JP2008224364A - 位相情報検出方法及び位相情報検出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】
高価な位相差顕微鏡を用いることなく、より簡便に、しかもリアルタイムに位相物体の位相情報を取得し得る位相情報検出方法及び位相情報検出装置を提供する。
【解決手段】
位相物体の画像からの光は、色収差を有する対物レンズを透過した後、光の波長に依存して異なる位置に結像する。この位相物体の画像を、互いに異なる複数の波長について対物レンズから等距離の位置において撮像することにより、複数の撮像画像を得る。この複数の撮像画像を画像処理することにより、位相物体の位相情報を得ることができる。画像処理は、複数の撮像画像のそれぞれについて輝度を補正して複数の輝度補正画像を得る。この輝度補正画像の差を採ることにより、輝度差画像を位相情報として得ることができる。
【選択図】 図３

Description

本発明は、位相情報検出方法及び位相情報検出装置に関し、より詳細には、位相物体の位相情報を瞬時にしかも簡便に得ることができる位相情報検出方法及び位相情報検出装置に関する。

生体細胞、細菌などの無色透明な被写体は、それを透過する光の位相を変化させるのみで殆ど光を吸収せず、「位相物体」と称されている。位相物体は通常の顕微鏡などでは観察することはできず、着色するなどの手法が必要となる。しかし、細胞などは着色することにより死滅するため、細胞培養などの生きたままの観察が必要な場面では着色することはできない。

位相物体をそのまま観察し得るものとして、位相差顕微鏡が知られている。しかし、位相差顕微鏡は高価であるため、より安価で位相物体の観察に適した顕微鏡が望まれている。

より安価で簡便に位相物体の観察を行うことができる方法として、ＴＩＥ（Transport of Intensity Equation）法がある（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）。この方法では、位相物体の撮影に際してピントをずらせるか、又は結像面をずらせて撮影した複数枚の画像を得、これを画像処理することにより、位相物体の位相情報の検出を行っている。しかし、この方法では、ピントや結像面の位置をずらせるための機構が必要となるという新たな問題点が生ずる。また、画像処理を行う前にピントをずらせて複数回の撮影を行う必要があるため、リアルタイムの観察には不便であるという問題点もある。
特表２００２−５２９６８９号公報（段落〔０００３〕） M. R. Teague、「決定論的位相再生（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）：グリーン関数解法」、J.Opt.Soc.Am, ７３ １４３４〜１４４１（１９８３年） N. Streibl、「強度方程式のトランスポートによる位相画像化」、Opt. Comm., ４９ ６〜１０（１９８４年）

本発明は上記従来技術の問題点を解決するために為されたものであり、本発明の目的は、高価な位相差顕微鏡を用いることなく、より簡便に、しかもリアルタイムに位相物体の位相情報を得ることができる位相情報検出方法及び位相情報検出装置を提供することである。

本発明の位相情報検出方法は、位相物体の画像を、色収差を有する対物レンズから等距離の位置において互いに異なる複数の波長について撮像することにより複数の撮像画像を得、該複数の撮像画像を比較することにより、前記位相物体の位相情報を得ることを特徴とする。

本発明の位相情報検出方法の原理について説明する。位相物体の画像を色収差を有する対物レンズ（凸レンズ）１２で結像させた場合、図１に示すように、その結像位置は波長によって異なる。即ち、図１に示すように、位相物体１０から出た光は、対物レンズ１２を透過した後、波長の長い赤（Ｒ）の光は対物レンズ１２から遠い位置に、波長の短い青（Ｂ）の光は対物レンズ１２に近い位置に、緑（Ｇ）の光は中間に、それぞれ結像する。

このような色収差を有する対物レンズ１２に対して、例えば緑（Ｇ）の光の結像位置に撮像素子１４を置くと、この撮像素子１４の位置には、図２に示すように、緑（Ｇ）の光については位相物体１０からの光が結像する。しかし、撮像素子１４上の赤（Ｒ）の光の結像は、あたかも位相物体１０よりも遠い位置に存在する位相物体１０’の画像のように考えることができる。同様に、撮像素子１４上の青（Ｂ）の光の結像は、あたかも位相物体１０よりも近い位置に存在する位相物体１０”の画像のように考えることができる。従って、撮像素子１４の位置で赤（Ｒ）、緑（Ｇ）、青（Ｂ）等の異なる波長について複数の画像を撮影すれば、前述のＴＩＥ法において撮像素子の位置をずらせた複数の画像を撮影したと同じことになる。この複数の画像から、ＴＩＥ法と同様に位相物体の位相情報を得ることが可能となる。

本発明の位相情報検出方法は、色収差を有する対物レンズを透過した後に光の波長に依存して異なる位置に結像する位相物体の画像を、前記対物レンズから等距離の位置において互いに異なる複数の波長について撮像することにより複数の撮像画像を得、該複数の撮像画像を画像処理することにより、前記位相物体の位相情報を得ることを特徴とする。

上述のようにして得た複数の画像について、ＴＩＥ法等と同様の画像処理を行えば、より正確な位相物体についての位相情報を得ることが可能となる。

以下、本発明の位相情報検出方法における画像処理について説明する。本発明においては、上述のようにＴＩＥ法と同様に、下記の数１に基づいて画像処理を行うことができる。

ここで、ｚは、ｘｙｚ空間における光軸であり、Ｉは光強度、φは光の位相を表している。

位相物体は無色透明なので光は減衰しないと仮定すると、上記の数１は、数２のように書き換えることができる。つまり、光の強度のｚ軸方向の微分は、位相のラプラシアン（２次微分）に比例する関係となる。

この数２は、本発明において得られた複数の撮像画像のそれぞれについて輝度を補正して複数の輝度補正画像を得、この輝度補正画像の差を採った輝度差画像を作成すれば、位相物体を画像として捕らえることができることを示している。

本発明の位相情報検出装置は、位相物体に照明光を供給する照明装置と、前記位相物体の画像を光の波長に依存して異なる位置に結像する色収差を有する対物レンズと、前記対物レンズから等距離の位置において互いに異なる複数の波長について撮像することにより複数の撮像画像を得る複数の撮像素子と、前記複数の撮像画像を比較する画像処理装置とを備えたことを特徴とする。

本発明の位相情報検出装置においても、前述の図１及び図２で説明した原理に基づいて位相物体の位相情報の検出を行うことができる。

また、本発明の位相情報検出装置は、位相物体に照明光を供給する照明装置と、前記位相物体の画像を光の波長に依存して異なる位置に結像する色収差を有する対物レンズと、前記対物レンズから等距離の位置において互いに異なる複数の波長について撮像することにより複数の撮像画像を得る複数の撮像素子と、前記複数の撮像画像を画像処理することにより、前記位相物体の位相情報を得る画像処理装置とを備えたことを特徴とする。

本発明においては、得られた複数の画像について、ＴＩＥ法等と同様の画像処理を行えば、より正確な位相物体についての位相情報を得ることが可能となる。例えば、上記数１、数２等で説明したようにして画像処理を行うことができる。

なお、本明細書においては、「位相情報」とは、数１や数２から得られる計算結果の他、この計算結果に基づいて作成された画像を含むものとする。

本発明の位相情報検出方法及び位相情報検出装置によれば、光の波長に依存して異なる位置に結像する位相物体の複数の画像を同時に得ることができるので、高価な位相差顕微鏡を用いることなく、より簡便に、しかもリアルタイムに位相物体の位相情報を得ることができる。

図３は、上記位相情報検出方法を実施するための位相情報検出装置の概略構成図である。本実施形態の位相情報検出装置は、同図に示すように、位相物体１０に照明光を供給する照明装置２２を備えている。位相物体１０に照射される照明光は平行光でなければならないが、照明装置２２と位相物体１０との間の距離が大きい場合には、点光源又光源からの光を絞り穴で絞ったものを近似的に平行光の光源として用いることができる。

また、本実施形態の装置は、対物レンズ１２と、光分離撮像装置２３とを有する撮像装置２４を備えている。本実施形態の対物レンズ１２は色収差を有し、従って、位相物体を撮像する場合、光の波長に依存して異なる位置に結像することになる。

更に、本実施形態では、撮像装置２４で得られた撮像画像を画像処理する画像処理装置２６と、画像処理装置２６で得られた処理後の画像を映し出す画像表示装置２８とを備えている。画像処理装置２６は、前述の数１及び数２に関連して説明した画像処理を行うように構成されている。また、画像表示装置２８としては、例えば、ＣＲＴ、液晶表示装置等を使用することができる。

図４は、本発明の一実施形態に係る撮像装置２４における対物レンズ１２及び光分離撮像装置２３の概略構成を示している。光分離撮像装置２３は、対物レンズ１２の透過光１９を部分的に撮像素子１４ａの方向に反射するハーフミラー１６と、ハーフミラー１６を透過した光を全て撮像素子１４ｂの方向に反射するミラー１７とを備えている。そして、本実施形態では、対物レンズ１２からハーフミラー１６を介して撮像素子１４ａに至る距離と、色収差を有する対物レンズ１２からミラー１７を介して撮像素子１４ｂに至る距離とが、等しくになるように配置されている。また、本実施形態では、ハーフミラー１６とミラー１７は反射又は透過する光の波長に対する選択性はない。一方、撮像素子１４ａと撮像素子１４ｂは、互いに異なる波長領域において高い感度を有している。従って、撮像素子１４ａと撮像素子１４ｂは、対物レンズ１２から等距離の位置において互いに異なる複数の波長の光について撮像することになる。

図５は、撮像装置２４における光分離撮像装置２３に代えて光分離撮像装置２５を備えた他の実施形態を示している。この実施形態では、ハーフミラー１６、ミラー１７、並びに撮像素子１４ａ及び１４ｂに代えて、ダイクロイックプリズム１８及び撮像素子１５ｂ,１５ｇ,１５ｒが使用されており、３板方式と称される。この構成では、対物レンズ１２の透過光１９のうち、青成分の光のみが反射面１８ｂで反射され、更に反射面１８ｐで反射された後、撮像素子１５ｂ上に結像する。また、反射面１８ｂを透過した光のうち、赤成分の光のみが反射面１８ｒで反射され、更に反射面１８ｑで反射された後、撮像素子１５ｒ上に結像する。更に、反射面１８ｒを透過した緑の光は、直進して撮像素子１５ｇ上に結像する。そして、本実施形態では、撮像素子１５ｂから対物レンズ１２に至る距離と、撮像素子１５ｇから対物レンズ１２に至る距離と、撮像素子１５ｒから対物レンズ１２に至る距離とが等しくなるように配置されている。従って、撮像素子１５ｂ,１５ｇ,１５ｒは、対物レンズ１２から等距離の位置において互いに異なる複数の波長の光、具体的にはそれぞれ青成分、緑成分、赤成分の光について撮像することになる。なお、この構成では、対物レンズ１２を透過した光は波長に応じてダイクロイックプリズム１８により分離されるので、前述の図４の撮像素子１４ａ及び１４ｂとは異なり、撮像素子１５ｂ,１５ｇ,１５ｒの感度の波長依存性は、可視光を検出し得る限り問題とはならない。

上記では、対物レンズ１２を１枚の凸レンズにより構成した場合について説明したが、対物レンズを少なくとも１枚の凸レンズと、少なくとも１枚の凹レンズとの組み合わせによって構成してもよい。図６は、１枚の凸レンズ１２ａと、１枚の凹レンズ１２ｂとの組み合わせによって対物レンズ１２を構成した場合を示している。ここでは説明の便宜上、赤成分の光と青成分の光について撮像することとし、凸レンズ１２ａの赤色に対する焦点距離ｆ_r、青色に対する焦点距離ｆ_b、凹レンズ１２ｂの赤色に対する焦点距離−ｆ_r、青色に対する焦点距離−ｆ_bとする。また、凸レンズ１２ａと凹レンズ１２ｂとの間の距離をδとし、撮像位置は、赤色と青色の何れの光についても凸レンズ１２ａから距離ｂの位置である。このような配置で位相物体１０を撮像する場合、赤色に対しては凸レンズ１２ａからａ_rの位置の画像を撮像することになり、青色に対しては凸レンズ１２ａからａ_bの位置の画像を撮像することになる。図６の配置では、凸レンズ１２ａと凹レンズ１２ｂの合成焦点距離をそれぞれの色についてｆ_r'、ｆ_b'とすると、レンズの式から、

ここで、凸レンズ１２ａと凹レンズ１２ｂの合成焦点距離ｆ_r'、ｆ_b'は、それぞれｆ_r ²／δ、ｆ_b ²／δなので、

の関係が成立する。この式から、

の関係が得られる。この関係から、例えば、ｆ_b＝１、ｆ_r＝１．０１、ａ_b＝２とした場合、ａ_r＝２．０５ならδ＝０．６１９、ａ_r＝２．１ならδ＝１．２０８となり、凸レンズ１２ａと凹レンズ１２ｂとの距離δを変えることにより、２つの像の距離（ａ_r−ａ_b）が変化することが分かる。

本発明の位相情報検出方法及び位相情報検出装置を用いて位相物体を撮影し、画像処理を行った結果について説明する。使用した本実施例の装置は、図３の装置において、図５の光分離撮像装置２５を備えたものであり、カラーＣＣＤカメラ（東芝ＩＫ−ＴＦ７、１０２４×７６８画素、３板ＣＣＤ方式）、照明（白色ＬＥＤスポット照明、ＣＣＳ ＨＬＶ−２４ＳＷ）、対物レンズ（ミツトヨ、セミプラン（アクロマート）、Ｘ１０）及び画像処理装置（川崎重工業、Ｋ−ＨＩＰＥ−Ｒ−ＰＣ）を用いて構成したものである。また、本実施例では、位相物体として、ＣＨＯ細胞（ハムスター）標本を用いた。上記のように、本実施例では、対物レンズとして、色収差を補正したアクロマートレンズを使用した。これは、市販のレンズは殆どに色収差補正が施されており、色収差補正のされていないレンズの入手は困難なためである。しかし、アクロマートレンズであっても完全に色収差が無いわけではないので、本発明において使用することができる。

この装置を用い、カラーＣＣＤカメラで上記のＣＨＯ細胞の画像を取得し、赤成分、緑成分、青成分に分離した画像を得た。これらの赤成分、緑成分、青成分の画像を図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃにそれぞれ示した。次に、これらの図７〜図７Ｃの画像の輝度値（０〜２５５）は、光源からの光の各波長成分の強弱に依存して全ての色について均一な分布とはならないので、各色の画像の平均輝度値が全て１２８となるように明るさを補正した。即ち、各画素の輝度値を（１２８／平均輝度値）倍した輝度補正画像を得た。得られた赤成分、緑成分、青成分の輝度補正画像を図８Ａ、図８Ｂ及び図８Ｃにそれぞれ示した。

これらの３つの輝度補正画像のうちの任意の２つについて、各画素の輝度の差を採ることにより、輝度差画像を作成した。その結果の一例を図９に示した。同図の画像は、各画素について（青成分の輝度値−赤成分の輝度値）を計算した後、画素全体の平均輝度値が１８０、輝度値の標準偏差が４０となるように調整することにより得られた画像である。また、３つの輝度補正画像のうちの他の任意の２つの組み合わせについて同様の処理を行った場合も、同様の画像が得られることを確認した。

比較のために、位相差顕微鏡を用いて撮影した画像、及び結像面をずらせて撮影してＴＩＥ法により画像処理した結果も併せて以下に示す。

図１０は、位相差顕微鏡で上記と同様のＣＨＯ細胞を撮影した画像を示している。同図と図９との比較から、本発明の位相情報検出方法及び位相情報検出装置によれば、位相差顕微鏡による画像と同様に、細胞などの位相物体の画像を鮮明に捉えることができることが分かる。

また、図１２は前述のＴＩＥ法により上記と同様のＣＨＯ細胞について得られた画像を示している。画像取得に用いた装置は、白黒ＣＣＤカメラ（ソニーＸＣ−ＨＲ７０、１０２４ｘ７６８画素）、照明（白色ＬＥＤスポット照明、ＣＣＳ ＨＬＶ−２４ＳＷ）及び対物レンズ（ミツトヨ、セミプラン（アクロマート相当）、Ｘ１０）を用いて構成したものである。図１１Ａは、この装置を用いて細胞より５μｍ反レンズ側にピントを合わせて撮影した画像を示している（後ピント画像）。また、図１１Ｂは、細胞より１０μｍレンズ側にピントを合わせて撮影した画像を示している（前ピント画像）。図１２の画像は、各画素について（後ピント画像の輝度値−前ピント画像の輝度値）を計算した後、画素全体の平均輝度値が１８０、輝度値の標準偏差が４０となるように調整することにより得られる画像である。

図１２図９との比較から、本発明の位相情報検出方法及び位相情報検出装置によれば、ＴＩＥ法による画像と同様に、細胞などの位相物体の画像を鮮明に捉えることができることが分かる。しかも、ＴＩＥ法ではピントをずらせて２回の撮影を行わなければならないのに対して、本発明の位相情報検出方法及び位相情報検出装置によれば、一回の撮影で複数の画像を同時に得ることができるので、位相物体の位相情報の取得を簡便かつ迅速に行うことができる。

本発明の位相情報検出方法及び位相情報検出装置によれば、位相物体の画像を簡便かつ迅速に取得することができるので、光学機器、医療分野、バイオ産業などの分野で利用可能である。

位相物体の画像を色収差を有する対物レンズ（凸レンズ）を用いて結像させた場合に、色収差が発現する様子を示す説明図である。 色収差を有する対物レンズを介して結像位置から逆に光路を辿ることにより想定される、各色についての位相物体の位置を表す説明図である。 本発明の一実施形態に係る位相情報検出装置の概略構成図である。 本発明の一実施形態に係る、撮像装置における光分離撮像装置の概略構成を示す図である。 本発明の一実施形態に係る撮像装置における光分離撮像装置を実現するための他の実施形態を示す図である。 １枚の凸レンズと１枚の凹レンズとの組み合わせによって対物レンズを構成した場合の色収差が発現する様子を説明するための図である。 本発明の装置により撮影したＣＨＯ細胞の画像から分離した赤成分の画像を表す図である。 本発明の装置により撮影したＣＨＯ細胞の画像から分離した緑成分の画像を表す図である。 本発明の装置により撮影したＣＨＯ細胞の画像から分離した青成分の画像を表す図である。 図７Ａの画像における平均輝度値が１２８となるように明るさを補正して得られた、赤成分の輝度補正画像を表す図である。 図７Ｂの画像における平均輝度値が１２８となるように明るさを補正して得られた、緑成分の輝度補正画像を表す図である。 図７Ｃの画像における平均輝度値が１２８となるように明るさを補正して得られた、青成分の輝度補正画像を表す図である。 各画素について（青成分の輝度値−赤成分の輝度値）を計算した後、画素全体の平均輝度値及び輝度値の標準偏差を調整することにより得られる画像を示す図である。 位相差顕微鏡でＣＨＯ細胞を撮影した画像を示す比較のための図である。 ＴＩＥ法の装置を用いて細胞より５μｍ反レンズ側にピントを合わせて撮影した画像（後ピント画像）を示す図である。 細胞より１０μｍレンズ側にピントを合わせて撮影した画像（前ピント画像）を示す図である。 各画素について（後ピント画像の輝度値−前ピント画像の輝度値）を計算した後、画素全体の平均輝度値及び輝度値の標準偏差を調整することにより得た画像を示す図である。

符号の説明

１０ 位相物体
１２ 対物レンズ
１２ａ 凸レンズ
１２ｂ 凹レンズ
１４ａ，１４ｂ 撮像素子
１５ｂ，１５ｇ，１５ｒ 撮像素子
１６ ハーフミラー
１７ ミラー
１８ ダイクロイックプリズム
１８ｂ，１８ｒ 反射面
１８ｐ，１８ｑ 反射面
１９ 透過光
２２ 照明装置
２３，２５ 光分離撮像装置
２４ 撮像装置
２６ 画像処理装置
２８ 画像表示装置

Claims (12)

1. 位相物体の画像を、色収差を有する対物レンズから等距離の位置において互いに異なる複数の波長について撮像することにより複数の撮像画像を得、該複数の撮像画像を比較することにより、前記位相物体の位相情報を得ることを特徴とする位相物体の位相情報検出方法。
2. 位相物体の画像を、色収差を有する対物レンズから等距離の位置において互いに異なる複数の波長について撮像することにより複数の撮像画像を得、該複数の撮像画像を画像処理することにより、前記位相物体の位相情報を得ることを特徴とする位相物体の位相情報検出方法。
3. 前記画像処理は、ｚ軸を光軸とするｘｙｚ空間において、Ｉ（ｘ,ｙ,ｚ）を光の強度、φ（ｘ,ｙ,ｚ）を光の位相とした場合に、下記の数１に基づいて行われることを特徴とする請求項２記載の位相物体の位相情報検出方法。
   
4. 前記画像処理は、ｚ軸を光軸とするｘｙｚ空間において、Ｉ（ｘ,ｙ,ｚ）を光の強度、φ（ｘ,ｙ,ｚ）を光の位相とした場合に、下記の数２に基づいて行われることを特徴とする請求項２記載の位相物体の位相情報検出方法。
   
5. 前記画像処理は、前記複数の撮像画像のそれぞれについて輝度を補正することにより複数の輝度補正画像を得、該輝度補正画像の差を採った輝度差画像を作成することにより行われることを特徴とする請求項２記載の位相物体の位相情報検出方法。
6. 前記対物レンズを少なくとも１枚の凸レンズと、少なくとも１枚の凹レンズとにより構成し、前記凸レンズ及び前記凹レンズの位置を変更することにより、光の波長に依存する前記位相物体の画像の結像位置を変更することを可能とした請求項１乃至５の何れかに記載の位相情報検出方法。
7. 位相物体に照明光を供給する照明装置と、
   前記位相物体の画像を光の波長に依存して異なる位置に結像する色収差を有する対物レンズと、
   前記対物レンズから等距離の位置において互いに異なる複数の波長について撮像することにより複数の撮像画像を得る複数の撮像素子と、
   前記複数の撮像画像を比較する画像処理装置と
   を備えたことを特徴とする位相物体の位相情報検出装置。
8. 位相物体に照明光を供給する照明装置と、
   前記位相物体の画像を光の波長に依存して異なる位置に結像する色収差を有する対物レンズと、
   前記対物レンズから等距離の位置において互いに異なる複数の波長について撮像することにより複数の撮像画像を得る複数の撮像素子と、
   前記複数の撮像画像を画像処理することにより、前記位相物体の位相情報を得る画像処理装置と
   を備えたことを特徴とする位相物体の位相情報検出装置。
9. 前記画像処理装置は、ｚ軸を光軸とするｘｙｚ空間において、Ｉ（ｘ,ｙ,ｚ）を光の強度、φ（ｘ,ｙ,ｚ）を光の位相とした場合に、前記の数１に基づいて画像処理を行うことを特徴とする請求項８記載の位相物体の位相情報検出装置。
10. 前記画像処理装置は、ｚ軸を光軸とするｘｙｚ空間において、Ｉ（ｘ,ｙ,ｚ）を光の強度、φ（ｘ,ｙ,ｚ）を光の位相とした場合に、前記の数２に基づいて画像処理を行うことを特徴とする請求項８記載の位相物体の位相情報検出装置。
11. 前記画像処理装置は、前記複数の撮像画像のそれぞれについて輝度を補正することにより複数の輝度補正画像を得、該輝度補正画像の差を採った輝度差画像を作成することを特徴とする請求項８記載の位相物体の位相情報検出装置。
12. 前記対物レンズを少なくとも１枚の凸レンズと、少なくとも１枚の凹レンズとにより構成し、前記凸レンズ及び前記凹レンズの位置を変更することにより、光の波長に依存する前記位相物体の画像の結像位置を変更することを可能とした請求項７乃至１１の何れかに記載の位相情報検出装置。