JP2008014802A

JP2008014802A - Cell electrophysiological sensor and manufacturing method therefor

Info

Publication number: JP2008014802A
Application number: JP2006186411A
Authority: JP
Inventors: Koji Ushio; 浩司牛尾; Masaya Nakatani; 将也中谷; Soichiro Hiraoka; 聡一郎平岡; Akiyoshi Oshima; 章義大島
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2006-07-06
Filing date: 2006-07-06
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2026-07-06
Also published as: JP4462241B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a cell electrophysiological sensor constituted so that an efficient structure is realized and measurement of high precision is performed in a state where a leakage current is reduced. <P>SOLUTION: The cell electrophysiological sensor is provided with a well 1, having a first through-hole 5 and a holding plate 2 having the second through hole 6 brought into contact with the lower part of the well 1 and constituted so that a flow channel plate 3 having a cavity 8 is brought into contact with the lower part of the holding plate 2 and a sensor chip 4 is brought into contact with the inside of the second through hole 6. At least the inner wall surface of the second through hole 6 and/or the outer wall surface of the sensor chip 4 is made hydrophilic, and the sensor chip 4 is joined with an adhesive 21. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞電気生理現象を測定するための細胞電気生理センサに関するものである。 The present invention relates to a cell electrophysiological sensor for measuring a cell electrophysiological phenomenon such as an intracellular potential or an extracellular potential used for measuring a physicochemical change generated by a cell activity.

電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。 The patch clamp method in electrophysiology is known as a method for measuring an ion channel existing in a cell membrane, and various functions of the ion channel have been elucidated by this patch clamp method. And the action of ion channels is an important concern in cytology, which has also been applied to drug development.

しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。 However, on the other hand, the patch clamp method requires an extremely high ability to insert a fine micropipette into a single cell with high precision in the measurement technique, so it requires skilled workers and requires high throughput. Is not an appropriate method.

このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要とせず、減圧を行うだけで自動に細胞を固定・測定を行うことができ、自動化システムとして適している。 For this reason, flat-type probes using microfabrication technology have been developed, and these do not require the insertion of a micropipette for each individual cell, and can automatically fix and measure cells simply by reducing the pressure. It is suitable as an automation system.

例えば、平板のデバイスに複数の貫通孔を設け、ここに接着した細胞の連続層を含み、電極で電位依存性のイオンチャンネル活性を測定する技術を開示している（特許文献１参照）。 For example, a technique is disclosed in which a plate-like device is provided with a plurality of through-holes and includes a continuous layer of cells adhered thereto, and a voltage-dependent ion channel activity is measured with an electrode (see Patent Document 1).

また、使用時に物体がオリフィスをシールし、これによって電気的に絶縁された電極間のインピーダンスの変化によって、媒体中の物体の電気的測定を行う装置について開示している（特許文献２参照）。
特表２００２−５１８６７８号公報特表２００３−５２７５８１号公報 In addition, an apparatus is disclosed in which an object seals an orifice during use, and an electrical measurement of an object in a medium is performed by a change in impedance between electrically insulated electrodes (see Patent Document 2).
JP 2002-518678 Gazette Japanese translation of PCT publication No. 2003-527581

しかしながら、前記従来の技術においては、複数の細胞の電気生理現象を一括して測定することができるが、測定対象の細胞数を増加させると一部に欠陥が発生したり、複雑になるという課題があった。 However, in the conventional technique, electrophysiological phenomena of a plurality of cells can be measured at once, but if the number of cells to be measured is increased, a defect is partially generated or complicated. was there.

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、測定対象の細胞数が増えた場合であっても、生産性に優れた効率的な細胞電気生理センサの構造を実現し、漏れ電流が少ない状態で高精度に測定することができる細胞電気生理センサとその製造方法を提供することを目的とする。 The present invention solves the above-described conventional problems, and realizes an efficient structure of a cell electrophysiological sensor excellent in productivity even when the number of cells to be measured is increased, and has a small leakage current. It is an object of the present invention to provide a cell electrophysiological sensor that can be measured with high accuracy in a state and a manufacturing method thereof.

前記従来の課題を解決するために、本発明は、第一の貫通孔を有するウエルと、このウエルの下方に当接した第二の貫通孔を有した保持プレートと、この保持プレートの下方に液体の流入口と流出口を両端に備えた空洞を有した流路プレートを当接し、前記第二の貫通孔の内部に第三の貫通孔を備えたダイアフラムを有したセンサチップを当接した細胞電気生理センサであって、少なくとも前記第二の貫通孔の内壁面、および／またはセンサチップの外壁面を親水性とし、接着剤によって前記センサチップを接合した構成とするものである。 In order to solve the conventional problem, the present invention provides a well having a first through hole, a holding plate having a second through hole in contact with the lower part of the well, and a lower part of the holding plate. A flow path plate having a cavity having a liquid inlet and an outlet at both ends is contacted, and a sensor chip having a diaphragm having a third through hole is contacted inside the second through hole. In the cell electrophysiological sensor, at least the inner wall surface of the second through hole and / or the outer wall surface of the sensor chip is made hydrophilic, and the sensor chip is joined by an adhesive.

本発明の細胞電気生理センサとその製造方法は、センサチップの外壁面、およびまたは第二の貫通孔の内壁面に親水性を付与し、接着剤で接合する際に、接合面が親水性を有していると接着剤との濡れ性が良くなり、接合強度が向上し、センサチップと第二の貫通孔の隙間からの液漏れによる漏れ電流を減少させることができることによって、高精度に測定することができるとともに量産性に優れた細胞電気生理センサとその製造方法を実現するものである。 The cell electrophysiological sensor and the method for producing the same of the present invention impart hydrophilicity to the outer wall surface of the sensor chip and / or the inner wall surface of the second through-hole, and the bonding surface is hydrophilic when bonded with an adhesive. If it has, the wettability with the adhesive will be improved, the bonding strength will be improved, and the leakage current due to liquid leakage from the gap between the sensor chip and the second through hole can be reduced, so measurement with high accuracy It is possible to realize a cell electrophysiological sensor that can be manufactured and is excellent in mass productivity and a method for manufacturing the same.

（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサとその製造方法について、図面を参照しながら説明する。 (Embodiment 1)
Hereinafter, the cell electrophysiological sensor and the manufacturing method thereof according to Embodiment 1 of the present invention will be described with reference to the drawings.

図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図であり、図２は要部拡大断面図である。 FIG. 1 is a cross-sectional view of a cell electrophysiological sensor according to Embodiment 1 of the present invention, and FIG. 2 is an enlarged cross-sectional view of a main part.

図１および図２において、１は樹脂よりなるウエルであり、このウエル１に細胞外液１８を貯留しておくための第一の貫通孔５を形成している。この第一の貫通孔５は断面形状をテーパー状に形成しておくことによって、電解液などの液体または細胞などを投入するときに効率が良い。 In FIG. 1 and FIG. 2, reference numeral 1 denotes a well made of resin, and a first through hole 5 for storing the extracellular fluid 18 is formed in the well 1. The first through-hole 5 is formed with a tapered cross-sectional shape, so that it is efficient when a liquid such as an electrolytic solution or cells are introduced.

また、前記ウエル１の下方には第二の貫通孔６を有した樹脂よりなる保持プレート２を当接しており、この保持プレート２の第二の貫通孔６の内部には、少なくとも一つの第三の貫通孔７を有したダイアフラム９を備えたセンサチップ４がセットされている。このセンサチップ４はシリコン基板をエッチング加工することによって、ダイアフラム９の厚み；２０μｍ、第三の貫通孔７の開口径：１〜３μｍφの寸法形状で一体的に加工することによって形成している。そして、この第三の貫通孔７の開口径は細胞２０の大きさによって適宜選択することができる。 A holding plate 2 made of resin having a second through hole 6 is in contact with the lower portion of the well 1, and at least one first through hole is formed in the second through hole 6 of the holding plate 2. A sensor chip 4 having a diaphragm 9 having three through holes 7 is set. The sensor chip 4 is formed by etching a silicon substrate and integrally processing the diaphragm 9 with a thickness of 20 μm and an opening diameter of the third through-hole 7 of 1 to 3 μmφ. The opening diameter of the third through hole 7 can be appropriately selected depending on the size of the cell 20.

このように、シリコンをセンサチップ４の構成材料とすることによって効率よく作製することができるとともに、その生産設備も入手が容易である。 Thus, by using silicon as a constituent material of the sensor chip 4, it can be efficiently manufactured and its production equipment is also easily available.

さらに、前記保持プレート２の下方には、その両端に液体を流出入させるための空洞８を有した流路プレート３を当接して細胞電気生理センサを構成しており、第三の貫通孔７の上面に細胞２０を密着保持し、この細胞の電気生理現象を測定することができるようになっている。前記空洞８には流入口１６から細胞内液１９を充填し、流出口１７から吸引ポンプなどを用いて吸引することによって細胞内液１９を充填することができる。 Furthermore, a cell electrophysiological sensor is configured below the holding plate 2 by contacting a flow path plate 3 having a cavity 8 for allowing a liquid to flow in and out at both ends of the holding plate 2. The cell 20 is held in close contact with the upper surface of the cell, and the electrophysiological phenomenon of the cell can be measured. The cavity 8 can be filled with the intracellular fluid 19 from the inlet 16 and sucked from the outlet 17 using a suction pump or the like.

また、ウエル１、保持プレート２、流路プレート３はすべて樹脂で構成しておくことが都合がよい、特に好ましくは熱可塑性樹脂である。これにより、これらの材料は熱溶着などの手段を用いることによって特に接着剤を使用することなく互いに強固に接合できる。さらに好ましくは、これらの熱可塑性樹脂はポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、オレフィンポリマー、ポリメタクリル酸メチルアセテート（ＰＭＭＡ）のいずれか、またはこれらの組み合わせである。これらの材料は熱溶着によって接合を行いやすい。さらに好ましくは、これら熱可塑性樹脂が環状オレフィンポリマー、線状オレフィンポリマー、またはこれらが重合した環状オレフィンコポリマー、またはポリエチレン（ＰＥ）からなる熱可塑性樹脂が作業性、製造コスト、材料の入手性の観点から好ましい。特に、環状オレフィンコポリマーは透明性、アルカリ・酸などの無機系薬剤に対する耐性が強く、本発明の製造方法もしくは使用環境に適している。またこれらの材料は紫外線を透過させることができるため、後で説明を行う接着剤の硬化時においても効果を発揮する。 Further, it is convenient that the well 1, the holding plate 2, and the flow path plate 3 are all made of a resin, and particularly preferably a thermoplastic resin. Thereby, these materials can be firmly bonded to each other without using an adhesive by using means such as heat welding. More preferably, these thermoplastic resins are polycarbonate (PC), polyethylene (PE), olefin polymer, polymethyl methacrylate acetate (PMMA), or a combination thereof. These materials are easily joined by thermal welding. More preferably, the thermoplastic resin is a cyclic olefin polymer, a linear olefin polymer, a cyclic olefin copolymer obtained by polymerizing them, or a thermoplastic resin made of polyethylene (PE). From the viewpoint of workability, production cost, and availability of materials. To preferred. In particular, the cyclic olefin copolymer is highly transparent and highly resistant to inorganic chemicals such as alkalis and acids, and is suitable for the production method or use environment of the present invention. Moreover, since these materials can transmit ultraviolet rays, they are also effective when the adhesive is cured as will be described later.

そして、保持プレート２の第二の貫通孔６にはセンサチップ４を埋め込んでおり、このセンサチップ４は材質がシリコンであって、フォトリソグラフィー、ドライエッチングなどの半導体加工技術によって形成し、ダイアフラム９と、このダイアフラム９に少なくとも一つの第三の貫通孔７を形成している。この第三の貫通孔７の直径は５μｍ以下が望ましく、細胞を保持するために最適な大きさの貫通孔となっている。このように、センサチップ４と、保持プレート２を別々に作製しておいて、保持プレート２の第二の貫通孔６にセンサチップ４をはめ込むことによって効率よく細胞電気センサを作製することができる。さらに、製造不良のセンサチップ４があった場合においても、センサチップ４の交換を容易に行うことができる。 A sensor chip 4 is embedded in the second through hole 6 of the holding plate 2. The sensor chip 4 is made of silicon and is formed by a semiconductor processing technique such as photolithography or dry etching. At least one third through hole 7 is formed in the diaphragm 9. The diameter of the third through-hole 7 is desirably 5 μm or less, and the through-hole has an optimal size for holding cells. As described above, the sensor chip 4 and the holding plate 2 are separately manufactured, and the cell chip sensor can be efficiently manufactured by fitting the sensor chip 4 into the second through hole 6 of the holding plate 2. . Furthermore, even when there is a defectively manufactured sensor chip 4, the sensor chip 4 can be easily replaced.

そして、保持プレート２にシリコン基板を用いて、一体的に作製した場合にはコストもかかり、歩留まりも悪くなり、リペア性も有しない構成となる。 When the silicon substrate is used for the holding plate 2 and it is integrally manufactured, the cost is increased, the yield is deteriorated, and the repair property is not provided.

そして、本実施の形態１におけるセンサチップ４の外壁面には親水性を付与しておくことが重要である。親水性を付与するための方法としては、センサチップ４の表面を化学的、あるいは物理的な処理を行って親水性を付与しておく、あるいは親水性を有する膜などを形成することによっても同様の効果を発揮することができる。そして、このセンサチップ４の表面に親水性を付与する方法としては、酸素プラズマによる炭素化合物の除去、紫外線照射による有機物の分解除去、あるいは硫酸、過酸化水素などによる湿式処理などによる炭素原子を含む有機物質の分解除去が親水性を高めうるためには非常に効果的であり、量産性にも優れている。 And it is important to provide hydrophilicity to the outer wall surface of the sensor chip 4 in the first embodiment. As a method for imparting hydrophilicity, the surface of the sensor chip 4 may be chemically or physically treated to impart hydrophilicity, or a hydrophilic film may be formed. The effect of can be demonstrated. The method for imparting hydrophilicity to the surface of the sensor chip 4 includes carbon atoms by removing carbon compounds with oxygen plasma, decomposing and removing organic substances by ultraviolet irradiation, or wet treatment with sulfuric acid, hydrogen peroxide, or the like. It is very effective for decomposing and removing organic substances to increase hydrophilicity, and is excellent in mass productivity.

また、図２では、薄膜プロセスを用いて親水性膜１０を形成した例を示しており、この親水性を有した親水性膜１０を設けることによって、親水性の効果を発揮することができる。 FIG. 2 shows an example in which the hydrophilic film 10 is formed by using a thin film process. By providing this hydrophilic film 10 having hydrophilicity, a hydrophilic effect can be exhibited.

そして、このセンサチップ４の外壁面に薄膜プロセスを用いて親水性を付与する方法としては、センサチップ４の外壁面にシリコン酸化物、またはシリコン窒化物をスパッタ法、ＣＶＤ法などの薄膜プロセスを用いて成膜することによって、例えば５００Å〜１０μｍのシリコン酸化物薄膜、あるいはシリコン窒化物薄膜を形成することによって、親水性膜１０を形成することができる。 As a method for imparting hydrophilicity to the outer wall surface of the sensor chip 4 using a thin film process, a thin film process such as sputtering or CVD using silicon oxide or silicon nitride is applied to the outer wall surface of the sensor chip 4. The hydrophilic film 10 can be formed, for example, by forming a silicon oxide thin film or a silicon nitride thin film having a thickness of 500 to 10 μm.

また、そのときの親水性は接触角表示で１０度以下が好ましい。この接触角は、固体表面の上に純水などの液滴を乗せ、平衡になった状態で、液滴表面と固体表面のなす角度をいう。そして、その測定方法は一般的にθ／２法を用いることができる。その方法は液滴の左右端点と頂点を結ぶ直線の、固体表面に対する角度から接触角を求めることができる。または分度器などを用いて測ることも可能である。 The hydrophilicity at that time is preferably 10 degrees or less in terms of contact angle. This contact angle refers to an angle formed between the droplet surface and the solid surface in a state where a droplet such as pure water is placed on the solid surface and is in equilibrium. And the measuring method can generally use the θ / 2 method. In this method, the contact angle can be obtained from the angle of the straight line connecting the left and right end points and the vertex of the droplet with respect to the solid surface. It is also possible to measure using a protractor or the like.

次に、図１に示すように第一の電極１４と第二の電極１５を設けているが、これらの電極１４，１５は細胞の電気生理現象によって発生する電気的指標、例えば電位、電流などを測定するためのものであるが、これらの形状、材質は特に限定するものではない。 Next, as shown in FIG. 1, a first electrode 14 and a second electrode 15 are provided. These electrodes 14 and 15 are electrical indicators generated by the electrophysiological phenomenon of the cells, such as potentials and currents. However, these shapes and materials are not particularly limited.

そして、このような親水性を付与したセンサチップ４を第二の貫通孔６の内部の所定の位置に配置し、第二の貫通孔６の周縁部とセンサチップ４のダイアフラム９の周縁部を跨ぐように接着剤２１を塗布して前記センサチップ４と保持プレート２を接合するとき、接着剤２１としては紫外線硬化の樹脂材料を用いることが生産性の観点から効率的である。 Then, the sensor chip 4 having such hydrophilicity is arranged at a predetermined position inside the second through hole 6, and the peripheral part of the second through hole 6 and the peripheral part of the diaphragm 9 of the sensor chip 4 are arranged. When the adhesive 21 is applied so as to straddle and the sensor chip 4 and the holding plate 2 are joined, it is efficient from the viewpoint of productivity to use an ultraviolet curable resin material as the adhesive 21.

そして、この紫外線硬化型の樹脂を接着剤として用いた場合、第二の貫通孔６の内壁面、および／またはセンサチップ４の外壁面を親水性に優れた特性を有しているとき、接着剤は第二の貫通孔６とセンサチップ４の外壁面との隙間を侵入しやすくなる。その結果として、表面に接着剤２１を塗布するだけで、第二の貫通孔６との内壁面とセンサチップ４の外壁面の隙間に対しても、接着剤２１である樹脂が容易に浸透する。その後、接着剤２１を硬化させることによってシール性に優れた細胞電気生理センサを実現することができる。例えば、前記のような親水性を付与した第二の貫通孔６とセンサチップ４の外壁面との隙間が数μｍの場合において、接着剤２１である樹脂が浸透する距離は１０〜５０μｍであった。一方、疎水性を有した場合における浸透性は数μｍ以下であった。 When this ultraviolet curable resin is used as an adhesive, the inner wall surface of the second through-hole 6 and / or the outer wall surface of the sensor chip 4 has an excellent hydrophilic property. The agent easily enters the gap between the second through hole 6 and the outer wall surface of the sensor chip 4. As a result, simply by applying the adhesive 21 to the surface, the resin as the adhesive 21 can easily penetrate into the gap between the inner wall surface of the second through-hole 6 and the outer wall surface of the sensor chip 4. . Thereafter, by curing the adhesive 21, a cell electrophysiological sensor having excellent sealing properties can be realized. For example, when the gap between the second through hole 6 imparted with hydrophilicity as described above and the outer wall surface of the sensor chip 4 is several μm, the distance that the resin as the adhesive 21 penetrates is 10 to 50 μm. It was. On the other hand, the permeability when hydrophobic was several μm or less.

次に、本発明の細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理活動を測定する方法について簡単に述べる。 Next, a method for measuring cell electrophysiological activity using the cell electrophysiological sensor of the present invention will be briefly described.

まず、ウエル１に細胞外液１８を、空洞８に細胞内液１９をウエル１の流入口１６から流出口１７にかけて吸引することで充填する。ここで細胞内液１９とは例えば哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ⁺イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ⁺イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液であり、細胞外液１８とはＫ⁺イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ⁺イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液である。この状態で、ウエル１の内部に設置した第一の電極１４と空洞８の内部に設置した第二の電極１５との間で、１００ｋΩ〜１０ＭΩ程度の導通抵抗値を観測することができる。これは細胞内液１９あるいは細胞外液１８が浸透し、第一の電極１４と第二の電極１５の間で電気回路が形成されるからである。 First, the extracellular fluid 18 is filled into the well 1 and the intracellular fluid 19 is filled into the cavity 8 by sucking from the inlet 16 to the outlet 17 of the well 1. Here, for example, in the case of mammalian muscle cells, the intracellular fluid 19 is typically an electrolyte solution to which K ⁺ ions are added at about 155 mM, Na ⁺ ions at about 12 mM, and Cl ⁻ ions at about 4.2 mM. The liquid 18 is an electrolytic solution to which about 4 mM of K ⁺ ions, about 145 mM of Na ⁺ ions, and about 123 mM of Cl ⁻ ions are added. In this state, a conduction resistance value of about 100 kΩ to 10 MΩ can be observed between the first electrode 14 installed inside the well 1 and the second electrode 15 installed inside the cavity 8. This is because the intracellular fluid 19 or the extracellular fluid 18 penetrates and an electric circuit is formed between the first electrode 14 and the second electrode 15.

次にウエル１側から細胞２０を投入する。なおセンサチップ４を第二の貫通孔６の内部に設置する方向として、ダイアフラム９が第一の貫通孔５側へ近くなるように配置しても良い。この選択は測定する細胞２０の性質によって最適に決定されるべきである。 Next, the cells 20 are introduced from the well 1 side. The sensor chip 4 may be disposed in the second through hole 6 so that the diaphragm 9 is closer to the first through hole 5 side. This selection should be optimally determined by the nature of the cell 20 being measured.

そして最後に、ウエル１の流入口１６または流出口１７の一方を減圧すると、細胞２０は第三の貫通孔７に引き付けられ、細胞２０が第三の貫通孔７を塞ぐことによって、ウエル１側と空洞８側の電気抵抗がＧΩ以上の十分に高い状態となる（ギガシールと呼ぶ）。このギガシールの状態において、細胞２０の電気生理活動によって細胞内外の電位が変化した場合には、わずかな電位差あるいは電流であっても高精度な測定が可能となる。 Finally, when one of the inlet 16 or the outlet 17 of the well 1 is depressurized, the cell 20 is attracted to the third through-hole 7, and the cell 20 closes the third through-hole 7. Then, the electric resistance on the side of the cavity 8 is sufficiently high (GΩ seal). In this giga-seal state, when the potential inside and outside the cell changes due to the electrophysiological activity of the cell 20, highly accurate measurement is possible even with a slight potential difference or current.

以上のように構成した細胞電気生理センサについて、以下にその製造方法を説明する。 The manufacturing method of the cell electrophysiological sensor configured as described above will be described below.

図３に示すようにまず始めに、センサチップ４はフォトリソグラフィー、ドライエッチング等の半導体加工技術を用いて、シリコンウエハなどからダイアフラム９を形成した後、このダイアフラム９に第三の貫通孔７を形成する。そして、個片化することによって一括して多数のセンサチップ４を作製することができる。 As shown in FIG. 3, first, the sensor chip 4 forms a diaphragm 9 from a silicon wafer or the like by using a semiconductor processing technique such as photolithography and dry etching, and then a third through hole 7 is formed in the diaphragm 9. Form. A large number of sensor chips 4 can be manufactured collectively by dividing into individual pieces.

その後、センサチップ４の外壁面に親水性膜１０を形成する。この親水性膜１０の形成法としては、酸素の介在した雰囲気中でのシリコンの熱酸化処理、あるいはＣＶＤ、スパッタ法などの薄膜プロセスを用いてシリコン化合物を成膜して形成することができる。この親水性膜１０の材料としては、シリコン酸化物やシリコン窒化物などが好ましい。これらの親水性膜１０は従来の方法を応用することによって容易に形成することができる。この親水性膜１０の効果については、後で詳細に説明する。 Thereafter, the hydrophilic film 10 is formed on the outer wall surface of the sensor chip 4. The hydrophilic film 10 can be formed by forming a silicon compound using a thermal oxidation process of silicon in an oxygen-containing atmosphere or a thin film process such as CVD or sputtering. As a material for the hydrophilic film 10, silicon oxide, silicon nitride, or the like is preferable. These hydrophilic films 10 can be easily formed by applying a conventional method. The effect of the hydrophilic film 10 will be described in detail later.

一方、保持プレート２は、まず下地となる電極材料を転写、めっき、薄膜プロセスなどの方法によって形成しておき、次に、例えばドリルあるいはレーザ加工によって穴開けを行い第二の貫通孔６を形成する。その後、フォトリソグラフィーによるパターニングを行い、さらにＡｇとＡｇＣｌを混合した電極をディスペンスまたはスクリーン印刷等の手法により第一の電極１４と第二の電極１５を形成する。なお、ドリルなどによる穴開けと、電極形成の工程順序は違っていてもよい。 On the other hand, the holding plate 2 is formed by first forming a base electrode material by a method such as transfer, plating or thin film process, and then forming a second through hole 6 by drilling, for example, by drilling or laser processing. To do. Thereafter, patterning by photolithography is performed, and further, a first electrode 14 and a second electrode 15 are formed by a technique such as dispensing or screen printing using a mixture of Ag and AgCl. It should be noted that the drilling process and the electrode forming process sequence may be different.

そして、ウエル１と流路プレート３は射出成型などによって金型による成型加工によって作製し、図１のような構成とすることができる。 The well 1 and the flow path plate 3 can be produced by molding using a mold by injection molding or the like, and can be configured as shown in FIG.

以上のような部材を用いて、まず保持プレート２とウエル１の接合を行う。この接合の方法としてはレーザ溶着による接合が好ましい。 First, the holding plate 2 and the well 1 are joined using the members as described above. As this joining method, joining by laser welding is preferable.

次に、センサチップ４を第二の貫通孔６の内部へ仮設置し、第二の貫通孔６の周縁部とセンサチップ４のダイアフラム９の周縁部を跨ぐように接着剤２１を塗布して固定する。この接着剤２１としてはＵＶ硬化型接着剤や熱硬化型接着剤を用いるとよい。ここで接着剤２１は親水性を有するセンサチップ４の外壁面と第二の貫通孔６の内壁面との間の隙間に浸透し、接着剤２１の硬化が完了するまで深さ方向へ浸透する。 Next, the sensor chip 4 is temporarily installed inside the second through hole 6, and an adhesive 21 is applied so as to straddle the peripheral edge of the second through hole 6 and the peripheral edge of the diaphragm 9 of the sensor chip 4. Fix it. As the adhesive 21, a UV curable adhesive or a thermosetting adhesive may be used. Here, the adhesive 21 penetrates into the gap between the outer wall surface of the sensor chip 4 having hydrophilicity and the inner wall surface of the second through-hole 6 and penetrates in the depth direction until the curing of the adhesive 21 is completed. .

ここで、接着剤２１によるセンサチップ４の第二の貫通孔６への接合が十分に行えていない場合、細胞２０の測定時において、細胞２０をトラップするためにセンサチップ４の第三の貫通孔７の上下空間に圧力差を発生させる必要があり、前記接着剤２１のはがれが発生したり、センサチップ４と第二の貫通孔６との間に隙間などがある場合、隙間から液漏れが発生することがあり、細胞２０の測定が行えない場合があった。しかしながら、本実施の形態１における細胞電気生理センサのようにセンサチップ４の外壁面、およびまたは第二の貫通孔６の内壁面の表面に親水性を付与したり、親水性膜１０を設けることによってセンサチップ４の外壁面、およびまたは第二の貫通孔６の内壁面の濡れ性が向上し、接着剤２１との親和性が高くなることによって界面の隙間にも接着剤２１が効率良く浸透する。その結果、接合の密着性が向上し、接着剤２１のはがれや液漏れを防止することができることから、細胞２０の測定を確実に行うことができる細胞電気生理センサを実現することができる。 Here, when the bonding of the sensor chip 4 to the second through-hole 6 by the adhesive 21 is not sufficiently performed, the third penetration of the sensor chip 4 to trap the cell 20 at the time of measurement of the cell 20. When a pressure difference needs to be generated in the space above and below the hole 7 and the adhesive 21 is peeled off or there is a gap between the sensor chip 4 and the second through hole 6, liquid leaks from the gap. May occur and measurement of the cells 20 may not be possible. However, like the cell electrophysiological sensor in the first embodiment, hydrophilicity is imparted to the outer wall surface of the sensor chip 4 and / or the inner wall surface of the second through-hole 6 or the hydrophilic film 10 is provided. As a result, the wettability of the outer wall surface of the sensor chip 4 and / or the inner wall surface of the second through-hole 6 is improved and the affinity with the adhesive 21 is increased, so that the adhesive 21 penetrates efficiently into the gaps at the interface. To do. As a result, the adhesiveness of the bonding is improved, and the adhesive 21 can be prevented from peeling off or leaking, so that a cell electrophysiological sensor capable of reliably measuring the cells 20 can be realized.

最後に、流路プレート３の接合を行い、図１に示すような細胞電気生理センサを作製することができる。 Finally, the flow path plate 3 is joined to produce a cell electrophysiological sensor as shown in FIG.

そして、ウエル１と保持プレート２、および保持プレート２と流路プレート３の接合方法としてはレーザによる溶着が好ましい。 As a method for joining the well 1 and the holding plate 2 and between the holding plate 2 and the flow path plate 3, welding by laser is preferable.

さらに、接着剤２１による第二の貫通孔６へのセンサチップ４の固定において、センサチップ４の内壁面に凹凸を形成した構造とすることによって、センサチップ４の外壁面と第二の貫通孔６の内壁面との間の接合強度を更に高めることから、さらに強固にセンサチップ４の第二の貫通孔６への固定を行うことができ、より接着剤２１のはがれや液漏れを防止し、これによって複数の細胞２０を一括して、確実に測定を行うことができる細胞電気生理センサを実現することができる。 Further, when the sensor chip 4 is fixed to the second through hole 6 by the adhesive 21, the outer wall surface of the sensor chip 4 and the second through hole are formed by forming an unevenness on the inner wall surface of the sensor chip 4. Since the bonding strength between the inner wall surface 6 and the inner wall surface 6 is further increased, the sensor chip 4 can be more firmly fixed to the second through-hole 6 and the adhesive 21 can be prevented from peeling off or leaking. Thus, it is possible to realize a cell electrophysiological sensor capable of measuring a plurality of cells 20 collectively and reliably.

また、センサチップ４の外壁面に設ける凹凸の形成法としては、センサチップ４の第三の貫通孔７とダイアフラム９をドライエッチングにより作成する際に、エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを用いることによって形成することができる。エッチングを促進するガスはＳＦ₆、ＣＦ₄などを用い、エッチングを抑制するガスはＣＨＦ₃、Ｃ₄Ｆ₈などを用いる。これはエッチングを促進するガスによってエッチングを少し行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜を少しだけ形成する。その後はエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスとを交互に使用し繰り返し行う。これによってセンサチップ４の外壁面に微小な凹凸を形成することができる。 Further, as a method of forming the unevenness provided on the outer wall surface of the sensor chip 4, when the third through hole 7 and the diaphragm 9 of the sensor chip 4 are formed by dry etching, a gas that promotes etching and a gas that suppresses etching. Can be formed. The gas that promotes etching uses SF ₆ , CF _4, etc., and the gas that suppresses etching uses CHF ₃ , C ₄ F _8, etc. In this method, after a little etching is performed with a gas that promotes etching, a protective film is formed only slightly with a gas that suppresses etching. Thereafter, the process is repeatedly performed by alternately using a gas that promotes etching and a gas that suppresses etching. As a result, minute irregularities can be formed on the outer wall surface of the sensor chip 4.

また、第二の貫通孔６の内壁に凹凸を設けることによっても、センサチップ４の外壁面と第二の貫通孔６の内壁面との間に浸透した接着剤２１との接触面が増加することによって接合を強固にすることができる。これによって、前記と同様の効果を発揮することができる。 Also, by providing irregularities on the inner wall of the second through hole 6, the contact surface with the adhesive 21 that has penetrated between the outer wall surface of the sensor chip 4 and the inner wall surface of the second through hole 6 increases. This can strengthen the bonding. As a result, the same effects as described above can be exhibited.

また、第二の貫通孔６の内壁面に設けた凹凸はドリルによる穴開け加工時に発生する凹凸を利用することができる。 Moreover, the unevenness | corrugation provided in the inner wall surface of the 2nd through-hole 6 can utilize the unevenness | corrugation which generate | occur | produces at the time of drilling with a drill.

また、接着剤２１が紫外線硬化型の接着剤であって、保持プレート２を紫外線光が透過する樹脂とすることによって、センサチップ４の側壁と第二の貫通孔６の内壁との間に接着剤２１が深く浸透した場合でも、保持プレート２が紫外線光を透過させるため、紫外線照射時に確実に接着剤２１を硬化させることができ、確実にセンサチップ４の第二の貫通孔６への固定を行うことができ、接着剤２１のはがれやセンサチップ４の外壁面と第二の貫通孔６の内壁面との隙間における液漏れを防止することができ、これによって細胞２０の測定を確実に行うことができる。 Further, the adhesive 21 is an ultraviolet curable adhesive, and the holding plate 2 is made of a resin that transmits ultraviolet light, thereby bonding between the side wall of the sensor chip 4 and the inner wall of the second through hole 6. Even when the agent 21 penetrates deeply, since the holding plate 2 transmits ultraviolet light, the adhesive 21 can be reliably cured at the time of ultraviolet irradiation, and the sensor chip 4 is securely fixed to the second through hole 6. And can prevent liquid leakage in the gap between the outer wall surface of the adhesive chip 21 and the outer wall surface of the sensor chip 4 and the inner wall surface of the second through hole 6, thereby reliably measuring the cells 20. It can be carried out.

（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサとその製造方法について図面を用いて説明する。 (Embodiment 2)
Next, a cell electrophysiological sensor and a method for manufacturing the same according to Embodiment 2 of the present invention will be described with reference to the drawings.

本実施の形態２における細胞電気生理センサの構成はほぼ実施の形態１の構成と同じであり、センサチップ４を第二の貫通孔６へ接着剤により固定する前にセンサチップ４または保持プレート２の親水性処理を行うという点が異なるところである。 The configuration of the cell electrophysiological sensor in the second embodiment is almost the same as that in the first embodiment, and the sensor chip 4 or the holding plate 2 is fixed before the sensor chip 4 is fixed to the second through hole 6 with an adhesive. The difference is that the hydrophilic treatment is performed.

ここで親水性処理としては酸素プラズマによる処理、紫外線照射による処理、硫酸と過酸化水素水を用いた湿式処理などがある。これらの方法はすべて、付着している疎水基である炭素を除去し、親水性を向上させる処理である。酸素プラズマによる方法は酸素ラジカルと炭素を反応させ二酸化炭素を形成させることによって、紫外線照射による方法も酸素ラジカルと炭素を反応させ二酸化炭素を形成させることによって、また湿式処理による方法は炭素を硫酸により還元反応させることによって、二酸化炭素を形成し、表面に付着している疎水基である炭素を除去する方法である。これによって接着剤が結合を行いやすい親水性の状態にすることができる。 Here, the hydrophilic treatment includes treatment with oxygen plasma, treatment with ultraviolet irradiation, wet treatment using sulfuric acid and hydrogen peroxide. All of these methods are treatments for removing the attached carbon, which is a hydrophobic group, and improving hydrophilicity. The oxygen plasma method reacts oxygen radicals with carbon to form carbon dioxide, the ultraviolet irradiation method also reacts oxygen radicals with carbon to form carbon dioxide, and the wet treatment method uses carbon with sulfuric acid. In this method, carbon dioxide, which is a hydrophobic group attached to the surface, is removed by forming a carbon dioxide by a reduction reaction. This makes it possible to obtain a hydrophilic state in which the adhesive is easily bonded.

このようにセンサチップ４の親水性処理を行うことによって、センサチップ４の外壁の濡れ性が向上し、接着剤２１との親和性が向上し密着性が向上し、接着剤２１のはがれやセンサチップ４と第二の貫通孔６の内壁との間での液漏れを防止でき、これによっても細胞測定を確実に行うことができる。 By performing the hydrophilic treatment of the sensor chip 4 in this manner, the wettability of the outer wall of the sensor chip 4 is improved, the affinity with the adhesive 21 is improved and the adhesion is improved, and the peeling of the adhesive 21 and the sensor Liquid leakage between the chip 4 and the inner wall of the second through-hole 6 can be prevented, and cell measurement can be reliably performed also by this.

また第二の貫通孔６の内壁を含む保持プレート２の親水性処理を行うことによって、第二の貫通孔６の内壁の濡れ性が向上し、接着剤２１との親和性が向上し密着性が向上し、接着剤２１のはがれやセンサチップ４と第二の貫通孔６の内壁の間での液漏れが防止でき、これによっても細胞測定を確実に行うことができる。 Further, by performing the hydrophilic treatment of the holding plate 2 including the inner wall of the second through hole 6, the wettability of the inner wall of the second through hole 6 is improved, the affinity with the adhesive 21 is improved, and the adhesiveness is increased. As a result, it is possible to prevent peeling of the adhesive 21 and liquid leakage between the sensor chip 4 and the inner wall of the second through-hole 6, and it is possible to reliably perform cell measurement.

本発明の細胞電気生理センサとその製造方法は、複数の細胞を一括して効率よく測定できる細胞の測定に有用である。 The cell electrophysiological sensor and the method for producing the same of the present invention are useful for measuring cells that can efficiently measure a plurality of cells at once.

本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図Sectional drawing of the cell electrophysiological sensor in Embodiment 1 of this invention 同要部拡大断面図Enlarged sectional view of the main part 同断面図Cross section

Explanation of symbols

１ウエル
２保持プレート
３流路プレート
４センサチップ
５第一の貫通孔
６第二の貫通孔
７第三の貫通孔
８空洞
９ダイアフラム
１４第一の電極
１５第二の電極
１６流入口
１７流出口
１８細胞外液
１９細胞内液
２０細胞
２１接着剤 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Well 2 Holding plate 3 Flow path plate 4 Sensor chip 5 1st through-hole 6 2nd through-hole 7 3rd through-hole 8 Cavity 9 Diaphragm 14 1st electrode 15 2nd electrode 16 Inlet 17 Outlet 18 Extracellular fluid 19 Intracellular fluid 20 Cell 21 Adhesive

Claims

A well having a first through-hole, a holding plate having a second through-hole abutting below the well, and a cavity having a liquid inlet and outlet at both ends below the holding plate. A cell electrophysiological sensor that abuts a sensor chip having a diaphragm having a diaphragm having a third through hole inside the second through hole, the abutting flow path plate having at least the second through hole A cell electrophysiological sensor in which an inner wall surface of a hole and / or an outer wall surface of a sensor chip are made hydrophilic and the sensor chip is bonded with an adhesive.

The cell electrophysiological sensor according to claim 1, wherein the sensor chip is made of silicon, and the outer wall surface of the sensor chip facing the inner wall surface of the second through hole is made of silicon oxide.

The cell electrophysiological sensor according to claim 1, wherein the sensor chip is made of silicon and the outer wall surface of the sensor chip facing the inner wall surface of the second through hole is made of silicon nitride.

The cell electrophysiological sensor according to claim 1, wherein a plurality of irregularities are provided on the outer wall surface of the sensor chip.

The cell electrophysiological sensor according to claim 1, wherein a plurality of irregularities are provided on the inner wall surface of the second through hole.

The cell electrophysiological sensor according to claim 1, wherein the adhesive is an ultraviolet curable type.

The cell electrophysiological sensor according to claim 1, wherein the flow path plate and / or the holding plate is an ultraviolet transmissive resin.

The cell electrophysiological sensor according to claim 7, wherein the flow path plate and / or the holding plate is selected from a material comprising a cyclic olefin polymer, a linear olefin polymer, a cyclic olefin copolymer obtained by copolymerization thereof, or polyethylene.

A well having a first through-hole, a holding plate having a second through-hole abutting below the well, and a cavity having a liquid inlet and outlet at both ends below the holding plate. A cell electrophysiological sensor that abuts a sensor chip having a diaphragm having a diaphragm having a third through hole inside the second through hole, the abutting flow path plate having at least the second through hole A method for manufacturing a cell electrophysiological sensor in which an inner wall surface of a hole and / or an outer wall surface of a sensor chip is made hydrophilic and the sensor chip is joined by an adhesive, the inner wall surface of the second through-hole or the sensor chip A method for producing a cell electrophysiological sensor in which after the hydrophilicity is imparted to the outer wall surface, the sensor chip is disposed in the second through hole, and then the sensor chip and the holding plate are bonded using an adhesive.

The method for producing a cell electrophysiological sensor according to claim 9, wherein oxygen plasma treatment is used as a method for imparting hydrophilicity.

The method for producing a cellular electrophysiological sensor according to claim 9, wherein ultraviolet irradiation treatment is used as a method for imparting hydrophilicity.

The method for producing a cellular electrophysiological sensor according to claim 9, wherein wet treatment with sulfuric acid or hydrogen peroxide is used as a method for imparting hydrophilicity.