JP2008073048A - Monocyte separation and cultivation device and method for recovering dendritic cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、単球分離培養装置および樹状細胞回収方法に関するものである。 The present invention relates to a monocyte separation culture apparatus and a dendritic cell collection method.
近年、細胞機能の研究や、細胞の分離、培養技術の進歩によって、種々の疾患に対して細胞を移植する治療法が試みられている。このような治療では、血液や組織液など種々の細胞が混在した細胞懸濁液から目的細胞を分離し、培養等の操作の後、患者へ細胞を移植することが行われている。 In recent years, treatment methods for transplanting cells for various diseases have been attempted by studying cell functions, cell separation, and progress in culture techniques. In such treatment, target cells are separated from a cell suspension in which various cells such as blood and tissue fluid are mixed, and the cells are transplanted into a patient after an operation such as culture.
樹状細胞は、強力な抗原提示細胞としての機能が最近明らかになり、細胞治療の一つとして研究が進められている。この治療は、樹状細胞に患者の癌細胞あるいは癌特異的抗原を提示する方法、樹状細胞に抗原遺伝子を導入する方法、樹状細胞を腫瘍細胞と細胞融合させる方法などの処理を行い、処理された樹状細胞を患者に戻すことで、患者の持つ免疫機能を強化させる一種の免疫療法であり、癌ワクチンとしての利用が期待されている。 Dendritic cells have recently been revealed to function as powerful antigen-presenting cells, and are being studied as one of cell therapies. This treatment includes treatment such as a method of presenting a patient's cancer cell or cancer-specific antigen to dendritic cells, a method of introducing an antigen gene into dendritic cells, a method of cell fusion of dendritic cells with tumor cells, It is a kind of immunotherapy that reinforces the immune function of the patient by returning the treated dendritic cells to the patient, and is expected to be used as a cancer vaccine.
この治療のために必要な樹状細胞は、骨髄、末梢血、臍帯血に含まれるCD34陽性細胞から培養によって分化誘導させる方法、末梢血や臍帯血に含まれる未熟な樹状細胞を採取する方法、末梢血単核球分画から培養によって分化誘導させる方法などによって得られ、特に末梢血単球を利用する方法が臨床応用に広く用いられている。 Dendritic cells necessary for this treatment are a method of inducing differentiation by culture from CD34 positive cells contained in bone marrow, peripheral blood, and cord blood, and a method of collecting immature dendritic cells contained in peripheral blood and cord blood. It is obtained by a method of inducing differentiation from a peripheral blood mononuclear cell fraction by culturing, and particularly a method using peripheral blood monocytes is widely used for clinical application.
末梢血単球を利用する方法では、最初にアフェレーシスや比重遠心法によって末梢血中の単球を分離し、さらに比重遠心法や非付着性細胞の除去を行うことによって単球を分離している。このようにして得られた単球は、IL−4、GM−CSFなどのサイトカインや血清を添加した培養液中で培養される。 In the method using peripheral blood monocytes, monocytes in the peripheral blood are first separated by apheresis or specific gravity centrifugation, and then monocytes are separated by specific gravity centrifugation or removal of non-adherent cells. . The monocytes thus obtained are cultured in a culture solution to which cytokines such as IL-4 and GM-CSF and serum are added.
このような操作は、一般的な培養用の理化学用具を用いて行われているため、分離操作中に何回も分離用遠沈管に移し替える作業が必要であるので、操作が非常に煩雑である。また、遠心操作を繰り返すので、細胞へのダメージが大きく、細胞のロスの危険性が高いだけでなく、また、処理に時間を要する。さらに、分離操作と培養操作は、開放操作で行われるために細菌汚染の危険性が高い。 Since such operations are performed using general physics and chemistry tools for culture, it is necessary to transfer to the centrifuge tube for separation many times during the separation operation, so the operation is very complicated. is there. In addition, since the centrifugal operation is repeated, not only the damage to the cells is large and the risk of cell loss is high, but also the processing takes time. Furthermore, since the separation operation and the culture operation are performed in an open operation, there is a high risk of bacterial contamination.
本発明の目的は、無菌的な操作で、末梢血などから単球を分離するとともに、培養することができる単球分離培養装置を提供することである。本発明の他の目的は、品質の良い樹状細胞を効率良く回収することができる樹状細胞回収方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a monocyte separation and culture apparatus capable of separating and culturing monocytes from peripheral blood or the like by aseptic operation. Another object of the present invention is to provide a dendritic cell recovery method capable of efficiently recovering high quality dendritic cells.
このような目的は、下記(1)〜(8)の本発明により達成される。
(1) 単球を含有する被処理液から単球を選択的に分離するとともに、分離された単球を培養する単球分離培養装置であって、ガス透過性がある材質からなり、流入口および流出口を有するハウジングと、該ハウジング内を流入室と流出室とに区分するように設けられた単球捕捉フィルターとからなる単球分離器具と、該単球分離器具の流入口に連通する被処理液の流入ラインと、
該流入ラインに連通する培養液の添加ラインと、該単球分離器具の流出口に連通する排出ラインとを備えることを特徴とする単球分離培養装置。
Such an object is achieved by the present inventions (1) to (8) below.
(1) A monocyte separation and culture apparatus for selectively separating monocytes from a liquid to be treated containing monocytes and culturing the separated monocytes, which is made of a gas-permeable material and has an inlet. A monocyte separation instrument comprising a housing having an outlet and an outlet, and a monocyte capturing filter provided to divide the inside of the housing into an inflow chamber and an outflow chamber, and communicates with the inlet of the monocyte separation instrument The inflow line of the liquid to be treated;
A monocyte separation and culture apparatus comprising a culture solution addition line communicating with the inflow line and a discharge line communicating with the outlet of the monocyte separation instrument.
(2) 前記単球捕捉フィルターは、平均孔径が6〜8μmであり、かつ肉厚(mm)と平均孔径(mm)との比が100〜200である上記(1)に記載の単球分離培養装置。 (2) The monocyte separation filter according to (1), wherein the monocyte capturing filter has an average pore diameter of 6 to 8 μm, and a ratio of a wall thickness (mm) to an average pore diameter (mm) of 100 to 200. Culture device.
(3) 前記単球捕捉フィルターは、連通孔を有するスポンジ状多孔質体からなる上記(1)または(2)に記載の単球分離培養装置。 (3) The monocyte separation and culture apparatus according to (1) or (2), wherein the monocyte capturing filter is formed of a sponge-like porous body having communication holes.
(4) 前記排出ラインは、末端に回収バッグを有し、前記単球分離器具を通過した被処理液を回収する回収ラインと、使用済みの培養液を排出する廃液ラインとに分岐している上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の単球分離培養装置。 (4) The discharge line has a recovery bag at the end, and is branched into a recovery line for recovering the liquid to be processed that has passed through the monocyte separation instrument, and a waste liquid line for discharging the used culture medium. The monocyte separation and culture apparatus according to any one of (1) to (3) above.
(5) 前記単球を含有する被処理液は、末梢血である上記(1)ないし(4)のいずれかに記載の単球分離培養装置。 (5) The monocyte separation and culture apparatus according to any one of (1) to (4), wherein the liquid to be treated containing monocytes is peripheral blood.
(6) ガス透過性がある材質からなり、流入口および流出口を有するハウジングと、該ハウジング内を流入室と流出室とに区分するように設けられた単球捕捉フィルターとからなる単球分離器具を用いて、単球を含有する被処理液から単球を選択的に分離するとともに、分離された単球から得られる樹状細胞を回収する樹状細胞回収方法であって、前記単球を含有する被処理液を前記単球分離器具の流入口から導入して、前記単球捕捉フィルターにより単球を捕捉し、その他の被処理液を前記単球分離器具の流出口から排出する工程と、培養液を前記単球分離器具の流入口から導入して、前記分離された単球から樹状細胞を分化誘導する工程と、抗原溶液を前記単球分離器具の流入口から導入して、前記樹状細胞に抗原を提示する工程と、前記単球分離器具の流入口から前記抗原を提示された樹状細胞を回収する工程とを含むことを特徴とする樹状細胞回収方法。 (6) A monocyte separation comprising a housing made of a gas permeable material and having an inlet and an outlet, and a monocyte trapping filter provided to divide the housing into an inflow chamber and an outflow chamber. A dendritic cell collection method for selectively separating monocytes from a treatment liquid containing monocytes using an instrument and collecting dendritic cells obtained from the separated monocytes, the monocytes The liquid to be treated is introduced from the inlet of the monocyte separation instrument, the monocytes are captured by the monocyte capture filter, and the other liquid to be treated is discharged from the outlet of the monocyte separation instrument. Introducing a culture solution from the inlet of the monocyte separation instrument, inducing differentiation of dendritic cells from the separated monocytes, and introducing an antigen solution from the inlet of the monocyte separation instrument. Presenting the antigen to the dendritic cell; Dendritic cells recovery method, characterized in that the inlet of the Kitan ball separating device and recovering dendritic cells presenting said antigen.
(7) 前記単球から樹状細胞を分化誘導する工程は、一定時間経過後に、前記単球分離器具の流出口から培養液を排出し、再び新しい培養液を前記単球分離器具の流入口から導入する操作を複数回行うものである上記(6)に記載の樹状細胞回収方法。 (7) In the step of inducing differentiation of dendritic cells from the monocytes, after a lapse of a certain time, the culture solution is discharged from the outlet of the monocyte separation instrument, and the new culture solution is again supplied to the inlet of the monocyte separation instrument. The dendritic cell collection method according to the above (6), wherein the operation of introducing from is performed a plurality of times.
(8) 前記抗原を提示された樹状細胞を回収する工程は、前記単球分離器具の流出口から培養液を排出した後に、置換液を前記単球分離器具の流入口から導入して、培養液を流出口から排出し、次いで、回収液を前記単球分離器具の流出口から導入して行う上記(6)または(7)に記載の樹状細胞回収方法。 (8) The step of recovering the dendritic cells presented with the antigen, after discharging the culture solution from the outlet of the monocyte separation instrument, introducing a replacement solution from the inlet of the monocyte separation instrument, The method for recovering dendritic cells according to (6) or (7) above, wherein the culture solution is discharged from the outlet and then the recovery solution is introduced from the outlet of the monocyte separation instrument.
本発明の単球分離培養装置は、無菌的に、かつ簡単な操作で、末梢血などから単球を分離するとともに、培養することができる。また、本発明の樹状細胞回収方法は、簡単な操作で、細胞へのダメージが少なく品質の良い樹状細胞を効率良く回収することができる。 The monocyte separation and culture apparatus of the present invention can separate and culture monocytes from peripheral blood and the like in an aseptic and simple operation. Moreover, the dendritic cell collection method of the present invention can efficiently collect dendritic cells with good quality with little damage to the cells by a simple operation.
以下、本発明の実施形態に係る単球分離培養装置および樹状細胞回収方法を詳細に説明する。
最初に、本発明の実施形態に係る単球分離培養装置に用いる単球捕捉フィルターについて説明する。図1は、本発明の実施形態に係る単球分離培養装置に用いる単球分離器具の平面図であり、図2は、図1の断面図である。
Hereinafter, the monocyte separation culture apparatus and the dendritic cell collection method according to the embodiment of the present invention will be described in detail.
First, the monocyte capture filter used in the monocyte separation and culture apparatus according to the embodiment of the present invention will be described. FIG. 1 is a plan view of a monocyte separation instrument used in a monocyte separation and culture apparatus according to an embodiment of the present invention, and FIG. 2 is a cross-sectional view of FIG.
図1および図2に示すように、本発明の実施形態に係る単球分離培養装置に用いる単球捕捉フィルター11は、単球を含有する被処理液から単球を選択的に捕捉できる濾材であり、ハウジング12内を流入室15と流出室16とに区分するように設けられている。ハウジング12は、ガス透過性がある材質からなり、流入口13および流出口14を有するものである。
本実施形態において、単球分離器具1は、ハウジング12と単球捕捉フィルター11とを備えるものであり、流入口13からハウジング12内に入った被処理液が流入室15を通って、必ず単球捕捉フィルター11を通過して、流出室16に流れ、流出口14から出るように構成されている。
As shown in FIGS. 1 and 2, the monocyte capture filter 11 used in the monocyte separation and culture apparatus according to the embodiment of the present invention is a filter medium that can selectively capture monocytes from a liquid to be treated containing monocytes. The housing 12 is provided so as to be divided into an
In the present embodiment, the
ここで、被処理液とは、末梢血、臍帯血、骨髄液またはこれらを比重遠心分離することにより得られた単球浮遊液、バフィーコートなどの単球を含有する生体由来の液状物である。
ハウジング12は、2枚のシートからなり、単球捕捉フィルター11によって捕捉された単球を培養するのにあったて支障のない程度のガス透過性を有する熱可塑性樹脂からなる。具体的には、軟質ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン、エチレン−酢酸ビニル共重合体などが挙げられる。
Here, the liquid to be treated is peripheral blood, umbilical cord blood, bone marrow fluid, or a monocyte suspension obtained by subjecting these to specific gravity centrifugation, or a liquid derived from a living body containing monocytes such as buffy coat. .
The housing 12 is made of two sheets, and is made of a thermoplastic resin having gas permeability that does not hinder the cultivation of monocytes captured by the monocyte capturing filter 11. Specific examples include soft polyvinyl chloride, polyolefin, and ethylene-vinyl acetate copolymer.
また、流入口13および流出口14は、チューブ形状であり、ハウジング12を構成する2枚のシートの間に、単球捕捉フィルター11と共に挟んだ状態で高周波融着や熱シールすることによって、ハウジング12に固定されるため、ハウジング12とのシール性に優れる材料からなる。具体的には、ハウジング12と同一の材料か、融点が近い材料である。
Moreover, the
単球捕捉フィルター11は、肉厚(mm)と平均孔径(mm)との比(肉厚/平均孔径)が100〜200の範囲になるものであり、120〜150の範囲であることがより好適である。肉厚(mm)と平均孔径(mm)との比は、この範囲より小さくなると単球の捕捉率の低下を招く。また、この範囲より大きくなると、単球以外の細胞の捕捉率が高くなり、余分な細胞成分が多くなる。 The monocyte capture filter 11 has a ratio of thickness (mm) to average pore diameter (mm) (thickness / average pore diameter) in the range of 100 to 200, more preferably in the range of 120 to 150. Is preferred. When the ratio of the wall thickness (mm) to the average pore diameter (mm) is smaller than this range, the monocyte capture rate is lowered. Moreover, when larger than this range, the capture rate of cells other than a monocyte will become high and an excess cell component will increase.
単球捕捉フィルター11の平均孔径は、直径55mmの円盤状に打抜いたフィルターをパームポロメーターで測定したときの値である。また、単球捕捉フィルター11は、総肉厚と平均孔径との比が上記の範囲に入るものであれば、単層(1枚)でも複数層(複数枚を重ねたもの)からなるものでもよい。
単球捕捉フィルター11は、単球以外の細胞は吸着しない材料で、細胞培養用担体として使用可能なものであればよい。また、液を通過させる観点から、親水性、保水性を有するものが好ましい。このような材料としては、天然樹脂、合成樹脂、天然繊維、合成繊維などが挙げられる。具体的には、ポリウレタン、ポリビニルアルコールなどの合成樹脂からなる連通孔を有するスポンジ状多孔質体や、ポリエステル、ナイロン、ポリオレフィンなどの合成樹脂からなる織布または不織布からなる繊維塊である。
The average pore diameter of the monocyte capturing filter 11 is a value when a filter punched into a disk shape having a diameter of 55 mm is measured with a palm porometer. The monocyte capture filter 11 may be a single layer (single) or a plurality of layers (multiple layers) as long as the ratio of the total thickness to the average pore diameter falls within the above range. Good.
The monocyte capture filter 11 may be any material that does not adsorb cells other than monocytes and can be used as a cell culture carrier. Moreover, what has hydrophilic property and water retention property from a viewpoint of making a liquid pass is preferable. Examples of such materials include natural resins, synthetic resins, natural fibers, and synthetic fibers. Specifically, it is a sponge-like porous body having a communicating hole made of a synthetic resin such as polyurethane or polyvinyl alcohol, or a fiber lump made of a woven or non-woven cloth made of a synthetic resin such as polyester, nylon or polyolefin.
次に、本発明の実施形態に係る単球分離培養装置について説明する。図3は、本発明の実施形態に係る単球分離培養装置を説明するための平面図である。また、図4は、本発明の他の実施形態に係る単球分離培養装置を説明するための平面図である。 Next, a monocyte separation and culture apparatus according to an embodiment of the present invention will be described. FIG. 3 is a plan view for explaining the monocyte separation and culture apparatus according to the embodiment of the present invention. FIG. 4 is a plan view for explaining a monocyte separation and culture apparatus according to another embodiment of the present invention.
図3に示すように、本発明の実施形態に係る単球分離培養装置100は、単球を含有する被処理液から単球を選択的に分離するとともに、分離された単球を培養するためのフィルターを備えるバッグシステムであり、上述した単球分離器具1と、単球分離器具1の流入口13に連通する被処理液の流入ライン21と、流入ライン21に連通する培養液の添加ライン22と、単球分離器具1の流出口14に連通する排出ライン31とを備える。
As shown in FIG. 3, the monocyte separation and
流入ライン21は、末端に単球を含有する被処理液を収容するための処理液バッグ2を備えている。この処理液バッグ2には、被処理液をバッグ内に収容する採液ライン23が設けられていることが好ましい。
The
被処理液が末梢血である場合には、処理液バッグ2として公知の採血バッグを用いることができ、この場合には、採液ライン23は末端に採血針(図示せず)を有する採血チューブを用いられる。また、被処理液が臍帯血や骨髄液である場合には、処理液バッグ2として凍結保存に適した材料からなる容器を用いることができる。
When the liquid to be treated is peripheral blood, a known blood collection bag can be used as the
添加ライン22は、添加ポート222と、この添加ポート222の先端に設けられたコネクタ221を備えている。このコネクタ221は、洗浄液が入ったシリンジや容器(図示せず)を接続するために設けられている。
The
排出ライン31は、末端に廃液バッグ34を有し、単球分離器具1を通過した被処理液を回収するための回収ライン32と、使用済みの培養液を排出するための廃液ライン33とに分岐している。図3に示す実施形態では、廃液ライン33の末端に廃液バッグ34が設けられている。
The discharge line 31 has a
図4に示すように、本発明の他の実施形態に係る単球分離培養装置110においては、廃液ライン33が、廃液ポート332と、この廃液ポート332の先端に設けられたコネクタ331とから構成されている。このコネクタ331には、廃液を収容するためのシリンジ、バッグ、容器など(図示せず)を接続することができる。このように、単球分離培養装置110は、図3に示す単球分離培養装置100と廃液ライン33の構成が異なる。なお、この他の構成については、図3に示す単球分離培養装置100と同様であるため説明を省略する。
As shown in FIG. 4, in the monocyte separation and
処理液バッグ2、回収バッグ3および廃液バッグ34は、軟質ポリ塩化ビニルのような熱可塑性樹脂材料からなる2枚のシートを高周波融着や熱シールにより融着して作製された公知の血液バッグを用いられる。
The
図示した処理液バッグ2、回収バッグ3および廃液バッグ34は、それぞれ2つの排出口25,35,345を有するものであるが、これに限らず、排出口がなくても、排出口が1つまたは3つ以上あってもよい。これらの排出口は、バッグ内の液体をサンプリングしたり、バッグ内の液体を別のバッグなどに分離するために設けられている。
The illustrated
図3および図4における流入ライン21、排出ライン31および回収ライン32と、図3における廃液ライン33は、軟質ポリ塩化ビニルのような熱可塑性樹脂材料からなる可撓性のチューブで構成されている。これらの各ラインには、必要に応じて、ローラークレンメ、ワンタッチクレンメなどの開閉手段を取り付けることができる。
The
次に、本発明の実施形態に係る単球分離培養装置の使用方法、すなわち、本発明の実施形態に係る樹状細胞回収方法について説明する。 Next, a method for using the monocyte separation and culture apparatus according to the embodiment of the present invention, that is, a dendritic cell recovery method according to the embodiment of the present invention will be described.
本発明の実施形態に係る樹状細胞回収方法は、上述した単球分離器具を用いて、単球を含有する被処理液から単球を選択的に分離するとともに、分離された単球から得られる樹状細胞を回収する方法であり、以下の<1>〜<4>の工程を含むものである。 The method for collecting dendritic cells according to the embodiment of the present invention selectively separates monocytes from the treatment liquid containing monocytes using the monocyte separation instrument described above and obtains them from the separated monocytes. The method includes the following steps <1> to <4>.
<1> 単球を含有する被処理液(例えば、末梢血)を単球分離器具1の流入口13から導入して、単球捕捉フィルター11により単球を捕捉し、その他の被処理液(実質的に単球を除く細胞成分を含む末梢血)を単球分離器具1の流出口14から排出する工程
<1> A liquid to be treated (for example, peripheral blood) containing monocytes is introduced from the
<2> 培養液(培地およびサイトカインを含有する溶液)を単球分離器具1の流入口13から導入して、分離された単球から樹状細胞を分化誘導する工程
<2> A step of introducing a culture solution (a solution containing a medium and cytokine) from the
<3> 抗原溶液(抗原分子およびサイトカインを含有する溶液)を単球分離器具1の流入口13から導入して、樹状細胞に抗原を提示する工程
<3> A step of introducing an antigen solution (a solution containing antigen molecules and cytokines) from the
<4> 単球分離器具1の流入口13から抗原を提示された樹状細胞を回収する工程
<4> Step of collecting dendritic cells presenting the antigen from the
以下、図3に示す単球分離培養装置100を用いて、単球を含有する被処理液として末梢血(全血)を用いる場合を例にして、上記各工程を具体的に説明する。
Hereinafter, using the monocyte separation and
上記<1>の工程は、全血から単球を分離するための工程である。この工程では、予め処理液バッグ2に収容され、抗凝固剤と混合された全血を、流入ライン21を通して流入口13から単球分離器具1内に導入し、単球捕捉フィルター11に通して実質的に単球のみを選択的に捕捉させることにより分離し、残りの血液成分(赤血球、血小板、リンパ球および顆粒球)を単球分離器具1の流出口14から排出させることにより、全血から実質的に単球だけが単球分離器具1内に分離され、残りの血液成分は排出ライン31および回収ライン32を介して回収バッグ3内に回収される。なお、このような操作に先立って、プライミング操作を行うことが好ましい。
The process <1> is a process for separating monocytes from whole blood. In this step, whole blood previously stored in the
この工程においては、残りの血液成分を確実に排出させるために、単球捕捉フィルター11に単球を捕捉させた状態で洗浄液を通して単球捕捉フィルター11を洗浄することが好ましい。具体的には、予め洗浄液が充填されたシリンジ(図示せず)を添加ライン22のコネクタ221に接続し、洗浄液を添加ポート222から流入口13を介して単球分離器具1内に流入し、単球捕捉フィルター11に通過させて、流出口14から排出ライン31および回収ライン32を介して回収バッグ3内に排出することにより、単球分離器具1の流出室16などに残留していた残りの血液成分が確実に洗い流される。洗浄液としては、FCS、ヒト血漿、ヒトアルブミン等を加えた生理食塩水や、デキストラン40、PBSなどを用いることができる。
In this step, it is preferable to wash the monocyte capture filter 11 through the washing liquid in a state where the monocyte capture filter 11 captures the monocytes in order to reliably discharge the remaining blood components. Specifically, a syringe (not shown) preliminarily filled with a cleaning liquid is connected to the
このような<1>の工程が終了後に、末梢血(全血)が入っていた処理液バッグ2および残りの血液成分が回収された回収バッグ3は、不要となるので、処理液バッグ2は流入ライン21の所定位置でチューブシーラーを用いてシールして取り外し、回収バッグ3は回収ライン32の所定位置でチューブシーラーを用いてシールして取り外す。
Since the
上記<2>の工程は、単球から樹状細胞を分化誘導するための工程である。この工程では、単球分離器具1の流入口13を開放状態、流出口14を閉塞状態とし、予め培地およびサイトカインを含有する培養液を入れたシリンジを添加ライン22のコネクタ221に接続して、添加ポート222から流入ライン21を介して、流入口13から単球分離器具1内の単球捕捉フィルター11に捕捉されている単球に培養液を添加することにより、単球から樹状細胞が分化誘導される。この工程で用いる培養液は、培地およびサイトカインを含有するものである。
The step <2> is a step for inducing differentiation of dendritic cells from monocytes. In this step, the
この工程では、単球分離器具1の流入口13および流出口14を閉塞状態とし、一定時間経過後に、流出口14を開放状態にして、単球分離器具1内の培養液を排出し、流出口14を閉塞し、流入口13を再び開放状態として、新しい培地およびサイトカインを含有する培養液を単球分離器具1内に導入し、流入口13を閉塞し、一定時間経過後に、この操作(培養液の交換)を複数回繰り返し行うことにより、短時間で効率良く、単球から樹状細胞を分化誘導することができる。
In this step, the
この操作にあたって、単球分離器具1内の培養液の排出は、培養液を排出ライン31から廃液ライン33を介して廃液バッグ34に送り込むことにより行われる。なお、図4に示す単球分離培養装置110を用いる場合には、廃液ライン33のコネクタ331に、廃液を回収するためのバッグなどを接続して行われる。
In this operation, the culture solution in the
この工程で用いる培地としては、1〜10%FCS、ヒト血漿が加えられたRPMI 1640またはX−Vivo 10、AIM−Vなどが挙げられる。サイトカインとしては、GM−CSFおよびIL−4などを用いることができる。
このような<2>の工程は、単球から樹状細胞が分化誘導されるまで行われる。具体的には、3〜20日程度、好ましくは5〜10日程度行う。このような一連の操作は、37℃,5%CO2雰囲気下で行うことが好ましい。
Examples of the medium used in this step include RPMI 1640 or X-Vivo 10, AIM-V to which 1 to 10% FCS and human plasma are added. As cytokines, GM-CSF, IL-4, and the like can be used.
Such a process <2> is performed until dendritic cells are induced to differentiate from monocytes. Specifically, it is performed for about 3 to 20 days, preferably about 5 to 10 days. Such a series of operations is preferably performed at 37 ° C. in a 5
上記<3>の工程は、樹状細胞に抗原を提示するための工程である。この工程では、抗原溶液を単球分離器具1の流入口13から導入して、樹状細胞に抗原が提示される。抗原分子の導入は、予め抗原分子を充填したシリンジ(図示せず)を添加ライン22のコネクタ221に接続し、抗原溶液を添加ポート222から流入口13を介して単球分離器具1内に導入し、樹状細胞に添加することにより行われる。この工程で用いる抗原溶液は、抗原分子を含有するものであり、抗原分子の他にサイトカインを含有していても良い。抗原分子としては、癌細胞溶解産物、酸抽出ペプチド、癌特異的合成ペプチドなどを用いることができる。また、サイトカインとしては、TNF−αなどを用いることができる。
The step <3> is a step for presenting an antigen to dendritic cells. In this step, the antigen solution is introduced from the
このような<3>の工程は、数時間〜数日、好ましくは4時間〜2日行う。この間に、培養液の交換、培地の交換またはサイトカインの交換や、抗原分子の添加を必要に応じて行うことにより、確実に樹状細胞に抗原を提示することができる。 Such <3> step is performed for several hours to several days, preferably 4 hours to 2 days. During this time, the antigen can be surely presented to the dendritic cells by exchanging the culture medium, the medium or the cytokine, or adding the antigen molecule as necessary.
上記<4>の工程は、抗原を提示された樹状細胞を回収するための工程である。この工程では、単球分離器具1の流入口13から抗原を提示された樹状細胞が回収される。抗原提示後の樹状細胞の回収は、単球分離器具1内の培養液を排出した後に、置換液を導入して、培養液を流出口から排出し、次いで、回収液を導入する操作により行う。
The step <4> is a step for recovering the dendritic cells presented with the antigen. In this step, dendritic cells presenting the antigen are collected from the
具体的には、最初に、単球分離器具1内の培養液を単球分離器具1の流出口14から排出ライン31および廃液ライン33を介して廃液バッグ34内に排出し、その後に、予め置換液を充填したシリンジ(図示せず)を添加ライン22のコネクタ221に接続し、置換液を添加ポート222から単球分離器具1の流入口13を介して単球分離器具1内に導入し、抗原提示後の樹状細胞を置換液に浮遊させ、次いで、置換液が入っていたシリンジで樹状細胞浮遊液を吸引することにより、シリンジ内に抗原提示後の樹状細胞を回収する。
Specifically, first, the culture solution in the
なお、図4に示す単球分離培養装置110を用いる場合には、廃液を回収するためのバッグ(図示せず)を廃液ライン33のコネクタ331に接続して、このバッグ内に培養液を排出する。また、樹状細胞の回収は、置換液を単球分離器具1内に流入した後に、予め回収液を充填したシリンジなど(図示せず)を廃液ライン33のコネクタ331に接続し、回収液を廃液ポート332から排出ライン31を介して流出口14から単球分離器具1内に流入し、単球捕捉フィルター1に通して(逆流させる)、置換液が入っていたシリンジに排出することにより行うことができる。
In the case of using the monocyte separation and
この工程で用いる回収液としては、FCS、ヒト血漿、ヒトアルブミンなどを加えた生理食塩水や、デキストラン40、PBSなどを好適に用いることができる。また、置換液としても、回収液と同様のものを用いることができる。 As the recovery solution used in this step, physiological saline added with FCS, human plasma, human albumin, or the like, dextran 40, PBS or the like can be suitably used. In addition, as the replacement liquid, the same liquid as the recovered liquid can be used.
表1に示すような、平均孔径、肉厚および肉厚と平均孔径の比(肉厚/平均孔径)を有する実施例1〜10および比較例1〜9の単球捕捉フィルターを作製し、単球および残りの血液成分(リンパ球、顆粒球、赤血球および血小板)の捕捉率を算出した。 As shown in Table 1, the monocyte capture filters of Examples 1 to 10 and Comparative Examples 1 to 9 having average pore diameter, thickness, and ratio of thickness to average pore diameter (thickness / average pore diameter) were prepared. The capture rate of spheres and remaining blood components (lymphocytes, granulocytes, erythrocytes and platelets) was calculated.
ポリウレタン製のスポンジ状多孔質体を直径26mmの円形に切り抜いて、単球捕捉フィルターを作製した。このフィルターを外周面からの液漏れがないように平膜固定用の容器にセットした。そして、この容器の流入口には軟質ポリ塩化ビニル製チューブを接続し、流出口には21G注射針(21G)を接続し、この注射針の先端に、ろ過した血液を回収できるように血液回収容器をセットした。なお、流出口から血液回収容器までの落差は15cmとした。 A sponge-like porous body made of polyurethane was cut out into a circle having a diameter of 26 mm to produce a monocyte capturing filter. This filter was set in a container for fixing a flat membrane so as not to leak liquid from the outer peripheral surface. A flexible polyvinyl chloride tube is connected to the inlet of the container, a 21G injection needle (21G) is connected to the outlet, and blood is collected at the tip of the injection needle so that the filtered blood can be recovered. The container was set. The drop from the outlet to the blood collection container was 15 cm.
最初に、流入口から0.5%アルブミン加生理食塩水を平膜固定用容器に流してプライミングし、次いで、予め各血球成分数(リンパ球、顆粒球、赤血球および血小板)をカウントしたCPD加新鮮全血(末梢血)10mLを3mL/minの流速でろ過し、フィルターに単球を捕捉させた。そして、30mLの0.5%アルブミン加生理食塩水を流してフィルターを洗浄した。このような操作の終了後に、ろ液中の各血球成分の数をカウントし、捕捉率を算出した。この結果を表1に示す。なお、ろ過前後の各血球成分数は、自動血球計算機(Sysmex SE−9000)で測定した。 First, priming was performed by flowing 0.5% albumin-added physiological saline from the inflow port into a flat membrane fixing container, and then adding CPD in which the number of each blood cell component (lymphocytes, granulocytes, red blood cells and platelets) was counted in advance. 10 mL of fresh whole blood (peripheral blood) was filtered at a flow rate of 3 mL / min, and monocytes were captured by the filter. Then, 30 mL of 0.5% albumin-added physiological saline was flowed to wash the filter. After completion of such an operation, the number of each blood cell component in the filtrate was counted, and the capture rate was calculated. The results are shown in Table 1. In addition, the number of each blood cell component before and behind filtration was measured with the automatic hemocytometer (Sysmex SE-9000).
表1に示す結果より、実施例1〜9の単球捕捉フィルターは、単球の捕捉率が高く、残りの血液成分(リンパ球、顆粒球、赤血球および血小板)の捕捉率は低く、単球が選択的に捕捉されている。特に、実施例2および実施例3の単球捕捉フィルターは、リンパ球、顆粒球、赤血球および血小板の捕捉率が低い。
これに対して、比較例1〜9のフィルターは、単球の捕捉率が高いと、残りの血液成分(リンパ球、顆粒球、赤血球および血小板)の捕捉率も高く、単球の捕捉率が低いと、残りの血液成分(リンパ球、顆粒球、赤血球および血小板)の捕捉率も低く、単球が選択的に捕捉されていない。
From the results shown in Table 1, the monocyte capture filters of Examples 1 to 9 have a high monocyte capture rate, and the remaining blood components (lymphocytes, granulocytes, erythrocytes and platelets) have a low capture rate. Is selectively captured. In particular, the monocyte capture filters of Example 2 and Example 3 have a low capture rate of lymphocytes, granulocytes, erythrocytes and platelets.
In contrast, when the filters of Comparative Examples 1 to 9 have a high monocyte capture rate, the remaining blood components (lymphocytes, granulocytes, erythrocytes and platelets) have a high capture rate, and the monocyte capture rate is high. When it is low, the remaining blood components (lymphocytes, granulocytes, erythrocytes and platelets) are not captured well, and monocytes are not selectively captured.
1 単球分離器具
11 単球捕捉フィルター
12 ハウジング
13 流入口
14 流出口
15 流入室
16 流出室
100 単球分離培養装置
110 単球分離培養装置
2 処理液バッグ
21 流入ライン
22 添加ライン
221 コネクタ
222 添加ポート
23 採液ライン
25 排出口
3 回収バッグ
31 排出ライン
32 回収ライン
33 廃液ライン
331 コネクタ
332 廃液ポート
34 廃液バッグ
345 排出口
35 排出口
DESCRIPTION OF
Claims (8)
ガス透過性がある材質からなり、流入口および流出口を有するハウジングと、該ハウジング内を流入室と流出室とに区分するように設けられた単球捕捉フィルターとからなる単球分離器具と、
該単球分離器具の流入口に連通する被処理液の流入ラインと、
該流入ラインに連通する培養液の添加ラインと、
該単球分離器具の流出口に連通する排出ラインとを備えることを特徴とする単球分離培養装置。 A monocyte separation and culture apparatus for selectively separating monocytes from a liquid to be treated containing monocytes and culturing the separated monocytes,
A monocyte separation instrument comprising a housing having an inlet and an outlet, and a monocyte capturing filter provided to divide the housing into an inflow chamber and an outflow chamber;
An inflow line of the liquid to be treated communicating with the inlet of the monocyte separation instrument;
A culture addition line communicating with the inflow line;
A monocyte separation and culture apparatus comprising a discharge line communicating with an outlet of the monocyte separation instrument.
単球を含有する被処理液から単球を選択的に分離するとともに、分離された単球から得られる樹状細胞を回収する樹状細胞回収方法であって、
前記単球を含有する被処理液を前記単球分離器具の流入口から導入して、前記単球捕捉フィルターにより単球を捕捉し、その他の被処理液を前記単球分離器具の流出口から排出する工程と、
培養液を前記単球分離器具の流入口から導入して、前記分離された単球から樹状細胞を分化誘導する工程と、
抗原溶液を前記単球分離器具の流入口から導入して、前記樹状細胞に抗原を提示する工程と、
前記単球分離器具の流入口から前記抗原を提示された樹状細胞を回収する工程とを含むことを特徴とする樹状細胞回収方法。 Using a monocyte separation instrument comprising a housing made of a gas permeable material and having an inlet and an outlet, and a monocyte trapping filter provided to divide the housing into an inflow chamber and an outflow chamber And
A dendritic cell recovery method for selectively separating monocytes from a treatment liquid containing monocytes and recovering dendritic cells obtained from the separated monocytes,
The treatment liquid containing the monocytes is introduced from the inlet of the monocyte separation instrument, the monocytes are captured by the monocyte capture filter, and the other treatment liquid is discharged from the outlet of the monocyte separation instrument. Discharging process;
Introducing a culture solution from the inlet of the monocyte separation instrument and inducing differentiation of dendritic cells from the separated monocytes;
Introducing an antigen solution from the inlet of the monocyte separation instrument and presenting the antigen to the dendritic cells;
Recovering the dendritic cells presented with the antigen from the inlet of the monocyte separation instrument.
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