JP2008011833A

JP2008011833A - NEW beta-1,3-GLUCANASE DERIVED FROM AGROSTIS ALBA

Info

Publication number: JP2008011833A
Application number: JP2006189310A
Authority: JP
Inventors: Daizo Koga; 大三古賀; Mahira Watanabe; マヒラ渡辺; Takashi Okimura; 崇沖村
Original assignee: Yamaguchi University NUC
Current assignee: Yamaguchi University NUC
Priority date: 2006-07-10
Filing date: 2006-07-10
Publication date: 2008-01-24

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new β-1,3-glucanase gene as a component of a biocidal agent such as an agrochemical and an antifungal agent capable of being added to a target plant body from the exterior, and to provide a protein encoded by the gene and a method for producing the β-1,3-glucanase. <P>SOLUTION: The new β-1,3-glucanase gene is derived from Agrostis alba which is well known as the plant resisting to cold and disease. The protein encoded by the gene and the method for producing the β-1,3-glucanase are also provided. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、工業用、農業用として有用な酵素であるβ−１，３−グルカナーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼをコードした遺伝子に関する。 The present invention relates to β-1,3-glucanase and a gene encoding β-1,3-glucanase which are enzymes useful for industrial and agricultural purposes.

グルカナーゼは、グルコースなどの単糖が多数結合した多糖類の一種グルカンの加水分解反応を触媒する酵素である。グルカンにはその構造からβ−１，４−グルカン（セルロース）やβ−１，３−グルカン（酵母、カビ、キノコなどの微生物の細胞壁骨格を構成）など幾つかの種類が知られ、近年のバイオマス利用意識の高まりや抗菌物質としての酵素の働きへの注目から、微生物の持つグルカナーゼをセルロース分解や口腔衛生などに利用する試みがなされている（特許文献１，２）。 Glucanase is an enzyme that catalyzes the hydrolysis reaction of a kind of polysaccharide, glucan, in which a number of monosaccharides such as glucose are bound. Several types of glucans are known, such as β-1,4-glucan (cellulose) and β-1,3-glucan (which constitutes the cell wall skeleton of microorganisms such as yeast, mold and mushroom). Attempts have been made to use glucanases possessed by microorganisms for cellulose degradation, oral hygiene, and the like from the growing awareness of biomass utilization and the attention of enzymes as antibacterial substances (Patent Documents 1 and 2).

またβ−１，３−グルカンは、細菌や菌類などの細胞壁構成成分であることから、β−１，３−グルカナーゼ遺伝子を組み込んだトランスジェニック植物の形での利用が提示されている（特許文献３−９）。これらの試みは、植物とは他種の生物、例えば真菌類などから単離したβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子を植物細胞に導入し、遺伝子組み換え植物体内でβ−１，３−グルカナーゼを発現させることで、病原性微生物への抵抗性を付与しようとするものであった。しかしながら、遺伝子組み換え植物に対する社会的不安感は根強いものがあり、容易に受け入れられるものではなかった。そこで、対象となる生物自体への遺伝子の組み込みなど細胞の形質転換を伴わない、しかもヒトをはじめとする哺乳動物に無害でかつ効果の高い殺生物剤（殺菌・殺虫剤等）の開発が待たれていた。
特開２００５−２８７４４０エンド−１，４−βグルカナーゼ特開２００６−１３６２８３ α−１，３−グルカナーゼ特開平６−１９７６５１耐病原体性トランスジェニック植物およびその生物を作製するのに用いるＤＮＡトランスファベクターならびにその生物を作製する方法特開平８−２８０２８３菌類耐性植物、該菌類耐性植物の製造方法および該方法で使用する組換えポリヌクレオチド特表平９−５０１３２２キチナーゼ、キチナーゼをコードするＤＮＡおよびそのＤＮＡを含有する植物特表２００３−５０４０３０新規抗真菌剤および殺菌剤、その製造及び使用法特開平９−１２１７０５耐病性ゾイシア属植物特開平７−２７４２５２病害抵抗性イネ科植物およびその作出方法特表２００４−５２００４８真菌耐性トランスジェニック植物 Moreover, since β-1,3-glucan is a cell wall constituent component such as bacteria and fungi, use in the form of a transgenic plant incorporating a β-1,3-glucanase gene has been proposed (Patent Literature). 3-9). These attempts are based on the introduction of β-1,3-glucanase genes isolated from other species of organisms such as fungi, into plant cells, and expression of β-1,3-glucanases in genetically modified plants. It was intended to impart resistance to pathogenic microorganisms. However, the social anxiety about genetically modified plants has persisted and has not been easily accepted. Therefore, the development of biocides (such as bactericides and insecticides) that do not involve cell transformation such as gene integration into the target organism itself and that are harmless to mammals including humans and are highly effective was awaited. It was.
JP2005-287440 endo-1,4-β glucanase JP2006-136283 α-1,3-glucanase Patent application title: DNA transfer vector used for producing pathogen-resistant transgenic plants and organisms thereof, and method for producing the organisms Patent application title: Fungal resistant plant, method for producing the fungal resistant plant, and recombinant polynucleotide used in the method JP 9-501322 chitinase, DNA encoding chitinase and plant containing the DNA Special table 2003-504030 New antifungal agent and fungicide, production and use thereof JP-A-9-121705 Disease-resistant Zoisia genus plant JP-A-7-274252 Disease-resistant gramineous plant and method for producing the same Special table 2004-520048 Fungal-resistant transgenic plant

上記の現状に鑑み、本発明者らは、いわゆる農薬や抗真菌剤などとして植物の外部から与えることが可能な殺生物剤の検討を行った。本発明者らはまず、殺生物剤として一般に用いられている化学物質ではなく、植物が本来持っている防御機構に着目し、植物自身が生産する酵素そのものを殺生物剤の成分として利用するという観点から研究を進め、これまでにカビなどの細胞壁成分であるキチンを分解する酵素キチナーゼにより、キチン質を有するカビなどの駆除に良好な効果を見いだしている。しかしキチナーゼのみでは効果は十分ではなく、更に効果の高い殺生物剤の開発のためには細菌や害虫の外皮等に含まれるグルカン類が有効であるとの推測から、上述のβ−１，３−グルカナーゼに着目した。本発明者らは種々の植物においてβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子を検討し、その結果寒さや病気に強いセイヨウシバ（Ａｇｒｏｓｔｉｓａｌｂａ）から得られるβ−１，３−グルカナーゼが、殺生物剤として極めて有効であることを見いだし、本発明を完成した。
従来、セイヨウシバのβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子は全く知られておらず、本発明者らによって初めて解明された新規な遺伝子である。それ故、本発明は、新規なβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子、その遺伝子のコードするタンパク質すなわちβ−１，３−グルカナーゼ、並びに該β−１，３−グルカナーゼの生産方法を提供するものである。 In view of the above situation, the present inventors have examined biocides that can be given from outside the plant as so-called agricultural chemicals or antifungal agents. The present inventors first focus on the defense mechanism inherent in plants, not the chemical substances generally used as biocides, and use the enzymes themselves produced as biocide components. Research has been carried out from the viewpoint, and so far, it has found a good effect on extinction of fungi and the like having chitin quality by an enzyme chitinase that degrades chitin which is a cell wall component of fungi and the like. However, chitinase alone is not effective enough, and for the development of a more effective biocide, it is estimated that glucans contained in bacteria and insect pests are effective. -Focused on glucanase. The present inventors examined the β-1,3-glucanase gene in various plants, and as a result, β-1,3-glucanase obtained from Agrostis alba which is resistant to cold and disease is extremely useful as a biocide. It was found that it was effective, and the present invention was completed.
Conventionally, the β-1,3-glucanase gene of Atlantic squirrels is not known at all, and is a novel gene that has been elucidated for the first time by the present inventors. Therefore, the present invention provides a novel β-1,3-glucanase gene, a protein encoded by the gene, ie, β-1,3-glucanase, and a method for producing the β-1,3-glucanase. is there.

すなわち本発明の第１の態様は、セイヨウシバ由来のβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子に係る配列番号１で示される塩基配列、または該塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる事を特徴とする、β−１，３−グルカナーゼ遺伝子を提供する。 That is, the first aspect of the present invention consists of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 relating to the β-1,3-glucanase gene derived from Psyllium or the base sequence having 80% or more homology with the base sequence. A β-1,3-glucanase gene is provided.

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の遺伝子を組み込んだベクターを提供する。 The second aspect of the present invention provides a vector incorporating the gene described in the first aspect.

本発明の第３の態様は、第２の態様に記載のベクターを含んだ形質転換細胞を提供する。 A third aspect of the present invention provides a transformed cell containing the vector according to the second aspect.

本発明の第４の態様は、宿主がＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓである、第３の態様に記載の形質転換細胞を提供する。 The fourth aspect of the present invention provides the transformed cell according to the third aspect, wherein the host is Pichia pastoris.

本発明の第５の態様は、第１の態様に記載の遺伝子がコードする、セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼを提供する。 According to a fifth aspect of the present invention, there is provided a turkey β-1,3-glucanase encoded by the gene according to the first aspect.

本発明の第６の態様は、配列番号２で示されるアミノ酸配列、または配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質を提供する。 A sixth aspect of the present invention is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and β-1,3-glucanase activity A protein having

本発明の第７の態様は、第３または第４の態様に記載の形質転換細胞を用いた、β−１，３−グルカナーゼの生産方法を提供する。 A seventh aspect of the present invention provides a method for producing β-1,3-glucanase using the transformed cell according to the third or fourth aspect.

本発明の第８の態様は、第５または第６の態様に記載のタンパク質を有効成分とする殺生物剤を提供する。 The eighth aspect of the present invention provides a biocide containing the protein according to the fifth or sixth aspect as an active ingredient.

本発明の提供する新規β−１，３−グルカナーゼ遺伝子、その遺伝子を含むベクターやベクターを導入した形質転換細胞、並びに新規β−１，３−グルカナーゼ遺伝子がコードするタンパク質を用いることにより、作物の病原性微生物に対する新規な殺生物剤として利用可能な新規β１，３−グルカン加水分解酵素を製造することが可能となる。本発明が提供するタンパク質は、菌類の細胞壁を特異的に分解可能な酵素であり、これまで用いられてきた化学農薬に替わりうる新たな殺生物剤として利用可能である。 By using a novel β-1,3-glucanase gene provided by the present invention, a vector containing the gene, a transformed cell into which the vector has been introduced, and a protein encoded by the novel β-1,3-glucanase gene, It becomes possible to produce a novel β1,3-glucan hydrolase that can be used as a novel biocide against pathogenic microorganisms. The protein provided by the present invention is an enzyme capable of specifically degrading the cell walls of fungi, and can be used as a new biocide that can replace the chemical pesticides used so far.

以下に本発明を利用するための最良の形態を述べる。本発明の第１の態様は、配列番号１で示される塩基配列、または配列番号１で示される塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなる事を特徴とする、セイヨウシバ由来のβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子を提供する。本発明は寒さや病害虫に強いことで知られるセイヨウシバ（Ａｇｒｏｓｔｉｓａｌｂａ）が持つ生体防御機構、特に病原性の菌類などへの抵抗手段として用いられる酵素の一種β−１，３−グルカナーゼに着目し、このタンパク質をコードする遺伝子をクローニングして利用可能としたものである。β−１，３−グルカンは菌類に特徴的な細胞壁構成多糖の一種であり、加水分解によってこれを選択的に切断するβ−１，３−グルカナーゼは他種生物に害を与えることなく、標的とする病原性微生物、例えばうどん粉病菌などを選択的に除去可能な新規殺生物剤の成分として利用可能な酵素である。塩基配列には個体差もあり、配列番号１で示した配列において１または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されることも考えられるが、これらの場合にあってもコドンの読み枠をずらさない変異（置換）であって、更にアミノ酸配列の置換につながらない変異、あるいはアミノ酸配列が置換されても酵素活性に影響を与えない変異であれば、β−１，３−グルカナーゼをコードする遺伝子としての利用には問題なく、またコドンの読み枠をずらす変異（欠失、付加）であってもそのコードするタンパク質が酵素活性を保持していれば上記同様問題なく利用することが可能である。おおよその目安として、配列番号１の塩基配列と８０％以上の相同性を有する遺伝子であれば、本発明の目的に利用可能である。 The best mode for using the present invention will be described below. According to a first aspect of the present invention, there is provided a β-derived from wild buckwheat, characterized by comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a base sequence having 80% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. A -1,3-glucanase gene is provided. The present invention pays attention to a biological defense mechanism possessed by Agross alba which is known to be resistant to cold and pests, particularly β-1,3-glucanase which is a kind of enzyme used as a resistance means against pathogenic fungi, The gene encoding this protein is made available by cloning. β-1,3-glucan is a kind of polysaccharide constituting cell walls characteristic of fungi, and β-1,3-glucanase that selectively cleaves it by hydrolysis is a target without harming other species. The enzyme can be used as a component of a novel biocide capable of selectively removing pathogenic microorganisms such as powdery mildew. There are individual differences in the base sequence, and it is possible that one or several bases are deleted, substituted or added in the sequence shown in SEQ ID NO: 1. A gene that encodes β-1,3-glucanase if it is a non-shifting mutation (substitution) that does not lead to further substitution of the amino acid sequence, or a mutation that does not affect the enzyme activity even if the amino acid sequence is substituted. As long as there is no problem, and even if it is a mutation (deletion, addition) that shifts the reading frame of the codon, it can be used without any problem as long as the encoded protein retains the enzyme activity. . As a rough guide, any gene having 80% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can be used for the purpose of the present invention.

本発明の実施の態様としては、上述の遺伝子を適当なベクターに組み込んで、更にこのベクターを宿主となる細胞に導入して形質転換細胞を作成し、この形質転換細胞に遺伝子のコードするタンパク質を発現させて利用することが好ましい。この場合においてベクターとはプラスミドベクターやウィルスベクターなど、遺伝子導入のために分子生物学において用いられているものであれば特にその種類は問わず、何ら本発明を限定するものでは無いが、例えば複製起点と抗生物質耐性遺伝子とインサートチェック（Ｂｌｕｅ／Ｗｈｉｔｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のためのＬａｃＺ遺伝子と、インサート切り出しのための複数制限酵素サイトを有したベクターであれば良く、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどはその一例である。また形質転換に用いる細胞も、分子生物学で通常用いられているものであればどの様なものでも良く、特に本発明を限定するものでは無いが、例としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｂｉｓｉａｅ）、昆虫細胞−バキュロウィルス系、メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）などの系が利用可である。また本発明の遺伝子は、大量発現させて産物そのものを殺生物剤の有効成分として利用しようとするものであるが、勿論植物細胞に導入し、いわゆる遺伝子組み換えによって「病気に強い植物」を作出するためにも利用可能であり、その場合は宿主となる植物の細胞を培養してこれに分子生物学で通常用いられている手法により遺伝子を導入し、導入細胞から植物体を形成させれば良い。 As an embodiment of the present invention, the above gene is incorporated into an appropriate vector, this vector is further introduced into a host cell, a transformed cell is prepared, and the protein encoded by the gene is introduced into the transformed cell. It is preferable to express and use. In this case, the vector is not particularly limited as long as it is used in molecular biology for gene introduction, such as a plasmid vector or a viral vector, and the present invention is not limited at all. Any vector may be used as long as it has a starting point, an antibiotic resistance gene, a LacZ gene for insert check (Blue / White selection), and a plurality of restriction enzyme sites for insert excision, such as pBluescript. The cells used for transformation may be any cells that are usually used in molecular biology, and the present invention is not particularly limited. Examples thereof include Escherichia coli, yeast ( Saccharomyces cerevisiae), insect cell-baculovirus systems, methanol-utilizing yeast (Pichia pastoris), and other systems are available. The gene of the present invention is expressed in large quantities and the product itself is intended to be used as an active ingredient of a biocide. Of course, the gene is introduced into a plant cell to produce a “disease-resistant plant” by so-called genetic recombination. In this case, a plant cell serving as a host is cultured, a gene is introduced into the cell by a technique usually used in molecular biology, and a plant body is formed from the introduced cell. .

本発明の遺伝子がコードするタンパク質、好適には配列番号２で示したアミノ酸配列、または配列番号２で示したアミノ酸配列と８０％以上の相同性を持つタンパク質も、本発明に含まれるべきものである。遺伝子に変異がある場合と同様に、配列番号２に記載のアミノ酸配列に１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは挿入されたものも、本発明の範囲内である。実質的に酵素活性を保持しているならば、アミノ酸変異の数や場所は問わず、本発明を限定するものではない。上述の形質転換細胞を大量培養し、全タンパク質中から本発明のβ−１，３−グルカナーゼを精製し、これを適切な緩衝液や展着剤などと混合することによって、うどん粉病など病原性微生物に効果のある殺生物剤を製造することも可能となる。タンパク質の精製については、分子生物学で通常用いられている手法の中から適宜選択すれば良く、殺生物剤における緩衝液や展着剤などの補助成分についても目的に合わせて適宜組み合わせれば良く、どちらも本発明を限定するものではない。以下、本発明を実施例により更に詳しく述べるが、本発明は実施例に限定されるものではない。 A protein encoded by the gene of the present invention, preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a protein having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 should also be included in the present invention. is there. Similarly to the case where there is a mutation in the gene, it is also within the scope of the present invention that one or several amino acids are deleted, substituted or inserted into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. The number and location of amino acid mutations are not limited as long as the enzyme activity is substantially retained, and the present invention is not limited thereto. Pathogenicity such as powdery mildew is obtained by culturing a large amount of the above-mentioned transformed cells, purifying the β-1,3-glucanase of the present invention from the total protein, and mixing it with an appropriate buffer or spreading agent. It is also possible to produce biocides that are effective against microorganisms. For protein purification, it can be selected as appropriate from methods commonly used in molecular biology, and auxiliary components such as buffers and spreaders in biocides can be combined as appropriate according to the purpose. Neither is limiting the present invention. EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in more detail, this invention is not limited to an Example.

（材料及びグルカナーゼの誘導）セイヨウシバ（Ｆｉｎｅｂｅｎｔｇｒａｓｓ，学名Ａｇｒｏｓｔｉｓａｌｂａ）からβ−１，３−グルカナーゼの遺伝子を単離するために、細胞培養で得られたカルスを用い、Ｍｏｎｏ−ａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ６（ＭＡＣＯ６）処理によってβ−１，３−グルカナーゼを誘導した。セイヨウシバのカルス０．３ｇに対して０．３％のＭＡＣＯ６溶液を５０μｌ投与し、１２時間ごとにサンプリングしつつ４８時間まで誘導を行った。サンプリング時には液体窒素によりカルスを凍結させ、−８０℃で保存した。各時間におけるサンプルから粗酵素液を抽出してポリアクリルアミドゲルで電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）を行い、グリコール化水溶性カードラン（Ｃｕｒｄｌａｎ）を基質としてβ−１，３−グルカナーゼの活性染色を行ってその酵素活性の強さを確認した。結果を図１に示す。図中各レーンはサンプリング時間（上段の数字）を示し、矢印で示した部分がβ−１，３−グルカナーゼの活性（染色の強さが活性の強さを表す）を示す。３６時間におけるサンプルで最も活性が強かったため、この時点のサンプルから遺伝子クローニングのためＲＮＡを抽出した。 (Induction of Material and Glucanase) Mono-acetylchitoglycosaccharide 6 (MACO6) treatment was performed using callus obtained in cell culture to isolate the gene of β-1,3-glucanase from Fine Bentgrass (Scientific name: Agrostis alba). Induced β-1,3-glucanase. 50 μl of 0.3% MACO6 solution was administered to 0.3 g of calli calli and induced up to 48 hours while sampling every 12 hours. At the time of sampling, the callus was frozen with liquid nitrogen and stored at −80 ° C. A crude enzyme solution was extracted from the sample at each time, electrophoresed on a polyacrylamide gel (Native-PAGE), and β-1,3-glucanase was stained using glycolated water-soluble curdlan (Curdlan) as a substrate. The strength of the enzyme activity was confirmed. The results are shown in FIG. In the figure, each lane indicates the sampling time (upper number), and the part indicated by an arrow indicates the activity of β-1,3-glucanase (the intensity of staining represents the intensity of activity). Since the activity was strongest in the sample at 36 hours, RNA was extracted from the sample at this time point for gene cloning.

（セイヨウシバカルスからのＲＮＡ抽出）上述のＭＡＣＯ６誘導後３６時間のサンプル（液体窒素で凍結）を乳鉢で粉砕し、ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。以後の操作はこのＲＮＡを鋳型とした。 (Extraction of RNA from Shiba callus) A sample (frozen in liquid nitrogen) 36 hours after induction of MACO6 described above was pulverized in a mortar, and total RNA was extracted using RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). Subsequent operations used this RNA as a template.

（３’−ＲＡＣＥによるｃＤＮＡの塩基配列決定）前述の全ＲＮＡを鋳型とし、ＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔＲＴｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて３’−ＲＡＣＥ（ＲａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ）を行った。操作の概要を図２に示す。ｍＲＮＡにおけるＰｏｌｙＡｔａｉｌのプライマーとしてＯｌｉｇｏ−ｄＴにアダプター配列を付加したものをプライマーとし、Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いて３７℃、６０分インキュベートしてＦｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡを合成した（図２）。図中ＢＲＬはアダプターの配列を示し、黒塗りのバーはｍＲＮＡを、白抜きのバーは合成されたｃＤＮＡをそれぞれ示す。更にこのｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号３で示した５’プライマー（Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙに解読した部分配列から作成）と配列番号４で示すアダプター配列に対応する３’プライマーを用いてＰＣＲ（２．５ｕｎｉｔｓＴＡＫＡＲＡＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３，１．５ｍＭＭｇＣｌ_２，５０ｍＭＫＣｌ，０．２ｍＭｄＮＴＰ，４μＭｅａｃｈｐｒｉｍｅｒ）を行い、３’側の配列を増幅した（図２）。ＰＣＲ産物はＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を用いて精製し、ＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてサブクローニングを行った上、塩基配列を決定した。 (Base sequence determination of cDNA by 3′-RACE) 3′-RACE (Rapid amplification of cDNA ends) was performed using the above-mentioned total RNA as a template and Omniscript RT kit (Qiagen). An outline of the operation is shown in FIG. First strand cDNA was synthesized by incubating at 37 ° C. for 60 minutes using Reverse transcriptase as a primer for Poly A tail in mRNA with an adapter sequence added to Oligo-dT (FIG. 2). In the figure, BRL indicates the adapter sequence, black bars indicate mRNA, and white bars indicate synthesized cDNA. Furthermore, using this cDNA as a template, PCR (2.5 units TAKARA Taq) was performed using a 5 ′ primer represented by SEQ ID NO: 3 (prepared from a partial sequence decoded in Preliminary) and a 3 ′ primer corresponding to the adapter sequence represented by SEQ ID NO: 4. _{DNA polymerase, 10mM Tris-HCl pH8.3,1.5mM} MgCl 2, 50mM KCl, 0.2mM dNTP, subjected to 4 [mu] M the each primer), and amplifying the sequence 3 '(FIG. 2). The PCR product was purified using GENECLEAN (Qbiogene), subcloned using TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen), and the nucleotide sequence was determined.

（５’−ＲＡＣＥによるｃＤＮＡの塩基配列決定） β−１，３−グルカナーゼｍＲＮＡの５’側の塩基配列を明らかにするために、ＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔＲＴＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて５’−ＲＡＣＥを行った。前述の３’−ＲＡＣＥで明らかになった配列を基に逆転写プライマー（配列番号５）を設計して、３’−ＲＡＣＥと同条件でｃＤＮＡを合成した。更に５’−ＲＡＣＥにおいては、反応後にＴｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを用いてＯｌｉｇｏ−ｄＣを付加し、末端標識とした。こうして得られたｃＤＮＡを鋳型として、配列番号６，７で示すプライマー（配列６＝ＢＲＬ配列＋Ｏｌｉｇｏ−ｄＧ，配列７＝３’−ＲＡＣＥの結果から設計）でＰＣＲを行った。３’−ＲＡＣＥと同様、ＰＣＲ産物をクローニングして塩基配列を決定した。概要を図３に示す。図中の記号などは図２と同様である。 (Base sequence determination of cDNA by 5′-RACE) In order to clarify the 5 ′ base sequence of β-1,3-glucanase mRNA, 5′-RACE was performed using Omniscript RT Kit (Qiagen). . A reverse transcription primer (SEQ ID NO: 5) was designed based on the sequence revealed by the aforementioned 3'-RACE, and cDNA was synthesized under the same conditions as 3'-RACE. Furthermore, in 5'-RACE, Oligo-dC was added using Terminal deoxynucleotidyl transferase after the reaction to form end labels. Using the cDNA thus obtained as a template, PCR was performed with the primers shown in SEQ ID NOs: 6 and 7 (designed from the results of sequence 6 = BRL sequence + Oligo-dG, sequence 7 = 3′-RACE). Similar to 3'-RACE, the PCR product was cloned and the nucleotide sequence was determined. An outline is shown in FIG. The symbols in the figure are the same as those in FIG.

（セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子の全長配列決定）３’−ＲＡＣＥ，５’−ＲＡＣＥで明らかになった部分配列から全長配列を決定するために、配列番号８，９（上記で明らかになった配列を基に設計）で示した２つのプライマーを用い、ＦｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡを鋳型にして、信頼性の高いポリメラーゼであるＥｌｏｎｇａｓｅＥｎｚｙｍｅＭｉｘｔｕｒｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲを行った。模式図を図４に、結果を図５に示す。図中レーンＭは分子量マーカー（φ×１７４ＨａｅＩＩＩ／λ−ＨｉｎｄＩＩＩ）、レーンＧｌｕはＰＣＲ産物を表し、矢印で示した１４９０ｂｐ付近にシングルバンドが得られた。このＰＣＲ産物を前述の方法でクローニングし、シークエンスを行ってセイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子の全塩基配列を決定した。配列番号１に全塩基配列を、配列番号２に塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。この結果から、セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子のＯＲＦは１３１４ｂｐ（３３番目のＡＴＧ−１３２８番目のＴＴＡまで）で、４３８個のアミノ酸からなり、分子量３８．５ｋＤａ，ｐＩは６．４４と推定された。 (Full-length Sequencing of Psyllium β-1,3-glucanase Gene) In order to determine the full-length sequence from the partial sequence revealed by 3′-RACE, 5′-RACE, SEQ ID NOs: 8 and 9 (obtained above) PCR was performed using Elongase Enzyme Mixture (Invitrogen), which is a highly reliable polymerase, using the first strand cDNA as a template, and using the two primers shown in FIG. A schematic diagram is shown in FIG. 4, and the results are shown in FIG. In the figure, lane M represents a molecular weight marker (φ × 174 HaeIII / λ-HindIII), lane Glu represents a PCR product, and a single band was obtained near 1490 bp indicated by an arrow. This PCR product was cloned by the method described above, and sequenced to determine the entire nucleotide sequence of the Western buckwheat β-1,3-glucanase gene. SEQ ID NO: 1 shows the entire base sequence, and SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence deduced from the base sequence. Based on this result, the ORF of the American buckwheat β-1,3-glucanase gene is 1314 bp (up to the 33rd ATG-1328th TTA), is composed of 438 amino acids, has a molecular weight of 38.5 kDa, and a pI of 6.44. It was done.

本発明の提供する新規β−１，３−グルカナーゼ遺伝子及びこの遺伝子がコードするタンパク質は、菌類に対して特異的に作用する殺生物剤の製造を可能にするものであり、農業分野においてこれまでの化学農薬に替わる新たな農薬の有効成分として利用可能である。また本発明の遺伝子は、遺伝子組み換えによって植物に菌類に対する抵抗性を付与するのにも利用可能である。 The novel β-1,3-glucanase gene provided by the present invention and the protein encoded by this gene enable the production of a biocide that specifically acts on fungi, It can be used as an active ingredient for new pesticides that replace chemical pesticides. The gene of the present invention can also be used to impart resistance to fungi to plants by genetic recombination.

ＭＡＣＯ６で誘導したセイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼの、活性染色の結果を示す。図中各レーンは誘導開始からの時間（サンプリングした時点）における酵素活性を示し、活性の強さは反応の強さで表されている（矢印部分）。誘導開始から３６時間において、最も強い酵素の活性が見られた。The result of the activity dyeing | staining of the buckwheat β-1,3-glucanase induced | guided | derived with MACO6 is shown. Each lane in the figure shows the enzyme activity at the time from the start of induction (at the time of sampling), and the strength of the activity is represented by the strength of the reaction (arrow part). The strongest enzyme activity was observed at 36 hours from the start of induction. セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子のクローニング過程を模式的に示す。本図は３’−ＲＡＣＥの過程を表し、黒塗りのバーはＲＮＡを、白抜きのバーはｃＤＮＡを示す。ＢＲＬはキット付属のアダプター配列、ＢＲＬ’はアダプター配列に対応するプライマーをそれぞれ表す。The cloning process of the Western buckwheat β-1,3-glucanase gene is schematically shown. This figure shows the process of 3'-RACE, black bars indicate RNA and white bars indicate cDNA. BRL represents an adapter sequence attached to the kit, and BRL ′ represents a primer corresponding to the adapter sequence. セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子のクローニング過程における、５’−ＲＡＣＥの過程を示す。黒塗りのバーはＲＮＡを、白抜きのバーはｃＤＮＡを示す。ＢＲＬはキット付属のアダプター配列、ＢＲＬ’はアダプター配列に対応するプライマーをそれぞれ表す。The 5'-RACE process in the cloning process of the Western buckwheat β-1,3-glucanase gene is shown. Black bars indicate RNA, and white bars indicate cDNA. BRL represents an adapter sequence attached to the kit, and BRL ′ represents a primer corresponding to the adapter sequence. セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子のクローニング過程における、全長配列のクローニング過程を示す。The cloning process of the full-length sequence in the cloning process of the European buckwheat β-1,3-glucanase gene is shown. セイヨウシバβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子の全長を、ＦｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡを鋳型にして両端のプライマーで増幅させた結果を示す。レーンＭは分子量マーカーを、レーンＧｌｕはＰＣＲ産物を表し、１４９０ｂｐ付近にシングルバンドが確認された。分子量マーカーはφ×１７４ＨａｅＩＩＩ／λ−ＨｉｎｄＩＩＩを用いた。The result of amplifying the full length of the Western buckwheat β-1,3-glucanase gene with primers at both ends using First strand cDNA as a template is shown. Lane M represents a molecular weight marker, lane Glu represents a PCR product, and a single band was confirmed around 1490 bp. As the molecular weight marker, φ × 174 HaeIII / λ-HindIII was used.

Claims

Β-1,3, characterized by comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 relating to the β-1,3-glucanase gene derived from Atlantic buckwheat or the base sequence having 80% or more homology with the base sequence -Glucanase gene.

A vector incorporating the gene according to claim 1.

A transformed cell comprising the vector according to claim 2.

The transformed cell according to claim 3, wherein the host is Pichia pastoris.

A wild buckwheat β-1,3-glucanase encoded by the gene according to claim 1.

A protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having β-1,3-glucanase activity.

A method for producing β-1,3-glucanase using the transformed cell according to claim 3 or 4.

A biocide containing the protein according to claim 5 or 6 as an active ingredient.