JP2008241374A - 検出キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】検出キットは、検出対象物を選択的に検出し得る検出キットであって、検出対象物と特異的に結合する結合部位11と、反応性を有する第1の反応部位12とを含む第1の化合物1と、第1の反応部位12と反応する第2の反応部位21と、標識部位22とを含む第2の化合物2とを有し、第1の化合物1と第2の化合物2とを反応させることにより、第1の反応部位12と第2の反応部位21とを連結させる。
【選択図】図1
Description
このELISA法による抗原抗体反応検出法では、2次抗体反応時に抗体に固定化された酵素による色素反応によって抗原の検出が行われている。しかし、抗原の存在量が超微量である場合、抗原の検出感度が得られないという問題を有する。
ところが、基板に成長させたPEGポリマーの密度、大きさに比較して抗体分子は大きい。そのため、基板表面に固定化できる抗体分子の数は少なくなる。その結果、抗原の検出感度が、得られないという問題を有している。
本発明の検出キットは、検出対象物を選択的に検出し得る検出キットであって、
前記検出対象物と特異的に結合する結合部位と、反応性を有する第1の反応部位とを含む第1の化合物と、
前記第1の反応部位と反応する第2の反応部位と、標識部位とを含む第2の化合物とを有し、
前記第1の化合物と前記第2の化合物とを反応させることにより、前記第1の反応部位と前記第2の反応部位とを連結させることを特徴とする。
これにより、結合部位と標識部位とを有する検出試薬が得られるので、検出対象物を高感度に検出することができる。
これにより、抗原または抗体と特異的に結合し得る検出対象物(抗体または抗原)を高感度に検出することができる。
本発明の検出キットでは、前記第1の反応部位および前記第2の反応部位は、それぞれ重合性基で構成されていることが好ましい。
これにより、第1の反応部位および第2の反応部位の反応性が高いので、第1の反応部位と第2の反応部位とを容易に連結することができる。また、重合性基で重合反応が起こるので、第2の化合物を複数導入することができる。
これにより、第1の連結部位は反応性の高い基を有するので、結合部位および第1の反応部位を確実に連結することができる。
本発明の検出キットでは、前記第1の連結部位は、粒子を含むものであることが好ましい。
これにより、粒子は表面積が大きいので、粒子表面側に複数の結合部位および/または第1の反応部位を結合することができる。
これにより、複数の検出対象物および/または複数の第2の化合物と結合することができるので、検出対象物の検出感度を向上させることができる。
本発明の検出キットでは、前記粒子に結合する前記結合部位および前記第1の反応部位の存在比は、前記結合部位を[A]、前記第1の反応部位を[B]としたとき、A/Bが0.1〜1.0であることが好ましい。
これにより、第1の反応部位の存在割合が多いので、第2の化合物を多く結合することができる。その結果、複数の標識部位を有する検出試薬を得ることができる。
これにより、酸化還元電流、蛍光強度または色調が変化するので、電気化学的検出または蛍光検出が可能となる。
本発明の検出キットでは、前記標識部位を複数有することが好ましい。
これにより、標識部位を複数有する検出試薬が得られるので、検出対象物の検出感度をより向上させることができる。
これにより、第2の連結部位は、反応性の高い基を有するので、標識部位および第2の反応部位を確実に連結することができる。
本発明の検出キットでは、さらに、検出対象物を選択的に捕捉し得る捕捉物が担持された基体を有することが好ましい。
これにより、基体と第1の化合物と第2の化合物とを用いることで検出対象物を検出できるので、簡易かつ迅速に検出対象物を検出することができる。
当該ウェルの内面に前記捕捉物が担持されていることが好ましい。
これにより、ウェルと第1の化合物と第2の化合物とを用いることで検出対象物を検出できるので、より簡易かつ迅速に検出対象物を検出することができる。
本発明の検出キットでは、前記基体は、粒状に形成されていることが好ましい。
これにより、基体の表面を滑らかにすることができるので、低抵抗で試料溶液中を移動することができる。
<検出キット>
本実施形態の検出キットは、検出対象物と特異的に結合する結合部位を有する第1の化合物と、検出対象物の検出感度を上げる標識部位を有する第2の化合物とを含むものである。
図1、2は、第1の化合物を模式的に示す図、図3は、第2の化合物を模式的に示す図である。
図1に示す第1の化合物1は、結合部位11と、反応性を有する第1の反応部位12と、結合部位11と第1の反応部位12とを連結する第1の連結部位13とを有している。
このような抗体の種類は、特に限定されず、例えば、IgG、IgM、IgA、IgE等が挙げられる。これらの中でも、IgGが好ましい。IgGは、生産が容易であり、検出等可能な抗原の種類が増大する。
このような第1の反応部位12は、特に限定されないが、例えば、ビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、スチリル基などの重合性基、マレイミド基、ピリジルジスルフィド基、N−ヒドロキシサクシンイミド基、NHS基などが挙げられる。これらのうち、重合性基であることが好ましく、ビニル基であることがより好ましい。重合性基、特にビニル基は、反応性に富む基であるので、第1の反応部位12と第2の反応部位21とを効率よく反応させることができる。
例えば、結合部位11を抗体とした場合、結合部位11の表面にはフリーアミノ基が存在するので、結合基はアミド結合が含まれていることが好ましい。これにより、抗体と結合基とが効率良く反応するので、抗体と結合基とを確実に結合することができる。
また、第1の連結部位13には、ポリエチレングリコール(PEG)鎖(スペーサ)が含まれていることが好ましい。これにより、結合部位11と第一の反応部位12とが一定距離離間するので、第1の反応部位12と第2の反応部位21とを効率的に反応することができる。
このように、PEG鎖は、一般的に水溶性になりやすい鎖構造のため、水中にて緩和伸張構造を取り易い。
したがって、第1の連結部位13にPEG鎖が含まれていることにより、水中において伸長構造を取り易くなるので、液体試料151中の検出対象物を高感度に検出することができる。
また、第1の連結部位13は、粒子13aを含むことが好ましい。これにより、粒子13aは表面積が大きいので、粒子13aの表面に複数の結合部位11、第1の反応部位12を結合することができる。
以上のような結合部位11、第1の反応部位12、第1の連結部位13を有する第1の化合物1は、例えば、以下に示す化合物(1)、化合物(2)、図2に示す構造のものが挙げられる。なお、化合物(1)および化合物(2)のいずれも、結合部位(PEG鎖とアミド結合している部位)11は抗体である。
このような粒子13aとしては、例えば、金、銀などの金属、これらの金属酸化物、色素、顔料、ポリスチレン、メタクリル酸などが挙げられる。このうち、金属であることが好ましく、金であることがより好ましい。
金は、硫黄原子とスルフィド結合することができるので、図2に示すように、複数の結合部位11および第1の反応部位12を硫黄原子を介して簡単に結合させることができる。その結果、第2の化合物2の連結により、標識部位22が多く存在するので、検出対象物を高感度に検出することができる。
これにより、結合部位11よりも第1の反応部位12の存在割合が大きいので、標識部位22を有する第2の化合物2をより多く連結することができる。その結果、標識部位22の存在割合が増大し、検出対象物をより高感度に検出することができる。
一方、結合部位11および第1の反応部位12の存在比が前記範囲よりも大きすぎると、第1の反応部位12の存在割合が小さくなりすぎ、第2の化合物2を連結する割合が小さくなるおそれがある。
第2の反応部位21は、第1の化合物1の第1の反応部位12と反応して、結合する部位である。すなわち、第2の反応部位21は、第1の化合物1と第2の化合物2とを連結する機能を有する。
この標識部位22としては、例えば、蛍光物質、酸化還元物質または色素化合物などが挙げられる。これらは2種以上組み合せて用いることもできる。標識部位22を複数用いることにより、検出対象物を高感度に検出することができる。
標識部位22に蛍光物質を用いた場合、検出対象物を含む液体試料151中に第1の反応部位12と第2の反応部位21とが連結した蛍光検出試薬5を混合することで、蛍光強度が変化するので、簡単に検出対象物の検出をすることができる。
標識部位22に色素化合物を用いた場合、検出対象物を含む試料の色調の変化により、検出対象物の存在を確認できるので、より簡単に検出対象物を検出することができる。
このような蛍光物質52としては、特に限定されないが、例えば、フルオレセイン、ダンシルクロライド、フルオレスカミン、7−クロロ−4−ニトロベンゾ−2−オキサ−1,3−ジアゾ−ル(NBD−クロライド)、オルトアミノチオフェノール、ダンシルヒドラジンなどの芳香族有機化合物などが挙げられる。
オスミウム−ビピリジル錯体は、水溶性であるためポリマーとの親和性が高い。また、ポリマー鎖も水和構造の中で伸張し、反応が進行しやすい。そのため、検出対象物の検出を行った場合、酸化還元電流をより効率よく検出することができる。
色素化合物としては、特に限定されないが、例えば、ポルフィリン、クロロフィル、ニュートラルレッド、メチレンブルー、フェノールフタレイン、インドシアニングリーン、シアニン色素、アゾ色素、フラボノイド、カロチノイドなどが挙げられる。
例えば、標識部位22をフェロセンとした場合、結合基はエステル結合が含まれていることが好ましい。これにより、フェロセンと結合基とが効率良く反応するので、フェロセンと結合基とを確実に結合することができる。
以上のような第2の反応部位21、標識部位22、第2の連結部位23を有する第2の化合物2は、例えば、以下に示す化合物(5)〜(7)などが挙げられる。
この検出キットには、検出対象物の検出に必要なもの、例えば、検出対象物を選択的に捕捉し得る捕捉物8が担持された基体190が含まれていてもよい。
このような基体190としては、例えば、バイオセンサーに用いる作用電極121、基板120、担体124などが挙げられる。これにより、検出対象物を一旦基体190の捕捉物8に捕捉した後、第1の化合物1および第2の化合物2を用いて、検出対象物の高感度検出をすることができる。
その他、本発明の検出キットは、スパチュラ、反応容器、スポイトなどを含んでいてもよい。これにより、測定場所を問わず、より迅速に検出対象物の検出を行うことができる。
また、本発明の検出キットは、持ち運びを容易にするために、第1の化合物1や第2の化合物2などを容器に収容して提供することができる。
このような検出キットに含まれる第1の化合物1および第2の化合物2は、それぞれ、次のようにして製造することができる。
[1]第1の製造方法
まず、結合部位11である抗体と、PEGの一端にエステル基を介してコハク酸イミドを、他端にエステル基を介して第1の反応部位12を有する下記化合物(8)を用意する。
抗体の表面には、アミノ酸の1種であるリシン由来のフリーアミノ基が存在する。そのため、当該アミノ基と化合物(8)とで反応が進行する。したがって、化合物(8)が前記したような量であることにより、化合物(8)が過剰に存在するので、抗体のアミノ基と過不足なく反応することができる。
反応温度は、0〜60℃であることが好ましく、20〜40℃であることがより好ましい。
反応のpHは、6〜8であることが好ましく、6.5〜7.5であることがより好ましい。
以上のような反応条件を好ましい条件に設定することにより、抗体と化合物(8)との反応が効率よく進行するので、収率よく第1の化合物1(化合物(9))を得ることができる。
次に、第1の連結部13に金微粒子を含む場合の第1の化合物1の第2の製造方法について説明する。
[A1] まず、金微粒子とアミノエタンチオールを用意する。
この金微粒子の外径は、0.01〜10μmであることが好ましく、0.05〜1μmであることがより好ましい。
また、金微粒子の表面積は、1×10−15〜1×10−11m2であることが好ましく、5×10−15〜8×10−13m2であることがより好ましい。
アミノエタンチオールの使用量は、0.1〜1mmol/Lであることが好ましく、0.5〜0.8mmol/Lであることがより好ましい。アミノエタンチオールの使用量がこのような範囲であることにより、アミノエタンチオールの量が金微粒子の量よりも多いので、金微粒子の表面に複数のアミノエタンチオールを結合することができる。
反応溶媒は、特に限定されないが、ジクロロエタン、アセトニトリル、塩化メチレン、メタノールなどの各種溶媒が挙げられる。
これにより、金に硫黄原子を介してアミノエタンが結合した化合物(10)を得た。
このときの反応条件は、反応溶媒中、25℃で1時間攪拌をしながら反応を行うことが好ましい。
反応溶媒は前記[A2]で挙げたものと同様である。
これにより、金微粒子に硫黄原子を介してアミノ基と第1の反応部位12とが結合した化合物(12)を得た。
このときの反応条件は、反応溶媒中、25℃で1時間攪拌をしながら反応を行うことが好ましい。
反応溶媒は前記[A2]で挙げたものと同様である。
これにより、アミノ基とコハク酸イミド基が反応した化合物(14)を得た。
このときの反応条件は、反応溶媒中、25℃で1時間攪拌をしながら反応を行うことが好ましい。
反応溶媒は前記[A2]で挙げたものと同様である。
これにより、第1の連結部13に粒状の金微粒子を有する第1の化合物1(化合物(15))を得た。
これにより、複数の検出対象物と複数の結合部位11とが、複数の第2の反応部位21と複数の第1の反応部位とが反応するので、検出対象物の検出感度をより一層向上することができる。
[1]第1の製造方法
まず、下記に示す標識化合物(16)と、下記に示すPEGの一端に第2の反応部位21と、他端に水酸基とを有する化合物(17)とを用意する。
反応時間は、0.5〜10時間であることが好ましく、1〜5時間であることがより好ましい。
反応温度は、0〜60℃であることが好ましく、20〜40℃であることがより好ましい。
以上のような反応条件を好ましい条件に設定することにより、化合物(16)と化合物(17)との反応が過不足なく進行するので、収率よく第2の化合物2(化合物(18))を得ることができる。
次に、第2の化合物2の第2の製造方法について説明する。
まず、一端に第2の反応部位21を有する化合物(19)と、一端に標識部位22を有する化合物(20)とを用意する。
ラジカル重合反応時間は、0.5〜10時間であることが好ましく、1〜5時間であることがより好ましい。
ラジカル重合反応温度は、50〜300℃であることが好ましく、100〜250℃であることがより好ましい。
反応圧力は、常圧程度であることが好ましい。
触媒としては、例えば、過酸化ベンゾイルなどのラジカル触媒などが挙げられる。そして、触媒の量は、0.1〜5mmolであることが好ましく、0.5〜1mmolであることがより好ましい。
この化合物(21)は、標識部位22を複数有するので、第1の化合物1との結合により、検出対象物をより高感度に検出することができる。
以上のような製造方法により、第1の化合物1と第2の化合物2とが得られ、これらを含む検出キットが得られる。
このようにして得られた第1の化合物1および第2の化合物2を含む検出キットは、例えば、次のようにして使用することができる。
以下、検出キットの使用方法(検出対象物の検出方法)について、図を用いて詳細に説明する。以下の説明では、検出対象物質に抗原3を、結合部位11に抗体を用いた場合を代表して説明する。
まず、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第1の検出方法について説明する。
図4は、第1の検出方法を説明を模式的に示す縦断面図である。
なお、以下の説明では、図4中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
第1の検出方法は、第1の化合物1と第2の化合物2とを反応させて蛍光検出試薬5を調製する工程[A1]と、蛍光検出試薬5を液体試料151中に供給する工程[A2]と、蛍光検出試薬5と抗原3との結合により生じる蛍光強度の変化を検出する工程[A3]とを有する。
まず、第1の化合物1と第2の化合物2とを反応して蛍光検出試薬5を調製する。なお、以下の説明では、蛍光検出試薬5の結合部位11を抗体51、標識部位22を蛍光物質52として説明する。
蛍光検出試薬5の調製は、例えば、下記反応式で示すように、第1の反応部位12にビニル基を有する第1の化合物1(化合物(22))と標識部位22に蛍光物質52を有する第2の化合物2(化合物(23))とを、高圧水銀灯による紫外線照射により光重合反応させることにより行う。
なお、蛍光検出試薬5の重合度(紫外線照射時間)を制御することによって、抗体51分子表面に第1の連結部12を介して多数の蛍光物質52を導入できる。
例えば、第1の連結部12の1鎖長あたり100個の蛍光物質52を導入できる。仮に、10ポリマー鎖が1抗体より成長反応を起こしたとすると、1抗体51分子あたり1000個の蛍光物質52を導入できる。これにより、蛍光物質52を大量に導入できるので、抗原の検出感度を大幅に増幅することができる。
また、後述する第2の検出方法と同様に、化合物(28)と化合物(23)との反応により、金微粒子を含む蛍光検出試薬5を調製することもできる。
図4(a)に示すように、検出対象物である抗原3を含む液体試料151を反応容器152に入れる。
次に、図4(a)に示すように、液体試料151(試料供給空間150)中に蛍光検出試薬5を供給する。これにより、抗原3と蛍光検出試薬5とが接触する。
ここで、液体試料(被検体)151としては、例えば、血液、尿、汗、リンパ液、髄液、胆汁、唾液等の体液や、これらの体液に各種処理を施した処理済み液、お酒などの飲食品、医薬品、化粧品等が挙げられる。
なお、蛍光検出試薬5の供給濃度は、特に限定されないが、0.01〜1mmol/Lであることが好ましく、0.05〜0.5mmol/Lであることがより好ましい。
抗体51が抗原3に結合すると、蛍光検出試薬5の蛍光物質52により、抗原3の蛍光強度が増大する。すなわち、抗原3に抗体51が結合していない状態では、抗原3の蛍光強度は、0または極めて低い値である。しかし、蛍光検出試薬5の抗体51が抗原3に結合することにより、抗原3の蛍光強度が増大する。この蛍光強度を蛍光光度計や蛍光検出器を用いたHPLCなどで測定することにより、抗原3を検出することができる。
なお、液体試料151中の抗原3の濃度を測定する場合は、予め濃度既知の抗原3含有液体試料151を段階的に複数調製する。そして、上記検出方法により、各濃度の液体試料151中の抗原3を測定する。測定により得られた各液体試料151中の抗原3の蛍光強度を縦軸に、抗原3の濃度を横軸として検量線を作成する。
以上のような方法により、抗原3の存在を検出することができ、抗原3の濃度を定量することもできる。
次に、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第2の検出方法について説明する。
図5は、バイオセンサーを測定装置に装着した状態を示す模式図(斜視図)、図6は、図5に示すバイオセンサーを模式的に示す平面図、図7は、図6に示すバイオセンサーのA−A線断面図、図8は、図6に示すA−A線断面図の部分拡大図である。
なお、以下の説明では、図6中の紙面手前側を「上」、紙面奥側を「下」と言う。また、図7および図8中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
図5に示す測定装置(電子機器)101は、バイオセンサー100と、バイオセンサー100で得られた電流値(酸化還元電流)を解析する処理回路200を備えた演算装置102と、バイオセンサー100を装着するコネクタ131と、処理回路200とコネクタ131とを接続する配線132とを有する。
バイオセンサー100は、図6に示すように、基板120上に、作用電極121、対向電極122および参照電極123を備える検出部110を有している。
また、検出部110以外の基板120上の範囲は、図7に示すように、絶縁膜160で覆われている。すなわち、基板120上に絶縁膜160が設けられ、検出部110は、絶縁膜160の一部に設けられた開口部165から露出している。
基板120の構成材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリエチレンナフタレート(PES)、ポリイミド(PI)等の各種樹脂材料、石英ガラスのような各種ガラス材料、アルミナ、ジルコニアのような各種セラミックス材料等が挙げられ、これらのうちの1種または2種以上を組み合わせて用いることができる。
作用電極121の上側には、反応層140が設けられている。
対向電極122は、作用電極121との間に電圧を印加する電極である。試料供給空間150に液体試料151を供給した状態で、作用電極121と対向電極122との間に、作用電極121側が高電位となるように電圧を印加すると、抗原3と捕捉物8との結合により、電流値の変化を確実に捉えることができる。
また、対向電極122の面積は、作用電極121の2倍以上であるのが好ましく、10倍以上であるのがより好ましい。これにより、より高い精度で電流値を測定することができる。
参照電極123の構成材料としては、例えば、銀−塩化銀、水銀−硫酸水銀等が挙げられる。
このような絶縁膜160は、絶縁性の材料で構成されている。絶縁膜160の種類は特に限定されず、有機材料や無機材料のいずれも用いることができる。
有機材料としては、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルフェノール、ポリイミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテートなどの高分子化合物が挙げられる。これらは、1種または2種以上組み合わせて用いることができる。
このような絶縁膜160の平均厚さは、特に限定されないが、10〜5000nm程度であるのが好ましく、50〜1000nm程度であるのがより好ましい。絶縁膜160の厚さを前記範囲とすることにより、各電極121、122、123同士および配線130同士を、確実に絶縁することができる。
捕捉物8は、抗原3と特異的に反応するものであれば特に限定されないが、例えば、抗体が挙げられる。この抗体は、第1の化合物1の抗体と同様の抗体とすることができる。
このような架橋剤としては、作用電極121の金属表面へ結合し得る官能基と、捕捉物8と結合し得る官能基とを有するものであればよい。
捕捉物8と結合し得る基としては、カルボキシル基、酸ハライド、活性エステル(フタル酸イミドエステル、コハク酸イミドエステル等)等のカルボキシル基反応性誘導体等のアミド結合形成基、エステル結合形成基、チオエステル結合形成基等が挙げられる。
第2の検出方法は、第1の化合物1と第2の化合物2とを反応させて酸化還元検出試薬4を調製する工程[B1]と、試料供給空間150に液体試料151を供給する工程[B2]と、酸化還元検出試薬4を液体試料151中に供給する工程[B3]と、酸化還元検出試薬4と抗原3との結合により生じる酸化還元電流の変化を検出する工程[B4]とを有する。
まず、第1の化合物1と第2の化合物2とを反応して酸化還元検出試薬4を調製する。
なお、以下の説明では酸化還元検出試薬4の結合部位を抗体41、標識部位22をフェロセン(酸化還元物質)42として説明する。
酸化還元検出試薬4の調製は、例えば、第1の化合物1(化合物(22))と標識部位22にフェロセン42を有する第2の化合物2(化合物(25))とを、第1の検出方法と同様の条件で反応させることにより行う。
なお、第1の検出方法と同様に、酸化還元検出試薬4の重合度(紫外線照射時間)を制御することによって、抗体41分子表面に第1の連結部12を介して多数のフェロセン42を導入することができる。
また、第1の検出方法と同様の方法により、化合物(2)と化合物(7)とを反応させて、酸化還元検出試薬4(化合物(27))を得ることもできる。
図8(a)に示すように、液体試料151を試料供給空間150に供給する。
試料供給空間150に液体試料151を供給すると、反応層140と液体試料151が接触する。
反応層140と液体試料151とが接触すると、図8(b)に示すように、反応層140の表面に存在する捕捉物8が液体試料151中に含まれる抗原3と反応し、結合する。
しかしながら、捕捉物8と抗原3とが結合しても感度が低い場合があり、処理回路200が電流値の変化を十分に検出することができない場合がある。このような場合、抗原3の検出感度を上げるために、本発明の酸化還元検出試薬4(検出キット)が用いられる。
図8(c)に示すように、捕捉物8と抗原3とが結合した液体試料151中に、酸化還元検出試薬4を供給する。
液体試料151中に酸化還元検出試薬4を供給すると、捕捉物8に結合している抗原3に酸化還元検出試薬4の抗体41が接触する。
抗原3に抗体41が接触すると、図8(d)に示すように、抗原3と抗体41とが反応し、結合する。
なお、酸化還元検出試薬4の供給量は、蛍光検出試薬5と同様である。
作用電極121と対向電極122との間に、作用電極121側が高電位となるように電圧を印加しておくと、抗原3と抗体41との結合による、酸化還元物質42の酸化還元反応により酸化還元電流値が変化する。この酸化還元電流の変化を処理回路200が検出することにより、抗原3を検出することができる。
また、液体試料151中の抗原3の濃度を測定する場合は、第1の検出方法と同様の方法で行うことができる。
なお、ポリマー鎖に1000個程度の酸化還元物質42(フェロセン分子)が存在する場合、約3×1010 個のフェロセン分子が存在する。そのため、1個あたりのフェロセン分子のモル濃度は0.5×10−13mol/Lとなり、高感度の電気化学測定(CV測定)を行えばナノレベルにて抗体分子1個あたりの検出が可能となる。
例えば、金微粒子1個あたり、同様のフェロセンポリマー導入された状態にて約1600個のフェロセンが存在し、これが例えば、抗原3に細密固定化できたとすると、5×104個の金微粒子が抗原3に存在する。これら固定化された全フェロセン分子数は約8×1011個となり約1.2×10−12mol/Lにて、さらに一桁検出感度が向上する。
このように、この機能性ポリマーによる抗体反応増幅手法によれば、原理的には1分子抗体反応の結果がモニター可能であり、計測速度及び感度向上に大きな効果が期待できる。
次に、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第3の検出方法について説明する。
以下、第3の検出方法について説明するが、前記第2検出方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
図9は、バイオセンサーを模式的に示す平面図、図10は、図9に示すバイオセンサーのB−B線断面図。
なお、以下の説明では、図10中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
すなわち、図9および図10に示すバイオセンサー100は、各検出部110に圧電素子180が設けられている。
また、基板120には、凹部126が設けられている。この凹部126に下電極183(および上電極182)が対応するように、圧電体181の縁部が基板120に固定(固着)されている。
圧電体181の材料としては、例えば、水晶、ニオブ酸リチウム、タンタル酸リチウムおよびホウ酸リチウム等の圧電材料を用いることができる。なお、これらの材料は、単独で用いてもよいし、2種以上を組み合わせて(例えば、積層体として)用いることができる。
そして、上電極182の上面には、反応層140が設けられている。
絶縁膜160および反応層140は、それぞれ、前記第2の検出方法で説明した絶縁膜160および反応層140と同様の構成とすることができ、前記第2の検出方法と同様にして形成することができる。
[C1]検出試薬調製工程
B1工程と同様に行う。
[C2]液体試料供給工程
B2工程と同様に行う。
B3工程と同様に行う。
[C4]抗原検出工程
作用電極121と対向電極122との間に、作用電極121側が高電位となるように電圧を印加しておくと、抗原3と抗体41との結合により、反応層140の質量が変化し、圧電素子180から検出される振動数も変化する。この振動数の変化を処理回路200が検出することにより、抗原3を検出することができる。
以上のような動作により、捕捉物8に結合した抗原3に酸化還元検出試薬4が結合した場合と結合していない場合とで振動周波数が大きく変化するので、液体試料151中の抗原3の量を簡単に高感度に検出することができる。
次に、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第4の検出方法について説明する。
図11は、第4の検出方法を模式的に説明するための縦断面図である。
なお、以下の説明では、図11中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
本検出方法では、捕捉物8を作用電極121上に担持する代わりに、捕捉物8を粒状の担体124に担持した捕捉物担体7を用いている。
捕捉物担体7は、液体試料151中の抗原3を捕捉する機能を有する。
この捕捉物担体7の担体124は、本実施形態においては球状(粒状)に形成されている。これにより、試料溶液中151を少ない抵抗で移動するので、抗原3の検出を迅速に行うことができる。また、球状であることにより、表面積が大きくなるので、捕捉物8をより多く担体124の表面に担持することができる。
なお、担体124の形状は、球状に限定されず、角柱状、円柱状などであってもよい。
担体124を構成する材料は、特に限定されず、前述した基板120や作用電極121を構成する材料と同様のものが挙げられる。
そこで、本発明の検出キットにより得られる色調検出試薬6を用いて、抗原3の存在を検出する。
第4の検出方法は、第1の化合物1と第2の化合物2とを反応させて色調検出試薬6を調製する工程[D1]と、試料供給空間150に液体試料151を供給する工程[D2]と、色調検出試薬6を液体試料151中に供給する工程[D3]と、色調検出試薬6と抗原3との結合により生じる色調の変化を検出する工程[D4]とを有する。
まず、第1の化合物1と第2の化合物2とを反応して色調検出試薬6を調製する。
なお、以下の説明では色調検出試薬6の結合部位11を抗体61、標識部位22を色素化合物62として説明する。
色調検出試薬6の調製は、例えば、第1の化合物1(化合物(22))と標識部位22に色素化合物62を有する第2の化合物2(化合物(30))とを、第1の検出方法と同様の条件で反応させることにより行う。
まず、図11(a)に示すように、液体試料151を反応容器152に供給する。
次に、図11(a)に示すように、液体試料151(試料供給空間150)中に捕捉物担体7を供給する。
液体試料151中に捕捉物担体7を供給すると、抗原3と捕捉物担体7の捕捉物8とが接触する。
抗原3と捕捉物8とが接触すると、図11(b)に示すように、捕捉物担体7の捕捉物8が抗原3を捕捉し、結合する。
次に、図11(c)に示すように、液体試料151中に色調検出試薬6を供給する。
液体試料151中に色調検出試薬6を供給すると、捕捉物担体7の捕捉物8に結合している抗原3に色調検出試薬6の抗体61が接触する。
抗原3に抗体61が接触すると、図11(d)に示すように、抗原3と抗体61とが反応し、結合する。
なお、色調検出試薬6の液体試料151に対する比重は、1g/cm3以下であることが好ましい。
液体試料151中に含まれていた抗原3は、捕捉物担体7との結合により不溶化し、そして、色調検出試薬6との結合により抗原捕捉物9となって色調が変化する。
抗原捕捉物9は、液体試料151に対する比重が大きくなるので、時間の経過とともに除々に液体試料空間150の下部へと沈降し、凝集していく。そのため、反応容器152を外部から視認したとき、色調も除々に反応容器152の下部へと移動する。
このとき、反応容器125中の色調は、反応容器152内の下端部では抗原捕捉物9の色素化合物62の色調が認められ、反応容器152内の上方側では液体試料151の色調、例えば、無色透明が認められる。
なお、液体試料151中の抗原3の濃度を測定する場合は、第1の検出方法と同様の方法で行うことができる。
次に、本発明の検出キットを用いた検出対象物の第5の検出方法について説明する。
図12は、第5の検出方法を模式的に説明する縦断面斜視図である。
なお、以下の説明では、図12中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
以下、第5の検出方法について説明するが、前記第1の検出方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
本検出方法は、ウェル125を有する基板120を用いて行う。
基板120は、複数のウェル125を有している。そして、そのウェル125の底面に捕捉物8が担持されている。
抗原3の検出は、第2の検出方法と同様の方法で行われる。しかし、ウェル125が電極を有していない場合には、例えば、第1の検出方法と同様に、蛍光により検出される。
以上、本発明の検出キットを説明したが、本発明はこれに限定されるものでない。
例えば、本発明の検出キットでは、各部の構成は、同様の機能を発揮する任意の構成のものに置換することができ、また、任意の構成を付加することもできる。
Claims (13)
- 検出対象物を選択的に検出し得る検出キットであって、
前記検出対象物と特異的に結合する結合部位と、反応性を有する第1の反応部位とを含む第1の化合物と、
前記第1の反応部位と反応する第2の反応部位と、標識部位とを含む第2の化合物とを有し、
前記第1の化合物と前記第2の化合物とを反応させることにより、前記第1の反応部位と前記第2の反応部位とを連結させることを特徴とする検出キット。 - 前記結合部位は、抗原または抗体である請求項1に記載の検出キット。
- 前記第1の反応部位および前記第2の反応部位は、それぞれ重合性基で構成されている請求項1または2に記載の検出キット。
- 前記第1の化合物は、前記結合部位と前記第1の反応部位との間に、前記結合部位と前記第1の反応部位とを連結する第1の連結部位を有する請求項1ないし3のいずれかに記載の検出キット。
- 前記第1の連結部位は、粒子を含むものである請求項4に記載の検出キット。
- 前記粒子の表面に、前記結合部位および/または前記第1の反応部位が複数結合している請求項5に記載の検出キット。
- 前記粒子に結合する前記結合部位および前記第1の反応部位の存在比は、前記結合部位を[A]、前記第1の反応部位を[B]としたとき、A/Bが0.1〜1.0である請求項6に記載の検出キット。
- 前記標識部位は、酸化還元物質、蛍光物質および色素化合物の少なくとも1種で構成される請求項1ないし7のいずれかに記載の検出キット。
- 前記標識部位を複数有する請求項1ないし8のいずれかに記載の検出キット。
- 前記第2の化合物は、前記第2の反応部位と前記標識部位との間に、前記第2の反応部位と前記標識部位とを連結する第2の連結部位を有する請求項1ないし9のいずれかに記載の検出キット。
- さらに、検出対象物を選択的に捕捉し得る捕捉物が担持された基体を有する請求項1ないし10のいずれかに記載の検出キット。
- 前記基体は、ウェルを備え、
当該ウェルの内面に前記捕捉物が担持されている請求項11に記載の検出キット。 - 前記基体は、粒状に形成されている請求項11または12に記載の検出キット。
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