JP2008222581A - 1-O-alpha-GLUCOPYRANOSYL D-PSICOSE AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースに関し、詳しくはD-プシコースとα-グルコシル糖化合物から酵素化学的に製造されるD-グルコースとD-プシコースを構成糖とする1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの製造方法に関する。 The present invention relates to 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose, and more specifically, 1-O- containing D-glucose and D-psicose produced enzymatically from D-psicose and an α-glucosyl sugar compound as constituent sugars. The present invention relates to a method for producing α-glucopyranosyl D-psicose.
D-プシコースはフルクトースのC-3エピマーであり、天然にはほとんど存在しない希少糖である。近年、D-プシコースの大量生産技術が本発明者何森らによって確立され（非特許文献１）、その利用が広く検討されつつある。該糖は、ノンカロリーの甘味料として（非特許文献２）、食品への利用だけでなく、肥満に対する効果、動脈硬化への効果、糖尿病への効果など医療面における利用の可能性が期待される機能性の単糖類である。 D-psicose is a C-3 epimer of fructose and is a rare sugar that does not exist in nature. In recent years, mass production technology of D-psicose has been established by the inventors of the present invention (Non-patent Document 1), and its use is being studied widely. The sugar is not only used as a non-caloric sweetener (Non-Patent Document 2), but is expected to be used not only for food but also for medical purposes such as an effect on obesity, an effect on arteriosclerosis, and an effect on diabetes. It is a functional monosaccharide.
従来、単糖に機能性は期待できず、単糖をオリゴ糖あるいは配糖体化することによって、便通改善や水性溶媒への溶解度の増加など、単糖には存在しなかった機能が生ずると考えられてきた。現在まで、本単糖(D-プシコース)を構成糖に含む二糖類は、パラチノース生成酵素によるグルコシルプシコースの生成が報告されているが（非特許文献３）、その構造や生成量の検討には至っていない。またStereptomyces hygroscopicus var. decoyicusの生産する配糖体として、プシコフラニン（6-アミノ-9-D-プシコフラノシルプリン）の報告がある（非特許文献４）。しかしながら、現在、これらのオリゴ糖や配糖体を工業的に生産するには十分といえない状況にある。 Conventionally, the functionality of monosaccharides cannot be expected, and when monosaccharides are converted to oligosaccharides or glycosides, functions that did not exist in monosaccharides, such as improved bowel movement and increased solubility in aqueous solvents, are generated. Has been considered. To date, disaccharides containing this monosaccharide (D-psicose) as a constituent sugar have been reported to produce glucosyl psicose by palatinose synthase (Non-patent Document 3). Not reached. There is also a report of psicofuranin (6-amino-9-D-psicofuranosylpurine) as a glycoside produced by Stereoptomyces hygroscopicus var. Decoyicus (Non-patent Document 4). However, at present, it is not sufficient to industrially produce these oligosaccharides and glycosides.
一般に糖転移反応は特定の化合物に含まれる糖を供与体として利用し、水酸基を有する化合物、すなわち受容体に単糖を転移させる。この際、供与体となる糖類は二糖以上あるいは配糖体であることが必須である。また、単糖を転移させるためには、リン酸化した単糖類やフッ化処理した単糖類を用いることが必要である。従って、これらの糖を利用するにはオリゴ糖の大量生産や応用性を狭める原因となることが考えられる。 In general, the sugar transfer reaction uses a sugar contained in a specific compound as a donor, and transfers a monosaccharide to a compound having a hydroxyl group, that is, an acceptor. At this time, it is essential that the saccharide serving as a donor is a disaccharide or more or a glycoside. In order to transfer monosaccharides, it is necessary to use phosphorylated monosaccharides or fluorinated monosaccharides. Therefore, it can be considered that the use of these sugars may cause the mass production and applicability of oligosaccharides to be narrowed.
現在、多くのオリゴ糖は本糖転移反応を経て生産されている。糖転移反応には、糖転移反応を触媒する新規な酵素をコードする遺伝子及びその製造法（特許文献１）、糖転移反応によって得られた糖脂質（特許文献２）、糖転移反応を利用した飲食物の製造方法（特許文献３、４）、糖転移反応及びそれを利用したナフトール型―糖結合物質の製造法が挙げられる。
また、βガラクトシダーゼの転移反応による乳果オリゴ糖の生産（非特許文献６）や藤田らによるβフルクトフラノシダーゼによるフルクトオリゴ糖の生産(非特許文献６)、新規オリゴ糖及びその製造法（特許文献５）などに実用化試験結果が報告されている。
Currently, many oligosaccharides are produced through this glycosyl transfer reaction. For the transglycosylation reaction, a gene encoding a novel enzyme that catalyzes the transglycosylation reaction and its production method (Patent Document 1), a glycolipid obtained by the transglycosylation reaction (Patent Document 2), and the transglycosylation reaction Examples include a method for producing food and drink (Patent Documents 3 and 4), a sugar transfer reaction, and a method for producing a naphthol-type sugar-binding substance using the same.
In addition, production of dairy oligosaccharides by transfer reaction of β-galactosidase (Non-patent document 6), production of fructo-oligosaccharides by β-fructofuranosidase (Non-patent document 6) by Fujita et al., Novel oligosaccharides and production methods thereof (patents) The practical application test results are reported in the literature 5).
本発明者はすでに、特許文献6に示すようにエンド1,4-β-D-キシラナーゼを用いて、新規二糖類であるキシロシルプシコースの合成に成功している。しかしながら、加水分解酵素を利用している転移反応であるため、D-プシコースを含む新規二糖類の収量が低いことや多種類の結合様式を有する反応物質が生成することを明らかにしている。 The inventor has already succeeded in synthesizing a novel disaccharide, xylosylpsicose, using endo 1,4-β-D-xylanase as shown in Patent Document 6. However, since it is a transfer reaction using hydrolase, it has been clarified that the yield of novel disaccharides including D-psicose is low and that reactants with various types of binding are generated.
D-プシコースの大量生産技術が確立され、D-プシコースに機能性が存在することが明らかになったことで、単糖の状態で機能を有するD-プシコースをオリゴ糖あるいは配糖体化することにより、既存のオリゴ糖よりもさらに高い機能を備えた新規オリゴ糖の創成が期待されるが、D-プシコースへのD-グルコースの転移反応を検討した例は、パラチノース生成酵素によるグルコシルプシコースの生成のみであり、その立体構造や収量を検討した例は見あたらない（非特許文献3）。
本発明は、D-グルコースとD-プシコースを構成糖とする1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの提供を目的としている。
D-psicose mass production technology has been established, and it has become clear that D-psicose has functionality, so that D-psicose that functions in the form of a monosaccharide can be converted to an oligosaccharide or glycoside. Is expected to create new oligosaccharides with higher functionality than existing oligosaccharides. The example of examining the transfer reaction of D-glucose to D-psicose is the production of glucosylpsicose by palatinose synthase. However, there are no examples of examining the three-dimensional structure and yield (Non-patent Document 3).
An object of the present invention is to provide 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose having D-glucose and D-psicose as constituent sugars.
そこで発明者らは、D-プシコースを構成糖としたオリゴ糖を製造する方法について研究を進める過程において、D-プシコースとα-グルコシル糖化合物(マルトース以上)を含有する溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ(EC 2.4.1.19)を水生媒体中で作用させることにより、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの生産ができることを見出し、本発明の完成に至った。 Therefore, in the process of proceeding with research on a method for producing an oligosaccharide having D-psicose as a constituent sugar, the inventors added cyclomaltodextrin / gluca to a solution containing D-psicose and an α-glucosyl sugar compound (maltose or higher). It was found that 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose can be produced by allowing notransferase (EC 2.4.1.19) to act in an aquatic medium, thereby completing the present invention.
すなわち本発明は、下記の(1)〜(4)の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを要旨としている。
(1)下記構造式1で示されるD-グルコースとD-プシコースを構成糖とする1-O-α-グルコピラノシルD-プシコース。
(1) 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose having D-glucose and D-psicose represented by the following structural formula 1 as constituent sugars.
また、本発明は、下記の(5)の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの混合物を要旨としている。
(5) (1)ないし(4)の二糖類からなる群から選ばれる1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを1以上含有する1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの混合物。
The gist of the present invention is a mixture of 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose of the following (5).
(5) A mixture of 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose containing one or more 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose selected from the group consisting of the disaccharides of (1) to (4).
また、本発明は、下記の(6)〜(9)の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの製造法を要旨としている。
(6) D-プシコ−スとα-グルコシル糖化合物を含有する溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ(EC 2.4.1.19)を水性媒体中で作用させ、下記構造式1,2,3及び4で示される1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを反応媒体から分離、あるいは精製することを特徴とする1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの製造方法。
(8) 1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを生成せしめるに際し、1-O-α-マルトシルD-プシコース及び1-O-α-マルトトリオシルD-プシコースを生成しないか若しくはそれらが検出できないほど少ないことを特徴とする請求項6又は8記載の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの製造方法。
(9) α-グルコシル糖化合物が、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、可溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、及びグリコーゲンから選ばれる1種または2種以上の糖質である請求項1,2又は3に記載の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの製造方法。
In addition, the gist of the present invention is the following (6) to (9) of the method for producing 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose.
(6) Cyclomaltodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19) is allowed to act in an aqueous medium on a solution containing D-psicose and an α-glucosyl sugar compound, and the following structural formulas 1, 2, 3 and 4 A method for producing 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose, comprising separating or purifying 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose represented by formula (1).
(8) When 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose is generated, 1-O-α-maltosyl D-psicose and 1-O-α-maltotriosyl D-psicose are not generated or cannot be detected. 9. The method for producing 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose according to claim 6 or 8, characterized in that the amount is small.
(9) The α-glucosyl sugar compound is one or more carbohydrates selected from malto-oligosaccharide, maltodextrin, cyclodextrin, amylose, amylopectin, soluble starch, liquefied starch, gelatinized starch, and glycogen. Item 4. A method for producing 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose according to Item 1, 2 or 3.
大量生産法が確立され、機能性が存在することが明らかになったD-プシコースについてオリゴ糖あるいは配糖体化することにより、既存のオリゴ糖よりもさらに高い機能を備えた新規オリゴ糖の創成が期待されるが、D-プシコースとD-グルコースを構成糖とする1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを提供することができる。 Creation of new oligosaccharides with higher functions than existing oligosaccharides by converting oligosaccharides or glycosides into D-psicose, which has been established as a mass production method and has been demonstrated to have functionality However, 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose containing D-psicose and D-glucose as constituent sugars can be provided.
本発明の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースはD-プシコースとα-グルコシル糖化合物(マルトース以上)を含有する溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを水性媒体中で作用させることにより、D-グルコシル基をD-プシコースに転移させることにより生産される。 The 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose of the present invention is obtained by allowing cyclomaltodextrin glucanotransferase to act in an aqueous medium on a solution containing D-psicose and an α-glucosyl sugar compound (maltose or higher). -Produced by transferring the glucosyl group to D-psicose.
D-グルコシル基をD-プシコースに転移させる作用を有するシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼは、市販のBacillus stearothermophilus由来のシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（株式会社 林原生物化学研究所製）が適しているが、Contizyme（Amano enzyme社製）、ToruzymeR3（Novozyme社製）及びBacillus属の生産するシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼにも当該1-O-α-グルコピラノシルD-プシコース生産性を有するものがある。 A commercially available cyclomaltodextrin / glucanotransferase derived from Bacillus stearothermophilus (manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratories Co., Ltd.) is suitable as the cyclomaltodextrin / glucanotransferase having the action of transferring the D-glucosyl group to D-psicose. However, Contizyme (manufactured by Amano enzyme), ToruzymeR3 (manufactured by Novozyme) and cyclomaltodextrin / glucanotransferase produced by the genus Bacillus also have the productivity of 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose.
次に本発明の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの製造法について説明する。
本発明の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースはD-プシコースとα-グルコシル糖化合物(マルトース以上)を含有する溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを水性媒体中で作用させることにより生産される。かかる反応に用いられるシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼは糖転移反応であり、本酵素生産菌の菌体内あるいは菌対外酵素を用いる他、酵素液の固定化等をおこない作用させてもよい。
Next, a method for producing 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose of the present invention will be described.
1-O-α-glucopyranosyl D-psicose of the present invention is produced by allowing cyclomaltodextrin / glucanotransferase to act in an aqueous medium on a solution containing D-psicose and an α-glucosyl sugar compound (maltose or higher). The Cyclomaltodextrin / glucanotransferase used in such a reaction is a glycosyltransferase reaction, and may be used by immobilizing an enzyme solution or the like in addition to using the intracellular or external enzyme of the enzyme-producing bacterium.
もちろん市販のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを用いても問題は無く、例えばBacillus 属 やKlebisilla属など、それ自体公知のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ生産菌や組換酵素であってもよい。さらに本酵素液を各種クロマトグラフィーで精製し、精製酵素として作用させてもよい。 Of course, there is no problem even if a commercially available cyclodextrin / glucanotransferase is used. For example, a known cyclodextrin / glucanotransferase producing bacterium or a recombinant enzyme such as Bacillus genus or Klebisilla genus may be used. Further, the enzyme solution may be purified by various chromatography and allowed to act as a purified enzyme.
D-プシコースとα-グルコシル糖化合物(マルトース以上)を含有する溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを水性媒体中で作用させる場合、例えばpH5.5に調製した0.01〜0.1M酢酸緩衝液中でD-プシコース15.0%存在下、シクロデキストリン（株式会社林原生物化学研究所製）5.0%で10〜90℃10分以上作用させること等によって反応液中に1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースが得られる。得られた反応液から、常法に従い、カラムクロマトグラフィーなどの処理により、本発明の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを精製することができる。 When cyclomaltodextrin / glucanotransferase is allowed to act in an aqueous medium on a solution containing D-psicose and an α-glucosyl sugar compound (maltose or higher), for example, in a 0.01 to 0.1 M acetate buffer adjusted to pH 5.5. 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose is added to the reaction solution by reacting with cyclodextrin (produced by Hayashibara Biochemical Laboratories Co., Ltd.) 5.0% at 10-90 ° C for 10 minutes or more in the presence of 15.0% D-psicose can get. From the resulting reaction solution, 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose of the present invention can be purified by treatment such as column chromatography according to a conventional method.
以下に実施例をあげて本発明の方法をさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらに限定されるものではない。
試験に用いた市販酵素剤を表1に示す。
Table 1 shows commercially available enzyme agents used in the test.
1.5mlのマイクロチューブ内に50mgのα-グルコシル糖化合物、すなわち各重合度のマルトオリゴ糖（マルトース、マルトトリオース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースあるいはマルトヘプタオース）、マルトデキストリン、シクロデキストリンあるいは可溶性澱粉及び50mgのD-プシコースを採取し、100マイクロリットルの50mM酢酸緩衝液pH5.5中を加えた懸濁溶液に、20マイクロリットルのシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研修所製）を加え（30U相当量）、40℃で18時間反応させた。反応終了後、反応液を沸騰湯浴中で10分間加熱処理し、反応液を遠心分離（1,500xg, 5分間）した後、上清を100倍希釈した。本上清溶液にイオン交換樹脂AG501（Bio-Rad社製）を添加し20分放置した後、0.45ミクロンのメンブランフィルターでろ過した溶液を高速液体クロマトグラフィーを用いて同定した。
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の分析条件は以下のとおりである。
カラム：Shodex KS-802 2連結（昭和電工株式会社製）
溶離液：蒸留水
流速：1ml/分
検出器：示差屈折率計（日立製作所製）
シクロデキストリン及びD-プシコースの反応液をHPLCで分析したクロマトグラム及び各重合度のマルトオリゴ糖による1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの生成結果をそれぞれ、図1及び図2に示した。図1における保持時間17.01のピーク成分は、D-プシコースとシクロデキストリンなど、α-グルコシル化合物を混合した場合にのみ生成することがわかった。また本ピーク成分を等量の0.2N塩酸と混合し、100℃で3時間加水分解、中和後、再びHPLCで分析したところ、D-プシコースとD-グルコースに相当する溶出位置にそれぞれピークが認められた。このことから、D-プシコースとα-グルコシル化合物の酵素反応によって、D-プシコースを構成糖とした1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースが特異的に生産されることがわかった。本二糖類化合物は、いずれのα-グルコシル化合物においても2〜10mg/ml濃度で1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを生成していた（図2）。
50 mg α-glucosyl sugar compound in a 1.5 ml microtube, that is, maltooligosaccharide (maltose, maltotriose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose or maltoheptaose) of each degree of polymerization, Maltodextrin, cyclodextrin or soluble starch and 50 mg of D-psicose were collected and suspended in 100 microliters of 50 mM acetate buffer pH 5.5 in 20 microliters of cyclomaltodextrin glucanotransferase ( (Produced by Hayashibara Biochemical Training Institute Co., Ltd.) was added (equivalent to 30U) and reacted at 40 ° C for 18 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was heat-treated in a boiling water bath for 10 minutes, the reaction solution was centrifuged (1,500 × g, 5 minutes), and the supernatant was diluted 100 times. Ion exchange resin AG501 (manufactured by Bio-Rad) was added to the supernatant solution and allowed to stand for 20 minutes, and then the solution filtered through a 0.45 micron membrane filter was identified using high performance liquid chromatography.
The analysis conditions of high performance liquid chromatography (HPLC) are as follows.
Column: Shodex KS-802 2 consolidated (made by Showa Denko KK)
Eluent: distilled water
Flow rate: 1ml / min
Detector: Differential refractometer (manufactured by Hitachi, Ltd.)
The chromatogram obtained by analyzing the reaction solution of cyclodextrin and D-psicose by HPLC and the production results of 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose by maltooligosaccharides of each degree of polymerization are shown in FIGS. 1 and 2, respectively. It was found that the peak component with a retention time of 17.01 in FIG. 1 was generated only when α-glucosyl compounds such as D-psicose and cyclodextrin were mixed. In addition, this peak component was mixed with an equal amount of 0.2N hydrochloric acid, hydrolyzed at 100 ° C for 3 hours, neutralized, and analyzed by HPLC again. A peak was found at the elution position corresponding to D-psicose and D-glucose. Admitted. From this, it was found that 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose containing D-psicose as a constituent sugar was specifically produced by an enzyme reaction between D-psicose and an α-glucosyl compound. This disaccharide compound produced 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose at a concentration of 2 to 10 mg / ml in any α-glucosyl compound (FIG. 2).
1.5mlのマイクロチューブ内に50mgのα-シクロデキストリン及び 50mgのD-プシコースを採取し、50マイクロリットルの50mM酢酸緩衝液pH5.5中を加えた懸濁溶液に、20マイクロリットルのBacillus stearothermophilus由来シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、Bacillus licheniformis を宿主として生産された組み換え酵素由来のToruzymeR3あるいはBacillus macerans 由来Contizymeをそれぞれ（5U相当量）加え、40℃で48時間反応させた。反応終了後の溶液は実施例1の分析方法に従って、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを分析した。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは様々な起源のシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼで合成されるが、その起源によって収量が異なった。本反応条件における1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースはBacillus stearothermophilus由来シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、ToruzymeR3及びContizymeでそれぞれ、2.8mg/ml、1.8mg/ml及び0.18mg/mlであった。
50 microliters of α-cyclodextrin and 50 mg of D-psicose collected in a 1.5 ml microtube and added to a suspension of 50 microliters of 50 mM acetate buffer pH 5.5, derived from 20 microliters of Bacillus stearothermophilus Cyclomaltodextrin / glucanotransferase, ToruzymeR3 derived from recombinant enzyme produced using Bacillus licheniformis as a host, or Contizyme derived from Bacillus macerans (5 U equivalent) were added and reacted at 40 ° C. for 48 hours. The solution after the reaction was analyzed for 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose according to the analysis method of Example 1.
1-O-α-Glucopyranosyl D-psicose was synthesized by cyclomaltodextrin glucanotransferase of various origins, but the yields differed depending on the origin. The 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose under the reaction conditions was 2.8 mg / ml, 1.8 mg / ml and 0.18 mg / ml for Bacillus stearothermophilus- derived cyclomaltodextrin / glucanotransferase, ToruzymeR3 and Contizyme, respectively.
1.5mlのマイクロチューブ内に25%(W/V)α-シクロデキストリンを段階的に希釈したもの10マイクロリットル及び25%D-プシコースを段階的に希釈したもの10マイクロリットルを含む溶液に、McIlvaine緩衝液pH5.5を10マイクロリットル添加した後、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（林原生物化学研究所製）10マイクロリットルを加え（15U相当量）、40℃で18時間反応させた。反応終了後の溶液は実施例1の分析方法に従って、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを分析した。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは、α-シクロデキストリンとD-プシコースの割合が1:4の場合に生産性が最大となった（図3）。
In a solution containing 10 microliters of 25% (W / V) α-cyclodextrin diluted stepwise and 10 microliters of 25% D-psicose diluted stepwise in a 1.5 ml microtube, McIlvaine After adding 10 microliters of buffer solution pH 5.5, 10 microliters of cyclomaltodextrin / glucanotransferase (manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratories) was added (15 U equivalent amount) and reacted at 40 ° C. for 18 hours. The solution after the reaction was analyzed for 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose according to the analysis method of Example 1.
1-O-α-Glucopyranosyl D-psicose was most productive when the ratio of α-cyclodextrin to D-psicose was 1: 4 (Figure 3).
1.5mlのマイクロチューブ内に25%(W/V)α-シクロデキストリン4マイクロリットル及び25%D-プシコース16マイクロリットルを含む溶液に、所定のpHに調整したMcIlvaine緩衝液を10マイクロリットル添加した後、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（林原生物化学研究所製）10マイクロリットルを加え（15U相当量）、40℃で18時間反応させた。反応終了後の溶液は実施例1の分析方法に従って、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを分析した。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは、緩衝液のpHが5〜6において、生産性が最大となった（図5）。
10 microliters of McIlvaine buffer adjusted to a predetermined pH was added to a solution containing 4 microliters of 25% (W / V) α-cyclodextrin and 16 microliters of 25% D-psicose in a 1.5 ml microtube. Thereafter, 10 microliters of cyclomaltodextrin / glucanotransferase (manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratories) was added (15 U equivalent), and the mixture was reacted at 40 ° C. for 18 hours. The solution after the reaction was analyzed for 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose according to the analysis method of Example 1.
The productivity of 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose was maximized when the pH of the buffer was 5-6 (FIG. 5).
1.5mlのマイクロチューブ内に25%(W/V)α-シクロデキストリン4マイクロリットル及び25%D-プシコース16マイクロリットルを含む溶液に、McIlvaine緩衝液pH5.5を10マイクロリットル添加した後、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（林原生物化学研究所製）10マイクロリットルを加え（15U相当量）、各温度条件で3時間反応させた。反応終了後の溶液は実施例1の分析方法に従って、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを分析した。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの生産性は、反応温度が上昇するに伴い徐々に増加し、60℃で最大となった後、徐々に減少する傾向を示した（図5）。
After adding 10 microliters of McIlvaine buffer pH 5.5 to a solution containing 4 microliters of 25% (W / V) α-cyclodextrin and 16 microliters of 25% D-psicose in a 1.5 ml microtube, 10 microliters of maltodextrin / glucanotransferase (manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratories) was added (amount equivalent to 15 U) and reacted at each temperature condition for 3 hours. The solution after the reaction was analyzed for 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose according to the analysis method of Example 1.
The productivity of 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose increased gradually as the reaction temperature increased, showed a tendency to decrease after reaching a maximum at 60 ° C (Fig. 5).
1.5mlのマイクロチューブ内に25%(W/V)α-シクロデキストリン4マイクロリットル及び25%D-プシコース16マイクロリットルを含む溶液に、McIlvaine緩衝液pH5.5を10マイクロリットル添加した後、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（林原生物化学研究所製）10マイクロリットルを加え（15U相当量）、40℃で所定時間反応させた。また反応開始100時間において、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（林原生物化学研究所製）10マイクロリットルを更に加え（15U相当量）反応を継続した。反応終了後の溶液は実施例1の分析方法に従って、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを分析した。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの生産性は、反応時間に伴って上昇したが、62時間でほぼ平衡に達し、新たなシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを添加した後においても、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの生産性の増加は認められなかった。（図6）。
After adding 10 microliters of McIlvaine buffer pH 5.5 to a solution containing 4 microliters of 25% (W / V) α-cyclodextrin and 16 microliters of 25% D-psicose in a 1.5 ml microtube, 10 microliters of maltodextrin / glucanotransferase (produced by Hayashibara Biochemical Laboratories) was added (equivalent to 15 U) and reacted at 40 ° C. for a predetermined time. Further, at 100 hours from the start of the reaction, 10 microliters of cyclomaltodextrin / glucanotransferase (produced by Hayashibara Biochemical Laboratories) was further added (equivalent to 15 U), and the reaction was continued. The solution after the reaction was analyzed for 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose according to the analysis method of Example 1.
The productivity of 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose increased with the reaction time, but almost reached equilibrium in 62 hours, and even after adding new cyclomaltodextrin glucanotransferase, No increase in productivity of O-α-glucopyranosyl D-psicose was observed. (Figure 6).
15mlのコニカルチューブ内に0.4gのα-シクロデキストリン及び1.6gのD-プシコースを採取し、蒸留水で4倍に希釈したMcIlvaine緩衝液pH5.5に溶解し、14.6mlとした。本溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（林原生物化学研究所製）400マイクロリットルを加え（600U相当量）、40℃で40時間反応させた。反応液を沸騰湯浴中で10分間加熱処理することにより、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを失活させた後、2000Uのアミログルコシダーゼ（Sigma社製）を加え、40℃で18時間反応させた。反応液を再び沸騰湯浴中で10分間加熱処理しアミログルコシダーゼを失活させた後、遠心分離（15,000xg,10分間）し、上清液を回収した。本上清液におよそ10gのAG501イオン交換樹脂（Bio-Rad社製）を添加し1時間放置した。
イオン交換樹脂を除いた溶液に活性炭1gを添加し、1時間攪拌した。ろ紙及びメンブランフィルターで活性炭を除去した後、本溶液を5mlになるまで減圧濃縮した。本溶液をToyopearl HW40S カラムクロマトグラフィー（カラム：φ2.5x90cm）に供した。分離条件は蒸留水を溶離液とし、カラム温度は40℃、さらに流速1mｌ/分でおこなった。溶離液を2mlずつフラクションコレクターで分画し、屈折率計(アタゴPR-100)で糖濃度を測定した（図7）。2糖類に相当する画分を回収し再度、減圧濃縮した後、Dowex50W(Ca型)カラムクロマトグラフィー（カラム：：φ2.5x90cm）に供した。分離条件は、蒸留水を溶離液とし、カラム温度25℃、流速1ml/分でおこなった。溶離液を3mlずつフラクションコレクターで分画し、屈折率計（アタゴFP-100）で糖濃度を測定した（図8）。二糖類化合物に相当する溶出ピークを回収し、減圧濃縮した後、凍結乾燥によって51.0mgの白色粉末を得た。
In a 15 ml conical tube, 0.4 g α-cyclodextrin and 1.6 g D-psicose were collected and dissolved in McIlvaine buffer pH 5.5 diluted 4-fold with distilled water to 14.6 ml. To this solution, 400 microliters of cyclomaltodextrin / glucanotransferase (produced by Hayashibara Biochemical Laboratories) was added (equivalent to 600 U) and reacted at 40 ° C. for 40 hours. After inactivating the cyclomaltodextrin / glucanotransferase by heating the reaction solution in a boiling water bath for 10 minutes, 2000 U of amyloglucosidase (Sigma) was added and reacted at 40 ° C. for 18 hours. . The reaction solution was again heat-treated in a boiling water bath for 10 minutes to inactivate amyloglucosidase, and then centrifuged (15,000 × g, 10 minutes) to recover the supernatant. About 10 g of AG501 ion exchange resin (manufactured by Bio-Rad) was added to the supernatant and left for 1 hour.
1 g of activated carbon was added to the solution excluding the ion exchange resin and stirred for 1 hour. After removing the activated carbon with a filter paper and a membrane filter, the solution was concentrated under reduced pressure to 5 ml. This solution was subjected to Toyopearl HW40S column chromatography (column: φ2.5 × 90 cm). Separation conditions were distilled water as an eluent, a column temperature of 40 ° C., and a flow rate of 1 ml / min. The eluate was fractionated by 2 ml with a fraction collector, and the sugar concentration was measured with a refractometer (Atago PR-100) (FIG. 7). Fractions corresponding to disaccharides were collected, concentrated again under reduced pressure, and then subjected to Dowex 50W (Ca type) column chromatography (column: φ2.5 × 90 cm). Separation conditions were performed using distilled water as an eluent, a column temperature of 25 ° C., and a flow rate of 1 ml / min. The eluent was fractionated by 3 ml with a fraction collector, and the sugar concentration was measured with a refractometer (Atago FP-100) (FIG. 8). The elution peak corresponding to the disaccharide compound was collected, concentrated under reduced pressure, and then lyophilized to obtain 51.0 mg of white powder.
各種糖質分解酵素による分解性
0.5mlの50mM酢酸緩衝液pH5.5に5mgの1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを溶解し、1.5mlマイクロチューブに50マイクロリットルをそれぞれ採取し（0.5mg相当）、0.5U相当量の各種グルコシダーゼ（Barley由来β-アミラーゼ、Rhizopus sp.由来アミログルコシダーゼ、Rice由来α-グルコシダーゼ、Aspergillus niger由来β-グルコシダーゼ）をそれぞれに添加し、40℃で18時間反応させた。反応終了後の溶液は実施例1の分析方法に従って、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを分析した。
その結果、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは、α-グルコシダーゼのみで分解され他の糖質分解酵素の作用は全く受けないことがわかった。
Degradability by various carbohydrate degrading enzymes
Dissolve 5 mg of 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose in 0.5 ml of 50 mM acetate buffer pH 5.5, collect 50 microliters each in a 1.5 ml microtube (equivalent to 0.5 mg), Various glucosidases (Barley-derived β-amylase, Rhizopus sp.- derived amyloglucosidase, Rice- derived α-glucosidase, Aspergillus niger- derived β-glucosidase) were added to each and reacted at 40 ° C. for 18 hours. The solution after the reaction was analyzed for 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose according to the analysis method of Example 1.
As a result, it was found that 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose was decomposed only by α-glucosidase and was not affected by other carbohydrases.
得られた新規二糖類化合物の性状が明らかになった。
構成糖
1.2mgの1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを0.2N塩酸0.2mlに溶解し、減圧下2時間98℃で加水分解した。加水分解試料を中和した後、一定量を上記HPLCで分析したところ、D-グルコース及びD-プシコースに相当する溶出位置に、同じ割合でピークが認められた。このことから、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは、D-グルコースとD-プシコースが1:1の割合で結合していることがわかった。
分子量
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの分子量は、TSKgel Oligo-PWカラム（東ソー株式会社製）を用いてHPLCで分析した。なおグルコースオリゴマー(1-20)(生化学工業株式会社製)を標準物質として用いた。
HPLC分析によって算出される1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの分子量は、293と見積もられた。これはD-グルコースとD-プシコースがグリコシド結合した場合の理論値342にほぼ等しい値となった。
NMR測定
試料40mgを600マイクロリットルのD2Oに溶解し、1HNMR及び13CNMRスペクトルを測定した。
NMR測定条件は、以下のとおりである。
装置：JEOL NM-SCM40
観測周波数：１HNMR:399.65MHｚ 13CNMR:100.40MHz
基準:TSP
温度:29.8℃
上記測定条件における結果を図9及び図10に示した。
測定結果から、二糖類化合物の結合様式はグルコースの還元末端1位がα結合でプシコースに結合していることが考えられたが、結合部位が異なった複数の混合物であることがわかった。
メチル化分析
常法に従って、新規二糖類化合物を部分メチル化した後、トリフルオロ酢酸を用いて水分解し、生成したメチル化単糖をアルジトールアセテート誘導体とし、ガスクロマトグラフ質量分析計で測定した。
ガスクロマトグラフ質量分析計の測定条件は以下のとおりである。
装置：日本電子 Auto-MassIII 質量分析計
Hewlett-Packard HP5890Aガスクロマトグラフ
ガスクロ部
装置：Hewlett-Packard HP5890A
カラム 液相:SPB-5（スペルコジャパン）
タイプ:fused silica capillary 25m x 0.25 mm I.D.
キャリアーガス:He
カラム温度:60℃, 1分 → 280℃
8℃/分
注入口温度:280℃
注入量:1マイクロリットル
注入モード:splitless
質量分析計部
イオン化方式:EI
電子加速電圧:70V
イオン化電流:300マイクロA
イオン源温度:250℃
イオン加速電圧:3.0KV
走査範囲:m/z40〜500(1sec/scan)
走査間隔:1sec
新規二糖類をメチル化し加水分解後、メチル化単糖をアルジトールアセテート(部分メチル化アルジトールアセテート)に変換し、ガスクロマトグラフ質量分析計により、糖鎖結合位置を解析した。トータルイオンクロマトグラフ図11に示し、図12及び図13に各ピークのマススペクトルを示した。
以上の性状より以下の構造式が得られた。
Constituent sugar
1.2 mg of 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose was dissolved in 0.2 ml of 0.2N hydrochloric acid and hydrolyzed at 98 ° C. for 2 hours under reduced pressure. After neutralizing the hydrolyzed sample, a certain amount was analyzed by the above-mentioned HPLC. As a result, peaks were observed at the same ratio at the elution positions corresponding to D-glucose and D-psicose. This indicates that 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose has D-glucose and D-psicose bound at a ratio of 1: 1.
Molecular weight
The molecular weight of 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose was analyzed by HPLC using a TSKgel Oligo-PW column (manufactured by Tosoh Corporation). Glucose oligomer (1-20) (manufactured by Seikagaku Corporation) was used as a standard substance.
The molecular weight of 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose calculated by HPLC analysis was estimated to be 293. This was almost equal to the theoretical value 342 when D-glucose and D-psicose were glycosidically bonded.
NMR measurement
A 40 mg sample was dissolved in 600 microliters of D2O, and 1 HNMR and 13 CNMR spectra were measured.
The NMR measurement conditions are as follows.
Equipment: JEOL NM-SCM40
Observation frequency: 1 HNMR: 399.65 MHz 13 CNMR: 100.40 MHz
Standard: TSP
Temperature: 29.8 ℃
The results under the above measurement conditions are shown in FIG. 9 and FIG.
From the measurement results, it was considered that the binding mode of the disaccharide compound was bound to psicose at the reducing terminal position 1 of glucose by an α bond, but it was found to be a plurality of mixtures with different binding sites.
Methylation analysis
In accordance with a conventional method, the novel disaccharide compound was partially methylated, then hydrolyzed with trifluoroacetic acid, and the resulting methylated monosaccharide was converted into an alditol acetate derivative and measured with a gas chromatograph mass spectrometer.
The measurement conditions of the gas chromatograph mass spectrometer are as follows.
Equipment: JEOL Auto-MassIII Mass Spectrometer
Hewlett-Packard HP5890A gas chromatograph Gas chromatograph unit: Hewlett-Packard HP5890A
Column Liquid phase: SPB-5 (Spelco Japan)
Type: fused silica capillary 25m x 0.25 mm ID
Carrier gas: He
Column temperature: 60 ° C, 1 minute → 280 ° C
8 ℃ / min Inlet temperature: 280 ℃
Injection volume: 1 microliter
Injection mode: splitless
Mass spectrometer
Ionization method: EI
Electron acceleration voltage: 70V
Ionization current: 300 micro A
Ion source temperature: 250 ° C
Ion acceleration voltage: 3.0KV
Scan range: m / z 40 to 500 (1 sec / scan)
Scan interval: 1 sec
After methylation and hydrolysis of the new disaccharide, the methylated monosaccharide was converted to alditol acetate (partially methylated alditol acetate), and the sugar chain binding position was analyzed by a gas chromatograph mass spectrometer. The total ion chromatogram is shown in FIG. 11, and the mass spectrum of each peak is shown in FIGS.
From the above properties, the following structural formula was obtained.
本発明化合物である1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは新規物質であり、ビフィ
ズス菌の増殖や植物の代謝に効果のある糖として、食品及び農林分野、さらに輸液等の糖
質としての医療分野への適用が期待される。
1-O-α-Glucopyranosyl D-psicose, a compound of the present invention, is a novel substance, and is a saccharide that is effective in the growth of bifidobacteria and plant metabolism. Application in the field is expected.
Claims (9)
The α-glucosyl sugar compound is one or more saccharides selected from malto-oligosaccharide, maltodextrin, cyclodextrin, amylose, amylopectin, soluble starch, liquefied starch, gelatinized starch, and glycogen. A process for producing 7 or 8 1-O-α-glucopyranosyl D-psicose.
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