JP2008220304A - Membrane-bound prenyltransferase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、膜結合性プレニルトランスフェラーゼ、その製造方法、当該トランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、および当該ＤＮＡの単離方法に関する。 The present invention relates to a membrane-bound prenyltransferase, a method for producing the same, a DNA encoding the transferase, and a method for isolating the DNA.
植物の生産する二次代謝産物の数は五万種を超えるとされ、天然有機化合物の大きなリソースとなっている。構造上の特徴から便宜上いくつかのグループに分類されるが、実際には異なったグループ間の特徴を併せ持つ化合物も非常に多い。プレニル化された芳香族化合物はその好例で、プレニル基は植物二次代謝産物の構造や生理活性の多様性に大きく貢献している。生合成的には複合経路と呼ばれる経路で生合成されるこれらの化合物は、耐虫性や耐病性などを担うことで植物の生命維持に必要な役割を担う一方で、薬用植物において生理活性本体としてその薬理作用に寄与しているものもある（非特許文献１）。例えば、プレニルフラボノイドには、抗腫瘍活性や抗菌作用といった様々な生理活性をもつものが多数報告されており（非特許文献２）、医薬及び食品産業でも非常に重要な化合物群となっている。これらはまた植物にとっては食害、感染防御において重要な役割を果たしている。 The number of secondary metabolites produced by plants is said to exceed 50,000, and this is a great resource for natural organic compounds. Although it is classified into several groups for convenience from the structural features, there are actually a large number of compounds having features between different groups. A prenylated aromatic compound is a good example, and the prenyl group contributes greatly to the diversity of structure and physiological activity of plant secondary metabolites. Biosynthetically, these compounds biosynthesized through a pathway called the complex pathway play a role necessary for plant life maintenance by bearing insect resistance, disease resistance, etc. Some of them contribute to their pharmacological action (Non-patent Document 1). For example, many prenylflavonoids having various physiological activities such as antitumor activity and antibacterial activity have been reported (Non-patent Document 2), which is a very important compound group in the pharmaceutical and food industries. They also play an important role in plant damage and defense.
とりわけ、プレニルフラボノイドなどプレニル芳香族化合物の生理活性に対するプレニル基の重要性は多くの研究者により指摘されており、実際プレニル基を持たない母核化合物には生理活性が見られないことも少なくない。従って、これら芳香族化合物のプレニル化を触媒する酵素は、産業的にも非常に重要と認識されている。しかし、芳香族を基質とするプレニルトランスフェラーゼは膜結合性のものが多く、生化学的研究の困難さから、これまで分子生物学的な解析が遅れており、フラボノイドを基質とする植物プレニルトランスフェラーゼに至っては、その遺伝子のクローニングは未だ一例も報告されていなかった。
したがって本発明は、膜結合性のプレニルトランスフェラーゼのＤＮＡを単離する方法、その単離方法によって得られるＤＮＡ、および膜結合性のプレニルトランスフェラーゼの提供を課題とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for isolating membrane-bound prenyltransferase DNA, DNA obtained by the isolation method, and membrane-bound prenyltransferase.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、従来、大腸菌を用いた発現系では膜蛋白質を発現させるのは困難であったところ、酵母でライブラリーを作成することにより植物由来の膜結合性プレニルトランスフェラーゼのｃＤＮＡの単離に成功し、本発明を完成するに至った。 The inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above problems, and conventionally, it has been difficult to express a membrane protein in an expression system using Escherichia coli. The present inventors have succeeded in isolating the membrane-bound prenyltransferase cDNA derived from the present invention and completed the present invention.
すなわち本発明は、以下の通りである。
項１．膜結合性プレニルトランスフェラーゼにおける、NDxxDxxxD、NQxxDxxxD、NQxxExxxD、DDxxDxxxD、DQxxDxxxD、またはDQxxExxxDからなる群より選択される少なくとも１つの保存モチーフを有し、かつ
化学式（Ｉ）：
That is, the present invention is as follows.
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素基、水酸基、フェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩ）：
(Wherein R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group, a phenyl group, a phenol group or an aryl group;
R 3 and R 4 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group),
Chemical formula (II):
（式中、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、水素基、水酸基、フェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ７およびＲ８は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩＩ）：
(Wherein R 5 and R 6 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group, a phenyl group, a phenol group or an aryl group;
R 7 and R 8 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group),
Chemical formula (III):
（式中、Ｒ９はフェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、あるいは
化学式（ＩＶ）：
(Wherein R 9 represents a phenyl group, a phenol group or an aryl group,
R 10 , R 11 and R 12 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group), or chemical formula (IV):
（式中、Ｒ１３はフェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）
で表される化合物にプレニル基を導入する酵素活性を示す膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
項２．YxxxxxxxG*AT、LxFxIGWLQ、(S/A)Gxx(S/T)FR, TxPxxxxFCxxIおよびAEYxxxPLFからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列モチーフを有する、項１記載の膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
項３．プレニルドナーとしてジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）を基質とする、項１に記載の膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
項４．以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
項５．以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチド：
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号３において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
項６．以下の（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチド：
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｆ）配列番号５において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
項７．以下の（ｇ）又は（ｈ）のポリペプチド：
（ｇ）配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｈ）配列番号７において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
項８．以下の（ｉ）又は（ｊ）のポリペプチド：
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｊ）配列番号９において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
項９．植物由来である、項１〜８のいずれかに記載の膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
項１０．植物が、マメ科、クワ科、オトギリソウ科、ミカン科、セリ科、キク科またはアサ科またはホップから選択される、項９に記載の膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
項１１．以下の（ｋ）又は（ｌ）に示すＤＮＡからなる遺伝子：
（ｋ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｌ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
項１２．以下の（ｍ）又は（ｎ）に示すＤＮＡからなる遺伝子：
（ｍ）配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｎ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
項１３．以下の（ｏ）又は（ｐ）に示すＤＮＡからなる遺伝子：
（ｏ）配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｐ）配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
項１４．以下の（ｑ）又は（ｒ）に示すＤＮＡからなる遺伝子：
（ｑ）配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｒ）配列番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
項１５．以下の（ｓ）又は（ｔ）に示すＤＮＡからなる遺伝子：
（ｓ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｔ）配列番号１０に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
項１６．項１１〜１５のいずれかに記載の遺伝子と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子。
項１７．項１１〜１６のいずれかに記載の遺伝子を含むベクター。
項１８．項１７に記載のベクターを保持する形質転換体。
項１９．項１８記載の形質転換体を培養し、その形質転換体および／またはその培養物から膜結合性プレニルトランスフェラーゼを採取する工程を含んでなる膜結合性プレニルトランスフェラーゼの調製方法。
項２０．形質転換体が酵母又は植物である、項１９に記載の方法。
項２１．項１１〜１６のいずれかに記載の遺伝子によってコードされる膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。
項２２．配列表の配列番号２、４、６、８または１０のいずれかに記載の塩基配列あるいはその一部を含んでなる塩基配列との相同性を利用することによって、膜結合性プレニルトランスフェラーゼ遺伝子を単離する方法。
(Wherein R 13 represents a phenyl group, a phenol group or an aryl group;
R 14 , R 15 and R 16 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group)
A membrane-bound prenyltransferase exhibiting an enzyme activity for introducing a prenyl group into a compound represented by the formula:
(A) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 1 and having prenyl transferase activity.
(C) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
(D) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 3, and having prenyltransferase activity.
(E) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5,
(F) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added, or substituted in SEQ ID NO: 5 and having prenyltransferase activity.
(G) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7,
(H) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 7 and having prenyltransferase activity.
(I) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9,
(J) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 9 and having prenyltransferase activity.
(K) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2,
(L) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encodes a membrane-bound prenyltransferase.
(M) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4,
(N) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and encodes a membrane-bound prenyltransferase.
Item 13. A gene comprising DNA shown in the following (o) or (p):
(O) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6,
(P) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and encodes a membrane-bound prenyltransferase.
Item 14. The gene consisting of DNA shown in the following (q) or (r):
(Q) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8,
(R) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 and encodes a membrane-bound prenyltransferase.
(S) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 10,
(T) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and encodes a membrane-bound prenyltransferase.
Item 16. A gene comprising a base sequence having at least 70% homology with the gene according to any one of
Item 17. Item 17. A vector comprising the gene according to any one of
Item 18. Item 18. A transformant carrying the vector according to Item 17.
Item 19. Item 19. A method for preparing a membrane-bound prenyltransferase comprising culturing the transformant according to Item 18 and collecting the membrane-bound prenyltransferase from the transformant and / or the culture.
Item 21. Item 17. A membrane-bound prenyltransferase encoded by the gene according to any one of
Item 22. By utilizing the homology with the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 or 10 in the sequence listing or a base sequence comprising a part thereof, a membrane-bound prenyltransferase gene can be isolated. How to release.
本発明によれば、
以下の化学式（Ｉ）：
According to the present invention,
The following chemical formula (I):
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素基、水酸基、フェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩ）：
(Wherein R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group, a phenyl group, a phenol group or an aryl group;
R 3 and R 4 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group),
Chemical formula (II):
（式中、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、水素基、水酸基、フェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ７およびＲ８は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩＩ）：
(Wherein R 5 and R 6 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group, a phenyl group, a phenol group or an aryl group;
R 7 and R 8 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group),
Chemical formula (III):
（式中、Ｒ９はフェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、あるいは
化学式（ＩＶ）：
(Wherein R 9 represents a phenyl group, a phenol group or an aryl group,
R 10 , R 11 and R 12 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group), or chemical formula (IV):
（式中、Ｒ１３はフェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）
で表される化合物にプレニル基を導入する酵素活性を示す、プレニルトランスフェラーゼおよび当該酵素をコードする遺伝子が提供される。本発明の酵素は熱に対して安定であることから産業的に利用しやすい酵素である。また、本発明の酵素により、様々な有用な生理活性を示すプレニル芳香族化合物を大量かつ安価に生産できる。さらに、本発明の遺伝子の配列を用いて、プレニル化二次代謝物を多く含有する植物などから、芳香族化合物をプレニル化する酵素の遺伝子を単離することが可能となる。
(Wherein R 13 represents a phenyl group, a phenol group or an aryl group;
R 14 , R 15 and R 16 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group)
A prenyl transferase and a gene encoding the enzyme exhibiting an enzyme activity for introducing a prenyl group into the compound represented by the formula: Since the enzyme of the present invention is stable against heat, it is an industrially easy enzyme. In addition, prenyl aromatic compounds exhibiting various useful physiological activities can be produced in large quantities and at low cost by the enzyme of the present invention. Furthermore, using the gene sequence of the present invention, it is possible to isolate a gene of an enzyme that prenylates an aromatic compound from a plant containing a large amount of prenylated secondary metabolites.
また、農業分野における分子育種のツールとしても、本発明の膜結合プレニルトランスフェラーゼ遺伝子を利用することができる。 The membrane-bound prenyltransferase gene of the present invention can also be used as a molecular breeding tool in the agricultural field.
（膜結合性プレニルトランスフェラーゼ）
本発明の膜結合性プレニルトランスフェラーゼは、膜結合性プレニルトランスフェラーゼにおける保存モチーフを少なくとも１つ有し、かつ
以下の化学式（Ｉ）：
(Membrane-bound prenyltransferase)
The membrane-bound prenyltransferase of the present invention has at least one conserved motif in the membrane-bound prenyltransferase and has the following chemical formula (I):
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、水素基、水酸基、フェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩ）：
(Wherein R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group, a phenyl group, a phenol group or an aryl group;
R 3 and R 4 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group),
Chemical formula (II):
（式中、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、水素基、水酸基、フェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ７およびＲ８は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩＩ）：
(Wherein R 5 and R 6 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group, a phenyl group, a phenol group or an aryl group;
R 7 and R 8 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group),
Chemical formula (III):
（式中、Ｒ９はフェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、あるいは
化学式（ＩＶ）：
(Wherein R 9 represents a phenyl group, a phenol group or an aryl group,
R 10 , R 11 and R 12 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group), or chemical formula (IV):
（式中、Ｒ１３はフェニル基、フェノール基若しくはアリール基を示し、
Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）
で表される化合物にプレニル基を導入する酵素活性を示す膜結合性プレニルトランスフェラーゼである。
(Wherein R 13 represents a phenyl group, a phenol group or an aryl group;
R 14 , R 15 and R 16 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group)
Is a membrane-bound prenyltransferase exhibiting an enzyme activity for introducing a prenyl group into a compound represented by the formula:
膜結合性プレニルトランスフェラーゼにおける保存モチーフとしては、例えば、NDxxDxxxD、NQxxDxxxD、NQxxExxxD、DDxxDxxxD、DQxxDxxxD、またはDQxxExxxDからなる群より選択される少なくとも１つの保存モチーフが挙げられる。これらの保存モチーフにおいて、ｘで表された箇所はいかなるアミノ酸であってもよい。 Examples of the conserved motif in the membrane-bound prenyl transferase include at least one conserved motif selected from the group consisting of NDxxDxxxD, NQxxDxxxD, NQxxExxxD, DDxxDxxxD, DQxxDxxxD, or DQxxExxxD. In these conserved motifs, the position represented by x may be any amino acid.
本発明の膜結合性プレニルトランスフェラーゼは、さらにYxxxxxxxG*AT、LxFxIGWLQ、(S/A)Gxx(S/T)FR, TxPxxxxFCxxIおよびAEYxxxPLFからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列モチーフを有していてもよい。ｘで表された箇所は上記と同様である。また、これらのモチーフは、相互に、後述の図５のマルチアラインメントで示す程度の間隔をおいた位置に存するのが好ましいが、これらに限定はされない。 The membrane-bound prenyltransferase of the present invention further has at least one amino acid sequence motif selected from the group consisting of YxxxxxxxG * AT, LxFxIGWLQ, (S / A) Gxx (S / T) FR, TxPxxxxFCxxI and AEYxxxPLF. May be. The part represented by x is the same as described above. In addition, these motifs are preferably located at positions spaced apart from each other by the degree of multi-alignment shown in FIG. 5 described later, but are not limited thereto.
本発明の膜結合性プレニルトランスフェラーゼが活性を示す基質としては、フラボノイド、イソフラボノイド、クマリン、カルコンおよび／またはフロログルシノールなどが挙げられる。 Examples of the substrate in which the membrane-bound prenyltransferase of the present invention exhibits activity include flavonoids, isoflavonoids, coumarins, chalcones and / or phloroglucinol.
好ましいフラボノイドとしては、ナリンゲニン、ヘスペレチン、ガランギン、クリシン、イソサクラネチンまたは２’，４’，４−トリヒドロキシ−６’−メトキシカルコンなどが挙げられる。 Preferred flavonoids include naringenin, hesperetin, galangin, chrysin, isosakuranetin or 2 ', 4', 4-trihydroxy-6'-methoxychalcone.
本発明の膜結合性プレニルトランスフェラーゼは、プレニルドナーとしてジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、フィチル二リン酸（ＰＤＰ）などを基質とする。 The membrane-bound prenyltransferase of the present invention has dimethylallyl diphosphate (DMAPP), geranyl diphosphate (GPP), farnesyl diphosphate (FPP), geranylgeranyl diphosphate (GGPP), phytyl diphosphate (PGPP) as prenyl donors. PDP) is used as a substrate.
例えば、本発明の膜結合性プレニルトランスフェラーゼの一例としては、以下の（ａ）〜（ｊ）のポリペプチドが挙げられる：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号３において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｆ）配列番号５において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｇ）配列番号７のびアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｈ）配列番号７において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（ｊ）配列番号９において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
For example, examples of the membrane-bound prenyltransferase of the present invention include the following polypeptides (a) to (j):
(A) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 1 and having prenyltransferase activity;
(C) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
(D) a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 3 and having prenyl transferase activity;
(E) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5,
(F) a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 5 and having prenyltransferase activity;
(G) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7,
(H) a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 7 and having prenyltransferase activity;
(I) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and (j) an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 9, and a prenyltransferase A polypeptide having activity.
（ｂ）のポリペプチドは、（ａ）のポリペプチドにおいて、１又は複数個、例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたポリペプチドであってもよい。 The polypeptide (b) is a polypeptide in which one or more, for example 1 to 50, preferably 1 to 30 amino acids are substituted, added, deleted or inserted in the polypeptide (a). May be.
（ｄ）のポリペプチドは、（ｃ）のポリペプチドにおいて、１又は複数個、例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたポリペプチドであってもよい。 The polypeptide (d) is a polypeptide in which one or more, for example, 1 to 50, preferably 1 to 30, amino acids are substituted, added, deleted or inserted in the polypeptide (c). May be.
（ｆ）のポリペプチドは、（ｅ）のポリペプチドにおいて、１又は複数個、例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたポリペプチドであってもよい。 The polypeptide of (f) is a polypeptide in which one or more, for example, 1 to 50, preferably 1 to 30 amino acids are substituted, added, deleted or inserted in the polypeptide of (e). May be.
（ｈ）のポリペプチドは、（ｇ）のポリペプチドにおいて、１又は複数個、例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたポリペプチドであってもよい。 The polypeptide (h) is a polypeptide in which one or more, for example, 1 to 50, preferably 1 to 30, amino acids are substituted, added, deleted or inserted in the polypeptide (g). May be.
（ｉ）のポリペプチドは、（ｊ）のポリペプチドにおいて、１又は複数個、例えば１〜５０個、好ましくは１〜３０個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたポリペプチドであってもよい。 The polypeptide (i) is a polypeptide in which one or more, for example 1 to 50, preferably 1 to 30 amino acids are substituted, added, deleted or inserted in the polypeptide (j). May be.
限定はされないが、具体的には、以下のように置換することが可能である：例えばアミノ酸の置換の場合は、タンパク質の構造保持の観点から、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンは非極性アミノ酸に分類され；セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンは極性アミノ酸に分類され；フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンは芳香族アミノ酸に分類され；アスパラギン酸、グルタミン酸は酸性アミノ酸に分類される。従って、同じ群のアミノ酸から選択して置換することができる。 Although it is not limited, specifically, substitution is possible as follows: For example, in the case of amino acid substitution, from the viewpoint of maintaining the structure of the protein, it is polar, charged, soluble, hydrophilic / hydrophobic. In this respect, the amino acid can be substituted with an amino acid having properties similar to those of the amino acid before substitution. For example, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, and proline are classified as nonpolar amino acids; serine, threonine, cysteine, methionine, asparagine, and glutamine are classified as polar amino acids; phenylalanine, tyrosine, and tryptophan are classified as aromatic amino acids. Aspartic acid and glutamic acid are classified as acidic amino acids. Accordingly, substitution can be made by selecting from the same group of amino acids.
好ましい置換の具体例としては、例えば、配列表の配列番号１で表すアミノ酸配列において、１２６番目のメチオニンのアラニンへの置換、１５８番目のバリンのメチオニンへの置換などが挙げられる。 Specific examples of preferable substitution include substitution of 126th methionine with alanine and substitution of 158th valine with methionine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
また、本発明の膜結合性プレニルトランスフェラーゼは、植物由来であることが好ましく、特に、マメ科、クワ科、オトギリソウ科、ミカン科、セリ科、キク科またはアサ科、ホップ由来であることが好ましい。 Further, the membrane-bound prenyltransferase of the present invention is preferably derived from a plant, and particularly preferably derived from a legume, mulberry, hypericaceae, citrus, asteraceae, chrysanthemum, or genus, hop. .
（膜結合性プレニルトランスフェラーゼ遺伝子）
本発明には、以下の（ｋ）〜（ｔ）のいずれかのＤＮＡからなる膜結合性プレニルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる：
（ｋ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｌ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、
（ｍ）配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｎ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、
（ｏ）配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｐ）配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、
（ｑ）配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｒ）配列番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、
（ｓ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡ、および
（ｔ）配列番号１０に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
(Membrane-bound prenyltransferase gene)
The present invention includes a membrane-bound prenyltransferase gene comprising any of the following DNAs (k) to (t):
(K) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2,
(L) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encodes a membrane-bound prenyltransferase;
(M) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4,
(N) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and encodes a membrane-bound prenyltransferase;
(O) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6,
(P) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, and which encodes a membrane-bound prenyltransferase;
(Q) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8,
(R) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, and which encodes a membrane-bound prenyltransferase;
(S) hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 10 and (t) DNA consisting of the base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and membrane-bound DNA encoding sex prenyltransferase.
ここで、本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、例えば、検出対象となるポリヌクレオチドを固定化した支持体に、プローブを作用させ、０．７〜１．０MのNaCl存在下において４２℃にて２時間プレハイブリダイゼーションを行った後、０．７〜１．０MのNaCl存在下において４２℃にて１２〜１６時間ハイブリダイゼーションを行い、その後０．１〜２倍程度のSSC溶液（１倍濃度のSSC溶液の組成は、１５０mM塩化ナトリウム、１５mMクエン酸ナトリウム）を用いて４２℃でフィルターを洗浄することにより同定できるDNA等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed.,（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。 As used herein, “polynucleotide hybridizing under stringent conditions” refers to a polynucleotide obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like. Meaning, for example, a probe is allowed to act on a support on which a polynucleotide to be detected is immobilized, and after prehybridization at 42 ° C. for 2 hours in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl, Hybridization is performed at 42 ° C. for 12 to 16 hours in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl, and then about 0.1 to 2 times the SSC solution (the composition of the 1 time concentration SSC solution is 150 mM sodium chloride). , 15 mM sodium citrate) at 42 ° C. Mention may be made of a more identification can be DNA and the like. Hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989).
本発明には、（ｋ）〜（ｔ）のいずれかの遺伝子と、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列からなる遺伝子が含まれる。 In the present invention, any one of the genes (k) to (t) and, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 93% or more, particularly preferably 95% or more. Most preferably, a gene comprising a base sequence having a homology of 98% or more is included.
（ベクター）
本発明のベクターは、上記（ｋ）〜（ｔ）のＤＮＡが挿入された組み換えベクターである。ベクターとしては公知の酵母用、植物細胞用等のものを広く使用できる。公知のベクターとしては、酵母用ベクターとしてはpDR196、pYES-DEST 52、Yip5、Yrp17、Yep24など、植物細胞用としては、pGWB vector(pGWB2、pGWB5、pGWB80など；島根大学、中川強先生よりご分与)、pBiEl2-GUS、pIG121-Hm、pBI121、pBiHyg-HSE、pB119、pBI101、pGV3850、pABH-Hm1などが挙げられる。本発明において使用されるベクターは、必要に応じて、選択マーカー（例えば、薬物耐性遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子）を含有する。
(vector)
The vector of the present invention is a recombinant vector into which the DNAs (k) to (t) are inserted. Known vectors for yeast, plant cells, etc. can be widely used. Known vectors include pDR196, pYES-DEST 52, Yip5, Yrp17, and Yep24 for yeast vectors, and pGWB vectors for plant cells (pGWB2, pGWB5, pGWB80, etc .; from Shimane University, Tsuyoshi Nakagawa PBiEl2-GUS, pIG121-Hm, pBI121, pBiHyg-HSE, pB119, pBI101, pGV3850, pABH-Hm1, and the like. The vector used in the present invention contains a selectable marker (for example, drug resistance gene, antibiotic resistance gene, reporter gene) as necessary.
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、本発明の組み換えベクターを保持する形質転換体である。宿主は、ベクターに適したものを使用すればよい。例えば、酵母、植物細胞、昆虫細胞（Sf9など）などが好ましい。特に好ましい形質転換体としては、酵母又は植物細胞などが挙げられる。形質転換方法は当業者に周知である。
(Transformant)
The transformant of the present invention is a transformant carrying the recombinant vector of the present invention. What is necessary is just to use a host suitable for a vector. For example, yeast, plant cells, insect cells (Sf9 etc.) are preferred. Particularly preferred transformants include yeast or plant cells. Transformation methods are well known to those skilled in the art.
（膜結合性プレニルトランスフェラーゼの調製方法）
上記形質転換体および／またはその培養物の培養液から膜結合性プレニルトランスフェラーゼを回収することで、活性を保持した組換え膜結合性プレニルトランスフェラーゼを得ることができる。
(Method for preparing membrane-bound prenyltransferase)
By recovering the membrane-bound prenyltransferase from the transformant and / or the culture solution thereof, a recombinant membrane-bound prenyltransferase retaining the activity can be obtained.
具体的には、例えば、Yazaki et al (JBC, 2002, 277, 6240-6246)に記載の方法を用いて行うことが出来る。 Specifically, for example, the method described in Yazaki et al (JBC, 2002, 277, 6240-6246) can be used.
また、本発明の膜結合プレニルトランスフェラーゼは、例えば、酵母発現系を用いた大量生産により、または大豆などの食用植物で発現させることにより、得ることができる。 In addition, the membrane-bound prenyltransferase of the present invention can be obtained, for example, by mass production using a yeast expression system or by expression in an edible plant such as soybean.
より具体的には、本発明の膜結合プレニルトランスフェラーゼは、酵母において高い活性を持ったタンパク質として発現できるため、形質転換酵母の培養液にナリンゲニン等のフラボノイドを基質として投与する事で、効率よくプレニル化フラボノイドの大量生産が可能である。ナリンゲニンは適度な水溶性と疎水性を持つため、生体膜を通過する事ができ、酵母細胞内のプレニルトランスフェラーゼと接触できる。酵母はサイトゾルにDMAPPを生合成する経路（メバロン酸経路）を有しているため、プレニル基質はインビボで供給される。生産されたプレニル化フラボノイドは、酵母細胞あるいは培地から回収する事で、効率のよい生産が見込まれる。 More specifically, since the membrane-bound prenyltransferase of the present invention can be expressed as a protein having high activity in yeast, prenyl can be efficiently obtained by administering a flavonoid such as naringenin as a substrate to a culture solution of transformed yeast. Large-scale production of hydroflavonoids is possible. Naringenin has moderate water solubility and hydrophobicity, so it can cross biological membranes and can contact prenyltransferase in yeast cells. Since yeast has a pathway for biosynthesis of DMAPP in the cytosol (mevalonate pathway), the prenyl substrate is supplied in vivo. The produced prenylated flavonoid is expected to be efficiently produced by recovering it from yeast cells or culture media.
あるいは、本発明の膜結合プレニルトランスフェラーゼを大豆等の植物細胞で発現させる事で、プレニル化フラボノイドを植物で生産する事も可能である。植物細胞の場合、DMAPPを生合成する経路は２つあり、一つはサイトゾルのメバロン酸経路、もう一方はプラスチド内に局在する非メバロン酸経路である。前者のDMAPPを利用してプレニル化フラボノイドを生産させるためには、プラスチド局在化シグナルを除いた改変遺伝子を、後者のDMAPPを利用したプレニル化フラボノイド生産を行うためには、内在性のプラスチド局在化シグナルを使うかRuBisCo小サブユニットなど他遺伝子のプラスチド局在化シグナルを連結してプレニルトランスフェラーゼをプラスチドに局在させる。フラボノイド基質は、内在性のものがプレニル化されるため、植物を育成させてその組織からプレニル化フラボノイドを回収する。あるいは、ナリンゲニンのようなフラボノイドを吸収させてプレニル化させ、それを植物組織から回収する事も効率の良い生産に有効である。植物のどの組織でプレニル化フラボノイドを生産させるのが良いかは、組織特異的なプロモータを利用する事で制御可能である。 Alternatively, prenylated flavonoids can be produced in plants by expressing the membrane-bound prenyltransferase of the present invention in plant cells such as soybeans. In the case of plant cells, there are two pathways for biosynthesis of DMAPP, one is the cytosolic mevalonate pathway and the other is the non-mevalonate pathway localized in plastids. In order to produce prenylated flavonoids using the former DMAPP, a modified gene excluding the plastid localization signal is used. In order to produce prenylated flavonoids using the latter DMAPP, the endogenous plastid station is used. Localize prenyltransferases to plastids by using localization signals or linking plastid localization signals of other genes such as RuBisCo small subunit. Since the endogenous flavonoid substrate is prenylated, the plant is grown and the prenylated flavonoid is recovered from the tissue. Alternatively, it is also effective for efficient production that flavonoids such as naringenin are absorbed to be prenylated and recovered from the plant tissue. Which tissue in the plant should produce prenylated flavonoids can be controlled by using a tissue-specific promoter.
プレニル化フラボノイドを生産する植物は、上記のように化合物生産の目的にも利用可能であるが、プレニル化フラボノイドの多くが高い抗菌活性を有する事から、病害虫に対して高い抵抗性を示す事が考えられる。従って、農業分野における分子育種のツールとして、本発明の膜結合プレニルトランスフェラーゼ遺伝子は利用可能である。 Plants producing prenylated flavonoids can be used for the purpose of compound production as described above, but since many prenylated flavonoids have high antibacterial activity, they may exhibit high resistance to pests. Conceivable. Therefore, the membrane-bound prenyltransferase gene of the present invention can be used as a molecular breeding tool in the agricultural field.
（遺伝子の単離方法）
また、配列表の配列番号２、４、６、８または１０のいずれかに記載の塩基配列あるいはその一部を含んでなる塩基配列との相同性を利用すれば、膜結合性プレニルトランスフェラーゼ遺伝子を単離することができる。
(Gene isolation method)
Further, if the homology with the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 or 10 in the sequence listing or a base sequence comprising a part thereof is used, a membrane-bound prenyltransferase gene can be obtained. It can be isolated.
具体的な方法としては、例えば、膜結合性プレニルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれると予想される遺伝子ライブラリーを、前記塩基配列をプローブとしてスクリーニングする方法、あるいは、前記塩基配列情報に基づいたプライマーを調製し、膜結合性プレニルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれると予想されるサンプルを鋳型としたＰＣＲを実施する方法などが挙げられる。 Specific methods include, for example, a method of screening a gene library expected to contain a membrane-bound prenyltransferase gene using the base sequence as a probe, or preparing a primer based on the base sequence information. And a method of performing PCR using a sample expected to contain a membrane-bound prenyltransferase gene as a template.
以下、本発明を、実施例を示してより詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．発現ライブラリーの構築
S.flavescens培養細胞を、フラボノイドのプレニル化酵素を誘導させるために、0.1Mのジャスモン酸メチルDMSO溶液20μlを添加し、３６時間培養した(終濃度0.1 mM)。培養細胞よりOligotex-MAG mRNA Purification Kit(タカラバイオ社)を使用してpoly(A)+RNAを単離した。cDNAプラスミドライブラリーを、cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE)を使用し、膜結合性タンパク質の酵母発現用ベクターpDR196を用いて、構築した。cDNAの第１鎖を、7μgのポリ(A)+RNA、XhoI制限部位を含むoligo(dT)18アンカープライマーを使用して合成した。cDNAの第２鎖を合成した後、EcoRI制限サイトを含む平滑末端アダプターを二本鎖DNAへ結合させ、次いで当該フラグメントを、構成的プロモーターPMA1を有するプラスミド、pDR196中に組み込んだ。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated in more detail, this invention is not limited to these.
1. Construction of expression library
In order to induce flavonoid prenylation enzyme, 20 μl of 0.1 M methyl jasmonate DMSO solution was added to S. flavescens cultured cells and cultured for 36 hours (final concentration 0.1 mM). Poly (A) + RNA was isolated from the cultured cells using Oligotex-MAG mRNA Purification Kit (Takara Bio Inc.). A cDNA plasmid library was constructed using the cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE) and the yeast expression vector pDR196 for membrane-bound proteins. The first strand of cDNA was synthesized using 7 μg poly (A) + RNA, an oligo (dT) 18 anchor primer containing a XhoI restriction site. After synthesizing the second strand of the cDNA, a blunt end adapter containing an EcoRI restriction site was ligated to the double stranded DNA, and the fragment was then incorporated into a plasmid with the constitutive promoter PMA1, pDR196.
２．SfN8DT cDNAのクローニングおよびDNA塩基配列の決定
上記構築したｃＤＮＡライブラリーをEscherichia coli DH10Bに導入し、約10,000個のクローンをランダムに選出し、ＰＭＡ１プロモーター領域にアニールするプライマーを用いて５’末端から配列決定した。そのうち、既知の膜結合性プレニルトランスフェラーゼにおける保存モチーフ6種(NDxxDxxxD, NQxxDxxxD, NQxxExxxD, DDxxDxxxD, DQxxDxxxD, DQxxExxxD)のいずれかを有する２００クローンを選出した。当該ｃＤＮＡクローンを、ＳＯＳＵＩプログラム（http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)を用いて分析し、少なくとも配列決定した領域において膜貫通領域を有する２０クローンを検出した。２００クローンを３つの細胞内局在予測プログラム：ChloroP, PSORT, およびWoLF_PSORT（ChloroP; http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/, PSORT; http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html, WoLF_PSORT; http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/)を用いて分析し、３０クローンがプラスチド移行シグナルを有していることがわかった。
これらのクローンを、酢酸リチウム法を用いて酵母株W303-1A-Δcoq2に導入した。SD-Ura液体培地（１８０ｍｌ）中で対数増殖期に達するまで培養することによって、酵母形質転換体中で組換えタンパク質発現させ、そこからYazakiら（JBC, 2002, 277, 6240-6246）に記載の方法を用いてミクロソーム画分を調製した。それぞれの形質転換体の膜フラクションを５００μｌの0.1 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 8.5)中に再懸濁し、次いで、ナリンゲニンとDMAPPを基質として酵素活性によるスクリーニングを行った。
酵素生成物はＨＰＬＣ分析を用いてスクリーニングした。ＨＰＬＣ分析は以下で行った：
Shimadzu LC-10A system (島津製作所、日本、京都): column YMC-Pack Pro C18 RS (YMC,日本、京都) 4.6 x 250 mm; 溶媒システム, メタノール:H2O:酢酸(70: 30: 0.3); 流速, 1 ml min-1; 検出, SPD6A フォトダイオード・アレイ検出器で230-320 nm。
2. Cloning of SfN8DT cDNA and determination of DNA base sequence The cDNA library constructed above is introduced into Escherichia coli DH10B, about 10,000 clones are randomly selected and sequenced from the 5 'end using primers that anneal to the PMA1 promoter region. Were determined. Among them, 200 clones having any one of the six conserved motifs (NDxxDxxxD, NQxxDxxxD, NQxxExxxD, DDxxDxxxD, DQxxDxxxD, DQxxExxxD) in the known membrane-bound prenyltransferase were selected. The cDNA clone was analyzed using the SOSUI program (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/), and 20 clones having a transmembrane region in at least the sequenced region were detected. 200 clones from three subcellular localization prediction programs: ChloroP, PSORT, and WoLF_PSORT (ChloroP; http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/, PSORT; http: //psort.ims.u- tokyo.ac.jp/form.html, WoLF_PSORT; http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/), 30 clones were found to have a plastid translocation signal.
These clones were introduced into the yeast strain W303-1A-Δcoq2 using the lithium acetate method. Recombinant proteins are expressed in yeast transformants by culturing in SD-Ura liquid medium (180 ml) until reaching the logarithmic growth phase, and then described in Yazaki et al. (JBC, 2002, 277, 6240-6246) The microsomal fraction was prepared using the method described above. The membrane fraction of each transformant was resuspended in 500 μl of 0.1 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), and then screened for enzyme activity using naringenin and DMAPP as substrates.
Enzyme products were screened using HPLC analysis. HPLC analysis was performed as follows:
Shimadzu LC-10A system (Shimadzu, Kyoto, Japan): column YMC-Pack Pro C18 RS (YMC, Kyoto, Japan) 4.6 x 250 mm; solvent system, methanol: H 2 O: acetic acid (70:30: 0.3) ; Flow rate, 1 ml min -1 ; Detection, 230-320 nm with SPD6A photodiode array detector.
その結果、２００個の酵母形質転換体中、１つのクローンの生成物が、８−ジメチルアリルナリンゲニンと同じ保持時間を有することがわかった。さらに、その生成物はフォトダイオード・アレイ検出において、標品と同等のＵＶスペクトルを示した。
こうして、sophoraflavanone G (SFG)生合成における最初のフラボノイド・プレニルトランスフェラーゼであるナリンゲニン 8-ジメチルアリルトランスフェラーゼ(以下SfN8DTと称す)のcDNA(全長1,495 bp, ORF 410 a.a.)が得られた。
SfN8DTの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。
As a result, it was found that the product of one clone among 200 yeast transformants had the same retention time as 8-dimethylallylnaringenin. In addition, the product showed a UV spectrum comparable to that of a standard in photodiode array detection.
Thus, cDNA (total length 1,495 bp, ORF 410 aa) of naringenin 8-dimethylallyltransferase (hereinafter referred to as SfN8DT), which is the first flavonoid prenyltransferase in biosynthesis of sophoraflavanone G (SFG), was obtained.
The base sequence of SfN8DT is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
３．酵母発現系を用いた組換えSfN8DTの基質特異性の解析
組換えSfN8DTの酵素化学的性質を主にＨＰＬＣ分析を用いて行った。さらにプレニルドナーに対する基質特異性はＬＣ／ＭＣ分析で行い、様々なフラボノイド化合物（アピゲニン、ケンフェロール、クエルセチン、タクシフォリン、ゲニステイン、マーキアイン）に対する基質特異性はRadioactive assayによって行った。
その結果、組換えSfN8DTは、ナリンゲニン以外に同じフラバノン骨格を有するヘスペレチンのみをプレニル化し、それ以外は基質としなかった。また、SFGの二番目のプレニル化段階の基質であるLGや、この酵素と類似の配列を持つ別の酵素が基質とするHGAもSfN8DTの基質とはならなかった。一方、プレニルドナーとしては、DMAPPを基質とすることが分かった。
3. Analysis of substrate specificity of recombinant SfN8DT using yeast expression system Enzymatic chemistry of recombinant SfN8DT was performed mainly using HPLC analysis. Furthermore, the substrate specificity for prenyl donors was determined by LC / MC analysis, and the substrate specificity for various flavonoid compounds (apigenin, kaempferol, quercetin, taxifolin, genistein, marquiaine) was determined by a radioactive assay.
As a result, recombinant SfN8DT prenylated only hesperetin having the same flavanone skeleton other than naringenin, and did not use it as a substrate. In addition, LG, which is the substrate for the second prenylation step of SFG, and HGA, which is a substrate for another enzyme having a similar sequence to this enzyme, did not become the substrate for SfN8DT. On the other hand, as a prenyl donor, DMAPP was found to be a substrate.
４．組換えSfN8DTの酵素化学的解析
酵母発現系を用いて、組換えSfN8DTのKm、至適温度、至適pH、二価カチオン要求性を調べた。
具体的には、前述と同様の方法にてミクロソーム画分を調製し、ＨＰＬＣにより生成物の量を検出した。
これらの結果は、至適温度を除いて、クララ培養細胞の膜画分を用いたnativeな酵素において報告されている結果と一致するものであった(Yamamotoら、Phytochemistry, 2000年参照)。結果を図１〜図４に示す。なお、組換えSfN8DTの至適温度は、７０〜８０℃であった（図２）。
4). Enzymatic Chemical Analysis of Recombinant SfN8DT Using a yeast expression system, Km, optimal temperature, optimal pH, and divalent cation requirement of recombinant SfN8DT were examined.
Specifically, a microsomal fraction was prepared by the same method as described above, and the amount of the product was detected by HPLC.
These results were consistent with those reported for native enzymes using the membrane fraction of Clara cultured cells, except for the optimum temperature (see Yamamoto et al., Phytochemistry, 2000). The results are shown in FIGS. In addition, the optimal temperature of recombinant SfN8DT was 70-80 degreeC (FIG. 2).
５．SfN8DT以外のHPT様クローンのクローニング
クララcDNAライブラリーのシーケンス情報から、SfN8DT同様にホモゲンチジン酸プレニルトランスフェラーゼと高い相同性を有する４クローン（それぞれSf1c12f、Sf1C12c、SfL17a、SfL17bと称する）を見出し、RACE法によりcDNAを単離した。
具体的には、RACEの鋳型としてはInvitrogen社のGeneRacerキットを用いて作製したcDNA混合物を用い、PCRにより各cDNAの5’-末端あるいは3’-末端を特異的に増幅した。ここで用いたRNA試料は、ライブラリーを作成したものと同じ、ジャスモン酸メチル処理したクララ培養細胞由来の全RNAである。このPCRにおいて、5’-RACEのフォワードプライマーは、上記キットのアダプター配列を、リバースプライマーは、各遺伝子の内部配列とした。3’-RACEの場合には、フォワードプライマーを各遺伝子の内部配列とし、リバースプライマーにはoligo-dT (20 mer) を用いた。増幅されたDNA断片はシーケンシングにより、各遺伝子のcDNA末端である事を確認した。全長cDNAを取得するためには、改めて5’-末端とoligo-dT (20 mer)をプライマーに、GeneRacerの混合物を用いてPCRを行った。
これらのうち、SfL17b、Sf1C12f、Sf1C12c、SfL17a、SfL17bおよびSfN8DTとホモゲンチジン酸プレニルトランスフェラーゼとの間のシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列の相同性を比較した(図５)。その結果、Sf1C12f、Sf1C12c、SfL17a、およびSfL17bはSfN8DTと高い相同性を有していた。Sf1C12f（全長1684bp, ORF 410a.a.)、Sf1C12c(全長1527bp, ORF 391a.a.)、SfL17a(全長1325bp, ORF 407a.a.)、およびSfL17b(全長1373bp, ORF 379a.a.)の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号４、６、８および１０に示す。
5. Cloning of HPT-like clones other than SfN8DT From the Clara cDNA library sequence information, 4 clones having high homology with homogentisic acid prenyltransferase (referred to as Sf1c12f, Sf1C12c, SfL17a, and SfL17b, respectively) are found by the RACE method. cDNA was isolated.
Specifically, a cDNA mixture prepared using a GeneRacer kit manufactured by Invitrogen was used as a RACE template, and the 5′-end or 3′-end of each cDNA was specifically amplified by PCR. The RNA sample used here is the same total RNA derived from Clara cultured cells treated with methyl jasmonate as the library was prepared. In this PCR, the 5′-RACE forward primer was the adapter sequence of the kit, and the reverse primer was the internal sequence of each gene. In the case of 3′-RACE, the forward primer was used as the internal sequence of each gene, and oligo-dT (20 mer) was used as the reverse primer. The amplified DNA fragment was confirmed to be the cDNA end of each gene by sequencing. In order to obtain full-length cDNA, PCR was performed again using a mixture of GeneRacer with 5′-end and oligo-dT (20 mer) as primers.
Among these, the homology of the amino acid sequences excluding the signal peptide between SfL17b, Sf1C12f, Sf1C12c, SfL17a, SfL17b and SfN8DT and homogentisic prenyltransferase was compared (FIG. 5). As a result, Sf1C12f, Sf1C12c, SfL17a, and SfL17b had high homology with SfN8DT. Sf1C12f (full length 1684bp, ORF 410a.a.), Sf1C12c (full length 1527bp, ORF 391a.a.), SfL17a (full length 1325bp, ORF 407a.a.), and SfL17b (full length 1373bp, ORF 379a.a.) bases The sequences are shown in SEQ ID NOs: 4, 6, 8, and 10, respectively.
６．SfN8DTのｍＲＮＡの発現解析
ノーザンブロット及びＲＴ−ＰＣＲによりクララ植物体及びクララ培養細胞におけるSfN8DTの発現解析をした(プローブ: 全長ORF)。組織別発現解析には、武田薬草園でサンプリングしたクララ植物体（草丈：約１７０ｃｍ、根直径：〜３ｃｍ）を用いた。組織別発現解析の結果から、根のみでSfN8DTの発現が見られ、しかもその発現は根の皮部分に特異的であった。これは、同じ根の試料を用いてHPLCで解析したプレニルフラボノイドの蓄積部位と一致した(図７、後述)。
次にクララ実生を用い、MJ（ジャスモン酸メチル）とSA（サリチル酸）への発現応答を調べた(図６)。方法としては、MJ及びSA (500 nmol) を含ませたコットンを培養容器に置き、24時間後に地上部と根を別々に回収した。その結果、インタクトな実生においてはMJやSAによりSfN8DTの発現誘導は観察されなかった。
一方、培養細胞においても、MJ、SA、YE（yeast extract）への発現応答を調べた。植え継ぎ3日後に、MJ、SA、YEをそれぞれ終濃度100 μM、100 μM、5 mg / ml になるよう添加し、24時間後に回収した。その結果、クララ実生を用いた場合と異なり、MJ、SA、YEによりその発現が著しく上昇した。この結果は、クララ培養細胞において既に報告のあるMJやYE添加によるN8DT活性誘導、およびそれに伴うSFGの生産増大とよく一致した。
培養細胞において、主要プレニルフラボノイドはSFGであるのに対し、植物体においてはメチル化されたプレニルフラボノイド(kurarinoneやkushenol I など)等が主要プレニルフラボノイドであることが報告されている（Yamamotoら, Z. Naturforsch, 1992)。そこで、組織別発現解析に用いたサンプルからエタノール抽出を行い、HPLC分析に供した。その結果、既報の通り、根のみにプレニルフラボノイド、特にkurarinone、kushenol Iが多く含有されていた(図７)。また、根の中心部分にはほとんどフラボノイドが検出されなかった。この化合物分布と発現解析の結果から、プレニルフラボノイドの生合成は根の皮部分で行われ、そのままそこに蓄積されると考えられる。
一方、地上部においては、kurarinone、kushenol I、des-o-methylanhydroicartin、SFGの主要プレニルフラボノイドは検出されなかった。対照的にその代わりフラボンの7-o-glucosideであるapigenin 7-o-glucosideやluteolin 7-o-glucosideが検出された。これらの化合物は根では検出されなかった。
6). Expression analysis of SfN8DT mRNA Expression analysis of SfN8DT in Clara plants and Clara cultured cells was performed by Northern blot and RT-PCR (probe: full length ORF). The expression analysis according to tissue used a Clara plant body (plant height: about 170 cm, root diameter: ˜3 cm) sampled at Takeda herb garden. From the results of the tissue-specific expression analysis, SfN8DT expression was observed only in the roots, and the expression was specific to the root skin. This coincided with the prenylflavonoid accumulation site analyzed by HPLC using the same root sample (FIG. 7, described later).
Next, using Clara seedlings, the expression response to MJ (methyl jasmonate) and SA (salicylic acid) was examined (FIG. 6). As a method, cotton containing MJ and SA (500 nmol) was placed in a culture vessel, and after 24 hours, the above-ground part and the root were collected separately. As a result, no induction of SfN8DT expression was observed by MJ or SA in intact seedlings.
On the other hand, expression responses to MJ, SA, and YE (yeast extract) were also examined in cultured cells. Three days after transplanting, MJ, SA, and YE were added to final concentrations of 100 μM, 100 μM, and 5 mg / ml, respectively, and collected 24 hours later. As a result, the expression was remarkably increased by MJ, SA, and YE, unlike the case of using Clara seedlings. This result was in good agreement with the previously reported N8DT activity induction by MJ and YE addition in Clara cultured cells and the accompanying increase in SFG production.
In cultured cells, the major prenyl flavonoid is SFG, whereas methylated prenyl flavonoids (such as kurarinone and kushenol I) have been reported to be the major prenyl flavonoids in plants (Yamamoto et al., Z Naturforsch, 1992). Then, ethanol extraction was performed from the sample used for the expression analysis according to tissue, and it used for the HPLC analysis. As a result, as already reported, prenyl flavonoids, especially kurarinone and kushhenol I, were mostly contained only in the roots (FIG. 7). Further, almost no flavonoid was detected in the central part of the root. From the results of this compound distribution and expression analysis, it is considered that the biosynthesis of prenylflavonoids is carried out in the root skin part and accumulated there as it is.
On the other hand, no major prenylflavonoids of kurarinone, kushenol I, des-o-methylanhydroicartin and SFG were detected in the above-ground part. In contrast, flavone 7-o-glucoside, apigenin 7-o-glucoside and luteolin 7-o-glucoside were detected. These compounds were not detected in the roots.
Claims (22)
化学式（Ｉ）：
Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩ）：
Ｒ７およびＲ８は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、
化学式（ＩＩＩ）：
Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）、あるいは
化学式（ＩＶ）：
Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、同一または異なって、水素基、水酸基若しくはメトキシル基を示す）
で表される化合物にプレニル基を導入する酵素活性を示す膜結合性プレニルトランスフェラーゼ。 A membrane-bound prenyltransferase having at least one conserved motif selected from the group consisting of NDxxDxxxD, NQxxDxxxD, NQxxExxxD, DDxxDxxxD, DQxxDxxxD, or DQxxExxxD, and the chemical formula (I):
R 3 and R 4 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group),
Chemical formula (II):
R 7 and R 8 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group),
Chemical formula (III):
R 10 , R 11 and R 12 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group), or chemical formula (IV):
R 14 , R 15 and R 16 are the same or different and each represents a hydrogen group, a hydroxyl group or a methoxyl group)
A membrane-bound prenyltransferase exhibiting an enzyme activity for introducing a prenyl group into a compound represented by the formula:
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(A) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 1 and having prenyl transferase activity.
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号３において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。 The following polypeptide (c) or (d):
(C) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
(D) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 3, and having prenyltransferase activity.
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｆ）配列番号５において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。 The following polypeptide (e) or (f):
(E) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5,
(F) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added, or substituted in SEQ ID NO: 5 and having prenyltransferase activity.
（ｇ）配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｈ）配列番号７において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。 The following polypeptide (g) or (h):
(G) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7,
(H) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 7 and having prenyltransferase activity.
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｊ）配列番号９において、１又は２以上のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。 The following polypeptide (i) or (j):
(I) a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9,
(J) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, added or substituted in SEQ ID NO: 9 and having prenyltransferase activity.
（ｋ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｌ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。 A gene comprising DNA shown in the following (k) or (l):
(K) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2,
(L) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encodes a membrane-bound prenyltransferase.
（ｍ）配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｎ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。 A gene comprising DNA shown in the following (m) or (n):
(M) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4,
(N) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and encodes a membrane-bound prenyltransferase.
（ｏ）配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｐ）配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。 A gene comprising DNA shown in the following (o) or (p):
(O) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6,
(P) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and encodes a membrane-bound prenyltransferase.
（ｑ）配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｒ）配列番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。 The gene consisting of DNA shown in the following (q) or (r):
(Q) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8,
(R) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 and encodes a membrane-bound prenyltransferase.
（ｓ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｔ）配列番号１０に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ膜結合性プレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。 The gene consisting of DNA shown in the following (s) or (t):
(S) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 10,
(T) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and encodes a membrane-bound prenyltransferase.
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