by immersion for 10 hours.
［採血］
水浸拘束前後に採血を行った。得られた血液は室温で１時間静置した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分）し、その上清を血清として−４０℃で保管した。なお、胃潰瘍が発症する前のストレス負荷前血清は、２４時間の絶食をする前にエーテル麻酔し尾静脈より採取した。また、胃潰瘍発症後のストレス負荷後血清は、１０時間の水浸拘束後にエーテル麻酔し心臓より採取し、二次元電気泳動に供試した。また、採血後直ちに胃を摘出し、潰瘍部分の面積を計測し、胃全体に対する潰瘍部分の面積の占める割合を潰瘍指数（％）とした。水浸拘束試験によるストレス性胃潰瘍の潰瘍指数は約２０％だった。
[Blood collection]
Blood was collected before and after water immersion restraint. The obtained blood was allowed to stand at room temperature for 1 hour, then centrifuged (3000 rpm, 15 minutes), and the supernatant was stored as serum at −40 ° C. The pre-stress serum before onset of gastric ulcer was collected from the tail vein after ether anesthesia before fasting for 24 hours. In addition, the post-stress serum after onset of gastric ulcer was subjected to ether anesthesia after 10 hours of water immersion restraint, collected from the heart, and subjected to two-dimensional electrophoresis. Further, immediately after blood collection, the stomach was removed, the area of the ulcer portion was measured, and the ratio of the area of the ulcer portion to the whole stomach was taken as the ulcer index (%). The ulcer index of the stress gastric ulcer by the water immersion restraint test was about 20%.
（ストレスバイオマーカーの同定）
［二次元電気泳動法（２−Ｄ）］
二次元電気泳動は、Tonge R., Shaw J., Middleton B., Rowlinson R., Rayner S., Young J., Pognan F., Hawkins E., Currie I. and Davison M. : Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics, 1(3), 377-396 (2001)記載の方法に準じて行った。水浸拘束試験によって得られた血清をMultiple Affinity Removal Spin Cartridge, 0.45 mL Ms-3(Mouse)（Agilent Technologies）で処理し、サンプル溶解液（４％ CHAPS、７Ｍ Urea、２Ｍ Thiourea）に溶解させた。ストレスバイオマーカー解析用のサンプルについては、ストレス負荷前のサンプルをＣｙ３（GE Healthcare社製）で、ストレス負荷後のサンプルをＣｙ５（GE Healthcare社製）で、ストレス負荷前及び負荷後のサンプルの等量混合物をＣｙ２（GE Healthcare社製）でそれぞれ標識した。３種の標識サンプルを混合し、等量の２×等電点電気泳動用サンプルバッファー（４％ CHAPS、２％ DTT、７Ｍ Urea、２Ｍ Thiourea）を加え、膨潤用バッファー（２％ CHAPS、０．００２％ Bromophenolblue、１％ DTT、７Ｍ Urea、２Ｍ Thiourea）にて終容量４５０μＬとなるように調製した。ＩＰＧバッファー（ｐＨ３−１０ ＮＬ）（GE Healthcare社製）を０．５％加え、ｐＨ３−１０ ＮＬのImmobilineドライストリップ（GE Healthcare社製）で等電点電気泳動をおこなった。等電点電気泳動が完了したImmobilineドライストリップは平衡化した後、ゲル濃度１０％で調製したアクリルアミドゲルにアプライし、二次元目の電気泳動を行った。電気泳動後のゲルの画像イメージはTyphoon 9400 imager（GE Healthcare社製）にて読み込み、画像はDecyderソフトウェア（GE Healthcare社製）で解析した（図６）。
(Identification of stress biomarkers)
[Two-dimensional electrophoresis (2-D)]
Two-dimensional electrophoresis is performed by Tonge R., Shaw J., Middleton B., Rowlinson R., Rayner S., Young J., Pognan F., Hawkins E., Currie I. and Davison M .: Validation and development of This was performed according to the method described in fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics, 1 (3), 377-396 (2001). Serum obtained by water immersion restraint test was treated with Multiple Affinity Removal Spin Cartridge, 0.45 mL Ms-3 (Mouse) (Agilent Technologies) and dissolved in sample lysate (4% CHAPS, 7M Urea, 2M Thiourea). . For samples for stress biomarker analysis, the sample before stress loading is Cy3 (manufactured by GE Healthcare), the sample after stress loading is Cy5 (manufactured by GE Healthcare), samples before and after stress loading, etc. The quantity mixture was labeled with Cy2 (GE Healthcare). Three kinds of labeled samples are mixed, and an equal volume of 2 × isoelectric focusing sample buffer (4% CHAPS, 2% DTT, 7M Urea, 2M Thiourea) is added, and a swelling buffer (2% CHAPS, 0. 002% Bromophenolblue, 1% DTT, 7M Urea, 2M Thiourea) to a final volume of 450 μL. IPG buffer (pH 3-10 NL) (manufactured by GE Healthcare) was added in an amount of 0.5%, and isoelectric focusing was performed with a pH 3-10 NL Immobiline dry strip (manufactured by GE Healthcare). Immobiline dry strips that had been subjected to isoelectric focusing were equilibrated, and then applied to an acrylamide gel prepared at a gel concentration of 10%, followed by second-dimensional electrophoresis. The gel image after electrophoresis was read with Typhoon 9400 imager (GE Healthcare), and the image was analyzed with Decyder software (GE Healthcare) (FIG. 6).
ストレスバイオマーカー解析用ゲルでストレス負荷前後のスポットを比較し、ストレス負荷後のｐＨ７．０〜８．５付近、分子量４５〜５０ｋＤａ付近に現れたスポット（発現タンパク質）を同定用ゲルより以下の方法で解析した。 Compare the spots before and after stress loading with the gel for stress biomarker analysis, and spot (expressed protein) appearing near pH 7.0-8.5 and molecular weight 45-50 kDa after stress loading from the gel for identification as follows We analyzed with.
タンパク質同定用のゲルのサンプルは、ストレス前後のサンプルの等量混合物５００μｇに対して、等容量の２×等電点電気泳動用サンプルバッファーを加え、膨潤用バッファーで５０μＬに調整した。ＩＰＧバッファー（ｐＨ３−１０ ＮＬ）を０．５％加え、等電点電気泳動と二次元目の電気泳動を行い、ストレス負荷後にのみ現れたスポットを同定用ゲルよりPicker（GE Healthcare社製）で切り出し、トリプシンでゲル内消化を行ったのちZip-Tip（ミリポア社製）で精製を行い、マトリックスと混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＡＳ（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight / Mass Spectrometry；マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間型質量分析法）（Bruker Daltonics K.K.社製）により分解成分の分子量を測定した。次に、分解成分の分子量を基に、Mascotデータベースで、Database1：NCBInr、Peptide Mass Tolerance：±０．１〜１．０Ｄａ、Fragment Mass Tolerance：±０．５〜１．０Ｄａ、Max Missed Clevages：１の検索条件によりコンビネーションサーチを行い、切り出したスポットの成分を同定した。その結果、ｐＨ７．０〜８．５付近、分子量４５〜５０ｋＤａ付近に現れたスポットがエノラーゼβであることがわかった。また、上記画像解析結果から、エノラーゼβと同定されたスポットはストレス負荷により２１．４４倍増加した（図７）。 The sample of gel for protein identification was adjusted to 50 μL with a swelling buffer by adding an equal volume of 2 × isoelectric focusing sample buffer to 500 μg of an equal mixture of samples before and after stress. Add 0.5% of IPG buffer (pH 3-10 NL), perform isoelectric focusing and second-dimensional electrophoresis, and use Spotter (made by GE Healthcare) to spot spots that appear only after stress loading. After excision and digestion with trypsin, purification with Zip-Tip (Millipore), mixing with matrix, MALDI-TOF / MAS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight / Mass Spectrometry; matrix support) The molecular weight of the decomposition component was measured by (laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry) (manufactured by Bruker Daltonics KK). Next, based on the molecular weight of the decomposition component, in the Mascot database, Database1: NCBInr, Peptide Mass Tolerance: ± 0.1-1.0 Da, Fragment Mass Tolerance: ± 0.5-1.0 Da, Max Missed Clevages: 1 A combination search was performed under the above search conditions, and the components of the cut-out spot were identified. As a result, it was found that a spot that appeared in the vicinity of pH 7.0 to 8.5 and a molecular weight of 45 to 50 kDa was enolase β. Moreover, the spot identified as enolase β from the above image analysis results increased by 21.44 times due to stress load (FIG. 7).
以上の結果を表１にまとめた。 The above results are summarized in Table 1.
（ＥＬＩＳＡによるアポリポタンパク質Ｈの測定）
１．走行試験
被験者（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）４名で２ｋｍ、約２０分間のジョギング試験を実施した。
２．採血
ジョギング前後に被験者の上腕静脈より採血を行った。得られた血液を４℃で、一晩静置した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分）し、その上清を血清として−４０℃で保管した。
３．ＥＬＩＳＡによるアポリポタンパク質Ｈの検出
１０倍希釈した血清を固相に、抗体にAnti-Apolipoprotein H, Mouse-Mono(1D2) MA1-25289（フナコシ株式会社製）を用いたダイレクトＥＬＩＳＡにより、ジョギング前後の被験者Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの血清中におけるアポリポタンパク質Ｈを測定した。その結果、ジョギング後にアポリポタンパク質Ｈが一様に増加した（図８）。実施例１のラットの水浸拘束試験の結果ではアポリポタンパク質Ｈは減少したが、この違いはストレスの種類の差異、あるいは対象種の差異が考えられ、一定の動物種で一定のストレスを負荷することにより、一様に増加あるいは減少するマーカーであると考えられた。以上のことから、アポリポタンパク質Ｈのストレスマーカーとしての有効性が明らかとなった。また、抗アポリポタンパク質Ｈ抗体を用いたＥＬＩＳＡや、さらに簡易なイムノクロマト法などにより、ストレス負荷個体の血清から容易にアポリポタンパク質Ｈが測定可能であり、その増減によりストレス負荷の判定できると考えられる。
(Measurement of apolipoprotein H by ELISA)
1. Running test A jogging test of 2 km and about 20 minutes was performed by 4 subjects (A, B, C, D).
2. Blood collection Blood was collected from the brachial vein of the subject before and after jogging. The obtained blood was allowed to stand at 4 ° C. overnight and then centrifuged (3000 rpm, 15 minutes), and the supernatant was stored as serum at −40 ° C.
3. Detection of apolipoprotein H by ELISA Subjects before and after jogging by direct ELISA using 10-fold diluted serum in solid phase and anti-Apolipoprotein H, Mouse-Mono (1D2) MA1-25289 (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) as an antibody Apolipoprotein H in serum of A, B, C, D was measured. As a result, apolipoprotein H increased uniformly after jogging (FIG. 8). Although the apolipoprotein H decreased in the result of the water immersion restraint test of the rat of Example 1, this difference may be a difference in the type of stress or a difference in the target species, and a certain stress is applied to a certain animal species. Therefore, it was considered to be a marker that increases or decreases uniformly. From the above, the effectiveness of apolipoprotein H as a stress marker was clarified. Further, it is considered that apolipoprotein H can be easily measured from the serum of stress-stressed individuals by ELISA using an anti-apolipoprotein H antibody or a simple immunochromatography method, and the stress load can be determined by the increase or decrease.
（ＥＬＩＳＡによるフェチュインβの測定）
１．走行試験
被験者（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）４名で２ｋｍ、約２０分間のジョギング試験を実施した。
２．採血
ジョギング前後に被験者の上腕静脈より採血を行った。得られた血液を４℃で、一晩静置した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分）し、その上清を血清として−４０℃で保管した。
３．ＥＬＩＳＡによるフェチュインβの検出
１０倍希釈した血清を固相に、抗体にAnti-Fetuin B, Mouse-Mono(212621) MAB1725（フナコシ株式会社製）を用いたダイレクトＥＬＩＳＡにより、ジョギング前後の被験者Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの血清中におけるフェチュインβを測定した。その結果、被験者Ｃを除いたＡ、Ｂ、Ｄでは、実施例１のラットの水浸拘束試験の結果と同様に、ジョギング後にフェチュインβが減少した。（図９）。以上のことから、フェチュインβのストレスマーカーとしての有効性が明らかとなった。また、抗フェチュインβ抗体を用いたＥＬＩＳＡや、さらに簡易なイムノクロマト法などにより、ストレス負荷個体の血清から容易にフェチュインβが測定可能であり、その増減によりストレス負荷の判定できると考えられる。
(Measurement of fetuin β by ELISA)
1. Running test A jogging test of 2 km and about 20 minutes was performed by 4 subjects (A, B, C, D).
2. Blood collection Blood was collected from the brachial vein of the subject before and after jogging. The obtained blood was allowed to stand at 4 ° C. overnight and then centrifuged (3000 rpm, 15 minutes), and the supernatant was stored as serum at −40 ° C.
3. Detection of fetuin β by ELISA Subject A and B before and after jogging by direct ELISA using 10-fold diluted serum as a solid phase and Anti-Fetuin B, Mouse-Mono (212621) MAB1725 (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) as an antibody. , C and D were measured for fetuin β. As a result, in A, B, and D excluding the subject C, fetuin β decreased after jogging, similar to the result of the water immersion restraint test of the rat in Example 1. (FIG. 9). From the above, the effectiveness of fetuin β as a stress marker was clarified. In addition, fetuin β can be easily measured from the serum of stress-stressed individuals by ELISA using an anti-fetuin β antibody or a simple immunochromatography method, and it is considered that the stress load can be determined by the increase or decrease.
（ＥＬＩＳＡによるアクチンβの測定）
１．走行試験
被験者（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）４名で２ｋｍ、約２０分間のジョギング試験を実施した。
２．採血
ジョギング前後に上腕静脈より採血を行った。得られた血液を４℃で、一晩静置した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分）し、その上清を血清として−４０℃で保管した。
３．ＥＬＩＳＡによるアクチンβの検出
固相化抗体にAnti-Actin β, Mouse-Mono(B11V08) AM00194PU-N（フナコシ株式会社製）を、ＨＲＰ標識抗体にMouse monoclonal(mAbcam8226) to beta Actin-Loading Control (HRP)（アブカム株式会社製）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、ジョギング前後の被験者Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの血清中におけるアクチンを測定した。その結果、実施例１のラットの水浸拘束試験の結果と同様に、ジョギングによりアクチンの増加が認められた（図１０）。以上のことから、アクチンβのストレスマーカーとしての有効性が明らかとなった。また、抗アクチンβ抗体を用いたＥＬＩＳＡや、さらに簡易なイムノクロマト法などにより、ストレス負荷個体の血清から容易にアクチンβが測定可能であり、その増減によりストレス負荷の判定できると考えられる。
(Measurement of actin β by ELISA)
1. Running test A jogging test of 2 km and about 20 minutes was performed by 4 subjects (A, B, C, D).
2. Blood collection Blood was collected from the brachial vein before and after jogging. The obtained blood was allowed to stand at 4 ° C. overnight and then centrifuged (3000 rpm, 15 minutes), and the supernatant was stored as serum at −40 ° C.
3. Detection of actin β by ELISA Anti-Actin β, Mouse-Mono (B11V08) AM00194PU-N (Funakoshi Co., Ltd.) is used as the immobilized antibody, and Mouse monoclonal (mAbcam8226) to beta Actin-Loading Control (HRP) is used as the HRP-labeled antibody. ) (Abcam Co., Ltd.) was used to measure actin in the serum of subjects A, B, C, and D before and after jogging. As a result, as in the result of the water immersion restraint test of the rat of Example 1, an increase in actin was observed by jogging (FIG. 10). From the above, the effectiveness of actin β as a stress marker was clarified. In addition, it is considered that actin β can be easily measured from the serum of stress-stressed individuals by ELISA using an anti-actin β antibody or a simple immunochromatography method, and the stress load can be determined by the increase or decrease.
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