JP2008231045A - Anti-triose phosphate isomerase antibody, reagent with reduced content of triose phosphate isomerase, enzyme immunoassay using the same and enzyme immunoassay kit - Google Patents

Anti-triose phosphate isomerase antibody, reagent with reduced content of triose phosphate isomerase, enzyme immunoassay using the same and enzyme immunoassay kit Download PDF

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悦朗 伊藤
Masakane Yamashita
正兼 山下
Toshiaki Miura
敏明 三浦
Satoshi Watabe
聡 渡部
Keizo Ito
敬三 伊藤
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SAPPORO BIO KOBO KK
TOKUSHIMA BUNRI UNIV
Hokkaido University NUC
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Hokkaido University NUC
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a means to reduce the influence of triose phosphate isomerase (TIM) in the blank reaction to enable higher sensitivity quantification of dihydroxyacetone-3-phosphate of the product of TIM in the method of using TIM as a labeled enzyme in the enzyme immunoassay to increase the quantification of dihydroxyacetone-3-phosphate with the use of an enzyme cycling method. <P>SOLUTION: An anti-TIM antibody, a reagent with a reduced content of TIM, an enzyme immunoassay using the same, and an enzyme immunoassay kit are disclosed. In carrying out the enzyme cycling method using TIM as a labeled enzyme in the enzyme immunoassay, by removing the TIM mixed together in the substrate, enzyme, coenzyme and buffer which are used in the enzyme cycling reaction, the enzyme immunoassay having higher sensitivity than before is achieved. A superhigh sensitivity method of measuring a labeled protein utilizes this enzyme immunoassay. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、抗トリオースフォスフェートイソメラーゼ抗体、トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された試薬およびそれを用いた酵素抗体免疫測定方法、並びに酵素抗体免疫測定用キットに関する。特に本発明は、酵素免疫測定方法においてトリオースフォスフェートイソメラーゼを標識酵素に用いた酵素サイクリング法を行う場合、酵素サイクリング反応に使用する基質、酵素、補酵素、緩衝液に混在しているトリオースフォスフェートイソメラーゼを除去することで、従来にも増して高感度化が可能な酵素免疫測定方法およびこの酵素免疫測定方法を利用する標的タンパク質の超高感度測定法に関する。   The present invention relates to an anti-triphosphate phosphate isomerase antibody, a reagent with a reduced content of triphosphate phosphate isomerase, an enzyme antibody immunoassay method using the same, and an enzyme antibody immunoassay kit. In particular, in the enzyme immunoassay method, the triose mixed in the substrate, enzyme, coenzyme, and buffer used in the enzyme cycling reaction when performing enzyme cycling using triosephosphate isomerase as a labeling enzyme. The present invention relates to an enzyme immunoassay method capable of further increasing sensitivity by removing phosphate isomerase, and an ultrasensitive assay method for a target protein using this enzyme immunoassay method.

タンパク質の高感度測定法としてラジオイムノアッセイ法が技術的に確立されているが、検出装置の感度を上げる以外の方法では、現状(10-16moles程度)以上の高感度化は技術的に不可能である。また、特別な施設が必要であり短寿命の核種を使用すれば試薬の使用期限が極端に短くなる上、測定感度も急激に下がってしまう、長寿命の核種を使用すれば、放射性廃棄物という大きな問題を抱えることになるという放射性物質特有のジレンマをかかえており、測定法に関する研究開発も改良もほとんど行われていないのが現状である。 Radioimmunoassay has been technically established as a high-sensitivity measurement method for proteins, but it is technically impossible to increase the sensitivity beyond the current level (about 10 -16 moles) by methods other than increasing the sensitivity of the detector. It is. In addition, if special facilities are required and the short-lived nuclides are used, the expiration date of the reagent will be extremely shortened, and the measurement sensitivity will be drastically reduced.If long-lived nuclides are used, it will be called radioactive waste. It has a radioactive material-specific dilemma that it will have major problems, and there has been little research and development or improvement on measurement methods.

その他の高感度測定法として酵素免疫測定法(ELISA法)がある。酵素免疫測定法は開発当初の比色法(10-13moles)から蛍光法、発光法へと高感度化(10-15moles)が進められ、専用測定装置も開発されている。しかし、測定操作が簡便になっただけで感度的には限界がきている。(非特許文献１)
「超高感度酵素免疫測定法」（学会出版センター・１９９３年） Another highly sensitive assay is enzyme immunoassay (ELISA). Enzyme immunoassays have been developed with high sensitivity (10 -15 moles) from the original colorimetric method (10 -13 moles) to the fluorescence method and luminescence method, and dedicated measuring devices have also been developed. However, the sensitivity is limited only by the simple measurement operation. (Non-Patent Document 1)
"Ultrasensitive enzyme immunoassay" (Academic Publishing Center, 1993)

そこで、感度をより高めた酵素サイクリング法を組み合わせた酵素免疫測定法(ELISA法)が開発された。標的タンパク質を、酵素免疫測定法を用いてより高感度に測定するには、酵素免疫測定法の標識酵素によって生成する生成物を増幅することが考えられる。また、ある種の化合物を増幅する方法として、種々の酵素サイクリング法が知られていた。本発明者らも、酵素免疫測定法の標識酵素による生成物を、酵素サイクリング法により増幅して、標的タンパク質を、酵素免疫測定法を用いてより高感度に測定することができる方法を開発し、特許出願した（特願2006-010051号）。   Therefore, an enzyme immunoassay (ELISA method) that combines the enzyme cycling method with higher sensitivity was developed. In order to measure a target protein with higher sensitivity using an enzyme immunoassay, it is conceivable to amplify a product produced by a label enzyme of the enzyme immunoassay. Various enzyme cycling methods have been known as methods for amplifying certain compounds. The present inventors have also developed a method capable of amplifying the product of the enzyme-linked immunosorbent assay enzyme using the enzyme cycling method and measuring the target protein with higher sensitivity using the enzyme immunoassay method. And applied for a patent (Japanese Patent Application No. 2006-010051).

特許出願した方法は、酵素免疫測定法の標識酵素として、トリオースフォスフートイソメラーゼ(TIM)を選択し、TIMの生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトの定量の感度を、酵素サイクリング法を用いて高めた方法である。酵素サイクリング法として、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ(GPO)、およびラクテートヒドロゲナーゼ(LDH)を用いてジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトから過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を定量することを含む方法を用いた。TIMは、ターンオバー数が極めて高く標識酵素として最適であり、その基質であるグリセルアルデヒド 3-リン酸から生成するジヒドロキシアセトン 3-リン酸（DAP）を上記酵素サイクリング法で増幅定量することができる。   The patent-pending method selects triose phosphate isomerase (TIM) as the labeling enzyme for enzyme immunoassay, and determines the sensitivity of quantification of dihydroxyacetone-3-phosphate, the product of TIM, using enzyme cycling. This is an enhanced method. As an enzyme cycling method, hydrogen peroxide is generated from dihydroxyacetone-3-phosphate using glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), glycerol-3-phosphate oxidase (GPO), and lactate hydrogenase (LDH). A method comprising quantifying the hydrogen peroxide produced was used. TIM has an extremely high turnover number and is optimal as a labeling enzyme. Dihydroxyacetone 3-phosphate (DAP) generated from its substrate, glyceraldehyde 3-phosphate, can be amplified and quantified by the above enzyme cycling method. .

ところが、上記酵素サイクリング法を組み合わせても、TIMの生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトの定量の感度は、予想するほど上がらなかった。その原因をさらに追求したところ、酵素サイクリング法に用いる酵素、基質、試薬、緩衝液等の反応用の資材に混在するTIMがブランク反応を起こし、その結果、酵素サイクリングとの組合せにより検出シグナルが増幅されても同時にブランク反応も増幅されるためS/N比が改善されることは無く、結果的にタンパク質を超高感度に測定することはできないことが判明した。   However, even when the above enzyme cycling method was combined, the sensitivity of quantification of dihydroxyacetone-3-phosphate, which is a product of TIM, did not increase as expected. When the cause was further pursued, TIM mixed in the reaction materials such as enzymes, substrates, reagents, and buffers used in the enzyme cycling method caused a blank reaction, and as a result, the detection signal was amplified in combination with enzyme cycling. However, since the blank reaction is also amplified at the same time, the S / N ratio is not improved, and as a result, it has been found that the protein cannot be measured with extremely high sensitivity.

そこで、本発明の目的は、酵素免疫測定法の標識酵素としてトリオースフォスフートイソメラーゼ(TIM)を用い、TIMの生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトの定量の感度を、酵素サイクリング法を用いて高めた方法において、ブランク反応におけるTIMの影響を低減して、より高感度にジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトの定量が行える手段を提供することにある。   Therefore, an object of the present invention is to use triose phosphate isomerase (TIM) as a labeling enzyme in an enzyme immunoassay, and to determine the sensitivity of quantification of dihydroxyacetone-3-phosphate, which is a product of TIM, using an enzyme cycling method. An object of the present invention is to provide a means for quantifying dihydroxyacetone-3-phosphate with higher sensitivity by reducing the influence of TIM in the blank reaction in the method enhanced by using the method.

具体的には、ブランク反応におけるTIMの影響は、反応用の資材に含まれるTIMが原因であることから、反応用の資材に含まれるTIMを除去することができる手段を提供することが本発明の目的の１つである。そこで、反応用の資材に含まれるTIMを除去してタンパク質の超高感度測定を行うことをさらに検討した。その結果、酵素以外の反応用の資材である基質、試薬、緩衝液中に存在するTIMは加熱処理、ゲルろ過等により容易に取り除くことが出来た。しかし、酵素の安定性を損なわずに酵素中のTIM活性を除去することは、加熱処理、ゲルろ過等の処理では非常に困難であった。そこで、本発明のもう一つの目的は、酵素の安定性を損なわずに酵素中のTIM活性を除去することができる手段を提供することにある。   Specifically, since the TIM in the blank reaction is caused by the TIM contained in the reaction material, the present invention provides a means for removing the TIM contained in the reaction material. Is one of the purposes. Therefore, we further investigated the ultrasensitive measurement of protein by removing TIM contained in the reaction material. As a result, TIM present in the substrate, reagent, and buffer solution, which are materials for reactions other than enzymes, could be easily removed by heat treatment, gel filtration, and the like. However, it has been very difficult to remove the TIM activity in the enzyme without impairing the stability of the enzyme by a treatment such as heat treatment or gel filtration. Therefore, another object of the present invention is to provide means capable of removing TIM activity in an enzyme without impairing the stability of the enzyme.

そこで、本発明者らが種々検討した結果、TIMに特異的なモノクローナル抗体を用いることで、酵素の安定性を損なわずに酵素中のTIM活性を除去することができ、このモノクローナル抗体を用いることで得られた酵素を用いること、さらには、TIMを除去した酵素以外の反応用の資材を適宜用いることで、ブランク反応におけるTIMの影響を低減して、酵素免疫測定法の標識酵素としてトリオースフォスフートイソメラーゼ(TIM)を用い、TIMの生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトの定量を、より高感度に行えることを見いだして、本発明を完成させた。   Thus, as a result of various studies by the present inventors, by using a monoclonal antibody specific for TIM, TIM activity in the enzyme can be removed without impairing the stability of the enzyme. In addition, the use of the enzyme obtained in step 1 and the use of reaction materials other than the enzyme from which TIM has been removed as appropriate reduces the influence of TIM in the blank reaction, and triose as a labeling enzyme for enzyme immunoassay. The present invention was completed by finding that the quantification of dihydroxyacetone-3-phosphate, which is a product of TIM, can be performed with higher sensitivity using phosphate isomerase (TIM).

上記課題を解決するための発明は以下のとおりである。
［１］トリオースフォスフェートイソメラーゼまたはトリオースフォスフェートイソメラーゼの断片に特異的に結合する抗体。
［２］トリオースフォスフェートイソメラーゼが、哺乳類、両生類、細菌および酵母から成る群から選ばれる少なくとも1種の生物に由来する酵素である［１］に記載の抗体。
［３］トリオースフォスフェートイソメラーゼが大腸菌由来の酵素である［１］に記載の抗体。
［４］ＩｇＧである［１］〜［３］のいずれかに記載の抗体。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の抗体と担体とからなり、前記抗体が前記担体に固定化されている、抗体固定化担体。
［６］［１］〜［４］のいずれかに記載の抗体、および／または請求項５に記載の抗体固定化担体とトリオースフォスフェートイソメラーゼ含有原料とを接触させ、前記原料に含まれるトリオースフォスフェートイソメラーゼと前記抗体とを結合させる工程、
抗体と結合しなかった前記原料に含まれる成分を前記抗体および／または抗体固定化担体と分離する工程、並びに
前記抗体と結合した成分を抗体から脱離して、トリオースフォスフェートイソメラーゼを含む画分を回収する工程
とを含む、原料より純度の高いトリオースフォスフェートイソメラーゼを含む画分の調製方法。
［７］［１］〜［４］のいずれかに記載の抗体、および／または［５］に記載の抗体固定化担体とトリオースフォスフェートイソメラーゼと目的物質とを含有する原料とを接触させ、前記原料に含まれるトリオースフォスフェートイソメラーゼと前記抗体とを結合させる工程、並びに
抗体と結合しなかった前記目的物質を含む成分を前記抗体および／または抗体固定化担体と分離する工程、
とを含む、原料よりトリオースフォスフェートイソメラーゼ濃度を低減した、目的物質を含む画分の製造方法。
［８］トリオースフォスフェートイソメラーゼと目的物質とを含有する原料に含まれる目的物質が、グリセルアルデヒド-3-リン酸、ラクテート、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、NAD及び／又はNADH、並びにトリエタノールアミンから成る群から選ばれる少なくとも1種の物質である［７］に記載の製造方法。
［９］トリオースフォスフェートイソメラーゼと目的物質とを含有する原料が、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬、ラクテート含有試薬、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、ペルオキシダーゼ含有試薬、NAD及び／又はNADH含有試薬、並びにトリエタノールアミン含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬である［７］に記載の製造方法。
［１０］前記抗体と結合した成分を抗体から脱離して、トリオースフォスフェートイソメラーゼを含む画分を回収する工程をさらに含む、［７］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が1単位に対して5×10-11単位以下に低減されたグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、及びペルオキシダーゼ含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬。
［１２］グリセルアルデヒド-3-リン酸を基質として用い、かつトリオースフォスフェートイソメラーゼを標識酵素として用いた酵素抗体免疫測定方法であって、前記グリセルアルデヒド-3-リン酸は、トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減されたグリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬として供給される前記方法。
［１３］前記酵素抗体免疫反応の生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトを酵素サイクリング法により増感して定量する系をさらに含む、［１２］に記載の方法。
［１４］前記酵素サイクリング法が、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ(GPO)、およびラクテートヒドロゲナーゼ(LDH)を用いてジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトから過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を定量することを含む方法である［１２］または［１３］に記載の方法。
［１５］トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬、ラクテート含有試薬、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、ペルオキシダーゼ含有試薬、NAD及び／又はNADH含有試薬、並びにトリエタノールアミン含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬を用いる、［１４］に記載の方法。
［１６］グリセルアルデヒド-3-リン酸を基質として用い、かつトリオースフォスフェートイソメラーゼを標識酵素として用いた酵素抗体免疫反応を利用し、かつ前記酵素抗体免疫反応の生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトを酵素サイクリング法により増感して定量する系をさらに含む酵素抗体免疫測定方法であって、
前記酵素サイクリング法が、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ(GPO)、およびラクテートヒドロゲナーゼ(LDH)を用いてジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトから過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を定量することを含む方法であり、かつ
トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬、ラクテート含有試薬、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、ペルオキシダーゼ含有試薬、NAD及び／又はNADH含有試薬、並びにトリエタノールアミン含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬を用いる、前記方法。
［１７］グリセルアルデヒド-3-リン酸を基質として用い、かつトリオースフォスフェートイソメラーゼを標識酵素として用いた酵素抗体免疫測定方法に用いるキットであって、トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬を含む、前記キット。
［１８］グリセルアルデヒド-3-リン酸を基質として用い、かつトリオースフォスフェートイソメラーゼを標識酵素として用いた酵素抗体免疫反応を利用し、かつ前記酵素抗体免疫反応の生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトを酵素サイクリング法により増感して定量する系をさらに含む酵素抗体免疫測定方法に用いるキットであって、
トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬、ラクテート含有試薬、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、ペルオキシダーゼ含有試薬、NAD及び／又はNADH含有試薬、並びにトリエタノールアミン含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬を含む、前記キット。
［１９］前記グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、及びペルオキシダーゼ含有試薬は、トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が1単位に対して5×10-11単位以下に低減されたものである［１８］に記載のキット。
［２０］［１］〜［４］のいずれかに記載の抗体を被験試料に接触せしめ、免疫反応によりトリオースフォスフェートイソメラーゼを検出および／または測定する方法。
［２１］抗体が放射性物質、酵素及び／又は蛍光物質により標識されている［２０］に記載の方法。 The invention for solving the above-mentioned problems is as follows.
[1] An antibody that specifically binds to triphosphate phosphate isomerase or a fragment of triphosphate phosphate isomerase.
[2] The antibody according to [1], wherein the triphosphate phosphate isomerase is an enzyme derived from at least one organism selected from the group consisting of mammals, amphibians, bacteria, and yeasts.
[3] The antibody according to [1], wherein the triphosphate phosphate isomerase is an enzyme derived from E. coli.
[4] The antibody according to any one of [1] to [3], which is IgG.
[5] An antibody-immobilized carrier comprising the antibody according to any one of [1] to [4] and a carrier, wherein the antibody is immobilized on the carrier.
[6] The antibody according to any one of [1] to [4] and / or the antibody-immobilized carrier according to claim 5 and a triphosphate isomerase-containing raw material are brought into contact with each other. Binding the phosphate isomerase and the antibody;
A step of separating the component contained in the raw material that did not bind to the antibody from the antibody and / or the antibody-immobilized carrier, and a fraction containing triphosphate isomerase by detaching the component bound to the antibody from the antibody A method for preparing a fraction containing triosephosphate isomerase having a purity higher than that of a raw material.
[7] The antibody according to any one of [1] to [4] and / or the antibody-immobilized carrier according to [5], a triosephosphate isomerase, and a raw material containing a target substance, are contacted, A step of binding the triphosphate phosphate isomerase contained in the raw material and the antibody, and a step of separating a component containing the target substance that did not bind to the antibody from the antibody and / or antibody-immobilized carrier;
A method for producing a fraction containing a target substance, wherein the triphosphate phosphate isomerase concentration is reduced from the raw material.
[8] The target substance contained in the raw material containing triphosphate phosphate isomerase and the target substance is glyceraldehyde-3-phosphate, lactate, glycerol-3-phosphate dehydrogenase, glycerol-3-phosphate oxidase, [7] The production method according to [7], which is at least one substance selected from the group consisting of lactate dehydrogenase, peroxidase, NAD and / or NADH, and triethanolamine.
[9] A raw material containing triosephosphate isomerase and a target substance is a glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent, a lactate-containing reagent, a glycerol-3-phosphate dehydrogenase-containing reagent, or glycerol-3-phosphate oxidase [7] The production method according to [7], which is at least one reagent selected from the group consisting of a reagent containing a reagent, a lactate dehydrogenase-containing reagent, a peroxidase-containing reagent, a NAD and / or NADH-containing reagent, and a triethanolamine-containing reagent.
[10] The production method according to any one of [7] to [9], further comprising a step of desorbing the component bound to the antibody from the antibody and recovering a fraction containing triphosphate isomerase.
[11] Glycerol-3-phosphate dehydrogenase-containing reagent, glycerol-3-phosphate oxidase-containing reagent, lactate dehydrogenase in which the content of triosephosphate isomerase is reduced to 5 × 10 -11 units or less per unit At least one reagent selected from the group consisting of a reagent containing a reagent and a peroxidase-containing reagent.
[12] An enzyme-antibody immunoassay method using glyceraldehyde-3-phosphate as a substrate and triosephosphate isomerase as a labeling enzyme, wherein the glyceraldehyde-3-phosphate is triose The method, wherein the phosphate isomerase is supplied as a glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent having a reduced content.
[13] The method according to [12], further comprising a system for sensitizing and quantifying dihydroxyacetone-3-phosphate, which is a product of the enzyme antibody immune reaction, by an enzyme cycling method.
[14] The enzyme cycling method comprises peroxidation from dihydroxyacetone-3-phosphate using glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), glycerol-3-phosphate oxidase (GPO), and lactate hydrogenase (LDH). The method according to [12] or [13], which comprises generating hydrogen and quantifying the generated hydrogen peroxide.
[15] A glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent, a lactate-containing reagent, a glycerol-3-phosphate dehydrogenase-containing reagent, and a glycerol-3-phosphate oxidase-containing reagent with a reduced content of triosephosphate isomerase The method according to [14], wherein at least one reagent selected from the group consisting of: a lactate dehydrogenase-containing reagent, a peroxidase-containing reagent, a NAD and / or NADH-containing reagent, and a triethanolamine-containing reagent is used.
[16] Dihydroxyacetone--which utilizes an enzyme antibody immune reaction using glyceraldehyde-3-phosphate as a substrate and triosephosphate isomerase as a labeling enzyme, and is a product of the enzyme antibody immune reaction An enzyme antibody immunoassay method further comprising a system for sensitizing and quantifying 3-phosphate by enzyme cycling method,
The enzyme cycling method generates hydrogen peroxide from dihydroxyacetone-3-phosphate using glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), glycerol-3-phosphate oxidase (GPO), and lactate hydrogenase (LDH) A glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent, a lactate-containing reagent, glycerol-3-, wherein the glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent has a reduced content of triphosphate phosphate isomerase. At least one reagent selected from the group consisting of a phosphate dehydrogenase-containing reagent, a glycerol-3-phosphate oxidase-containing reagent, a lactate dehydrogenase-containing reagent, a peroxidase-containing reagent, an NAD and / or NADH-containing reagent, and a triethanolamine-containing reagent Using said method.
[17] A kit for use in an enzyme-antibody immunoassay method using glyceraldehyde-3-phosphate as a substrate and triphosphate phosphate isomerase as a labeling enzyme, wherein the content of triphosphate phosphate isomerase is reduced Said kit comprising a glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent.
[18] Dihydroxyacetone--which utilizes an enzyme antibody immune reaction using glyceraldehyde-3-phosphate as a substrate and triosephosphate isomerase as a labeling enzyme, and is a product of the enzyme antibody immune reaction A kit used for an enzyme antibody immunoassay method further comprising a system for sensitizing and quantifying 3-phosphate by enzyme cycling method,
Glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent, lactate-containing reagent, glycerol-3-phosphate dehydrogenase-containing reagent, glycerol-3-phosphate oxidase-containing reagent, lactate dehydrogenase with reduced triosephosphate isomerase content The kit comprising at least one reagent selected from the group consisting of a reagent containing a reagent, a reagent containing peroxidase, a reagent containing NAD and / or NADH, and a reagent containing triethanolamine.
[19] The glycerol-3-phosphate dehydrogenase-containing reagent, glycerol-3-phosphate oxidase-containing reagent, lactate dehydrogenase-containing reagent, and peroxidase-containing reagent have a triphosphate phosphate isomerase content of 5 per 1 unit. The kit according to [18], which is reduced to × 10 -11 units or less.
[20] A method for detecting and / or measuring triphosphate phosphate isomerase by contacting an antibody according to any one of [1] to [4] with a test sample and performing an immune reaction.
[21] The method according to [20], wherein the antibody is labeled with a radioactive substance, an enzyme and / or a fluorescent substance.

本発明によれば、
（１）TIMに特異的なモノクローナル抗体が提供される。
そして、この抗体を用いることで、
（２）酵素試薬等の試薬に含まれるTIMを除去して、TIMの含有量を低減した試薬を提供することができ、併せて、
（３）上記抗体を用いることで、TIMを精製することもできる。 According to the present invention,
(1) A monoclonal antibody specific for TIM is provided.
And by using this antibody,
(2) It is possible to provide a reagent in which the content of TIM is reduced by removing TIM contained in a reagent such as an enzyme reagent,
(3) TIM can also be purified by using the above antibody.

さらに、本発明によれば、TIMの含有量を低減した試薬を用いることで、
（４）より高感度化した酵素免疫測定法(ELISA法)を提供することができる。
酵素免疫測定法(ELISA法)の感度は、10-15moles以上に高めることもでき、標的タンパク質の超高感度測定が可能である。 Furthermore, according to the present invention, by using a reagent having a reduced TIM content,
(4) An enzyme immunoassay (ELISA method) with higher sensitivity can be provided.
The sensitivity of enzyme immunoassay (ELISA) can be increased to 10 -15 moles or more, and ultrasensitive measurement of the target protein is possible.

加えて、前記モノクローナル抗体を用いることで、
（５）TIMの検出方法も提供することができる。 In addition, by using the monoclonal antibody,
(5) A method for detecting TIM can also be provided.

［TIMに特異的なモノクローナル抗体］
本発明は、トリオースフォスフェートイソメラーゼ（TIM）またはトリオースフォスフェートイソメラーゼ（TIM）の断片に特異的に結合する抗体に関する。トリオースフォスフェートイソメラーゼは、種々の生物に広く分布する酵素であり、例えば、哺乳類、両生類、細菌および酵母等に含まれる。本発明におけるトリオースフォスフェートイソメラーゼ（TIM）は、哺乳類、両生類、細菌および酵母から成る群から選ばれる少なくとも1種の生物に由来する酵素であることができる。但し、これらの限定される糸ではない。より具体的にはトリオースフォスフェートイソメラーゼが大腸菌由来の酵素であることができる。また、全長のトリオースフォスフェートイソメラーゼ（TIM）でなくても、トリオースフォスフェートイソメラーゼ（TIM）の断片であって抗原性を有する抗体であれば、本発明に含まれる。 [Monoclonal antibody specific to TIM]
The present invention relates to antibodies that specifically bind to triphosphate phosphate isomerase (TIM) or a fragment of triphosphate phosphate isomerase (TIM). Triosephosphate isomerase is an enzyme widely distributed in various organisms, and is contained in, for example, mammals, amphibians, bacteria and yeasts. The triphosphate phosphate isomerase (TIM) in the present invention can be an enzyme derived from at least one organism selected from the group consisting of mammals, amphibians, bacteria and yeasts. However, these are not limited yarns. More specifically, the triphosphate phosphate isomerase can be an enzyme derived from E. coli. Further, even if it is not a full-length triphosphate isomerase (TIM), any antibody that is a fragment of triphosphate isomerase (TIM) and has antigenicity is included in the present invention.

TIMに対する特異的抗体は、ポロクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも良く、免疫動物もマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、羊等公知の動物を利用できる。   The specific antibody against TIM may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and known animals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, goats and sheep can be used as immunized animals.

この発明のモノクローナル抗体は、TIM又はその抗原性フラグメントを抗原として用いることにより得ることができる。具体的には、例えば、斯かる抗原で免疫感作しておいた哺乳動物より採取した抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞とのハイブリドーマを作製し、これよりこの発明のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマのクローンを選択し、これを生体内外で培養することにより得ることができる。   The monoclonal antibody of the present invention can be obtained by using TIM or an antigenic fragment thereof as an antigen. Specifically, for example, a hybridoma of an antibody-producing cell collected from a mammal that has been immunized with such an antigen and a cell derived from a mammal capable of infinite growth is prepared. It can be obtained by selecting a hybridoma clone that can be produced and culturing it in vitro or in vivo.

免疫感作は慣用の方法によればよく、例えば、上記のごとき抗原を単独又は適宜アジュバントとともに哺乳動物の静脈、皮内、皮下又は腹腔内に注射接種し、一定期間飼育する。哺乳動物に特に限定はなく、所期の抗体産生細胞が得られるかぎり、種類、大きさ、雌雄は問わない。通常はラット、マウス、ハムスターなどのげっ歯類が用いられ、後記無限増殖可能な哺乳類由来の細胞との適合性も勘案しながら、最適のものが選択される。哺乳動物の種類や大きさにも依るが、抗原の接種量は、通常、総接種量を約５乃至５００μｇ／匹とし、これを約１乃至２週間の間隔を置いて２乃至５回に分けて接種する。そして、最終接種から３乃至５日後に脾臓を摘出し、分散して抗体産生細胞としての脾細胞を得る。   Immunization may be carried out by a conventional method. For example, the antigen as described above may be injected or injected into a mammal's vein, intradermal, subcutaneous or intraperitoneal cavity together with an appropriate adjuvant and reared for a certain period. The mammal is not particularly limited, and the type, size, and sex are not limited as long as the desired antibody-producing cells can be obtained. Usually, rodents such as rats, mice, hamsters and the like are used, and the most suitable one is selected in consideration of compatibility with cells derived from mammals that can be grown indefinitely. Depending on the type and size of the mammal, the inoculation amount of the antigen is usually about 5 to 500 μg / animal and divided into 2 to 5 times at intervals of about 1 to 2 weeks. Inoculate. Then, 3 to 5 days after the final inoculation, the spleen is removed and dispersed to obtain spleen cells as antibody-producing cells.

つぎに、斯くして得られた抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞とを融合させて、目的のハイブリドーマを含む細胞融合産物を得る。無限増殖可能な哺乳類由来の細胞には、通常、Ｐ３−ＮＳ１−Ａｇ４−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ１８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）及びＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）などのマウス骨髄種由来の細胞株又はその変異株が用いられる。細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコールやセンダイウイルスを始めとする融合促進剤や電気パルスによる慣用の方法が用いられ、一例を挙げると、融合促進剤を含む融合培地に抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞を約１：１乃至１：１０の割合で浮遊させ、この状態のまま、約３０乃至４０℃で約１乃至５分間インキュベートする。融合培地には、例えば、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地及びイスコフ改変ダルベコ培地を始めとする通常一般のものを用い得るが、ウシ血清などの血清類は除いておくのが望ましい。   Next, the antibody-producing cells thus obtained are fused with cells derived from mammals capable of infinite growth to obtain a cell fusion product containing the target hybridoma. The cells derived from mammals capable of infinite growth usually include mice such as P3-NS1-Ag4-1 cells (ATCC TIB18), P3-X63-Ag8 cells (ATCC TIB9) and SP2 / 0-Ag14 cells (ATCC CRL1581). A cell line derived from a myeloid species or a mutant thereof is used. For cell fusion, for example, conventional methods using fusion promoters such as polyethylene glycol and Sendai virus and electric pulses are used. For example, antibody-producing cells can be infinitely proliferated in a fusion medium containing a fusion promoter. Mammalian cells are suspended at a ratio of about 1: 1 to 1:10 and incubated in this state at about 30 to 40 ° C. for about 1 to 5 minutes. For the fusion medium, for example, MEM medium, RPMI 1640 medium, and Iscov modified Dulbecco medium can be used in general common media, but it is desirable to exclude serum such as bovine serum.

目的のハイブリドーマを選択するには、まず、上記のようにして得た細胞融合産物をＨＡＴ培地などの選択用培地に移し、約３０乃至４０℃で約３日乃至３週間培養してハイブリドーマ以外の細胞を死滅させる。つぎに、ハイブリドーマを常法により培養し、培養物中に分泌された抗体につき、当該蛋白質との反応性を試験する。試験には、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ及びバイオアッセイなどの抗体を検出するための慣用の方法が用いられ、例えば、富山朔二・安東民衛編『単クローン抗体実験マニュアル』、１９９１年、講談社サイエンティフィク発行、第１０５乃至１５２頁にはそのための方法が種々詳述されている。当該蛋白質に特異的な抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法などにより、直ちにクローニングされ、単一クローン化されたこの発明によるハイブリドーマを得る。   To select a target hybridoma, first, the cell fusion product obtained as described above is transferred to a selection medium such as HAT medium and cultured at about 30 to 40 ° C. for about 3 days to 3 weeks. Kill cells. Next, the hybridoma is cultured by a conventional method, and the reactivity of the antibody secreted into the culture with the protein is tested. For the test, conventional methods for detecting antibodies such as enzyme immunoassay, radioimmunoassay, and bioassay are used. For example, “Monoclonal Antibody Experiment Manual” edited by Tomi Yamato and Minami Ando, 1991, Kodansha Scientific Various methods for doing this are described in detail in Fix Issue, pages 105-152. A hybridoma producing an antibody specific to the protein is immediately cloned by a limiting dilution method or the like to obtain a hybridoma according to the present invention which is single-cloned.

この発明のモノクローナル抗体は、斯かるハイブリドーマを生体内外で培養することにより得ることができる。培養には、哺乳類由来の細胞を培養するための慣用の方法が用いられ、例えば、生体外の培養培地で培養するときには、その培養物から、一方、ヒト以外の温血動物に移植し、生体内で培養するときには、その腹水及び／又は血液からモノクローナル抗体を採取する。後述のハイブリドーマＭ−１はモノクローナル抗体の産生能高く、しかも、生体内外における培養が容易であるという特徴がある。培養物又は腹水若しくは血液からモノクローナル抗体を採取するには、抗体一般を精製するための斯界における慣用の方法が用いられる。個々の方法としては、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動が挙げられ、これらは必要に応じて組合せて適用される。精製したモノクローナル抗体は、その後、濃縮・乾燥し、用途に応じて液状又は固状とすることができる。   The monoclonal antibody of the present invention can be obtained by culturing such a hybridoma in vitro or in vivo. For culturing, a conventional method for culturing cells derived from mammals is used. For example, when culturing in an in vitro culture medium, the culture is transplanted to a warm-blooded animal other than a human and live. When cultured in the body, monoclonal antibodies are collected from the ascites and / or blood. Hybridoma M-1, which will be described later, is characterized by high production ability of monoclonal antibodies and easy culture in vivo and in vitro. To collect monoclonal antibodies from culture or ascites or blood, conventional methods in the art for purifying antibodies in general are used. Individual methods include, for example, salting out, dialysis, filtration, concentration, centrifugation, fractional precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography, gel electrophoresis and isoelectric focusing. Electrophoresis can be mentioned, and these are applied in combination as necessary. The purified monoclonal antibody can then be concentrated and dried to be liquid or solid depending on the application.

本発明のモノクローナル抗体は、TIMと特異的に反応する。本発明のハイブリドーマは、生体内外で培養すると、斯かるモノクローナル抗体を産生する。本発明による製造方法によるときには、斯かるモノクローナル抗体の所望量が容易に得られる。本発明によるTIM精製方法によるときには、TIMと夾雑物質を含む混合物から、TIMが高純度且つ効率的に採取される。本発明によるTIM除去方法によるときには、TIMを含む混合物から、TIMを選択的かつ高効率に除去される。   The monoclonal antibody of the present invention specifically reacts with TIM. The hybridoma of the present invention produces such a monoclonal antibody when cultured in vitro or in vivo. When the production method according to the present invention is used, a desired amount of such a monoclonal antibody can be easily obtained. When the TIM purification method according to the present invention is used, TIM is collected with high purity and efficiency from a mixture containing TIM and contaminants. When the TIM removal method according to the present invention is used, TIM is selectively and efficiently removed from the mixture containing TIM.

本発明によるTIMを除去して調製された基質、酵素、補酵素、緩衝液の少なくても１つを含む資材を用いるときには、TIMを標識酵素に用いた酵素抗体免疫反応において、酵素サイクリング法で被検試料中の標的物質を高感度で定性的または定量的に検出することができる。   When using a material containing at least one of a substrate, enzyme, coenzyme, and buffer solution prepared by removing TIM according to the present invention, in enzyme antibody immunoreaction using TIM as a labeling enzyme, an enzyme cycling method is used. The target substance in the test sample can be detected with high sensitivity and qualitatively or quantitatively.

本発明によるTIM抗体を用いるときには、適宜手法によりその免疫反応を測定することにより、被検試料中のTIMを定性的又は定量的に検出することができる。   When the TIM antibody according to the present invention is used, the TIM in the test sample can be detected qualitatively or quantitatively by measuring the immune reaction by an appropriate method.

この発明でいうモノクローナル抗体とは、TIMに特異的なモノクローナル抗体全般を包含するものとし、その出所・由来、クラスは問わない。また抗体作製用の抗原のTIMとしては、例えば、生物種から抽出した基質、酵素、補酵素を用いる場合は、その生物種由来のTIMを免疫源にすることが望ましいが、特に限定するものではない。   Monoclonal antibodies referred to in this invention include all monoclonal antibodies specific to TIM, and their origin, origin and class are not limited. In addition, for example, when using a substrate, an enzyme, or a coenzyme extracted from a biological species as the antigen TIM for antibody production, it is desirable to use the TIM derived from the biological species as an immunogen, but it is not particularly limited. Absent.

［抗体固定化担体］
本発明は、上記本発明の抗体と担体とからなり、前記抗体が前記担体に固定化されている、抗体固定化担体を包含する。担体としては、例えば、ゲル状の水不溶性担体を用いることができる。水不溶性担体としては、例えば、デキストラン、アガロース、ラテックスビーズ、磁気ビーズ等（商品名としては例えば、Sepharose CL-4Bやホルミル-セルロファイン等）を挙げることができる。 [Antibody immobilized on antibody]
The present invention includes an antibody-immobilized carrier comprising the antibody of the present invention and a carrier, wherein the antibody is immobilized on the carrier. As the carrier, for example, a gel-like water-insoluble carrier can be used. Examples of the water-insoluble carrier include dextran, agarose, latex beads, magnetic beads and the like (trade names such as Sepharose CL-4B and formyl-cellulofine).

［TIM精製方法］
本発明は、上記本発明の抗体、および／または抗体固定化担体とトリオースフォスフェートイソメラーゼ含有原料とを接触させ、前記原料に含まれるトリオースフォスフェートイソメラーゼと前記抗体とを結合させる工程、抗体と結合しなかった前記原料に含まれる成分を前記抗体および／または抗体固定化担体と分離する工程、並びに前記抗体と結合した成分を抗体から脱離して、トリオースフォスフェートイソメラーゼを含む画分を回収する工程とを含む、原料より純度の高いトリオースフォスフェートイソメラーゼを含む画分の調製方法（TIM精製方法）を包含する。 [TIM purification method]
The present invention includes a step of bringing the antibody of the present invention and / or an antibody-immobilized carrier into contact with a triphosphate isomerase-containing material, and binding the triphosphate phosphate isomerase contained in the material with the antibody, Separating the component contained in the raw material that did not bind to the antibody and / or the antibody-immobilized carrier, and detaching the component bound to the antibody from the antibody to obtain a fraction containing triphosphate isomerase. A method for preparing a fraction containing a triphosphate phosphate isomerase having a higher purity than the raw material (TIM purification method).

本発明のモノクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによるTIMの精製にきわめて有用である。斯かる精製方法は、この発明のモノクローナル抗体をTIMとTIM以外の夾雑蛋白質を始めとする夾雑物質との混合物に接触させてモノクローナル抗体にTIMのみを吸着させる工程と、吸着した蛋白質をモノクローナル抗体から脱着させる工程を含んでなり、両工程は、通常、水性媒体中で行なわれる。この発明のモノクローナル抗体は、通常、ゲル状の水不溶性担体に結合した状態で用いられ、その水不溶性担体を円筒管などにカラム状に充填し、これに、例えば、ウサギ筋肉ホモジェネート抽出液若しくは形質転換体の培養液又はそれらの部分精製品を通液すると、実質的にTIMのみが水不溶性担体上のモノクローナル抗体に吸着する。吸着したTIMは、モノクローナル抗体周囲の水素イオン濃度を変えることにより、容易に脱着させることができ、例えば、ＩｇＧのクラスに属するモノクローナル抗体を用いる場合は酸性側のｐＨ、通常、ｐＨ２乃至３で、一方、ＩｇＭのクラスに属するモノクローナル抗体を用いる場合はアルカリ側のｐＨ、通常、ｐＨ１０乃至１１で溶出させる。   The monoclonal antibody of the present invention is very useful for the purification of TIM by immunoaffinity chromatography. Such a purification method comprises a step of bringing the monoclonal antibody of the present invention into contact with a mixture of TIM and a contaminant such as a contaminant protein other than TIM to adsorb only TIM to the monoclonal antibody, and the adsorbed protein from the monoclonal antibody. Both steps are usually carried out in an aqueous medium. The monoclonal antibody of the present invention is usually used in a state of being bound to a gel-like water-insoluble carrier, and the water-insoluble carrier is packed into a cylindrical tube or the like in a column shape, for example, a rabbit muscle homogenate extract or a trait. When the culture medium of the transformant or a partially purified product thereof is passed, substantially only TIM is adsorbed to the monoclonal antibody on the water-insoluble carrier. The adsorbed TIM can be easily desorbed by changing the hydrogen ion concentration around the monoclonal antibody. For example, when a monoclonal antibody belonging to the IgG class is used, the pH on the acidic side, usually pH 2 to 3, On the other hand, when a monoclonal antibody belonging to the IgM class is used, it is eluted at an alkaline pH, usually pH 10-11.

［TIM除去方法］
さらに、本発明は、上記本発明の抗体、および／または抗体固定化担体とトリオースフォスフェートイソメラーゼと目的物質とを含有する原料とを接触させ、前記原料に含まれるトリオースフォスフェートイソメラーゼと前記抗体とを結合させる工程、並びに抗体と結合しなかった前記目的物質を含む成分を前記抗体および／または抗体固定化担体と分離する工程とを含む、原料よりトリオースフォスフェートイソメラーゼ濃度を低減した、目的物質を含む画分の製造方法（TIM除去方法）に関する。 [TIM removal method]
Furthermore, the present invention provides the above-described antibody of the present invention, and / or an antibody-immobilized carrier, a raw material containing triphosphate isomerase and a target substance, and the triphosphate phosphate isomerase contained in the raw material and the above-mentioned A step of binding an antibody, and a step of separating a component containing the target substance that did not bind to the antibody from the antibody and / or antibody-immobilized carrier, wherein the triphosphate isomerase concentration is reduced from the raw material, The present invention relates to a method for producing a fraction containing a target substance (TIM removal method).

上記TIM除去方法においては、トリオースフォスフェートイソメラーゼと目的物質とを含有する原料に含まれる目的物質が、例えば、グリセルアルデヒド-3-リン酸、ラクテート、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、NAD及び／又はNADH、並びにトリエタノールアミンから成る群から選ばれる少なくとも1種の物質であることができる。   In the TIM removal method, the target substance contained in the raw material containing triphosphate isomerase and the target substance is, for example, glyceraldehyde-3-phosphate, lactate, glycerol-3-phosphate dehydrogenase, glycerol- It can be at least one substance selected from the group consisting of 3-phosphate oxidase, lactate dehydrogenase, peroxidase, NAD and / or NADH, and triethanolamine.

上記TIM除去方法においては、トリオースフォスフェートイソメラーゼと目的物質とを含有する原料が、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬、ラクテート含有試薬、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、ペルオキシダーゼ含有試薬、NAD及び／又はNADH含有試薬、並びにトリエタノールアミン含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬であることができる。   In the TIM removal method, the raw material containing triphosphate isomerase and the target substance is a glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent, a lactate-containing reagent, a glycerol-3-phosphate dehydrogenase-containing reagent, glycerol-3 -It can be at least one reagent selected from the group consisting of phosphate oxidase-containing reagents, lactate dehydrogenase-containing reagents, peroxidase-containing reagents, NAD and / or NADH-containing reagents, and triethanolamine-containing reagents.

上記TIM除去方法においては、前記抗体と結合した成分を抗体から脱離して、トリオースフォスフェートイソメラーゼを含む画分を回収する工程をさらに含むこともできる。   The TIM removal method may further include a step of desorbing a component bound to the antibody from the antibody and recovering a fraction containing triphosphate isomerase.

この発明のモノクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによるTIMの除去にきわめて有用である。斯かる除去方法は、この発明のモノクローナル抗体をTIMとTIM以外の蛋白質を始めとする物質との混合物に接触させてモノクローナル抗体にTIMのみを吸着させる工程と、吸着しない画分を回収する工程を含んでなり、両工程は、通常、水性媒体中で行なわれる。この発明のモノクローナル抗体は、通常、ゲル状の水不溶性担体に結合した状態で用いられ、その水不溶性担体を円筒管などにカラム状に充填し、これに、例えば、TIMを標識酵素に用いる酵素サイクリング法で使用する基質、酵素、補酵素、緩衝液を通液すると、実質的にTIMのみが水不溶性担体上のモノクローナル抗体に吸着する。TIM以外の物質や緩衝液は水不溶性担体上のモノクローナル抗体に吸着せず、そのまま素通り画分として回収できる。素通り画分は必要により透析、濃縮をして使用する。   The monoclonal antibody of the present invention is extremely useful for removing TIM by immunoaffinity chromatography. Such a removal method comprises a step of bringing the monoclonal antibody of the present invention into contact with a mixture of TIM and a substance such as a protein other than TIM to adsorb only TIM to the monoclonal antibody, and a step of recovering a fraction that is not adsorbed. Comprising, both steps are usually performed in an aqueous medium. The monoclonal antibody of the present invention is usually used in a state of being bound to a gel-like water-insoluble carrier, and the water-insoluble carrier is packed into a cylindrical tube or the like in a column shape, for example, an enzyme using TIM as a labeling enzyme. When the substrate, enzyme, coenzyme, and buffer used in the cycling method are passed, substantially only TIM is adsorbed to the monoclonal antibody on the water-insoluble carrier. Substances and buffers other than TIM are not adsorbed to the monoclonal antibody on the water-insoluble carrier and can be recovered as it is as a flow-through fraction. The flow-through fraction is used after dialysis and concentration if necessary.

[TIM除去酵素製品]
本発明は、トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減されたグリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬、ラクテート含有試薬、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、ペルオキシダーゼ含有試薬、NAD及び／又はNADH含有試薬、並びにトリエタノールアミン含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬を包含する。 [TIM removal enzyme products]
The present invention relates to a glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent, a lactate-containing reagent, a glycerol-3-phosphate dehydrogenase-containing reagent, and a glycerol-3-phosphate oxidase-containing reagent in which the content of triosephosphate isomerase is reduced , A lactate dehydrogenase-containing reagent, a peroxidase-containing reagent, a NAD and / or NADH-containing reagent, and a triethanolamine-containing reagent.

本発明は、グリセルアルデヒド-3-リン酸、ラクテート、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、NAD及び／又はNADHの一つ以上を含む製品であって、この製品に混在するTIMが、TIMに対する特異的抗体により除去された製品を包含する。TIMに対する特異的抗体により除去は、上記で説明した方法により実施できる。TIMの除去の程度は、例えば最もTIMの混在が多いグリセロール-3-リン酸オキシダーゼ、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼやラクテートデヒドロゲナーゼの1単位に対して5×10-11単位以下、好ましくは5×10-13単位以下、より好ましくは5×10-15単位以下のTIM活性となることが好ましい。ペルオキシダーゼも同様に1単位に対して5×10-11単位以下、好ましくは5×10-13単位以下、より好ましくは5×10-15単位以下のTIM活性となることが好ましい。 The present invention is a product comprising one or more of glyceraldehyde-3-phosphate, lactate, glycerol-3-phosphate dehydrogenase, glycerol-3-phosphate oxidase, lactate dehydrogenase, peroxidase, NAD and / or NADH. Thus, TIM mixed in this product includes products in which TIM is removed by a specific antibody against TIM. Removal with a specific antibody against TIM can be carried out by the method described above. The degree of TIM removal is, for example, 5 × 10 −11 unit or less, preferably 5 × with respect to 1 unit of glycerol-3-phosphate oxidase, glycerol-3-phosphate dehydrogenase and lactate dehydrogenase with the largest amount of TIM. It is preferable that the TIM activity is 10 −13 units or less, more preferably 5 × 10 −15 units or less. Similarly, peroxidase preferably has a TIM activity of 5 × 10 −11 units or less, preferably 5 × 10 −13 units or less, more preferably 5 × 10 −15 units or less per unit.

上記TIM除去した製品は、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ、およびラクテートヒドロゲナーゼを用いて、TIMの生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェートから過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を定量することを含む酵素サイクリング法に用いられる。TIMの生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェートは、抗体酵素複合体の酵素としてTIMを用いる酵素免疫測定方法における生成物であることができる。尚、酵素サイクリング法に基質として、ラクテート、グリセロール-3-リン酸、NAD及び／又はNADHを用いる。   The TIM-removed product uses glycerol-3-phosphate dehydrogenase, glycerol-3-phosphate oxidase, and lactate hydrogenase to generate hydrogen peroxide from dihydroxyacetone-3-phosphate, the product of TIM. , Used in enzyme cycling methods that involve quantifying the hydrogen peroxide produced. Dihydroxyacetone-3-phosphate, which is a product of TIM, can be a product in an enzyme immunoassay method using TIM as an enzyme of an antibody-enzyme complex. In addition, lactate, glycerol-3-phosphate, NAD and / or NADH are used as substrates in the enzyme cycling method.

[酵素免疫測定方法]
本発明は、グリセルアルデヒド-3-リン酸を基質として用い、かつトリオースフォスフェートイソメラーゼを標識酵素として用いた酵素抗体免疫測定方法であって、前記グリセルアルデヒド-3-リン酸は、上記本発明のトリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬として供給される前記方法に関する。この方法は、前記酵素抗体免疫反応の生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトを酵素サイクリング法により増感して定量する系をさらに含むこともできる。前記酵素サイクリング法は、例えば、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ(GPO)、およびラクテートヒドロゲナーゼ(LDH)を用いてジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトから過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を定量することを含む方法であることができる。 [Enzyme immunoassay]
The present invention is an enzyme antibody immunoassay method using glyceraldehyde-3-phosphate as a substrate and triphosphate phosphate isomerase as a labeling enzyme, wherein the glyceraldehyde-3-phosphate is the above-mentioned The present invention relates to the above-mentioned method supplied as a glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent having a reduced content of triosephosphate isomerase of the present invention. This method may further include a system in which dihydroxyacetone-3-phosphate, which is a product of the enzyme antibody immune reaction, is sensitized and quantified by an enzyme cycling method. The enzyme cycling method includes, for example, hydrogen peroxide from dihydroxyacetone-3-phosphate using glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), glycerol-3-phosphate oxidase (GPO), and lactate hydrogenase (LDH). And producing hydrogen peroxide and quantifying the produced hydrogen peroxide.

上記方法においては、トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬、ラクテート含有試薬、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、ペルオキシダーゼ含有試薬、NAD及び／又はNADH含有試薬、並びにトリエタノールアミン含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬を用いることができる。   In the above method, the glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent, the lactate-containing reagent, the glycerol-3-phosphate dehydrogenase-containing reagent, the glycerol-3-phosphate oxidase, in which the content of triosephosphate isomerase is reduced At least one reagent selected from the group consisting of a reagent containing a reagent, a lactate dehydrogenase-containing reagent, a peroxidase-containing reagent, a NAD and / or NADH-containing reagent, and a triethanolamine-containing reagent can be used.

本発明は、グリセルアルデヒド-3-リン酸を基質として用い、かつトリオースフォスフェートイソメラーゼを標識酵素として用いた酵素抗体免疫反応を利用し、かつ前記酵素抗体免疫反応の生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトを酵素サイクリング法により増感して定量する系をさらに含む酵素抗体免疫測定方法であって、
前記酵素サイクリング法が、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ(GPO)、およびラクテートヒドロゲナーゼ(LDH)を用いてジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトから過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を定量することを含む方法であり、かつ
トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬、ラクテート含有試薬、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、ペルオキシダーゼ含有試薬、NAD及び／又はNADH含有試薬、並びにトリエタノールアミン含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬を用いる、前記方法も包含する。 The present invention relates to dihydroxyacetone, which utilizes an enzyme antibody immune reaction using glyceraldehyde-3-phosphate as a substrate and triphosphate phosphate isomerase as a labeling enzyme, and is a product of the enzyme antibody immune reaction. -3- An enzyme antibody immunoassay method further comprising a system for sensitizing and quantifying phosphate by an enzyme cycling method,
The enzyme cycling method generates hydrogen peroxide from dihydroxyacetone-3-phosphate using glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), glycerol-3-phosphate oxidase (GPO), and lactate hydrogenase (LDH) A glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent, a lactate-containing reagent, glycerol-3-, wherein the glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent has a reduced content of triphosphate phosphate isomerase. At least one reagent selected from the group consisting of a phosphate dehydrogenase-containing reagent, a glycerol-3-phosphate oxidase-containing reagent, a lactate dehydrogenase-containing reagent, a peroxidase-containing reagent, an NAD and / or NADH-containing reagent, and a triethanolamine-containing reagent This method is also included.

本発明は、抗体酵素複合体の酵素としてTIMを用いる酵素免疫測定方法において、基質、酵素、補酵素、緩衝液に微量混在しているTIMを特異的に除去した試薬を用いることを特徴とする。この方法では、TIMの生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトの定量は、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ(GPO)、およびラクテートヒドロゲナーゼ(LDH)を用いてジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトから過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を定量することを含む酵素サイクリング法を用いて行われる。さらに、少なくとも前記ジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトの定量に用いられるGPOを含む酵素製品は、この酵素製品に混在するTIMが、TIMに対する特異的抗体により除去されたものである。   The present invention is characterized in that, in an enzyme immunoassay method using TIM as an enzyme of an antibody-enzyme complex, a reagent that specifically removes TIM mixed in a trace amount in a substrate, enzyme, coenzyme, and buffer is used. . In this method, quantification of dihydroxyacetone-3-phosphate, the product of TIM, was performed using glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), glycerol-3-phosphate oxidase (GPO), and lactate hydrogenase (LDH). It is carried out using an enzyme cycling method that involves generating hydrogen peroxide from dihydroxyacetone-3-phosphate and quantifying the generated hydrogen peroxide. Furthermore, in the enzyme product containing GPO used for quantification of at least the dihydroxyacetone-3-phosphate, TIM mixed in the enzyme product is removed by a specific antibody against TIM.

本発明の酵素免疫測定方法は、抗体酵素複合体の酵素としてTIMを用いること以外は、通常の酵素免疫測定と同様に実施することができる。例えば、被検体に特異的に結合する抗体を表面に固着させた基板、例えば、プレートウエルを用いることができる。   The enzyme immunoassay method of the present invention can be carried out in the same manner as a normal enzyme immunoassay, except that TIM is used as the enzyme of the antibody-enzyme complex. For example, a substrate on which an antibody that specifically binds to the analyte is fixed on the surface, for example, a plate well can be used.

標識酵素がTIMである抗体酵素複合体は、常法(石川栄治ら：酵素免疫測定法、第3版、医学書院)により調製できる。例えば、実施例に記載のように、マレイミド化したTIMと標識される抗体を混合し、所定時間反応させることで、調製することができる。   An antibody-enzyme complex in which the labeling enzyme is TIM can be prepared by a conventional method (Eiji Ishikawa et al .: Enzyme Immunoassay, 3rd edition, Medical School). For example, as described in the Examples, it can be prepared by mixing maleimidated TIM and labeled antibody and reacting for a predetermined time.

抗体酵素複合体を構成する抗体は、本発明の酵素免疫測定方法により測定されるべき被検体に特異的に結合する抗体から適宜選択することができる。例えば、本発明の酵素免疫測定方法は、タンパク質の分析に用いられるが、その場合、抗体酵素複合体の抗体は、被検体であるタンパク質に特異的に結合する抗体である。また、この場合、被検体であるタンパク質に特異的に結合する抗体を表面に固着させた基板を用いる。また、抗体酵素複合体を構成する抗体および基板に固着させる抗体は、抗体の断片であっても良い。本発明の酵素免疫測定方法における、被検体は、タンパク質に限定されず、通常の酵素免疫測定方法が測定対象とするタンパク質以外のすべての物質であることができる。   The antibody constituting the antibody-enzyme complex can be appropriately selected from antibodies that specifically bind to the analyte to be measured by the enzyme immunoassay method of the present invention. For example, the enzyme immunoassay method of the present invention is used for protein analysis. In this case, the antibody of the antibody-enzyme complex is an antibody that specifically binds to the protein as the analyte. In this case, a substrate on which an antibody that specifically binds to the protein as the analyte is fixed to the surface is used. The antibody constituting the antibody-enzyme complex and the antibody to be fixed to the substrate may be antibody fragments. The analyte in the enzyme immunoassay method of the present invention is not limited to a protein, and can be any substance other than the protein to be measured by a normal enzyme immunoassay method.

本発明の酵素免疫測定方法では、上記酵素サイクリング法を用いる。この酵素サイクリング法の詳細を以下に示す。   In the enzyme immunoassay method of the present invention, the above enzyme cycling method is used. Details of this enzyme cycling method are shown below.

GAPDH：グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ
GPO：グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ
LDH：ラクテートデヒドロゲナーゼ
TIM：トリオースフォスフェートイソメラーゼ GAPDH: Glycerol-3-phosphate dehydrogenase
GPO: Glycerol-3-phosphate oxidase
LDH: Lactate dehydrogenase
TIM: Triosephosphate isomerase

抗体酵素複合体の標識酵素であるTIMによって、グリセルアルデヒド-3-リン酸からジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトが生成する。ジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトは、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)によりグリセロール-3-リン酸に変換され、グリセロール-3-リン酸は、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ(GPO)によりジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトに戻され、それと同時に過酸化水素を生成する。このサイクルにより、過酸化水素が蓄積し、この蓄積した過酸化水素を定量する。この時点での過酸化水素の蓄積反応は直線的でしかないが、標識酵素にトリオースホスフェイトイソメラーゼ(TIM)を用いることにより、GAPDHの基質であるDihydroxyacetone-3-phosphateをサイクリング反応系に継続的に追加することができ、その結果過酸化水素の蓄積反応は幾何級数的に増大する。尚、GAPDHの反応により消費(酸化)されたNADは、ラクテートヒドロゲナーゼ(LDH)を用いてNADHに戻される(還元される)。このように、酵素サイクリング法には、基質として、ラクテート、グリセロール-3-リン酸、NADおよび／またはNADHを用いる。   Dihydroxyacetone-3-phosphate is produced from glyceraldehyde-3-phosphate by TIM which is a labeling enzyme of the antibody-enzyme complex. Dihydroxyacetone-3-phosphate is converted to glycerol-3-phosphate by glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), and glycerol-3-phosphate is dihydroxylated by glycerol-3-phosphate oxidase (GPO). It is returned to acetone-3-phosphate and at the same time it produces hydrogen peroxide. By this cycle, hydrogen peroxide is accumulated, and the accumulated hydrogen peroxide is quantified. At this point, the hydrogen peroxide accumulation reaction is only linear, but by using triose phosphate isomerase (TIM) as the labeling enzyme, GAPDH substrate Dihydroxyacetone-3-phosphate is continued in the cycling reaction system. As a result, the hydrogen peroxide accumulation reaction increases exponentially. The NAD consumed (oxidized) by the GAPDH reaction is returned (reduced) to NADH using lactate hydrogenase (LDH). Thus, lactate, glycerol-3-phosphate, NAD and / or NADH are used as substrates in the enzyme cycling method.

過酸化水素を定量は、比色・発光等の検出系で測定することで実施できる。生成した過酸化水素の定量は、例えば、パーオキシダーゼ(POD)を用いる発色法により行われる。但し、この方法に限定する意図はない。   Hydrogen peroxide can be quantified by measuring with a detection system such as colorimetry or luminescence. The hydrogen peroxide produced is quantified by, for example, a color development method using peroxidase (POD). However, there is no intention to limit to this method.

本発明では、少なくとも前記ジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトの定量に用いられるGPOを含む酵素製品として、酵素製品に混在するTIMが、TIMに対する抗体による吸収操作による除去またはTIM抗体溶液を添加することにより不活性化されたものを用いる。   In the present invention, as an enzyme product containing GPO used for quantification of at least the dihydroxyacetone-3-phosphate, TIM mixed in the enzyme product is removed by absorption operation with an antibody against TIM or by adding a TIM antibody solution. Use inactivated one.

[酵素サイクリング法用キット]
本発明は、グリセルアルデヒド-3-リン酸を基質として用い、かつトリオースフォスフェートイソメラーゼを標識酵素として用いた酵素抗体免疫測定方法に用いるキットであって、トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬を含む、前記キットに関する。 [Enzyme cycling kit]
The present invention is a kit for use in an enzyme antibody immunoassay method using glyceraldehyde-3-phosphate as a substrate and triphosphate phosphate isomerase as a labeling enzyme, wherein the content of triphosphate phosphate isomerase is It relates to said kit comprising a reduced glyceraldehyde-3-phosphate containing reagent.

さらに本発明は、グリセルアルデヒド-3-リン酸を基質として用い、かつトリオースフォスフェートイソメラーゼを標識酵素として用いた酵素抗体免疫反応を利用し、かつ前記酵素抗体免疫反応の生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトを酵素サイクリング法により増感して定量する系をさらに含む酵素抗体免疫測定方法に用いるキットであって、
トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬、ラクテート含有試薬、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、ペルオキシダーゼ含有試薬、NAD及び／又はNADH含有試薬、並びにトリエタノールアミン含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬を含む、前記キットにも関する。トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された試薬は、上述のとおりである。 Furthermore, the present invention uses an enzyme-antibody immune reaction using glyceraldehyde-3-phosphate as a substrate and triphosphate phosphate isomerase as a labeling enzyme, and is a product of the enzyme-antibody immune reaction, dihydroxy A kit used in an enzyme antibody immunoassay method further comprising a system for sensitizing and quantifying acetone-3-phosphate by an enzyme cycling method,
Glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent, lactate-containing reagent, glycerol-3-phosphate dehydrogenase-containing reagent, glycerol-3-phosphate oxidase-containing reagent, lactate dehydrogenase with reduced triosephosphate isomerase content The kit also includes at least one reagent selected from the group consisting of a reagent containing a reagent, a reagent containing peroxidase, a reagent containing NAD and / or NADH, and a reagent containing triethanolamine. The reagent in which the content of triosephosphate isomerase is reduced is as described above.

本発明は、上記TIMを除去したグリセロール-3-リン酸オキシダーゼ、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼやラクテートデヒドロゲナーゼを含む酵素製品を含む酵素サイクリング法用キットを包含する。このキットは、酵素サイクリング法に基質として、ラクテート、グリセロール-3-リン酸、NAD及び／又はNADHをさらに含むことができる。このキットは、酵素サイクリング法を用いる酵素免疫測定方法に利用できる。ここでの酵素サイクリング法および酵素免疫測定方法とは、上記本発明の酵素免疫測定方法についての説明で説明した方法と同様である。   The present invention includes a kit for an enzyme cycling method comprising an enzyme product containing glycerol-3-phosphate oxidase, glycerol-3-phosphate dehydrogenase or lactate dehydrogenase from which the TIM has been removed. The kit may further comprise lactate, glycerol-3-phosphate, NAD and / or NADH as a substrate for the enzyme cycling method. This kit can be used for an enzyme immunoassay method using an enzyme cycling method. Here, the enzyme cycling method and the enzyme immunoassay method are the same as those described in the description of the enzyme immunoassay method of the present invention.

本発明は、上記本発明の抗体を被験試料に接触せしめ、免疫反応によりトリオースフォスフェートイソメラーゼを検出および／または測定する方法を包含する。ここで、抗体は、放射性物質、酵素及び／又は蛍光物質により標識されていることができる。   The present invention includes a method in which the antibody of the present invention is contacted with a test sample, and triphosphate phosphate isomerase is detected and / or measured by an immune reaction. Here, the antibody can be labeled with a radioactive substance, an enzyme and / or a fluorescent substance.

本発明のモノクローナル抗体は、TIMの検出を必要とする諸分野にも広範な用途を有する。すなわち、この発明のモノクローナル抗体にラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどの標識イムノアッセイを適用するときには、被検試料中のTIMを迅速且つ正確に定性又は定量分析することができる。斯かる分析において、この発明のモノクローナル抗体は、例えば、放射性物質、酵素及び／又は蛍光物質により標識して用いられる。この発明のモノクローナル抗体はTIMに特異的に反応し、免疫反応を呈するので、その免疫反応をこれら標識物質を指標に測定すれば、被検試料中のごく微量のTIMを精度良く検出することができる。標識イムノアッセイは、バイオアッセイと比較して、一度に数多くの被検試料を分析できるうえに、分析に要する時間と労力が少なくてすみ、しかも、分析が高精度であるという特徴がある。したがって、この発明による検出方法は、TIMを製造する際の工程管理や製品の品質管理にきわめて有用である。なお、この発明はモノクローナル抗体の標識や標識アッセイそのものに係わるものではないので詳細な説明は省くが、例えば、ピー・ティッセン著、石川栄治訳『エンザイムイムノアッセイ』、１９８９年、東京化学同人発行にはそのための方法が種々詳述されている。   The monoclonal antibodies of the present invention have a wide range of applications in fields that require the detection of TIM. That is, when a labeled immunoassay such as a radioimmunoassay, an enzyme immunoassay, or a fluorescent immunoassay is applied to the monoclonal antibody of the present invention, TIM in a test sample can be qualitatively or quantitatively analyzed quickly and accurately. In such analysis, the monoclonal antibody of the present invention is used after being labeled with, for example, a radioactive substance, an enzyme and / or a fluorescent substance. Since the monoclonal antibody of the present invention specifically reacts with TIM and exhibits an immune reaction, if the immune reaction is measured using these labeling substances as indicators, it is possible to accurately detect a very small amount of TIM in a test sample. it can. Compared to bioassays, labeled immunoassays are characterized by being able to analyze a large number of test samples at once, requiring less time and labor for analysis, and being highly accurate in analysis. Therefore, the detection method according to the present invention is extremely useful for process control and product quality control in manufacturing TIM. The present invention does not relate to the labeling of the monoclonal antibody or the labeling assay itself, and therefore will not be described in detail. For example, P. Thyssen, translated by Eiji Ishikawa, “Enzyme Immunoassay”, published in 1989 by Tokyo Chemical Dojin Various methods for this are described in detail.

以下、実施例に基づきこの発明を説明するが、斯界の技術水準においては、斯かる実施例は多種多様に改変可能である。斯かる技術水準に鑑み、この発明がこれら実施例のみに限定されるべきでないことは云うまでもない。   Hereinafter, the present invention will be described based on examples. However, in the state of the art, such examples can be variously modified. In view of such a technical level, it goes without saying that the present invention should not be limited only to these embodiments.

実施例１ ハイブリドーマの調製   Example 1 Preparation of hybridoma

実施例1-1 抗原の調製方法
大腸菌トリオースイソメラーゼ (TIM) のコード領域を含むDNA断片を得るため、大腸菌ゲノムを鋳型にして2種のオリゴヌクレオチドプライマー、
TIM-F (5'プライマー) 5'-CCCTGCGGCGGCCAATCTTCCTTTATTCGC-3'（配列番号１）と
TIM-R (3'プライマー) 5'-TAAGTGCCGGATATCGAAATCCGGCACCTG-3'（配列番号２）を用いてPCRを行った。PCR反応はPfu Turbo DNA ポリメラーゼ (Stratagene) を用いて、熱変性94℃30秒、アニーリング55℃1分、伸長反応72℃2分のサイクルを30回行った（以降のPCR反応も全て同じ条件で行った）。 Example 1-1 Antigen Preparation Method To obtain a DNA fragment containing the coding region of E. coli triose isomerase (TIM), two oligonucleotide primers using the E. coli genome as a template,
TIM-F (5 'primer) 5'-CCCTGCGGCGGCCAATCTTCCTTTATTCGC-3' (SEQ ID NO: 1)
PCR was performed using TIM-R (3 ′ primer) 5′-TAAGTGCCGGATATCGAAATCCGGCACCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 2). The PCR reaction was performed using Pfu Turbo DNA polymerase (Stratagene) 30 cycles of heat denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 1 minute, and extension reaction at 72 ° C for 2 minutes (all subsequent PCR reactions were performed under the same conditions). went).

得られたDNA断片をTAクローニングによりpGEM-T Easy Vector (Promega)に挿入した。クローニングしたDNAの塩基配列を解読し、これが大腸菌TIMをコードすることを確認した後、このDNAを鋳型にして2種のプライマー、TIMF57B (5'プライマー) 5'-CTGGATCCAGCCACATCATGCTGGGTGC-3' (下線部はBamHI切断認識部位) （配列番号３）と TIMRX (3'プライマー) 5'-TCACTCGAGAGCCTGTTTAGCCGCTTCTGC-3' (下線部はXhoI切断認識部位)（配列番号４）を用いてPCRを行い、N末端56個のアミノ酸を欠いた大腸菌トリオースイソメラーゼ (TIM F57) をコードするDNAを増幅した。得られたPCR断片をBamHIとXhoIで消化後、pGEX-KG (Guan & Dixon, Analytical Biochemistry 192: 262-267, 1991) のBamHI/XhoI部位に挿入した。発現ベクターを感染させた大腸菌XL-1 Blue MRF' (Stratagene) を0.5 mM isopropyl s-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) で処理することで、TIM F57のN末にグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）を付加した融合タンパク質 (GST-TIM F57) を発現させた。GST-TIM F57は大腸菌の封入体に濃縮されたため、凍結融解後、超音波破砕して得られた大腸菌粗抽出液から遠心分離で不溶画分を単離し、これをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) で分離した。GST-TIM F57を含むゲル部位を切り出し、2.5 mMトリスと19.2 mMグリシンを含む緩衝液（pH 8.2）中で電気溶出によりGST-TIM F57を精製した。精製した融合タンパク質は超純水で透析後、ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を測定し、0.05 mg/mlの濃度に調整した後にマウスへの免疫に使用した。 The obtained DNA fragment was inserted into pGEM-T Easy Vector (Promega) by TA cloning. After decoding the base sequence of the cloned DNA and confirming that it encodes E. coli TIM, two primers, TIMF57B (5 'primer) 5'-CT GGATCC AGCCACATCATGCTGGGTGC-3' (underlined) Part is PCR using BamHI cleavage recognition site (SEQ ID NO: 3) and TIMRX (3 'primer) 5'-TCA CTCGAG AGCCTGTTTAGCCGCTTCTGC-3' (underlined is XhoI cleavage recognition site) A DNA encoding E. coli triose isomerase (TIM F57) lacking the terminal 56 amino acids was amplified. The obtained PCR fragment was digested with BamHI and XhoI and then inserted into the BamHI / XhoI site of pGEX-KG (Guan & Dixon, Analytical Biochemistry 192: 262-267, 1991). Glutathione S-transferase (GST) was added to the N-terminus of TIM F57 by treating Escherichia coli XL-1 Blue MRF '(Stratagene) infected with the expression vector with 0.5 mM isopropyl sD-1-thiogalactopyranoside (IPTG) A fusion protein (GST-TIM F57) was expressed. Since GST-TIM F57 was concentrated in E. coli inclusion bodies, the insoluble fraction was isolated by centrifugation from the crude E. coli extract obtained by sonication after freezing and thawing, and this was isolated from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Separation by electrophoresis (SDS-PAGE). The gel part containing GST-TIM F57 was cut out and GST-TIM F57 was purified by electroelution in a buffer solution (pH 8.2) containing 2.5 mM Tris and 19.2 mM glycine. The purified fusion protein was dialyzed with ultrapure water, the protein concentration was measured by the Bradford method, adjusted to a concentration of 0.05 mg / ml, and used for immunization of mice.

抗TIMモノクローナル抗体のスクリーニングに使用する目的で、N末にＴ7タグ、Ｃ末にヒスチジンタグを付加した大腸菌トリオースイソメラーゼ（T7-TIM F1-His）を以下のように作製した。上記のTAクローニングで得られたTIM DNAを鋳型として2種のプライマー、TIMF1B (5'プライマー) 5'-GAGGATCCATGCGACATCCTTTAGTGAT-3'(下線部はBamHI部位) （配列番号５）と TIMRX (上述）を用いてPCRを行い、全長大腸菌TIM (TIM F1) を増幅した。得られたPCR断片はBamHIとXhoIで消化し、pET21a (Novagen) のBamHI/XhoI部位に挿入した。得られた発現ベクターを大腸菌BL21 (DE3) plysSに感染させ、0.5 mM IPTGにより融合タンパク質T7-TIM F1-Hisを発現させた。融合タンパク質は亜鉛キレート樹脂（TALON metal affinity resin, BD Bioscience) で部分精製した後、GST-TIM F57と同様にSDS-PAGEで分離後、電気溶出により精製した。精製した融合タンパク質は超純水に溶解し、ELISA法および免疫ブロット法によるハイブリドーマのスクリーニングに用いた。 For the purpose of screening for anti-TIM monoclonal antibody, E. coli triose isomerase (T7-TIM F1-His) with a T7 tag added to the N terminus and a histidine tag added to the C terminus was prepared as follows. Two primers, TIMF1B (5 'primer) 5'-GA GGATCC ATGCGACATCCTTTAGTGAT-3' (underlined BamHI site) (SEQ ID NO: 5) and TIMRX (above) PCR was performed to amplify full-length E. coli TIM (TIM F1). The obtained PCR fragment was digested with BamHI and XhoI and inserted into the BamHI / XhoI site of pET21a (Novagen). The obtained expression vector was infected with E. coli BL21 (DE3) plysS, and the fusion protein T7-TIM F1-His was expressed with 0.5 mM IPTG. The fusion protein was partially purified with a zinc chelate resin (TALON metal affinity resin, BD Bioscience), separated by SDS-PAGE in the same manner as GST-TIM F57, and purified by electroelution. The purified fusion protein was dissolved in ultrapure water and used for screening of hybridomas by ELISA and immunoblotting.

大腸菌TIMと他の生物種TIMのアミノ酸配列の比較を図1に、TIM F57のアミノ酸配列を図2に、抗原として使用したGST-TIM F57のSDS-PAGE像を図3に示す。   FIG. 1 shows a comparison of the amino acid sequences of E. coli TIM and other species TIM, FIG. 2 shows the amino acid sequence of TIM F57, and FIG. 3 shows an SDS-PAGE image of GST-TIM F57 used as an antigen.

実施例1-2 抗原の免疫方法
GST-TIM F57 (0.05 mg/ml) 0.4 mlと完全フロインドアジュバント (Complete Freund's Adjuvant) 0.4 mlを、連結した2本の注射筒を用いてwater in oil の状態になるまで良く混合し、6週齢のBalb/cメスマウス2匹の腹腔に0.4 mlずつ投与した。10日後、GST-TIM F57 (0.05 mg/ml) 0.4 mlと不完全フロインドアジュバント (Incomplete Freund's Adjuvant) 0.4 ml を混合した液を上記のマウス腹腔に0.4 mlずつ投与した。その後、同様の抗原注射を10日間隔で2回行った。最初の抗原注射から40日後、GST-TIM F57溶液 (0.05 mg/ml) のみを上記2匹のマウスの腹腔に0.2 mlずつ投与し、その3日後にマウスから脾臓を摘出し、モノクローナル抗体を作製した。 Example 1-2 Antigen Immunization Method
GST-TIM F57 (0.05 mg / ml) 0.4 ml and complete Freund's Adjuvant 0.4 ml are mixed well using two connected syringes until it becomes water in oil. 0.4 ml each was administered to the abdominal cavity of two female Balb / c mice. Ten days later, 0.4 ml of a mixture of 0.4 ml of GST-TIM F57 (0.05 mg / ml) and 0.4 ml of incomplete Freund's Adjuvant was administered to the abdominal cavity of the mouse. Thereafter, similar antigen injections were performed twice at 10-day intervals. 40 days after the first antigen injection, only GST-TIM F57 solution (0.05 mg / ml) was administered to the abdominal cavity of the above 2 mice 0.2 ml at a time, and 3 days later, the spleen was removed from the mouse to produce a monoclonal antibody. did.

実施例1-3 融合方法
摘出したマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞 (PAI) を混合し、50%ポリエチレングリコール4000を融合促進剤として細胞融合を行なった。融合後の細胞は10%牛血清を含む60 ml のHAT培地に懸濁し、1穴あたり100μlずつ、96穴プレート6枚に分注した。 Example 1-3 Fusion Method Spleen cells and myeloma cells (PAI) of isolated mice were mixed, and cell fusion was performed using 50% polyethylene glycol 4000 as a fusion accelerator. The fused cells were suspended in 60 ml of HAT medium containing 10% bovine serum, and 100 μl per well was dispensed into six 96-well plates.

実施例1-4 スクリーニング方法
2匹のマウスから得た96穴プレート12枚は、5% CO2インキュベーター中、37℃で培養した。培養上清をT7-TIM F1-Hisを吸着させたマイクロタイタープレートを用いてELISA法によりスクリーニングし、抗体産生陽性ウエルを1つ得た。このウエル中の細胞を限界希釈法によりクローニングし、T7-TIM F1-Hisを用いたELISA法により22個の抗体産生陽性ウエルを得た。最終的にT7-TIM F1-Hisを発現する大腸菌粗抽出液を用いた免疫ブロット法によりスクリーニングを行い、抗体産生能が最も高いクローン1個を選別した。他の21クローンから得た培養上清を同様に調査したところ、選んだクローンと全く同じ染色パターンを示したため、これらの細胞はすべて同じクローンであると判断した。 Example 1-4 Screening Method
Twelve 96-well plates obtained from two mice were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. The culture supernatant was screened by ELISA using a microtiter plate adsorbed with T7-TIM F1-His, and one antibody-producing positive well was obtained. Cells in this well were cloned by limiting dilution, and 22 antibody production positive wells were obtained by ELISA using T7-TIM F1-His. Finally, screening was performed by immunoblotting using an E. coli crude extract expressing T7-TIM F1-His, and one clone with the highest antibody-producing ability was selected. When the culture supernatants obtained from the other 21 clones were examined in the same manner, they showed exactly the same staining pattern as the selected clones. Therefore, it was judged that these cells were all the same clones.

実施例2 得られた培養上清の特徴
得られたモノクローナル抗体のクラスは軽鎖に(鎖を持つIgG1であった。このモノクローナル抗体はT7-TIM F1-Hisを発現する大腸菌の粗抽出液に対する免疫ブロット法で、特異的に大腸菌TIM（リコンビナントタンパク質と内在性タンパク質の両方）を認識した。また、この抗体はアフリカツメガエル卵母細胞からの粗抽出液に対する免疫ブロット法で内在性ツメガエルTIMも認識し、種を超えて広くTIMを検出できることが明らかとなった(図4)。 Features Class monoclonal antibody obtained in Example 2 obtained culture supernatant was IgG 1 having a (chain light chain. Crude extract of E. coli This monoclonal antibody expressing T7-TIM F1-His Specifically recognized E. coli TIM (both recombinant protein and endogenous protein), and this antibody was also detected by immunoblotting on crude extracts from Xenopus oocytes. It was revealed that TIM can be detected widely across species (Fig. 4).

実施例3 腹水の作成方法及び精製方法
週齢のBalb/cメスマウスの腹腔に0.5 mlのプリスタンを注射し、10日後にも同量のプリスタンを注射した。二回目のプリスタン注射から3日後、75 mm2フラスコで70%コンフルエントに達したハイブリドーマを遠心で回収し、その全量をマウスの腹腔に注射した。腹水作製に使用したマウスは6匹で、ハイブリドーマの注射10日後に腹水を採取した。マウス腹水1.6 mlを透析膜に移し、PBS緩衝液(pH7.0)100 mlで3回透析を繰り返して、十分に低分子物質を取り除き、PBS緩衝液(pH7.0)に置換した。この溶液を0.45μmフィルターでろ過した後、HiTrap protein-G(1 ml)にアプライし、素通り分画のフラクション(1) を得た。次にPBS緩衝液(pH7.0) 10mlで溶出して、洗浄分画のフラクション(2) を得た。更に100 mMグリシン緩衝液(pH 2.7) 5mlで溶出して、吸着分画のフラクション(3) を得た。このフラクション(1) (2) (3) のタンパク量を測定したのち、SDS-PAGEで確認を行ったところ、フラクション(1) (2) では多数のバンドが認められたが、フラクション(3) は分子量15万付近に1本のバンドのみが認められた。このフラクション(3) について、TIMに対する結合活性を確認したところ、良好な結合活性が認められた。以上の操作により、抗TIMマウスモノクローナル抗体（IgGフラクション）を得た。 Example 3 Ascites Preparation Method and Purification Method 0.5 ml of pristane was injected into the abdominal cavity of a week-old Balb / c female mouse, and the same amount of pristane was injected 10 days later. Three days after the second pristane injection, the hybridoma that reached 70% confluence in a 75 mm 2 flask was collected by centrifugation, and the entire amount was injected into the abdominal cavity of the mouse. Six mice were used to produce ascites, and ascites was collected 10 days after the hybridoma injection. 1.6 ml of mouse ascites was transferred to a dialysis membrane, and dialysis was repeated 3 times with 100 ml of PBS buffer (pH 7.0) to sufficiently remove low molecular weight substances and replaced with PBS buffer (pH 7.0). This solution was filtered through a 0.45 μm filter and then applied to HiTrap protein-G (1 ml) to obtain a fraction (1) of the flow-through fraction. Next, elution was performed with 10 ml of PBS buffer (pH 7.0) to obtain a fraction (2) of the washed fraction. Further, elution was performed with 5 ml of 100 mM glycine buffer (pH 2.7) to obtain a fraction (3) of the adsorption fraction. After measuring the amount of protein in fractions (1), (2), and (3), and confirming by SDS-PAGE, a large number of bands were observed in fractions (1) and (2). Only one band was observed around 150,000 molecular weight. With respect to this fraction (3), when the binding activity to TIM was confirmed, a good binding activity was observed. By the above operation, an anti-TIM mouse monoclonal antibody (IgG fraction) was obtained.

実施例4 抗体カラムの作製方法
BIO-RAD社製アフィゲルHzイムノアフィニティーキット(153-6060)を使用し、キットに付属の説明書に従って抗TIMマウスIgGをゲルに結合させた。具体的には以下の通りの操作を行った。 Example 4 Preparation method of antibody column
Using an Affigel Hz immunoaffinity kit (153-6060) manufactured by BIO-RAD, anti-TIM mouse IgG was bound to the gel according to the instructions attached to the kit. Specifically, the following operations were performed.

IgG(抗体)の酸化Oxidation of IgG (antibody)

IgGカップリングIgG coupling

実施例5 抗体カラムによるTIM除去GPOの調製
抗体カラムによるGPO中TIM除去方法
Example 5 Preparation of TIM-removed GPO by antibody column
Removal of TIM in GPO using antibody column

実施例6 抗体カラムによりTIMを除去したGPOを使用した酵素サイクリング反応
反応試液
50 mM TEA 緩衝液 (pH 9.5)
GAPDH 15単位/ml
POD 2単位/ml
LDH 40単位/ml
Glyceraldehyde-3-phosphate(GAP) 1 mM
Lactate 8 mM
Amplex Red 20μM
NAD 0.16 mM
試料
フラクション1(134単位/ml GPO) Example 6 Enzymatic cycling reaction using GPO with TIM removed by antibody column
Reaction reagent
50 mM TEA buffer (pH 9.5)
GAPDH 15 units / ml
POD 2 units / ml
LDH 40 units / ml
Glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) 1 mM
Lactate 8 mM
Amplex Red 20μM
NAD 0.16 mM
Sample fraction 1 (134 units / ml GPO)

測定方法
反応試液250μlに試料を2μl加えて、蛍光マイクロプレートリーダー（コロナ社製ＭＴＰ−２０００ＦＰ）で励起波長550 nm、蛍光波長590 nmを使用して37℃での蛍光強度を測定した。図5に示すようなブランク反応のタイムコースが得られ、比較例1に比べて20％以上ブランクを抑えることが出来た。
GPO：グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ
GAPDH：グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ
POD：パーオキシダーゼ
LDH：ラクテートデヒドロゲナーゼ Measurement Method 2 μl of the sample was added to 250 μl of the reaction sample solution, and the fluorescence intensity at 37 ° C. was measured using an excitation wavelength of 550 nm and a fluorescence wavelength of 590 nm with a fluorescence microplate reader (MTP-2000FP manufactured by Corona). A blank reaction time course as shown in FIG. 5 was obtained, and compared to Comparative Example 1, blanks could be suppressed by 20% or more.
GPO: Glycerol-3-phosphate oxidase
GAPDH: Glycerol-3-phosphate dehydrogenase
POD: Peroxidase
LDH: Lactate dehydrogenase

比較例１ 未処理のGPOを使用した酵素サイクリング反応
抗体カラムによりTIMを除去しない未処理のGPOを使用して、実施例1と同様の測定操作を行った。図5に示すようなブランク反応のタイムコースが得られた。 Comparative Example 1 Enzymatic Cycling Reaction Using Untreated GPO The same measurement procedure as in Example 1 was performed using untreated GPO that did not remove TIM by the antibody column. A time course of blank reaction as shown in FIG. 5 was obtained.

実施例７ 抗体カラムによるTIM除去GAPDHの調製
抗体カラムによるGPO中TIM除去方法
Example 7 Preparation of TIM-removed GAPDH by antibody column
Removal of TIM in GPO using antibody column

実施例8 抗体カラムによりTIMを除去したGAPDHを使用した酵素サイクリング反応
反応試液
100 mMグリシン 緩衝液 (pH 9.5)
カラム処理GAPDH 250単位/ml
NADH 0.4 mM
チオNAD 10 mM
基質液
Glyceraldehyde-3-phosphate(GAP) 1 mM
測定方法
反応試液190 μlをマイクロプレートに分注し、次に基質液を5μlとDWを5μl加えて、マイクロプレートリーダー（コロナ社製ＭＴＰ−５００Lab）で405 nmのフィルターを使用して37℃での吸光度変化を測定した。 Example 8 Enzyme cycling reaction using GAPDH with TIM removed by antibody column
Reaction reagent
100 mM glycine buffer (pH 9.5)
Column processing GAPDH 250 units / ml
NADH 0.4 mM
Thio NAD 10 mM
Substrate solution
Glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) 1 mM
Method of measurement Dispense 190 μl of the reaction solution into a microplate, add 5 μl of substrate solution and 5 μl of DW, and use a 405 nm filter with a microplate reader (Corona MTP-500Lab) at 37 ° C. The change in absorbance was measured.

図6に示すようなブランク反応のタイムコースが得られ、比較例2に比べて半分以下にブランクを抑えることが出来た。   A time course of blank reaction as shown in FIG. 6 was obtained, and blanks could be suppressed to half or less compared to Comparative Example 2.

比較例2 未処理のGAPDHを使用した酵素サイクリング反応
抗体カラムによりTIMを除去しない未処理のGAPDHを使用して、実施例２と同様の測定操作を行った。図6に示すようなブランク反応のタイムコースが得られた。 Comparative Example 2 Enzymatic Cycling Reaction Using Untreated GAPDH Using the untreated GAPDH in which TIM was not removed by the antibody column, the same measurement operation as in Example 2 was performed. A time course of blank reaction as shown in FIG. 6 was obtained.

本発明を応用した検査法を確立することにより、BSE検査や血液製剤のウイルス検査における検出感度不足による汚染食品や輸血製剤による感染防御に極めて有効な方法になりうる。また、末梢血からの超早期がん診断が可能になる。
その他、今後急速に市場が拡大する分野では、遺伝子組換え医薬品・抗体医薬・再生医療・組織工学から由来する製品の厳密で高感度な品質保証のための超高感度残留タンパク質（異種由来タンパク質）の検出系にも汎用的に利用することが可能と思われる。
また研究用試薬、環境計測、バイオセンサー等への直接的な利用も見込まれる。 By establishing a test method to which the present invention is applied, it can be an extremely effective method for the prevention of infection by contaminated foods and transfusion products due to insufficient detection sensitivity in BSE tests and virus tests of blood products. In addition, ultra-early cancer diagnosis from peripheral blood becomes possible.
In other fields where the market will rapidly expand in the future, ultra-sensitive residual proteins (heterogeneous proteins) for strict and sensitive quality assurance of products derived from genetically modified drugs, antibody drugs, regenerative medicine, and tissue engineering It seems that it can be used for a general purpose detection system.
In addition, direct use for research reagents, environmental measurement, biosensors, etc. is also expected.

大腸菌TIMと他の生物におけるTIMのアミノ酸配列の比較Comparison of amino acid sequences of TIM in Escherichia coli TIM and other organisms 抗原に使用した大腸菌TIM F57のアミノ酸配列Amino acid sequence of E. coli TIM F57 used for antigen 抗原に使用したGST-TIM F57のSDS-PAGESDS-PAGE of GST-TIM F57 used for antigen 抗大腸菌TIMモノクローナル抗体による免疫ブロットImmunoblotting with anti-E. Coli TIM monoclonal antibody 抗体カラムによりTIMを除去したGPOを使用した酵素サイクリング反応Enzymatic cycling using GPO with TIM removed by antibody column 抗体カラムによりTIMを除去したGAPDHを使用した酵素サイクリング反応Enzymatic cycling reaction using GAPDH with TIM removed by antibody column

Claims (21)

トリオースフォスフェートイソメラーゼまたはトリオースフォスフェートイソメラーゼの断片に特異的に結合する抗体。 An antibody that specifically binds to triphosphate phosphate isomerase or a fragment of triphosphate phosphate isomerase. トリオースフォスフェートイソメラーゼが、哺乳類、両生類、細菌および酵母から成る群から選ばれる少なくとも1種の生物に由来する酵素である請求項１に記載の抗体。 2. The antibody according to claim 1, wherein the triosephosphate isomerase is an enzyme derived from at least one organism selected from the group consisting of mammals, amphibians, bacteria, and yeasts. トリオースフォスフェートイソメラーゼが大腸菌由来の酵素である請求項１に記載の抗体。 The antibody according to claim 1, wherein the triphosphate phosphate isomerase is an enzyme derived from E. coli. ＩｇＧである請求項１〜３のいずれかに記載の抗体。 The antibody according to any one of claims 1 to 3, which is IgG. 請求項１〜４のいずれかに記載の抗体と担体とからなり、前記抗体が前記担体に固定化されている、抗体固定化担体。 An antibody-immobilized carrier comprising the antibody according to any one of claims 1 to 4 and a carrier, wherein the antibody is immobilized on the carrier. 請求項１〜４のいずれかに記載の抗体、および／または請求項５に記載の抗体固定化担体とトリオースフォスフェートイソメラーゼ含有原料とを接触させ、前記原料に含まれるトリオースフォスフェートイソメラーゼと前記抗体とを結合させる工程、
抗体と結合しなかった前記原料に含まれる成分を前記抗体および／または抗体固定化担体と分離する工程、並びに
前記抗体と結合した成分を抗体から脱離して、トリオースフォスフェートイソメラーゼを含む画分を回収する工程
とを含む、原料より純度の高いトリオースフォスフェートイソメラーゼを含む画分の調製方法。 The antibody according to any one of claims 1 to 4 and / or the antibody-immobilized carrier according to claim 5 and a triphosphate isomerase-containing raw material are contacted, and the triphosphate phosphate isomerase contained in the raw material Binding the antibody;
A step of separating the component contained in the raw material that did not bind to the antibody from the antibody and / or the antibody-immobilized carrier, and a fraction containing triphosphate isomerase by detaching the component bound to the antibody from the antibody A method for preparing a fraction containing triosephosphate isomerase having a purity higher than that of a raw material. 請求項１〜４のいずれかに記載の抗体、および／または請求項５に記載の抗体固定化担体とトリオースフォスフェートイソメラーゼと目的物質とを含有する原料とを接触させ、前記原料に含まれるトリオースフォスフェートイソメラーゼと前記抗体とを結合させる工程、並びに
抗体と結合しなかった前記目的物質を含む成分を前記抗体および／または抗体固定化担体と分離する工程、
とを含む、原料よりトリオースフォスフェートイソメラーゼ濃度を低減した、目的物質を含む画分の製造方法。 The antibody according to any one of claims 1 to 4 and / or the antibody-immobilized carrier according to claim 5, a raw material containing triphosphate isomerase and a target substance are brought into contact with each other, and are contained in the raw material. A step of binding the triosephosphate isomerase and the antibody, and a step of separating a component containing the target substance that did not bind to the antibody from the antibody and / or an antibody-immobilized carrier.
A method for producing a fraction containing a target substance, wherein the triphosphate phosphate isomerase concentration is reduced from the raw material. トリオースフォスフェートイソメラーゼと目的物質とを含有する原料に含まれる目的物質が、グリセルアルデヒド-3-リン酸、ラクテート、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、NAD及び／又はNADH、並びにトリエタノールアミンから成る群から選ばれる少なくとも1種の物質である請求項７に記載の製造方法。 The target substance contained in the raw material containing triosephosphate isomerase and the target substance is glyceraldehyde-3-phosphate, lactate, glycerol-3-phosphate dehydrogenase, glycerol-3-phosphate oxidase, lactate dehydrogenase, The production method according to claim 7, which is at least one substance selected from the group consisting of peroxidase, NAD and / or NADH, and triethanolamine. トリオースフォスフェートイソメラーゼと目的物質とを含有する原料が、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬、ラクテート含有試薬、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、ペルオキシダーゼ含有試薬、NAD及び／又はNADH含有試薬、並びにトリエタノールアミン含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬である請求項７に記載の製造方法。 A raw material containing triphosphate phosphate isomerase and a target substance is a glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent, a lactate-containing reagent, a glycerol-3-phosphate dehydrogenase-containing reagent, a glycerol-3-phosphate oxidase-containing reagent, The production method according to claim 7, which is at least one reagent selected from the group consisting of a lactate dehydrogenase-containing reagent, a peroxidase-containing reagent, a NAD and / or NADH-containing reagent, and a triethanolamine-containing reagent. 前記抗体と結合した成分を抗体から脱離して、トリオースフォスフェートイソメラーゼを含む画分を回収する工程をさらに含む、請求項７〜９のいずれかに記載の製造方法。 The production method according to any one of claims 7 to 9, further comprising a step of desorbing a component bound to the antibody from the antibody and recovering a fraction containing triphosphate isomerase. トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が1単位に対して5×10-11単位以下に低減されたグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、及びペルオキシダーゼ含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬。 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase-containing reagent, glycerol-3-phosphate oxidase-containing reagent, lactate dehydrogenase-containing reagent in which the content of triosephosphate isomerase is reduced to 5 × 10 -11 units or less per unit And at least one reagent selected from the group consisting of peroxidase-containing reagents. グリセルアルデヒド-3-リン酸を基質として用い、かつトリオースフォスフェートイソメラーゼを標識酵素として用いた酵素抗体免疫測定方法であって、前記グリセルアルデヒド-3-リン酸は、トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減されたグリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬として供給される前記方法。 An enzyme antibody immunoassay method using glyceraldehyde-3-phosphate as a substrate and triphosphate phosphate isomerase as a labeling enzyme, wherein the glyceraldehyde-3-phosphate is a triphosphate phosphate isomerase The method as described above, wherein the glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent with a reduced content is supplied. 前記酵素抗体免疫反応の生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトを酵素サイクリング法により増感して定量する系をさらに含む、請求項１２に記載の方法。 The method according to claim 12, further comprising a system for sensitizing and quantifying dihydroxyacetone-3-phosphate, which is a product of the enzyme antibody immune reaction, by an enzyme cycling method. 前記酵素サイクリング法が、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ(GPO)、およびラクテートヒドロゲナーゼ(LDH)を用いてジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトから過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を定量することを含む方法である請求項１２または１３に記載の方法。 The enzyme cycling method generates hydrogen peroxide from dihydroxyacetone-3-phosphate using glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), glycerol-3-phosphate oxidase (GPO), and lactate hydrogenase (LDH) The method according to claim 12 or 13, wherein the method comprises quantifying hydrogen peroxide produced. トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬、ラクテート含有試薬、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、ペルオキシダーゼ含有試薬、NAD及び／又はNADH含有試薬、並びにトリエタノールアミン含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬を用いる、請求項１４に記載の方法。 Glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent, lactate-containing reagent, glycerol-3-phosphate dehydrogenase-containing reagent, glycerol-3-phosphate oxidase-containing reagent, lactate dehydrogenase with reduced triosephosphate isomerase content The method according to claim 14, wherein at least one reagent selected from the group consisting of a reagent containing a reagent, a reagent containing peroxidase, a reagent containing NAD and / or NADH, and a reagent containing triethanolamine is used. グリセルアルデヒド-3-リン酸を基質として用い、かつトリオースフォスフェートイソメラーゼを標識酵素として用いた酵素抗体免疫反応を利用し、かつ前記酵素抗体免疫反応の生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトを酵素サイクリング法により増感して定量する系をさらに含む酵素抗体免疫測定方法であって、
前記酵素サイクリング法が、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ(GPO)、およびラクテートヒドロゲナーゼ(LDH)を用いてジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトから過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を定量することを含む方法であり、かつ
トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬、ラクテート含有試薬、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、ペルオキシダーゼ含有試薬、NAD及び／又はNADH含有試薬、並びにトリエタノールアミン含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬を用いる、前記方法。 Dihydroxyacetone-3-phosphate, which utilizes an enzyme antibody immune reaction using glyceraldehyde-3-phosphate as a substrate and triosephosphate isomerase as a labeling enzyme, and is a product of the enzyme antibody immune reaction An enzyme antibody immunoassay method further comprising a system for sensitizing and quantifying fate by an enzyme cycling method,
The enzyme cycling method generates hydrogen peroxide from dihydroxyacetone-3-phosphate using glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), glycerol-3-phosphate oxidase (GPO), and lactate hydrogenase (LDH) A glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent, a lactate-containing reagent, glycerol-3-, wherein the glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent has a reduced content of triphosphate phosphate isomerase. At least one reagent selected from the group consisting of a phosphate dehydrogenase-containing reagent, a glycerol-3-phosphate oxidase-containing reagent, a lactate dehydrogenase-containing reagent, a peroxidase-containing reagent, an NAD and / or NADH-containing reagent, and a triethanolamine-containing reagent Using said method. グリセルアルデヒド-3-リン酸を基質として用い、かつトリオースフォスフェートイソメラーゼを標識酵素として用いた酵素抗体免疫測定方法に用いるキットであって、トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬を含む、前記キット。 A kit used for an enzyme antibody immunoassay method using glyceraldehyde-3-phosphate as a substrate and triphosphate phosphate isomerase as a labeling enzyme, wherein the content of triphosphate phosphate isomerase is reduced. The kit comprising a glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent. グリセルアルデヒド-3-リン酸を基質として用い、かつトリオースフォスフェートイソメラーゼを標識酵素として用いた酵素抗体免疫反応を利用し、かつ前記酵素抗体免疫反応の生成物であるジヒドロキシアセトン-3-フォスフェイトを酵素サイクリング法により増感して定量する系をさらに含む酵素抗体免疫測定方法に用いるキットであって、
トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が低減された、グリセルアルデヒド-3-リン酸含有試薬、ラクテート含有試薬、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、ペルオキシダーゼ含有試薬、NAD及び／又はNADH含有試薬、並びにトリエタノールアミン含有試薬から成る群から選ばれる少なくとも1種の試薬を含む、前記キット。 Dihydroxyacetone-3-phosphate, which utilizes an enzyme antibody immune reaction using glyceraldehyde-3-phosphate as a substrate and triosephosphate isomerase as a labeling enzyme, and is a product of the enzyme antibody immune reaction A kit used for an enzyme antibody immunoassay method further comprising a system for sensitizing and quantifying fate by an enzyme cycling method,
Glyceraldehyde-3-phosphate-containing reagent, lactate-containing reagent, glycerol-3-phosphate dehydrogenase-containing reagent, glycerol-3-phosphate oxidase-containing reagent, lactate dehydrogenase with reduced triosephosphate isomerase content The kit comprising at least one reagent selected from the group consisting of a reagent containing a reagent, a reagent containing peroxidase, a reagent containing NAD and / or NADH, and a reagent containing triethanolamine. 前記グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ含有試薬、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ含有試薬、ラクテートデヒドロゲナーゼ含有試薬、及びペルオキシダーゼ含有試薬は、トリオースフォスフェートイソメラーゼの含有量が1単位に対して5×10-11単位以下に低減されたものである請求項１８に記載のキット。 The glycerol-3-phosphate dehydrogenase-containing reagents, glycerol-3-phosphate oxidase-containing reagent, lactate dehydrogenase-containing reagent and peroxidase-containing reagent, triose phosphate isomerase content of 5 × 10 per unit of - The kit according to claim 18, wherein the kit is reduced to 11 units or less. 請求項１〜４のいずれかに記載の抗体を被験試料に接触せしめ、免疫反応によりトリオースフォスフェートイソメラーゼを検出および／または測定する方法。 A method for detecting and / or measuring triphosphate phosphate isomerase by contacting an antibody according to any one of claims 1 to 4 with a test sample and performing an immune reaction. 抗体が放射性物質、酵素及び／又は蛍光物質により標識されている請求項２０に記載の方法。 The method according to claim 20, wherein the antibody is labeled with a radioactive substance, an enzyme and / or a fluorescent substance.
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