JP2008054658A - Site-specific binding of extraneous molecule to protein, and utilization of the binding - Google Patents

Site-specific binding of extraneous molecule to protein, and utilization of the binding Download PDF

Info

Publication number
JP2008054658A
JP2008054658A JP2006299023A JP2006299023A JP2008054658A JP 2008054658 A JP2008054658 A JP 2008054658A JP 2006299023 A JP2006299023 A JP 2006299023A JP 2006299023 A JP2006299023 A JP 2006299023A JP 2008054658 A JP2008054658 A JP 2008054658A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
peptide
protein
tgase
complex
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2006299023A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP4604201B2 (en
Inventor
Tenho Kamiya
典穂 神谷
Yuzuru Tominaga
譲 富永
Tatsuo Maruyama
達生 丸山
Masahiro Goto
雅宏 後藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyushu University NUC
Original Assignee
Kyushu University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyushu University NUC filed Critical Kyushu University NUC
Priority to JP2006299023A priority Critical patent/JP4604201B2/en
Publication of JP2008054658A publication Critical patent/JP2008054658A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP4604201B2 publication Critical patent/JP4604201B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for site-specifically binding an extraneous molecule to a peptide or protein using transglutaminase (TGase). <P>SOLUTION: In the method, the peptide or protein has a lysine (Lys) residue recognizable by TGase or a primary amine, and the extraneous molecule is anionic (e.g. a nucleic acid) and has glutamine (Gln) residues recognizale by TGase. In a preferable embodiment, the TGase is a microorganismal origin, and the Gln residue (Q) recognizable by TGase exists as carbobenzoyl-L-glutamylglycine (Z-QG) and the glutamine (Gln) residue (K) recognizabele by TGase exists as MKHKGS. This method is applicable to in situ hybridization, DNA/protein chips and biosensors. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、タンパク質の部位特異的な修飾方法に関する。より詳細には、トランスグルタミナーゼを用いて、タンパク質に部位特異的に核酸を連結する方法に関する。本発明は、in situ ハイブリダイゼーション、DNA／プロテインチップ、バイオセンサーに応用可能である。   The present invention relates to a method for site-specific modification of a protein. More specifically, the present invention relates to a method for site-specifically linking a nucleic acid to a protein using transglutaminase. The present invention can be applied to in situ hybridization, DNA / protein chip, and biosensor.

タンパク質に何らかの修飾を施すことにより、タンパク質機能の向上や、天然にはない機能を付与することが可能になる。有機分子により修飾を施されたタンパク質は、タンパク質ハイブリッドと呼ばれる。特に、高分子−タンパク質ハイブリッドの利用価値は高く、工・医・薬学の幅広い分野で利用されている。これまでに、酵素やタンパク質の安定化を目的としてポリエチレングリコール(PEG)による修飾が盛んに検討されてきた。   By applying some modification to the protein, it is possible to improve the protein function or to provide a function that does not exist in nature. Proteins modified with organic molecules are called protein hybrids. In particular, the polymer-protein hybrid has a high utility value and is used in a wide range of fields such as engineering, medicine, and pharmacy. So far, modification with polyethylene glycol (PEG) has been extensively studied for the purpose of stabilizing enzymes and proteins.

最近、核酸(DNA or PNA or RNA)-タンパク質ハイブリッドに注目が集まっている。なぜなら、核酸の配列依存的な相補性により、タンパク質に無限の組み合わせの分子認識能を付与することが可能なためである。実際、DNAチップをベースとしたproteinチップ（非特許文献1）や、DNA-タンパク質ハイブリッドとPCR法と組み合わせた高感度検出系（非特許文献2）の構築等が報告されている。しかしながら、DNA-タンパク質ハイブリッドの調製はそれほど容易ではない。タンパク質にCys残基が存在する場合は、チオール基間のジスルフィド結合や、チオール−マレイミド間の選択的な化学修飾反応が検討されてきたが、前者では結合の安定性、後者では対象タンパク質に唯一のCys残基がタンパク質表面に露出して存在しない限り反応特異性の面で不十分である。したがって、タンパク質にDNAを安定かつ部位特異的に導入するための修飾法の確立が望まれている。   Recently, attention has been focused on nucleic acid (DNA or PNA or RNA) -protein hybrids. This is because the nucleic acid sequence-dependent complementarity can impart an unlimited number of molecular recognition capabilities to proteins. In fact, construction of a protein chip based on a DNA chip (Non-patent Document 1) and a high-sensitivity detection system (Non-patent Document 2) combining a DNA-protein hybrid and a PCR method have been reported. However, the preparation of DNA-protein hybrids is not so easy. When proteins have Cys residues, disulfide bonds between thiol groups and selective chemical modification reactions between thiol and maleimide have been studied, but the former is the only stable protein, and the latter is the only target protein. Unless Cys residues are exposed on the protein surface, the reaction specificity is insufficient. Therefore, establishment of a modification method for stably and site-specifically introducing DNA into a protein is desired.

これを達成する最も有力な手段として、これまでにexpressed protein ligation（EPL）技術を利用する手法が提案されている（PNA-protein conjugateについて非特許文献3及びDNA-protein conjugateについて、非特許文献4）。EPL技術を利用すれば、タンパク質の特定部位に、共有結合的にDNAを導入することが可能である。しかしながら、この方法は、目的タンパク質をインテインとの融合タンパク質として調製しなければならないこと、修飾部位がC末端に限定されること、導入するDNAにCys残基を導入する必要があること、といった制限がある。   As the most promising means for achieving this, methods using expressed protein ligation (EPL) technology have been proposed so far (Non-Patent Document 3 for PNA-protein conjugate and Non-Patent Document 4 for DNA-protein conjugate). ). By using EPL technology, DNA can be covalently introduced into a specific site of a protein. However, this method is limited in that the target protein must be prepared as a fusion protein with intein, the modification site is limited to the C-terminus, and a Cys residue must be introduced into the DNA to be introduced. There is.

また、タンパク質とDNAのハイブリッド化に酵素トランスグルタミナーゼ（TGase）を利用する試みもある。TGaseは、ペプチドやタンパク質中のGln残基側鎖とLys残基側鎖のε-アミノ基又は第１級アミンとの間を共有結合で架橋する反応を触媒する。TGaseを使ってタンパク質DNAハイブリッドを調製する場合、タンパク質側のGln残基とLys残基とのいずれをターゲットとするかで、ハイブリッド化する有機分子のデザインが異なる。これまで、タンパク質とポリリシン、タンパク質とPEG、又はタンパク質と分岐型糖鎖とのハイブリッド化等が検討されてきた（特許文献1及び非特許文献5〜8）。これらのケースでは、ポリリシン又はアミノ化PEG若しくはアミノ化糖鎖が、タンパク質側のTGase活性なGln残基との架橋が試みられた。また、TGaseに関しては、カルボベンゾイル-L-グルタミルグリシン（Z-QG）がグルタミン残基を供与する良基質として知られている（先行技術文献9〜11）ほか、TGaseに対してグルタミン供与体となりうる基質のアミノ酸配列に関連した報告がある（前掲先行技術文献6、並びに先行技術文献12〜14）。   There is also an attempt to use the enzyme transglutaminase (TGase) to hybridize protein and DNA. TGase catalyzes a reaction that covalently crosslinks between the Gln residue side chain and the lysine side chain ε-amino group or primary amine in peptides and proteins. When preparing a protein DNA hybrid using TGase, the design of the organic molecule to be hybridized differs depending on whether the Gln residue or Lys residue on the protein side is targeted. So far, hybridization of a protein and polylysine, a protein and PEG, or a protein and a branched sugar chain has been studied (Patent Document 1 and Non-Patent Documents 5 to 8). In these cases, polylysine or aminated PEG or aminated sugar chain was attempted to crosslink with a TGase-active Gln residue on the protein side. As for TGase, carbobenzoyl-L-glutamylglycine (Z-QG) is known as a good substrate for donating glutamine residues (prior art documents 9 to 11), and is a glutamine donor for TGase. There are reports related to the amino acid sequences of the possible substrates (the above-mentioned prior art document 6 and the prior art documents 12 to 14).

一方、本発明者らはTGaseの工学的応用について研究してきたが、TGaseに対しLys残基を供与し、良基質として働くMKHKGS（非特許文献15及び16）、GSGMKETAAARFERAHMDSGS（改変型S-peptide：非特許文献17）、MGGSTKHKIPGGS（非特許文献18）、N末端トリ又はペンタグリシン（N-terminal GGG or N-terminal GGGGG：非特許文献19）といったタグを見いだしている。   On the other hand, the inventors of the present invention have studied the engineering application of TGase. However, MKHKGS (Non-patent Documents 15 and 16), GSGMKETAAARFERAHMDSGS (modified S-peptide: Non-patent literature 17), MGGSTKHKIPGGS (non-patent literature 18), N-terminal tri- or pentaglycine (N-terminal GGG or N-terminal GGGGG: non-patent literature 19) and other tags have been found.

先行技術文献Prior art documents

特開平8-89278号公報JP-A-8-89278 Angew. Chem. Int. Ed., 44, 7635, 2005Angew. Chem. Int. Ed., 44, 7635, 2005 Nature Methods, 2, 31, 2005Nature Methods, 2, 31, 2005 Chem. Commun., 822, 2003Chem. Commun., 822, 2003 Bioorg. Med, Chem, Lett., 14, 2407, 2004Bioorg. Med, Chem, Lett., 14, 2407, 2004 Biochemistry, 35, 13072, 1996Biochemistry, 35, 13072, 1996 Bioconjugate Chem., 11, 502, 2000Bioconjugate Chem., 11, 502, 2000 Bioconjugate Chem., 12, 701, 2001Bioconjugate Chem., 12, 701, 2001 J. Am. Chem. Soc., 126, 14013, 2004J. Am. Chem. Soc., 126, 14013, 2004 J. Biol. Chem., 240, 2951-2960, 1965J. Biol. Chem., 240, 2951-2960, 1965 Agric. Biol. Chem., 53, 2613-2617, 1989Agric. Biol. Chem., 53, 2613-2617, 1989 Analytical Biochemistry, 249, 54-60, 1997Analytical Biochemistry, 249, 54-60, 1997 Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2608-2613, 2000Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2608-2613, 2000 J. Am. Chem. Soc., 128, 4542-4543, 2006J. Am. Chem. Soc., 128, 4542-4543, 2006 Analytical Biochemistry, 281, 68-76, 2000Analytical Biochemistry, 281, 68-76, 2000 Biomacromolecules, 6, 35, 2005Biomacromolecules, 6, 35, 2005 Biomacromolecules, 6, 2299, 2005Biomacromolecules, 6, 2299, 2005 Bioconjugate Chem., 15, 491-497, 2004Bioconjugate Chem., 15, 491-497, 2004 Biotechnol. Bioeng., 86, 399-404Biotechnol. Bioeng., 86, 399-404 FEBS Lett., 579, 2092-2096, 2005FEBS Lett., 579, 2092-2096, 2005

本発明者らは、TGaseを使ってタンパク質DNAハイブリッドを調製するに際し、まずアミノ化DNAを用いることとした。そして、TGase活性なGln残基を有するタンパク質として、TGaseの良基質であるジメチルカゼインを選択し、アミノ化DNAとのハイブリッド化を試みたが、架橋化反応は進行しなかった。詳細な理由は不明であるが、ポリアニオンであるDNAがTGase反応におけるカチオン性アミノ基の反応性を低下させている可能性がある。   The present inventors first decided to use aminated DNA when preparing a protein DNA hybrid using TGase. Then, dimethylcasein, which is a good substrate for TGase, was selected as a protein having a TGase-active Gln residue, and hybridization with aminated DNA was attempted. However, the crosslinking reaction did not proceed. Although the detailed reason is unknown, there is a possibility that DNA which is a polyanion has reduced the reactivity of the cationic amino group in the TGase reaction.

そこで発想を転換し、MTGの良基質として知られるジペプチドZ-Gln-Gly（Z-QG）のカルボキシル基を活性エステル（NHS）化し、これをアミノ化DNAと縮合することで、TGase活性なGln残基を有するDNA（Z-QG-DNA）を合成した（図1）。   Therefore, the idea was changed, and the carboxyl group of the dipeptide Z-Gln-Gly (Z-QG), which is known as a good substrate for MTG, was converted to an active ester (NHS) and condensed with aminated DNA. Residue-containing DNA (Z-QG-DNA) was synthesized (FIG. 1).

次に、TGase活性なLys残基を有するNK6-AP（MKHKGS配列をN末端に有するアルカリホスファターゼ）とZ-QG-DNAとを混合し、TGase反応に供したところ、NK6-APとZ-QG-DNAのハイブリッド化が可能なことが明らかとなった（図2）。また、ハイブリッド化前後でAPの酵素活性は充分に保持されており、DNAが目的タンパク質（NK6-AP）のペプチドタグ選択的に導入されていることが明らかとなった。さらに、MKHKGS配列をC末端に有するアルカリホスファターゼ、MKHKGS配列をN末端に有する緑色蛍光タンパク質（EGFP）及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）についても、同様の操作によりDNAとのハイブリッド化が可能なことを確認し、本発明を完成した。   Next, NK6-AP having an TGase-active Lys residue (alkaline phosphatase having an MKHKGS sequence at the N-terminus) and Z-QG-DNA were mixed and subjected to TGase reaction. As a result, NK6-AP and Z-QG -It became clear that DNA can be hybridized (Fig. 2). Moreover, the enzyme activity of AP was sufficiently retained before and after hybridization, and it was revealed that DNA was introduced selectively for the peptide tag of the target protein (NK6-AP). In addition, alkaline phosphatase with MKHKGS sequence at the C-terminus, green fluorescent protein (EGFP) and glutathione-S-transferase (GST) with MKHKGS sequence at the N-terminus can be hybridized with DNA by the same procedure. The present invention was completed.

I. 複合体、複合体の形成方法、複合体の製造方法：
本発明は、トランスグルタミナーゼ（TGase）を用いて、ペプチド又はタンパク質へ部位特異的に外来分子を連結する方法であって：分子が、アニオン性であり、かつTGaseが認識可能なグルタミン（Gln）残基を有し；そして、ペプチド又はタンパク質が、TGaseが認識可能なリシン（Lys）残基又は第１級アミンを有するものである、前記方法を提供する。また、本発明は、トランスグルタミナーゼ（TGase）を用いて、ペプチド又はタンパク質へ部位特異的に外来分子を連結する方法であって：
ペプチド又はタンパク質が、TGaseが認識可能なリシン（Lys）残基又は第１級アミンを有するものであり、そして
分子が、アニオン性であり、かつTGaseが認識可能なグルタミン（Gln）残基を有するものである、前記方法を提供する。 I. Complexes, complex formation methods, and complex production methods:
The present invention relates to a method for site-specifically linking a foreign molecule to a peptide or protein using transglutaminase (TGase): the molecule is anionic and has a glutamine (Gln) residue that can be recognized by TGase And a peptide or protein having a lysine (Lys) residue or primary amine recognizable by TGase. The present invention also relates to a method for site-specifically linking a foreign molecule to a peptide or protein using transglutaminase (TGase):
The peptide or protein has a lysine (Lys) residue or primary amine that can be recognized by TGase, and the molecule has an anionic and glutamine (Gln) residue that can be recognized by TGase The method is provided.

本発明において用いることのできる、タンパク質又はペプチドに組み込まれる外来分子は、アニオン性の分子である。本明細書で「アニオン性分子」というときは、溶液中でアニオンとしての性質を有するものであり、これには、核酸が含まれる。核酸には、DNA、PNA又はRNAが含まれる。アニオン性分子の好ましい例は核酸である。核酸の配列及び長さには特に制限はない。長さに関しては、40mer程度であれば、本発明に充分に用いることができることが確認されている（実施例参照）。   The foreign molecule incorporated into the protein or peptide that can be used in the present invention is an anionic molecule. In the present specification, the term “anionic molecule” refers to a substance having an anionic property in a solution, and includes a nucleic acid. Nucleic acids include DNA, PNA or RNA. A preferred example of an anionic molecule is a nucleic acid. There is no particular limitation on the sequence and length of the nucleic acid. Regarding the length, it has been confirmed that if it is about 40 mer, it can be sufficiently used in the present invention (see Examples).

本発明においては、アニオン性分子は、用いるTGaseが認識可能なGln残基を有する。アニオン性分子が核酸である場合、該核酸は、5’末端、又は3’末端またはそれ以外の所望の部分に、必要に応じスペーサーを介して、TGaseが認識可能なGln残基が結合したものである。   In the present invention, the anionic molecule has a Gln residue that can be recognized by the TGase used. When the anionic molecule is a nucleic acid, the nucleic acid has a Gln residue that can be recognized by TGase bound to the 5 ′ end, 3 ′ end or other desired portion via a spacer as necessary. It is.

TGaseが認識可能なGln残基は、カルボベンゾイル-L-グルタミルグリシン（Z-QG）として存在することが好ましい。また、微生物由来TGaseの良基質として、LLQG（配列番号：1）、LAQG（配列番号：2）、LGQG（配列番号：3）、PLAQSH（配列番号：4）、FERQHMDS（配列番号：5）、若しくはTEQKLISEEDL（配列番号：6）のアミノ酸配列からなるペプチド、又はGLGQGGG（配列番号：7）、GFGQGGG（配列番号：8）、GVGQGGG（配列番号：9）、若しくはGGLQGGG（配列番号：10）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。また、guinea pig liver由来のTGaseの良基質として、カルボベンゾイル-L-グルタミルフェニルアラニン（Z-QF）、又はEAQQIVM（配列番号：11）のアミノ酸配列からなるペプチド、又はGGGQLGG（配列番号：12）、GGGQVGG（配列番号：13）、GGGQRGG（配列番号：14）、GQQQLG（配列番号：15）、PNPQLPF（配列番号：16）若しくはPKPQQFM（配列番号：17）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。TGaseが認識可能なGln残基は、用いるTGaseの種類に応じ、このようなペプチドとして存在してもよい。   The Gln residue that can be recognized by TGase is preferably present as carbobenzoyl-L-glutamylglycine (Z-QG). Moreover, as a good substrate of microorganism-derived TGase, LLQG (SEQ ID NO: 1), LAQG (SEQ ID NO: 2), LGQG (SEQ ID NO: 3), PLAQSH (SEQ ID NO: 4), FERQHMDS (SEQ ID NO: 5), Or a peptide consisting of the amino acid sequence of TEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 6), or the amino acid of GLGQGGG (SEQ ID NO: 7), GFGQGGG (SEQ ID NO: 8), GVGQGGG (SEQ ID NO: 9), or GGLQGGG (SEQ ID NO: 10) Peptides consisting of sequences are known. Further, as a good substrate for TGase derived from guinea pig liver, carbobenzoyl-L-glutamylphenylalanine (Z-QF), a peptide consisting of the amino acid sequence of EAQQIVM (SEQ ID NO: 11), or GGGQLGG (SEQ ID NO: 12), A peptide comprising the amino acid sequence of GGGQVGG (SEQ ID NO: 13), GGGQRGG (SEQ ID NO: 14), GQQQLG (SEQ ID NO: 15), PNPQLPF (SEQ ID NO: 16) or PKPQQFM (SEQ ID NO: 17) is known. . Gln residues that can be recognized by TGase may exist as such peptides depending on the type of TGase used.

なお、N末端がグリシン（G）である基質ペプチドは、N末端アミノ基がTGaseの基質になりうるため、自己架橋による副産物が生じうる。したがって、N末端がグリシン（G）である基質ペプチドについては、N末端アミノ基の水素を適切な基で置換することによりTGaseの基質とはならないように保護して、所望の連結を行うことができるようにするとよい。なお、本明細書において「N末端保護」というときは、特別な場合を除き、このような意味で用いている。そして、N末端保護の手段により、反応性が異なることが知られている。詳細には、ほ乳類由来TGaseに関して、GQQQLGのN末アセチル化による保護（即ち、Ac-GQQQLG）、またN末端アミノ酸をDOPA（L-3,4-dihydroxyphenylalanine）にする（即ち、DOPA-GQQQLG）と反応性が向上することが知られている。このような保護の例を、本発明においても利用することができる。   In addition, since the N-terminal amino group can be a substrate for TGase in the substrate peptide whose N-terminus is glycine (G), a by-product due to self-crosslinking can occur. Therefore, for substrate peptides whose N-terminus is glycine (G), the N-terminal amino group can be protected from becoming a substrate for TGase by replacing the hydrogen of the amino group with an appropriate group, and desired ligation can be performed. You should be able to do it. In the present specification, “N-terminal protection” is used in this sense except in special cases. It is known that the reactivity varies depending on the means of N-terminal protection. Specifically, regarding mammalian-derived TGase, protection by N-terminal acetylation of GQQQLG (ie, Ac-GQQQLG), and N-terminal amino acid as DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) (ie, DOPA-GQQQLG) It is known that the reactivity is improved. Examples of such protection can also be used in the present invention.

TGaseが認識可能なGln残基を有するアニオン性分子は、TGaseが認識可能なGln残基を有する上述のようなペプチドを所望の分子（例えば、核酸）に結合することにより調製することができる。ペプチドは、用いるTGaseによって、良く認識されるものを選択することが好ましく、また、できるだけ短いものを選択することが好ましい場合がある。また、上述以外に、種々ペプチドを選択しうるが、そのアミノ配列中にTGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンが共存しないようなものを選択することが好ましい。共存する場合には、TGaseにより、自己架橋する可能性があり、目的のタンパク質（又はペプチド）−核酸複合体の収率に好ましくない影響を与える場合があるからである。   An anionic molecule having a Gln residue recognizable by TGase can be prepared by binding a peptide as described above having a Gln residue recognizable by TGase to a desired molecule (for example, a nucleic acid). It is preferable to select a peptide that is well recognized depending on the TGase used, and it may be preferable to select a peptide that is as short as possible. In addition to the above, various peptides can be selected, but it is preferable to select a peptide that does not coexist with a Lys residue or primary amine that can be recognized by TGase in the amino sequence. In the case of coexistence, TGase may cause self-crosslinking, which may adversely affect the yield of the target protein (or peptide) -nucleic acid complex.

微生物由来のTGase（「MTGase」又は「MTG」のように記載される場合がある。）を用いる場合、TGaseが認識可能なGln残基は、Z-QGとして存在することが好ましい。TGaseが認識可能なGln残基を有するDNAであって、該Gln残基がZ-QGをとして存在するもの、すなわちZ-QG−DNAの調製方法の例としては、次のようなものがある：NH2-(CH2)6-等を末端に付加することによりアミノ化した所望の塩基配列を有するDNAを準備し、一方、Z-QGは、下記のようにNHSで活性化しておく。   When a TGase derived from a microorganism (may be described as “MTGase” or “MTG”) is used, the Gln residue that can be recognized by TGase is preferably present as Z-QG. DNA having a Gln residue that can be recognized by TGase, in which the Gln residue exists as Z-QG, that is, examples of methods for preparing Z-QG-DNA include the following: : Prepare a DNA having the desired base sequence aminated by adding NH2- (CH2) 6- etc. to the end, while Z-QG is activated with NHS as described below.

そして、アミノ化DNAと活性エステル化Z-QGとを縮合することで、Z-QG−DNAを得ることができる。精製は、ゲル濾過カラムで行うことができ、同定は、TOF-MSで行うことができる。また、HPLCで、生成物の確認及び収率を求めることができる。   Then, Z-QG-DNA can be obtained by condensing aminated DNA with active esterified Z-QG. Purification can be performed with a gel filtration column and identification can be performed with TOF-MS. Moreover, the confirmation and yield of the product can be obtained by HPLC.

また、C末端のカルボキシル基を活性エステル化する上述の方法に加えて、TGaseが認識可能なGln残基を有するペプチドをDNAに導入する方法として、アミノ基と反応性の高い官能基をペプチドに導入する方法がある。例えば、アルデヒド化、アシルアジド化、スルフォニルクロライド化、エポキシ化、イソシアネート化、又はイソチオシアネート化した基質ペプチドを調製できれば、これをアミノ化DNAと反応させることにより、TGaseが認識可能なGln残基を有するDNAを調製することができる。但し、これらの反応性官能基は、基質ペプチドにおいてTGase認識に影響がない部分に導入する必要がある。したがって、上述のように、Gln残基とは離れたC末端のカルボキシル基を活性化する方法は、この目的において最も優れたものの一つである。TGaseの反応に影響がなければ、グルタミン酸やアスパラギン酸のカルボキシル基を活性化することにより、アミノ化DNAと反応させてもよい
。 In addition to the above-mentioned method of esterifying the carboxyl group at the C-terminal, a method of introducing a peptide having a Gln residue that can be recognized by TGase into DNA has a functional group highly reactive with an amino group in the peptide. There is a way to introduce. For example, if it is possible to prepare an aldehyde, acylazidation, sulfonyl chloride, epoxidation, isocyanate, or isothiocyanate substrate peptide, it has a Gln residue that TGase can recognize by reacting it with aminated DNA DNA can be prepared. However, these reactive functional groups need to be introduced into a portion of the substrate peptide that does not affect TGase recognition. Therefore, as described above, the method of activating the C-terminal carboxyl group separated from the Gln residue is one of the most excellent for this purpose. If it does not affect the reaction of TGase, it may be reacted with aminated DNA by activating the carboxyl group of glutamic acid or aspartic acid.

本発明においては、アニオン性分子により修飾されるペプチド又はタンパク質は、用いるTGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有する。なお、本明細書では、タンパク質を例に説明することがあるが、その説明は、特別な場合を除き、ペプチドにも当てはまる。本明細書では、Lys残基を例に説明することがあるが、その説明は、特別な場合を除き、第１級アミンにも当てはまる。   In the present invention, a peptide or protein modified with an anionic molecule has a Lys residue or a primary amine that can be recognized by the TGase used. In the present specification, protein may be described as an example, but the description also applies to peptides except in special cases. In the present specification, Lys residue may be described as an example, but the description also applies to primary amines except in special cases.

TGaseに対し、Lys残基（又は第１級アミン）供与体となる基質は、Gln残基供与体となる基質に比較して構造的な制約が少ないと考えられる。したがって、修飾しようとするタンパク質（又はペプチド）が、TGaseが認識可能なLys残基を元来有している場合もあり、そのような場合は、新たにTGaseが認識可能なLys残基を含むタグをタンパク質に付加しなくてもよい場合がある。   A substrate that serves as a Lys residue (or primary amine) donor for TGase is considered to have fewer structural restrictions than a substrate that serves as a Gln residue donor. Therefore, there are cases where the protein (or peptide) to be modified originally has a Lys residue that can be recognized by TGase. In such a case, a new Lys residue that can be recognized by TGase is included. In some cases, a tag may not be added to a protein.

一方、TGaseが認識可能なLys残基（K）は、MKHKGS（配列番号：18）のアミノ酸配列を有するペプチドとして存在してもよい。このようなTGaseが認識可能なLys残基を含むペプチドによるタグ化は、アニオン性分子を、タンパク質の所望の部位、例えばC末端又はN末端に連結する目的で用いてもよい。TGaseが認識可能なLys残基を含む他のペプチド又はそのアミノ酸配列の例としては、改変型S-peptide（GSGMKETAAARFERAHMDSGS（配列番号：19））、MGGSTKHKIPGGS（配列番号：20）、N末端グリシン（N-terminal GGG、N-terminal GGGGG（配列番号：21））、N末端MKHKGSと対象タンパク質間のリンカー部位を伸ばしたMKHKGSGGGSGGGS（配列番号：22）がある。   On the other hand, the Lys residue (K) that can be recognized by TGase may exist as a peptide having the amino acid sequence of MKHKGS (SEQ ID NO: 18). Such tagging with a peptide containing a Lys residue that can be recognized by TGase may be used for the purpose of linking an anionic molecule to a desired site of the protein, for example, the C-terminus or the N-terminus. Examples of other peptides containing Lys residues that can be recognized by TGase or amino acid sequences thereof include modified S-peptide (GSGMKETAAARFERAHMDSGS (SEQ ID NO: 19)), MGGSTKHKIPGGS (SEQ ID NO: 20), N-terminal glycine (N -terminal GGG, N-terminal GGGGG (SEQ ID NO: 21)), and MKHKGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 22) with an extended linker site between the N-terminal MKHKGS and the target protein.

C末端又はN末端にTGaseが認識可能なLys残基を含むペプチドを付加したタンパク質は、遺伝子工学的な手法を用いて、組換えタンパク質として調製することができる。C末端又はN末端にTGaseの基質ペプチドタグが導入された当該組換えタンパク質の精製は、それぞれN末端又はC末端に付加した(His)6-tagを利用し（TGaseの反応性の低下を回避するために、基質ペプチドタグを入れた末端とは異なる末端にHis-tagを入れるようにデザインするとよい。）、ゲル濾過カラムにより行うことができ、またアミノ酸配列の確認は当該タンパク質をコードするプラスミドベクターの遺伝子配列をDNAシーケンサーにて確認するか、N末端に導入された基質ペプチドについてはN末端分析により直接同定することができる。タンパク質の精製の確認は SDS-PAGE で行うことができる。   A protein to which a peptide containing a Lys residue that can be recognized by TGase is added at the C-terminus or N-terminus can be prepared as a recombinant protein using genetic engineering techniques. Purification of the recombinant protein with a TGase substrate peptide tag introduced at the C-terminus or N-terminus uses (His) 6-tag added to the N-terminus or C-terminus, respectively (avoids a decrease in TGase reactivity) In order to achieve this, it is recommended that the His-tag be inserted at a different end from the end where the substrate peptide tag is inserted.) The gel filtration column can be used, and the amino acid sequence can be confirmed by a plasmid encoding the protein. The vector gene sequence can be confirmed with a DNA sequencer, or the substrate peptide introduced at the N-terminus can be directly identified by N-terminus analysis. Confirmation of protein purification can be performed by SDS-PAGE.

ペプチド又はタンパク質の好ましい例は、容易に検出可能な性質を有するものであり、例えばアルカリホスファターゼ（AP）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、抗体エピトープ配列を含むペプチド及びビオチン等である。ペプチドタグが容易に導入可能との観点からは、遺伝子工学的に製造可能なタンパク質が好ましい。   Preferred examples of peptides or proteins are those that have easily detectable properties, such as alkaline phosphatase (AP), green fluorescent protein (GFP), glutathione-S-transferase (GST), luciferase, peroxidase, antibody epitope sequences Including peptides and biotin. From the viewpoint that a peptide tag can be easily introduced, a protein that can be produced by genetic engineering is preferred.

本発明においては、トランスグルタミナーゼ（TGase）として、種々のものを用いうる。現在、TGaseとして、哺乳類（guinea pig、ヒト）、無脊椎動物（昆虫、カブトガニ、ウニ）、植物、菌類、原生生物（粘菌）由来のものが知られており、またヒトの場合については、８種類のアイソザイムが見つかっている。本発明において用いることのできるTGaseの好ましい例は、微生物由来のものである。   In the present invention, various types of transglutaminase (TGase) can be used. Currently, TGase is known to be derived from mammals (guinea pigs, humans), invertebrates (insects, horseshoe crabs, sea urchins), plants, fungi, and protozoa (slime molds). Eight types of isozymes have been found. Preferred examples of TGase that can be used in the present invention are those derived from microorganisms.

本発明のTGaseを用いたタンパク質への部位特異的な外来分子の連結方法の、最も好ましい態様の一つは、微生物由来のTGase、Z-QG及びMKHKGSを組み合わせて用いるものである。   One of the most preferred embodiments of the method for linking site-specific foreign molecules to proteins using the TGase of the present invention is to use a combination of microorganism-derived TGase, Z-QG and MKHKGS.

本発明においてMTGを用いた場合、予想されているMTGの触媒反応から、Lys残基を有するタンパク質又はペプチドとZ-QG-DNAとの連結反応は、MTG活性中心であるシステイン（Cys）残基の、Z-QG-DNAのGlnへの求核置換反応によるアシル−酵素複合体の形成と、続いて起こるタンパク質のLysによるアシル−酵素複合体への求核置換反応によるMTGの脱離、の2段階で進行すると予想される。
本発明者らの検討によると、タンパク質濃度に対し15倍以上のZ-QG-DNA濃度とした場合においても、反応率（ペプチド又はタンパク質−核酸複合体に転化した、TGaseが認識可能なLys残基又は1級アミンを有するペプチド又はタンパク質の割合。例えば、AP-DNA複合体に転化したNK6-APの割合。）は50〜60%にまでしか到達しないことから、この反応の律速段階は2段階目であると予想された。そこでタンパク質としてNK6-APを用い、NK6-AP過剰の条件下での連結反応による反応効率の向上を試みたところ、充分に高い（例えば80％以上、好ましくは95％以上の）反応率を得るには、Z-QG-DNAに対するNK6-APの濃度比が2以上であることが好ましいことが分かった（実施例7参照）。また、Z-QG-DNAの濃度は、おそらく1μM以上であることが好ましいと思われた。 When MTG is used in the present invention, the ligation reaction between a protein or peptide having a Lys residue and Z-QG-DNA from the expected catalytic reaction of MTG is a cysteine (Cys) residue that is the active center of MTG. Formation of an acyl-enzyme complex by nucleophilic substitution reaction of Z-QG-DNA to Gln, and subsequent elimination of MTG by nucleophilic substitution reaction to acyl-enzyme complex by Lys of protein. Expected to progress in two stages.
According to the study by the present inventors, even when the Z-QG-DNA concentration is 15 times or more than the protein concentration, the reaction rate (Lys residue converted to peptide or protein-nucleic acid complex and recognizable by TGase can be obtained. Since the ratio of peptides or proteins with groups or primary amines (for example, the ratio of NK6-AP converted to AP-DNA complexes) reaches only 50-60%, the rate limiting step of this reaction is 2 Expected to be a stage. Therefore, when NK6-AP was used as a protein and an attempt was made to improve the reaction efficiency by a ligation reaction under an excess of NK6-AP, a sufficiently high reaction rate (for example, 80% or more, preferably 95% or more) was obtained. It was found that the concentration ratio of NK6-AP to Z-QG-DNA is preferably 2 or more (see Example 7). Also, it seems that the concentration of Z-QG-DNA is preferably 1 μM or more.

したがって、本発明の好ましい態様においては、TGaseが認識可能なGln残基を有するアニオン性分子に対する、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するペプチド又はタンパク質のモル濃度比は、好ましくは2以上であり、より好ましくは5以上である。なお、本明細書で単に「濃度比」というときは、特別な場合を除き、モル濃度による比を指す。Z-QG-DNAに対するNK6-APのモル濃度比は、[NK6-AP]／[Z-QG-DNA]と表すこともできる。   Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, the molar concentration ratio of the peptide or protein having a Lys residue or primary amine recognizable by TGase to the anionic molecule having a Gln residue recognizable by TGase is preferably Is 2 or more, more preferably 5 or more. In the present specification, the term “concentration ratio” refers to a ratio based on molar concentration unless otherwise specified. The molar concentration ratio of NK6-AP to Z-QG-DNA can also be expressed as [NK6-AP] / [Z-QG-DNA].

また、本明細書の実施例のように、TGaseとしてMTGを用いて連結反応を行う場合には、上述のようにモル濃度比が適切な範囲となるようにすることに加えて、pH5.5〜8.0、温度4〜50℃（例えば、室温）で行うことが好ましい。このようにすれは、12時間以内、好ましくは6時間以内、より好ましくは3時間以内に、充分に高い反応率が達成可能である（実施例7参照）。   In addition, as in the examples of the present specification, when the ligation reaction is performed using MTG as TGase, in addition to adjusting the molar concentration ratio to an appropriate range as described above, pH 5.5 It is preferable to carry out at -8.0 and the temperature of 4-50 degreeC (for example, room temperature). Thus, a sufficiently high reaction rate can be achieved within 12 hours, preferably within 6 hours, more preferably within 3 hours (see Example 7).

このような高い反応率が達成できる方法により得られたペプチド又はタンパク質−核酸複合体溶液には、未反応のアニオン性分子（例えば、遊離のZ-QG-DNA）がほとんど存在せず、以下で詳述する、ペプチド又はタンパク質の固定化、又は標的分子の検出にそのまま用いたとしても、複合体と未反応分子との競合が実質的に生じないか、生じたとしても目的とする固定化又は検出の結果には実質的な影響を与えないほど少ないと考えられる。したがって、複合体溶液を精製することなく、直接固定化又は検出へと利用できるメリットがある（実施例8参照）。   In the peptide or protein-nucleic acid complex solution obtained by such a method that can achieve a high reaction rate, there is almost no unreacted anionic molecule (for example, free Z-QG-DNA). Even if it is directly used for peptide or protein immobilization or detection of a target molecule to be described in detail, the competition between the complex and the unreacted molecule does not substantially occur, or even if it occurs, the desired immobilization or The detection result is considered to be so small that it does not substantially affect the detection result. Therefore, there is an advantage that it can be directly used for immobilization or detection without purifying the complex solution (see Example 8).

本発明以前に、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するペプチド又はタンパク質とTGaseが認識可能なGln残基を有する外来分子とをTGaseを用いて連結することにより、タンパク質複合体を得る手段は存在しなかった。したがって、本発明の方法により連結された複合体は、物質として新規なものということができる。   Prior to the present invention, a protein complex was obtained by linking a peptide or protein having a Lys residue or primary amine recognizable by TGase and a foreign molecule having a Gln residue recognizable by TGase using TGase. There was no means to get it. Therefore, it can be said that the complex connected by the method of the present invention is a novel substance.

よって本発明はまた、以下のものも提供する：
（３）TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するペプチド又はタンパク質と、TGaseが認識可能なGln残基を有する核酸とを、TGaseにより連結することにより得られる、ペプチド又はタンパク質−核酸複合体。 Thus, the present invention also provides the following:
(3) Peptide or protein obtained by ligating a peptide or protein having a Lys residue or primary amine recognizable by TGase and a nucleic acid having a Gln residue recognizable by TGase with TGase Nucleic acid complex.

本明細書において、本発明の複合体に関連して、「TGaseにより連結する」というときは、特別な場合を除き、得られる連結部は、Lys残基とGln残基とが、ε（γ-グルタミル）リシン結合を形成することにより構成されている。   In the present specification, in the context of the complex of the present invention, when “ligated by TGase”, except for special cases, the resulting lysate is composed of Lys residue and Gln residue as ε (γ -Glutamyl) is formed by forming a lysine bond.

本発明の複合体は、好ましい態様においては、TGaseが認識可能なLys残基を有するペプチド又はタンパク質と、Z-QG、又はLLQG、LAQG、LGQG、PLAQSH、FERQHMDS、若しくはTEQKLISEEDLのアミノ酸配列からなるペプチド、又はGLGQGGG、GFGQGGG、GVGQGGG、若しくはGGLQGGGのアミノ酸配列からなる、N末端保護ペプチド（好ましくは、N末端がアセチル基又はL-3,4-ジヒドロキシルフェニルアラニル基で保護されたペプチド）、又はZ-QF、又はEAQQIVMのアミノ酸配列からなるペプチド、又はGGGQLGG、GGGQVGG、GGGQRGG、GQQQLG、PNPQLPF若しくはPKPQQFMのアミノ酸配列からなる、N末端保護ペプチド（好ましくは、N末端がアセチル基又はL-3,4-ジヒドロキシルフェニルアラニル基で保護されたペプチド）を有する核酸とが、ε（γ-グルタミル）リシン結合で連結した構造からなる。   In a preferred embodiment, the complex of the present invention is a peptide or protein having a Lys residue that can be recognized by TGase and a peptide consisting of an amino acid sequence of Z-QG or LLQG, LAQG, LGQG, PLAQSH, FERQHMDS, or TEQKLISEEDL. Or an N-terminal protected peptide consisting of the amino acid sequence of GLGQGGG, GFGQGGG, GVGQGGG, or GGLQGGG (preferably a peptide in which the N-terminal is protected with an acetyl group or an L-3,4-dihydroxylphenylalanyl group), or A peptide consisting of an amino acid sequence of Z-QF or EAQQIVM, or an N-terminal protective peptide consisting of an amino acid sequence of GGGQLGG, GGGQVGG, GGGQRGG, GQQQLG, PNPQLPF or PKPQQFM (preferably the N-terminal is an acetyl group or L-3,4 A peptide having a peptide protected with a -dihydroxylphenylalanyl group) linked by an ε (γ-glutamyl) lysine bond.

なお、guinea pig liver TGase について、EAQQIVM については、Q3 >> Q4 という報告がある（Anal. Biochem., 281, 68, 2000)。但し、Factor XIIIa では、EAQQIVM においてはQ3が優先的に反応しうる。また、PKPQQFM については、Q4 >> Q5 という報告がある（Biochemistry, 35, 13072, 1996)。また、EAQQIVM については、コア配列と考えられるAQQIV部分のみを用いることも有用であろう。   Regarding guinea pig liver TGase, EAQQIVM has been reported as Q3 >> Q4 (Anal. Biochem., 281, 68, 2000). However, in Factor XIIIa, Q3 can preferentially react in EAQQIVM. As for PKPQQFM, there is a report of Q4 >> Q5 (Biochemistry, 35, 13072, 1996). For EAQQIVM, it may be useful to use only the AQQIV part that is considered to be the core sequence.

ペプチド又はタンパク質の好ましい例は、容易に検出可能な性質を有するものであり、例えばAP、GFP、GST、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、抗体エピトープ配列を含むペプチド及びビオチン等である。ペプチドタグが容易に導入可能との観点からは、遺伝子工学的に製造可能なタンパク質が好ましい。ペプチド又はタンパク質におけるTGaseが認識可能なLys残基（K）は、MKHKGSのアミノ酸配列を有するペプチドとして存在してもよい。このようなTGaseが認識可能なLys残基を含むペプチドタグは、ペプチド又はタンパク質の所望の部位、例えばC末端又はN末端に付加することができる。TGaseが認識可能なLys残基を含む他のペプチド又はそのアミノ酸配列の例としては、改変型S-peptide（GSGMKETAAARFERAHMDSGS）、MGGSTKHKIPGGS、N末端グリシン（N-terminal GGG、N-terminal GGGGG）、N末端MKHKGSと対象タンパク質間のリンカー部位を伸ばしたMKHKGSGGGSGGGSがある。   Preferred examples of peptides or proteins are those having easily detectable properties, such as AP, GFP, GST, luciferase, peroxidase, peptides containing antibody epitope sequences and biotin. From the viewpoint that a peptide tag can be easily introduced, a protein that can be produced by genetic engineering is preferred. The Lys residue (K) that can be recognized by TGase in a peptide or protein may exist as a peptide having the amino acid sequence of MKHKGS. Such a peptide tag containing a Lys residue that can be recognized by TGase can be added to a desired site of the peptide or protein, for example, the C-terminus or N-terminus. Examples of other peptides containing Lys residues that can be recognized by TGase or amino acid sequences thereof include modified S-peptide (GSGMKETAAARFERAHMDSGS), MGGSTKHKIPGGS, N-terminal glycine (N-terminal GGG, N-terminal GGGGG), N-terminal There is MKHKGSGGGSGGGS with an extended linker site between MKHKGS and the target protein.

複合体の好ましい態様の一つは、CK6-APとZ-QG-DNAとの複合体及びNK6-APとZ-QG-DNAとの複合体である。このような複合体は、安定な酵素であるAPと、安定な分子であるDNAが、アミド結合という安定な共有結合で連結されているため、複合体全体としても安定性であるというメリットがある。   One of preferable embodiments of the complex is a complex of CK6-AP and Z-QG-DNA and a complex of NK6-AP and Z-QG-DNA. Such a complex has the advantage that the complex as a whole is stable because AP, which is a stable enzyme, and DNA, which is a stable molecule, are linked by a stable covalent bond called an amide bond. .

本発明の複合体の形成方法は、対象となるペプチド又はタンパク質を、部位特異的に外来分子で修飾することにより、複合体を形成させるものであるが、従来法に比較して、以下の特徴及びメリットを有する：
・対象タンパク質は、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有する天然タンパク質、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを導入することができるあらゆるタンパク質を包含する。また、インテインのような大きなタンパク質性タグを必要としない。
・タンパク質の修飾部位は、C末端に限定されない。TGase活性なLys残基が存在するか、そのようなLys残基を有するタグを導入することができる部位であれば、修飾可能である
。C末端、N末端に加え、loop領域のようなタンパク質構造中の揺らぎの大きな部位も修飾対象となりうる。
・外来分子として核酸を選択する場合、その塩基配列及び長さには、特に制限がない。 The method for forming a complex of the present invention is to form a complex by modifying a target peptide or protein with a foreign molecule in a site-specific manner. And have the benefits:
The target protein includes a natural protein having a Lys residue or primary amine that can be recognized by TGase, and any protein that can introduce a Lys residue or primary amine that can be recognized by TGase. In addition, large proteinaceous tags such as intein are not required.
-The protein modification site is not limited to the C-terminus. Modification is possible as long as there is a TGase-active Lys residue or a site into which a tag having such a Lys residue can be introduced. In addition to the C-terminal and N-terminal, sites with large fluctuations in the protein structure, such as the loop region, can also be modified.
-When a nucleic acid is selected as a foreign molecule, its base sequence and length are not particularly limited.

本発明の複合体、複合体の形成方法、複合体の製造方法は、DNAチップをベースとしたプロテインチップ開発、DNAチップのハイブリダイゼーション検出用高感度分子プローブ、in situ ハイブリダイゼーションのための分子プローブ（特にAP-DNA）、（機能性）DNAとのハイブリッド化による分子センサーの構築、アンチセンスオリゴDNAとのハイブリッド化による創薬に応用可能である。   The complex of the present invention, the method of forming the complex, and the method of producing the complex include the development of a protein chip based on a DNA chip, a highly sensitive molecular probe for detecting hybridization of a DNA chip, and a molecular probe for in situ hybridization. It can be applied to the construction of molecular sensors by hybridization with (especially AP-DNA) and (functional) DNA, and drug discovery by hybridization with antisense oligo DNA.

II. 複合体の利用：
本発明はまた、以下のものも提供する：
（４）ペプチド又はタンパク質の基材表面への固定化方法であって、
a) 基材表面に固定化された核酸、
b) ペプチド又はタンパク質−核酸複合体であって、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するペプチド又はタンパク質と、TGaseが認識可能なGln残基を有する核酸とを、TGaseにより連結することにより得られるものであり；さらに核酸部分が、固定化核酸の有する塩基配列の全部又は一部に相補的な核酸配列を有するものである、前記ペプチド又はタンパク質−核酸複合体
を用い、
固定化核酸と、ペプチド又はタンパク質−核酸複合体の核酸部分とを、ハイブリダイズさせて固定化物を形成する工程を含むものである、前記固定化方法。
（５）ペプチド又はタンパク質の基材表面への固定化物の製造方法であって：
基材表面に予め固定化されている核酸と、ペプチド又はタンパク質−核酸複合体の核酸部分とを、ハイブリダイズさせて固定化物を形成する工程を含み、
ペプチド又はタンパク質−核酸複合体が、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するペプチド又はタンパク質と、TGaseが認識可能なGln残基を有する核酸とを、TGaseにより連結することにより得られるペプチド又はタンパク質−核酸複合体である、前記製造方法。 II. Use of the complex:
The present invention also provides the following:
(4) A method for immobilizing a peptide or protein on the surface of a substrate,
a) nucleic acid immobilized on the surface of the substrate,
b) A peptide or protein-nucleic acid complex, in which a peptide or protein having a Lys residue or primary amine that can be recognized by TGase and a nucleic acid having a Gln residue that can be recognized by TGase are linked by TGase Using the peptide or protein-nucleic acid complex, wherein the nucleic acid portion has a nucleic acid sequence complementary to all or part of the base sequence of the immobilized nucleic acid,
The said immobilization method which includes the process of hybridizing the nucleic acid part and the nucleic acid part of a peptide or protein-nucleic acid complex to form an immobilization product.
(5) A method for producing an immobilized product of a peptide or protein on a substrate surface, wherein:
A step of hybridizing a nucleic acid preliminarily immobilized on the surface of a substrate and a nucleic acid portion of a peptide or protein-nucleic acid complex to form an immobilized product,
A peptide or protein-nucleic acid complex is obtained by ligating a peptide or protein having a Lys residue or primary amine recognizable by TGase and a nucleic acid having a Gln residue recognizable by TGase with TGase. The said manufacturing method which is a peptide or protein-nucleic acid complex obtained.

本発明のこれらの方法における基材表面への核酸の固定化のためには、従来技術、例えばDNAマイクロアレイ等を調製する際に用いられる技術を適用することができる。「基材」は、ガラス、シリコンなどのプラスチック製の、チップ、ビーズ、ウェル、プレート等の形態とすることができ、核酸は、従来技術を用いて、基材表面に非共有結合（静電結合）的に、又は共有結合で固定することができる。あらかじめ調製した核酸を基板に固定化してもよく、基板上で直接核酸を合成してもよい。簡便には、アビジンで被覆された市販のプレートを用い、ビオチン化した所望のDNAを固定することができる。   In order to immobilize nucleic acids on the substrate surface in these methods of the present invention, conventional techniques such as those used in preparing DNA microarrays can be applied. The “substrate” may be in the form of a chip, bead, well, plate, or the like made of plastic such as glass or silicon, and the nucleic acid is non-covalently bonded (electrostatic) to the substrate surface using conventional techniques. It can be fixed (bonded) or covalently. A nucleic acid prepared in advance may be immobilized on a substrate, or the nucleic acid may be directly synthesized on the substrate. Conveniently, the desired biotinylated DNA can be immobilized using a commercially available plate coated with avidin.

本発明のこれらの方法において、ペプチド又はタンパク質−核酸複合体として、これまで述べてきたような本発明の複合体が用いられるが、そのペプチド又はタンパク質部分は、目的に応じ、種々の性質・構造のものとすることができる。また、その核酸部分は、固定化核酸の有する塩基配列の全部又は一部に相補的な核酸配列を有するものとする。   In these methods of the present invention, the complex of the present invention as described above is used as the peptide or protein-nucleic acid complex, and the peptide or protein portion has various properties and structures depending on the purpose. Can be. Moreover, the nucleic acid part shall have a nucleic acid sequence complementary to all or a part of the base sequence of the immobilized nucleic acid.

本発明のこれらの方法においては、固定化核酸と、ペプチド又はタンパク質−核酸複合体の核酸部分とを、ハイブリダイズさせることにより固定化する。ハイブリダイズのための条件は、当業者であれば、用いる核酸部分の長さ・塩基配列等に応じて、適宜設計することができる。本発明のこれらの方法については、実施例4及び8、並びに図6、7及び13を参照することができる。なお、本発明者らは、上述したように、複合体連結反応溶液を精製することなく、直接固定化に利用できることを確認しており、また、ペプチド又はタンパク質−核酸複合体は、相補的な塩基配列を有する固定化核酸にはハイブリダイズするが、非相補的な塩基配列を有する固定化核酸にはハイブリダイズしないことも確認している。   In these methods of the present invention, the immobilized nucleic acid and the nucleic acid part of the peptide or protein-nucleic acid complex are immobilized by hybridization. Those skilled in the art can appropriately design hybridization conditions according to the length, base sequence, etc. of the nucleic acid moiety used. Reference can be made to Examples 4 and 8 and FIGS. 6, 7 and 13 for these methods of the invention. In addition, as described above, the present inventors have confirmed that the complex ligation reaction solution can be directly used for immobilization without purification, and the peptide or protein-nucleic acid complex is complementary. It has also been confirmed that it hybridizes to an immobilized nucleic acid having a base sequence, but does not hybridize to an immobilized nucleic acid having a non-complementary base sequence.

本発明はまた、以下のものも提供する：
（６）標的分子の検出方法であって：
ペプチド又はタンパク質−核酸複合体であって、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するペプチド又はタンパク質と、TGaseが認識可能なGln残基を有する核酸とを、TGaseにより連結することにより得られるものであり；さらにペプチド又はタンパク質
部分が容易に検出可能な性質を有し、かつ核酸部分が標的分子に特異的に結合可能な塩基配列を有するものである、前記ペプチド又はタンパク質−核酸複合体を準備し；そして
対象物中に存在する標的分子と複合体とを核酸部分により特異的に結合させ；そして
結合している複合体を、ペプチド又はタンパク質部分により検出する工程を含む、前記検出方法。 The present invention also provides the following:
(6) A target molecule detection method comprising:
A peptide or protein-nucleic acid complex, wherein a peptide or protein having a Lys residue or primary amine that can be recognized by TGase and a nucleic acid having a Gln residue that can be recognized by TGase are linked by TGase. A peptide or protein-nucleic acid, wherein the peptide or protein part has a property that can be easily detected, and the nucleic acid part has a base sequence that can specifically bind to a target molecule. Providing a complex; and specifically binding the target molecule and complex present in the object with a nucleic acid moiety; and detecting the bound complex with a peptide or protein moiety, Detection method.

本発明の検出方法は、標的物質の定性、定量、識別、染色、局在化の調査等の目的で用いることができる。
本発明のこの方法においては、ペプチド又はタンパク質−核酸複合体として、本発明の複合体が用いられるが、また、核酸部分は、標的分子に特異的に結合可能な核酸配列を有するものとする。ペプチド又はタンパク質部分は、容易に検出可能な性質を有するものであり、好ましい例は、アルカリホスファターゼ（AP）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、抗体エピトープ配列を含むペプチド及びビオチン等である。ペプチドタグが容易に導入可能との観点からは、遺伝子工学的に製造可能なタンパク質が好ましい。この方法において、標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物（ATP）、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルス等でありうる。検出対象は、DNA転写膜、又は細胞若しくは個体組織切片等である。 The detection method of the present invention can be used for the purpose of qualitative, quantitative, identification, staining, localization investigation of a target substance.
In this method of the present invention, the complex of the present invention is used as a peptide or protein-nucleic acid complex, and the nucleic acid moiety has a nucleic acid sequence capable of specifically binding to a target molecule. Peptide or protein moieties have easily detectable properties and preferred examples include alkaline phosphatase (AP), green fluorescent protein (GFP), glutathione-S-transferase (GST), luciferase, peroxidase, antibody epitope Peptides containing sequences, biotin and the like. From the viewpoint that a peptide tag can be easily introduced, a protein that can be produced by genetic engineering is preferred. In this method, the target molecule may be a nucleic acid, a relatively small organic compound (ATP), a protein, a peptide, a metal ion, a multimer with a complex structure, a virus, or the like. The detection target is a DNA transfer film, a cell or individual tissue section, or the like.

本発明の検出方法は、標的核酸分子の検出方法として特に有用である。すなわち、標的分子が核酸であり、複合体の核酸部分が標的核酸分子の配列の全部又は一部と相補的な配列を有するものであり、標的核酸分子と複合体の核酸部分とをハイブリダイズさせることにより特異的に結合させる工程を含むものは、本発明の検出方法の特に好ましい実施態様の一つである。   The detection method of the present invention is particularly useful as a method for detecting a target nucleic acid molecule. That is, the target molecule is a nucleic acid, the nucleic acid portion of the complex has a sequence complementary to all or part of the sequence of the target nucleic acid molecule, and the target nucleic acid molecule and the nucleic acid portion of the complex are hybridized. One of the particularly preferable embodiments of the detection method of the present invention includes a step of specifically binding by the above-described method.

この態様において、検出対象は、(1)DNA転写膜、又は(2)細胞若しくは個体組織切片等である。 (1)の場合、標的核酸はPCRにより増幅されたDNA又はゲノム断片DNA、であり(2)の場合、標的核酸は細胞又は個体組織中に含まれる核酸（mRNA又はDNA）となる。この方法は、従来法、例えばジゴキシゲニン（DIG）標識化プローブを用いる方法に比較して、種々の点で優れている。例えば、DIG法では、プローブのDIG修飾及び標識化された抗DIG抗体が必要であり、それに伴う煩雑な洗浄操作が必要となるが、本発明の複合体（例えば、Z-QG-DNA-AP）を用いれば、DIG標識化プローブ及び標識化抗DIG抗体が不要になるため、試薬、手間及び時間を大幅に削減することが可能となる。   In this embodiment, the detection target is (1) a DNA transfer membrane, or (2) a cell or individual tissue section. In the case of (1), the target nucleic acid is DNA or genomic fragment DNA amplified by PCR, and in the case of (2), the target nucleic acid is a nucleic acid (mRNA or DNA) contained in a cell or individual tissue. This method is superior in various respects as compared with a conventional method, for example, a method using a digoxigenin (DIG) labeled probe. For example, the DIG method requires DIG modification of the probe and a labeled anti-DIG antibody, which requires a complicated washing operation, but the complex of the present invention (for example, Z-QG-DNA-AP ) Eliminates the need for a DIG-labeled probe and a labeled anti-DIG antibody, so that the reagent, labor, and time can be greatly reduced.

なお、TGaseを使うと、ペプチドタグを介して組換え酵素どうしを架橋化した酵素ポリマーの調製も可能となる。したがって、酵素ポリマーを得て、それと核酸を連結することで、１つの認識部位（核酸）に対して複数のシグナル増幅部位（酵素）を配置することが可能となる。このような改変により、さらに検出感度の向上が可能になると思われる。   When TGase is used, it is possible to prepare an enzyme polymer in which recombinant enzymes are cross-linked through a peptide tag. Therefore, it is possible to arrange a plurality of signal amplification sites (enzymes) for one recognition site (nucleic acid) by obtaining an enzyme polymer and linking it with a nucleic acid. Such modification is expected to further improve the detection sensitivity.

本発明はまた、以下のものも提供する：
（７）標的分子の検出方法であって：
標的分子の検出方法であって：
a) 基材表面に固定化された核酸、
b) 固定化核酸の全部又は一部に相補的な配列（固定化核酸相補的配列）、及び標的分子に特異性的に結合可能な配列（標的分子特異的配列）を有するアプタマー核酸、並びに
c) ペプチド又はタンパク質−核酸複合体であって、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するペプチド又はタンパク質と、TGaseが認識可能なGln残基を有する核酸とを、TGaseにより連結することにより得られるものであり；さらにペプチド又はタンパク質部分が容易に検出可能な性質を有し、かつ核酸部分がアプタマー核酸の標的分子特異的配列の全部又は一部に相補的な配列を有するものである、前記ペプチド又はタンパク質−核酸複合体
を用い、
1) 固定化核酸に、アプタマー核酸を供し、固定化核酸とアプタマー核酸の固定化核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせることにより、アプタマー核酸を固定化し；
2) 固定化アプタマー核酸に、標的分子を含む可能性のある試料を供し、標的分子が存在する場合には標的分子とアプタマー核酸の標的分子特異的配列を有する部分とを結合させ、かつタンパク質−核酸複合体を供し、標的分子が存在しない場合にはタンパク質−核酸複合体の核酸部分とアプタマー核酸とをハイブリダイズさせることにより、タンパク質を固定化し；
3) 固定化タンパク質の有無又はその量をタンパク質の性質に基づいて検出することにより、試料中の標的分子を検出する
工程を含む、前記検出方法。 The present invention also provides the following:
(7) A target molecule detection method comprising:
A method for detecting a target molecule comprising:
a) nucleic acid immobilized on the surface of the substrate,
b) an aptamer nucleic acid having a sequence complementary to all or part of the immobilized nucleic acid (immobilized nucleic acid complementary sequence) and a sequence capable of specifically binding to the target molecule (target molecule-specific sequence), and
c) A peptide or protein-nucleic acid complex, in which a peptide or protein having a Lys residue or primary amine recognizable by TGase and a nucleic acid having a Gln residue recognizable by TGase are linked by TGase In addition, the peptide or protein portion has an easily detectable property, and the nucleic acid portion has a sequence complementary to all or part of the target molecule-specific sequence of the aptamer nucleic acid. Using the peptide or protein-nucleic acid complex,
1) immobilizing aptamer nucleic acid by subjecting the immobilized nucleic acid to aptamer nucleic acid and hybridizing the immobilized nucleic acid and a portion having an immobilized nucleic acid complementary sequence of the aptamer nucleic acid;
2) A sample that may contain the target molecule is provided to the immobilized aptamer nucleic acid. When the target molecule is present, the target molecule is bound to the portion having the target molecule-specific sequence of the aptamer nucleic acid, and the protein- Providing a nucleic acid complex and immobilizing the protein by hybridizing the nucleic acid portion of the protein-nucleic acid complex and the aptamer nucleic acid in the absence of the target molecule;
3) The said detection method including the process of detecting the target molecule in a sample by detecting the presence or absence or quantity of the immobilized protein based on the property of the protein.

本発明のこの方法における基材表面への核酸の固定化のためには、上述のペプチド又はタンパク質の固定化方法に関して説明したのと同様の技術を適用することができる。
この方法ではさらに、固定化核酸の全部又は一部に相補的な配列（固定化核酸相補的配列）、及び標的分子に特異性的に結合可能な配列（標的分子特異的配列）を有する核酸（アプタマー核酸）が用いられる。標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルス等でありうる。標的分子特異的配列を有する部分は、従来技術、例えばSELEX（試験管内人工進化法）工程を用いることにより産生することができ、また標的分子に対して非常に高い標的親和性及び特異性を有するものとすることができる。標的分子特異的配列を有する部分は、修飾ヌクレオチドで構成されていてもよい。 In order to immobilize the nucleic acid on the substrate surface in this method of the present invention, the same technique as described above for the peptide or protein immobilization method can be applied.
In this method, a nucleic acid having a sequence complementary to all or part of the immobilized nucleic acid (immobilized nucleic acid complementary sequence) and a sequence capable of specifically binding to the target molecule (target molecule-specific sequence) ( Aptamer nucleic acid) is used. The target molecule may be a nucleic acid, a relatively small organic compound, a protein, a peptide, a metal ion, a multimer with a complex structure, a virus, or the like. Portions with target molecule specific sequences can be produced by using conventional techniques such as SELEX (In-vitro Artificial Evolution) process and have very high target affinity and specificity for the target molecule Can be. The portion having the target molecule-specific sequence may be composed of modified nucleotides.

この方法において、ペプチド又はタンパク質−核酸複合体として、本発明の複合体が用いられるが、そのペプチド又はタンパク質部分は、容易に検出可能な性質を有するものであり、好ましい例は、アルカリホスファターゼ（AP）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、抗体エピトープ配列を含むペプチド及びビオチン等である。ペプチドタグが容易に導入可能との観点からは、遺伝子工学的に製造可能なタンパク質が好ましい。また、核酸部分は、アプタマー核酸の標的分子特異的配列の全部又は一部に相補的な配列を有する。   In this method, the complex of the present invention is used as a peptide or protein-nucleic acid complex. The peptide or protein part has an easily detectable property, and a preferred example is alkaline phosphatase (AP ), Green fluorescent protein (GFP), glutathione-S-transferase (GST), luciferase, peroxidase, peptide containing antibody epitope sequence, biotin and the like. From the viewpoint that a peptide tag can be easily introduced, a protein that can be produced by genetic engineering is preferred. The nucleic acid portion has a sequence complementary to all or a part of the target molecule-specific sequence of the aptamer nucleic acid.

この方法においては、 固定化核酸に、アプタマー核酸を供し、固定化核酸とアプタマー核酸の固定化核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせることにより、アプタマー核酸を固定化するが、このハイブリダイズのための条件は、当業者であれば、用いる核酸部分の長さ・塩基配列等に応じて、適宜設計することができる。   In this method, an aptamer nucleic acid is immobilized on an immobilized nucleic acid by hybridizing an immobilized nucleic acid and a portion having an immobilized nucleic acid complementary sequence of the aptamer nucleic acid. Those skilled in the art can appropriately design the conditions according to the length, base sequence, etc. of the nucleic acid moiety used.

また、この方法においては、次いで固定化アプタマー核酸に、標的分子を含む可能性のある試料を供し、標的分子が存在する場合には標的分子とアプタマー核酸の標的分子特異的配列を有する部分とを結合させ、さらにタンパク質−核酸複合体を供し、標的分子が存在しない場合にはタンパク質−核酸複合体の核酸部分とアプタマー核酸とをハイブリダイズさせる。試料は、細胞若しくは組織抽出液、体液等でありうる。   In this method, the immobilized aptamer nucleic acid is then subjected to a sample that may contain the target molecule, and when the target molecule is present, the target molecule and the portion having the target molecule-specific sequence of the aptamer nucleic acid are combined. In addition, a protein-nucleic acid complex is provided, and when no target molecule is present, the nucleic acid portion of the protein-nucleic acid complex is hybridized with the aptamer nucleic acid. The sample can be a cell or tissue extract, a body fluid or the like.

さらにこの方法においては、固定化タンパク質の有無又はその量をタンパク質の性質に基づいて検出することにより、試料中の標的分子を検出することができる。
アプタマー核酸においては、固定化核酸相補的配列を有する部分と、標的分子特異的配列を有する部分とは、重複してもよく、連続してもよく、また適当なスペーサーを介して両者が存在するように設計することができる。標的分子特異的配列を有する部分（アプタマー領域）が分子認識のためにある立体構造をとることを考慮すると、該部分は、固定化核酸相補的配列を有する部分とは少なくとも重複しないようにするのがよい。 Furthermore, in this method, the target molecule in the sample can be detected by detecting the presence or absence of the immobilized protein or the amount thereof based on the nature of the protein.
In aptamer nucleic acids, the portion having an immobilized nucleic acid complementary sequence and the portion having a target molecule-specific sequence may overlap or may be continuous, and both exist via an appropriate spacer. Can be designed as Considering that the part having the target molecule-specific sequence (aptamer region) takes a certain three-dimensional structure for molecular recognition, the part should not at least overlap with the part having the immobilized nucleic acid complementary sequence. Is good.

アプタマー核酸は、固定化核酸相補的配列及び標的分子特異的配列以外に、所望の場合にはタンパク質−核酸複合体と適切にハイブリダイズするための配列をさらに含んでいてもよい。ペプチド又はタンパク質−核酸複合体の核酸部分は、アプタマー核酸の標的分子特異的配列の全部又は一部に相補的な配列を有するが、この特異的配列の全部又は一部に相補的な配列からなる領域が長い（標的分子特異的配列と重複が多い）と、却ってアプタマー核酸とはハイブリダイズできない場合が生じうる。また短い（重複が少ない）と、標的分子が存在し、アプタマー核酸と結合している場合にも、ペプチド又はタンパク質−核酸複合体とアプタマー核酸とがハイブリダイズしてしまう場合が生じうる。当業者であれば、このような考慮して、固定化核酸、アプタマー核酸、ペプチド又はタンパク質−核酸複合体の核酸部分を、適宜設計することができる。   In addition to the immobilized nucleic acid complementary sequence and the target molecule specific sequence, the aptamer nucleic acid may further include a sequence for appropriately hybridizing with the protein-nucleic acid complex, if desired. The nucleic acid part of the peptide or protein-nucleic acid complex has a sequence complementary to all or part of the target molecule-specific sequence of the aptamer nucleic acid, but consists of a sequence complementary to all or part of this specific sequence If the region is long (there is a lot of overlap with the target molecule-specific sequence), there may occur a case where it cannot hybridize with the aptamer nucleic acid. Moreover, if the target molecule is present and bound to the aptamer nucleic acid, the peptide or protein-nucleic acid complex and the aptamer nucleic acid may be hybridized if the target molecule is short (less overlapping). Those skilled in the art can appropriately design the nucleic acid portion of the immobilized nucleic acid, aptamer nucleic acid, peptide, or protein-nucleic acid complex in consideration of such considerations.

本発明のこの方法については、実施例5並びに図8及び9を参照することができる。   Reference may be made to Example 5 and FIGS. 8 and 9 for this method of the invention.

〔実施例1：アルカリホスファターゼとDNAとの連結〕
(1) Z-QG-DNAの合成
MTGの良基質として知られるジペプチドZ-Gln-Gly（Z-QG）のカルボキシル基を活性エステル（NHS）化し、これをアミノ化DNAと縮合することで、TGase活性なGln残基を有するDNA（Z-QG-DNA）を合成した（図1）。 [Example 1: Ligation of alkaline phosphatase and DNA]
(1) Synthesis of Z-QG-DNA
By converting the carboxyl group of the dipeptide Z-Gln-Gly (Z-QG), which is known as a good substrate for MTG, into an active ester (NHS) and condensing it with aminated DNA, DNA with a TGase-active Gln residue ( Z-QG-DNA) was synthesized (FIG. 1).

Step 1: NHS（N-hydroxysuccinimide, 0.5M,キシダ化学）とZ-QG（0.5M, Sigma-Aldrich）をDMSO 1mLに溶解し、EDC（(3-dimethyl-aminopropy1)carbodiimide, 同仁化学）0.6M
DMSO溶液）1mLを滴下し、室温で24時間攪拌した。 Step 1: Dissolve NHS (N-hydroxysuccinimide, 0.5M, Kishida Chemical) and Z-QG (0.5M, Sigma-Aldrich) in 1 mL of DMSO, EDC ((3-dimethyl-aminopropy1) carbodiimide, Dojin Chemical) 0.6M
1 mL of DMSO solution was added dropwise and stirred at room temperature for 24 hours.

Step 2: 0.2Mホウ酸緩衝液(pH9)に溶解したアミノ化DNA (24-mer, 5'-NH2-(CH2)6-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA-3'（配列番号：23）, Gene Net) 水溶液250μLに、上記のNHS化Z-QG DMSO溶液50μLを添加した。室温で3時間撹拝後、NAP-10ゲル濾過カラムによりZ-QG-DNAを精製した。Z-QG-DNAの同定はTOF-MSで行い、HPLCで生成物の確認及び収率85％（アミノ化DNA基準）を求めた。   Step 2: Aminated DNA dissolved in 0.2M borate buffer (pH 9) (24-mer, 5'-NH2- (CH2) 6-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA-3 '(SEQ ID NO: 23) , Gene Net) 50 μL of the NHS-modified Z-QG DMSO solution was added to 250 μL of the aqueous solution. After stirring at room temperature for 3 hours, Z-QG-DNA was purified by a NAP-10 gel filtration column. Z-QG-DNA was identified by TOF-MS, and the product was confirmed by HPLC and the yield was 85% (based on aminated DNA).

(2) NK6-AP、CK6-APの合成
TGase活性なLys残基を有するNK6-AP（MKHKGS配列をN末端に有するアルカリホスファターゼ）及びCK6-AP（MKHKGS配列をC末端に有するアルカリホスファターゼ）を合成した。 (2) Synthesis of NK6-AP and CK6-AP
NK6-AP (alkaline phosphatase having an MKHKGS sequence at the N-terminus) and CK6-AP (alkaline phosphatase having an MKHKGS sequence at the C-terminus) having a TGase-active Lys residue were synthesized.

具体的な調製法を以下に示す。
2.1) NK6-AP発現ベクターの構築
pET22b(+)（Novagen）からPCRによりpET22b(+)のApaIサイト上流からpel B leaderの終りまでを増幅した。この時、pelB leader側にK6-tag(MKHKGS)をコードするDNAとBamHIサイトが導入されるようにプライマーを設計した。増幅後、生成したDNAをApaI/BamHIで処理した。pET22-APを同じくApaI/BamHIで処理した後、脱リン酸化反応を行いその後、増幅したDNAを挿入することでNK6-AP発現ベクター:pET22-NK6-APを調製した。 A specific preparation method is shown below.
2.1) Construction of NK6-AP expression vector
From pET22b (+) (Novagen), PCR was amplified from upstream of the Apa I site of pET22b (+) to the end of pel B leader. At this time, primers were designed so that DNA encoding K6-tag (MKHKGS) and BamH I site were introduced into the pelB leader side. After amplification, the generated DNA was treated with Apa I / BamH I. pET22-AP was similarly treated with Apa I / BamH I, dephosphorylated, and then amplified DNA was inserted to prepare an NK6-AP expression vector: pET22-NK6-AP.

2.2) CK6-AP発現ベクターの構築
pET22-APから、PCRによりAPをコードするDNAを増幅した。この時APのN末端側に制限酵素BamHIサイトとHis-tagをコードするDNAが、またC末端側にK6-tag(MKHKGS)をコードするDNAとHindIIIサイトが導入されるようにプライマーを設計した。増幅後、生成したDNAをBamHI/HindIIIで処理した。pET22b(+)を同じくBamHI/HindIIIで処理した後、脱リン酸化反応を行いその後、増幅したDNAを挿入することでCK6-AP発現ベクター:pET22-CK6-APを調製した。 2.2) Construction of CK6-AP expression vector
From pET22-AP, DNA encoding AP was amplified by PCR. At this time, primers should be introduced so that DNA encoding the restriction enzyme BamHI site and His-tag is introduced on the N-terminal side of AP, and DNA encoding K6-tag (MKHKGS) and HindIII site are introduced on the C-terminal side. Designed. After amplification, the generated DNA was treated with BamH I / Hind III. pET22b (+) was similarly treated with BamH I / Hind III, dephosphorylated, and then amplified DNA was inserted to prepare a CK6-AP expression vector: pET22-CK6-AP.

2.3) 各組換えAPの発現および精製
各組換えAPは大腸菌BL21株（Novagen）を用いて発現させた。まずそれぞれの発現ベクターを大腸菌BL21株に導入し形質転換体を得た。形質転換体はアンピシリン(100mg/L)を含むLB培地にて前培養を3時間程度行った(37℃、250rpm)。その後アンピシリン(100mg/L)を含むLB培地中(1L)にてOD600 = 0.6に達するまで培養を行い(37℃、250rpm)、IPTGを終濃度0.1mMになるように添加した。IPTG添加後、27℃、200rpmにて24時間培養を行った。
得られた菌体は遠心分離により集菌し、ショ糖緩衝液 (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, にEDTA 1 mM、ショ糖20wt%を溶解させたもの)により2回洗浄を行い、浸透圧衝撃法用緩衝液 (5 mM MgCl2溶液) を用い細胞を再懸濁させた後、超音波処理により細胞を粉砕した。その後遠心分離により無細胞抽出液を回収し、これをHis-tagおよびゲル濾過カラムを用いて精
製することで、各組換えAPを得た。各組換えAPのアミノ酸配列の確認は、当該組換えAPをコードするプラスミドベクターのDNA配列の確認をDNAシーケンサーにて行い、精製の確認はSDS-PAGE で行った。 2.3) Expression and purification of each recombinant AP
Each recombinant AP was expressed using E. coli strain BL21 (Novagen). First, each expression vector was introduced into Escherichia coli BL21 strain to obtain a transformant. The transformant was pre-cultured in an LB medium containing ampicillin (100 mg / L) for about 3 hours (37 ° C., 250 rpm). Thereafter, the cells were cultured in LB medium (1 L) containing ampicillin (100 mg / L) until OD600 = 0.6 (37 ° C., 250 rpm), and IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM. After adding IPTG, the cells were cultured at 27 ° C. and 200 rpm for 24 hours.
The obtained cells are collected by centrifugation, washed twice with sucrose buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, EDTA 1 mM, sucrose 20 wt%), and permeated. The cells were resuspended using a buffer solution for pressure shock (5 mM MgCl2 solution), and then pulverized by sonication. Thereafter, the cell-free extract was collected by centrifugation and purified using a His-tag and a gel filtration column to obtain each recombinant AP. The amino acid sequence of each recombinant AP was confirmed with a DNA sequencer by confirming the DNA sequence of the plasmid vector encoding the recombinant AP, and the purification was confirmed by SDS-PAGE.

(3) TGase反応
次に、NK6-AP又はCK6-APとZ-QG-DNAを混合し、TGase反応に供した。
具体的には、以下の条件で、反応した。
・CK6-AP又はNK6-AP : 2.8 μM
・Z-QG-DNA : 44 μM
・MTG（分子量38,000、Ca2+イオン非依存性、pH5〜8で活性） : 1.1 U/ml
・Buffer : 50 mM Tris-HCl pH 7.0
・Temp 25℃
・Time 24 hour
(4) AP活性の測定
TGase反応の前及び後のAP活性を、以下のように確認した。
・反応後の溶液（NK-6AP(pH7.0)）: 5μl/ml
・p-ニトロフェニルリン酸 : 1mM
・pH 8.0
・Temp 25℃
一分間当たりに1μmolのp-ニトロフェノールを生成するAPの量を1Uと定義した。 (3) TGase reaction Next, NK6-AP or CK6-AP and Z-QG-DNA were mixed and subjected to a TGase reaction.
Specifically, the reaction was performed under the following conditions.
・ CK6-AP or NK6-AP: 2.8 μM
・ Z-QG-DNA: 44 μM
MTG (Molecular weight 38,000, Ca 2+ ion independent, active at pH 5-8): 1.1 U / ml
Buffer: 50 mM Tris-HCl pH 7.0
・ Temp 25 ℃
・ Time 24 hour
(4) AP activity measurement
AP activity before and after the TGase reaction was confirmed as follows.
-Solution after reaction (NK-6AP (pH7.0)): 5μl / ml
・ P-Nitrophenyl phosphate: 1mM
・ PH 8.0
・ Temp 25 ℃
The amount of AP producing 1 μmol of p-nitrophenol per minute was defined as 1U.

(4) 結果
CK6-AP又はNK6-APとZ-QG-DNAの連結が可能なことが明らかとなった（図2）。また、連結後のAPの酵素活性は、連結前の酵素活性と同等であったことから（図3）、目的タンパク質の機能損失を伴わないタンパク質とDNAの連結が可能なことが明らかとなった。これは、DNAが目的タンパク質（NK6-AP）のペプチドタグ選択的に導入されていることも示している。 (4) Results
It was revealed that CK6-AP or NK6-AP and Z-QG-DNA can be linked (FIG. 2). Moreover, the enzyme activity of AP after ligation was equivalent to the enzyme activity before ligation (Fig. 3), so it became clear that protein and DNA can be linked without loss of function of the target protein. . This also indicates that DNA has been introduced selectively for the peptide tag of the target protein (NK6-AP).

〔実施例2：EGFP又はGSTとDNAとの連結〕
MKHKGS配列をN末端に有する緑色蛍光タンパク質（EGFP）及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）についても、実施例1の実験操作でDNAとの連結が可能なことが確認された（図4）。 [Example 2: Ligation of EGFP or GST and DNA]
It was also confirmed that the green fluorescent protein (EGFP) and glutathione-S-transferase (GST) having the MKHKGS sequence at the N-terminus can be linked to DNA by the experimental procedure of Example 1 (FIG. 4).

〔実施例3：種々の長さのDNAとの連結〕
異なる長さのDNAとの連結を試みた。
Z-QG-DNAの合成：
実施例1のZ-QG-DNAの合成において、アミノ化DNAの長さを20、30又は40 merとした。それ以外の点は、実施例1と同様の実験操作を行った。
結果：
DNAの鎖長に依存せず連結が可能であった（図5，3、4及び5レーンはそれぞれ20、30及び40mer Z-QG-DNAとNK6-APとの連結の結果）。高分子同士を連結する際の酵素反応の優位性を示している。 [Example 3: Ligation with DNA of various lengths]
Attempts were made to link DNAs of different lengths.
Synthesis of Z-QG-DNA:
In the synthesis of Z-QG-DNA of Example 1, the length of the aminated DNA was 20, 30 or 40 mer. Otherwise, the same experimental operation as in Example 1 was performed.
result:
Ligation was possible without depending on the DNA chain length (FIGS. 5, 3, 4 and 5 lanes were results of ligation of 20, 30 and 40mer Z-QG-DNA and NK6-AP, respectively). It shows the superiority of the enzymatic reaction when linking polymers.

〔実施例4：DNA部位を介した配向制御型タンパク質固定化〕
得られたタンパク質-DNA複合体を核酸部位の相補性（DNA hybridization）を介して固定化することを試みた。核酸部位選択的な固定化の達成は、DNAチップをベースとしたproteinチップや、in situ hybridizationへの応用を可能にする。 [Example 4: Immobilization of orientation-controlled protein via DNA site]
An attempt was made to immobilize the obtained protein-DNA complex through complementation of the nucleic acid site (DNA hybridization). The achievement of selective immobilization of nucleic acid sites enables application to protein chips based on DNA chips and in situ hybridization.

方法：
アビジンでコートされた96穴マイクロプレート（Nunc immobilizer, Streptavidin plates）上に、NK6-APとの連結に用いたDNAの相補的配列を有するビオチン化DNAを固定化し
た。ここに実施例1で得られたNK6-AP-Z-QG-DNAを、まず His-tagを使ってNiキレートカラムにより未反応 DNA とタンパク質成分を分離し、その後、PD10ゲル濾過カラムで溶出時に用いられたイミダゾールを徐去した後に添加し、洗浄操作の後、NK6-AP-Z-QG-DNAの酵素活性を指標として固定化挙動を検討した。概念図を図6に示す。 Method:
Biotinylated DNA having a complementary sequence of DNA used for ligation to NK6-AP was immobilized on a 96-well microplate (Nunc immobilizer, Streptavidin plates) coated with avidin. Here, NK6-AP-Z-QG-DNA obtained in Example 1 was first separated from unreacted DNA and protein components by Ni chelate column using His-tag, and then eluted with PD10 gel filtration column. The imidazole used was added after gradual removal, and after washing, the immobilization behavior was examined using the enzyme activity of NK6-AP-Z-QG-DNA as an index. A conceptual diagram is shown in FIG.

実験は、下記の手順にしたがって行った。
1) アビジンコートされた96-wellプレートを、TBST (25mM Tris, 2.7mM KCl, 0.137M NaCl, 0.05 vol% Tween20)でprewashした。
2) 100 μLの500 nM biotin-cDNA(TBSに溶解)を加え、1時間インキュベートした後、TBSTで洗浄した。
3) 100 μLの NK6-AP-Z-QG-DNA(0.3U/L、TBSに溶解)を加え、1時間インキュベートした後、TBSTで洗浄した。
4) ECF基質（アマシャム バイオサイエンス株式会社）を加えた。
5) AP活性を、FX-Pro molecular imager (Bio-Rad)で検出した（Ex 430 nm/Em 560 nm）。 The experiment was performed according to the following procedure.
1) Avidin-coated 96-well plates were prewashed with TBST (25 mM Tris, 2.7 mM KCl, 0.137 M NaCl, 0.05 vol% Tween20).
2) 100 μL of 500 nM biotin-cDNA (dissolved in TBS) was added, incubated for 1 hour, and washed with TBST.
3) 100 μL of NK6-AP-Z-QG-DNA (0.3 U / L, dissolved in TBS) was added, incubated for 1 hour, and then washed with TBST.
4) ECF substrate (Amersham Biosciences) was added.
5) AP activity was detected with FX-Pro molecular imager (Bio-Rad) (Ex 430 nm / Em 560 nm).

結果：
結果を図7に示した。APに連結したDNAの相補鎖を固定化したウェルにのみAP活性が検出されたことから、NK6-APとZ-QG-DNAとの複合体（NK6-AP-Z-QG-DNA）は、DNA部位を介してタンパク質機能を保持したまま固定化されたことが明らかであった。この結果は、DNA hybridizationを介したタンパク質の固定化が可能なことを示すとともに、DNAが有する多様な機能（分子認識能：DNA aptamerや触媒能：DNAzyme）を、目的タンパク質の機能に影響をあたえることなく容易に付与することが可能なことも示している。 result:
The results are shown in FIG. Since AP activity was detected only in the wells to which the complementary strand of DNA linked to AP was immobilized, the complex of NK6-AP and Z-QG-DNA (NK6-AP-Z-QG-DNA) It was apparent that the protein was immobilized while retaining the protein function via the DNA site. This result indicates that the protein can be immobilized via DNA hybridization, and various functions of DNA (molecular recognition ability: DNA aptamer and catalytic ability: DNAzyme) can affect the function of the target protein. It also shows that it can be easily applied without any problem.

〔実施例5：AP-DNA conjugateを利用した小分子の検出〕
AP-DNA conjugateの応用例として、ATPに特異性を有するDNAアプタマーを用いる小分子（ATP）検出系の構築を試みた。その概念を図8に示す。 [Example 5: Detection of small molecule using AP-DNA conjugate]
As an application example of AP-DNA conjugate, we attempted to construct a small molecule (ATP) detection system using a DNA aptamer having specificity for ATP. The concept is shown in FIG.

方法：
アビジン被覆ブラックマイクロプレート（Nunc イモビライザー）はNunc社から購入した。アルカリフォスファターゼ（AP）の基質ECFはアマシャム バイオサイエンス株式会社から購入した。 ATP (adenosine triphosphate)、ADP、AMP、GTP (guanosine triphosphate)はSigma社から購入した。 Method:
Avidin-coated black microplate (Nunc immobilizer) was purchased from Nunc. Alkaline phosphatase (AP) substrate ECF was purchased from Amersham Biosciences. ATP (adenosine triphosphate), ADP, AMP, and GTP (guanosine triphosphate) were purchased from Sigma.

本実施例で用いたDNA類の配列は以下の通りある。   The sequences of DNAs used in this example are as follows.

・ATP存在下での蛍光性基質ECFを用いたAP活性測定
1) 5×SSCT緩衝液(クエン酸ナトリウム500 mM、NaCl 750 mM、tween 0.05 v/v％、pH 7)でアビジン被覆ブラックマイクロプレートの各wellをprewashした。
2) 5×SSC緩衝液を用いてビオチン化DNA溶液 0.5 μMを調製し 、各wellに100 μlロードして一時間室温で放置した。
3) 5×SSCT緩衝液で、フリーのビオチン化DNAを洗い流した。
4) DNAアプタマー溶液 0.1 mM、0.5 μlと5×SSC緩衝液99.5 μlを加えて調製した100 μlの水溶液 を各wellにロードして一時間室温で放置した。
5) 5×SSCT緩衝液で、フリーのDNAアプタマーを洗い流した。
6) 5×SSC緩衝液を用いて各小分子溶液を1 mM、48 μl調製したのち、各wellにロードして一時間室温で放置した。
7) 洗浄操作を行わずに、調製したAP-DNA複合体溶液 2 μlを各wellにロードして一時間室温で放置した。
8) 5×SSCT緩衝液で、フリーのAP-DNA複合体を洗い流した。
9) ECFの原液をTris-HCl緩衝液(pH 8、1 M)で10倍希釈し、この調製した溶液を各wellに100 μlロードし、一時間室温で反応を行った。
10) 蛍光イメージャーで各wellの蛍光測定を行った。 ・ Measurement of AP activity using fluorescent substrate ECF in the presence of ATP
1) Each well of the avidin-coated black microplate was prewashed with 5 × SSCT buffer (sodium citrate 500 mM, NaCl 750 mM, tween 0.05 v / v%, pH 7).
2) A 0.5 μM biotinylated DNA solution was prepared using 5 × SSC buffer, and 100 μl was loaded in each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
3) Free biotinylated DNA was washed away with 5 × SSCT buffer.
4) DNA aptamer solution 100 mM of an aqueous solution prepared by adding 0.1 mM, 0.5 μl and 5 × SSC buffer 99.5 μl was loaded into each well and left at room temperature for 1 hour.
5) Free DNA aptamer was washed away with 5 × SSCT buffer.
6) After preparing 1 mM and 48 μl of each small molecule solution using 5 × SSC buffer, each small molecule solution was loaded into each well and left at room temperature for 1 hour.
7) Without washing, 2 μl of the prepared AP-DNA complex solution was loaded into each well and left at room temperature for 1 hour.
8) The free AP-DNA complex was washed away with 5 × SSCT buffer.
9) The ECF stock solution was diluted 10-fold with Tris-HCl buffer (pH 8, 1 M), and 100 μl of this prepared solution was loaded into each well and reacted at room temperature for 1 hour.
10) The fluorescence of each well was measured with a fluorescence imager.

結果：
結果を図9に示した。ATPに応答したAPシグナルの変化が観察された。AP-DNA複合体が図7に示す概念に基づき、小分子検出のための分子素子として利用可能なことが明らかとなった。また、この系においては、検出限界が1mMであることが明らかとなった。 result:
The results are shown in FIG. Changes in the AP signal in response to ATP were observed. Based on the concept shown in FIG. 7, it was revealed that the AP-DNA complex can be used as a molecular element for small molecule detection. In this system, the detection limit was found to be 1 mM.

〔実施例6：AP-DNA複合体形成に関するpHの影響〕
NK6-AP又はCK6-APとZ-QG-DNAの複合体の形成を、種々のpHにおいて行った。
方法：
以下の条件で、反応した。
・CK6-AP又はNK6-AP : 2.8 μM
・Z-QG-DNA : 44 μM
・MTG : 1.1 U/ml
・Buffer : 50 mM MES pH 5.5-7.0
・Buffer : 50 mM Tris-HCl pH 7.0-8.0
・Temp 25℃
・Time 24 hour
反応産物は、そのままSDS-PAGEに供した。 [Example 6: Effect of pH on AP-DNA complex formation]
Complex formation of NK6-AP or CK6-AP and Z-QG-DNA was performed at various pHs.
Method:
The reaction was performed under the following conditions.
・ CK6-AP or NK6-AP: 2.8 μM
・ Z-QG-DNA: 44 μM
・ MTG: 1.1 U / ml
Buffer: 50 mM MES pH 5.5-7.0
Buffer: 50 mM Tris-HCl pH 7.0-8.0
・ Temp 25 ℃
・ Time 24 hour
The reaction product was directly subjected to SDS-PAGE.

結果：
結果を下表及び図10に示した。CK6-AP、NK6-APとも、pH5.5〜8.0においてZ-QG-DNAとの反応が十分に進み、AP-DNA複合体を得ることができた。 result:
The results are shown in the table below and FIG. With both CK6-AP and NK6-AP, the reaction with Z-QG-DNA proceeded sufficiently at pH 5.5 to 8.0, and an AP-DNA complex could be obtained.

NK6-AP又はCK6-APとZ-QG-DNAとの連結においては、pH依存性が通常の溶液系とは異なり、低pHで収率が向上する傾向が見られた。
APはダイマーであり、SDS-PAGEから上記に示すように、約50％以上の収率で複合体が得られていることから、少なくともダイマーあたり１つのDNAが連結しているものと予想された。 In the ligation of NK6-AP or CK6-AP and Z-QG-DNA, the pH dependency was different from that of a normal solution system, and a tendency to improve the yield at a low pH was observed.
AP is a dimer, and as shown above from SDS-PAGE, the complex was obtained in a yield of about 50% or more, so it was expected that at least one DNA was linked per dimer. .

〔実施例7：タンパク質過剰の条件下でのNK6-APとDNAとの連結〕
予想されているMTGの触媒反応から、ここでの連結反応はMTG活性中心であるシステイン（Cys）残基の、Z-QG-DNAのGlnへの求核置換反応によるアシル−酵素複合体の形成と、続いて起こるタンパク質のLysによるアシル−酵素複合体への求核置換反応によるMTGの脱離、の2段階で進行すると予想される。 [Example 7: Ligation of NK6-AP and DNA under protein-excess conditions]
From the expected catalytic reaction of MTG, the ligation reaction here is the formation of acyl-enzyme complex by nucleophilic substitution reaction of cysteine (Cys) residue, which is the active center of MTG, to Gln of Z-QG-DNA. And subsequent elimination of MTG by nucleophilic substitution reaction to the acyl-enzyme complex with Lys of the protein is expected to proceed.

上述の通り、タンパク質濃度に対し15倍以上のZ-QG-DNA濃度においても、反応率は50〜60%にまでしか到達しないことから、この反応の律速段階は２段階目であると予想される。そこでタンパク質としてNK6-APを用い、NK6-AP過剰の条件下での連結反応による反応効率の向上を試みた。   As described above, even at a Z-QG-DNA concentration 15 times higher than the protein concentration, the reaction rate reaches only 50-60%, so the rate-limiting step of this reaction is expected to be the second step. The Thus, NK6-AP was used as a protein, and an attempt was made to improve reaction efficiency by ligation reaction under the condition of NK6-AP excess.

方法：
以下の条件で反応した。
・NK6-AP（実施例1で調製したもの） : 0〜16 μM
・Z-QG-DNA（実施例1で調製したもの DNAは24 mer） : 1.6 μM
・MTG : 1.1 U/ml
・Buffer : 50 mM Tris-HCl pH 7.0
・Temp 25℃
・Time 0〜12 hour Method:
The reaction was performed under the following conditions.
NK6-AP (prepared in Example 1): 0-16 μM
・ Z-QG-DNA (DNA prepared in Example 1 is 24 mer): 1.6 μM
・ MTG: 1.1 U / ml
Buffer: 50 mM Tris-HCl pH 7.0
・ Temp 25 ℃
・ Time 0-12 hours

結果：
結果を図11に示した。Z-QG-DNA濃度に対し5倍以上のNK6-AP濃度にすることにより、12時間後において反応率（AP-DNA複合体に転化したZ-QG-DNAの割合）は95％以上に達した。またZ-QG-DNA濃度に対し、5倍のNK6-AP濃度の条件下において、連結反応率の時間変化測定を行ったところ、3時間でほぼ反応が完結することが明らかとなった（図12）。
この実施例で得られたNK6-AP-DNA複合体反応溶液には、遊離のZ-QG-DNAがほとんど存在せず、競合的なハイブリダイゼーションがないため、実施例4のように反応後に溶液をHis-tag精製することなく、直接核酸部位選択的な固定化へと利用できると考えられる。 result:
The results are shown in FIG. By setting the NK6-AP concentration to 5 times higher than the Z-QG-DNA concentration, the reaction rate (ratio of Z-QG-DNA converted to AP-DNA complex) reached 95% or more after 12 hours. did. When the time-dependent measurement of the ligation reaction rate was performed under the condition of NK6-AP concentration 5 times that of the Z-QG-DNA concentration, it was found that the reaction was almost completed in 3 hours (Fig. 12).
In the NK6-AP-DNA complex reaction solution obtained in this example, there is almost no free Z-QG-DNA, and there is no competitive hybridization. It can be used directly for nucleic acid site-specific immobilization without purifying His-tag.

なお、充分な反応率を得るには、Z-QG-DNA に対する NK6-AP のモル濃度比が2以上であることが好ましく、必要であると考えられ、また、Z-QG-DNAの濃度は、1 μM 以上が好ましいと考えられた。   In order to obtain a sufficient reaction rate, the molar concentration ratio of NK6-AP to Z-QG-DNA is preferably 2 or more, and it is considered necessary, and the concentration of Z-QG-DNA is 1 μM or more was considered preferable.

〔実施例8：複合体の精製を必要としない核酸部位選択的なタンパク質固定化〕
複合体を精製せずに、核酸部位選択的なタンパク質固定化に用いた。また、新たなコントロール実験として、非相補鎖DNAを提示したプレートへのNK6-AP-DNA複合体の固定化も試みた。 [Example 8: Nucleic acid site-selective protein immobilization that does not require purification of the complex]
The complex was used for nucleic acid site selective protein immobilization without purification. In addition, as a new control experiment, we attempted to immobilize the NK6-AP-DNA complex on a plate displaying non-complementary strand DNA.

方法：
実験は、下記の手順にしたがって行った。
1）アビジンコートされた96-wellプレートを、TBST (25mM Tris, 2.7mM KCl, 0.137M NaCl, 0.05 vol% Tween20)でprewashした。
2）100 μLの500 nM biotin-cDNA（実施例4で用いたものと同じ。）、またはbiotin-non-cDNA（DNA部分の配列は 5'-biotin-(CH2)6-ACC CTT CCT C-3'（配列番号：27））それぞれをTBSに溶解して加え、1時間インキュベートした後、TBSTで洗浄した。
3）実施例7における反応溶液（5倍のNK6-AP濃度の条件下において、3時間反応を行ったもの）を2000倍希釈したものを100 μL加え、1時間インキュベートした後、TBSTで洗浄した。
4）ECF基質（アマシャム バイオサイエンス株式会社）を加えた。
5）AP活性を、FX-Pro molecular imager（Bio-Rad）で検出した（Ex 430 nm/Em 560 nm）。 Method:
The experiment was performed according to the following procedure.
1) A 96-well plate coated with avidin was prewashed with TBST (25 mM Tris, 2.7 mM KCl, 0.137 M NaCl, 0.05 vol% Tween20).
2) 100 μL of 500 nM biotin-cDNA (same as used in Example 4) or biotin-non-cDNA (DNA part sequence is 5'-biotin- (CH 2 ) 6 -ACC CTT CCT C -3 ′ (SEQ ID NO: 27) was dissolved in TBS, added, incubated for 1 hour, and washed with TBST.
3) 100 μL of the reaction solution in Example 7 (reacted for 3 hours under conditions of 5 times NK6-AP concentration) diluted 2000 times was added, incubated for 1 hour, and then washed with TBST .
4) ECF substrate (Amersham Biosciences) was added.
5) AP activity was detected with FX-Pro molecular imager (Bio-Rad) (Ex 430 nm / Em 560 nm).

結果：
結果を図13に示した。相補鎖を固定化したウェルにのみAP活性が検出されたことから、反応溶液を精製することなく、NK6-AP-Z-QG-DNAを固定化可能であることが明らかであった。また非相補鎖には固定化されないことが明らかとなった。 result:
The results are shown in FIG. Since AP activity was detected only in the wells to which the complementary strand had been immobilized, it was clear that NK6-AP-Z-QG-DNA could be immobilized without purifying the reaction solution. It was also revealed that it was not immobilized on the non-complementary strand.

図1は、Z-QG-DNAの調製スキームを示した図である。FIG. 1 is a diagram showing a preparation scheme of Z-QG-DNA. 図2は、CK6-AP又はNK6-APとZ-QC-DNAとから、MTGを用いて複合体を調製した実験の結果を示した写真である（実施例1）。FIG. 2 is a photograph showing the results of an experiment in which a complex was prepared from CK6-AP or NK6-AP and Z-QC-DNA using MTG (Example 1). 図3は、複合体形成実験に関し、反応（NK6-AP(pH7.0)）前後におけるAP活性を比較したグラフである（実施例1）。FIG. 3 is a graph comparing the AP activity before and after the reaction (NK6-AP (pH 7.0)) in the complex formation experiment (Example 1). 図4は、APの代わりにEGFP又はGSTを同様に用いて、DNAとの複合体を調製した実験の結果を示した写真である（実施例2）。FIG. 4 is a photograph showing the results of an experiment in which a complex with DNA was prepared in the same manner using EGFP or GST instead of AP (Example 2). 図5は、異なる長さのZ-QC-DNAとNK6-APとの複合体を調製した実験の結果を示した写真である（実施例3）。FIG. 5 is a photograph showing the results of an experiment in which complexes of different lengths of Z-QC-DNA and NK6-AP were prepared (Example 3). 図6は、AP-DNA複合体の固定化の概念を示した図である。FIG. 6 is a diagram showing the concept of immobilization of AP-DNA complex. 図7は、DNAハイブリダイゼーションを利用するタンパク質の固定化の概念図、及びそれに関する実験の結果を示した写真からなる。FIG. 7 is a conceptual diagram of protein immobilization using DNA hybridization and a photograph showing the results of an experiment relating thereto. 図8は、DNAアプタマーとAP-DNA複合体とを組み合わせた小分子（ATP）検出を示した図である。FIG. 8 is a diagram showing small molecule (ATP) detection in which a DNA aptamer and an AP-DNA complex are combined. 図9は、41merのアプタマーを用いたATP検出実験に関し、ATP濃度と蛍光強度との関係を示したグラフである。FIG. 9 is a graph showing the relationship between ATP concentration and fluorescence intensity in an ATP detection experiment using a 41-mer aptamer. 図10は、CK6-AP又はNK6-APとZ-QC-DNAとからMTGを用いて複合体を調製する際のpHの与える影響を検討した実験の結果を示した写真である。AはCK6-AP、BはNK6-APについての結果を示す。FIG. 10 is a photograph showing the results of an experiment examining the effect of pH on the preparation of a complex using MTG from CK6-AP or NK6-AP and Z-QC-DNA. A shows the results for CK6-AP and B for NK6-AP. 図11は、タンパク質過剰の条件下で、NK6-APとZ-QC-DNAとから、MTGを用いて複合体を調製した実験の反応効率を示したグラフである（実施例7）。FIG. 11 is a graph showing the reaction efficiency of an experiment in which a complex was prepared using MTG from NK6-AP and Z-QC-DNA under protein excess conditions (Example 7). 図12は、Z-QG-DNA濃度に対し5倍のNK6-AP濃度の条件下において、連結反応率の時間変化測定を行った結果のグラフである（実施例7）。FIG. 12 is a graph showing the results of time-dependent measurement of the ligation reaction rate under the condition of NK6-AP concentration 5 times higher than the Z-QG-DNA concentration (Example 7). 図13は、複合体の精製を必要としない核酸部位選択的な固定化タンパク質固定化の実験の結果を示した写真である（実施例8）。FIG. 13 is a photograph showing the results of a nucleic acid site-selective immobilized protein immobilization experiment that does not require purification of the complex (Example 8).

Claims (16)

トランスグルタミナーゼ（TGase）を用いて、ペプチド又はタンパク質へ部位特異的に外来分子を連結する方法であって：
ペプチド又はタンパク質が、TGaseが認識可能なリシン（Lys）残基又は第１級アミンを有するものであり、そして
分子が、アニオン性であり、かつTGaseが認識可能なグルタミン（Gln）残基を有するものである、前記方法。 A method of site-specifically linking a foreign molecule to a peptide or protein using transglutaminase (TGase):
The peptide or protein has a lysine (Lys) residue or primary amine that can be recognized by TGase, and the molecule has an anionic and glutamine (Gln) residue that can be recognized by TGase Said method. 分子が、TGaseが認識可能なGln残基を有するDNA、PNA又はRNAである、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the molecule is DNA, PNA or RNA having a Gln residue recognizable by TGase. TGaseが微生物由来のものであり、かつTGaseが認識可能なGln残基（Q）が、カルボベンゾイル-L-グルタミルグリシン（Z-QG）、又はLLQG、LAQG、LGQG、PLAQSH、FERQHMDS、若しくはTEQKLISEEDLのアミノ酸配列からなるペプチド、又はGLGQGGG、GFGQGGG、GVGQGGG、若しくはGGLQGGGのアミノ酸配列からなる、N末端保護ペプチド（好ましくは、N末端がアセチル基又はL-3,4-ジヒドロキシルフェニルアラニル基で保護されたペプチド）として存在するか、又は
TGaseがほ乳類由来のものであり、かつTGaseが認識可能なGln残基（Q）が、Z-QG、カルボベンゾイル-L-グルタミルフェニルアラニン（Z-QF）、又はEAQQIVMのアミノ酸配列からなるペプチド、又はGGGQLGG、GGGQVGG、GGGQRGG、GQQQLG、PNPQLPF若しくはPKPQQFMのアミノ酸配列からなる、N末端保護ペプチド（好ましくは、N末端がアセチル基又はL-3,4-ジヒドロキシルフェニルアラニル基で保護されたペプチド）として存在する、請求項３に記載の方法。 Gln residue (Q) that TGase is derived from microorganisms and TGase can recognize is carbobenzoyl-L-glutamylglycine (Z-QG), or LLQG, LAQG, LGQG, PLAQSH, FERQHMDS, or TEQKLISEEDL A peptide comprising an amino acid sequence, or an N-terminal protected peptide comprising an amino acid sequence of GLGQGGG, GFGQGGG, GVGQGGG, or GGLQGGG (preferably the N-terminal is protected with an acetyl group or an L-3,4-dihydroxylphenylalanyl group. Peptide) or
A peptide in which TGase is derived from a mammal and the Gln residue (Q) recognizable by TGase is an amino acid sequence of Z-QG, carbobenzoyl-L-glutamylphenylalanine (Z-QF), or EAQQIVM, or As an N-terminal protected peptide consisting of the amino acid sequence of GGGQLGG, GGGQVGG, GGGQRGG, GQQQLG, PNPQLPF or PKPQQFM (preferably a peptide whose N-terminal is protected with an acetyl group or an L-3,4-dihydroxylphenylalanyl group) 4. A method according to claim 3 present. TGaseが認識可能なGln残基を有するアニオン性分子に対する、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するペプチド又はタンパク質のモル濃度比が、2以上（好ましくは5以上）である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。   A molar concentration ratio of a peptide or protein having a Lys residue or primary amine recognizable to TGase to an anionic molecule having a Gln residue recognizable by TGase is 2 or more (preferably 5 or more). The method according to any one of claims 1 to 3. TGaseを用いて、ペプチド又はタンパク質と外来分子との複合体を製造する方法であって：
分子が、アニオン性であり、かつTGaseが認識可能なGln残基を有し；そして
ペプチド又はタンパク質が、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するものである、前記方法。 A method for producing a complex of a peptide or protein and a foreign molecule using TGase comprising:
Said method wherein the molecule is anionic and has a Gln residue recognizable by TGase; and the peptide or protein has a Lys residue or primary amine recognizable by TGase. 分子が、TGaseが認識可能なGln残基を有するDNA、PNA又はRNAである、請求項５に記載の方法。   The method according to claim 5, wherein the molecule is DNA, PNA or RNA having a Gln residue recognizable by TGase. TGaseが微生物由来のものであり、かつTGaseが認識可能なGln残基（Q）が、カルボベンゾイル-L-グルタミルグリシン（Z-QG）、又はLLQG、LAQG、LGQG、PLAQSH、FERQHMDS、若しくはTEQKLISEEDLのアミノ酸配列からなるペプチド、又はGLGQGGG、GFGQGGG、GVGQGGG、若しくはGGLQGGGのアミノ酸配列からなる、N末端保護ペプチド（好ましくは、N末端がアセチル基又はL-3,4-ジヒドロキシルフェニルアラニル基で保護されたペプチド）として存在するか、又は
TGaseがほ乳類由来のものであり、かつTGaseが認識可能なGln残基（Q）が、Z-QG、カルボベンゾイル-L-グルタミルフェニルアラニン（Z-QF）、又はEAQQIVMのアミノ酸配列からなるペプチド、又はGGGQLGG、GGGQVGG、GGGQRGG、GQQQLG、PNPQLPF若しくはPKPQQFMのアミノ酸配列からなる、N末端保護ペプチド（好ましくは、N末端がアセチル基又はL-3,4-ジヒドロキシルフェニルアラニル基で保護されたペプチド）として存在する、請求項６に記載の方法。 Gln residue (Q) that TGase is derived from microorganisms and TGase can recognize is carbobenzoyl-L-glutamylglycine (Z-QG), or LLQG, LAQG, LGQG, PLAQSH, FERQHMDS, or TEQKLISEEDL A peptide comprising an amino acid sequence, or an N-terminal protected peptide comprising an amino acid sequence of GLGQGGG, GFGQGGG, GVGQGGG, or GGLQGGG (preferably the N-terminal is protected with an acetyl group or an L-3,4-dihydroxylphenylalanyl group. Peptide) or
A peptide in which TGase is derived from a mammal and the Gln residue (Q) recognizable by TGase is an amino acid sequence of Z-QG, carbobenzoyl-L-glutamylphenylalanine (Z-QF), or EAQQIVM, or As an N-terminal protected peptide consisting of the amino acid sequence of GGGQLGG, GGGQVGG, GGGQRGG, GQQQLG, PNPQLPF or PKPQQFM (preferably a peptide whose N-terminal is protected with an acetyl group or an L-3,4-dihydroxylphenylalanyl group) 7. A method according to claim 6 present. TGaseが認識可能なGln残基を有するアニオン性分子に対する、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するペプチド又はタンパク質のモル濃度比が、2以上（好ましくは5以上）である、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。   A molar concentration ratio of a peptide or protein having a Lys residue or primary amine recognizable to TGase to an anionic molecule having a Gln residue recognizable by TGase is 2 or more (preferably 5 or more). The method according to any one of claims 5 to 7. TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するペプチド又はタンパク質と、TGaseが認識可能なGln残基を有する核酸とを、TGaseにより連結することにより得られる、ペプチド又はタンパク質−核酸複合体。   Peptide or protein-nucleic acid complex obtained by ligating a peptide or protein having a Lys residue or primary amine recognizable by TGase and a nucleic acid having a Gln residue recognizable by TGase with TGase . TGaseが認識可能なLys残基を有するペプチド又はタンパク質と、Z-QG、又はLLQG、LAQG、LGQG、PLAQSH、FERQHMDS、若しくはTEQKLISEEDLのアミノ酸配列からなるペプチド、又はGLGQGGG、GFGQGGG、GVGQGGG、若しくはGGLQGGGのアミノ酸配列からなる、N末端保護ペプチド（好ましくは、N末端がアセチル基又はL-3,4-ジヒドロキシルフェニルアラニル基で保護されたペプチド）、又はZ-QF、又はEAQQIVMのアミノ酸配列からなるペプチド、又はGGGQLGG、GGGQVGG、GGGQRGG、GQQQLG、PNPQLPF若しくはPKPQQFMのアミノ酸配列からなる、N末端保護ペプチド（好ましくは、N末端がアセチル基又はL-3,4-ジヒドロキシルフェニルアラニル基で保護されたペプチド）を有する核酸とが、ε（γ-グルタミル）リシン結合で連結している、請求項９に記載の複合体。   A peptide or protein having a Lys residue that can be recognized by TGase and a peptide consisting of an amino acid sequence of Z-QG, LLQG, LAQG, LGQG, PLAQSH, FERQHMDS, or TEQKLISEEDL, or an amino acid of GLGQGGG, GFGQGGG, GVGQGGG, or GGLQGGG N-terminal protected peptide consisting of a sequence (preferably a peptide whose N-terminal is protected with an acetyl group or L-3,4-dihydroxylphenylalanyl group), or a peptide consisting of an amino acid sequence of Z-QF or EAQQIVM Or an N-terminal protected peptide comprising an amino acid sequence of GGGQLGG, GGGQVGG, GGGQRGG, GQQQLG, PNPQLPF or PKPQQFM (preferably a peptide whose N-terminal is protected with an acetyl group or an L-3,4-dihydroxylphenylalanyl group 10. The complex according to claim 9, which is linked to a nucleic acid having a ε (γ-glutamyl) lysine bond. タンパク質が、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質又はグルタチオン-S-トランスフェラーゼである、請求項９又は１０に記載の複合体。   11. The complex according to claim 9 or 10, wherein the protein is alkaline phosphatase, green fluorescent protein or glutathione-S-transferase. ペプチド又はタンパク質の基材表面への固定化方法であって：
a) 基材表面に固定化された核酸、
b) ペプチド又はタンパク質−核酸複合体であって、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するペプチド又はタンパク質と、TGaseが認識可能なGln残基を有する核酸とを、TGaseにより連結することにより得られるものであり；さらに核酸部分が、固定化核酸の有する塩基配列の全部又は一部に相補的な核酸配列を有するものである、前記ペプチド又はタンパク質−核酸複合体
を用い、
固定化核酸と、ペプチド又はタンパク質−核酸複合体の核酸部分とを、ハイブリダイズさせて固定化物を形成する工程を含むものである、前記固定化方法。 A method for immobilizing a peptide or protein on a substrate surface comprising:
a) nucleic acid immobilized on the surface of the substrate,
b) A peptide or protein-nucleic acid complex, in which a peptide or protein having a Lys residue or primary amine that can be recognized by TGase and a nucleic acid having a Gln residue that can be recognized by TGase are linked by TGase Using the peptide or protein-nucleic acid complex, wherein the nucleic acid portion has a nucleic acid sequence complementary to all or part of the base sequence of the immobilized nucleic acid,
The said immobilization method which includes the process of hybridizing the nucleic acid part and the nucleic acid part of a peptide or protein-nucleic acid complex to form an immobilization product. ペプチド又はタンパク質の基材表面固定化物の製造方法であって：
a) 基材表面に固定化された核酸、
b) ペプチド又はタンパク質−核酸複合体であって、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するペプチド又はタンパク質と、TGaseが認識可能なGln残基を有する核酸とを、TGaseにより連結することにより得られるものであり；さらに核酸部分が、固定化核酸の有する塩基配列の全部又は一部に相補的な核酸配列を有するものである、前記ペプチド又はタンパク質−核酸複合体
を用い、
固定化核酸と、ペプチド又はタンパク質−核酸複合体の核酸部分とを、ハイブリダイズさせて固定化物を形成する工程を含むものである、前記固定化物の製造方法。 A method for producing a peptide or protein substrate surface immobilized product, comprising:
a) nucleic acid immobilized on the surface of the substrate,
b) A peptide or protein-nucleic acid complex, in which a peptide or protein having a Lys residue or primary amine that can be recognized by TGase and a nucleic acid having a Gln residue that can be recognized by TGase are linked by TGase Using the peptide or protein-nucleic acid complex, wherein the nucleic acid portion has a nucleic acid sequence complementary to all or part of the base sequence of the immobilized nucleic acid,
The method for producing an immobilized product, comprising a step of hybridizing an immobilized nucleic acid and a nucleic acid part of a peptide or protein-nucleic acid complex to form an immobilized product. 標的分子の検出方法であって：
ペプチド又はタンパク質−核酸複合体であって、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するペプチド又はタンパク質と、TGaseが認識可能なGln残基を有する核酸とを、TGaseにより連結することにより得られるものであり；さらにペプチド又はタンパク質部分が容易に検出可能な性質を有し、かつ核酸部分が標的分子に特異的に結合可能な塩基配列を有するものである、前記ペプチド又はタンパク質−核酸複合体を準備し；そして
対象物中に存在する標的分子と複合体とを核酸部分により特異的に結合させ；そして
結合している複合体を、ペプチド又はタンパク質部分により検出する工程を含む、前記検出方法。 A method for detecting a target molecule comprising:
A peptide or protein-nucleic acid complex, wherein a peptide or protein having a Lys residue or primary amine that can be recognized by TGase and a nucleic acid having a Gln residue that can be recognized by TGase are linked by TGase. A peptide or protein-nucleic acid, wherein the peptide or protein part has a property that can be easily detected, and the nucleic acid part has a base sequence that can specifically bind to a target molecule. Providing a complex; and specifically binding the target molecule and complex present in the object with a nucleic acid moiety; and detecting the bound complex with a peptide or protein moiety, Detection method. 標的分子が核酸であり、複合体の核酸部分が標的核酸分子の配列の全部又は一部と相補的な配列を有するものであり、
標的核酸分子と複合体の核酸部分とをハイブリダイズさせることにより特異的に結合させる工程を含む、請求項１４に記載の検出方法。 The target molecule is a nucleic acid, and the nucleic acid portion of the complex has a sequence complementary to all or part of the sequence of the target nucleic acid molecule;
The detection method according to claim 14, comprising a step of specifically binding the target nucleic acid molecule and the nucleic acid part of the complex by hybridizing. 標的分子の検出方法であって：
a) 基材表面に固定化された核酸、
b) 固定化核酸の全部又は一部に相補的な配列（固定化核酸相補的配列）、及び標的分子に特異性的に結合可能な配列（標的分子特異的配列）を有するアプタマー核酸、並びに
c) ペプチド又はタンパク質−核酸複合体であって、TGaseが認識可能なLys残基又は第１級アミンを有するペプチド又はタンパク質と、TGaseが認識可能なGln残基を有する核酸とを、TGaseにより連結することにより得られるものであり；さらにペプチド又はタンパク質部分が容易に検出可能な性質を有し、かつ核酸部分がアプタマー核酸の標的分子特異的配列の全部又は一部に相補的な配列を有するものである、前記ペプチド又はタンパク質−核酸複合体
を用い、
1) 固定化核酸に、アプタマー核酸を供し、固定化核酸とアプタマー核酸の固定化核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせることにより、アプタマー核酸を固定化し；
2) 固定化アプタマー核酸に、標的分子を含む可能性のある試料を供し、標的分子が存在する場合には標的分子とアプタマー核酸の標的分子特異的配列を有する部分とを結合させ、かつタンパク質−核酸複合体を供し、標的分子が存在しない場合にはタンパク質−核酸複合体の核酸部分とアプタマー核酸とをハイブリダイズさせることにより、タンパク質を固定化し；
3) 固定化タンパク質の有無又はその量をタンパク質の性質に基づいて検出することにより、試料中の標的分子を検出する
工程を含む、前記検出方法。 A method for detecting a target molecule comprising:
a) nucleic acid immobilized on the surface of the substrate,
b) an aptamer nucleic acid having a sequence complementary to all or part of the immobilized nucleic acid (immobilized nucleic acid complementary sequence) and a sequence capable of specifically binding to the target molecule (target molecule-specific sequence), and
c) A peptide or protein-nucleic acid complex, in which a peptide or protein having a Lys residue or primary amine recognizable by TGase and a nucleic acid having a Gln residue recognizable by TGase are linked by TGase In addition, the peptide or protein portion has an easily detectable property, and the nucleic acid portion has a sequence complementary to all or part of the target molecule-specific sequence of the aptamer nucleic acid. Using the peptide or protein-nucleic acid complex,
1) immobilizing aptamer nucleic acid by subjecting the immobilized nucleic acid to aptamer nucleic acid and hybridizing the immobilized nucleic acid and a portion having an immobilized nucleic acid complementary sequence of the aptamer nucleic acid;
2) A sample that may contain the target molecule is provided to the immobilized aptamer nucleic acid. When the target molecule is present, the target molecule is bound to the portion having the target molecule-specific sequence of the aptamer nucleic acid, and the protein- Providing a nucleic acid complex and immobilizing the protein by hybridizing the nucleic acid portion of the protein-nucleic acid complex and the aptamer nucleic acid in the absence of the target molecule;
3) The said detection method including the process of detecting the target molecule in a sample by detecting the presence or absence or quantity of the immobilized protein based on the property of the protein.
JP2006299023A 2006-08-02 2006-11-02 Site-specific linkage of foreign molecules to proteins and their use Active JP4604201B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006299023A JP4604201B2 (en) 2006-08-02 2006-11-02 Site-specific linkage of foreign molecules to proteins and their use

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006211451 2006-08-02
JP2006299023A JP4604201B2 (en) 2006-08-02 2006-11-02 Site-specific linkage of foreign molecules to proteins and their use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2008054658A true JP2008054658A (en) 2008-03-13
JP4604201B2 JP4604201B2 (en) 2011-01-05

Family

ID=39238145

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006299023A Active JP4604201B2 (en) 2006-08-02 2006-11-02 Site-specific linkage of foreign molecules to proteins and their use

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP4604201B2 (en)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009286701A (en) * 2008-05-27 2009-12-10 Kyushu Univ Substrate for protein immobilization and method for protein immobilization
WO2010002042A1 (en) * 2008-07-04 2010-01-07 国立大学法人 九州大学 Enzyme substrate for labeling of protein
WO2010010966A1 (en) 2008-07-24 2010-01-28 国立大学法人九州大学 Nucleoside triphosphate derivative, nucleic acid probe, multilabeled nucleic acid probe, method for production of multilabeled nucleic acid probe, and method for detection of target nucleic acid
JP2011026324A (en) * 2008-07-24 2011-02-10 Kyushu Univ Enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate derivative
JP2011169878A (en) * 2010-01-22 2011-09-01 Kyushu Univ Nucleic acid detecting kit
WO2013191265A1 (en) 2012-06-22 2013-12-27 国立大学法人九州大学 Method for producing protein-nucleic acid complex, and method for detecting target substance
JP2014156419A (en) * 2013-02-15 2014-08-28 Kyushu Univ Fusion protein, her2 protein detection probe, method of producing her2 protein detection probe and method of detecting her2 protein
WO2014208776A1 (en) 2013-06-28 2014-12-31 国立大学法人九州大学 PROTEIN-POLYMER COMPLEX, TGase SUBSTRATE-CONTAINING POLYMER, TGase SUBSTRATE-CONTAINING MONOMER, METHOD FOR PRODUCING PROTEIN-POLYMER COMPLEX, AND METHOD FOR IMPROVING PROTEIN FUNCTION ON INTERFACE OR IN VICINITIY OF INTERFACE OF SOLID-LIQUID
WO2019181235A1 (en) * 2018-03-19 2019-09-26 国立大学法人九州大学 Method for producing lipidated protein, and lipidated protein

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01101900A (en) * 1987-09-24 1989-04-19 Merck Patent Gmbh Method and reagent for conducting hybridization
JPH0889278A (en) * 1994-09-29 1996-04-09 Ajinomoto Co Inc Modified protein for introducing gene and its production
JP2000300287A (en) * 1999-03-15 2000-10-31 Shinichiro Nishimura Introduction of sugar chain by using transglutaminase
US20020172968A1 (en) * 2001-02-22 2002-11-21 Hongxiang Liu Biochips comprising nucleic acid/protein conjugates

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01101900A (en) * 1987-09-24 1989-04-19 Merck Patent Gmbh Method and reagent for conducting hybridization
JPH0889278A (en) * 1994-09-29 1996-04-09 Ajinomoto Co Inc Modified protein for introducing gene and its production
JP2000300287A (en) * 1999-03-15 2000-10-31 Shinichiro Nishimura Introduction of sugar chain by using transglutaminase
US20020172968A1 (en) * 2001-02-22 2002-11-21 Hongxiang Liu Biochips comprising nucleic acid/protein conjugates

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009286701A (en) * 2008-05-27 2009-12-10 Kyushu Univ Substrate for protein immobilization and method for protein immobilization
WO2010002042A1 (en) * 2008-07-04 2010-01-07 国立大学法人 九州大学 Enzyme substrate for labeling of protein
JPWO2010002042A1 (en) * 2008-07-04 2011-12-22 国立大学法人九州大学 Enzyme substrate for protein labeling
US20110184147A1 (en) * 2008-07-04 2011-07-28 Kyushu University, National University Corporation Enzyme substrate for labeling of protein
JP4621926B2 (en) * 2008-07-24 2011-02-02 国立大学法人九州大学 Enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate, nucleic acid probe, multilabeled nucleic acid probe, method for producing multilabeled nucleic acid probe, and method for detecting target nucleic acid
JP2011026324A (en) * 2008-07-24 2011-02-10 Kyushu Univ Enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate derivative
JP2010047559A (en) * 2008-07-24 2010-03-04 Kyushu Univ Enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate, nucleic acid probe, multilabeled nucleic acid probe, method for production of multilabeled nucleic acid probe, and method for detection of target nucleic acid
WO2010010966A1 (en) 2008-07-24 2010-01-28 国立大学法人九州大学 Nucleoside triphosphate derivative, nucleic acid probe, multilabeled nucleic acid probe, method for production of multilabeled nucleic acid probe, and method for detection of target nucleic acid
US8198418B2 (en) 2008-07-24 2012-06-12 Kyushu University, National University Corporation Nucleoside triphosphate derivative, nucleic acid probe, multilabeled nucleic acid probe, method for production of multilabeled nucleic acid probe, and method for detection of target nucleic acid
JP2011169878A (en) * 2010-01-22 2011-09-01 Kyushu Univ Nucleic acid detecting kit
JP2014003934A (en) * 2012-06-22 2014-01-16 Kyushu Univ Method for producing protein-nucleic acid complex and method for detecting target
WO2013191265A1 (en) 2012-06-22 2013-12-27 国立大学法人九州大学 Method for producing protein-nucleic acid complex, and method for detecting target substance
US9388454B2 (en) 2012-06-22 2016-07-12 Kyushu University, Nat'l University Corporation Method for producing protein-nucleic acid conjugate, and method for detecting target substance
JP2014156419A (en) * 2013-02-15 2014-08-28 Kyushu Univ Fusion protein, her2 protein detection probe, method of producing her2 protein detection probe and method of detecting her2 protein
WO2014208776A1 (en) 2013-06-28 2014-12-31 国立大学法人九州大学 PROTEIN-POLYMER COMPLEX, TGase SUBSTRATE-CONTAINING POLYMER, TGase SUBSTRATE-CONTAINING MONOMER, METHOD FOR PRODUCING PROTEIN-POLYMER COMPLEX, AND METHOD FOR IMPROVING PROTEIN FUNCTION ON INTERFACE OR IN VICINITIY OF INTERFACE OF SOLID-LIQUID
JPWO2014208776A1 (en) * 2013-06-28 2017-02-23 国立大学法人九州大学 Protein-polymer complex, TGase substrate-containing polymer, TGase substrate-containing monomer, method for producing protein-polymer complex, and method for enhancing protein function at or near the solid-liquid interface
US9688777B2 (en) 2013-06-28 2017-06-27 Hitachi, Ltd. Protein-polymer complex, TGase substrate-containing polymer, TGase substrate-containing monomer, method for producing protein-polymer complex, and method for improving protein function at solid-liquid interface or in vicinity of solid-liquid interface
WO2019181235A1 (en) * 2018-03-19 2019-09-26 国立大学法人九州大学 Method for producing lipidated protein, and lipidated protein
JPWO2019181235A1 (en) * 2018-03-19 2021-03-11 国立大学法人九州大学 Method for producing lipidated protein, and lipidated protein

Also Published As

Publication number Publication date
JP4604201B2 (en) 2011-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4604201B2 (en) Site-specific linkage of foreign molecules to proteins and their use
JP7097627B2 (en) Large molecule analysis using nucleic acid encoding
US9678080B2 (en) Bis-biotinylation tags
JP2021501576A (en) Methods and kits using nucleic acid encoding and / or labeling
JP2021501577A (en) Kit for analysis using nucleic acid encoding and / or labeling
JP4621926B2 (en) Enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate, nucleic acid probe, multilabeled nucleic acid probe, method for producing multilabeled nucleic acid probe, and method for detecting target nucleic acid
JP3989542B2 (en) Coded reaction cassette
JPH09506762A (en) Proximity sequence-compositions and methods for detecting target nucleic acid sequences utilizing enzyme molecules
JPWO2010002042A1 (en) Enzyme substrate for protein labeling
EP2358897B1 (en) Methods and compositions in particle-based detection of target molecules using linking molecules
EP2358898A1 (en) Methods and compositions in particle-based detection of target molecules using covalent bond forming reactive pairs
Sueoka et al. Chemistry‐driven epigenetic investigation of histone and DNA modifications
WO2023196642A1 (en) Methods and systems for processing polymeric analytes
US20090215029A1 (en) Methods of isolating and purifying nucleic acid-binding biomolecules and compositions including same
Kojima et al. Immobilization of proteins onto microbeads using a DNA binding tag for enzymatic assays
JPH02257897A (en) Enzyme-nucleic acid hydrazone and hydrazide combined composition and binding thereof
Sueoka et al. Personal Account
JP5509440B2 (en) Method for producing protein-nucleic acid complex and method for detecting target
WO2002074950A1 (en) Method of analyzing intermolecular interaction
JP5704481B2 (en) Nucleic acid detection kit
M. Palomo Click-chemistry in biocatalysis
WO2005030989A1 (en) Method of in situ detection of proteins using aptamers
JPWO2005001086A1 (en) Immobilized mRNA-puromycin conjugate and uses thereof
JP5146785B2 (en) Enzyme substrate modified nucleoside triphosphate derivatives
JP2002257832A (en) Protein labeling reagent

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20090928

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20090928

A975 Report on accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005

Effective date: 20091022

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20091126

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100125

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20100304

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100604

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20100729

A911 Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20100819

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20100906

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350