JP2008237099A - Enzyme functional electrode, biosensor and fuel cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、例えばアルコール等の特定の基質から電子を引き抜く脱水素酵素の特性を利用する酵素機能電極、該酵素機能電極を利用して上記基質濃度を測定するバイオセンサ、及び上記基質を燃料として発電する燃料電池に関する。 The present invention includes, for example, an enzyme functional electrode that utilizes the characteristics of a dehydrogenase that extracts electrons from a specific substrate such as alcohol, a biosensor that measures the substrate concentration using the enzyme functional electrode, and the substrate as a fuel. The present invention relates to a fuel cell for generating electricity.
酵素機能電極は、例えばアルコール、グルコース等の特定の基質（標的物質）を検知するセンサとして利用されており、特に、それら標的物質以外の成分の影響を受け難い利点を有するバイオセンサが各分野で広く利用されている。こうしたバイオセンサとしては、例えば、インシュリン療法で血中のグルコース濃度を制御している糖尿病患者に必要とされる血糖値センサ、疲労度の測定に必要とされる乳酸センサ、ワインなどのアルコール飲料や食料品の品質をモニタリングするために用いられるアルコールセンサなどが知られている。 The enzyme functional electrode is used as a sensor for detecting a specific substrate (target substance) such as alcohol and glucose, for example. In particular, biosensors that have the advantage of being hardly affected by components other than the target substance are used in various fields. Widely used. Examples of such biosensors include blood glucose level sensors required for diabetic patients whose blood glucose levels are controlled by insulin therapy, lactic acid sensors required for measuring fatigue levels, alcoholic beverages such as wine, Alcohol sensors used for monitoring the quality of food products are known.
また、やはり酵素機能電極を利用して、例えばグルコースやエタノールなどの基質を燃料として発電するバイオ電池（例えば体内埋め込み型の電池や、環境負荷の少ない電池等）が近年着目されている。こうしたバイオ電池は、化学エネルギーを直接電気エネルギーに変換する燃料電池の一種であり、
・白金等の貴金属を触媒に用いる必要がない。
・燃料のクロスオーバーによるエネルギー損失が発生しない。
・一酸化炭素等による触媒被毒が発生しない。
・室温稼動など動作条件が穏やかである。
といった多くの利点を有している。
In recent years, bio batteries (for example, implantable batteries, batteries with a low environmental load, etc.) that generate electricity using a substrate such as glucose or ethanol as a fuel have also attracted attention in recent years. These biocells are a type of fuel cell that converts chemical energy directly into electrical energy,
-There is no need to use noble metals such as platinum as catalysts.
・ Energy loss due to fuel crossover does not occur.
・ Catalyst poisoning by carbon monoxide does not occur.
・ Operating conditions such as room temperature operation are mild.
Has many advantages.
このようなバイオセンサやバイオ電池（燃料電池）で使用される酵素機能電極に利用される酵素としては、酸素との反応性がないとの理由から脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）が望ましいことが知られている。そして、生物が有する脱水素酵素には、例えば、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）やＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補因子とするもの、ＦＡＤ（フラビンアデニンヌクレオチド）を補因子とするもの、ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）を補因子とするもの、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）を補因子とするもの等がある。 It is known that a dehydrogenase is desirable as an enzyme used for an enzyme functional electrode used in such a biosensor or biocell (fuel cell) because it is not reactive with oxygen. ing. Examples of dehydrogenases possessed by organisms include, for example, NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) and NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) as cofactors, and FAD (flavin adenine nucleotide) as cofactors. And those using FMN (flavin mononucleotide) as a cofactor and those using PQQ (pyrroloquinoline quinone) as a cofactor.
このうち、ＮＡＤ（Ｐ）を補因子とする酵素を用いる場合、電極からＮＡＤ（Ｐ）が漏れる問題があり、それを防止する目的で、ＮＡＤ（Ｐ）をＰＥＧ（ポリエチレングリコール）等の高分子に固定する試みや、電極上に化学結合で固定する試みが行われてはいるが、いずれの試みでも、得られる電流は極めて小さい。また、ＮＡＤ（Ｐ）は電極上で電子を伝達する際に、不可逆性のダイマーになる傾向があり、それが原因で出力が低下するといった不具合も有している。このように、ＮＡＤ（Ｐ）を補因子とする酵素は、バイオセンサやバイオ電池に応用するとき、信頼性の低下や劣化を招く要因を有している。 Among them, when using an enzyme having NAD (P) as a cofactor, there is a problem that NAD (P) leaks from the electrode. For the purpose of preventing this, NAD (P) is a polymer such as PEG (polyethylene glycol). Attempts have been made to fix them on the electrode or to fix them on the electrodes with chemical bonds, but the current obtained by either attempt is extremely small. Further, NAD (P) tends to become an irreversible dimer when electrons are transferred on the electrode, and this also has a problem that the output is reduced. As described above, an enzyme having NAD (P) as a cofactor has a factor that causes a decrease in reliability or deterioration when applied to a biosensor or a biobattery.
そこで近年は、ＰＱＱを補因子とする酵素をバイオセンサやバイオ電池の酵素として用いる検討がなされ始めている。このような酵素としては、例えば、膜結合型のグルコース脱水素酵素（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ由来）、可溶性のグルコース脱水素酵素（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．３４−１由来）、膜結合型のアルコール脱水素酵素（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．３３由来）、可溶性のアルコール脱水素酵素（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ由来）等がある。 In recent years, therefore, studies have been started on the use of an enzyme having PQQ as a cofactor as an enzyme in a biosensor or biobattery. Examples of such enzymes include membrane-bound glucose dehydrogenase (derived from Acinetobacter calcaceticus, Gluconobacter suboxydans), soluble glucose dehydrogenase (derived from Acinetobacter calcaceticus, Erwinia sp. 34-1), and membrane-bound alcohol. Examples include dehydrogenase (derived from Gluconobacter sp. 33), soluble alcohol dehydrogenase (derived from Comonas testosteroni), and the like.
その中でも、バイオマスから生産可能なエタノールを酸化できる酵素は、環境に優しいバイオ電池用の触媒として注目されている。アルコールを燃料とする酵素機能電極に用いる酵素としては、特に、グルコノバクター由来の膜結合型アルコール脱水素酵素（ＡＤＨｔｙｐｅIII）が注目されている。例えば、非特許文献１に見られるように、グルコノバクター由来のＡＤＨｔｙｐｅIIIをグラファイト電極やカーボン電極、カーボンスクリーンプリント電極に固定して、電子メディエータを用いないで、アルコールの酸化電流を得る手段が開発されている。また、非特許文献２では、導電性高分子のポリピロール内にＡＤＨｔｙｐｅIIIを固定することで、アルコールの酸化電流を得ることに成功している。さらに、非特許文献３では、テトラブチルアンモニウムブロマイド（ＴＢＡＢ）により形成される、多孔質なナフィオン膜にＡＤＨｔｙｐｅIIIを固定した、酵素機能電極が、バイオ電池として働くことを示している。
上述した、ＰＱＱを補酵素としたＡＤＨｔｙｐｅIIIは、アルコールから奪った電子を先ずサブユニットI内のＰＱＱに渡す。電子は、引き続き、同じサブユニットI内に存在するヘムＣI、サブユニットII内のヘムＣII１と順次移動し、最終的にはヘムＣII２またはヘムＣII３にまで渡される。 The above-described ADH type III using PQQ as a coenzyme first passes electrons taken from alcohol to PQQ in subunit I. The electrons subsequently move sequentially with the heme CI present in the same subunit I and the heme CII1 within the subunit II, and finally passed to the heme CII2 or the heme CII3.
ｐＨ７．０溶液におけるＡＤＨｔｙｐｅIIIのヘムＣIの電位は−１３０ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌであるが、ＣII1の電位は４９ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌであり、ＣII２およびＣII３の電位はいずれも１８８ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌであるから、酵素内における電子の移動先であるヘムＣIIの酸化還元電位は、ヘムＣIの電位よりも高い。そのため、ヘムＣIからヘムＣIIを経て電極に電子が移動するときの電位差は、ヘムＣIから直接電極に電子移動する際の電位差よりも小さくなり、結果として、電極の性能が悪くなってしまう。
本発明は、以上の点に鑑みなされたものであり、安定して高電位を維持することができる酵素機能電極、その酵素電極を利用したバイオセンサ及び燃料電池を提供することを目的とする。
Since the potential of heme CI of ADHtype III in the pH 7.0 solution is −130 mV vs Ag / AgCl, the potential of CII1 is 49 mV vs Ag / AgCl, and the potentials of CII2 and CII3 are both 188 mV vs Ag / AgCl. The redox potential of heme CII, which is the electron transfer destination in the enzyme, is higher than the potential of heme CI. Therefore, the potential difference when electrons move from the heme CI to the electrode via the heme CII is smaller than the potential difference when electrons move directly from the heme CI to the electrode, resulting in poor electrode performance.
The present invention has been made in view of the above points, and an object of the present invention is to provide an enzyme functional electrode capable of stably maintaining a high potential, a biosensor using the enzyme electrode, and a fuel cell.
（１）請求項１記載の酵素機能電極は、電極上に特定の基質を酸化する酵素を備え、基質から酵素を介して電極に電子が伝達される酵素機能電極であって、その酵素は、ＰＱＱを補酵素とする膜結合型アルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIIIであり、且つ、チトクロームＣを含むサブユニットIIを含まず、サブユニットIおよびサブユニットIIIから構成されるもの（以下、「ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）」とする）である。 (1) The enzyme functional electrode according to claim 1 is an enzyme functional electrode comprising an enzyme that oxidizes a specific substrate on the electrode, and electrons are transferred from the substrate to the electrode through the enzyme, It is a membrane-bound alcohol dehydrogenase type III that uses PQQ as a coenzyme, does not contain subunit II containing cytochrome C, and consists of subunit I and subunit III (hereinafter referred to as “ADH type III (I / III) ”).
このような構造を有する酵素機能電極では、サブユニットIのヘムＣIからサブユニットIIのヘムＣIIに電子が伝達することはなく、それが原因で起きる電圧降下も生じない。その結果、本発明の酵素機能電極を、例えば、バイオ電池のアノードに用いた場合、カソード極との間の酸化還元電位差で決まる電位は、従来のように、ＡＤＨｔｙｐｅIIIをそのまま活用する場合よりも、２００〜３００ｍＶ大きくなる。 In the enzyme functional electrode having such a structure, electrons are not transferred from the heme CI of the subunit I to the heme CII of the subunit II, and a voltage drop caused by the electron is not generated. As a result, when the enzyme functional electrode of the present invention is used, for example, in the anode of a bio battery, the potential determined by the oxidation-reduction potential difference with the cathode electrode is higher than in the case of using ADHtype III as it is conventionally. Increased by 200 to 300 mV.
また、サブユニットIIは疎水性表面を持ち、膜内に入り込む領域であるが、そのサブユニットIIを除くことで、本発明が備える酵素（アルコール脱水素酵素）は、界面活性剤を使用せずとも可溶化することが可能となり、酵素を固定化する手段やハンドリングなどの面で、膜蛋白質のような制限を受けなくて済む。
（２）請求項２の酵素機能電極では、酵素のうち、ヘムの存在する面が前記電極と接触する。このことにより、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）から電極に直接電子を伝達させることができる。この場合、酵素機能電極は、電子メディエータを備えなくても良いので、電子メディエータが酵素機能電極から外れて対極と反応し、クロスオーバー現象を引き起こしてしまうようなことがない。その結果、カソード極とアノード極との間のセパレータを無くすことが可能となる。
Subunit II has a hydrophobic surface and is a region that enters the membrane. By removing subunit II, the enzyme (alcohol dehydrogenase) provided by the present invention does not use a surfactant. Both of them can be solubilized, and there is no need to be restricted like a membrane protein in terms of means for immobilizing the enzyme and handling.
(2) In the enzyme functional electrode according to claim 2, the surface of the enzyme where heme is present is in contact with the electrode. As a result, electrons can be directly transferred from the ADH type III (I / III) to the electrode. In this case, since the enzyme functional electrode does not need to include an electron mediator, the electron mediator does not come off the enzyme functional electrode and react with the counter electrode to cause a crossover phenomenon. As a result, it is possible to eliminate the separator between the cathode electrode and the anode electrode.
ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）と電極間の直接電子伝達を実現するためには、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のヘムＣI部周辺の露出部におけるアミノ酸において、疎水性、または極性非電荷の割合を高めることが好ましい。この場合、天然に存在するＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を用いても良いし、ヘムＣI部周辺の露出部におけるアミノ酸の組成を疎水性または極性非電荷の特性に改変したものを用いても良い。 To achieve direct electron transfer between ADHtype III (I / III) and the electrode, increase the proportion of hydrophobic or polar uncharged amino acids in the exposed part around the heme CI part of ADHtype III (I / III) Is preferred. In this case, naturally occurring ADH type III (I / III) may be used, or the amino acid composition in the exposed portion around the heme CI portion may be modified to have hydrophobic or polar uncharged characteristics.
また、酸化還元電位がヘムＣIよりも高い電子メディエータを用いることも可能である。この場合、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が基質の酸化で得た電子を効率的に電極に渡すことが可能となり、電流量の向上が期待できる。特に、ヘムＣI部周辺の表面特性が電極面と反対の場合など、ヘムＣI部と電極面の距離が離れている場合でも、効率的に、電極に電子を伝達することができる。
（３）請求項３記載の酵素機能電極では、酵素が、グルコノバクター・サブオキシダンス（Gluconobacter suboxydans）が有するキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII由来である。この酵素のサブユニットIのヘムＣI周辺の露出面におけるアミノ酸組成は、その殆どが疎水性アミノ酸であり、アルギニンのみが電荷を帯びているアミノ酸である。その結果、請求項３記載の酵素機能電極では、電子メディエータを用いなくても、電極への効率的な電子伝達が可能となる。
（４）請求項４記載の酵素機能電極では、電極が、導電性金属、半導体材料、及び金属酸化物から成る群から選択された１以上の材料から成る。この材料を用いることにより、電極表面の形状や構造に制限されることなく、酵素から電極への電子伝達が容易に実現されるようになる。
（５）請求項５記載の酵素機能電極は、酸化還元電位がヘムＣIよりも高い電子メディエータを備える。このことにより、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が基質の酸化で得た電子を効率的に電極に渡すことが可能となり、電流量の向上が可能となる。特に、ヘムＣI部周辺の表面特性が電極面と反対の場合など、ヘムＣI部と電極面の距離が離れている場合でも、効率的に、電極に電子を伝達することができる。
（６）請求項６記載のバイオセンサは、請求項１〜５のいずれかに記載の酵素機能電極を備える。
It is also possible to use an electron mediator having a redox potential higher than that of heme CI. In this case, it becomes possible for ADHtype III (I / III) to efficiently pass electrons obtained by oxidation of the substrate to the electrode, and an improvement in the amount of current can be expected. In particular, even when the distance between the hem CI portion and the electrode surface is large, such as when the surface characteristics around the hem CI portion are opposite to the electrode surface, electrons can be efficiently transmitted to the electrode.
(3) In the enzyme functional electrode according to claim 3, the enzyme is derived from alcohol dehydrogenase type III, which is a quinohem protein of Gluconobacter suboxydans. Most of the amino acid composition in the exposed surface around the heme CI of subunit I of this enzyme is a hydrophobic amino acid, and only arginine is a charged amino acid. As a result, the enzyme functional electrode according to claim 3 can efficiently transfer electrons to the electrode without using an electron mediator.
(4) In the enzyme functional electrode according to claim 4, the electrode is made of one or more materials selected from the group consisting of conductive metals, semiconductor materials, and metal oxides. By using this material, electron transfer from the enzyme to the electrode can be easily realized without being limited by the shape and structure of the electrode surface.
(5) The enzyme functional electrode according to claim 5 includes an electron mediator having a redox potential higher than that of heme CI. This makes it possible for ADHtype III (I / III) to efficiently pass the electrons obtained by the oxidation of the substrate to the electrode, and the amount of current can be improved. In particular, even when the distance between the hem CI portion and the electrode surface is large, such as when the surface characteristics around the hem CI portion are opposite to the electrode surface, electrons can be efficiently transmitted to the electrode.
(6) A biosensor according to claim 6 includes the enzyme functional electrode according to any one of claims 1 to 5.
本発明のバイオセンサは、備えている酵素機能電極の酵素により酸化される基質の濃度を的確に測定することができる。すなわち、酵素機能電極に電子メディエータを用いない場合は、ＡＤＨｔｙｐｅIIIのサブユニットIに存在するヘムＣIの酸化還元電位よりも正側の電位を電極に与えることにより、基質から酵素を介して電極に電子が伝達されることで得られる電流値として、基質の濃度が検知されるようになる。また、酵素機能電極に電子メディエータを用いる場合は、その電子メディエータよりも正側の電位を電極に与えることにより、基質から酵素を介して電極に電子が伝達されることで得られる電流値として、基質の濃度が検知されるようになる。本発明のバイオセンサとしては、例えば、アルコールの濃度を測定するバイオセンサが挙げられる。
（７）請求項７記載の燃料電池は、請求項１〜５のいずれかに記載の酵素機能電極を備える。
The biosensor of the present invention can accurately measure the concentration of the substrate oxidized by the enzyme of the enzyme functional electrode provided. In other words, when an electron mediator is not used for the enzyme functional electrode, by applying a potential on the positive side of the redox potential of heme CI present in subunit I of ADHtype III to the electrode, electrons are transferred from the substrate to the electrode via the enzyme. The concentration of the substrate is detected as a current value obtained by transmitting. In addition, when an electron mediator is used for the enzyme functional electrode, by applying a positive potential to the electrode from the electron mediator, as a current value obtained by transferring electrons from the substrate to the electrode through the enzyme, The concentration of the substrate will be detected. Examples of the biosensor of the present invention include a biosensor that measures the concentration of alcohol.
(7) A fuel cell according to a seventh aspect includes the enzyme functional electrode according to any one of the first to fifth aspects.
本発明の燃料電池は、例えば、請求項１〜５のいずれかに記載の酵素機能電極からなるアノード極と、酸素に電子を伝達することのできる触媒又は酵素のいずれかを保持するカソード極とを備え、アノード極とカソード極とが電気的に結合されるとともに、それら各電極間がイオン導電性を有する物質で隔てられる構造を有する。本発明の燃料電池は、上記構造を有することにより、アルコール燃料で発電できる。 A fuel cell of the present invention includes, for example, an anode electrode composed of the enzyme functional electrode according to any one of claims 1 to 5, and a cathode electrode that holds either a catalyst or an enzyme capable of transferring electrons to oxygen. The anode and the cathode are electrically coupled, and the electrodes are separated from each other by a material having ionic conductivity. The fuel cell of the present invention can generate electric power with alcohol fuel by having the above structure.
以下、本発明にかかる酵素機能電極、及びそれを用いたバイオセンサ及び燃料電池（バイオ電池）の実施の形態について、図１〜図６を参照して説明する。
図１は、本発明の一実施形態である酵素機能電極１の構造を模式的に示すものである。この酵素機能電極１は、特定の基質（標的物質）９を酸化する脱水素酵素３を触媒として、上記基質９から電極１１へと電子を伝達するものである。すなわち、酵素機能電極１は、特定の基質９を酸化する酵素３が電極１１の表面に固定されており、この酵素３が基質９を酸化することにより基質９から電子（ｅ-）が引き抜かれて酸化物１３が得られるとともに、酵素３が還元されることにより酵素３から電極１１に電子が伝達される。
DESCRIPTION OF EMBODIMENTS Hereinafter, embodiments of an enzyme functional electrode according to the present invention, and a biosensor and a fuel cell (biocell) using the same will be described with reference to FIGS.
FIG. 1 schematically shows the structure of an enzyme functional electrode 1 according to an embodiment of the present invention. The enzyme functional electrode 1 is configured to transfer electrons from the substrate 9 to the electrode 11 using the dehydrogenase 3 that oxidizes a specific substrate (target substance) 9 as a catalyst. That is, in the enzyme functional electrode 1, an enzyme 3 that oxidizes a specific substrate 9 is fixed on the surface of the electrode 11, and an electron (e − ) is extracted from the substrate 9 by the enzyme 3 oxidizing the substrate 9. Thus, the oxide 13 is obtained, and the enzyme 3 is reduced, whereby electrons are transferred from the enzyme 3 to the electrode 11.
酵素機能電極１で用いる酵素３は、サブユニットI（符合５）およびサブユニットIII（符合７）で構成される。この酵素３は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ（グルコノバクター・サブオキシダンス）由来のキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII（ＡＤＨｔｙｐｅIII）のサブユニットIおよびサブユニットIIIで構成される蛋白質からなる。酵素３から電極１１への電子の伝達は、このチトクロームＣI部位５ａを介して行われる。 The enzyme 3 used in the enzyme functional electrode 1 is composed of subunit I (symbol 5) and subunit III (symbol 7). This enzyme 3 consists of a protein composed of subunit I and subunit III of alcohol dehydrogenase type III (ADH type III), which is a quinohem protein derived from Gluconobacter suboxydans (Gluconobacter suboxydans). Electrons are transferred from the enzyme 3 to the electrode 11 through the cytochrome CI site 5a.
また、チトクロームＣI部位５ａは、電子を放出する能力を有するヘム鉄が隣接するアミノ酸とともに外部に向けて露出する構造を有している。そして、これらヘム鉄に隣接するアミノ酸は、アルギニン以外は、疎水性アミノ酸が多く、電荷を有していないアミノ酸の割合が高くなっており、チトクロームＣI部位５ａの表面には、いわゆる疎水面が形成されている。この疎水面は、電極１１の表面に近接している。これにより、ヘム鉄と電極１１の表面との親和性が高められるとともに、ヘム鉄を電極１１の表面に近づけることができるようになるため、チトクロームＣI部位５ａから電極１１に直接電子を効率的に伝達することが可能になる。 The cytochrome CI site 5a has a structure in which heme iron having the ability to emit electrons is exposed to the outside together with the adjacent amino acid. In addition to arginine, these amino acids adjacent to heme iron have many hydrophobic amino acids, and the proportion of amino acids having no charge is high. A so-called hydrophobic surface is formed on the surface of cytochrome CI site 5a. Has been. This hydrophobic surface is close to the surface of the electrode 11. As a result, the affinity between heme iron and the surface of the electrode 11 is enhanced, and the heme iron can be brought closer to the surface of the electrode 11, so that electrons are efficiently transferred directly from the cytochrome CI site 5 a to the electrode 11. It becomes possible to communicate.
図２は、本発明の他の実施形態である酵素機能電極の構造を模式的に示すものである。図２に示すように、酵素機能電極１では、特定の基質９を酸化する酵素３が電子メディエータ１５に化学結合しており、電子メデイエータ１５は電極１１の表面に固定されている。酵素３が基質９を酸化することにより、基質９から電子（ｅ-）が引き抜かれて酸化物１３が得られるとともに、酵素３が還元されることにより、酵素３から電子メディエータ１５に電子が伝達され、引き続き、電子メディエータ１５から電極１１に電子が伝達される。酵素３は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ（グルコノバクター・サブオキシダンス）由来のキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII（ＡＤＨｔｙｐｅIII）のサブユニットIおよびサブユニットIIIで構成される蛋白質からなる。 FIG. 2 schematically shows the structure of an enzyme functional electrode according to another embodiment of the present invention. As shown in FIG. 2, in the enzyme functional electrode 1, the enzyme 3 that oxidizes a specific substrate 9 is chemically bonded to the electron mediator 15, and the electron mediator 15 is fixed to the surface of the electrode 11. When the enzyme 3 oxidizes the substrate 9, electrons (e − ) are extracted from the substrate 9 to obtain the oxide 13, and when the enzyme 3 is reduced, electrons are transferred from the enzyme 3 to the electron mediator 15. Subsequently, electrons are transmitted from the electron mediator 15 to the electrode 11. Enzyme 3 is composed of a protein composed of subunit I and subunit III of alcohol dehydrogenase type III (ADH type III), a quinohem protein derived from Gluconobacter suboxydans (Gluconobacter suboxydans).
酵素機能電極１で検知することのできる基質９としては、例えば、エタノール、メタノール、ブタノール、１、２−プロパンジオール等のアルコールが挙げられる。
電極１１としては、電極表面の形状や構造に制限されることなく、導電性のある物質なら全てのものを用いることができ、例えば、カーボン材、導電性金属、半導体材料および金属酸化物などを用いることができる。このうち、特に好ましいものはカーボン材である。このようなカーボン材としては、例えばカーボン紙、（カーボンスクリーンプリント電極）、カーボンフェルト、カーボンブラック、カーボンパウダー、カーボンペースト、カーボン繊維、単層カーボンナノチューブ、２層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブ、カーボンナノチューブアレイ、グラッシーカーボン、ダイヤモンドコート、メソポーラスカーボングラファイト、多結晶グラファイトおよび熱分解黒鉛等が挙げられる。またこれらうち、特にメソポーラスカーボングラファイト等の多孔質な構造を有する電極１１を用いれば、その多孔質内部にＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を物理的に固定することができるため、電極１１の耐熱性や寿命の向上を図ることができる。また、カーボンナノチューブを含む電極１１を用いれば、カーボンナノチューブにＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を直接固定することができるため、カーボンナノチューブの有する高い比表面積により高い電流密度を確保することが可能となる。
Examples of the substrate 9 that can be detected by the enzyme functional electrode 1 include alcohols such as ethanol, methanol, butanol, and 1,2-propanediol.
The electrode 11 is not limited to the shape or structure of the electrode surface, and any material that is conductive can be used. For example, a carbon material, a conductive metal, a semiconductor material, a metal oxide, and the like can be used. Can be used. Among these, a carbon material is particularly preferable. Examples of such a carbon material include carbon paper, (carbon screen print electrode), carbon felt, carbon black, carbon powder, carbon paste, carbon fiber, single-walled carbon nanotube, double-walled carbon nanotube, multi-walled carbon nanotube, and carbon nanotube. Examples thereof include an array, glassy carbon, diamond coat, mesoporous carbon graphite, polycrystalline graphite, and pyrolytic graphite. Of these, particularly, when the electrode 11 having a porous structure such as mesoporous carbon graphite is used, ADHtype III (I / III) having PQQ as a coenzyme can be physically fixed in the porous interior. The heat resistance and life of the electrode 11 can be improved. Further, if the electrode 11 containing carbon nanotubes is used, ADH type III (I / III) using PQQ as a coenzyme can be directly fixed to the carbon nanotubes, so that high current density is ensured by the high specific surface area of the carbon nanotubes. It becomes possible.
電極１１の表面は疎水性であるか、疎水性の官能基で修飾されていることが好ましい。こうすることにより、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のＣ１露出面に形成される疎水面と、疎水性の電極１１の表面とが近づきやすくなるため、チトクロームＣ１から外部に向けて露出するヘム鉄と電極１１の表面とが近づきやすくなる。 The surface of the electrode 11 is preferably hydrophobic or modified with a hydrophobic functional group. By doing so, the hydrophobic surface formed on the C1 exposed surface of ADHtype III (I / III) using PQQ as a coenzyme and the surface of the hydrophobic electrode 11 can be easily approached, so that the cytochrome C1 is directed outward. The exposed heme iron and the surface of the electrode 11 are likely to approach each other.
酵素機能電極１において、酵素３、すなわち、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を電極１１に固定する方法としては、例えば、図３（ａ）〜（ｃ）に示す方法がある。なお、図３（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、電極１１の表面に酵素３が固定される構造を模式的に示す断面図である。 In the enzyme functional electrode 1, as a method of immobilizing the enzyme 3, that is, ADHtype III (I / III) having PQQ as a coenzyme, to the electrode 11, there are methods shown in FIGS. 3 (a) to 3 (c), for example. 3A to 3C are cross-sectional views schematically showing a structure in which the enzyme 3 is immobilized on the surface of the electrode 11, respectively.
すなわち、図３（ａ）に示すように、酵素３は、電極１１の表面に形成された電極孔１７内に固定することができる。この場合、酵素３は、電極１１の表面に物理的に吸着されても良いし、電極１１の表面上にゲル状物質で固定されても良いし、電極１１の表面を被膜する高分子の中に物理的に固定されても良いし、電極１１の表面上のポテンシャル場にしたがって物理的に吸着されても良い。 That is, as shown in FIG. 3A, the enzyme 3 can be fixed in the electrode hole 17 formed on the surface of the electrode 11. In this case, the enzyme 3 may be physically adsorbed on the surface of the electrode 11, may be fixed with a gel-like substance on the surface of the electrode 11, or may be a polymer that coats the surface of the electrode 11. The electrode 11 may be physically fixed, or may be physically adsorbed according to the potential field on the surface of the electrode 11.
また、図３（ｂ）に示すように、酵素３は、パウダー状に加工された電極材（例えばカーボンペースト）１１ａの中に混合されていても良い。ここで、パウダー状に加工された電極材１１ａにおけるパウダー粒子の大きさは特に制限されない。また、パウダー間をバインダーで固めても良いし、パウダー間にリン脂質等を含ませて酵素３の流動性を持たせても良いし、パウダー間に各種物質を入れても良い。 Moreover, as shown in FIG.3 (b), the enzyme 3 may be mixed in the electrode material (for example, carbon paste) 11a processed into the powder form. Here, the size of the powder particles in the electrode material 11a processed into a powder shape is not particularly limited. Further, the powder may be hardened with a binder, the phospholipid may be included between the powders to give the fluidity of the enzyme 3, and various substances may be put between the powders.
また、図３（ｃ）に示すように、酵素３を、電極１１の表面の官能基１９と架橋剤２１による化学結合を通じて固定しても良い。電極１１の表面の官能基１９としては、例えば、アミノ基、チオール基、カルボニル基および水酸基等が挙げられ、官能基１９の鎖長は短いほど好ましい。また、架橋剤２１としては、例えば、水溶性カルボニルイミド、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコール・ジグリシジル・エステル、ジメチルピメミリデイトおよびジメチルスベリミデイト等が挙げられる。 In addition, as shown in FIG. 3C, the enzyme 3 may be immobilized through a chemical bond between the functional group 19 on the surface of the electrode 11 and the crosslinking agent 21. Examples of the functional group 19 on the surface of the electrode 11 include an amino group, a thiol group, a carbonyl group, and a hydroxyl group. The shorter the chain length of the functional group 19, the better. Examples of the cross-linking agent 21 include water-soluble carbonylimide, glutaraldehyde, polyethylene glycol diglycidyl ester, dimethyl pimemidite, and dimethyl suberimidate.
なお、これら図３（ａ）〜（ｃ）に示す電極構造は、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）に電子メデイエータ（図示略）が接する構造であっても良い。電子メディエータと、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）との間は、化学的な結合を介して固定しても良い。
更に、これら図３（ａ）〜（ｃ）に示す電極構造においては、電極１１の表面がさらにイオン導電性を有するゲル状物質を主成分とする保護材２３で保護されていても良い。この保護材２３は、ゲル状物質以外に適宜の膜材等も使用することができる。こうした膜材やゲル状物質としては、例えば、陽イオンを含むナフィオン樹脂（商品名、Ｄｕ Ｐｏｎｔ社製）、光架橋性のスチルバゾリウム化ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、アガロースゲル、アルギン酸ゲルおよびアクリルアミドゲル等が挙げられる。こうした膜材やゲル状物質にイオン化物を適当な割合で混合することにより、酵素３から電極１１に電子を伝達する反応と、電極１１がプロトンを放出する反応とを両立させることが可能となるため、酵素３から電極１１への電子伝達能力をさらに高めることができる。
The electrode structures shown in FIGS. 3A to 3C may be structures in which an electronic mediator (not shown) is in contact with ADHtype III (I / III) using PQQ as a coenzyme. The electron mediator and the ADHtype III (I / III) using PQQ as a coenzyme may be fixed via a chemical bond.
Further, in the electrode structures shown in FIGS. 3A to 3C, the surface of the electrode 11 may be further protected by a protective material 23 mainly composed of a gel substance having ionic conductivity. As the protective material 23, an appropriate film material or the like can be used in addition to the gel substance. Examples of such film materials and gel-like substances include Nafion resin containing a cation (trade name, manufactured by Du Pont), photocrosslinkable stilbazolated polyvinyl alcohol, polyethylene oxide, polyvinyl alcohol, agarose gel, alginic acid gel, and acrylamide. A gel etc. are mentioned. By mixing an ionized product in an appropriate ratio with such a membrane material or gel material, it is possible to achieve both a reaction for transferring electrons from the enzyme 3 to the electrode 11 and a reaction for the electrode 11 to release protons. Therefore, the ability to transfer electrons from the enzyme 3 to the electrode 11 can be further enhanced.
図４は、酵素機能電極１を用いた３電極式の電気化学測定用セル２５の構造を模式的に示すものである。図４に示すように、電気化学測定用セル２５は、作用電極Ｗ、参照電極Ｒおよび対極Ａから構成されており、このうち作用電極Ｗとして、上述したグラッシーカーボン電極にＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が固定された酵素機能電極１を用いる。また、参照電極Ｒとして、Ａｇ／ＡｇＣｌ（銀／塩化銀）電極を用い、対極Ａとして白金電極を用いる。 FIG. 4 schematically shows the structure of a three-electrode electrochemical measurement cell 25 using the enzyme functional electrode 1. As shown in FIG. 4, the electrochemical measurement cell 25 is composed of a working electrode W, a reference electrode R, and a counter electrode A. Among them, the above-described glassy carbon electrode is used as the working electrode W, and ADH type III (I / III) Is used. Further, an Ag / AgCl (silver / silver chloride) electrode is used as the reference electrode R, and a platinum electrode is used as the counter electrode A.
このような電気化学測定用セル２５において、作用電極Ｗに電圧が加えられると、作用電極Ｗの表面にて酸化還元反応が起こり、その印加電圧が参照電極Ｒの電位の基準とされ、電位制御回路によりその電位が制御される。ここで、電気化学測定用セル２５中に基質として、例えば、一定濃度のエタノールを加えると、作用電極Ｗおよび対極Ａ間にエタノールの酸化電流が流れ、電流測定回路にてその電流値が測定される。 In such an electrochemical measurement cell 25, when a voltage is applied to the working electrode W, an oxidation-reduction reaction occurs on the surface of the working electrode W, and the applied voltage is used as a reference for the potential of the reference electrode R, thereby controlling the potential. The potential is controlled by the circuit. Here, for example, when ethanol of a certain concentration is added as a substrate in the electrochemical measurement cell 25, an oxidation current of ethanol flows between the working electrode W and the counter electrode A, and the current value is measured by the current measurement circuit. The
図５は、こうした原理に基づき、酵素機能電極１を利用してセルＣｅ中の基質濃度を検知するバイオセンサの一例を模式的に示すものである。図５に示すように、このバイオセンサ２７も、図４に例示した電気化学測定用セル２５と同様に、作用電極Ｗ、参照電極Ｒおよび対極Ａを備えている。また、作用電極Ｗとしても、図４におけるセル２５と同様に、グラッシーカーボン電極にＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が固定された酵素機能電極１を用いる。ここで、セルＣｅ中に基質として、例えばエタノールを添加し、その添加量を段階的に増やしていくと、エタノール濃度の増加に伴って電流値の上昇が観察される。このように、作用電極Ｗとして、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）が固定された酵素機能電極１を用いることにより、基質濃度を測定可能なバイオセンサ２７を得ることができる。 FIG. 5 schematically shows an example of a biosensor that detects the substrate concentration in the cell Ce using the enzyme functional electrode 1 based on such a principle. As shown in FIG. 5, the biosensor 27 also includes a working electrode W, a reference electrode R, and a counter electrode A, like the electrochemical measurement cell 25 illustrated in FIG. 4. Also, as the working electrode W, the enzyme functional electrode 1 in which ADH type III (I / III) is fixed to the glassy carbon electrode is used as in the cell 25 in FIG. Here, for example, when ethanol is added as a substrate in the cell Ce and the amount added is increased stepwise, an increase in the current value is observed as the ethanol concentration increases. Thus, by using the enzyme functional electrode 1 on which ADHtype III (I / III) is immobilized as the working electrode W, the biosensor 27 capable of measuring the substrate concentration can be obtained.
また、図６は、酵素機能電極１を利用して検知される基質を燃料として発電する燃料電池の一例を模式的に示すものである。燃料電池２９は、燃料供給タンク３１から燃料が供給される燃料拡散電極（アノード極）３３と、空気供給タンク３５から空気が供給される空気拡散電極（カソード極）３７とを有する。また、これらアノード極３３とカソード極３７との間には電解質膜３９が充填されている。そして、アノード極３３の電解質膜３９側には酵素担持面４１が形成されており、カソード極３７の電解質膜３９側には触媒担持面４３が形成されている。ここで、上記アノード極３３は、グラッシーカーボン電極の酵素担持面４１に、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）を固定したものであり、上述した酵素機能電極１と同様のものである。また、カソード極３７は白金電極であり、その触媒担持面４３には白金が固定されている。 FIG. 6 schematically shows an example of a fuel cell that generates electricity using a substrate detected by using the enzyme functional electrode 1 as a fuel. The fuel cell 29 has a fuel diffusion electrode (anode electrode) 33 to which fuel is supplied from a fuel supply tank 31 and an air diffusion electrode (cathode electrode) 37 to which air is supplied from an air supply tank 35. An electrolyte membrane 39 is filled between the anode electrode 33 and the cathode electrode 37. An enzyme carrying surface 41 is formed on the anode electrode 33 on the electrolyte membrane 39 side, and a catalyst carrying surface 43 is formed on the cathode electrode 37 on the electrolyte membrane 39 side. Here, the anode electrode 33 is obtained by fixing ADH type III (I / III) to the enzyme carrying surface 41 of the glassy carbon electrode, and is the same as the enzyme functional electrode 1 described above. The cathode electrode 37 is a platinum electrode, and platinum is fixed to the catalyst carrying surface 43 thereof.
このような燃料電池２９において、燃料として基質であるエタノールが供給されると、アノード極３３ではエタノールがＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）により酸化されることで水素が発生するとともに酸化還元反応電流が得られ、カソード極３７では供給される空気（酸素）と電解質膜４１を通じて得られる水素との反応により水が生成される。すなわち、基質を燃料とした発電が行われるようになる。なお、カソード極３７の触媒担持面４３に固定される触媒としては、白金以外にも、例えば、ジアホラーゼ酵素、プルオキシターゼ酵素、およびその他酸素の還元を実現する錯体触媒等を用いることができる。 In such a fuel cell 29, when ethanol as a substrate is supplied as fuel, ethanol is oxidized by ADH type III (I / III) at the anode electrode 33, so that hydrogen is generated and a redox reaction current is obtained. In the cathode electrode 37, water is generated by a reaction between the supplied air (oxygen) and hydrogen obtained through the electrolyte membrane 41. That is, power generation using the substrate as fuel is performed. In addition, as a catalyst fixed to the catalyst carrying surface 43 of the cathode electrode 37, for example, a diaphorase enzyme, a pull oxidase enzyme, and other complex catalysts that realize oxygen reduction can be used.
以上に説明した、この実施の形態にかかる酵素機能電極１、該酵素機能電極１を利用した電気化学測定用セル２５、バイオセンサ２７、又は燃料電池２９によれば、以下に列記するような効果が得られる。 According to the enzyme functional electrode 1 according to this embodiment, the electrochemical measurement cell 25, the biosensor 27, or the fuel cell 29 using the enzyme functional electrode 1 described above, the effects listed below: Is obtained.
（１）酵素機能電極１が備える酵素３は、グルコノバクター・サブオキシダンスが有するキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII由来であり、サブユニットIIを持たない、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）からなる。サブユニットIのヘムＣIの酸化還元電位は、サブユニットIIの酸化還元電位よりも低いので、サブユニットIIを含まない酵素３の酸化還元電位は、従来のアルコール脱水素酵素よりも低くなる。 (1) The enzyme 3 provided in the enzyme functional electrode 1 is derived from ADH type III (I / III), which is derived from alcohol dehydrogenase type III, which is a quinohem protein of Gluconobacter suboxydans, and does not have subunit II. Become. Since the redox potential of heme CI in subunit I is lower than the redox potential of subunit II, the redox potential of enzyme 3 not containing subunit II is lower than that of conventional alcohol dehydrogenase.
そのため、酵素機能電極１を備えたセンサを用いて、基質（例えばエタノール等のアルコール）の酸化により発生する酸化電流を検知する場合、酵素機能電極１について設定する酸化還元電位値を、従来のアルコール脱水素酵素電極を用いた時よりも、広い範囲内（特に低い酸化還元電位で）で設定することが可能となる。その結果、測定サンプル内に存在するビタミン類などの夾雑物由来の酸化還元ピークと重ならない酸化還元電位値を、酵素機能電極１について設定することが可能となり、より信頼性の高いセンサを実現することができる。また、酵素機能電極としての出力向上も可能である。 Therefore, when an oxidation current generated by the oxidation of a substrate (for example, alcohol such as ethanol) is detected using a sensor equipped with the enzyme functional electrode 1, the oxidation-reduction potential value set for the enzyme functional electrode 1 is changed to a conventional alcohol. It is possible to set within a wider range (especially at a lower redox potential) than when using a dehydrogenase electrode. As a result, a redox potential value that does not overlap with redox peaks derived from contaminants such as vitamins present in the measurement sample can be set for the enzyme functional electrode 1, thereby realizing a more reliable sensor. be able to. Moreover, the output as an enzyme functional electrode can be improved.
（２）電極１１の材料は、電極１１の表面の形状や構造によって制限されることがなく、例えば、導電性金属、半導体材料、及び金属酸化物から成る群から選択された１以上の材料とすることができる。このため、電極１１の材料として、例えば、電極１１への溶液の浸透が発生しにくく、出力低下の発生が抑制される材料を選択することができる。また、特にカーボン材を電極１１として用いれば、上記ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）におけるチトクロームＣ１部とカーボン材との間の電子伝達能力に優れているため、酵素３から電極１１への電子伝達がより円滑に実現されるようになる。 (2) The material of the electrode 11 is not limited by the shape or structure of the surface of the electrode 11, for example, one or more materials selected from the group consisting of conductive metals, semiconductor materials, and metal oxides can do. For this reason, as the material of the electrode 11, for example, it is possible to select a material that hardly causes the solution to penetrate into the electrode 11 and suppresses the decrease in output. In particular, when a carbon material is used as the electrode 11, the electron transfer from the enzyme 3 to the electrode 11 is more excellent because the electron transfer capability between the cytochrome C1 part in the ADHtype III (I / III) and the carbon material is excellent. It will be realized smoothly.
（３）電極１１の表面は、疎水性であるか、あるいは疎水性の官能基で修飾されているものとすることができる。この場合、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のチトクロームＣ１において外部に露出されるヘム鉄の露出部位の周辺が、疎水性アミノ酸や非電荷アミノ酸に覆われるようになる。すなわち、疎水性の電極１１の表面に対してヘム鉄がより近づきやすくなり、酵素３から電極１１への電子伝達能力がより高められる。また、チトクロームＣ１の表面に形成される疎水面と、疎水性の電極１１の表面とが近接することにより、酵素３の、電極１１の表面上でのより高い配向制御が可能となるため、酵素機能電極１のさらなる出力向上が可能となる。 (3) The surface of the electrode 11 may be hydrophobic or modified with a hydrophobic functional group. In this case, the periphery of the exposed portion of heme iron exposed to the outside in cytochrome C1 of ADHtype III (I / III) is covered with a hydrophobic amino acid or an uncharged amino acid. That is, heme iron is more likely to approach the surface of the hydrophobic electrode 11, and the ability to transfer electrons from the enzyme 3 to the electrode 11 is further enhanced. In addition, since the hydrophobic surface formed on the surface of cytochrome C1 and the surface of the hydrophobic electrode 11 are close to each other, the higher orientation control of the enzyme 3 on the surface of the electrode 11 becomes possible. The output of the functional electrode 1 can be further improved.
（４）酵素３である、ＰＱＱを補酵素とするＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）は、イオン導電性を有する膜、あるいはゲル状物質からなる保護材２３により保護することができる。これにより、酵素３から電極１１に電子を伝達する反応と、酵素３からプロトンが放出される反応とが両立されるようになり、ひいては、電子伝達能力がさらに高まる。 (4) ADHtype III (I / III), which is enzyme 3 and uses PQQ as a coenzyme, can be protected by a protective material 23 made of a film having ion conductivity or a gel substance. As a result, the reaction of transferring electrons from the enzyme 3 to the electrode 11 and the reaction of releasing protons from the enzyme 3 are compatible, and the electron transfer capability is further enhanced.
（５）酵素機能電極１を通じて基質９の濃度を測定する電気化学測定用セル２５、バイオセンサ２７を構成すれば、酵素機能電極１に用いられる酵素３により酸化される基質９の濃度を的確に測定することができる。すなわち、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）のチトクロームＣ１の酸化還元電位よりも正側の電位を電極１１に与えることにより、酵素３により基質９から電子が伝達されるときに、基質９の濃度に対応する電流値が検知される。 (5) If the electrochemical measurement cell 25 for measuring the concentration of the substrate 9 through the enzyme functional electrode 1 and the biosensor 27 are configured, the concentration of the substrate 9 oxidized by the enzyme 3 used in the enzyme functional electrode 1 is accurately determined. Can be measured. That is, by applying a positive potential to the electrode 11 with respect to the redox potential of cytochrome C1 of ADHtype III (I / III), it corresponds to the concentration of the substrate 9 when electrons are transferred from the substrate 9 by the enzyme 3. Current value is detected.
（６）酵素機能電極１からなるアノード極３３と、酵素３に電子を伝達することのできる触媒および酵素のいずれかを保持するカソード極３７とを備え、アノード極３３とカソード極３７とを電気的に結合するとともに、それら各電極間をイオン導電性を有する物質で隔てる燃料電池２９を構成することもできる。これにより、酵素機能電極１に用いられる酵素３により酸化される基質９を燃料として発電する燃料電池２９であって、より発電能力の高い電池２９を安定して実現することができる。特に、ＡＤＨｔｙｐｅIIIに存在するサブユニットIIを除くことで、酵素３内で生じる電位降下を防ぐことが可能となり、より高い電位を確保できるバイオ電池２９を実現することができる。 (6) An anode 33 composed of the enzyme functional electrode 1 and a cathode 37 holding either a catalyst capable of transferring electrons to the enzyme 3 or an enzyme are provided. The anode 33 and the cathode 37 are electrically connected. In addition, the fuel cell 29 can be configured such that the electrodes are separated from each other by a material having ionic conductivity. As a result, the fuel cell 29 that generates electricity using the substrate 9 oxidized by the enzyme 3 used for the enzyme functional electrode 1 as fuel, and has a higher power generation capability, can be realized stably. In particular, by removing the subunit II present in ADHtype III, it is possible to prevent a potential drop that occurs in the enzyme 3, and it is possible to realize a biobattery 29 that can ensure a higher potential.
次に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。 Next, based on an Example, this invention is demonstrated in detail.
ａ）ＡＤＨtypeIII(Complex)の調製
糖分を多めにした培地で増殖させた、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓを遠心処理（９、０００Ｇ×１０ｍｉｎ）で回収し、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で２回洗浄した。洗浄菌体の湿重１ｇを５ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で懸濁させ、フレンチプレス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）を用い、１６、０００ｐｓｉの条件下で菌を破壊した。引き続き、遠心処理（９、０００Ｇ×１０ｍｉｎ）により、菌破砕残渣を取り除いた。
a) Preparation of ADHtypeIII (Complex) Gluconobacter subunits grown in a medium with a high sugar content were collected by centrifugation (9,000 G × 10 min) and twice with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0). Washed. 1 g of wet weight of the washed cells was suspended in 5 mL of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), and the cells were destroyed using a French press (American Instrument Co.) under the condition of 16,000 psi. Subsequently, the crushing residue was removed by centrifugation (9,000 G × 10 min).
上清を回収し、超遠心分離処理（８、６００Ｇ×９０ｍｉｎ）により膜画分を沈殿させた。膜画分を、蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍＬになるように、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で懸濁させ、終濃度が１．０％（ｗ／ｖ）になるように、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えた。４℃で６０ｍｉｎ間インキュベートした後、超遠心処理（８、６００Ｇ×９０ｍｉｎ）で可溶化したＡＤＨを上清にて回収し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を外液として透析処理をおこなった。 The supernatant was collected, and the membrane fraction was precipitated by ultracentrifugation (8, 600 G × 90 min). The membrane fraction was suspended in 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) so that the protein concentration was 20 mg / mL, and the final concentration was 1.0% (w / v). Triton X-100 was added. After incubation at 4 ° C. for 60 min, ADH solubilized by ultracentrifugation (8, 600 G × 90 min) is recovered in the supernatant, and 5 mM potassium phosphate buffer containing 0.1% Triton X-100 Dialysis was performed using (pH 6.0) as an external solution.
０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに透析済みの蛋白液をアプライし、カラムに対して各々５倍容量である、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の濃度勾配（５−５０ｍＭ）により、ＡＤＨを溶出させた。２０−３０ｍＭのフラクション領域にＡＤＨ活性のある画分は溶出され、その画分を回収した後、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で透析し、ＡＤＨtypeIIIを含む蛋白溶液を得た。このＡＤＨtypeIIIは、サブユニットI、サブユニットII、及びサブユニットIIIを全て備えたもの（以下、「ＡＤＨtypeIII(Complex)」とする）である。 The dialyzed protein solution was applied to a DEAE-Toyopearl column equilibrated with 5 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.1% Triton X-100. ADH was eluted with a concentration gradient (5-50 mM) of a potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.1% Triton X-100. A fraction having ADH activity is eluted in the 20-30 mM fraction region, and the fraction is collected, dialyzed with 5 mM acetate buffer (pH 5.0) containing 0.1% Triton X-100, and ADH type III. A protein solution containing was obtained. The ADH type III includes all of the subunit I, the subunit II, and the subunit III (hereinafter referred to as “ADH type III (Complex)”).
ｂ）ＡＤＨtypeIII（I/III）の調製
前記ａ）で得られた透析後の蛋白溶液を、同じ緩衝液で平衡化した、ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムにアプライした。０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５ｍＭの酢酸緩衝液で洗浄した後、更にカラムに対して５倍容量の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄した。その際、ＡＤＨのサブユニットIIが溶出した。カラムに吸着したＡＤＨは、カラムに対して各々５倍容量である、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の濃度勾配（４０−１００ｍＭ）により溶出させた。
b) Preparation of ADH type III (I / III) The protein solution after dialysis obtained in a) was applied to a CM-Toyopearl column equilibrated with the same buffer. After washing with 5 mM acetate buffer containing 0.1% Triton X-100, the column was further washed with 40 mM acetate buffer (pH 5.0) containing 5-fold volume 0.1% Triton X-100. . At that time, ADH subunit II was eluted. ADH adsorbed on the column was eluted with a concentration gradient (40-100 mM) of acetate buffer (pH 5.0) containing 0.1% Triton X-100, each having a volume of 5 times the column.
その結果、７０ｍＭ付近に、ＡＤＨtypeIII(Complex)が溶出された。引き続き、カラムに対して各々５倍容量である、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の濃度勾配（１００−２００ｍＭ）により溶出させた。さらに、カラムに対して５倍容量である、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）により、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I／III）画分を溶出させた。 As a result, ADH type III (Complex) was eluted at around 70 mM. Subsequently, the column was eluted with a concentration gradient (100-200 mM) of acetate buffer (pH 5.0) containing 0.1% Triton X-100, each having a volume of 5 times the column. Furthermore, the ADHtype III (I / III) fraction was eluted with 200 mM acetate buffer (pH 5.0) containing 0.1% Triton X-100, which is 5 times the volume of the column.
このようにして得られた３．３５ｍｇ／ｍＬ濃度のＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液４００μLを、透析遠心チューブ（ＭＷＣＯ:５０、０００）で５０μLに濃縮し、４００μLの５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を加えて攪拌後、再度、透析遠心チューブで５０μLに濃縮した。この透析遠心処理を合計３回行った。 400 μL of the 3.35 mg / mL concentration of ADHtype III (I / III) solution thus obtained was concentrated to 50 μL with a dialysis centrifuge tube (MWCO: 50,000), and 400 μL of 5 mM sodium phosphate buffer (pH 6). 0.0) was added and stirred, and the mixture was again concentrated to 50 μL with a dialysis centrifuge tube. This dialysis centrifugation treatment was performed three times in total.
このようにして得られたＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）を含む溶液を、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌカラム（１ｍＬ容積）にアプライした。２５ｍＬの５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）でカラムを洗浄した後、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）でＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）を溶出させた。ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液は、遠心透析チューブで１５０μLに濃縮した後に回収した。この操作により、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）に吸着していた界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を取り除くことができた。 The solution containing ADHtype III (I / III) thus obtained was applied to a Toyopearl column (1 mL volume) equilibrated with 5 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0). After washing the column with 25 mL of 5 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0), ADHtype III (I / III) was eluted with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0). The ADHtype III (I / III) solution was collected after concentration to 150 μL with a centrifugal dialysis tube. By this operation, the surfactant Triton X-100 adsorbed on ADH type III (I / III) could be removed.
ｃ）酵素機能電極１の製造
酵素機能電極１は、図７（ａ）、（ｂ）に示すように、φ３ｍｍである棒状のＧＣ電極１１と、その先端付近において、ＧＣ電極１１の外周を覆うように取り付けられた筒状のゴムパッキン４５と、ＧＣ電極１１及びゴムパッキン４５の間を満たす樹脂４７とを備えている。ゴムパッキン４５の端部４５ａは、ＧＣ電極１１の上面１１ａよりも上方（図７における上方向）に張り出しており、ＧＣ電極１１の上方には、周囲をゴムパッキン４５で囲まれた液保持部４９が形成されている。
c) Manufacture of enzyme functional electrode 1 As shown in FIGS. 7A and 7B, the enzyme functional electrode 1 covers a rod-shaped GC electrode 11 having a diameter of 3 mm and the outer periphery of the GC electrode 11 in the vicinity of the tip thereof. A cylindrical rubber packing 45 attached in this manner, and a resin 47 filling between the GC electrode 11 and the rubber packing 45 are provided. An end portion 45 a of the rubber packing 45 projects upward (upward in FIG. 7) from the upper surface 11 a of the GC electrode 11, and a liquid holding portion surrounded by the rubber packing 45 is disposed above the GC electrode 11. 49 is formed.
この液保持部４９に、前記ｂ）で得られたＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液４μLを滴下し、さらに、１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１５μL加え、その後、市販の透析膜（ＭＷＣＯ:２５、０００）５１で液保持部４９の上方を覆い、酵素機能電極１を完成した。 4 μL of the ADH type III (I / III) solution obtained in b) above is dropped into this liquid holding unit 49, and 15 μL of 0.1 M acetate buffer (pH 5.0) containing 10 mM CaCl 2 is further added. A commercially available dialysis membrane (MWCO: 25,000) 51 was used to cover the upper part of the liquid holding part 49 to complete the enzyme functional electrode 1.
ｄ）ＣＶ測定
前記ｃ）で製造した酵素機能電極１を、１５ｍＬの１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む、０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に浸し、対極に白金を用い、参照極に銀・塩化銀電極を用いて、−０．２Ｖから＋０．２Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で、２０ｍＶ／ｓの掃引速度でＣＶ測定を実施した。その結果を図８に示す。図８から明らかなとおり、０Ｖ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ前後に、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）の酸化還元ピークが観察された。
d) CV measurement The enzyme functional electrode 1 produced in c) is immersed in 0.1 M acetate buffer (pH 5.0) containing 15 mL of 10 mM CaCl 2 , platinum is used for the counter electrode, and silver / silver is used for the reference electrode. CV measurement was performed at a sweep rate of 20 mV / s in the range of -0.2 V to +0.2 V (vs Ag / AgCl) using a silver chloride electrode. The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 8, a redox peak of ADHtype III (I / III) was observed around 0 V vs Ag / AgCl.
ａ）電子メディエータを備えた酵素機能電極１の製造
０．１Ｍ ＬｉＣｌと１ｍＭ エチレンジアミンを含むエタノール溶液中に、φ3ｍｍのＧＣ電極を浸し、０〜１４００ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の間で、１０ｍＶ／ｓの掃引速度でサイクリック・ボルタメトリー（ＣＶ）した。この処理により、電極表面にＮＨ2基が付加された。
a) Production of enzyme functional electrode 1 equipped with electron mediator A φ3 mm GC electrode was immersed in an ethanol solution containing 0.1 M LiCl and 1 mM ethylenediamine, and 10 mV / s between 0 and 1400 mV (vs Ag / AgCl). Cyclic voltammetry (CV) at a sweep rate of. By this treatment, NH 2 groups were added to the electrode surface.
このエチレンジアミン処理したＧＣ電極を用いて、基本的には前記実施例１のｃ）と同様の構造を有する酵素機能電極１を製造した。ただし、液保持部４９に入れる液は、１５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＶＩ-Ｏｓ錯体（酸化還元電位：＋１００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）１μL、前記実施例１のｂ）にて調製したＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）４μL、及び０．１２５％のグルタルアルデヒド溶液１μLとした。そして、この液を加えた後、３０℃で２ｈｒ固定するようにした。なお、ＰＶＩ-Ｏｓ錯体は電子メディエータとして機能し、グルタルアルデヒドは架橋剤として機能する。 Using this ethylenediamine-treated GC electrode, an enzyme functional electrode 1 having basically the same structure as c) of Example 1 was produced. However, the liquid put in the liquid holding part 49 is 15 mg / mL concentration of PVI-Os complex (redox potential: +100 mV vs Ag / AgCl) 1 μL, ADHtype III (I / III) prepared in Example 1 b). 4 μL, and 1 μL of a 0.125% glutaraldehyde solution were prepared. And after adding this liquid, it was made to fix for 2 hours at 30 degreeC. Note that the PVI-Os complex functions as an electron mediator, and glutaraldehyde functions as a crosslinking agent.
ｂ）ＣＶ測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極１を、１５ｍＬの１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に浸し、対極に白金を用い、参照極に銀・塩化銀電極を用いて、−０．２Ｖから＋０．３Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で、２０ｍＶ／ｓの掃引速度でＣＶ測定を実施した。その結果を図９に示す。Ｏｓ錯体由来の酸化還元ピークが５０ｍＶ、及び１５０ｍＶ付近に観察された。
b) CV measurement The enzyme functional electrode 1 produced in the above a) is immersed in 15 mL of 0.1 M acetate buffer (pH 5.0) containing 10 mM CaCl 2 , platinum is used for the counter electrode, and silver / chloride is used for the reference electrode. CV measurement was performed at a sweep rate of 20 mV / s in the range of −0.2 V to +0.3 V (vs Ag / AgCl) using a silver electrode. The result is shown in FIG. Oxide-derived redox peaks were observed around 50 mV and 150 mV.
引き続き、終濃度０．１％になるようにエタノールを加え、上記と同様の条件でＣＶ測定を実施した。その結果も図９に示す。エタノールを加える前のＣＶ波形と異なり、エタノールの酸化電流が観測された。 Subsequently, ethanol was added to a final concentration of 0.1%, and CV measurement was performed under the same conditions as described above. The result is also shown in FIG. Unlike the CV waveform before adding ethanol, an oxidation current of ethanol was observed.
ｃ）定電位測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極１を、１５ｍＬの１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に浸し、対極に白金を用い、参照極に銀・塩化銀電極を用いて、４００ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の定電位測定を実施した。エタノールを添加しない緩衝液中で電流値が安定した後、終濃度０．１％になるようにエタノールを加えた。その結果、図１０に示すように、電流が観測された。
c) Constant potential measurement The enzyme functional electrode 1 produced in the above a) is immersed in 15 mL of 0.1 M acetate buffer (pH 5.0) containing 10 mM CaCl 2 , platinum is used as the counter electrode, and silver / silver is used as the reference electrode. A constant potential measurement of 400 mV (vs Ag / AgCl) was carried out using a silver chloride electrode. After the current value was stabilized in a buffer solution to which ethanol was not added, ethanol was added to a final concentration of 0.1%. As a result, current was observed as shown in FIG.
ａ）酵素機能電極の製造
０．１Ｍ ＬｉＣｌと、１ｍＭ エチレンジアミンとを含むエタノール溶液中にφ3ｍｍのＧＣ電極を浸し、０〜１４００ｍＶ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の間で１０ｍＶ／ｓの掃引速度でサイクリック・ボルタメトリー（ＣＶ）した。この処理により、電極表面にＮＨ2基が付加された。
a) Production of enzyme functional electrode A 3 mm GC electrode is immersed in an ethanol solution containing 0.1 M LiCl and 1 mM ethylenediamine, and cyclic at a sweep rate of 10 mV / s between 0 and 1400 mV (vs Ag / AgCl). -Voltammetry (CV). By this treatment, NH 2 groups were added to the electrode surface.
このエチレンジアミン処理したＧＣ電極を用いて、基本的には前記実施例１のｃ）と同様の構造を有する酵素機能電極１を製造した。ただし、液保持部４９に入れる液は、１５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＶＩ-Ｏｓ錯体（酸化還元電位：−１００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）１μL、前記実施例１のｂ）にて調製したＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）４μL、及び０．１２５％のグルタルアルデヒド用溶液１μLとした。そして、この液を加えた後、３０℃で２ｈｒ固定するようにした。 Using this ethylenediamine-treated GC electrode, an enzyme functional electrode 1 having basically the same structure as c) of Example 1 was produced. However, the liquid put into the liquid holding part 49 is ADH type III (I / III) prepared in 1 μL of PVI-Os complex (oxidation-reduction potential: −100 mV vs Ag / AgCl) at a concentration of 15 mg / mL, b in Example 1 above. ) 4 μL, and 1 μL of 0.125% glutaraldehyde solution. And after adding this liquid, it was made to fix for 2 hours at 30 degreeC.
ｂ）ＣＶ測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極１を、１５ｍＬの１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含む０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に浸し、対極に白金を用い、参照極に銀・塩化銀電極を用いて、−０．２Ｖから＋０．３Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で、２０ｍＶ／ｓの掃引速度でＣＶ測定を実施した。引き続き、終濃度０．１％になるようにエタノールを加え、上記と同様の条件でＣＶ測定を実施した。それらの結果を合わせて図１１に示す。エタノールの添加によりＣＶ波形は変化し、酸化電流が観測された。
（比較例１）
ａ）酵素機能電極の製造
基本的には、前記実施例１のｃ）と同様であるが、液保持部４９に滴下する溶液として、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液４μLの代わりに、同量のＡＤＨtypeIII(Complex)液を用いて、酵素機能電極を製造した。ここで用いたＡＤＨtypeIII(Complex)液は、前記実施例１のａ）で回収したＡＤＨtypeIII(complex)を濃縮し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したものである。
ｂ）測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極を用い、前記実施例１のｃ）と同様の方法でＣＶ測定を実施した。その結果を図１２に示す。図１２から明らかなとおり、酸化還元ピークは全く見られなかった。
（比較例２）
ａ）電極の製造
基本的には、前記実施例２のａ）と同様であるが、液保持部４９に滴下する溶液として、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I/III）液４μLの代わりに、同量のＡＤＨtypeIII(Complex)液を用いて電極を製造した。ここで用いたＡＤＨtypeIII(Complex)液は、前記実施例１のａ）で回収したＡＤＨtypeIII(Complex)を濃縮し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したものである。
ｂ）ＣＶ測定
前記ａ）で製造した酵素機能電極を用い、前記実施例２のｂ）と同様の方法でＣＶ測定を実施した。その結果を図１３に示す。図１３から明らかなとおり、エタノールを添加する前と後とで、ＣＶ波形は変化しなかった。
b) CV measurement The enzyme functional electrode 1 produced in the above a) is immersed in 15 mL of 0.1 M acetate buffer (pH 5.0) containing 10 mM CaCl 2 , platinum is used for the counter electrode, and silver / chloride is used for the reference electrode. CV measurement was performed at a sweep rate of 20 mV / s in the range of −0.2 V to +0.3 V (vs Ag / AgCl) using a silver electrode. Subsequently, ethanol was added to a final concentration of 0.1%, and CV measurement was performed under the same conditions as described above. The results are shown in FIG. The CV waveform changed with the addition of ethanol, and an oxidation current was observed.
(Comparative Example 1)
a) Manufacture of enzyme functional electrode Basically, it is the same as c) of Example 1 except that the same amount of solution is added to the liquid holding unit 49 instead of 4 μL of ADHtype III (I / III) liquid. An enzyme functional electrode was produced using ADH type III (Complex) solution. The ADH type III (Complex) solution used here is a 100 mM acetate buffer solution (pH 5.0) containing 0.1% Triton X-100 after concentrating the ADH type III (complex) recovered in a) of Example 1 above. It is dissolved in
b) Measurement Using the enzyme functional electrode prepared in a), CV measurement was performed in the same manner as in c) of Example 1. The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 12, no redox peak was observed.
(Comparative Example 2)
a) Manufacture of electrode Basically, the same as in a) of Example 2 except that the same amount of ADH type III (instead of 4 μL of ADH type III (I / III) solution) was dropped into the liquid holding unit 49. Complex) solution was used to manufacture the electrode. The ADH type III (Complex) solution used here is a 100 mM acetate buffer (pH 5.0) containing ADH type III (Complex) recovered in a) of Example 1 and containing 0.1% Triton X-100. It is dissolved in
b) CV measurement Using the enzyme functional electrode produced in a), CV measurement was carried out in the same manner as in b) of Example 2. The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 13, the CV waveform did not change before and after the addition of ethanol.
なお、本発明は、上記実施の形態として示した構成に限らず、これらを適宜変更した、以下の態様にて実施することもできる。
例えば、上記各実施例では、酵素３を、グルコノバクター・サブオキシダンス由来のアルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIII（I／III）とした。しかしながら、サブユニットI、II、及びIIIからなるヘテロ３量体の膜蛋白質である、ＡＤＨｔｙｐｅIIIを持つ菌株は他にも存在しており、それらの菌由来のＡＤＨｔｙｐｅIIIでも、サブユニットIIを除いた構造のものであれば、問題なく使うことができる。
Note that the present invention is not limited to the configuration shown as the above embodiment, and can be implemented in the following modes, which are appropriately changed.
For example, in each of the above Examples, the enzyme 3 was an alcohol dehydrogenase type III (I / III) derived from Gluconobacter suboxydans. However, there are other strains having ADH type III, which is a heterotrimeric membrane protein consisting of subunits I, II, and III. ADH type III derived from these strains also excludes subunit II. Can be used without problems.
また、グルコンアセトバクター・ユーロパエオス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）やグルコンアセトバクター・キシリナンス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ）など、サブユニットIIIが存在しないＡＤＨｔｙｐｅIIIもある。このような種類のＡＤＨについては、サブユニットIのみからなる、ＡＤＨｔｙｐｅIII（I）を用いることができる。いずれの場合においても、サブユニットIに存在する低電位のヘムＣから電極に電子を伝達できる構造であれば、特に制限するものではない。 There are also ADHtype III in which subunit III does not exist, such as Gluconacetobacter europaeus and Gluconacetobacter xylinus. For this type of ADH, ADHtype III (I) consisting only of subunit I can be used. In any case, the structure is not particularly limited as long as electrons can be transferred from the low-potential hem C present in the subunit I to the electrode.
１・・・酵素機能電極 ３・・・酵素 ５・・・サブユニットI
７・・・サブユニットIII ９・・・基質 １１・・・電極
１３・・・酸化物 １５・・・電子メディエータ １７・・・電極孔
１９・・・官能基 ２１・・・架橋剤 ２３・・・保護材
２５・・・電気化学測定用セル ２７・・・バイオセンサ ２９・・・燃料電池
３１・・・燃料供給タンク ３３・・・アノード極 ３５・・・空気供給タンク
３７・・・カソード極 ３９・・・電解質膜 ４１・・・酵素担持面
４３・・・触媒担持面 ４５・・・ゴムパッキン ４７・・・樹脂
４９・・・液保持部 ５１・・・透析膜 Ｒ・・・参照電極
Ｗ・・・作用電極 Ａ・・・対極
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Enzyme functional electrode 3 ... Enzyme 5 ... Subunit I
7 ... subunit III 9 ... substrate 11 ... electrode 13 ... oxide 15 ... electron mediator 17 ... electrode hole 19 ... functional group 21 ... cross-linking agent 23 ... -Protective material 25 ... Electrochemical measurement cell 27 ... Biosensor 29 ... Fuel cell 31 ... Fuel supply tank 33 ... Anode electrode 35 ... Air supply tank 37 ... Cathode electrode DESCRIPTION OF SYMBOLS 39 ... Electrolyte membrane 41 ... Enzyme carrying surface 43 ... Catalyst carrying surface 45 ... Rubber packing 47 ... Resin 49 ... Liquid holding part 51 ... Dialysis membrane R ... Reference electrode W ... Working electrode A ... Counter electrode
Claims (7)
特定の基質を酸化する酵素と、を備え、
前記基質から前記酵素を介して前記電極に電子が伝達される酵素機能電極において、
前記酵素は、ＰＱＱを補酵素とする膜結合型アルコール脱水素酵素ｔｙｐｅIIIであり、且つ、チトクロームＣを含むサブユニットIIを含まず、サブユニットIおよびサブユニットIIIから構成されることを特徴とする酵素機能電極。 Electrodes,
An enzyme that oxidizes a specific substrate,
In an enzyme functional electrode in which electrons are transferred from the substrate to the electrode via the enzyme,
The enzyme is a membrane-bound alcohol dehydrogenase type III using PQQ as a coenzyme, and does not include subunit II containing cytochrome C, and is composed of subunit I and subunit III. Enzyme functional electrode.
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|---|---|---|---|---|
| WO2010061822A1 (en) * | 2008-11-25 | 2010-06-03 | ソニー株式会社 | Method for immobilizing enzyme on electrode for fuel cell, fuel cell, method for manufacturing fuel cell, electrode for fuel cell, and method for manufacturing electrode for fuel cell |
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2007
- 2007-03-27 JP JP2007081714A patent/JP2008237099A/en active Pending
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