JP6979200B2 - Antibodies for detecting leptospira antigens used in the diagnosis of leptospirosis - Google Patents
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Description
本発明は，レプトスピラ症の診断に用いる病原性レプトスピラ抗原検出用抗体等に関する。さらに詳しくいうと本発明は，レプトスピラ症の診断を可能とするための3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenaseに対する抗体，ならびにこの抗体を用いたレプトスピラ症診断方法に関する。 The present invention relates to an antibody for detecting a pathogenic leptospiral antigen used for diagnosing leptospirosis and the like. More specifically, the present invention relates to an antibody against 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase for enabling the diagnosis of leptospirosis, and a method for diagnosing leptospirosis using this antibody.
レプトスピラ症（Leptospirosis）は，熱帯や亜熱帯などの地域を中心に広く分布する人獣共通感染症である。
レプトスピラ症の患者発生は全世界で年間約30〜50万人，致死率は23%にのぼると推測されている。また，病原性レプトスピラは250以上の血清型があり，正確な同定には，時間と高度の専門技術が必要となってくる。加えて，レプトスピラ症は，他の感染症（マラリア，デング等）と臨床症状が酷似していることもあり，正確な診断を困難としている。
Leptospirosis is a zoonotic disease that is widely distributed mainly in areas such as the tropics and subtropics.
It is estimated that the incidence of leptospirosis is about 300,000 to 500,000 per year worldwide, and the case fatality rate is 23%. In addition, pathogenic Leptospira has more than 250 serotypes, and accurate identification requires time and a high degree of expertise. In addition, leptospirosis is difficult to make an accurate diagnosis because its clinical symptoms are very similar to those of other infectious diseases (malaria, dengue, etc.).
これらの事情から，レプトスピラ症を適切に治療するとともに感染拡大を防ぐためには，早期発見ならびに正確な診断が重要となってくる。このことから，医療現場では，特異度・感度，ともに高い，病原性レプトスピラの迅速診断キットの開発が期待されており，研究が進められている（非特許文献１）。 Under these circumstances, early detection and accurate diagnosis are important in order to properly treat leptospirosis and prevent the spread of infection. For this reason, the development of a rapid diagnostic kit for pathogenic Leptospira with high specificity and sensitivity is expected in the medical field, and research is underway (Non-Patent Document 1).
非特許文献１には，レプトスピラ症として，フィリピンで分離される血清型Manilaeの菌株で感染させたハムスターの尿中において，菌由来の酵素（3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，以下，「HADH」と略する）が検出されること，ならびに，これに関する抗血清が作製されたことが開示されている。
先行技術において作製された抗血清は，尿中におけるHADHを検出することで，レプトスピラ症の感染有無の診断が期待できる点において有用である。
しかし，この先行技術における抗血清は，HADHのみならず他のバンドも検出してしまう。そのため，この先行技術は，レプトスピラ症に感染しておらず，HADHが検出されないはずのハムスターにおいても非特異的な検出を示すことから，必ずしもレプトスピラ症の感染を正確に診断することができない。
そのため，HADHのみを検出する特異性の高い技術の開発が強く望まれていた。
In
The antiserum produced in the prior art is useful in that it can be expected to diagnose the presence or absence of leptospirosis infection by detecting HADH in urine.
However, the antiserum in this prior art detects not only HADH but also other bands. Therefore, this prior art does not necessarily accurately diagnose leptospirosis infection because it is not infected with leptospirosis and shows non-specific detection even in hamsters in which HADH should not be detected.
Therefore, it has been strongly desired to develop a highly specific technology for detecting only HADH.
そこで，発明者は，先行技術におけるHADH自体の検出では，レプトスピラ症感染の正確な診断ができない可能性があることに気づいた。
すなわち，HADHは，病原性レプトスピラだけでなく，非病原性レプトスピラにおいても存在する。そのため，HADHそのものを検出したとしても，非病原性レプトスピラを検出する場合があり，この場合，偽陽性として検出することとなってしまい，正確な診断ができない。
さらには，ヒトにおいて同様の報告は未だなく，レプトスピラ患者の尿中でハムスターの尿中と同様に，HADHを検出できるかも不明である。
Therefore, the inventor noticed that the detection of HADH itself in the prior art may not be able to make an accurate diagnosis of leptospirosis infection.
That is, HADH is present not only in pathogenic leptospira but also in non-pathogenic leptospira. Therefore, even if HADH itself is detected, non-pathogenic leptospira may be detected. In this case, it will be detected as a false positive, and an accurate diagnosis cannot be made.
Furthermore, there are no similar reports in humans, and it is unclear whether HADH can be detected in the urine of leptospirosis patients as well as in the urine of hamsters.
上記事情を背景として，本発明では，HADHに対して特異度の高い検出，ならびレプトスピラ症診断方法の開発を第一の課題とする。さらに本発明では，可能な限り病原性レプトスピラのみを検出し，特異度をより高めたレプトスピラ症の診断方法の開発を第二の課題とする。 Against the background of the above circumstances, the first subject of the present invention is the development of a detection method having high specificity for HADH and a method for diagnosing leptospirosis. Further, in the present invention, the second subject is to develop a diagnostic method for leptospirosis in which only pathogenic leptospirosis is detected as much as possible and the specificity is further enhanced.
発明者は，鋭意研究の結果，HADHに対するモノクローナル抗体の作製を行い，作製された抗HADHモノクローナル抗体がHADHに対する特異性が高いことを実験的に確認し，発明を完成させたものである。 As a result of diligent research, the inventor produced a monoclonal antibody against HADH, and experimentally confirmed that the produced anti-HADH monoclonal antibody had high specificity for HADH, and completed the invention.
加えて発明者は，病原性レプトスピラと非病原性レプトスピラにおけるHADHアミノ酸配列を比較し，診断に有用な複数のアミノ酸配列部位を明らかにした。さらに発明者は，複数のアミノ酸配列部位の中から，病原性レプトスピラ由来HADHのC末端に位置するアミノ酸配列に着目し，これに特異的な抗体（以下，「抗HADH断片抗体」）を作製したところ，非病原性レプトスピラ症由来HADHには反応せず，複数の血清型の病原性レプトスピラ由来HADHの検出が可能となることを見出し，発明を完成させたものである。 In addition, the inventor compared the HADH amino acid sequences in pathogenic and non-pathogenic Leptospira and clarified multiple amino acid sequence sites useful for diagnosis. Furthermore, the inventor focused on the amino acid sequence located at the C-terminal of pathogenic Leptospira-derived HADH from among multiple amino acid sequence sites, and produced an antibody specific to this (hereinafter, "anti-HADH fragment antibody"). However, they have found that they do not respond to non-pathogenic leptospirosis-derived HADH and can detect multiple serotypes of pathogenic leptospirosis-derived HADH, and have completed the invention.
さらに発明者は，抗HADHモノクローナル抗体ならびに抗HADH断片抗体を組み合わせて作製したELISAキットを完成させた。
このELISAキットを用いた，レプトスピラ症感染患者と健常者のヒト尿試料による実験において，健常者と比較してレプトスピラ症感染患者のOD値が有意に高い測定値が示された。この結果から，このELISAキットが，ヒト生体試料においてもHADHの検出が可能であるとともに，レプトスピラ症感染患者に対して特異度の高い検出が可能になることが明らかになった。
Furthermore, the inventor completed an ELISA kit prepared by combining an anti-HADH monoclonal antibody and an anti-HADH fragment antibody.
In an experiment using human urine samples of leptospirosis-infected patients and healthy subjects using this ELISA kit, the OD values of leptospirosis-infected patients were significantly higher than those of healthy subjects. From this result, it was clarified that this ELISA kit can detect HADH even in human biological samples and can detect leptospirosis-infected patients with high specificity.
本発明は，以下の構成からなる。
本発明の第一の構成は，HADHを抗原とすることを特徴とする抗HADHモノクローナル抗体である。
本発明の第二の構成は，第一の構成に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。
本発明の第三の構成は，第一の構成に記載の抗HADHモノクローナル抗体によりHADHの検出を行い，レプトスピラ感染の診断を行うレプトスピラ症診断方法である。
本発明の第四の構成は，HADHの検出が，ELISA又はイムノクロマトグラフィーのいずれかによる第三の構成に記載のレプトスピラ症診断方法である。
The present invention has the following configurations.
The first configuration of the present invention is an anti-HADH monoclonal antibody characterized by using HADH as an antigen.
The second configuration of the present invention is a hybridoma that produces the monoclonal antibody according to the first configuration.
The third configuration of the present invention is a method for diagnosing leptospirosis in which HADH is detected by the anti-HADH monoclonal antibody described in the first configuration to diagnose leptospirosis infection.
The fourth configuration of the present invention is the method for diagnosing leptospirosis according to the third configuration in which the detection of HADH is based on either ELISA or later chromatography.
本発明の第五の構成は，HADHにおける配列番号１から配列番号５に示されるアミノ酸配列のいずれか又は複数を検出することにより，病原性レプトスピラ感染の診断を行うことを特徴とするレプトスピラ症診断方法である。
本発明の第六の構成は，少なくとも配列番号５の検出を行うことを特徴とする第五の構成に記載のレプトスピラ症診断方法である。
本発明の第七の構成は，前記検出が，抗体により行われることを特徴とする第五又は第六の構成に記載のレプトスピラ症診断方法である。
本発明の第八の構成は，さらに，HADHを抗原とする抗HADH抗体と合わせて，HADHの検出を行う第五から第七の構成いずれかに記載のレプトスピラ症診断方法である。
本発明の第九の構成は，ELISA又はイムノクロマトグラフィーのいずれかを用いて検出を行う第五から第八の構成いずれかに記載のレプトスピラ症診断方法である。
本発明の第十の構成は，第五から第九の構成いずれかに記載のレプトスピラ症診断方法に用いられる抗体である。
本発明の第十一の構成は，第十の構成に記載の抗体を含むことを特徴とするレプトスピラ症診断キットである。
A fifth configuration of the present invention is a diagnosis of leptospirosis, which comprises detecting pathogenic leptospirosis infection by detecting any or a plurality of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 5 in HADH. The method.
The sixth configuration of the present invention is the method for diagnosing leptospirosis according to the fifth configuration, which comprises detecting at least SEQ ID NO: 5.
The seventh configuration of the present invention is the method for diagnosing leptospirosis according to the fifth or sixth configuration, wherein the detection is performed by an antibody.
The eighth configuration of the present invention is the method for diagnosing leptospirosis according to any one of the fifth to seventh configurations, which further detects HADH in combination with an anti-HADH antibody using HADH as an antigen.
The ninth configuration of the present invention is the method for diagnosing leptospirosis according to any of the fifth to eighth configurations, in which detection is performed using either ELISA or immunochromatography.
The tenth configuration of the present invention is an antibody used in the method for diagnosing leptospirosis according to any one of the fifth to ninth configurations.
The eleventh configuration of the present invention is a leptospirosis diagnostic kit comprising the antibody according to the tenth configuration.
本発明により，HADHに特異度の高い検出技術の提供ならびに，可能な限り病原性レプトスピラのみを検出し，特異度をより高めたレプトスピラ症の診断方法の提供が可能となった。
すなわち，本発明の抗HADHモノクローナル抗体ならびに抗HADH断片抗体は，HADHの特異度の高い検出を可能とするものであり，これを単独もしくは組み合わせて用いることにより，病原性レプトスピラに対して，より特異度の高い診断を可能とするものである。
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it has become possible to provide a detection technique having high specificity for HADH and to provide a diagnostic method for leptospirosis having higher specificity by detecting only pathogenic leptospira as much as possible.
That is, the anti-HADH monoclonal antibody and the anti-HADH fragment antibody of the present invention enable highly specific detection of HADH, and by using them alone or in combination, they are more specific to pathogenic leptospira. It enables a high degree of diagnosis.
本発明のレプトスピラ症診断方法等について説明を行う。 The method for diagnosing leptospirosis of the present invention will be described.
＜＜HADHを抗原とした抗HADHモノクローナル抗体＞＞
本発明のレプトスピラ症診断方法の第一の態様においては，HADH全長を抗原として検出を行うものであり，HADHを抗原とする抗HADHモノクローナル抗体を用いることを特徴とする。加えて，かかる抗HADHモノクローナル抗体ならびにこれを産生するハイブリドーマについても，発明者により完成された発明である。
<< Anti-HADH monoclonal antibody using HADH as an antigen >>
In the first aspect of the method for diagnosing leptospirosis of the present invention, the full length of HADH is used as an antigen for detection, and an anti-HADH monoclonal antibody using HADH as an antigen is used. In addition, the anti-HADH monoclonal antibody and the hybridoma producing the anti-HADH monoclonal antibody are also inventions completed by the inventor.
本発明において抗HADHモノクローナル抗体とは，HADH全長を抗原とするモノクローナル抗体として定義される。また，モノクローナル抗体とは，抗体を構成するアミノ酸配列において，単一クローン（単一分子種）のみからなる分子，もしくは分子の集合体として定義される。 In the present invention, the anti-HADH monoclonal antibody is defined as a monoclonal antibody having the entire length of HADH as an antigen. A monoclonal antibody is defined as a molecule consisting of only a single clone (single molecular species) or an aggregate of molecules in the amino acid sequence constituting the antibody.
モノクローナル抗体の種類について，HADHの検出が可能である限り特に限定する必要はなく種々のものを用いることができる。このようなモノクローナル抗体の種類として，例えば，ヒト抗体，マウス抗体，ウサギ抗体，キメラ抗体，マルチスペシフィック抗体，人工抗体などを用いればよい。また，本発明におけるHADH検出の趣旨に沿う範囲で，化学修飾を行った抗体や抗体フラグメントを用いることができる。 The type of monoclonal antibody is not particularly limited as long as HADH can be detected, and various types can be used. As a type of such a monoclonal antibody, for example, a human antibody, a mouse antibody, a rabbit antibody, a chimeric antibody, a multispecific antibody, an artificial antibody or the like may be used. Further, a chemically modified antibody or antibody fragment can be used within the range of the purpose of HADH detection in the present invention.
抗HADHモノクローナル抗体は，通常用いられる手法により作製することができる。このような手法として，例えば，ハイブリドーマ法，ファージディスプレイ法，遺伝子工学的手法などにより作製することができる。
一例として，ハイブリドーマ法（実験例１参照）では，免疫原としてリコンビナントHADHなどを用いて免疫したマウスなどの動物の脾臓ないしリンパ節から採取したＢ細胞と，不死化させたミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマの作製を行う。この作製されたハイブリドーマについてスクリーニングを行い，HADHとの特異的結合能を有するものなど，HADHの検出に有用なハイブリドーマを選択すればよい。
ハイブリドーマからモノクローナル抗体を得るには，ハイブリドーマの培養を行い，その培養上清として得ることができる。もしくは，ハイブリドーマと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ，その腹水として得ることができる。
Anti-HADH monoclonal antibodies can be prepared by commonly used techniques. As such a method, for example, it can be produced by a hybridoma method, a phage display method, a genetic engineering method, or the like.
As an example, in the hybridoma method (see Experimental Example 1), B cells collected from the spleen or lymph node of an animal such as a mouse immunized with recombinant HADH as an immunogen are fused with immortalized myeloma cells. To produce a hybridoma. The produced hybridomas may be screened and hybridomas useful for detecting HADH, such as those having a specific binding ability to HADH, may be selected.
To obtain a monoclonal antibody from a hybridoma, the hybridoma can be cultured and obtained as a culture supernatant thereof. Alternatively, it can be administered to a mammal compatible with the hybridoma to proliferate and obtained as ascites.
得られた抗HADHモノクローナル抗体は，均一になるまで精製することが望ましく，この場合，通常のタンパク質として用いられる分離・精製方法を用いることができる。このような手法として例えば，アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム，限外濾過，塩析，透析など，これらを単独もしくは組み合わせて用いればよい。 It is desirable to purify the obtained anti-HADH monoclonal antibody until it becomes uniform. In this case, a separation / purification method used as a normal protein can be used. As such a method, for example, a chromatography column such as affinity chromatography, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. may be used alone or in combination.
作製された抗HADHモノクローナル抗体を用いて，HADHの検出を行い，レプトスピラ症の診断を行えばよい。
HADHの検出については，HADHの検出が可能である限り特に限定する必要はなく，種々の免疫学的測定方法を用いることができる。このような手法として，例えば，ELISAやイムノクロマトグラフィーを用いることができる。
HADH may be detected and leptospirosis may be diagnosed using the prepared anti-HADH monoclonal antibody.
The detection of HADH is not particularly limited as long as HADH can be detected, and various immunological measurement methods can be used. As such a method, for example, ELISA or immunochromatography can be used.
＜＜HADH断片を抗原とした抗HADH断片抗体＞＞
本発明のレプトスピラ症診断方法の第二の態様については，HADH断片を抗原として検出を行うものであり，発明者により，下記の知見が見出されたことを基礎とする。
(1) 病原性レプトスピラと非病原性レプトスピラのアミノ酸配列を比較し，下記に示す診断に有用な５つの配列が見出された。
配列番号１（285-296）：MSKTPDGKKEKL
配列番号２（301-311）：GADLYEPVPKF
配列番号３（317-332）：RQANKRISEADYTGAM
配列番号４（396-414）：DAIQLIEKAKLPVPEVLAK
配列番号５（410-424）：EVLAKAKPGKPFYEL
(2) 上記配列から配列番号５を最も好ましい部位として選択し，これを認識する抗HADHポリクローナル抗体を作製したところ，この抗体が，複数種の病原性レプトスピラ由来HADHを検出した一方，非病原性レプトスピラ由来HADHを検出しなかった。
(3) 上記実験結果から，配列番号５に記載のアミノ酸配列部位ならびにこれを認識する抗体が，病原性レプトスピラの診断に有用であることが分かった。
<< Anti-HADH fragment antibody using HADH fragment as an antigen >>
The second aspect of the method for diagnosing leptospirosis of the present invention is to detect a HADH fragment as an antigen, and is based on the following findings by the inventor.
(1) The amino acid sequences of pathogenic Leptospira and non-pathogenic Leptospira were compared, and the following five sequences useful for diagnosis were found.
SEQ ID NO: 1 (285-296): MSKTPDGKKEKL
SEQ ID NO: 2 (301-311): GADLYEPVPKF
SEQ ID NO: 3 (317-332): RQUANKRISEADYTGAM
SEQ ID NO: 4 (396-414): DAIQLIEKAKLPVPEVLAK
SEQ ID NO: 5 (410-424): EVLAKAKPGKPFYEL
(2) When SEQ ID NO: 5 was selected as the most preferable site from the above sequence and an anti-HADH polyclonal antibody recognizing this was prepared, this antibody detected multiple types of pathogenic Leptospira-derived HADH, but was non-pathogenic. No HADH derived from Leptospira was detected.
(3) From the above experimental results, it was found that the amino acid sequence site shown in SEQ ID NO: 5 and the antibody recognizing the amino acid sequence site are useful for the diagnosis of pathogenic Leptospira.
本発明におけるレプトスピラ症診断方法は，HADHにおける配列番号１から配列番号５に示されるアミノ酸配列のいずれか又は複数を検出することにより，病原性レプトスピラ感染の診断を行うことを特徴とする。
本発明において「HADHにおける配列番号１から配列番号５に示されるアミノ酸配列のいずれか又は複数を検出」とは，これら配列番号に記載されるアミノ酸配列そのもののみを検出することに限定されるものではない。すなわち，これら５つのアミノ酸配列が「病原性レプトスピラと非病原性レプトスピラのアミノ酸配列を比較し，診断に有用なアミノ酸配列である」という本発明の趣旨に沿う範囲で，これら５つのアミノ酸配列を包含するアミノ酸配列も検出対象として含まれるものである。このようなアミノ酸配列として，これら配列番号１から配列番号５に示されるアミノ酸配列に，それぞれのアミノ酸配列における近傍のアミノ酸ないし任意のアミノ酸を好ましくは６個，より好ましくは４個ほど付加する形の配列であればよい。
The method for diagnosing leptospirosis in the present invention is characterized in that pathogenic leptospirosis infection is diagnosed by detecting any or a plurality of amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 5 in HADH.
In the present invention, "detecting any or more of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 5 in HADH" is not limited to detecting only the amino acid sequences shown in these SEQ ID NOs. No. That is, these five amino acid sequences include these five amino acid sequences within the scope of the present invention that "the amino acid sequences of pathogenic and non-pathogenic Leptspira are compared and are useful for diagnosis". The amino acid sequence to be detected is also included as a detection target. As such an amino acid sequence, preferably 6 or more preferably 4 amino acids in the vicinity of each amino acid sequence or any amino acid in each amino acid sequence are added to the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 5. It may be an array.
これらアミノ酸配列部位を検出する手法としては，検出が可能である限り特に限定する必要はなく，種々の手法を用いることがでる。検出手法として，典型的には，ポリクローナル抗体，モノクローナル抗体，抗体フラグメント，もしくはこれらの修飾抗体などを用いた検出方法が挙げられる。
また，検出する検体としては，HADHの検出が可能な限り特に限定する必要はなく，種々の検体を用いることができるが，典型的には，尿を検体として，必要に応じ前処理を行い，用いることができる。
The method for detecting these amino acid sequence sites is not particularly limited as long as it can be detected, and various methods can be used. Typical examples of the detection method include a detection method using a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, an antibody fragment, or a modified antibody thereof.
The sample to be detected is not particularly limited as much as possible, and various samples can be used, but typically, urine is used as a sample and pretreatment is performed as necessary. Can be used.
アミノ酸配列として配列番号５に示すアミノ酸配列の検出を行うことが好ましい。これにより，病原性レプトスピラ由来HADHの検出特異性を高めることが可能となり，本発明のレプトスピラ症診断方法の有用性を向上させる効果を有する。 It is preferable to detect the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 as the amino acid sequence. This makes it possible to enhance the detection specificity of the pathogenic leptospirosis-derived HADH, and has the effect of improving the usefulness of the method for diagnosing leptospirosis of the present invention.
本発明のレプトスピラ症診断方法においては，抗HADHモノクローナル抗体，抗HADH断片抗体，これらを合わせて用いることができる。これにより，それぞれの検出特性を活かした，より特異度の高いレプトスピラ症診断が可能となるという効果を有する。 In the method for diagnosing leptospirosis of the present invention, an anti-HADH monoclonal antibody and an anti-HADH fragment antibody can be used in combination. This has the effect of enabling more specific diagnosis of leptospirosis by taking advantage of each detection characteristic.
これらを組み合わせた一態様として，Sandwich ELISAが挙げられる。
すなわち，マイクロプレートに，抗HADHモノクローナル抗体，抗HADH断片抗体のいずれかを固相化させ，これに検体試料，一次抗体，二次抗体（場合によっては検出用基質）を反応させるなどである。この場合，固相化された抗体とは，異なる種の組み合わせで一次抗体を用いることができる。
One aspect of combining these is Sandwich ELISA.
That is, either an anti-HADH monoclonal antibody or an anti-HADH fragment antibody is immobilized on a microplate, and a sample sample, a primary antibody, or a secondary antibody (in some cases, a substrate for detection) is reacted with the solid phase. In this case, the primary antibody can be used in a combination of different species from the immobilized antibody.
配列番号１から配列番号５を認識する抗HADH断片抗体ないし抗HADHモノクローナル抗体は，これをキット化したうえで用いることが好ましい。これにより，レプトスピラ症が疑われる患者などにおいて速やかに診断を行うことが可能となり，本発明のレプトスピラ症診断方法の有用性を向上させる効果を有する。
キット化については，被検体の種類や検出手段により適宜調整すればよく，例えば，配列番号１から５を認識しうる抗HADH断片抗体，抗HADHモノクローナル抗体，修飾抗体，これら抗体を固相化させたマイクロプレート，ICストリップ，尿の前処理のためのフィルター，蛍光標識された二次抗体などが挙げられる。
The anti-HADH fragment antibody or anti-HADH monoclonal antibody that recognizes SEQ ID NOs: 1 to 5 is preferably used after being made into a kit. This makes it possible to promptly make a diagnosis in a patient suspected of having leptospirosis, and has the effect of improving the usefulness of the method for diagnosing leptospirosis of the present invention.
The kit may be appropriately adjusted depending on the type of subject and the detection means. For example, an anti-HADH fragment antibody, an anti-HADH monoclonal antibody, a modified antibody, and these antibodies capable of recognizing SEQ ID NOs: 1 to 5 are immobilized. Examples include microplates, IC strips, filters for urine pretreatment, and fluorescently labeled secondary antibodies.
本発明について，実施例を用いて詳述する。 The present invention will be described in detail with reference to examples.
＜＜実験例１．抗HADHモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製＞＞
レプトスピラHADHを抗原として用い，抗レプトスピラHADHモノクローナル抗体の作製を行った。
<< Experimental Example 1. Preparation of anti-HADH monoclonal antibody-producing hybridoma >>
An anti-Leptospira HADH monoclonal antibody was prepared using Leptospira HADH as an antigen.
１．マウスをリコンビナントHADHで免疫し，リンパ節の摘出を行った。
２．リンパ節から，リンパ球を分離・精製した後，ミエローマ細胞と融合ならびに培養を行った。
３．得られた4320個のハイブリドーマについてELISAにより一次スクリーニングを行い，HADHと反応がみられた31個のハイブリドーマを得た（図１）。さらに，二次スクリーニングを行い，31個のうち，10個のハイブリドーマを選択した。
４．以下の検討では，選択された10個のハイブリドーマから得られる抗体を，抗HADHモノクローナル抗体として用いた。
1. 1. Mice were immunized with recombinant HADH and lymph nodes were removed.
2. 2. After separating and purifying lymphocytes from the lymph nodes, they were fused and cultured with myeloma cells.
3. 3. The obtained 4320 hybridomas were subjected to primary screening by ELISA, and 31 hybridomas that reacted with HADH were obtained (Fig. 1). In addition, secondary screening was performed and 10 hybridomas were selected out of 31.
4. In the following studies, antibodies obtained from the 10 selected hybridomas were used as anti-HADH monoclonal antibodies.
＜＜実験例２．抗HADHモノクローナル抗体のELISAによる評価＞＞
作製した抗HADHのハイブリドーマの性能評価を目的に，ELISAによる検討を行った。
<< Experimental Example 2. Evaluation of anti-HADH monoclonal antibody by ELISA >>
An ELISA study was conducted for the purpose of evaluating the performance of the prepared anti-HADH hybridoma.
１．リコンビナント3-HADHをコーティングしたマイクロプレートに，各種ハイブリドーマの培養上清，PO標識二次抗体，POD基質の順に反応させ，OD値の測定を行った。 1. 1. The microplate coated with recombinant 3-HADH was reacted in the order of culture supernatants of various hybridomas, PO-labeled secondary antibody, and POD substrate, and the OD value was measured.
２．得られた10個の抗HADHハイブリドーマの培養上清で検討を行った結果を図２に示す。
(1) 検討を行った10個の抗HADHハイブリドーマの培養上清は，そのすべてにおいて，陰性コントロールであるPBSと比較すると高いOD値を示していた。
(2) この結果から，検討を行った10個の抗HADHハイブリドーマいずれも，HADHに対する結合能を有するモノクローナル抗体を産生することが確認された
2. 2. The results of the examination using the culture supernatants of the obtained 10 anti-HADH hybridomas are shown in FIG.
(1) The culture supernatants of the 10 anti-HADH hybridomas examined showed higher OD values than PBS, which is a negative control, in all of them.
(2) From this result, it was confirmed that all of the 10 anti-HADH hybridomas examined produced monoclonal antibodies having the ability to bind to HADH.
３．マウスで腹水生産が良好だった5つの抗HADHハイブリドーマ（5A9，17C7，21C10，23A2，30G1）について，得られた腹水をプロテインGカラムにより精製し，精製抗体を用いてSandwich ELISAを行った結果を図３に示す。
(1) 検討を行った5つの抗HADHモノクローナル抗体は，そのすべてにおいて，陰性コントロールであるPBSと比較すると高いOD値を示していた。
(2) この結果から，検討を行った５つの抗HADHモノクローナル抗体は，いずれも，HADH対して特異性を有することが確認された。
3. 3. For five anti-HADH hybridomas (5A9, 17C7, 21C10, 23A2, 30G1) with good ascites production in mice, the obtained ascites was purified by a protein G column, and Sandwich ELISA was performed using a purified antibody. It is shown in FIG.
(1) The five anti-HADH monoclonal antibodies examined showed higher OD values in all of them compared to PBS, which is a negative control.
(2) From this result, it was confirmed that all of the five anti-HADH monoclonal antibodies examined had specificity for HADH.
４．５つの抗HADHモノクローナル抗体について，反応させる抗原濃度を変化させて検討を行った結果を図４に示す。
(1) 検討を行った5つの抗HADHモノクローナル抗体は，そのすべてにおいて，添加する抗原濃度に応じて，OD値が減少していた。
(2) この結果から，検討を行った５つの抗HADHモノクローナル抗体は，いずれも，HADH対して特異性を有するとともに，定量的な検出が可能なことが示された。
(3) また，17C7の例では，陽性の場合，黄色く呈色するのに対し，陰性の場合は無色透明であり，目視の点からも検出が可能であることが示された。
FIG. 4 shows the results of studies on four anti-HADH monoclonal antibodies by changing the concentration of the antigen to be reacted.
(1) In all of the five anti-HADH monoclonal antibodies examined, the OD value decreased according to the antigen concentration to be added.
(2) From this result, it was shown that all of the five anti-HADH monoclonal antibodies examined had specificity for HADH and could be quantitatively detected.
(3) In the case of 17C7, the color was yellow when it was positive, whereas it was colorless and transparent when it was negative, indicating that it can be detected visually.
＜＜実験例３．抗HADHモノクローナル抗体を用いた電気泳動による検出＞＞
作製を行った抗HADHモノクローナル抗体について，病原性レプトスピラならびに非病原性レプトスピラを用い，電気泳動による特異的検出が可能かどうかを調べることを目的に検討を行った。
<< Experimental Example 3. Detection by electrophoresis using anti-HADH monoclonal antibody >>
The prepared anti-HADH monoclonal antibody was investigated using pathogenic Leptospira and non-pathogenic Leptospira for the purpose of investigating whether specific detection by electrophoresis is possible.
１．病原性レプトスピラならびに非病原性レプトスピラの培養を行い，これらのタンパク成分を採取後，電気泳動を行った。
２．電気泳動後，タンパクをPVDF膜に転写し，作製した抗HADHモノクローナル抗体（5A9，3H12）と反応させた。抗原・抗体反応は，HRP標識二次抗体を用いて化学発光により検出した。
1. 1. Pathogenic Leptospira and non-pathogenic Leptospira were cultured, and these protein components were collected and then electrophoresed.
2. 2. After electrophoresis, the protein was transferred to a PVDF membrane and reacted with the prepared anti-HADH monoclonal antibody (5A9, 3H12). The antigen-antibody reaction was detected by chemiluminescence using an HRP-labeled secondary antibody.
３．図５に結果を示す。
(1) 5A9では，コントロールであるリコンビナントHADHならびに全ての病原性レプトスピラの検出が可能であった。加えて，非病原性レプトスピラ（L. biflexa）においては，HADHに相当するバンドは検出されず，その他，非特異的と思われる検出もほとんどなかった。
(2) 3H12では，コントロールであるリコンビナントHADHならびに全ての病原性レプトスピラの検出が可能であった。しかしながら，非病原性レプトスピラ（L. biflexa）においては，HADHとは異なるバンドが検出され，同様のバンドの検出が，全ての病原性レプトスピラにおいても検出された。
3. 3. The results are shown in FIG.
(1) 5A9 was able to detect the control recombinant HADH and all pathogenic leptospires. In addition, in non-pathogenic leptospira (L. biflexa), the band corresponding to HADH was not detected, and there were few other detections that seemed to be non-specific.
(2) In 3H12, it was possible to detect the control recombinant HADH and all pathogenic leptospires. However, in non-pathogenic leptospira (L. biflexa), a band different from HADH was detected, and detection of similar bands was also detected in all pathogenic leptospira.
４．この結果から，少なくとも5A9と3H12では，病原性レプトスピラの特異的検出という観点から，5A9の方が優れていることが確認された。 4. From this result, it was confirmed that 5A9 is superior to at least 5A9 and 3H12 from the viewpoint of specific detection of pathogenic leptospira.
＜＜実験例４．HADHの解析ならびに抗原決定＞＞
全ての病原性レプトスピラに反応するとともに特異性が高い抗体を作製することを目的として，病原性レプトスピラと非病原性レプトスピラのHADH配列構造を比較し，どの配列部分が抗体認識部位として適切かを明らかにするため，検討を行った。
<< Experimental Example 4. HADH analysis and antigen determination >>
The HADH sequence structures of pathogenic Leptospira and non-pathogenic Leptospira are compared for the purpose of producing highly specific antibodies that react with all pathogenic Leptospira, and it is clarified which sequence part is suitable as an antibody recognition site. In order to make it, we examined it.
１．病原性レプトスピラ（Leptospira interrogans）と非病原性レプトスピラ（Leptospira biflexa）の配列構造を比較した。
２．結果を図６ならびに図７に示す。
(1) 病原性レプトスピラ由来HADHは，436のアミノ酸配列を有し，それぞれ図６に示された配列部分において，シグナルペプチド部位，膜貫通部位，プロペプチド部位を示した。
(2) これと非病原性レプトスピラの配列を比較したところ，図７の四角で囲まれた部分に相当する下記５つの配列部分が，抗体認識部位として有用であることが分かった。
配列番号１（285-296）：MSKTPDGKKEKL
配列番号２（301-311）：GADLYEPVPKF
配列番号３（317-332）：RQANKRISEADYTGAM
配列番号４（396-414）：DAIQLIEKAKLPVPEVLAK
配列番号５（410-424）：EVLAKAKPGKPFYEL
３．さらに検討を行った結果，親水性を有するとともに，配列内部にターンがあると推測される配列番号５を，抗原ペプチドとして選択した。
1. 1. The sequence structures of pathogenic Leptospira interrogans and non-pathogenic Leptospira biflexa were compared.
2. 2. The results are shown in FIGS. 6 and 7.
(1) Pathogenic Leptospira-derived HADH has an amino acid sequence of 436, and showed a signal peptide site, a transmembrane site, and a propeptide site in the sequence portion shown in FIG. 6, respectively.
(2) When this was compared with the sequence of non-pathogenic Leptospira, it was found that the following five sequence parts corresponding to the parts surrounded by the square in FIG. 7 are useful as antibody recognition sites.
SEQ ID NO: 1 (285-296): MSKTPDGKKEKL
SEQ ID NO: 2 (301-311): GADLYEPVPKF
SEQ ID NO: 3 (317-332): RQUANKRISEADYTGAM
SEQ ID NO: 4 (396-414): DAIQLIEKAKLPVPEVLAK
SEQ ID NO: 5 (410-424): EVLAKAKPGKPFYEL
3. 3. As a result of further investigation, SEQ ID NO: 5, which is hydrophilic and is presumed to have a turn inside the sequence, was selected as the antigen peptide.
＜＜実験例５．抗HADH断片ポリクローナル抗体作製＞＞
配列番号５を認識する抗体作製を目的として行った。
<< Experimental Example 5. Preparation of anti-HADH fragment polyclonal antibody >>
This was performed for the purpose of producing an antibody that recognizes SEQ ID NO: 5.
１．抗原ペプチドをキャリアタンパクKLHにコンジュゲーションさせ，SPFウサギを4回抗原投与した。
２．アジュバントとして１回目は，完全フロインドアジュバントを使用し，それ以後は不完全フロイントアジュバントにした。
３．免疫開始56日後に全採血を行い，血清を分離し，抗HADH断片ポリクローナル抗体とした。
1. 1. The antigenic peptide was conjugated to the carrier protein KLH, and SPF rabbits were administered
2. 2. The first adjuvant was a complete Freund's adjuvant, and thereafter it was an incomplete Freund's adjuvant.
3. 3. Total blood was collected 56 days after the start of immunization, and serum was separated to obtain an anti-HADH fragment polyclonal antibody.
＜＜実験例６．抗HADH断片ポリクローナル抗体による特異性の確認＞＞
作製した抗HADH断片ポリクローナル抗体が，どのような認識能を有するかを確認することを目的として検討を行った。
<< Experimental Example 6. Confirmation of specificity by anti-HADH fragment polyclonal antibody >>
The purpose of this study was to confirm the cognitive ability of the prepared anti-HADH fragment polyclonal antibody.
１．病原性レプトスピラならびに非病原性レプトスピラの培養を行い，これらのタンパク成分を採取後，電気泳動を行った。
２．電気泳動後，タンパクをPVDF膜に転写し，作製した抗HADH断片ポリクローナル抗体と反応させた。抗原・抗体反応は，HRP標識二次抗体を用いて化学発光により検出した。
1. 1. Pathogenic Leptospira and non-pathogenic Leptospira were cultured, and these protein components were collected and then electrophoresed.
2. 2. After electrophoresis, the protein was transferred to a PVDF membrane and reacted with the prepared anti-HADH fragment polyclonal antibody. The antigen-antibody reaction was detected by chemiluminescence using an HRP-labeled secondary antibody.
３．図８に,非病原性レプトスピラと4種類の病原性レプトスピラの分析結果を示す。
(1) 非病原性レプトスピラ（L. biflexa）においては，HADHに相当するバンドは検出されなかった。
(2) 病原性レプトスピラ（Manilae，Hebdomadis，Icterohaemorrhagiae，Pyrogenes）においては，HADHに相当するバンドがはっきりと強く検出された。
3. 3. FIG. 8 shows the analysis results of non-pathogenic Leptospira and four types of pathogenic Leptospira.
(1) No band corresponding to HADH was detected in non-pathogenic leptospira (L. biflexa).
(2) In pathogenic leptospires (Manilae, Hebdomadis, Icterohaemorrhagiae, Pyrogenes), a band corresponding to HADH was clearly and strongly detected.
４．図９に，各種検体における比較結果を示す。なお，検討においては，陽性対象として，HADHを組み込んだ大腸菌を培養し，溶菌後に得られたタンパク分画を使用した。陰性対象として非病原性レプトスピラを培養し，溶菌後に得られたタンパク分画を使用した。
(1) 陽性コントロールにおいて，HADHは強く検出された。
(2) また，本検討に用いた2種の病原性レプトスピラ（L.interrogans serovar Manilae，L.interrogans serovar Hebdomadis），いずれにおいてもHADHが検出された。
(3) さらに，正常な尿において，HADHに相当するバンドは検出されなかった。
4. FIG. 9 shows the comparison results of various samples. In the study, Escherichia coli incorporating HADH was cultured as a positive target, and the protein fraction obtained after lysis was used. Non-pathogenic Leptospira was cultured as a negative subject, and the protein fraction obtained after lysis was used.
(1) HADH was strongly detected in the positive control.
(2) HADH was also detected in both of the two pathogenic leptospires (L.interrogans serovar Manilae and L.interrogans serovar Hebdomadis) used in this study.
(3) Furthermore, no band corresponding to HADH was detected in normal urine.
５．図１０に，レプトスピラ患者の尿を用いたHADHの検出を示す。なお，検討においては，陽性対象として，病原性レプトスピラを培養し，溶菌後に得られたタンパク分画を使用した。陰性対象として腎不全等の際に尿に排出されるタンパク質「アルブミン」を使用した。
(1) 陽性コントロールにおいて，HADHは強く検出された。
(2) また，レプトスピラ症患者A，B，いずれにおいてもHADHが検出された。
(3) さらに，抗HADH抗体はアルブミンと交差反応しないことを確認した。
5. FIG. 10 shows the detection of HADH using the urine of a leptospirosis patient. In the study, pathogenic Leptospira was cultured as a positive target, and the protein fraction obtained after lysis was used. As a negative subject, the protein "albumin" excreted in urine during renal failure was used.
(1) HADH was strongly detected in the positive control.
(2) HADH was also detected in both leptospirosis patients A and B.
(3) Furthermore, it was confirmed that the anti-HADH antibody did not cross-react with albumin.
６．これらの結果から，作製した抗HADH断片ポリクローナル抗体は，少なくとも4種類の病原性レプトスピラのHADHを認識すること，レプトスピラ症患者の尿のHADHを認識すること，ならびに，非病原性レプトスピラのHADHを認識しないことが示された。
7．よって，作製した抗HADH断片ポリクローナル抗体は，レプトスピラ症の診断において，特異度の高い抗体として用いられることが分かった。また，HADHを診断の対象として選択することにより，特異性の高い診断が可能となることが示された。
6. From these results, the prepared anti-HADH fragment polyclonal antibody recognizes HADH of at least four types of pathogenic leptospira, HADH of urine of patients with leptospirosis, and HADH of non-pathogenic leptospira. It was shown not to.
7. 7. Therefore, it was found that the prepared anti-HADH fragment polyclonal antibody is used as a highly specific antibody in the diagnosis of leptospirosis. It was also shown that selecting HADH as the diagnosis target enables highly specific diagnosis.
＜＜実験例７．生体試料を用いたHADH検出＞＞
作製した抗HADH断片ポリクローナル抗体もしくは抗HADHモノクローナル抗体を用いて，生体試料におけるHADH検出が可能かどうかについて，検討を行った。
<< Experimental Example 7. HADH detection using biological samples >>
Using the prepared anti-HADH fragment polyclonal antibody or anti-HADH monoclonal antibody, we investigated whether HADH could be detected in biological samples.
１．抗HADH断片ポリクローナル抗体もしくは抗HADHモノクローナル抗体を固相化したマイクロプレートを作製した。
２．健常者もしくはレプトスピラ症感染患者の尿，各種一次抗体，PO標識二次抗体，POD基質の順に反応させ，OD値の測定を行った。
1. 1. A microplate on which an anti-HADH fragment polyclonal antibody or an anti-HADH monoclonal antibody was immobilized was prepared.
2. 2. The urine of healthy subjects or leptospirosis-infected patients, various primary antibodies, PO-labeled secondary antibodies, and POD substrate were reacted in this order, and the OD value was measured.
３．結果を図１１に示す。
(1) 抗HADH断片ポリクローナル抗体を固相化したマイクロプレートにおいて，一次抗体として抗HADHモノクローナル抗体を用いて検討を行った結果を図１１の左に示す。抗HADHモノクローナル抗体のうち，17C7ならびに23A2において，健常者と感染症患者で差が認められた。
(2) 抗HADHモノクローナル抗体（17C7）を固相化したマイクロプレートにおいて，一次抗体として抗HADH断片ポリクローナル抗体を用いて検討を行った結果を図１１の右に示す。いずれにおいても差が認められたが，希釈倍率500倍の方が顕著な差が認められた。
3. 3. The results are shown in FIG.
(1) The results of a study using an anti-HADH monoclonal antibody as the primary antibody in a microplate on which an anti-HADH fragment polyclonal antibody was immobilized are shown on the left of FIG. Among the anti-HADH monoclonal antibodies, 17C7 and 23A2 showed a difference between healthy subjects and infectious disease patients.
(2) The results of an examination using an anti-HADH fragment polyclonal antibody as a primary antibody in a microplate on which an anti-HADH monoclonal antibody (17C7) was immobilized are shown on the right side of FIG. A difference was observed in all cases, but a remarkable difference was observed at a dilution ratio of 500 times.
４．これらの結果から，抗HADH断片ポリクローナル抗体もしくは抗HADHモノクローナル抗体を用いて，ヒト生体試料におけるHADHの検出が可能なことが示された。 4. From these results, it was shown that HADH can be detected in human biological samples using anti-HADH fragment polyclonal antibody or anti-HADH monoclonal antibody.
＜＜実験例８．各抗体を用いたICストリップの検討＞＞
作製された各抗体を用いて，ICストリップ（イムノクロマトストリップ）の試作を行い，その性能の評価を行った。
<< Experimental Example 8. Examination of IC strip using each antibody >>
Using each of the produced antibodies, an IC strip (immunochromatographic strip) was prototyped and its performance was evaluated.
１．ICストリップについて，メンブレン塗布用抗体として抗HADH断片ポリクローナル抗体，金コロイド標識用抗体として抗HADHモノクローナル抗体（17C7）を用いて作成を行った。 1. 1. The IC strip was prepared using an anti-HADH fragment polyclonal antibody as an antibody for membrane coating and an anti-HADH monoclonal antibody (17C7) as an antibody for colloidal gold labeling.
２．結果を図１２に示す。
(1) 陰性コントロール（25mMリン酸2水素カリウム溶液），ならびにHADHを含むすべての濃度において，コントロールラインにおける検出が確認できた。
(2) また，テストラインにおいては，312ng/mL以上の濃度で検出が可能であり，また，濃度依存的に検出バンドも濃くなっていた。
(3) なお，156ng/mL以下の濃度ならびに陰性コントロールでは，テストラインによる検出は確認されなかった。
2. 2. The results are shown in FIG.
(1) Negative control (25 mM potassium dihydrogen phosphate solution) and detection on the control line were confirmed at all concentrations including HADH.
(2) In addition, on the test line, detection was possible at a concentration of 312 ng / mL or higher, and the detection band became darker depending on the concentration.
(3) No detection by the test line was confirmed at a concentration of 156 ng / mL or less and a negative control.
３．この結果から，各抗体を用いたICストリップにより，HADHの検出が可能であることが示された。 3. 3. From this result, it was shown that HADH can be detected by the IC strip using each antibody.
Claims (7)
ことを特徴とする病原性レプトスピラの検出方法。A method for detecting pathogenic Leptospira.
ことを特徴とする病原性レプトスピラの検出方法。A method for detecting pathogenic Leptospira.
ことを特徴とする請求項２に記載の病原性レプトスピラの検出方法。The method for detecting a pathogenic Leptospira according to claim 2.
レストスピラ・インテロガンスであるRestspira Interrogance
ことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の病原性レプトスピラの検出方法。The method for detecting a pathogenic Leptospira according to any one of claims 1 to 3.
ELISA又はイムノクロマトグラフィーを用いるUse ELISA or later flow test
ことを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の病原性レプトスピラの検出方法。The method for detecting a pathogenic Leptospira according to any one of claims 1 to 4.
ことを特徴とする病原性レプトスピラの検出に用いる抗体。An antibody used for the detection of pathogenic Leptospira.
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