JP2008180723A - Apparatus for measuring glucose and ascorbic acid - Google Patents
Apparatus for measuring glucose and ascorbic acid Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008180723A JP2008180723A JP2008027657A JP2008027657A JP2008180723A JP 2008180723 A JP2008180723 A JP 2008180723A JP 2008027657 A JP2008027657 A JP 2008027657A JP 2008027657 A JP2008027657 A JP 2008027657A JP 2008180723 A JP2008180723 A JP 2008180723A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ascorbic acid
- glucose
- concentration
- electrode
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Description
本発明は、試料溶液中に含まれるグルコースとアスコルビン酸を同時に、簡便に測定するための測定装置に関するものである。 The present invention relates to a measuring apparatus for easily and simultaneously measuring glucose and ascorbic acid contained in a sample solution.
従来から、血糖、尿糖、あるいは果汁製品等中のグルコース測定においてにおいて、共存するアスコルビン酸の影響が大きな問題となっていた。グルコースの測定は多くの場合、酵素電極法より行われる。酵素電極法においては、グルコースをグルコース酸化酵素により酸化した場合に同時に生成する過酸化水素等、電子受容体が電子を受容したことによって生じる還元体を電極上で酸化し、このときの酸化電流値からグルコースを測定するが、アスコルビン酸は容易に酸化される化合物であり、過酸化水素等の酸化のために電極に正の電位を印加すると過酸化水素と同時に酸化されてしまい、正の誤差を与える要因となる。 Conventionally, the influence of coexisting ascorbic acid has been a major problem in the measurement of glucose in blood sugar, urine sugar, fruit juice products, and the like. In many cases, glucose is measured by an enzyme electrode method. In the enzyme electrode method, hydrogen peroxide, which is produced simultaneously when glucose is oxidized by glucose oxidase, oxidizes a reductant produced when an electron acceptor accepts electrons on the electrode, and the oxidation current value at this time Ascorbic acid is a compound that is easily oxidized. When a positive potential is applied to the electrode for oxidation of hydrogen peroxide, etc., it is oxidized simultaneously with hydrogen peroxide, resulting in a positive error. It becomes a factor to give.
このアスコルビン酸による誤差を除くため、従来、過酸化水素を透過させる一方、アスコルビン酸の透過を抑制する膜を電極表面に設ける等の方法が採用されていたが、必ずしもアスコルビン酸の影響を完全に排除するには至らなかった。一方、例えば、果汁製品等の品質管理においては、グルコースのみならずアスコルビン酸の測定も重要であるが、従来のグルコース酸化酵素を用いた酵素電極法ではアスコルビン酸濃度の同時測定は極めて困難であり、両者の濃度を知るためには、グルコース酸化酵素を用いた酵素電極法と他のアスコルビン酸測定方法、例えば比色法とを併用する必要があった。 In order to eliminate this error due to ascorbic acid, a method of permeating hydrogen peroxide while providing a film that suppresses permeation of ascorbic acid on the electrode surface has been adopted, but the influence of ascorbic acid is not necessarily completely affected. It did not lead to exclusion. On the other hand, for example, measurement of ascorbic acid as well as glucose is important in quality control of fruit juice products, etc., but simultaneous measurement of ascorbic acid concentration is extremely difficult with the conventional enzyme electrode method using glucose oxidase. In order to know both concentrations, it was necessary to use an enzyme electrode method using glucose oxidase and another ascorbic acid measurement method, for example, a colorimetric method.
本発明の課題は、このような事情のもとで、試料中アスコルビン酸が共存していても、その影響を排除して、正確にグルコース濃度を測定できるとともに、グルコースに加えアスコルビン酸濃度も同時に測定するための手段を提供することにある。 The problem of the present invention is that, under such circumstances, even if ascorbic acid is present in the sample, the influence of the ascorbic acid can be accurately eliminated and the glucose concentration can be accurately measured. It is to provide a means for measuring.
本発明者らは、グルコース測定において簡便で汎用される酵素電極法に着目し、一方で、酵素電極法においてアスコルビン酸が過剰な電流応答を与える原因となるという問題、また、グルコースとアスコルビン酸との両者を含む試料中から電流という一つの信号だけでは独立に二成分の濃度を求めることはできないという問題を解消し、さらに、その一方で、特に果汁等では、品質管理等の観点から両者の濃度を知りたいという要望に答えるべく種々研究を重ねた結果、グルコース酸化酵素反応及びアスコルビン酸の酸化反応を電極電流及びルミノールの電気化学発光の二種の信号で検知することにより、二成分の濃度を求め得ることを見いだし、本発明をなすに至った。 The present inventors have paid attention to an enzyme electrode method that is simple and widely used in glucose measurement, while the problem that ascorbic acid causes an excessive current response in the enzyme electrode method, and glucose and ascorbic acid The problem that the concentration of the two components cannot be obtained independently from only one signal of the current from the sample containing both of them is solved. As a result of various studies to answer the desire to know the concentration, the concentration of the two components was detected by detecting the glucose oxidase reaction and the oxidation reaction of ascorbic acid with two signals of electrode current and electroluminescence of luminol. As a result, the present invention has been found.
すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
グルコース及びアスコルビン酸含有試料中のグルコース及び／又はアスコルビン酸濃度を、該試料がグルコース酸化酵素に接触することにより発生する電極電流の測定とルミノールを使用する発光強度の測定を同時に行うことにより、測定する装置であって、上記試料の収容容器、該容器内に配置されたフェロセンあるいはその誘導体で修飾され、かつグルコース酸化酵素が固定された電極、該電極に発生した電流を計測する電気化学制御部、及び発生する過酸化水素とルミノールの反応により発生する発光強度を測定する発光測定部を有することを特徴とする、グルコース及びアスコルビン酸を含む試料中のグルコース濃度及び／又はアスコルビン酸濃度を計測する装置。
That is, the present invention is as follows.
Glucose and / or ascorbic acid concentration in a sample containing glucose and ascorbic acid is measured by simultaneously measuring the electrode current generated when the sample contacts glucose oxidase and the luminescence intensity using luminol. A container for storing the sample, an electrode modified with ferrocene or a derivative thereof disposed in the container and fixed with glucose oxidase, and an electrochemical control unit for measuring a current generated in the electrode And measuring a glucose concentration and / or an ascorbic acid concentration in a sample containing glucose and ascorbic acid, characterized by having a luminescence measuring section for measuring the luminescence intensity generated by the reaction between the generated hydrogen peroxide and luminol. apparatus.
本発明は、酵素電極法による電流測定と発光強度の測定を同時に行うことを特徴とするものであり、これにより、試料中にグルコースとアスコルビン酸が共存していても、アスコルビン酸の影響を排除して、正確にグルコース濃度できるとともに、グルコースに加えアスコルビン酸濃度も同時に測定することが可能となる。
したがって、本発明は、グルコースとアスコルビン酸が共存する試料、例えば果汁中のグルコース及びアスコルビン酸の分析に有利であり、その製品の品質管理等に有用である。
The present invention is characterized in that the current measurement by the enzyme electrode method and the measurement of the luminescence intensity are performed simultaneously, thereby eliminating the influence of ascorbic acid even if glucose and ascorbic acid coexist in the sample. Thus, it is possible to accurately measure the glucose concentration and simultaneously measure the ascorbic acid concentration in addition to glucose.
Therefore, the present invention is advantageous for analysis of glucose and ascorbic acid in a sample in which glucose and ascorbic acid coexist, such as fruit juice, and is useful for quality control of the product.
本発明は、酵素電極法と発光強度測定法を併用するものであり、本発明の測定系においては、少なくともグルコース酸化酵素とルミノールを有する発光強度測定系を使用する。
試料中にグルコースが存在する場合、試料中のグルコースはグルコース酸化酵素により、酸化されるとともに過酸化水素が生成し、該過酸化水素は、電極上で酸化されて電極電流を発生する。この電極電流値はグルコース濃度に比例するから、この電流値を測定すれば、グルコース濃度を測定可能であるが、アスコルビン酸が試料中に共存する場合においては、上記電極においてアスコルビン酸も濃度依存的に酸化されてしまい、測定される電流値を増大させてしまう。
The present invention uses an enzyme electrode method and a luminescence intensity measurement method in combination, and in the measurement system of the present invention, a luminescence intensity measurement system having at least glucose oxidase and luminol is used.
When glucose is present in the sample, the glucose in the sample is oxidized by glucose oxidase and hydrogen peroxide is generated, and the hydrogen peroxide is oxidized on the electrode to generate an electrode current. Since this electrode current value is proportional to the glucose concentration, the glucose concentration can be measured by measuring this current value. However, when ascorbic acid coexists in the sample, ascorbic acid also depends on the concentration at the electrode. It will be oxidized to increase the measured current value.
すなわち、この場合においては、測定される電極電流値は、グルコースとアスコルビン酸濃度の和に見合う量になり、グルコース濃度のみを測定することはできない。
本発明によれば、この電極電流値に反映されるアスコルビン酸の影響を発光強度測定法の併用により排除できる。
That is, in this case, the measured electrode current value is an amount commensurate with the sum of glucose and ascorbic acid concentrations, and it is not possible to measure only the glucose concentration.
According to the present invention, the influence of ascorbic acid reflected in the electrode current value can be eliminated by the combined use of the luminescence intensity measurement method.
上記グルコースの酸化により生成する過酸化水素は、ルミノールを酸化させることにより発光させる。この発光強度はグルコースの濃度に比例するが、アスコルビン酸はこの発光を濃度依存的に阻害する。したがって、この発光強度は、グルコース濃度とアスコルビン酸濃度の差として表すことができ、上記電極電流値と、この発光強度を測定すれば、試料中のグルコース濃度とアスコルビン酸濃度を求めることができる。 Hydrogen peroxide produced by the oxidation of glucose emits light by oxidizing luminol. This luminescence intensity is proportional to the glucose concentration, but ascorbic acid inhibits this luminescence in a concentration-dependent manner. Therefore, this luminescence intensity can be expressed as the difference between the glucose concentration and the ascorbic acid concentration, and the glucose concentration and ascorbic acid concentration in the sample can be determined by measuring the electrode current value and the luminescence intensity.
本発明においては、ルミノール発光強度測定系としては、ルミノールの他に、ルミノールを発光させるために、酸化還元能を有する物質を用いる。これらの物質としては、例えば鉄イオン、銅イオン、マンガンイオン、コバルトイオン等の金属イオン類、あるいは鉄、マンガンなどを有するポルフィリン等の有機金属錯体類、西洋わさび由来のペルオキシダーゼ、あるいはカタラーゼ等の酵素等が挙げられ、ルミノール発光に用いられている周知のものでよい。これらは溶液中に溶解乃至分散して、試料と接触させてもよいが、電極上に固定化するのが好ましい。また、発光強度の測定手段としては、例えば、光電子倍増管や市販の分光蛍光光度計等を挙げることができる。 In the present invention, as the luminol emission intensity measurement system, a substance having redox ability is used in addition to luminol, in order to emit luminol. Examples of these substances include metal ions such as iron ion, copper ion, manganese ion and cobalt ion, organometallic complexes such as porphyrin having iron and manganese, peroxidase derived from horseradish, and enzymes such as catalase. Etc., and the known ones used for luminol luminescence may be used. These may be dissolved or dispersed in the solution and brought into contact with the sample, but are preferably immobilized on the electrode. Examples of the means for measuring the emission intensity include a photomultiplier tube and a commercially available spectrofluorometer.
本発明において使用する電極としては、酸化還元能を有する物質としてフェロセンあるいはその誘導体を固定化して修飾した電極が特に好ましい。以下、この電極を使用した場合を例にとり、本発明をさらに具体的に説明する。
このフェロセンあるいはその誘導体としては、吸着、化学結合等により薄膜を形成し得るものであれば特に制限はなく、例えば、電極材料として金を用いる場合、金に結合性を示す、ＳＨ基を末端に有するフェロセニルアルカンチオール等が好都合に利用される。また、白金、酸化スズ等の電極上に強固な薄膜を作製するにはフェロセニル基を有する高分子、ポリビニルフェロセン等が好都合に利用される。
The electrode used in the present invention is particularly preferably an electrode modified by immobilizing ferrocene or a derivative thereof as a substance having redox ability. Hereinafter, the present invention will be described more specifically by taking the case of using this electrode as an example.
The ferrocene or a derivative thereof is not particularly limited as long as it can form a thin film by adsorption, chemical bonding, etc. For example, when gold is used as an electrode material, it has an SH group that is binding to gold and has a terminal SH group. The ferrocenylalkanethiol etc. which have are utilized conveniently. In order to produce a strong thin film on an electrode such as platinum or tin oxide, a polymer having a ferrocenyl group, polyvinyl ferrocene, or the like is advantageously used.
以下、この修飾電極を使用した場合を例にとり、本発明をさらに具体的に説明する。
まず、フェロセンあるいはその誘導体で修飾した電極を作製した後、上記修飾電極、参照電極等を透明な容器に挿入する。溶液中にグルコース酸化酵素、ルミノールを含む中性(pH 6-9程度)の緩衝液を加え、上記修飾電極にフェロセンを酸化するのに充分な正の電位を印加し、電極近傍に電気化学発光を検知するための素子、例えば光電子倍増管を設置する。溶液中には空気または酸素を飽和させ、適当な装置により撹拌することが好ましい。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically by taking the case of using this modified electrode as an example.
First, an electrode modified with ferrocene or a derivative thereof is prepared, and then the modified electrode, the reference electrode and the like are inserted into a transparent container. A neutral (pH 6-9) buffer containing glucose oxidase and luminol is added to the solution, a positive potential sufficient to oxidize ferrocene is applied to the modified electrode, and electrochemiluminescence is generated in the vicinity of the electrode. For example, a photomultiplier tube is installed. It is preferable to saturate air or oxygen in the solution and stir with a suitable apparatus.
次いで緩衝液中にグルコース、アスコルビン酸を含有する試料を添加すると、グルコース酸化酵素反応に伴いグルコースと溶存酸素とが反応し、過酸化水素が生成する。生成した過酸化水素は電極上で酸化されて酸化電流を与える一方、フェロセンが電極上で酸化して生成するフェリシニウムカチオンの触媒でルミノールと反応し、発光する。一方、アスコルビン酸は電極上で酸化されて酸化電流を増大させる一方、フェリシニウムカチオンを選択的に還元し、上記のルミノール発光の発光強度を低下させる。グルコース及びアスコルビン酸が適当な濃度範囲にある場合、酵素反応による過酸化水素の生成速度、及び過酸化水素の電極での酸化速度並びに発光反応の速度はグルコース濃度に比例し、またアスコルビン酸の酸化速度並びに発光反応の阻害（消光）の程度はアスコルビン酸濃度に比例する。 Next, when a sample containing glucose and ascorbic acid is added to the buffer, glucose and dissolved oxygen react with the glucose oxidase reaction to produce hydrogen peroxide. The generated hydrogen peroxide is oxidized on the electrode to give an oxidation current, while ferrocene is oxidized on the electrode to react with luminol by a catalyst of ferricinium cation and emits light. On the other hand, ascorbic acid is oxidized on the electrode to increase the oxidation current, while the ferricinium cation is selectively reduced to reduce the emission intensity of the luminol emission. When glucose and ascorbic acid are in the appropriate concentration range, the rate of hydrogen peroxide production by the enzymatic reaction, the rate of oxidation of hydrogen peroxide at the electrode, and the rate of the luminescence reaction are proportional to the glucose concentration, and the oxidation of ascorbic acid The rate and the degree of inhibition (quenching) of the luminescent reaction are proportional to the ascorbic acid concentration.
すなわち、グルコース濃度を［Ｇ］、アスコルビン酸濃度を［Ａ］で表せば、酸化電流応答はａ［Ｇ］＋ｂ「Ａ」（ａ，ｂは正の定数）で与えられ、また、発光量はｃ［Ｇ］−ｄ［Ａ］（ｃ，ｄは正の定数）で与えられることになる。したがって、試料中のグルコース濃度及び／又はアスコルビン酸濃度は、以下の関係式により求めることができる。
Ｉ ＝ａ［Ｇ］＋ｂ［Ａ］
Ｌ ＝ｃ［Ｇ］−ｄ［Ａ］
（但し、上記式中、Ｉは測定電流値、Ｌは発光強度、［Ｇ］はグルコース濃度、［Ａ］はアスコルビン酸濃度を表し、ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ正の定数を表す。）
硝子や金属酸化物を基板材料とする場合には適当なシランカプラーを用いることで、表面に反応性のアミノ基、カルボキシル基などを導入できるので、これを利用してフェロセン基を導入することが可能である。実験的に予めａ，ｂ，ｃ，ｄの定数を求めておくことは容易であり、これらを求めておけば、未知試料中のグルコースとアスコルビン酸との両者の濃度を電流応答と発光強度とから決定することができる。グルコース酸化酵素を修飾電極表面上に同時に固定しておけば、測定ごとに酵素を添加しなくても上記の測定は可能となる。
That is, if the glucose concentration is represented by [G] and the ascorbic acid concentration is represented by [A], the oxidation current response is given by a [G] + b “A” (a and b are positive constants), and the amount of luminescence is c [G] -d [A] (c and d are positive constants). Therefore, the glucose concentration and / or ascorbic acid concentration in the sample can be obtained by the following relational expression.
I = a [G] + b [A]
L = c [G] -d [A]
(In the above formula, I represents the measured current value, L represents the emission intensity, [G] represents the glucose concentration, [A] represents the ascorbic acid concentration, and a, b, c, and d represent positive constants, respectively.) )
When glass or metal oxide is used as a substrate material, a reactive amino group, carboxyl group, etc. can be introduced on the surface by using an appropriate silane coupler, and this can be used to introduce a ferrocene group. Is possible. It is easy to experimentally determine the constants a, b, c, and d in advance, and if these are determined, the concentration of both glucose and ascorbic acid in the unknown sample can be determined as the current response and the luminescence intensity. Can be determined from If glucose oxidase is simultaneously immobilized on the surface of the modified electrode, the above measurement can be performed without adding an enzyme for each measurement.
図６は、本発明の計測装置の１例を示す概略図である。
該装置は、少なくとも、センサー部（１）、攪拌器（２）、電気化学制御部３、データ記録部（４）および発光測定部（５）からなる。該センサー部（１）は、測定溶液（１−４）を収納した容器（１−７）、及び該容器内に配置可能に設けたフェロセン修飾電極（１−１）、参照電極（１−２）、白金線又は白金箔からなる対極（１−３）、試料注入部（１−７）を備え、収容容器には攪拌子が投入されている。
FIG. 6 is a schematic view showing an example of the measuring apparatus of the present invention.
The apparatus comprises at least a sensor unit (1), a stirrer (2), an
以下、該計測装置の作動について説明する。
計測装置の容器（１−７）に、グルコース酸化酵素、ルミノールを含有する測定溶液（１−４）を収容し、該容器内にフェロセン修飾電極（１−１）、参照電極（１−２）、白金線又は白金箔からなる対極（１−３）を配置し、さらに、上記参照電極（１−２）を介してフェロセン修飾電極（１−１）に所定の電位を印加する。該測定溶液は空気又は酸素により飽和させ、攪拌機（２）により攪拌子１を回転させて攪拌する。次いでグルコース及びアスコルビン酸を含有する試料溶液を試料注入部（１−５）から測定溶液中に注下し、攪拌及び遮光条件下、反応させる。
Hereinafter, the operation of the measuring device will be described.
A measurement solution (1-4) containing glucose oxidase and luminol is accommodated in a container (1-7) of the measuring device, and a ferrocene-modified electrode (1-1) and a reference electrode (1-2) are contained in the container. A counter electrode (1-3) made of platinum wire or platinum foil is disposed, and a predetermined potential is applied to the ferrocene-modified electrode (1-1) via the reference electrode (1-2). The measurement solution is saturated with air or oxygen, and the
上記電気化学制御部は、印可電位を制御するとともに、発生した電流を測定する機能を有し、試料溶液中のグルコースが測定溶液（１−４）中のグルコースオキシダーゼにより分解される際、溶存酸素と反応により生成した過酸化水素は、上記フェロセン修飾電極（１−１）において酸化され、酸化電流を該修飾電極に与える。これとともに、試料中のアスコルビン酸も上記修飾電極（１−１）で酸化され、酸化電流を該修飾電極に与える。これらにより発生した電流は、上記電気化学制御部（３）により測定され、記録部（４）に電流値データとして記録される。 The electrochemical control unit controls the applied potential and has a function of measuring the generated current. When glucose in the sample solution is decomposed by glucose oxidase in the measurement solution (1-4), dissolved oxygen The hydrogen peroxide produced by the reaction is oxidized at the ferrocene-modified electrode (1-1) and gives an oxidation current to the modified electrode. At the same time, ascorbic acid in the sample is also oxidized by the modified electrode (1-1), and an oxidation current is applied to the modified electrode. The current generated by these is measured by the electrochemical control unit (3) and recorded as current value data in the recording unit (4).
一方、上記過酸化水素は、フェロセンが電極上で酸化して生成するフェリシニウムカチオンの触媒でルミノールと反応し、発光する。これに対してアスコルビン酸は、フェリシニウムカチオンを選択的に還元し、上記のルミノール発光の発光強度を低下させる、これらに基づく発光強度は、発光測定部５で測定され、発光強度データとしてデータ記録部（４）に記録される。以下、このデータ記録部（４）に記録された電流値データと発光強度データは、上記関係式に基づき演算され、試料中のグルコース濃度及び／又はアスコルビン酸濃度を算出する。得られる濃度をグルコース濃度にするか、アスコルビン酸濃度にするかあるいはこれら濃度を同時に得るかは任意に選択できる。
On the other hand, the hydrogen peroxide reacts with luminol by a catalyst of ferricinium cation generated by oxidation of ferrocene on the electrode and emits light. On the other hand, ascorbic acid selectively reduces the ferricinium cation and lowers the emission intensity of the above luminol emission. The emission intensity based on these is measured by the
また、上記測定系を構成するため、フェロセンあるいはその誘導体で修飾した電極と、あるいはさらに、グルコース酸化酵素、及びルミノール等の試薬を加えて、グルコース濃度及び／又はアスコルビン酸の濃度を計測するために用い計測用キットとすることも可能である。このような計測用キットを用いれば、既存の計測装置等を用いて、簡便に上記測定系を構成することが可能となる。
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
In addition, in order to configure the above measurement system, in order to measure the glucose concentration and / or ascorbic acid concentration by adding an electrode modified with ferrocene or a derivative thereof, or a reagent such as glucose oxidase and luminol. It is also possible to use a measurement kit. If such a measurement kit is used, the measurement system can be simply configured using an existing measurement device or the like.
Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
（グルコース、アスコルビン酸の同時測定）
直径10mmの金ディスク基板を1.0 mMのフェロセニルウンデカンチオールのヘキサン溶液に1時間浸せきし、金電極表面にフェロセン基を導入した。この電極基板を、支持電解質である過塩素酸ナトリウム（0.1M）、ルミノール（100μM）、グルコース酸化酵素（1mg/ml）を含むpH7.7のリン酸緩衝液に浸せきし、撹拌を行う。ここに0-1.0mMの各濃度のアスコルビン酸を含むグルコース（1.0mM）溶液を添加し、同時に金電極に+0.6V（対銀-塩化銀電極）の電位を印加し、電流応答と発光強度を同時に測定した結果をそれぞれ図1、図2に示す。図１から分かるように電流値はアスコルビン酸の濃度の増加とともに増大した。これは修飾金基板において表面固定フェロセン基の酸化に伴う電流、ルミノールの酸化電流、そして添加したアスコルビン酸が酸化される電流が併せて観察される結果を示している。
(Simultaneous measurement of glucose and ascorbic acid)
A 10 mm diameter gold disk substrate was immersed in 1.0 mM ferrocenylundecanthiol hexane solution for 1 hour to introduce ferrocene groups on the gold electrode surface. This electrode substrate is immersed in a phosphate buffer solution having a pH of 7.7 containing sodium perchlorate (0.1 M), luminol (100 μM), and glucose oxidase (1 mg / ml), which are supporting electrolytes, and stirred. Glucose (1.0 mM) solution containing ascorbic acid at each concentration of 0-1.0 mM was added here, and at the same time, a potential of +0.6 V (vs. silver-silver chloride electrode) was applied to the gold electrode, and current response and emission intensity The results of simultaneous measurements are shown in FIGS. 1 and 2, respectively. As can be seen from FIG. 1, the current value increased as the concentration of ascorbic acid increased. This shows the result of observing the current accompanying oxidation of the surface-immobilized ferrocene group, the oxidation current of luminol, and the current of oxidizing the added ascorbic acid in the modified gold substrate.
一方、図2に示すように、発光強度は添加するアスコルビン酸の濃度が高くなるにつれて減少した。消光反応はアスコルビン酸濃度0-0.1mMの範囲ではアスコルビン酸の濃度に比例し、アスコルビン酸濃度が1.0mMのときに発光応答は観察されなくなった。図1および図2より、グルコース濃度［G］、アスコルビン酸濃度［A］とした時の酸化電流応答（ａ［Ｇ］＋ｂ「Ａ」（ａ，ｂは正の定数））および発光量（ｃ［Ｇ］−ｄ［Ａ］（ｃ，ｄは正の定数））における各定数は、a:4.4×10-2 (A／M)、b:2.0×10-1(A／M)、c:1.1×104 (１／M)、d:5.8× 10(１／M)となった。 On the other hand, as shown in FIG. 2, the emission intensity decreased as the concentration of added ascorbic acid increased. The quenching reaction was proportional to the concentration of ascorbic acid in the range of 0 to 0.1 mM ascorbic acid, and no luminescence response was observed when the concentration of ascorbic acid was 1.0 mM. 1 and 2, the oxidation current response (a [G] + b “A” (a and b are positive constants)) and the light emission amount (c) when the glucose concentration [G] and the ascorbic acid concentration [A] are used. Each constant in [G] -d [A] (c and d are positive constants)) is a: 4.4 × 10-2 (A / M), b: 2.0 × 10-1 (A / M), c : 1.1 × 104 (1 / M), d: 5.8 × 10 (1 / M).
通常、血清中、および清涼飲料水等中におけるアスコルビン酸の濃度は、グルコース濃度と比較しておよそ50分の1から100分の1程度であることが知られており、グルコース濃度1.0mＭの場合に、発光反応の阻害（消光）応答がアスコルビン酸濃度（アスコルビン酸濃度0-0.1mMの範囲）に対して比例することを証明できた本法は、グルコース、アスコルビン酸の同時検出が可能な方法として一般サンプルに広く適応可能である。 In general, the concentration of ascorbic acid in serum and soft drinks is known to be about 1/100 to 1/100 compared to the glucose concentration. Furthermore, this method, which proved that the inhibition (quenching) response of the luminescence reaction is proportional to the ascorbic acid concentration (ascorbic acid concentration range of 0-0.1 mM), is a method that enables simultaneous detection of glucose and ascorbic acid It can be widely applied to general samples.
（酵素固定化電極）
グルコース酸化酵素50mgを1mlのリン酸緩衝液（pH6.4）に溶解したものを、200 mg の脂質［N-(a-トリメチルアンモニオアセチル)-ジドデシル-D-グルタメートクロリド］を20mlの水溶液と混合し、冷蔵庫中（4度Ｃ）で一晩置き、脂質修飾酵素の沈殿を形成させる。脂質修飾酵素の沈殿を遠心分離し、水で洗浄する操作を繰り返し、沈殿の精製を行い脂質修飾酵素を得た。該酵素は凍結乾燥し保存可能である。
(Enzyme immobilized electrode)
Dissolve 50 mg of glucose oxidase in 1 ml of phosphate buffer (pH 6.4), add 200 mg of lipid [N- (a-trimethylammonioacetyl) -didodecyl-D-glutamate chloride] with 20 ml of aqueous solution. Mix and leave overnight in refrigerator (4 ° C) to form a precipitate of lipid modifying enzyme. The operation of centrifuging the lipid-modified enzyme precipitate and washing with water was repeated, and the precipitate was purified to obtain a lipid-modified enzyme. The enzyme can be lyophilized and stored.
一方、直径10mmの金ディスク基板を1.0 mMのフェロセニルウンデカンチオールのヘキサン溶液に1時間浸せきし、金電極表面にフェロセン基を導入した。この電極基板上に脂質修飾グルコース酸化酵素を展開し、乾燥し、グルコース酸化酵素を固定化した修飾電極を作製した。この酵素固定化修飾電極を、支持電解質である過塩素酸ナトリウム（0.1M）、ルミノール（100μM）を含むpH7.9のリン酸緩衝液に浸せきし、撹拌を行う。ここに0-1.0mMの各濃度のアスコルビン酸を含むグルコース（1.0mM）溶液を添加し、同時に金電極に+0.6V（対銀-塩化銀電極）の電位を印加し、電流応答と発光強度を同時に測定した結果をそれぞれ図３、図４に示す。 On the other hand, a gold disk substrate having a diameter of 10 mm was immersed in a hexane solution of 1.0 mM ferrocenylundecanthiol for 1 hour to introduce a ferrocene group on the gold electrode surface. A lipid-modified glucose oxidase was developed on this electrode substrate and dried to prepare a modified electrode on which glucose oxidase was immobilized. This enzyme-immobilized modified electrode is immersed in a phosphate buffer solution of pH 7.9 containing sodium perchlorate (0.1 M) and luminol (100 μM), which are supporting electrolytes, and stirred. Glucose (1.0 mM) solution containing ascorbic acid at each concentration of 0-1.0 mM was added here, and at the same time, a potential of +0.6 V (vs. silver-silver chloride electrode) was applied to the gold electrode, and current response and emission intensity The results of simultaneous measurement are shown in FIGS. 3 and 4, respectively.
図３から分かるように電流値はアスコルビン酸の濃度の増加とともに増大した。これは修飾金基板において表面固定フェロセン基の酸化に伴う電流、ルミノールの酸化電流、そして添加したアスコルビン酸が酸化される電流が併せて観察される結果を示している。一方、図３に示すように、発光強度は添加するアスコルビン酸の濃度が高くなるにつれて減少した。消光反応はアスコルビン酸濃度0-0.1mMの範囲ではアスコルビン酸の濃度に比例し（図４、図５）、アスコルビン酸濃度が0.5 mMより高濃度のときに発光応答は観察されなくなった。 As can be seen from FIG. 3, the current value increased as the concentration of ascorbic acid increased. This shows the result of observing the current accompanying oxidation of the surface-immobilized ferrocene group, the oxidation current of luminol, and the current of oxidizing the added ascorbic acid in the modified gold substrate. On the other hand, as shown in FIG. 3, the emission intensity decreased as the concentration of added ascorbic acid increased. The quenching reaction was proportional to the concentration of ascorbic acid in the range of ascorbic acid concentration 0-0.1 mM (FIGS. 4 and 5), and no luminescence response was observed when the ascorbic acid concentration was higher than 0.5 mM.
図３の結果および図４のアスコルビン酸濃度０−０．１ｍMの範囲における濃度−発光強度の関係から、本系におけるグルコース濃度［G］、アスコルビン酸濃度［A］とした時の酸化電流応答（ａ［Ｇ］＋ｂ「Ａ」（ａ，ｂは正の定数））および発光量（ｃ［Ｇ］−ｄ［Ａ］（ｃ，ｄは正の定数））における各定数は、a:4.4× 10-2 (A／M)、b:1.2×102(A／M)、c:3.4×105 (１／M)、d:9.3×103(１／M)となった。 From the result of FIG. 3 and the relationship between concentration and luminescence intensity in the range of 0 to 0.1 mM ascorbic acid concentration in FIG. 4, the oxidation current response when the glucose concentration [G] and ascorbic acid concentration [A] in this system are taken ( Each constant in a [G] + b “A” (a and b are positive constants)) and light emission amount (c [G] −d [A] (c and d are positive constants)) is a: 4.4 × 10-2 (A / M), b: 1.2 × 102 (A / M), c: 3.4 × 105 (1 / M), d: 9.3 × 103 (1 / M).
通常、血清中、および清涼飲料水等中におけるアスコルビン酸の濃度は、グルコース濃度と比較しておよそ50分の1から100分の1程度であることが知られており、グルコース濃度1.0mＭの場合に、発光反応の阻害（消光）応答がアスコルビン酸濃度（アスコルビン酸濃度0-0.1mMの範囲）に対して比例することを証明できた本法は、グルコース、アスコルビン酸の同時検出が可能な方法として一般サンプルに広く適応可能である。 In general, the concentration of ascorbic acid in serum and soft drinks is known to be about 1/100 to 1/100 compared to the glucose concentration. Furthermore, this method, which proved that the inhibition (quenching) response of the luminescence reaction is proportional to the ascorbic acid concentration (ascorbic acid concentration range of 0-0.1 mM), is a method that enables simultaneous detection of glucose and ascorbic acid It can be widely applied to general samples.
１ センサー部
１−１ 修飾電極
１−２ 参照電極
１−３ 対極（白金線または白金箔）
１−４ 測定溶液
１−５ 試料注入部
１−６ 攪拌子
１−７ 容器
２ 攪拌器
３ 電気化学制御部
４ データ記録部
５ 発光測定部
DESCRIPTION OF
1-4 Measurement Solution 1-5 Sample Injection Unit 1-6 Stirrer 1-7
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008027657A JP4756284B2 (en) | 2008-02-07 | 2008-02-07 | Apparatus for measuring glucose and ascorbic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008027657A JP4756284B2 (en) | 2008-02-07 | 2008-02-07 | Apparatus for measuring glucose and ascorbic acid |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003376230A Division JP4154485B2 (en) | 2003-11-05 | 2003-11-05 | Method for measuring glucose and ascorbic acid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008180723A true JP2008180723A (en) | 2008-08-07 |
| JP4756284B2 JP4756284B2 (en) | 2011-08-24 |
Family
ID=39724705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008027657A Expired - Fee Related JP4756284B2 (en) | 2008-02-07 | 2008-02-07 | Apparatus for measuring glucose and ascorbic acid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4756284B2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102590190A (en) * | 2012-01-31 | 2012-07-18 | 桂林理工大学 | Method for measuring chlorogenic acid by using Fe<2+>-H2O<2-> methylene blue chemical luminescence system |
| CN102053085B (en) * | 2009-10-28 | 2013-03-20 | 中国科学院高能物理研究所 | Method for detecting glucose by ferroferric oxide nano particle catalytic chemiluminescence |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05509399A (en) * | 1990-06-12 | 1993-12-22 | ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・リミテッド | How to analyze antioxidant capacity |
| JP2000065778A (en) * | 1998-08-26 | 2000-03-03 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Biosensor |
| JP2001133436A (en) * | 1999-11-01 | 2001-05-18 | Microtec Nition:Kk | Matrix type substrate for electrochemical emission |
| JP2002189014A (en) * | 2000-12-20 | 2002-07-05 | Sankyo Co Ltd | Enzyme electrode |
| JP2003139737A (en) * | 2001-10-30 | 2003-05-14 | Toyobo Co Ltd | Bio-sensor |
| JP2003279476A (en) * | 2002-03-25 | 2003-10-02 | Japan Science & Technology Corp | Surface plasmon resonance sensor |
-
2008
- 2008-02-07 JP JP2008027657A patent/JP4756284B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05509399A (en) * | 1990-06-12 | 1993-12-22 | ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・リミテッド | How to analyze antioxidant capacity |
| JP2000065778A (en) * | 1998-08-26 | 2000-03-03 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Biosensor |
| JP2001133436A (en) * | 1999-11-01 | 2001-05-18 | Microtec Nition:Kk | Matrix type substrate for electrochemical emission |
| JP2002189014A (en) * | 2000-12-20 | 2002-07-05 | Sankyo Co Ltd | Enzyme electrode |
| JP2003139737A (en) * | 2001-10-30 | 2003-05-14 | Toyobo Co Ltd | Bio-sensor |
| JP2003279476A (en) * | 2002-03-25 | 2003-10-02 | Japan Science & Technology Corp | Surface plasmon resonance sensor |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102053085B (en) * | 2009-10-28 | 2013-03-20 | 中国科学院高能物理研究所 | Method for detecting glucose by ferroferric oxide nano particle catalytic chemiluminescence |
| CN102590190A (en) * | 2012-01-31 | 2012-07-18 | 桂林理工大学 | Method for measuring chlorogenic acid by using Fe<2+>-H2O<2-> methylene blue chemical luminescence system |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4756284B2 (en) | 2011-08-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5368707A (en) | Convenient determination of trace lead in whole blood and other fluids | |
| JP3621084B2 (en) | Biosensor | |
| Nanjo et al. | Enzyme electrode for L-amino acids and glucose | |
| EP2228645B1 (en) | Method, device and apparatus for measuring the concentration of creatinine, and method, device and apparatus for measuring the amount of salt using the same | |
| KR101698988B1 (en) | Biosensor using redox cycling of an electron mediator | |
| RU2007141387A (en) | OXIDIZABLE TYPES OF COMPOUNDS AS AN INTERNAL STANDARD IN CONTROL SOLUTIONS FOR BIOSENSORS | |
| Li et al. | A single-layer structured microbial sensor for fast detection of biochemical oxygen demand | |
| JP2007333714A (en) | Electrochemical biosensor for measuring ultratrace amount of histamine | |
| Deng et al. | Self-gelatinizable copolymer immobilized glucose biosensor based on Prussian Blue modified graphite electrode | |
| Casero et al. | Peroxidase enzyme electrodes as nitric oxide biosensors | |
| Tatsuma et al. | Peroxidase model electrodes: Sensing of imidazole derivatives with heme peptide-modified electrodes | |
| JP3217066B2 (en) | Compositions useful for anaerobic determination of analytes | |
| JP6128578B2 (en) | Endotoxin concentration measuring method and endotoxin concentration measuring apparatus | |
| JP4756284B2 (en) | Apparatus for measuring glucose and ascorbic acid | |
| Aboul-Enein et al. | Chemiluminescence-based (bio) sensors—an overview | |
| Okuma et al. | Mediated amperometric biosensor for hypoxanthine based on a hydroxymethylferrocene-modified carbon paste electrode | |
| Fan et al. | Highly sensitive voltammetric biosensor for nitric oxide based on its high affinity with hemoglobin | |
| Campanella et al. | A new tool for superoxide and nitric oxide radicals determination using suitable enzymatic sensors | |
| JP4154485B2 (en) | Method for measuring glucose and ascorbic acid | |
| JP2005118014A (en) | Method of analysis and reagent used for the same | |
| CA2051119A1 (en) | Use of fluid insoluble oxidizing agents to eliminate interfering substances in oxidation-reduction measuring systems | |
| JP2528457B2 (en) | Hydrogen peroxide determination method | |
| EP1496126A1 (en) | Nanoparticles for optical sensors | |
| JP3867081B2 (en) | Fluorescence measurement of analyte with amine-N-oxide as redox indicator | |
| JPWO2005056824A1 (en) | Method for detecting sulfate-conjugated bile acid, test paper and biosensor used therefor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101012 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101203 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101220 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110517 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110518 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140610 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140610 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |