JP2008220184A - デオキシニバレノールを分解する新規微生物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】Nocardioides属に属し、デオキシニバレノールに対して分解能を有することを特徴とする新規微生物WSN05-2菌株(FERM AP-21227)、新規微生物LS1菌株(FERM AP-21223)、新規微生物SS1菌株(FERM AP-21225)、新規微生物SS2菌株(FERM AP-21226)を提供する。またNocardioides属に属する微生物を用いて、デオキシニバレノールを分解処理することを特徴とするデオキシニバレノールの分解処理方法であり、更に本発明は、Nocardioides属に属する微生物に加えて、alpha-proteobacteriaに属する新規微生物RS1菌株とを併用して、デオキシニバレノールを分解処理することを特徴とするデオキシニバレノールの分解処理方法である。
【選択図】なし
Description
<2>更に本発明は、Nocardioides属に属する微生物を用いて、デオキシニバレノールを分解処理することを特徴とするデオキシニバレノールの分解処理方法であり、前記Nocardioides属に属する微生物として、前記新規微生物を用いることが好ましい。
<3>更に本発明は、前記Nocardioides属に属する微生物に加えて、さらにalpha-proteobacteriaに属し、デオキシニバレノールに対して分解能を有することを特徴とする新規微生物RS1菌株(FERM AP-21224)を用いて、デオキシニバレノールを分解処理することを特徴とするデオキシニバレノールの分解処理方法である。
陽性の球菌で、Nocardioides属細菌の特徴を示し、ジャガイモ半合成寒天培地及び普通寒天培地で培養すると、いずれも円形で光沢のある乳白色のコロニーを形成する。
<根圏よりの分離>
ムギ栽培圃場においてムギの根を含む根圏土壌を採取し、該採取試料約1gを、下記表1に示す培地組成の無機塩培地1000mLにデオキシニバレノール100mgを加えた、デオキシニバレノールを唯一の炭素源とする培地(以下CDM培地という。)において、28℃で、振とう条件にて集積培養を行った。5〜7日間、CDM培地で培養後、培溶液から100μLを取り、更に新鮮なCDM培地に移し変え、同様の条件で振とう培養した。この操作を数回繰り返し、分解活性の再現性を確認した。
該懸濁液5mLを、前記CDM培地に接種し、28℃で振とう培養し、以下の増殖の判定及びデオキシニバレノールの抽出に供試した。前記懸濁液をCDM培地に接種した時を、以下のデオキシニバレノールの濃度測定における培養開始時(培養0時間後)とした。また、上記培養期間中、菌の増殖およびデオキシニバレノール濃度を測定するため、120μLの菌液を12時間ごとに回収した。
菌の増殖量を吸光度で測定した。前記120μLの菌液を、96ウェルプレートに入れ、前記マイクロプレート分光光度計により、波長595nmにおける吸光度を測定した。測定終了後、120μLある菌液のうち100μLに、500μLの酢酸エチルと400μLの飽和食塩水を加えて、タッチミキサーによる攪拌を行い、その後分層した有機溶媒層を回収することにより、デオキシニバレノールの抽出を行った。前記酢酸エチルと飽和食塩水による抽出を3回繰り返した後、該抽出物を遠心エバポレーター(EYELA,CVE-200D 40℃ 20分)によって、有機溶媒層を完全に除去し、デオキシニバレノール抽出物を得た。
前記デオキシニバレノール抽出物を、100μLのメタノールで懸濁し、逆相HPLC分析に供した。HPLC(東ソーHPLCシステム、ポンプ:CCPM-II、検出器:UV-8020、カラム:C18M 4E (Shodex)、検出波長:220 nm、移動相:メタノール:水=15:85、流速:1 mL/ 1 min)にて分析し、培養液中に残存していたデオキシニバレノールの濃度を検量線から求めた。培養開始時(培養0時間後)と培養60時間経過後の分析によって得られたクロマトグラムを図2に示す。
本発明のWSN05-2菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列の解析を行った。該菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号1に示す。さらに本発明の菌株について系統学的分類を行うため、既知微生物の塩基配列のデータベース上で、解析により得られた塩基配列のDNAデータベース相同性検索を行ったところ、WSN05-2菌株は、Nocardioides sp. AN3株と100%の相同性を示すことが明らかとなった。図1に、本発明の菌株の16S rRNA遺伝子の配列に基づく系統樹を示す。
本発明のWSN05-2菌株について、1/4GYM寒天培地(培地組成;Glucose;4g、Yeast extract;4g、Malt extract;10g、Peptone (NZ-amine);1g、NaCl;2g、MgSO4・5H2O;50 mg、CuSO4・5H2O;1.6 mg、FeSO4・5H2O;2.5mg、MnSO4・4H2O;1.2mg、CaCl2 ;5mg、ZnSO4・5H2O;3mg、全体で1000mlとし、NaOHでpH7.2に調整。以下GYM寒天培地という。)の上に25℃で培養すると、5日目に直径1mm程度の円形、全縁、ドーム型、表面平滑、光沢あり、やや透明、白色のコロニーを形成した。
本発明のWSN05-2菌株について、前記CDM培地で25℃2日間培養した後、該懸濁液を、波長610nmにおける吸光度が4となるように滅菌水に懸濁して、その菌懸濁液を作製した。一方ムギ粒約300粒を前記CDM培地に浸漬し、その後1時間風乾し、ムギ粒表面にデオキシニバレノールが付着したムギ粒を作製した。
前記デオキシニバレノール分解能試験(1)における前記CDM培地に換えて、前記PS液体培地で培養した以外はデオキシニバレノール分解能試験(1)と同様にして、デオキシニバレノール分解能試験(2)を実施した。結果を表3に示す。
<葉圏よりの分離>
ムギ栽培圃場においてムギの葉を採取し、該採取試料約0.1gを、実施例1と同様に、根圏よりの分離、選抜した菌のデオキシニバレノール分解能と菌の増殖、増殖の判定及びデオキシニバレノールの抽出、HPLCによるデオキシニバレノールの分析を行い、分解活性の確認を行った。培養開始時(培養0時間後)と培養77時間経過後の分析によって得られたクロマトグラムを図3に示す。
本発明のLS1菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列の解析を行った。該菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号2に示す。さらに本発明の菌株について系統学的分類を行うため、既知微生物の塩基配列のデータベース上で、解析により得られた塩基配列のDNAデータベース相同性検索を行ったところ、LS1菌株は、Nocardioideskribbensis KSL-6株と97%の相同性の相同性を示し、新規な菌株であることが明らかとなった。図1に、本発明の菌株の16S rRNA遺伝子の配列に基づく系統樹を示す。
本発明のLS1菌株について、前記PS寒天培地上に25℃で培養すると、5日目に直径0.5mm、10日で直径1mm程度の円形、全縁、ドーム型、表面平滑、光沢あり、乳白色のコロニーを形成する。また、黄色〜褐色の色素を産生する。前記1/100NA培地上に25℃で培養すると、3日目に直径0.5mmの円形、全縁、ドーム型、表面平滑、光沢あり、乳白色のコロニーを形成する。3日目以降、コロニーの直径は拡大しない。本発明のLS1菌株は、NA寒天培地上では生育しなかった。
本発明のLS1菌株について、前記CDM培地で25℃2日間培養した後、該懸濁液を、波長610nmにおける吸光度が4となるように滅菌水に懸濁して、その菌懸濁液を作製した。一方ムギ粒約300粒を前記CDM培地に浸漬し、その後1時間風乾し、ムギ粒表面にデオキシニバレノールが付着したムギ粒を作製した。
前記デオキシニバレノール分解能試験(1)における前記CDM培地に換えて、前記PS液体培地で培養した以外はデオキシニバレノール分解能試験(1)と同様にして、デオキシニバレノール分解能試験(2)を実施した。結果を表5に示す。
<根圏よりの分離>
ムギ栽培圃場において、ムギの根を含む根圏土壌を採取し、該採取試料約1gを、実施例1と同様に、根圏よりの分離、選抜した菌のデオキシニバレノール分解能と菌の増殖、増殖の判定及びデオキシニバレノールの抽出、HPLCによるデオキシニバレノールの分析を行い、分解活性の確認を行った。培養開始時(培養0時間後)と培養150時間経過後の分析によって得られたクロマトグラムを図4に示す。
本発明のSS1菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列の解析を行った。該菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号3に示す。さらに本発明の菌株について系統学的分類を行うため、既知微生物の塩基配列のデータベース上で、解析により得られた塩基配列のDNAデータベース相同性検索を行ったところ、SS1菌株は、Nocardioidessp. AN3株と99%の相同性を示し、新規な菌株であることが明らかとなった。図1に、本発明の菌株の16S rRNA遺伝子の配列に基づく系統樹を示す。
本発明のSS1菌株の培養は、1/4GYM寒天培地上に25℃で培養すると、5日目に直径0.5mm、10日で直径1mm程度の円形、全縁、ドーム型、表面平滑、光沢あり、やや透明、白色のコロニーを形成する。PS寒天培地上に25℃で培養すると、5日目に直径0.5mm、10日で直径1mm程度の円形、全縁、ドーム型、表面平滑、光沢あり、乳白色のコロニーを形成する。NA培地上に25℃で培養すると、7日目に直径0.5mm程度の円形、全縁、ドーム型、表面平滑、光沢あり、透明または半透明、乳白色のコロニーを形成する。1/100NA培地上に25℃で培養すると、3日目に直径0.5mmの円形、全縁、ドーム型、表面平滑、光沢あり、やや透明、白色のコロニーを形成するが、3日目以降、コロニーの直径は拡大しない。
<根圏よりの分離>
ムギ栽培圃場において、ムギの根を含む根圏土壌を採取し、該採取試料約1gを、実施例1と同様に、根圏よりの分離、選抜した菌のデオキシニバレノール分解能と菌の増殖、増殖の判定及びデオキシニバレノールの抽出、HPLCによるデオキシニバレノールの分析を行い、分解活性の確認を行った。培養開始時(培養0時間後)と培養70時間経過後の分析によって得られたクロマトグラムを図5に示す。
本発明のSS2菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列の解析を行った。該菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号4に示す。さらに本発明の菌株について系統学的分類を行うため、既知微生物の塩基配列のデータベース上で、解析により得られた塩基配列のDNAデータベース相同性検索を行ったところ、SS2菌株は、Nocardioides simplex と95%の相同性を示し、新規な菌株であることが明らかとなった。図1に、本発明の菌株の16S rRNA遺伝子の配列に基づく系統樹を示す。
本発明のSS2菌株の培養は、1/4GYM寒天培地上に25℃で培養すると、5日目に直径0.5mm、10日で直径1mm程度の円形、全縁、中央がくぼんだドーム型、粗面、光沢なし、乳白色のコロニーを形成する。PS寒天培地上に25℃で培養すると、5日目に直径0.5mm、10日で直径1mm程度の円形、全縁、中央がくぼんだドーム型、粗面、光沢なし、乳白色のコロニーを形成する。1/100NA培地上に25℃で培養すると、3日目に直径0.5mmの円形、全縁、ドーム型、粗面、光沢なし、乳白色のコロニーを形成するが、3日目以降、コロニーの直径は拡大しない。本発明のSS2菌株はNA培地上では生育しなかった。
<RS1菌株のデオキシニバレノール分解能>
本発明のRS1菌株について、実施例1と同様に、選抜した菌のデオキシニバレノール分解能と菌の増殖、増殖の判定及びデオキシニバレノールの抽出、HPLCによるデオキシニバレノールの分析を行い、分解活性の確認を行った。結果を表8に示す。
前記Nocardioides属に属するWSN05-2菌株、LS1菌株、SS1菌株、SS2菌株の分解活性をあらためて表9に示す。
Claims (11)
- Nocardioides属に属し、デオキシニバレノールに対して分解能を有することを特徴とする新規微生物WSN05-2菌株(FERM AP−21227)。
- Nocardioides属に属し、デオキシニバレノールに対して分解能を有することを特徴とする新規微生物LS1菌株(FERM AP−21223)。
- Nocardioides属に属し、デオキシニバレノールに対して分解能を有することを特徴とする新規微生物SS1菌株(FERM AP−21225)。
- Nocardioides属に属し、デオキシニバレノールに対して分解能を有することを特徴とする新規微生物SS2菌株(FERM AP−21226)。
- Nocardioides属に属する微生物を用いて、デオキシニバレノールを分解処理することを特徴とするデオキシニバレノールの分解処理方法。
- 前記Nocardioides属に属する微生物が、請求項1に記載の微生物である請求項5に記載のデオキシニバレノールの分解処理方法。
- 前記Nocardioides属に属する微生物が、請求項2に記載の微生物である請求項5に記載のデオキシニバレノールの分解処理方法。
- 前記Nocardioides属に属する微生物が、請求項3に記載の微生物である請求項5に記載のデオキシニバレノールの分解処理方法。
- 前記Nocardioides属に属する微生物が、請求項4に記載の微生物である請求項5に記載のデオキシニバレノールの分解処理方法。
- 前記Nocardioides属に属する微生物が、請求項1ないし請求項4に記載の微生物のいずれか1以上である請求項5に記載のデオキシニバレノールの分解処理方法。
- 請求項1ないし請求項4に記載のいずれか1以上の微生物に加えて、さらに
alpha-proteobacteriaに属し、デオキシニバレノールに対して分解能を有する新規微生物RS1菌株(FERM AP−21224)を用いて、デオキシニバレノールを分解処理することを特徴とするデオキシニバレノールの分解処理方法。
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