JP2007530596A - ゲルダナマイシンおよび誘導体はガン浸潤を阻害し、新規な標的を同定する - Google Patents

ゲルダナマイシンおよび誘導体はガン浸潤を阻害し、新規な標的を同定する Download PDF

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デイビッド ウェンケルト，
ユチャイ シェン，
ウッデ， ジョージ エフ． バンデ
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Abstract

フェムトモル濃度で、ｕＰＡ−プラスミンネットワークを遮断し、膠芽腫細胞および他の腫瘍の増殖および浸潤を阻害する、ゲルダナマイシン誘導体は、活性の高い抗ガン剤である可能性を秘めている。ＨＧＦ／ＳＦによって媒介されるＭｅｔチロシンキナーゼレセプター依存性のｕＰＡの活性化をｆＭレベルで遮断する、ＧＡおよび種々の１７−アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン誘導体が開示される。試験される化合物の阻害活性は、ｈｓｐ９０に結合するこのクラスの薬剤のすでに知られている能力とは相容れず、このことは、腫瘍の発達においてＨＧＦ／ＳＦによって媒介される事象についての新たな標的が存在することを示している。ガン細胞の活性を阻害するため、および腫瘍を処置するためにこのような化合物を使用する方法が開示される。

Description

（発明の分野）
ガンの薬理学の分野における本発明は、ゲルダナマイシン（１）の化学的誘導体（これらのいくつかは新規の化合物であり、フェムトモル濃度でガン細胞の活性を阻害する）、ならびに、ＨＧＦ依存性、Ｍｅｔ媒介性の腫瘍細胞の活性化、増殖、浸潤、および転移を阻害するためのこれらの化合物の使用に関する。新しい、まだ同定されていない標的に対して作用するこれらの化合物は、極めて強力な抗ガン剤である。
（背景技術の記載）
ゲルダナマイシン（ＧＡ）はアンサマイシンである天然産物の薬剤である（非特許文献１；非特許文献２）。ゲルダナマイシン（ＧＡ）は、ここでは、ＧＡ誘導体の１つのクラスを意味し、そのうちのいくつかは、ヒトの乳ガン、黒色種、および卵巣ガンについてのマウス異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性が示されている（非特許文献３；非特許文献４）。さらに、ＧＡクラスの薬剤は、いくつかのチロシンキナーゼおよびセリンキナーゼ腫瘍遺伝子産物（Ｈｅｒ２、Ｍｅｔ、Ｒａｆ、ｃｄｋ４、およびＡｋｔが含まれる）の発現を低下させる（非特許文献５；非特許文献６：非特許文献３）；非特許文献６；非特許文献４。これらの薬剤は、分子シャペロンＨＳＰ９０を阻害し、それによってクライアントである腫瘍タンパク質の適切な折り畳みを妨げ、それらの脱安定化を導くことによって、ナノモルの範囲の濃度で作用することが明らかにされている（したがって、本明細書中では、ｎＭ ＧＡインヒビターまたは「ｎＭ−ＧＡｉ」と呼ばれる）（非特許文献８：非特許文献６）。さらに、国立癌研究所Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎ ＮＣＩ−Ａｄｓによって提供された非特許文献４において列挙されている化合物薬剤のいくつかは、（薄層クロマトグラフィーによって）純粋ではないことが明らかにされており、これによって、初期の結果および解釈が誤りであり得るとの結論が導かれる。
最近の研究により、Ｍｅｔによるシグナル伝達経路がガン治療の治療標的である可能性を秘めていることが示された。Ｍｅｔ特異的リボザイムおよびアンチセンスストラテジーによっては、ＭｅｔおよびＨＧＦ／ＳＦの発現、腫瘍の増殖、ならびに腫瘍の転移の可能性が低下する（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。ＮＫ４（そのＮ末端の４つのクリングルドメインを有しているＨＧＦ／ＳＦ断片）は、Ｍｅｔレセプターについての競合するＨＧＦ／ＳＦアンタゴニストであり（非特許文献１３）、腫瘍の浸潤および転移、ならびに腫瘍血管形成を阻害することが明らかにされている（非特許文献１４）。ＨＧＦ／ＳＦに対するモノクローナル抗体は、胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスにおいては、ヒト異種移植片の腫瘍の増殖の阻害によってその活性を中和する（非特許文献１５）。インドールをベースとするレセプターチロシンキナーゼインヒビターＫ２５２ａおよびＰＨＡ６６５７５２は、Ｍｅｔキナーゼ活性、Ｍｅｔによって促される腫瘍の増殖および転移の可能性を阻害する（非特許文献１６；非特許文献１７）。
非特許文献４によって、腫瘍細胞の浸潤を阻害し得る、Ｍｅｔレセプターによるシグナル伝達経路のインヒビターがスクリーニングされた。ＨＧＦ／ＳＦは、細胞浸潤および転移の媒介因子である、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）およびそのレセプター（ｕＰＡＲ）の発現を誘導する。非特許文献４には、ｕＰＡとｕＰＡＲの誘導、それに続く、プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を利用する細胞をベースとするアッセイが記載されており、これによって、ＭＤＣＫ−２細胞の阻害特性について化合物をスクリーニングすることができる。ゲルダナマイシン（１）およびそのいくつかの誘導体は、フェムトモル（ｆＭ）濃度で高い阻害活性を示すことが明らかにされている。この極めて高い阻害活性には、（以下で開示されるように）本発明者らによって、浸潤複合体のさらなる活性、特に、三次元Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）全体へのヒト腫瘍細胞のインビトロでの浸潤が含められる。Ｍｅｔの発現の低下は、ナノモル（ｎＭ）濃度未満では観察されず、このことは、観察された阻害活性がＭｅｔレセプターのダウンレギュレーションとは無関係であることを示している。
ゲルダナマイシンおよび１７−アルキルアミノ−１７−デモトキシゲルダナマイシン誘導体は、熱ショックタンパク質９０（ｈｓｐ９０）のアミノ末端ドメイン領域のＡＴＰ結合部位に結合するそれらの能力が最もよく知られている（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献３；非特許文献２０；非特許文献２１）。Ｈｓｐ９０は、ＧＨＫＬ ＡＴＰａｓｅの構造タンパク質ファミリーに属している（非特許文献２２）。この豊富なタンパク質は、種々の重要なタンパク質の調節活性、代謝回転、および輸送を助ける。これは、細胞のシグナル伝達に関係しているタンパク質（例えば、転写因子、ステロイドレセプター、およびプロテインキナーゼ）の折り畳みおよび調節を手助けする（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）。ｈｓｐ９０の機能は、アンサマイシンである天然産物、例えば、ＧＡおよびマクベシンＩ（２）（非特許文献２７；非特許文献２８）、さらには、ラディシコール（３）（非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３）によって遮断される（化学構造についての本発明の詳細な説明を参照のこと）。現在、臨床試験の段階にある薬剤である、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（４）の抗腫瘍作用は、ｈｓｐ９０機能の遮断に起因すると考えられている（非特許文献３１；非特許文献３２）。
ＧＡの臨床的な使用に関する欠点は、その溶解性と毒性による制限であるが、誘導体１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧと省略される）（４）（ＮＳＣ．３３０５０７とも指定されている）は、腫瘍阻害活性を有しており、これには低い毒性が伴い（非特許文献３３）、第Ｉ相〜第ＩＩ相臨床試験において評価されている（非特許文献３４；非特許文献３１）。水溶解度が高く、経口投与に利用することができる、前臨床的評価の段階にある別のＧＡ誘導体は、１７−（ジメチルアミノエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（５）（１７−ＤＭＡＧと省略される）であり、これは、ｉ．ｐ．投与した場合には、原則的には１００％であり、経口投与された１７−ＡＡＧ（４）の約２倍である（非特許文献３５）。１７−ＡＡＧ（４）の代謝産物である１７−アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（６）は、ｐ１８５ｅｒｂＢ２を減少させる能力によって決定した場合には、同等の生物学的活性を有しており、強力な治療薬として開発されている途中である（非特許文献３６）。ＧＡおよび１７−ＡＡＧのいずれも、乳ガン細胞をタキソールによって媒介されるアポトーシス、およびドキソルビシンによって媒介されるアポトーシスに対して感作させることができる（非特許文献３７）。
特許文献１（Ｓａｓａｋｉら）には、Ｃ１７位およびＣ１９位で置換された種々のゲルダノマイシン誘導体が開示されている。これらの両方の位置での置換は、ヒドロキシ、アミノ、メチルアミノ、ピロリジノ、ピリジニル、メトキシ、ピペリジノ、モルホリノ、ハロゲン、シクロアルキル、および他の基でさらに置換することができるアルキル基（Ｃ２−１２）を含む種々のラジカルで２置換することができるアミンを含むとして列挙されている。これらの化合物は、特定の「ガン細胞」（これは、事実上、腫瘍ウイルスによって形質転換されたマウスの線維芽細胞クローンである）のインビトロでの増殖を阻害すると言われている。
Ｒｏｓｅｎら，特許文献２（１９９８年１１月１９日）には、タンパク質、レセプター、またはマーカーに特異的に結合する標的化部分と、ｈｓｐ０９結合部分（これは、アンサマイシン抗生物質が結合するｈｓｏｐ９０ポケットに結合する）の両方が含まれる、Ｈｓｐ９０標的化部分に結合させられたＧＡ誘導体が開示されている。この文献には、本明細書中で開示されるように、ＧＡをアジリジンと反応させて、合成プロセスの中間体である化合物１５を得ることが開示されている。この化合物は、ヨウ化シアン（ＩＣＮ）と反応させられ、１７−（Ｎ−ヨードエチル−Ｎ−シアノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）が生産される。後者のアナログはＨＳＰ９０に結合し、放射性ＩＣＮを使用することによって合成の間に簡単に放射標識することができた。「対応する１７−Ｎ−ヨードアルキル−Ｎ−シアノ）化合物を、アジリジンの代わりに、アゼチジン（３炭素）、ピロリジン（４炭素）などを使用して作成することができる」ことが開示されている。
Ｇａｌｌａｓｃｈｕｎら，特許文献３（１９９５年１月１２日）には、腫瘍遺伝子産物のインヒビターとして、および抗腫瘍薬／抗ガン剤としての種々のアンサマイシン誘導体が開示されている。１５ページ、１９行目から１７ページ１２行目、および実施例２〜９９を参照のこと。
特許文献４（Ｓｃｈｎｕｒら）には、Ｃ４、５、１１、１７、１９、および２２を含むＧＡの以下の環位置で置換されている多数のＧＡ誘導体が開示されている。これらの化合物は、インビボにおいてＳＫＢｒ３乳ガン細胞の増殖を阻害すると言われているが、どの水準においても、何らかの抗腫瘍作用を示す結果はもたらされていない。
特許文献５（２００４年１０月１４日）には、単独で、または他の薬剤との併用において、再狭窄を予防または軽減するＧＡアナログが開示されている。４ページには、以下の化合物が記載されている：１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（本発明の化合物４）；１７−［２−ジメチルアミノ）エチルアミノ］−デメトキシ−１１−Ｏ−メチルゲルダナマイシン、および１７−Ｎ−アゼチジニル−１７−デメトキシゲルダナマイシン（本発明の化合物１４）。
Ｍｅｔレセプターチロシンキナーゼおよびそのリガンド、肝細胞増殖因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）は、腫瘍発生および転移を導く。不適切なＭｅｔの発現は、ガンの転移と、ガン患者の全体的な生存率の低下に大きく関係しており（非特許文献３８：非特許文献３９）、そしてＭｅｔとＨＧＦ／ＳＦの両方が、多くのタイプのヒトおよび動物の悪性腫瘍および肉腫に関係している。包括的なリストについては、非特許文献４０を参照のこと。これは、その全体が引用により本明細書中に組み入れられる。Ｍｅｔによるシグナル伝達によっては、インビトロでは増殖と浸潤が、そして動物モデルにおいては腫瘍形成と転移が誘導される。ＨＧＦ／ＳＦは強力な血管形成性分子および生存分子である（非特許文献３８）。ＨＧＦ／ＳＦによるＭｅｔの活性化の１つの結末は、腫瘍の浸潤および転移における重要な要因である、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）タンパク質溶解ネットワークの誘導である。Ｍｅｔを発現する細胞のＨＧＦ／ＳＦへの曝露によっては、ｕＰＡおよび／またはｕＰＡレセプター（ｕＰＡＲ）の発現が誘導され、これによって、プラスミノーゲンの切断によるプラスミンの生産が導かれる（非特許文献４１；非特許文献４２；非特許文献４３）。腫瘍細胞の浸潤を阻害できる可能性がある薬剤について検索するために、非特許文献４は、イヌ腎臓ＭＤＣＫ上皮細胞における細胞をベースとするアッセイを開発し、ｕＰＡ活性を阻害する化合物を検索した。ＧＡのいくつかの誘導体が、フェムトモル（ｆＭ）濃度でｕＰＡ活性を阻害し（ｆＭ−ＧＡｉ）、これはＭｅｔの発現を低下させるために必要なｎＭ濃度をおよそ６桁下回る（非特許文献４）。これらの研究により、ＭＤＣＫ細胞が、親和性が高く、おそらくは少量である、ｆＭ−ＧＡｉ剤についての新規の標的を有していることが示唆された。
ｆＭレベルでの、ＧＡおよびその誘導体による腫瘍細胞中のＭｅｔによるシグナル伝達経路の破壊についての標的は、未だ知られていない。上記のｈｓｐ９０機能の破壊は、より高濃度、すなわち、マイクロモル（μＭ）およびそれ以上で生じることが知られている、このアンサマイシンクラスの薬剤の作用である。本発明者らは、未知の標的（単数または複数）についてのＧＡ誘導体の構造−活性の関係を評価し、そしてｆＭ標的（単数または複数）をｈｓｐ９０と区別することができた。
当該分野では、極めて低い濃度で有効である新しい抗ガン治療薬としての、ＧＡクラスのより強力な化合物が必要とされている。本発明はこの要求に答えるものである。
本発明者らの研究室によるこれまでの研究によって、ＮＣＩ Ａｎｔｉ−Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＣＩ ＡＤＳ）によって提供された３０を超えるＧＡ由来の薬剤のうちのわずか４個が、フェムトモル濃度で、ＭＤＣＫ細胞中の肝細胞増殖因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）によるウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）−プラスミンの活性化を阻害したことが示されている（非特許文献４）。これらの薬剤は、ナノモル範囲で活性を示したＧＡファミリーの薬剤（「ｎＭ−ＧＡｉ」薬剤と呼ばれる）に対して、本明細書中で「ｆＭ−ＧＡｉ」薬剤と呼ばれる。
Ｓａｓａｋｉ Ｋ，Ｒｉｎｅｈａｒｔ ＫＬ，Ｓｌｏｍｐ Ｇ，Ｇｒｏｓｔｉｃ ＭＦ，Ｏｌｓｏｎ ＥＣ，「Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ」,１９７０年,第９２巻,ｐ．７５９１−７５９３ ＤｅＢｏｅｒ Ｃ，Ｍｅｕｌｍａｎ ＰＡ，Ｗｎｕｋ ＲＪ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＤＨ．,「Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ）」,１９７０年，第２３巻,ｐ．４４２−７ Ｓｃｈｕｌｔｅ，ＴＷ，Ａｋｉｎａｇａ，Ｓ，Ｓｏｇａ，Ｓ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｗ，Ｓｔｅｎｓｇａｒｄ，Ｂ，Ｔｏｆｔ，Ｄ，Ｎｅｃｋｅｒｓ，ＬＭ．,「Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ」,１９９８年,第３巻,ｐ．１００−１０８ Ｗｅｂｂ，ＣＰ，Ｈｏｓｅ，ＣＤ，Ｋｏｏｃｈｅｋｐｏｕｒ，Ｓ，Ｊｅｆｆｅｒｓ，Ｍ，Ｏｓｋａｒｓｓｏｎ，Ｍ，Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ，Ｍｏｎｋｓ，Ａ，Ｖａｎｄｅ Ｗｏｕｄｅ，ＧＦ,「Ｃａｎｃ Ｒｅｓ」,２０００年,第６０巻,ｐ.３４２−９ Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ，ＭＶ,「Ｌｅｕｌｃｅｍｉａ」,２００２年,第１６巻,ｐ.４５５−６２ Ｏｃｈｅｌ，ＨＪ，Ｅｉｃｈｈｏｒｎ，Ｋ，Ｇａｄｅｍａｎｎ，Ｇ，「Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ」，２００１年，第６巻，ｐ．１０５−１２ Ｓｏｌｉｔ，ＤＢ，Ｚｈｅｎｇ，ＦＦ，Ｄｒｏｂｎｊａｋ，Ｍ，Ｍｕｎｓｔｅｒ，ＰＮ，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｂ，Ｖｅｒｂｅｌ，Ｄ，Ｈｅｌｌｅｒ，Ｇ，Ｔｏｎｇ，Ｗ，Ｃｏｒｄｏｎ− Ｃａｒｄｏ，Ｃ，Ａｇｕｓ，ＤＢ，Ｓｃｈｅｒ，ＨＩ，Ｒｏｓｅｎ，Ｎ（２００２）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ ８：９８６−９３ Ｂｏｎｖｉｎｉ，Ｐ，Ａｎ，ＷＧ，Ｒｏｓｏｌｅｎ，Ａ，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｐ，Ｔｒｅｐｅｌ，Ｊ，Ｇａｒｃｉａ ｄｅ Ｈｅｒｒｅｒｏｓ，Ａ，Ｄｕｎａｃｈ，Ｍ，Ｎｅｃｋｅｒｓ，ＬＭ（２００１）Ｃａｎｃ Ｒｅｓ ６１：１６７１−７ Ａｂｏｕｎａｄｅｒ，Ｒ，Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ，Ｓ，Ｌａｌ，Ｂ，Ｆｉｅｌｄｉｎｇ，Ｋ，Ｂｏｏｋ，Ａ，Ｄｉｅｔｚ，Ｈ，Ｂｕｒｇｅｒ，Ｐ，Ｌａｔｅｒｒａ，Ｊ．，「Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ」，１９９９年，第９１巻，ｐ．１５４８−１５５６ Ｊｉａｎｇ，Ｗ．Ｇ，Ｇｒｉｍｓｈａｗ，Ｄ，Ｌａｎｅ，Ｊ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．Ａ，Ａｂｏｕｎｄｅｒ，Ｒ，Ｌａｔｅｒｒａ，Ｊ，Ｍａｎｓｅｌ，Ｒ．Ｅ．，「Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ」，２００１年，第７巻，ｐ．２５５５−２５６２ Ａｂｏｕｎａｄｅｒ，Ｒ，Ｌａｌ，Ｂ，Ｌｕｄｄｙ，Ｃ，Ｋｏｅ，Ｇ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ，Ｒｏｓｅｎ，Ｅ．Ｍ，Ｌａｔｅｒｒａ，Ｊ．，「ＦＡＳＥＢ Ｊ」，２００２年，第１６巻，ｐ．１０８− １１０ Ｓｔａｂｉｌｅ，Ｌ．Ｐ，Ｌｙｋｅｒ，Ｊ．Ｓ，Ｈｕａｎｇ，Ｌ，Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ，Ｊ．Ｍ．，「Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ」，２００４年，第１１巻，ｐ．３２５−３３５ Ｄａｔｅ，Ｋ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ，Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ，Ｔａｎａｋａ，Ｍ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ」，１９９７年，第４２０巻，ｐ．１−６ Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，「Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ」，２００３年，第９４巻，ｐ．３２１−３２７ Ｃａｏ，Ｂ，Ｓｕ，Ｙ，Ｏｓｋａｒｓｓｏｎ，Ｍ，Ｚｈａｏ，Ｐ，Ｋｏｒｔ，ＥＪ，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ｊ，Ｗａｎｇ，ＬＭ，Ｖａｎｄｅ Ｗｏｕｄｅ，ＧＦ，「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」，２００１年，第９８巻，ｐ．７４４３−７４４８ Ｍｏｒｏｔｔｉ，Ａ，Ｍｉｌａ，Ｓ，Ａｃｃｏｒｎｅｒｏ，Ｐ，Ｔａｇｌｉａｂｕｅ，Ｅ，Ｐｏｎｚｅｔｔｏ，Ｃ．，「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」，２００２年，第２１巻，ｐ．４８８５−４８９３ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｇ，Ｓｃｈｒｅｃｋ，Ｒ，Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｊ，Ｋｕｒｕｇａｎｔｉ，Ｐ，Ｃｈａｎ，Ｅ，Ｌｅ，Ｐ，Ｃｈｅｎ，Ｊ，Ｗａｎｇ，Ｘ，Ｒｕｓｌｉｍ，Ｌ，Ｂｌａｋｅ，Ｒ，Ｌｉｐｓｏｎ，Ｋ．Ｅ，Ｒａｍｐｈａｌ，Ｊ，Ｄｏ，Ｓ，Ｃｕｉ，Ｊ．Ｊ，Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｍ，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．Ｂ．「Ｃａｎｃ Ｒｅｓ」，第６３巻，２００３年，ｐ．７３４５−７３５５ Ｓｔｅｂｂｉｎｓ，ＣＥ，Ｒｕｓｓｏ，ＡＡ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ，Ｒｏｓｅｎ，Ｎ，Ｈａｒｔｌ，ＦＵ，Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，ＮＰ．，「Ｃｅｌｌ」，１９９７年，第８９巻，ｐ．２３９−５０ Ｇｒｅｎｅｒｔ，ＪＰ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ＷＰ，Ｆａｄｄｅｎ，Ｐ，Ｈａｙｓｔｅａｄ，ＴＡ，Ｃｌａｒｋ，Ｊ，Ｍｉｍｎａｕｇｈ，Ｅ，Ｋｒｕｔｚｓｃｈ，Ｈ，Ｏｃｈｅｌ，ＨＪ，Ｓｃｈｕｌｔｅ，ＴＷ，Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ，Ｎｅｃｋｅｒｓ，ＬＭ，Ｔｏｆｔ，ＤＯ．，「Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ」，１９９７年，第２７２巻，ｐ．２３８４３−２３８５０ Ｒｏｅ，ＳＭ，Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ，Ｃ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｒ，Ｌａｄｂｕｒｙ，ＪＥ，Ｐｉｐｅｒ，ＰＷ，Ｐｅａｒｌ，ＬＨ，「Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ」，１９９９年，第４２巻，ｐ．２６０− ２６６ Ｊｅｚ，ＪＭ，Ｃｈｅｎ，ＪＣ，Ｒａｓｔｅｌｌｉ，Ｇ，Ｓｔｒｏｕｄ，ＲＭ，Ｓａｎｔｉ，ＤＶ．，「Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ」，２００３年，第１０巻，ｐ．３６１−３６８ Ｄｕｔｔａ，Ｒ，Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．「Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ」，２０００年，第２５巻，ｐ．２４−２８ Ｆｉｎｋ，ＡＬ．，「Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ」，１９９９年，第７９巻，ｐ．４２５−４４９ Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｋ，Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊ．，「Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ」，２００１年，第１８８巻，ｐ．２８１−２９０ Ｐｉｃａｒｄ，Ｄ，「Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ」，２００２年，第５９巻，ｐ．１６４０−１６４８ Ｐｒａｔｔ，ＷＢ，Ｔｏｆｔ，ＤＯ，「Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ」，２００３年，第２２８巻，ｐ．１１１−１３３ Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ，ＭＶ，Ｔｏｒｅｔｓｋｙ，Ｊ，Ｂｏｈｅｎ，Ｓ，Ｎｅｃｋｅｒｓ，Ｌ．，「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」，１９９６年，第９３巻，ｐ．８３７９−８３８３ Ｂｏｈｅｎ，ＳＰ，「Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ」，１９９８年，第１８巻，ｐ．３３３０−３３３９ Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ，Ｌ，Ｍｉｍｎａｕｇｈ，ＥＧ，Ｄｅ Ｃｏｓｔａ，Ｂ，Ｍｙｅｒｓ，ＣＥ，Ｎｅｃｋｅｒｓ，ＬＭ．「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」，１９９４年，第９１巻，ｐ．８３２４−８３２８ Ｓｈａｒｍａ，ＳＶ，Ａｇａｔｓｕｍａ，Ｔ，Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．，「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」，１９９８年，第１６巻，ｐ．２６３９−２６４５ Ｍａｌｏｎｅｙ，Ａ，Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｐ．，「Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ ｔｈｅｒ」，２００２年，第２巻，ｐ．３−２４ Ｎｅｃｋｅｒｓ，Ｌ，Ｉｖｙ，ＳＰ．，「Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｎｃｏｌ」，２００３年，第１５巻，ｐ．４１９−２４ Ｋａｍａｌ，Ａ，Ｔｈａｏ，Ｌ，Ｓｅｎｓｉｎｔａｆｆａｒ，Ｊ，Ｚｈａｎｇ，Ｌ，Ｂｏｅｈｍ，ＭＦ，Ｆｒｉｔｚ，ＬＣ，Ｂｕｒｒｏｗｓ，ＦＪ．，「Ｎａｔｕｒｅ」，２００３年，第４２５巻，ｐ．４０７−４１０ Ｇｏｅｔｚ，ＭＰ，Ｔｏｆｔ，ＤＯ，Ａｍｅｓ，ＭＭ，Ｅｒｌｉｃｈｍａｎ，Ｃ，「Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ」，２００３年，第１４巻，ｐ．１１６９−７６ Ｅｇｏｒｉｎ，ＭＪ，Ｌａｇａｔｔｕｔａ，ＴＦ，Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，ＤＲ，Ｃｏｖｅｙ，ＪＭ，Ｗｈｉｔｅ，ＫＤ，Ｍｕｓｓｅｒ，ＳＭ，Ｅｉｓｅｍａｎ，ＪＬ．，「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ」，２００２年，第４９巻，ｐ．７−１９ Ｅｇｏｒｉｎ ＭＪ，Ｒｏｓｅｎ ＤＭ，Ｗｏｌｆｆ ＪＨ，Ｃａｌｌｅｒｙ ＰＳ，Ｍｕｓｓｅｒ ＳＭ，Ｅｉｓｅｍａｎ ＪＬ，「Ｃａｎｃ Ｒｅｓ」，１９９８年，第５８巻，ｐ．２３８５−２３９６ Ｍｕｎｓｔｅｒ ＰＮ，Ｂａｓｓｏ Ａ，Ｓｏｌｉｔ Ｄ，Ｎｏｒｔｏｎ Ｌ，Ｒｏｓｅｎ Ｎ，「Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ」，２００１年，第７巻，ｐ．２２２８−２２３６ Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，Ｃ，Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，Ｗ，Ｇｈｅｒａｒｄｉ，Ｅ，Ｖａｎｄｅ Ｗｏｕｄｅ，ＧＦ，「Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ」，２００３年，第４巻，ｐ．９１５−２５ Ｍａｕｌｉｋ，Ｇ，Ｓｈｒｉｋｈａｎｄｅ，Ａ，Ｋｉｊｉｍａ，Ｔ，Ｍａ，ＰＣ，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ＰＴ，Ｓａｌｇｉａ，Ｒ，「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ」，２００２年，第１３巻，ｐ．４１−５９ ［ｏｎｌｉｎｅ］，インターネット，＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｖａｉ．ｏｒｇ／ｍｅｔａｎｄｃａｎｃｅｒ／＞ Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｎ，Ｍｉｚｕｎｏ，Ｓ，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ，Ｃｈｉｎ，Ｋ，Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｍ，Ｓｉｓｓｏｎ，ＴＨ，Ｓｉｍｏｎ，ＲＨ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ，Ｍｉｙａｋｅ，Ｍ，「Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ」，２００４年，第１６４巻，ｐ．１０９１−８ Ｊｅｆｆｅｒｓ，Ｍ，Ｒｏｎｇ，Ｓ，Ｖａｎｄｅ Ｗｏｕｄｅ，ＧＦ，「Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ」，１９９６年，第１６巻，ｐ．１１１５−２５ Ｔａｃｃｈｉｎｉ，Ｌ，Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｅ，Ｄｅ Ｐｏｎｔｉ，Ｃ，Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏ，ＭＡ，「Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ」，２００３年，第２９０巻，ｐ．３９１−４０１ 米国特許第４，２６２，９８９号明細書 国際公開第９８／５１７０２号パンフレット 国際公開第９５／０１３４２号パンフレット 米国特許第５，９３２，５６６号明細書 国際公開第２００４／０８７０４５号パンフレット
（発明の要旨）
本発明者らにより、ＭＤＣＫ細胞中のｕＰＡタンパク質溶解ネットワークを阻害することに対する特定のＧＡ誘導体（「ｆＭ−Ｇａｉ」化合物）のフェムトモル濃度（またはさらに低い）活性がＨＧＦ／ＳＦ依存性であることが発見された。このような感受性はまた、ヒトの腫瘍細胞にもあり、ここでは、ｕＰＡ活性をＨＧＦ／ＳＦによって顕著にアップレギュレートさせることができる。
ＨＧＦ／ＳＦによって媒介されるｕＰＡの誘導を阻害することに加えて、ｆＭ−ＧＡｉ化合物（種々の１７−アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン誘導体を含む）は、ＭＤＣＫ細胞のＨＧＦ／ＳＦによって誘導される散乱、ならびに、いくつかのヒト膠芽腫細胞株−ＤＢＴＲＧ、ＳＮＢ１９、およびＵ３７３のインビトロでの浸潤活性を阻害することが明らかにされている。しかし、ＨＳＰ９０はｆＭ−ＧＡｉの標的ではないことが本明細書において開示される。まず第一に、全てのＨＳＰ９０結合化合物がｆＭ−ＧＡｉ活性を示さない。高い親和性でＨＳＰ９０に結合するラディシコール（ＲＡ）（Ｒｏｅら，１９９９；Ｓｃｈｕｌｔｅら，１９９９）は、ｎＭ未満の濃度では、ＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるｕＰＡの活性化を阻害しない。ＧＡ、ｆＭ−ＧＡｉ薬剤、他のアンサマイシン（マクベシンＩおよびＩＩ（ＭＡ）を含む）、特定のＧＡ誘導体、およびラディシコールは、ｎＭの濃度で、ｕＰＡ活性とＭｅｔの発現を同時に阻害する。種々の細胞株とｎＭ濃度のこれらの薬剤を使用して、本発明者らは、全ての利用することができるＨＳＰ９０結合部位が占有されていることを示した。しかし、ＧＡによってＨＳＰ９０が占有されず、そしてＭｅｔタンパク質のレベルに影響が及ばないピコモル（ｐＭ）およびそれ未満の濃度のＧＡでもなお、ｕＰＡ活性、細胞の散乱、および腫瘍細胞の浸潤は阻害された。したがって、ｆＭ−ＧＡｉ薬剤は、ＨＧＦ／ＳＦの重要な生物学的活性（例えば、腫瘍細胞の浸潤）についての強力なインヒビターであるが、ＨＳＰ９０を通じてその作用が媒介されることはない。これによって、ＨＧＦ／ＳＦによって媒介されるｕＰＡの活性化についての新しい標的（単数または複数）が示される。
したがって、これらのｆＭ−ＧＡｉ化合物は、腫瘍細胞の浸潤を妨害するための薬剤候補であり、ガン細胞の浸潤を防ぐための外科手術、従来の化学療法、または放射線治療と組み合わせることができる。これらにはまた、放射性核種のような検出可能な標識と結合させた場合には、診断薬／予後薬としての有用性もある。
詳細には、本発明は、式Ｉまたは式ＩＩの化合物、あるいは、それらの薬学的に許容される塩に関し、これらは、１０−１１Ｍ未満の濃度でガン細胞中のＨＧＦ／ＳＦによるＭｅｔの活性化を阻害する特性を有している。式中、：
Ｒ１は、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、状況に応じて置換された低級アルキル、アルケニル、またはアルキニル；低級アルコキシ、アルケノキシ、アルキノキシ；直鎖または分岐したアルキルアミン、アルケニルアミン、およびアルキニルアミン；３〜６員複素環基（これは、状況に応じて置換される）である（そしてＲ１は、好ましくは、３〜６員複素環であり、式中、Ｎはヘテロ原子である）。
Ｒ２は、Ｈ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、状況に応じて置換された低級アルキル、アルケニル、またはアルキニル；低級アルコキシ、アルケノキシ、およびアルキノキシ；直鎖または分岐したアルキルアミン、アルケニルアミン、およびアルキニルアミン；３〜６員複素環基（これは、状況に応じて置換される）である；
Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、状況に応じて置換された低級アルキル、アルケニル、またはアルキニル；低級アルコキシ、アルケノキシ、およびアルキノキシ；直鎖または分岐したアルキルアミン、アルケニルアミン、およびアルキニルアミンであるか、あるいは、Ｎは、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロケニル、またはヘテロアリール環（これは、状況に応じて置換される）の構成要素である；
Ｒ４は、Ｈ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、状況に応じて置換された低級アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、そして式中、
位置Ｃ２＝Ｃ３、Ｃ４＝Ｃ５、およびＣ８＝Ｃ９の間の環二重結合は、状況に応じて、単結合となるように水素化される。
化合物は、好ましくは、１０−１１Ｍ未満、または１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、または１０−１４Ｍ未満、または１０−１５Ｍ未満、または１０−１６Ｍ未満、または１０−１７Ｍ未満、または１０−１８Ｍ未満、または１０−１９Ｍ未満の濃度で、ガン細胞中のＨＧＦ／ＳＦによるＭｅｔの活性化を阻害する。
好ましい実施形態においては、Ｒ１は示されるような置換基であり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のそれぞれはＨである。
化合物は、好ましくは、以下からなる群より選択される：
（ａ）１７−（２−フルオロエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
（ｂ）１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
（ｃ）１７−Ｎ−アジリジニル−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
（ｄ）１７−アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
（ｅ）１７−Ｎ−アゼチジニル−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
（ｆ）１７−（２−ジメチルアミノエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
（ｇ）１７−（２−クロロエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；および
（ｈ）ジヒドロゲルダナマイシン。
上記の化合物と薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物もまた提供される。
本発明は、Ｍｅｔを保有している腫瘍またはガン細胞の、ＨＧＦ／ＳＦによって誘導される、Ｍｅｔレセプターによって媒介される生物学的活性を阻害する方法に関する。この方法には、上記細胞に対して有効量の上記のような化合物を提供する工程が含まれる。化合物は、上記生物学的活性の阻害について、約１０−１１Ｍ未満、または約１０−１２Ｍ未満、または約１０−１３Ｍ未満、または約１０−１４Ｍ未満、または約１０−１５Ｍ未満、または約１０−１６Ｍ未満、または約１０−１７Ｍ未満、または約１０−１８Ｍ未満のＩＣ５０を有する。生物学的活性は、細胞内のｕＰＡ活性の誘導、インビトロまたはインビボでの増殖、あるいは細胞の散乱、インビトロまたはインビボでの上記細胞の浸潤であり得る。
ＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるＭｅｔを保有している腫瘍またはガン細胞の被験体での転移を阻害する方法もまた含まれる。この方法には、上記被験体に対して、有効量の本明細書中に開示される化合物を提供することが含まれる。化合物は、インビトロでのアッセイにおいて測定された場合には、腫瘍細胞の浸潤の阻害について上記に示されるように、約１０−１１Ｍまたはそれ未満のＩＣ５０を有する。好ましくは、阻害によって、上記細胞によって引き起こされる測定可能な腫瘍の退行、または上記被験体での腫瘍の増殖についての測定可能な低減が生じる。
感受性被験体（好ましくは、ヒト）をＭｅｔ陽性腫瘍の増殖または転移から防御する方法には、
（ａ）上記腫瘍を発症するリスクがある、
（ｂ）すでに処置された被験体の場合には、上記腫瘍を再発するリスクがある
のいずれかである上記被験体に、有効量の上記化合物を投与する工程が含まれる。
ハロゲン放射性核種で検出可能であるように標識された上記化合物は、好ましくは、１８Ｆ、７６Ｂｒ、７６Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉからなる群より選択されるＲ１基に対して結合させられる。
（好ましい実施形態の説明）
アンサマイシン（ゲルダナマイシンおよび誘導体である１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンを含む）とラディシコールは、おそらく細胞に対するそれらの作用機構である、熱ショックタンパク質９０に堅く結合するそれらの能力について知られている。実際、ＧＡおよび１７−アルキルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンは、アミノ末端ドメインｈｓｐ９０のＡＴＰ結合部位に結合する。
本発明者らは、ゲルダナマイシン（ＧＡ）とそのいくつかの誘導体が、フェムトモルレベルで、ＨＧＦ／ＳＦによって媒介されるＭｅｔチロシンキナーゼレセプターの活性化を阻害することを発見した。これは、ｕＰＡのレセプター依存性活性化として測定することができる。このような活性についての構造上の要件の評価によって、この活性の標的はＨＳＰ９０ではなく、むしろ複合体の未知のタンパク質であるとの結論が導かれた。
多数の化合物が合成され（または国立癌研究所から入手され）、試験され、そして以下で議論される。実施例１〜１９を参照のこと。化合物１〜３は、それぞれ、ＧＡ、マクベシン、およびラディシコールである。
Figure 2007530596
Figure 2007530596
 示される置換基を有している、式ＩＩＩおよびＩＶに示される２つのさらなる構造が合成され、研究された（実施例を参照のこと）。これらの化合物の１つ（１４）もまた、式ＩまたはＩＩの置換体として上記で明らかにされている。
注目すべきは、本発明の活性のある化合物、特に、ｆｍ−ＧＡｉ活性を有しているものは、酸化型の構造（ベンゾキノン、式Ｉ）または還元型の構造（ヒドロキノン、式ＩＩ）のいずれかを有することができることである。
Figure 2007530596
 他の場所に記載されない限りは、本明細書中に記載されるアルキル、アルコキシ、およびアルケニル部分には、直鎖、分岐鎖、および環状部分、ならびにそれらの組み合わせが含まれ得、そして、用語「ハロ」には、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードが含まれる。１つまたは２つの原子のみを含む基は分岐ではあり得ず、また、環状でもあり得ないことは明白である。さらに、他の場所に記載されない限りは、「状況に応じて置換される」には、０個から最大数（例えば、メチル基については３、フェニル基については５、など）までの置換基が含まれることが意味される。本明細書中で使用される場合は、用語「アルキル」によって、直鎖、分岐鎖、または環状の完全に飽和されている炭化水素残基が示される。炭素原子の数が明記されていない限りは、用語「アルキル」は、Ｃ１−６アルキル基（「低級アルキル」とも呼ばれる）を意味する。「アルキル基」が包括的な意味で（例えば、「プロピル」、「ブチル」、「ペンチル」、および「ヘキシル」など）使用される場合は、それぞれの用語にその全ての異性体形態（直鎖、分岐鎖、または環状）が含まれ得ることが理解されるであろう。
好ましいアルキルはＣ１−６アルキルであり、より好ましくは、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−３アルキルである。直鎖および分岐したアルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソ−ペンチル、１，２−ジメチルプロピル、１，１−ジメチルプロピルである。
シクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロプロピルメチル、シクロプロピルエチル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどである。
アルキル基は、本明細書中で定義されるように、状況に応じて、１つ以上の置換基で置換することができる。適切な置換基としては、以下が挙げられる：ハロ；ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル、トリクロロメチル）；ヒドロキシ；メルカプト；フェニル；ベンジル；アミノ；アルキルアミノ；ジアルキルアミノ；アリールアミノ；ヘテロアリールアミノ；アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、ブトキシ、プロポキシ、フェノキシ、ベンジルオキシなど）；チオ；アルキルチオ（例えば、メチルチオ；エチルチオ）；アシル（例えば、アセチル）；アシルオキシ（例えば、アセトキシ）；カルボキシ（−ＣＯ２Ｈ）；カルボキシアルキル；カルボキシアミド（例えば、−ＣＯＮＨ−アルキル、−ＣＯＮ（アルキル）２など）；カルボキシアリールおよびカルボキシアミドアリール（例えば、ＣＯＮＨ−アリール、−ＣＯＮ（アリール）２）；シアノ；またはケト（ここでは、ＣＨ２基はＣ＝Ｏによって置き換えられる）。
本明細書中で使用される場合は、用語「アルケニル」によって、上記で定義されたように、エチレンモノ−、ジ−、またはポリ−不飽和アルキルまたはシクロアルキル基を含む、少なくとも１つのＣ＝Ｃ二重結合を含む直鎖、分岐鎖、または環状の炭化水素残基から形成される基が示される。したがって、シクロアルケニルもまた意図される。炭素原子の数が特定されていない限りは、アルケニルは、好ましくは、Ｃ２−８アルケニルを意味する。より好ましくは、低級アルケニル（Ｃ２−６）であり、好ましくは、Ｃ２−５アルケニルであり、より好ましくは、Ｃ２−４アルケニルまたはＣ２−３アルケニルである。アルケニルおよびシクロアルケニルの例としては、以下が挙げられる：エテニル、プロペニル、１−メチルビニル、ブテニル、イソ−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、シクロペンテニル、１−メチル−シクロペンテニル、１−ヘキセニル、３−ヘキセニル、シクロヘキセニル、１−ヘプテニル、３−ヘプテニル、１−オクテニル、シクロオクテニル、１−ノネニル、２−ノネニル、３−ノネニル、１−デセニル、３−デセニル、１，３−ブタジエニル、１，４−ペンタジエニル、１，３−シクロペンタジエニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、１，３−シクロヘキサジエニル、１，４−シクロヘキサジエニル、１，３−シクロヘプタジエニル、１，３，５−シクロヘプタトリエニル、および１，３，５，７−シクロオクタテトラエニル。好ましいアルケニルは、直鎖または分岐鎖である。本明細書中で定義される場合は、アルケニル基は、置換されたアルキルについて上記に記載された状況に応じた置換基で、状況に応じて置換することができる。
本明細書中で使用される場合は、用語「アルキニル」により、上記で定義されたように、エチニルモノ−、ジ−、またはポリ−不飽和アルキルまたはシクロアルキル基を含む、少なくとも１つのＣ≡Ｃ三重結合を含む、直鎖、分岐鎖、または環状の炭化水素残基から形成される基が示される。炭素原子の数が特定されていない限りは、この用語は、Ｃ２−６アルキニル（低級アルキニル）、好ましくは、Ｃ２−５アルキニル、より好ましくは、Ｃ２−４アルキニルもしくはＣ２−３アルキニルを意味する。例としては、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、ブチニル（異性体を含む）、およびペンチニル（異性体を含む）が挙げられる。好ましいアルキニルは、直鎖アルキニルまたは分岐したアルキニルである。本明細書中で定義される場合は、アルキニルは、アルキルについて上記に記載された状況に応じた置換基で、状況に応じて置換することができる。
用語「アルコキシ」は、酸素で連結された場合の、それぞれのアルキル基を意味する。ＧＡ（１）は、１７Ｃ位置を置換するメトキシ基（−ＯＣＨ３）を有する（すなわち、式ＩのＲ１が−ＣＨ３である）。この位置を置換することができる他の基としては、Ｃ２−Ｃ６直鎖または分岐鎖のアルコキシラジカル、好ましくは、エトキシおよびプロピルオキシが挙げられる。Ｃ２−Ｃ６直鎖もしくは分岐鎖のアルケノキシ、またはＣ２−Ｃ６アルキノキシ基もまた、この位置に存在する場合がある。
用語「アリール」は、芳香族炭化水素環システムの、１つの、多核の、結合させられたかまたは縮合させられた残基を示す。アリールの例は、フェニル、ビフェニル、およびナフチルである。アリール基は、本明細書中で定義されるように、１つ以上の置換基で状況に応じて置換することができる。したがって、「アリール」は、本明細書中で使用される場合は、置換されたアリールもまた意味する。
本発明の化合物は、Ｒ１がＯＲを示す場合には、式Ｉ／ＩＩのＲ１の中のＲについて以下の置換基を含む：低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、状況に応じて置換された低級アルキル、アルケニル、またはアルキニル；低級アルコキシ、アルケノキシ、およびアルキノキシ；直鎖または分岐したアルキルアミン、アルケニルアミン、およびアルキニルアミンを示す（式中、Ｎは三級である場合も、また四級である場合もある）。
最も好ましいＲ１基は、３〜６員の複素環基であり、好ましくは、Ｎヘテロ原子を１つ含むヘテロアリール基である。３員（アジリジニル）および４員（アゼチジニル）ヘテロアリール環が最も好ましい。より大きな環（ピリジル、ピロリル、ピペリジニルなどを含む）もまた好ましい。
より広範囲では、用語「ヘテロアリール」は、１つの、多核の、結合させられたまたは縮合させられた芳香族複素環システムを示す。ここでは、環炭化水素残基の１つ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換され、複素環芳香族残基が提供される。２つ以上の炭素原子が置換される場合は、置換原子は、２つ以上の同じヘテロ原子である場合も、また２つの異なるヘテロ原子である場合もある。Ｎに加えて、適切なヘテロ原子としては、Ｏ、Ｓ、およびＳｅが挙げられる。複素環には、単結合と二重結合が含まれ得る。本発明の範囲に含まれる基の例は、他のヘテロ原子、縮合環などを有している基であり、これには、チエニル、フリル、インドリル、イミダゾリル、オキサゾリル、ピリダジニル、ピラゾリル、ピラジニル、チアゾリル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、プリニル、キナゾリニル、フェナジニル、アクリジニル、ベノキサゾリル、ベンゾチアゾリルなどが含まれる。本明細書中で定義される場合は、ヘテロアリール基は、利用することができる環位置で、１つ以上の上記置換基（例えば、低級アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルケノキシ基など）で、状況に応じてさらに１置換または２置換することができる。
１つの好ましい実施形態においては、式Ｉ／ＩＩ中のＲ１は、１つ以上のアルキル、カルボキシ、アミド、またはアミノ基（例えば、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−（ＣＨ２）ｍＣＯ２Ｒ１、−（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＯＲ２、−（ＣＨ２）ｍＣＯＮＨＲ２、−（ＣＨ２）ｍＮＨＲ２、−（ＣＨ２）ｍＣＯＮＲ２Ｒ３、または−（ＣＨ２）ｍＣＯＮＲ２Ｒ３（式中、ｍ＝０〜３であり、Ｒ１はＨ、アルキル、またはアリールであり、そしてＲ２またはＲ３は、別々に、Ｈ、アルキル、アリール、またはアシルである））で置換された、置換されたアリール基である。式Ｉ中の他の好ましいＲ１基としては、以下が挙げられる：フェニル；２−メチルフェニル；２，４−ジメチルフェニル；２，４，６−トリメチルフェニル；２−メチル、４−クロロフェニル；アリールオキシアルキル（例えば、フェノキシメチルまたはフェノキシエチル）；ベンジル；フェネチル；２，３または４−メトキシフェニル；２，３または４−メチルフェニル；２，３または４−ピリジル；２，４または５−ピリミジニル；２または３−チオフェニル；２，４または５−（１，３）−オキサゾリル；２，４または５−（１，３）−チアゾリル；２または４−イミダゾリル；３または５−シントリアゾリル。
アルキレン鎖は、例えば、Ａｒｎｄｔ−Ｅｉｓｔｅｒｔ合成によって伸ばすことができる。ここでは、酸塩化物がＣＨ２の挿入によってカルボン酸に変換される。したがって、カルボン酸基は、例えば、ＳＯ２Ｃｌ２での処理によって、その酸塩化物誘導体に変換することができる。酸塩化物誘導体は、ジアゾメタンと反応させてジアゾケトンを形成させることができ、これはその後、Ａｇ２／Ｈ２Ｏまたは安息香酸銀とトリエチルアミンで処理することができる。このプロセスを、アルキレン鎖の長さを伸ばすためにさらに繰り返すことができる。あるいは、アルデヒド（またはケト）基を、Ｗｉｔｔｉｇ型反応（例えば、Ｐｈ３（Ｐ）＝ＣＨＣＯ２Ｍｅ）させて、α，β−不飽和エステルを生じさせることができる。この二重結合の水素化によって、２つの炭素原子によって長さが伸ばされた、アルキレン鎖が得られる。同様の様式で、他のホスホランを使用して、より長い（そして状況によっては、置換されている、分岐している、または不飽和の）炭素鎖を生じさせることができる。
本発明の化合物には、Ｒ１について記載されたものと同じである、式Ｉ／ＩＩのＲ２置換基を有しているものが含まれる。アンサマイシン環は、位置Ｃ１７とＣ１９の両方を、別々に置換することができるが、Ｃ１７が置換されている場合には、Ｒ２はＨであることが好ましい。
式Ｉ／ＩＩの環位置２２でＮに結合したＲ３置換基は、好ましくは、Ｈ（ＧＡおよび本明細書中に例示される化合物においてはそうであるように）、または低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、状況に応じて置換された低級アルキル、アルケニル、またはアルキニル；低級アルコキシ、アルケノキシ、およびアルキノキシ；直鎖および分岐したアルキルアミン、アルケニルアミン、およびアルキニルアミンである（式中、Ｎは三級である場合も、また四級である場合もある）。Ｎは、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロケニル、またはヘテロアリール環の一部である場合もあり、これは状況に応じて置換される。Ｎが環の一部である場合は、３〜６員環であることが好ましく、好ましくは、それ以上のヘテロ原子を含まないものである。アジリジニル、アゼチジニル、ピリジル、ピロリル、ピペリジニルなどが最も好ましい。
Ｏ原子が式Ｉ／ＩＩの環位置Ｃ１１に結合させられ、これは、Ｒ４基で置換される。Ｒ４は、最も好ましくは低級アルキルであるが、これは、低級アルケニル、低級アルキニル、状況に応じて置換された低級アルキル、アルケニル、またはアルキニルである場合もあり、その結果、Ｃ１１に結合した部分は、アルコキシ部分であることが好ましいが、アルケノキシおよびアルキノキシ部分である場合もある。
上記で開示される式Ｉ／ＩＩの種々の置換基に加えて、位置Ｃ２＝Ｃ３、Ｃ４＝Ｃ５、およびＣ８＝Ｃ９の間の環二重結合は、単結合となるように水素化される場合がある。
式Ｉ／ＩＩの環の中の特定の位置での置換基の化学的操作に、他の可能性のある反応基の保護が必要である場合があることは明らかなはずである。適切な条件下での使用に適切な保護基、ならびにそれらの導入および除去のための方法は当該分野で周知であり、Ｇｒｅｅｎ ＴＷら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ，１９９９（その内容は引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。
本発明の化合物は、状況に応じて、診断に有用であるか治療に有用である放射性核種を、その置換された環構造に結合させることも、またはその置換された環構造に含めることもできる。（下記を参照のこと）。化合物は、タンパク質に特異的に結合する標的化部分に結合させることができる。
本発明の１つの実施形態においては、ＷＯ９８／５１７０２（前出）を考慮すると、本発明のＧＡ誘導体（遊離のものであるか、または検出可能であるように標識されて標的化部分に結合されているかどうかにはかかわらず）は、この化合物がＧＡ（化合物１）、化合物１５、または１７−（Ｎ−ヨードエチル−Ｎ−シアノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（放射性ヨウ素を含むもの、または含まないもの））ではないとの条件で、本明細書中に記載される化合物である。しかし、本発明の方法の実施形態には、本発明の使用がこの参考文献には開示されていないという事実に基づいて、このような排除される化合物も含まれる場合がある。
本発明の別の実施形態においては、ＷＯ９５／０１３４２（前出）を考慮すると、遊離のものであるか、または標的化部分に結合させられているか、あるいは、本発明の化合物に対する検出可能な標識で標識されているかどうかにはかかわらず、ＧＡ誘導体は、この化合物がＷＯ９５／０１３４２に開示されているもの、具体的には、１５ページ１９行目から１７ページ１２行目、または実施例２〜９９に列挙されている化合物ではないとの条件で、本明細書中に記載される化合物である。この参考文献の実施例２１には、本発明の化合物８が開示されているが、ｆＭまたはｆＭ未満の濃度で腫瘍細胞に対して活性であるその新しい特性は示唆されていない。
本発明の別の実施形態においては、米国特許第５，９３２，５６６号（Ｓｃｈｎｕｒら，前出）を考慮すると、遊離のものであるか、または検出可能であるように標識されているか、または標的化部分に結合させられているかにはかかわらず、ＧＡ誘導体は本明細書中に記載される化合物である。ただし、この化合物は以下ではない：
１７−アミノ−４，５−ジヒドロ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−メチルアミノ−４，５−ジヒドロ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−シクロプロピルアミノ−４，５−ジヒドロ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−（２’−ヒドロキシエチルアミノ）−４，５−ジヒドロ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−（２−メトキシエチルアミノ）−４，５−ジヒドロ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−（２’−フルオロエチルアミノ）−４，５−ジヒドロ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−ｓ−（＋）−２−ヒドロキシプロピルアミノ−４，５−ジヒドロ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−アゼチジン−１−イル−４，５−ジヒドロ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−（３−ヒドロキシアゼチジン−１−イル）−４，５−ジヒドロ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−アゼチジン−１−イル−４，５−ジヒドロ−１１−α−フルオロ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−アゼチジン−１−イル−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−（２’−シアノエチルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−（２’−フルオロエチルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−アミノ−２２−（２’−メトキシフェナシル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−アミノ−２２−（３’−メトキシフェナシル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−アミノ−２２−（４’−クロロフェナシル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−アミノ−２２−（３’，４’−ジクロロフェナシル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−アミノ−２２−（４’−アミノ−３’−ヨードフェナシル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−アミノ−２２−（４’−アジド−３’−ヨードフェナシル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−アミノ−１１−α−フルオロ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−アリルアミノ−１１−α−フルオロ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−プロパルギルアミノ−１１−α−フルオロ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−（２’−フルオロエチルアミノ）−１１−α−フルオロ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−アゼチジン−１−イル−１１−（４’−アジドフェニル）スルファミルカルボニル−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−（２’−フルオロエチルアミノ）−１１−ケト−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
１７−アゼチジン−１−イル−１１−ケト−１７−デメトキシゲルダナマイシン；および
１７−（３’−ヒドロキシアゼチジン−１−イル）−１１−ケト−１７−デメトキシゲルダナマイシン。
本発明の別の実施形態においては、ＷＯ２００４／０８７０４５（前出）を考慮すると、遊離のものであるか、または標的化部分に結合させられているか、あるいは検出可能な標識で標識されているかにはかかわらず、ＧＡ誘導体は本明細書中に記載される化合物である。ただし、この化合物は、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；１７−２−ジメチルアミノ）エチルアミノ］−デメトキシ−１１−Ｏ−メチルゲルダナマイシン；または１７−Ｎ−アゼチジニル−１７ではない。しかし、本発明の方法の実施形態には、本発明の使用がその参考文献には開示されていないという事実に基づいて、このような排除される化合物が含まれる場合がある。
（画像化のための放射性標識ＧＡ誘導体）
好ましい組成物は、本発明の検出可能であるように、または診断可能であるように標識されたＧＡ誘導化合物であり、これには、好ましくは、インビボで画像化することができるものである検出可能な標識が共有結合させられる。好ましい検出可能な標識は放射性核種であり、具体的には、ＧＡ誘導体に容易に結合させることができるハロゲン原子である。
Ｎを含む複素環（例えば、ＧＡ誘導体のアジリジン環、具体的には、１７−（１−アジリジニル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン（「１７−ＡＲＧ」（これは、本明細書中
では化合物１５である））を開環させるためにＨＸ酸を使用することによって、ハロゲン基Ｘ（＝Ｆ、Ｂｒ，Ｃｌ、Ｉ）を置換する化学反応は、このＧＡ誘導体のフルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨード形態を作製することの詳細については比較的簡単である（実施例１９を参照のこと）。放射性核種原子は共有結合させられる。このようなハロゲン化ＧＡ誘導体は、インビボで、研究、診断、および予後診断のための実験用動物モデルおよびヒトについての有用な造影剤であり得る。
好ましい実施形態においては、１７−（２−ハロエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンは、実施例１９に記載されるように、１５を放射性ＨＸ＊酸（式中、Ｘ＊は、１８Ｆ、７６Ｂｒ、７６Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、または１３１Ｉ）と反応させることによって作製される。
これらの核種のいくつかのの特性の概要が以下に示される（いくつかは、Ｖａｌｌａｂｈａｊｏｓｕｌａ，Ｓ，Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ３，Ｎｕｃｌｅａｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｉ Ｋｈａｌｋｈａｌｉら編）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１，ｐ．３３より得られる）。
Figure 2007530596
Figure 2007530596
 １２５Ｉと１３１Ｉは、２つのさらなる放射性核種であり；いずれも、治療薬としての有用性と、さらには、診断的な有用性を有している可能性がある。１２５Ｉは電子の捕捉によって崩壊し、そしてオージェ電子と、β線とを放射する。１３１Ｉはβ放射体である。１２５Ｉは、小動物の画像化、例えば、シンチグラフィーまたは単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）による腫瘍の画像化のために特に有用である。ＳＰＥＣＴの一般的な記述については、Ｈｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｓｅｍ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１７：１８３−１９９（１９８７）；Ｃｅｒｑｕｉｅｒａ，Ｍ．Ｄ．ら，Ｓｅｍ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１７：２００−２１３（１９８７）；Ｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．ら，Ｓｅｍ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１７：２１４−２１９（１９８７）を参照のこと。
インビボでの画像化に使用される放射性核種である１２３Ｉは粒子は放射しないが、１４０〜２００ｋｅＶの範囲で多数の光子を生じる。これは、従来のγカメラで容易に検出することができる。
これらのタイプの標識により、組織試料中のＭｅｔを保有している細胞の検出または定量が可能であり、したがって、Ｍｅｔ（もしくはそのＨＧＦへの結合）の発現またはその発現の増強が病理学的マーカーとしてもしくは診断マーカーとしての役割を担っているか、および／もしくは治療標的（特に、ガン）としての役割を果たす疾患において、診断ツールまたは予後診断ツールとして使用することができる。
したがって、好ましい診断方法はＰＥＴ画像診断法、シンチグラフィー分析、およびＳＰＥＣＴである。これらは、連続的な全身の画像を生じる様式で行うことができ、そして、定量的な「関心領域（ＲＯＩ）」の分析によって局所的な活性の決定が可能である。特に、動物モデルについての画像化手順および分析の例は、Ｇｒｏｓｓ ＭＤら，（１９８４）Ｉｎｖｅｓｔ Ｒａｄｉｏｌ １９：５３０−５３４；Ｈａｙ ＲＶら，（１９９７）Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｃｏｍｍｕｎ １８：３６７−３７８に記載されている。
（薬学的組成物、それらの処方と使用）
式Ｉ／ＩＩの化合物、およびそれらの薬学的に許容される塩は、非常に極めて強力な抗腫瘍薬／抗ガン剤として有用であり、ＨＧＦ／ＳＦとそのレセプターであるＭｅｔの間の特定の細胞性の相互作用、またはその後の結合を阻害することによって作用するようである。これらはまた、制御されていない細胞の増殖（例えば、ＥＧＦレセプター、ＮＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプター、およびインシュリンレセプター）において重要な役割を担っている、他の成長因子／レセプター相互作用を阻害することにおいても有用であり得る。
本発明の薬学的組成物には、当該分野で公知であるように、処方物中にＦＭ−ＧＡｉ化合物が含まれる。本発明の範囲内にある薬学的組成物には、ｆＭ−ＧＡｉ化合物がその意図される目的を達成するために有効な量で含まれている全ての組成物が含まれる。個々の必要性は異なるが、それぞれの成分の有効量の最適範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。典型的な投与量には、０．０１ｐｇから１００μｇ／ｋｇ／体重、より好ましくは、１ｐｇから１００μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、１０ｐｇ〜１０μｇ／ｋｇ体重が含まれる。
薬学的活性のある分子に加えて、薬学的組成物には適切な薬学的に許容されるキャリアが含まれる場合がある。これには、活性のある化合物の、当該分野で周知であるような薬学的に使用することができる調製物への処理を容易にする賦形剤および助剤が含まれる。注射または経口による投与のための適切な溶液には、賦形剤とともに、約０．０１から９９％の活性のある化合物（単数または複数）を含めることができる。
本発明の薬学的調製物は、公知の様式で、例えば、従来の混合、造粒、溶解、または凍結乾燥プロセスによって製造される。適切な賦形剤としては、増量剤、結合剤、崩壊剤、助剤、および安定剤を挙げることができる。これらは全て当該分野で公知である。非経口投与に適している処方物としては、水溶性形態のタンパク質（例えば、水溶性の塩）の水溶液が挙げられる。化合物は、好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させられ、水性の静脈内（ｉ．ｖ．）処方物になるように混合されたＤＭＳＯ溶液としてｉ．ｖ．投与される（１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンの投与の記述については、Ｇｏｅｔｚ ＪＰら，２００５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００５、２３：１０７８−１０８７を参照のこと）。別の化合物である１７−（２−ジメチルアミノエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンは、上記のようにＤＭＳＯ中でｉ．ｖ．で投与することも、また別の処方物で経口投与することもできる。本発明の化合物および方法については、好ましい溶媒は、標準的な水性のｉ．ｖ．溶液になるようにさらに希釈されたＤＭＳＯである。
さらに、適切な油状の注射懸濁液としての活性のある化合物の懸濁液が投与される場合がある。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ゴマ油または合成の脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が挙げられる。水性の注射懸濁液には、懸濁液の粘性を増大させる物質が含まれる場合がある。
組成物は、凍結乾燥させられた粒子物質、滅菌または無菌的に生産された溶液、錠剤、アンプルなどの形態であり得る。水（好ましくは、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水中のように、生理学的に許容されるｐＨに緩衝化させられたもの）または適切な有機溶媒のようなビヒクル、他の不活性な固体物質もしくは液体物質（例えば、生理食塩水または種々の緩衝液）が存在する場合がある。特定のビヒクルは重要ではなく、当業者であれば、どのビヒクルを本明細書中に記載される任意の特定の用途に使用するかを知っているであろう。
一般的な用語において、薬学的組成物は、本発明の高分子または高分子結合体を、１つ以上の非水溶性または水溶性の水性ビヒクルまたは非水性ビヒクルと混合する、その中に溶解させる、それらと結合させる、または別の方法で組み合わせることによって調製される。ビヒクル、キャリア、または賦形剤、さらには組成物の処方のための条件は、活性のある化合物の生物学的または薬学的活性に悪影響を及ぼさないことは絶対に必要である。
（被験体、処置様式、および投与経路）
本発明の好ましい動物被験体は哺乳動物である。本発明は、ヒト被験体の処置に特に有用である。用語「処置する」によって、ｆＭ−ＧＡｉ化合物を含む薬学的組成物の被験体への投与が意図される。処置には、臨床的な疾患の兆候の前にＭｅｔ陽性腫瘍を発症するリスクのある被験体、ならびに、そのような腫瘍またはガンと診断された、まだ処置されていないかまたは他の手段（例えば、外科手術、従来の化学療法）によって処置されている被験体に薬剤を投与することが含まれ、その被験体の腫瘍組織量が検出できないレベルにまで減少させられる。したがって、本発明は、腫瘍の一次成長、腫瘍増殖の再発、浸潤、および／または転移、あるいは転移性の増殖を防ぐこと、または阻害することにおいて有用である。
ｆＭ−ＧＡｉ化合物が薬学的に許容される賦形剤またはキャリアと混合される本発明の薬学的組成物は、それらの意図される目的を達成する任意の手段によって投与することができる。投与のための量およびレジメンは、任意の特定の疾患の処置の臨床分野の当業者であれば容易に決定することができる。好ましい量は以下に記載される。
本発明の活性のある化合物は、経口で、局所的に、非経口的に、吸入スプレーによって、直腸に、従来の非毒性の薬学的に許容されるキャリア、アジュバント、およびビヒクルを含む投与単位の処方物として投与することができる。
一般的には、本発明の方法には、被験体の疾患および症状にについて任意の公知であり適切な経路を使用する、注射または注入を含む非経口的経路による投与が含まれる。非経口的経路には、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内、腹腔内、クモ膜下腔内、クモ膜下槽内、経皮、局所、直腸、または吸入が含まれる。直接の腫瘍内注射もまた含まれる。あるいは、または同時に、投与は経口経路によって行われる場合もある。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康状態、体重、現在行われている処置の種類（行われている場合）、処置の頻度、および所望される作用の性質に応じて様々である。好ましくは、本発明の活性のある化合物は、従来の非毒性の薬学的に許容されるキャリア、アジュバント、およびビヒクルを含む投与量単位処方物において投与される。
１つの処置アプローチにおいては、複数の化合物と複数の方法が、外科手術と組み合わせて適用される。したがって、有効量のｆＭ−ＡＧｉ化合物が、腫瘍（原発腫瘍であるかまたは転移性腫瘍であるかにはかかわらず）の外科手術による切除部位に直接投与される。これは、開腹された外科手術部位に注射または「局所」投与によって、あるいは、縫合後に注射によって行うことができる。
１つの実施形態においては、規定量の化合物（好ましくは、約１ｐｇ〜１００μｇ）が
室温のヘパリン化された生理食塩溶液で１：１に稀釈された約７００ｍｌのヒト血漿に添加される。５００μｇ／ｄｌの濃度のヒトＩｇＧ（７００ｍｌの全容量中）もまた使用される場合がある。溶液は、室温で約１時間、静置される。その後、溶液の容器は、ｉｖ注入ラインに直接取り付けられ、約２０ｍｌ／分の好ましい速度で被験体に投与される。
別の実施形態においては、薬学的組成物は、被験体に直接ｉ．ｖ．注入される。適切な量（好ましくは、１ｐｇ〜１００μｇ）が、約２５０ｍｌのヘパリン化生理食塩溶液に添加され、約２０ｍｌ／分の速度で患者にｉｖ注入される。
組成物は一度だけ投与することができるが、通常は、６回から１２回（またはそれ以上、経験によって決定することは当業者の能力の範囲内である）投与される。処置は、毎日行うことができるが、一般的には、有用性と、被験体において観察される任意の毒性作用に応じて、２日毎から３日毎に行われるか、まれには１週間に１回行われる。経口経路による場合には、薬学的組成物（好ましくは、便利な錠剤またはカプセル剤の形態のもの）が１日に１回以上投与される場合もある。
本発明にしたがう全身投与のための薬学的処方物は、腸、非経口的、または局所投与のために処方することができ、そして、３つのタイプの処方物は全て、有効成分の全身投与を達成するために同時に投与される場合がある。
肺への滴下のためには、エアロゾル溶液が使用される。噴霧することができるエアロゾル調製物においては、活性のあるタンパク質または小分子薬剤が、固体または液体の不活性なキャリア物質と組み合わせられる場合がある。これは、スクイーズボトルに、または加圧された揮発性の、通常は気体の噴霧剤と混合して、パッケージすることができる。エアロゾル調製物には、溶媒、緩衝液、界面活性剤、および抗酸化剤を、本発明のタンパク質に加えて含めることができる。
器官を包むさや（「皮膜」）の中に腫瘍が出現することにより、多くの場合には、器官のさやの中に多量の流体の生産および蓄積が生じる。例として、（１）肺周囲の肺のさやの中の流体が原因である胸水、（２）腹膜内での流体の蓄積によって生じる腹水、および（３）髄膜の転移性ガン腫が原因である脳水腫が挙げられる。このような滲出および流体の蓄積は、一般的には、疾患の進行した段階で生じる。本発明では、窩または空隙（例えば、腫瘍を含む、腹膜、外皮空隙、心嚢および胸膜の空隙）への直接の薬学的組成物の投与が想定される。すなわち、薬剤は、腫瘍細胞を含む液腔に、または腫瘍を含む胸膜、腹膜、心嚢、および外皮空隙のような膜の近くに直接投与される。これらの部位は、悪性の腹水、胸膜および心嚢の滲出、あるいは髄膜癌腫症を示す。薬剤は、好ましくは、流体（例えば、腹水、胸水、または心嚢の滲出）の一部または完全な排水の後に投与されるが、滲出、腹水、および／またはガン腫症を含む排水されていない空隙に直接投与される場合もある。一般的には、ｆＭ−ＣＡｉ化合物の用量は、１フェムトグラムから１０μｇまで、好ましくは、１ｐｇから１μｇまでで変化し得、そして３日から１０日毎に投与される。これは、腹水または滲出の再貯留がなくなるまで続けられる。治療応答は、最後の胸膜内投与の４週間後にさらなる貯留がないことと考えられる。
局所投与については、活性のある化合物は、罹患した領域に活性成分を直接投与するための手段としての、軟膏（ｓａｌｖｅ）または膏薬（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）のような局所塗布されるビヒクルに処方することができる。ワクチン接種の研究から知られている乱切方法もまた使用することができる。有効成分についてのキャリアは、噴霧することができる形態、または噴霧することができない形態のいずれであってもよい。噴霧することができない形態は、半固体または固体の形態であり得、これには、局所塗布に特有のキャリアが含まれ、好ましくは水よりも大きい動粘性係数を有している。適切な処方物としては、液剤、懸濁剤、乳濁剤、クリーム剤、膏薬（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、粉剤、塗布薬、軟膏（ｓａｌｖｅ）などが挙げられるが、これらに限定はされない。所望される場合には、これらは滅菌される場合も、また、助剤（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝液、または浸透圧に影響を与える塩など）と混合される場合もある。噴霧することができない局所調製物についての好ましいビヒクルの例としては、膏薬基剤（例えば、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）；ＨＥＢクリームのような従来のクリーム剤；ゲル剤；ならびに石油ゼリーなどが挙げられる。
本発明の他の薬学的に許容されるキャリアは、当該分野で公知の、リポソームまたは他の時限放出もしくは徐放キャリアまたは薬剤投与デバイスである。
（化学療法薬および生物学的抗ガン剤との併用）
化学療法薬は、本発明の化合物と一緒に、当業者によって容易に決定される任意の従来の経路と用量で使用することができる。本発明において有用である抗ガン化学療法薬としては、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、ビンカ・アルカロイド、抗チューブリン薬、抗生物質、およびアルキル化剤が挙げられるが、これらに限定はされない。単独で、または組み合わせて使用することができる代表的な特異的な薬剤としては、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテーレ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、ベラパミル、ポドフィロトキシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキセート、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、アミノプテリン、コンブレタスタチン（単数または複数）、ならびにそれらの誘導体およびプロドラッグが挙げられる。
適切である場合には、このような薬剤の任意の１つ以上、腫瘍遺伝子のシグナル伝達経路を標的化するさらに新しい薬剤、またはアポトーシスを誘導するかもしくは血管形成を阻害する新しい薬剤、ならびに、生物学的産物（例えば、核酸分子、ベクター、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ構築物、およびリボザイム）が、本発明の化合物および方法と組み合わせて使用される場合がある。このような薬剤および治療方法の例としては、放射線治療薬、抗腫瘍薬（例えば、植物、真菌、もしくは細菌に由来する毒素または凝固剤、リシンＡ鎖、脱グリコシル化されたリシンＡ鎖、リボソーム不活化タンパク質、サルシン、ゲロニン、アスペルギリン、レストリクチシン、リボヌクレアーゼ、エピポドフィロトキシン、ジフテリア毒素、またはシュードモナス外毒素）と結合させられた抗腫瘍抗体が挙げられる。腫瘍細胞を死滅させることができるか、あるいは腫瘍細胞の増殖または分裂を抑制することができるさらなる細胞傷害性の、細胞増殖抑制性の、または抗細胞性の薬剤としては、抗血管形成薬、アポトーシス誘導薬、凝固剤、プロドラッグ、または腫瘍標的化形態、チロシンキナーゼインヒビター、アンチセンスストラテジー、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ならびにＶＥＧＦまたはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイムが挙げられる。多数のチロシンキナーゼインヒビターのうちの任意のものが、本発明の化合物とともに、または本発明の化合物の後で投与された場合に有用である。これらとしては、例えば、４−アミノピローロ［２，３−ｄ］ピリミジン（米国特許第５，６３９，７５７号）が挙げられる。ＶＥＧＦ−Ｒ２レセプターを介するチロシンキナーゼによるシグナル伝達を調節することができる有機低分子のさらなる例は、キナゾリン化合物および組成物である（米国特許第５，７９２，７７１号）。本発明と組み合わせて使用することができる他の薬剤は、ステロイド（例えば、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）４，９（１１）−ステロイドおよびＣ２１−酸素化ステロイド）である（米国特許第５，９７２，９２２号）。
サリドマイドおよび関連化合物、前駆体、アナログ、代謝産物、および加水分解産物（米国特許第５，７１２，２９１号および同第５，５９３，９９０号）もまた、血管形成を阻害するために組み合わせて使用される場合がある。これらのサリドマイドおよび関連化合物は経口投与することができる。腫瘍の退行を引き起こす他の抗血管形成薬としては、細菌の多糖ＣＭ１０１（現在臨床試験の段階にある）および抗体ＬＭ６０９が挙げられる。ＣＭ１０１は、腫瘍内で血管新生炎症を誘導し、ＶＥＧＦおよびそのレセプターの発現をダウンレギュレートする。トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）および血小板因子４（ＰＦ４）は、ヘパリンと結合し、血小板α顆粒の中で見られる血管形成のインヒビターである。インターフェロンおよびマトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター（ＭＭＰＩ）は、使用することができる、自然界に存在している血管形成インヒビターの２つの他のクラスである。メタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）の組織インヒビターは、自然界に存在しているＭＭＰＩのファミリーであり、これもまた血管形成を阻害する。他の十分に研究された抗血管形成薬はアンギオスタチン、エンドスタチン、バスキュロスタチン、カンスタチン、およびマスピンである。
化学療法薬は、単剤としてまたは多剤の組み合わせとして、１回の処置サイクルについて全投与量または少ない投与量で投与される。低用量の単剤である化学療法薬との本発明の組成物の併用が特に好ましい。このような組み合わせにおける化学療法薬の選択は、根本的な悪性腫瘍の性質によって決定される。肺腫瘍については、シスプラチンが好ましい。乳ガンについては、微小管インヒビター（例えば、タキソテーレ）が好ましい。消化器系腫瘍が原因である悪性腹水については、５−ＦＵが好ましい。「低用量」は、化学療法薬について使用される場合は、その薬剤についての承認されている（米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって）投与量未満の１０〜９５％である単剤の用量を意味する。レジメンが併用化学療法から構成される場合は、それぞれの薬剤の用量は同じ割合に減少させられる。ＦＤＡで承認されている投与量の＞５０％の減少が好ましいが、治療効果は、このレベルよりも上または下で見られ、これには最小の副作用が伴う。種々の部位の多発性腫瘍は、ｆＭ−ＧＡｉ化合物の全身投与によって、またはクモ膜下腔内投与もしくは腫瘍内投与によって処置される場合がある。
主要なヒトの腫瘍の全てについての最適な化学療法薬および併用レジメンは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ａｂｒａｈａｍ Ｊら，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２００１）；Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第４版，Ｃａｓｃｉａｔｏ，ＤＡら，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２０００）に示されている。これらはいずれも、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
（ｆＭ−ＧＡｉ化合物のインビボ試験）
ｆＭ−ＧＡｉ化合物は、ヒト腫瘍の典型と考えられる、十分に確立された齧歯類モデルにおいて治療効力について試験することができる。全体的なアプローチは、Ｇｅｒａｎ，Ｒ．Ｉ．ら，“Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ａｎｉｍａｌ Ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（第３版）”，Ｃａｎｃ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｐａｒｔ ３，３：１−１１２；およびＰｌｏｗｍａｎ，Ｊら，Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ，編，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ：Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｒｏｖａｌ，Ｐａｒｔ ＩＩ：Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ６，“Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ＮＣＩ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９７に詳細に記載されている。これらの参考文献はいずれも、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
（ヒト腫瘍の異種移植モデル）
国立ガン研究所（ＮＣＩ）によって行われた抗ガン剤の前臨床的発見および開発は、一連の試験手順、データのまとめ、および決定工程から構成されている（Ｇｒｅｖｅｒ，ＭＲ，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，１９：６２２−６３８（１９９２））。試験手順は、比較定量データが得られるように設計され、これによって、次いで、所定の化学的なクラスまたは生物学的なクラスから最良の候補の物質が選択できる。以下では、本発明者らは、前臨床薬の開発に現在使用されているヒト腫瘍の異種移植システム、特に、黒色腫について記載する。
１９７５年から、薬剤の発見のためのＮＣＩのアプローチには、ｉ．ｐ．移植されたマウスＰ３８８白血病モデル（上記を参照のこと）の中での化合物の予備スクリーニング、その後の、ヒトの固形腫瘍を含む移植可能な腫瘍のパネルの中での選択された化合物の評価が含まれる（Ｖｅｎｄｉｔｔｉ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｇａｒｒａｔｔｉｎｉ Ｓら，編，Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ２：１−２０（１９８４））。後者は、免疫不全胸腺欠損ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスの開発、およびこれらのマウスへのヒト腫瘍異種移植片の移植によって可能になった（Ｒｙｇａａｒｄ，Ｊ．ら，Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．７７：７５８−７６０（１９６９）；Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａ，Ｇ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．５１：６１５−６１９（１９７３））。選択されたマウスおよびヒトの腫瘍細胞株（Ｂ１６、Ａ−３７５、ＬＯＸ−ＩＭＶＩ黒色腫、およびＰＣ−３前立腺腺ガン）の転移の可能性および実験用の薬剤の評価についてのそれらの適性を評価する研究は、解剖上適切である宿主組織への腫瘍材料の移植によって誘導されるインビボモデルの重要性を支持した；このようなモデルは、特異的な腫瘍タイプに対する活性を阻害する化合物の詳細な評価に十分に適している。１９９０年ごろから、ＮＣＩでは、大規模な薬剤のスクリーニングのためにヒト腫瘍細胞株が使用され始めた（Ｂｏｙｄ，ＭＲ，ｉｎ：ＤｅＶｉｔａ，ＶＴら，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｕｐｄａｔｅｓ，ｖｏｌ ３，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｉｃｏｔｔ，１９８９、ｐｐ１−１２；Ｐｌｏｗｍａｎ，前出）。７つのタイプのガン（脳腫瘍、結腸ガン、白血病、肺ガン、黒色腫、卵巣ガン、および腎臓ガン）に由来する細胞株が、広い範囲の供給源から獲得され、凍結させられ、一連のインビトロおよびインビボでの特性決定に供された。このアプローチで「化合物に向けられた」薬剤の発見から「疾患に向けられた」薬剤の発見へとスクリーニングストラテジーがシフトした（Ｂｏｙｄ、前出）。疾患特異的なディファレンシャルな細胞傷害性を示す、スクリーニングによって同定した化合物が、さらなる前臨床的評価のための「手掛かり」と考えられた。一連のヒト腫瘍の異種移植モデルは、そのような要件に対応するように作成された。
マウスで確立させた最初の固形腫瘍は、腋窩の近くにｓ．ｃ．移植した３０〜４０ｍｇの腫瘍断片の連続継代によって維持される。異種移植片は、一般的には、容積倍加時間が安定するまで、通常は４回または５回の継代の間は、薬剤の評価には利用されない。
異種移植片のインビボでの増殖特性により、特に、異種移植片が初期段階のｓ．ｃ．モデルとして利用される場合には、試験薬剤の抗腫瘍活性の評価における使用についてのそれらの適性が決定される。本明細書中で使用される場合は、初期段階のｓ．ｃ．モデルは、処置の開始前にその腫瘍が６３〜２００ｍｇの段階にあるものと定義される。腫瘍を評価することにおいて考慮される増殖特性としては、割合（ｔａｋｅ−ｒａｔｅ）、２００ｍｇに達するまでの時間、倍加時間、および自発的な退行のしやすさが挙げられる。より早く増殖する腫瘍は、より高い評価が与えられる傾向があることが注目され得る。
当該分野で公知の多数のトランスジェニックマウスモデルのうちの任意のものを、本発明の化合物を試験するために使用することができる。特に有用なマウスのヒトＨＧＦ／ＳＦトランスジェニックモデルは、本発明者らとその共同研究者らのものに記載されており、インビボでヒト腫瘍の異種移植片に対して本発明の化合物を試験するために使用することができる。Ｚｈａｎｇ ＹＷら，（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４：１０１−１０６；米国仮特許出願第６０／５８７，０４４号を参照のこと（これらはそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。他のより以前から公知のモデルは以下に記載される。
（進行した段階の皮下異種移植モデル）
このようなｓ．ｃ．移植された腫瘍異種移植モデルは、臨床的に関係している活性のパラメーター（例えば、部分退行および完全退行、ならびに寛解の期間）を決定することを可能にする条件下で、試験薬剤の抗腫瘍活性を評価するために使用される（Ｍａｒｔｉｎ ＤＳら、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｐ ６８：３７−３８（１９８４）；Ｍａｒｔｉｎ ＤＳら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：２１８９−２１９２（１９８６）；Ｓｔｏｌｆｉ，ＲＬら、Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃ Ｉｎｓｔ ８０：５２−５５（１９８８））。腫瘍の増殖がモニタリングされ、腫瘍が１００〜４００ｍｇの重量範囲に達すると（分類日（ｓｔａｇｉｎｇ ｄａｙ）、重量の中央値約２００ｍｇ）、試験薬剤での処置が開始されるが、異種移植片に依存して、腫瘍はより大きいサイズで分類される（ｓｔａｇｅｄ）場合がある。腫瘍の大きさおよび体重は、およそ２回／週で得られる。（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｒａｎｃｈ ｏｆ ＤＴＰ ｏｆ ｔｈｅ ＮＣＩのスタッフによって開発された）ソフトウェアプログラムを通じてデータが保存され、効果についての種々のパラメーターが計算され、データが、グラフおよび表の両方の形式で提示される。毒性および抗腫瘍活性のパラメーターは以下のように定義される：
１．毒性：薬物関連の死（ＤＲＤ）および平均の正味の体重の減少に対する最大割合の両方が決定される。処置された動物の死は、最後の処置後１５日以内に動物が死亡し、そして、その腫瘍の重量がコントロールのマウスにおける致死的な量よりも小さいか、または死亡時のその正味の体重の減少が、死亡時または屠殺時のコントロールについての平均の正味の体重の変化よりも２０％大きいかのいずれかである場合に、処置に関係していると推測される。ＤＲＤはまた、研究者によって指定される場合もある。それぞれの観察日での各群のマウスの平均の正味の体重は、分類日の平均の正味の体重と比較される。生じた何らかの体重の減少は、分類日の体重の割合として計算される。これらの計算はまた、コントロールマウスについても行われる。なぜなら、いくつかの異種移植片の腫瘍増殖は、体重に対して悪影響を有するからである。
２．最適なＴ／Ｃ％：各処置群（Ｔ）およびコントロール群（Ｃ）の腫瘍の重量（Ａ重量）の変化は毎日計算され、腫瘍は、特定の観察日の腫瘍の重量の中央値から最初の処置日（分類日）の腫瘍の重量の中央値を引くことによって測定される。これらの値は、Ｔ／Ｃのパーセントを計算するために、以下のように使用される：
Ｔ／Ｃ％＝（ΔＴ／ΔＣ）×１００、ここでは、ΔＴ＞０または
＝（ΔＴ／ＴＩ）×１００、ここでは、ΔＴ＜０ （１）
そして、Ｔ１は処置の開始時の腫瘍の重量の中央値である。初回の処置過程の終了後に得られた最適（最小）値が、抗腫瘍活性を定量化するために使用される。
３．腫瘍増殖の遅延：これは、処置された群の重量が特定の数の倍加に達する（その分類日の重量からの）ことにおいて遅れる割合として、以下の式を使用してコントロールと比較して表される：
［（Ｔ−Ｃ）／Ｃ］×１００ （２）
ここで、ＴおよびＣは、それぞれ、処置群およびコントロール群についての、特定の大きさ（腫瘍を有していないマウスおよびＤＲＤを除く）に達するまでの時間の中央値（日数）である。増殖の遅延は、腫瘍の増殖速度を考慮してコントロールのパーセントとして表される。なぜなら、（Ｔ−Ｃ）のみに基づく増殖の遅延は、腫瘍の増殖速度の差をともなって有意に異なるからである。
４．正味の対数での細胞の死滅：処置の終了時に死滅した細胞のｌｏｇ１０単位の数の概算は以下のように計算される：
｛［（Ｔ−Ｃ）−処置期間］×０．３０１／倍加時間の中央値｝ （３）
ここで、「倍加時間」は、２００ｍｇから４００ｍｇに腫瘍の大きさが増大するために必要な時間であり、０．３０１は２のｌｏｇ１０であり、ＴおよびＣは、処置された腫瘍およびコントロールの腫瘍についての、特定の数の倍加に達するまでの時間の中央値（日数）である。処置期間が０である場合は、正味の対数での細胞の死滅についての式、および対数での細胞の死滅が増殖の遅延の割合と比例する増殖の遅延のパーセントから見ることができる。０の対数での細胞の死滅は、処置の終了時の細胞の集団が処置の開始時と同じであることを示す。＋６の対数での細胞の死滅は、細胞集団の９９．９９９９％の減少を示す。
５．腫瘍の退行：臨床関連の終点としての動物モデルにおける腫瘍の退行の重要性は、幾人かの研究者らによって提議されている（Ｍａｒｔｉｎら、１９８４，１９８６、前出；Ｓｔｏｌｆｉら、前出）。退行は、腫瘍の重量が処置の開始時の腫瘍の重量の５０％以下に減少し、６３ｍｇ（５×５ｍｍの腫瘍）未満にならない場合に、部分的と定義される。完全退行（ＣＲ）および腫瘍のない状態で生存しているものはいずれも、実験期間の間に、腫瘍量が測定できる限界以下にまで小さくなる（＜６３ｍｇ）という事例によって提議される。２つのパラメーターは、最後の観察日の前の、腫瘍の再生（ＣＲ動物において）または再生がないこと（腫瘍を有さない動物において）のいずれかの観察によって異なる。当業者は、より小さい腫瘍を測定することができるが、４×４ｍｍまたは５×５ｍｍ（それぞれ、３２および６３ｍｇ）よりも小さいｓ．ｃ．腫瘍の測定の精度には疑問がある。また、一旦、比較的大きい腫瘍が６３ｍｇにまで退行すると、残っている腫瘍の組成は、繊維性の物質／瘢痕組織だけである場合がある。処置の中断後の腫瘍の再生の測定によって、腫瘍細胞が処置をこえて生存したか否かについてのより信頼できる指標が提供される。
ｓ．ｃ．で増殖するほとんどの異種移植片は、進行した段階のモデルに使用することができるが、いくつかの腫瘍については、研究期間は腫瘍の壊死によって制限され得る。上記のように、このモデルによって、臨床的に関連するパラメーターの測定が可能であり、そして腫瘍の増殖に対する試験薬剤の効果についての豊富なデータが提供される。また、分類日から、研究者らは、血管形成が腫瘍の領域において生じ、分類によって、「所見がないもの（ｎｏ−ｔａｋｅ）」を実験から排除することができる。しかし、このモデルは、時間およびマウスに関してコストがかかり得る。ゆっくりと増殖する腫瘍については、マウスに腫瘍を移植することが十分にできるようになるまでに必要な継代時間は、少なくとも約４週間であり、さらに２〜３週間が、腫瘍を分類できるようになるまでに必要である場合がある。腫瘍を分類するためには、実際の薬物試験に必要とされるよりも、さらに多くのマウス（５０〜１００％さらに多い）に移植しなければならない。
（初期の処置および初期段階の皮下異種移植モデル）
これらのモデルは、進行した段階のモデルと似ているが、処置が腫瘍の発生に関してより早い時期に開始されるので、有用な腫瘍は、≧９０％の割合（ｔａｋｅ−ｒａｔｅ）（または＜１０％の自発的な退行速度）を有している腫瘍である。「早期処置モデル」は、処置が腫瘍が測定可能になる前（すなわち、＜６３ｍｇ）に開始されるモデルと定義される。「初期段階」のモデルは、処置が、腫瘍の大きさが６３〜２００ｍｇの範囲である時点で開始されるモデルである。６３ｍｇの大きさは、これが元の移植片（約３０ｍｇ）がいくらかの増殖を示したことを示すので、使用される。毒性のパラメーターは、進行した段階のモデルについてのパラメーターと同じであり；抗腫瘍活性のパラメーターも同様である。％Ｔ／Ｃ値は、腫瘍の重量の変化（Δ）として測定される代わりに、各観察日での腫瘍の重量の中央値から直接計算され、そして増殖の遅延は、腫瘍が特定の大きさ（例えば、５００または１０００ｍｇ）に達するために必要な移植後の日数に基づく。腫瘍を有していないマウスが記録されるが、ビヒクルで処置されたコントロール群が、同様の増殖特性を有しているマウスの＞１０％を含む場合には、「所見がないもの」または自発的な退行として指定される場合もある。「所見がないもの」は、確立させること、および徐々に増殖させることができなかった腫瘍である。自発的な退行（移植の失敗）は、増殖期間の後、その最大の大きさの≦５０％に減少した腫瘍である。腫瘍の退行は、通常は記録されない。なぜなら、これらは、初期段階のモデルにおいては、必ずしも抗腫瘍性効果の良好な指標ではないからである。早期処置モデルの主要な利点は、全ての移植されたマウスを使用する能力であり、これは、良好な腫瘍の採取割合（ｔａｋｅ−ｒａｔｅ）が必要とされるとの理由からである。実際には、このモデルに最も適している腫瘍は、より早く増殖するものである傾向がある。
（チャレンジを生き残るモデル）
別のアプローチでは、宿主の寿命に対するヒト腫瘍の増殖の効果が決定される。最後の観察日の前に瀕死の状態または広い範囲に及ぶ腹水に起因して死亡したかまたは屠殺された全てのマウスが、処置群（Ｔ）およびコントロール群（Ｃ）についての死亡日の中央値を計算するために使用される。これらの値は、寿命の延長（「ＩＬＳ」）の割合を計算するために、以下のように使用される：
ＩＬＳ％＝［（Ｔ−Ｃ／Ｃ）］×１００ （４）
可能な場合、滴定群が、ｌｏｇ１０での細胞の死滅の計算に使用される腫瘍の倍加時間を確立させるために含められる。死亡（または屠殺）は、目視観察および／または剖検の結果に基づいて、薬物関連と指定され得る。別の方法では、処置された動物の死は、死亡日がコントロールの平均死亡日よりも前にある場合（−２ＳＤ）、または動物が最後の処置後１５日以内に腫瘍の兆候を示さずに死亡した場合には、処置関連と指定される。
（標準薬剤に対する異種移植動物モデルの応答）
進行した段階のｓ．ｃ．異種移植モデルについての薬物感受性プロフィールを得ることにおいては、試験薬剤は、多用量レベルでのｉ．ｐ．投与後に評価される。活性の割合は、所定の腫瘍の倍加時間に基づいて選択された所定の処置スケジュールについての各薬物の最大耐用量（＜ＬＤ２０）を用いて得られる最適効果に基づき、よりゆっくりと増殖する腫瘍については処置の間の間隔はより長い。
Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｊ．ら、（前出）に記載されているように、少なくとも最少の抗腫瘍効果（％Ｔ／Ｃ≦４０）が、少なくとも２つ、そして１０個ほどの臨床薬物によって黒色腫の群において生じた。応答の数は、倍加時間と、腫瘍について観察される応答の数の範囲を含む組織のタイプに無関係であるようであった（他の腫瘍のタイプのそれぞれのサブパネルにも見られる）。応答が、腫瘍の部分退行または完全退行のより臨床的に関係する終点に関して考えられる場合には、これらの腫瘍モデル（全ての腫瘍にわたる）は、標準薬物療法に関しては極めて難治性であり；全部で４８の腫瘍のうちの３０の腫瘍（６２．５％）は、試験された薬物のいずれにも応答しなかった。
（インビボでの最初の化合物の評価のためのストラテジー）
インビトロでの最初のスクリーニングは、インビボでの追跡試験のための使用に最も適している腫瘍株を選択するための基準を提供する。ここでは、それぞれの化合物は、インビトロで薬剤に対して最大の感受性を示す細胞株に由来する異種移植片に対してのみ試験される。インビボ試験のための初期のストラテジーでは、進行した段階の腫瘍を有している動物の処置が重視される。
本明細書での用量の選択を導くために利用することができる特異的な情報に基づいて、代表的な試験薬剤について使用される用量よりもはるかに低い用量が選択される。１匹のマウスは、好ましくは、１ｐｇ／ｋｇと１ｍｇ／ｋｇとの間の１回のｉｐボーラス用量で処置され、１４日間観察される。連続する３用量の研究が、必要に応じて、致死量未満の用量範囲が確立されるまで行わ得る。試験薬剤は、その後、好ましくは、インビトロで試験薬剤に対して最も敏感であり、初期段階のモデルとしての使用に適している腫瘍の内の１つを使用する３つのｓ．ｃ．異種移植モデルにおいて評価される。化合物は、必要に応じて、いくつかの例外を含むが、腫瘍の重量の倍加時間に基づくスケジュールで、懸濁液としてｉｐ投与される。例えば、１．３〜２．５日、２．６〜５．９日、および６〜１０日の倍加時間については、好ましいスケジュールは、５回の処置を毎日（ｑｄ×５）、３回の処置を４日おきに（ｑ４ｄ×３）、および３回の処置を７日おき（ｑ７ｄ×３）である。ほとんどの腫瘍については、個々の処置の間隔は、ほぼ腫瘍の倍加時間であり、そして処置期間によってコントロールの腫瘍増殖の０．５〜１．０のｌｏｇ１０単位が可能である。１００〜２００ｍｇの段階の腫瘍については、処置の終了時のコントロールの腫瘍の大きさは、５００〜２０００ｍｇの範囲にあるはずであり、これによって、処置の後に試験薬剤の作用を評価するために十分な時間が、腫瘍の大きさに起因してマウスを屠殺することが必要となる前に、提供される。
（詳細な薬物の研究）
一旦、最初の評価においてインビボでの効力が実証されたとして化合物が同定されると、より詳細な研究が、化合物の治療効力をさらに研究するためにヒト腫瘍の異種移植モデルにおいて設計され、行われる。濃度および腫瘍細胞と宿主との薬物に対する曝露時間を変化させることにより、抗腫瘍活性を最適化するように、設計された処置ストラテジーを考案し、推奨することが可能である。
試験薬剤の抗腫瘍効果に対する「濃度×時間」の重要性は、アミノ−２０Ｍ−カンプトテシンを用いて得られるデータによって十分に説明された（Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｊ．ら、１９９７、前出）。これらの結果は、より長い時間の間、閾値を上回る血漿濃度を維持することが、最適な治療効果には必要であることを示唆した。
（転移の異種移植モデル）
本発明の化合物はまた、Ｃｒｏｗｌｅｙ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５０２１−５０２５（１９９３）に記載されているような実験用の転移モデルを使用して、後期での転移の阻害について試験される。後期での転移には、腫瘍細胞の付着および管外遊出、局所浸潤、播種、増殖および新脈管形成の工程が含まれる。レポーター遺伝子（好ましくは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子）で（または、その代わりに、酵素であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼまたはＬａｃＺをコードする遺伝子で）トランスフェクトされたヒトの黒色腫細胞がヌードマウスに接種される。これにより、これらのマーカーのいずれか（ＧＦＰの蛍光の検出または酵素活性の組織化学的比色検出）をこれらの細胞の運命を追跡するために利用することができる。細胞は、好ましくは、ｉｖで注射され、約１４日後に転移が（特に、肺、または局所リンパ節、大腿、および脳においても）同定される。これは、ヒトの黒色腫の自然に生じる転移の器官向性を模倣する。例えば、ＧＦＰを発現する黒色腫細胞（１匹のマウスについて１０６個の細胞）は、ヌードマウスの尾静脈にｉ．ｖ．注射される。動物は、１００μｇ／動物／日の試験組成物のｑ．ｄ．ＩＰで処置される。１つの転移性の細胞および病巣が視覚化され、蛍光顕微鏡または光学顕微鏡による組織化学、あるいは、組織を粉砕し、そして検出可能な標識の定量的比色アッセイによって定量される。
それぞれのマウスは、主要な器官全体にわたって転移の存在をさらに記録するために、組織病理学的研究および免疫細胞化学研究に供される。コロニーの数および大きさ（最大直径）を、デジタル画像分析（例えば、Ｆｕ，Ｙ．Ｓ．ら、Ａｎａｔ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．１１：１８７−１９５（１９８９）に記載される）によって表にすることができる。
コロニーの決定のために、肺、肝臓、脾臓、大動脈傍リンパ節（ｐａｒａ−ａｏｒｔｉｃ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）、腎臓、副腎、およびｓ．ｃ．組織の外植片が洗浄され、１〜２ｍｍ３の断片に細かく刻まれ、断片はＴｅｋｍａｎ組織杵（ｐｏｕｎｄｅｒ）で５分間粉砕される。粉砕された内容物は、篩にかけて濾過され、解離媒体（１０％のＦＣＳ、２００Ｕ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼおよび１００μｇ／ｍｌのＩ型ＤＮａｓｅが補充されたＭＥＭ）の中で、ゆっくり攪拌しながら３７℃で８時間インキュベートされる。その後、得られた細胞懸濁液が洗浄され、通常の媒体（例えば、選択用抗生物質（Ｇ−４１８またはハイグロマイシン）が補充された１０％のＦＣＳを含むＭＥＭ）中に再懸濁される。外植片が加えられ、腫瘍細胞のクローンの増殖の数が、エタノールでの固定、および適切なリガンド（例えば、腫瘍細胞マーカーに対するモノクローナル抗体）での染色後に決定される。コロニーの数が、８０ｃｍ２の面積全体について計数される。所望される場合は、並行する実験のセットを行うことができ、この場合は、クローンの増殖は固定も染色もされず、その代わりに、クローニング環を用いて新たに回収され、その後、コラゲナーゼの分泌（物質のゲル電気泳動による）とマトリゲルへの浸潤のような他の測定のために数個のみに分割された後プールされる。
マトリゲル浸潤アッセイは本明細書中に記載されているが、他の者によって記載されたアッセイを使用することもできる（Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｍ．Ｊ．Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，３８：１３７−１４７（１９８７）；Ａｌｂｉｎｉ，Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：３２３９−３２４５（１９８７）；Ｍｅｌｃｈｉｏｒｉ，Ａ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：２３５３−２３５６（１９９２）。
全ての実験は、好ましくは１０匹のマウスを有する群を用いて行われる。結果は、標準的な統計的検定を用いて分析される。
腫瘍に応じて、等数の腫瘍細胞のｓ．ｃ．による隣接部位への注射の１週間後に、０．２〜１０×１０５個の腫瘍細胞がｉ．ｖ．注射され、その後、さらに５週間の間隔で、血行性：自発的な肺転移の割合、および評価のために便利である全体の肺腫瘍組織量を得る。このモデルは、脾臓、肝臓、腎臓、副腎、大動脈傍リンパ節、およびｓ．ｃ．部位から多数の肺外の転移性クローン（これらのほとんどは、おそらく、局所的に増殖する腫瘍からの自発的な転移を示す）の回復をプロット（ｐｅｒｏｉｔ）し得る。
（処置手順）
試験組成物の用量は、特に、目的のガンの腫瘍についての適切な動物モデルを使用して、上記のように決定される。本発明の薬学的組成物が投与される。処置は、２００ｍｌの通常の生理食塩水中の０．００１ｎｇ、１ｎｇ、１００ｎｇ、および１００ｎｇの化合物を、１時間かけて被験体に静脈内注射することからなる。処置は、３回／週で、全部で１２回の処置が行われる。安定な疾患または退行しつつある疾患を有している患者は、１２回を超える処置で処置される。処置は、必要に応じて、通院患者基準または入院患者基準のいずれかで行われる。
（患者の評価）
治療に対する腫瘍の応答の評価は、治療の間およびその後の３０日間にわたって、１週間に１回行われる。処置に対する応答、副作用、および患者の健康状態に応じて、処置は終了されるか、または上記の標準的なプロトコールから延長される。腫瘍の応答についての基準は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒによって確立された基準であり、以下に列挙される。
Figure 2007530596
 患者の集団における治療の効率は、従来の統計学的方法を使用して評価され、これには、例えば、χ二乗検定またはフィッシャーの正確確率検定が含まれる。測定値の長期的変化および短期的変化を、別々に評価することができる。
（結果）
１５０人の患者が処置される。結果は以下にまとめられる。ポジティブな腫瘍応答（少なくとも、部分寛解）は、以下のように患者の８０％以上で観察される：
応答 ％
ＰＲ ６６％
＜ＰＲ ２０％
ＰＲ＋＜ＰＲ ８６％
（毒性：）
副作用の発生率は、処置全体の１０％と１％未満との間であり、臨床的には有意ではない。
本発明に有用であるＧＡ誘導化合物については、これは、本明細書中に記載されるインビトロアッセイ、生化学的アッセイ、または分子アッセイの少なくとも１つにおいて、フェムトモルレベルで活性を示すはずであり、インビボでもまた強い抗腫瘍活性を有するはずである。
ここで、本発明は一般的に記載されるが、本発明は、例示の目的で提供され、特に明記されない限り、本発明を限定することは意図されない以下の実施例を参照してさらに容易に理解される。
（実施例１〜１９）
（ゲルダナマイシンおよび誘導体の合成ならびに／または特徴付け）
一般的方法。融点は校正しない。赤外スペクトルを、Ｍａｔｔｏｎ Ｇａｌａｘｙ Ｓｅｒｉｅｓ ＦＴＩＲ ３０００分光光度計で記録した。紫外線−可視光線スペクトルを、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｕ−４００１分光光度計で記録した。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ−６００分光光度計、ＵｎｉｔｙＰｌｕｓ−５００分光光度計、ＶＲＸ−５００分光光度計、またはＶＲＸ−３００分光光度計で記録した。すべての配置において使用した番号付けは、他の場所で明記されていない限りは、ＧＡ環システムに基づいた（Ｓａｓａｋｉ，Ｋら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９２：７５９１（１９７０））。質量スペクトルは、ＭＳＵ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって行った。ＧＡおよびマクベシンＩＩは、国立癌研究所から提供された。マクベシンＩは、公開されている手順（Ｍｕｒｏｉ，Ｍら、１９８０）にしたがってマクベシンＩＩから合成した。ラディシコールは市販のものを入手した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。無水溶媒は標準的な方法を使用して精製した。
（実施例１）
（（＋）−ゲルダナマイシン（１））
Figure 2007530596
 。
（実施例２）
（１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（４））
（Ｓｃｈｎｕｒ，ＲＣら、１９９５ａ、１９９５ｂ）（＋）−ゲルダナマイシン（５．１ｍｇ、９．０μｍｏｌ）をクロロホルム（１．５ｍｌ）中でアルキルアミン（１０．０μｌ、０．１３ｍｍｏｌ）と一緒に室温で攪拌した。薄層クロマトグラフィーによりＧＡの完全な変換が示された際（１８時間）に、この混合物をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。シリカゲル（ヘキサン／酢酸エチル）上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによる分離により、生成物を紫色の固体として得た（５．３ｍｇ、９９％）。
Figure 2007530596
 。
（（４）のヒドロキノン形態：１７−アリルアミノ−１７−デメトキシ−１８，２１−ジヒドロゲルダナマイシン（ＤＨＡＡＧ））
１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（３．２ｍｇ、５．５μｍｏｌ）を酢酸エチル（３．０ｍｌ）に溶解させ、その後、亜ジチオン酸ナトリウムの水溶液（２．５ｍｌ）（約８５％、０．５０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で２時間攪拌した。窒素保護下で、淡い黄色の有機相を分離し、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、生成物を暗い黄色の固体として得た（３．０ｍｇ、９３％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例３）
（１７−（２−ジメチルアミノエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（５））
（Ｅｇｏｒｉｎ，ＭＪら、２００２）。Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（６．０μｌ、０．０５５ｍｍｏｌ）を、クロロホルム（１．０ｍｌ）中の（＋）−ゲルダナマイシン（４．３ｍｇ、７．７μｍｏｌ）の溶液に添加した。この混合物を室温で攪拌した。薄層クロマトグラフィーによってＧＡの完全な変換が示された（４時間）際に、混合物を０．５％の水酸化ナトリウム水溶液およびブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）によって分離により、生成物を紫色の固体として得た（４．５ｍｇ、９５％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例４）
（１７−アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（６））
（Ｓｃｈｎｕｒら、１９９５ｂ；Ｌｉ，ＬＨら、１９７７；Ｓａｓａｋｉ，Ｋら、１９７９）。濃縮したアンモニア水溶液（２８％、０．７０ｍｌ、０．０１０ｍｏｌ）を、アセトニトリル（５．０ｍｌ）中の（＋）−ゲルダナマイシンの溶液（５．０ｍｇ、９．０μｍｏｌ）に、室温で添加した。黄色の溶液は、ゆっくりと暗い赤色へと変化した。薄層クロマトグラフィーによってＧＡの完全な変換が示された（５時間）際に、混合物を酢酸エチルとブラインとの間に分配させた。有機相をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって固形残渣を分離することにより、生成物を暗い赤色の固体として得た（４．６ｍｇ、９５％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例５）
（１７−（２−クロロエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（７））
（Ｓａｓａｋｉら、前出）。水酸化ナトリウム水溶液（２．８０Ｍ、０．７５ｍｌ、２．１ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（３．０ｍｌ）中の（＋）−ゲルダナマイシン（１１．７ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）と２−塩酸クロロエチルアミン（２４２ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。この混合物を室温で攪拌した。薄層クロマトグラフィーによってＧＡの完全な変換が示された（２０時間）際に、この混合物を酢酸エチルとブラインとの間に分配させた。有機相をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって分離することにより、生成物を紫色の固体として得た（１２．０ｍｇ、９５％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例６）
（１７−（２−フルオロエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（８））
（Ｓｃｈｎｕｒら、１９９５ｂ）。水酸化ナトリウム水溶液（１．１０Ｍ、０．５３ｍｌ、０．５８ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１．０ｍｌ）中の（＋）−ゲルダナマイシン（５．５ｍｇ、９．８μｍｏｌ）および２−塩酸フルオロエチルアミン（６５ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。この混合物を室温で攪拌した。薄層クロマトグラフィーによってＧＡの完全な変換が示された（１２時間）際に、この混合物を酢酸エチルとブラインとの間に分配させた。有機相をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって分離することにより、生成物を紫色の固体として得た（５．７ｍｇ、９８％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例７）
（１７−（２−アセチルアミノエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（９））
（Ｓｃｈｎｕｒら、１９９５ｂ）。Ｎ−アセチルエチレンジアミン（９０％、１０．０μｌ、０．０９４ｍｏｌ）を、クロロホルム（１．０ｍｌ）中の（＋）−ゲルダナマイシン（５．０ｍｇ、８．９μｍｏｌ）の溶液に、室温で添加した。薄層クロマトグラフィーによってＧＡの完全な変換が示された（１０時間）際に、この混合物を蒸留水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）によって分離することにより、生成物を紫色の固体として得た（４．５ｍｇ、８０％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例８）
（１７−（６−アセチルアミノ−１−ヘキシル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１０））
クロロホルム中の（＋）−ゲルダナマイシン（５．７ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）およびＮ−（６−アミノヘキシル）アセトアミド（５．５ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で攪拌した。薄層クロマトグラフィーによってＧＡの完全な変換が示された（２０時間）際に、この混合物を蒸留水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）によって分離することにより、生成物を紫色の固体として得た（５．７ｍｇ、８２％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例９）
（（＋）−ビオチン １７−（６−アミノヘキシル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンアミド（１１））
１，６−ジアミノへキサン（１０．０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を、クロロホルム（１．０ｍｌ）中の（＋）−ゲルダナマイシンの溶液（５．０ｍｇ、８．９μｍｏｌ）の溶液に、室温で添加した。薄層クロマトグラフィーによってＧＡの完全な変換が示された（２０時間）際に、この混合物を０．５％の水酸化ナトリウム水溶液およびブラインで洗浄し、炭酸カリウム上で乾燥させ、そして濃縮した。その後、得られた暗い紫色の固体を、ＤＭＦ（１．０ｍｌ）中で（＋）−ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（３．０ｍｇ、８．８μｏｍｌ）とともに一晩攪拌した。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）によって溶媒を除去し、分離することにより、生成物を紫色の固体として得た（６．５ｍｇ、８５％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例１０）
（１７−［２−［２−（２−アセチルアミノエトキシ）エトキシ］エチル］アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１２））
クロロホルム（１．０ｍｌ）中の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（５６．０μｌ、０．３８ｍｍｏｌ）、無水酢酸（４６．０μｌ、０．４８ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（７３．２μｌ、０．５２ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で１時間攪拌し、その後、高減圧下で濃縮して乾燥させた。無色の固体残渣を、その後、クロロホルム（１．０ｍｌ）中の（＋）−ゲルダナマイシン（４．０ｍｇ、７．１μｍｏｌ）とともに攪拌した。薄層クロマトグラフィーによってＧＡの完全な変換が示された（２０時間）際に、この混合物を蒸留水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）によって分離することにより、所望の生成物を紫色の固体として得た（１．１ｍｇ、２１％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例１１）
（１７−カルボキシメチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１３））
（＋）−ゲルダナマイシン（３．１ｍｇ、５．５μｍｏｌ）を、エタノール（１．２ｍｌ）と水（０．３ｍｌ）との混合液中のグリシンナトリウム塩（１０．７ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）と一緒に室温で攪拌した。薄層クロマトグラフィーによってＧＡの完全な変換が示された（３時間）際に、紫色の混合物を希塩酸で酸性化し、クロロホルムと蒸留水との間で分配させた。この有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）によって分離することにより、生成物を紫色の固体として得た（３．２ｍｇ、９６％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例１２）
（１７−（１−アゼチジニル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１４））
（Ｓｃｈｎｕｒ，ＲＣら、１９９４）。アゼチジン（４．０μｌ、０．０５９ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１．５ｍｌ）中の（＋）−ゲルダナマイシン（７．５ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）の溶液に、攪拌しながら添加した。薄層クロマトグラフィーによってＧＡの完全な変換が示された（４０分間）際に、この混合物をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって分離することにより、生成物を深い紫色の固体として得た（７．７ｍｇ、９８％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例１３）
（１７−（１−アジリジニル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１５））
アジリジン（Ａｌｌｅｎ，ＣＦＨら、１９６３）（０．３０ｍｌ、５．８０ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２．０ｍｌ）中の（＋）−ゲルダナマイシン（５．８ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。この混合物を室温で攪拌した。薄層クロマトグラフィーによってＧＡの完全な変換が示された（２５分間）際に、この混合物をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって分離することにより、生成物をオレンジ色の固体として得た（５．６ｍｇ、９５％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例１４）
（５’−ブロモゲルダノキサジノン（１６））
３−ブロモ−４−ニトロフェノールおよび３−ブロモ−６−ニトロフェノール。１２ｍｌの氷酢酸中の３．８ｍｌの発煙硝酸（８９ｍｍｏｌｅ）を、周囲を氷浴で囲まれたフラスコの中の６０ｍｌの氷酢酸中の１５．２グラム（８７．９ｍｍｏｌｅ）の３−ブロモフェノールの溶液に、３５分間かけて添加した。この反応物を、さらに３０分間室温で攪拌し、その後、反応物を氷上に注いだ。その後、これを減圧下で濃縮した。シリカゲル上での中程度の速度のクロマトグラフィー（ｍｅｄｉｕｍ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（溶離液として１：２酢酸エチル：ヘキサン）によって、生成物である３−ブロモ−４−ニトロフェノール（３．４７グラム、１５．９ｍｍｏｌ、１８％の収率）；ｍ．ｐ．１３０〜１３１℃を分離し、その後、エーテル／へキサンから再結晶化させた（報告されているｍ．ｐ．１３０〜１３１℃（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｃら、１９８７）および１３１℃（Ｈｏｄｇｓｏｎ，ＨＨら、１９２６）；
Figure 2007530596
 。
２−アミノ−５−ブロモフェノール。３−ブロモ−６−ニトロフェノール（０．２９２グラム、１．３４ｍｍｏｌｅ）を、０．５％の水酸化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）中で攪拌した。ヒドロ亜硫酸ナトリウム（８５％の２．００グラム、９．７６ｍｍｏｌ）を反応フラスコに添加し、これを室温で１５分間攪拌した。その後、反応フラスコを希塩酸で、ｐＨが５になるまで酸性化した。次いで、この反応物を４０ｍＬ部のジエチルエーテルで３回抽出し、合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮して、粗２−アミノ−５−ブロモフェノール（０．５３３グラム、ｍ．ｐ．９９．５〜１００．５℃）を得た。これを、エチルエーテル／へキサンから再結晶化させて、純粋な生成物を得た（０．１５１グラム、０．８０ｍｍｏｌ、６０％の収率；ｍ．ｐ．１２５〜１２７℃（分解）（報告されているｍ．ｐ．１４９．５〜１５０．５℃（Ｂｏｙｌａｎｄ，Ｅら、１９５４）；
Figure 2007530596
 。
５’−ブロモゲルダノキサジノン（１６）（Ｗｅｂｂら、前出；Ｒｉｎｅｈａｒｔ，ＫＬら、１９７７）。氷酢酸（２．０ｍｌ）中の（＋）−ゲルダナマイシン（２１．８ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）と２−アミノ−５−ブロモフェノール（１４．６ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）との混合物を、窒素下で、７８℃で１９時間攪拌し、その後、冷却し、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）による深いオレンジ色の残渣の分離によって、未反応の（＋）−ゲルダナマイシンを一緒に含む粗生成物を得た。その後、これをクロロホルムに溶解させて、分配ＨＰＬＣ分離（Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａ−Ｐａｋ Ｓｉｌｉｃａ ６μｍ ７．８×３００ｍｍカラム、２．０ｍｌ／分、ＣＨＣｌ３／ＥｔＯＡｃ ２：３）に供し、生成物を明るいオレンジ色の粉末として得た（１６．４ｍｇ、６０％の収率）；ｍｐ２７４〜２７８℃（分解）（ｌｉｔ．ｍｐ２７５〜２７８℃）（Ｒｉｎｅｈａｒｔ，前出）。
Figure 2007530596
 。
（実施例１５）
（５’−ヨードゲルダノキサジノン（１７））
３−ヨード−４−ニトロフェノールおよび３−ヨード−６−ニトロフェノール。１２ｍｌの氷酢酸中の３．０ｍｌの発煙硝酸（７５ｍｍｏｌ）を、周囲を氷浴で囲まれたフラスコの中の６０ｍｌの氷酢酸中の１５．０３グラム（６８．３ｍｍｏｌ）の３−ヨードフェノールの溶液に対して、２５分間かけて添加した。この反応物を、さらに３０分間室温で攪拌し、その後反応物を氷上に注いだ。その後、これを減圧下で濃縮し、１５０ｍｌの水に取り込ませ、２部の３００ｍｌの塩化メチレンで抽出し、そして合わせた塩化メチレン層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、蒸発させて、１７グラムの有機残渣を得た。シリカゲル上での中程度の速度のクロマトグラフィー（溶離液として１：２酢酸エチル：ヘキサン）によって、生成物である３−ヨード−４−ニトロフェノール（６．９３グラム、２６．１ｍｍｏｌ、３８％の収率）；ｍ．ｐ．１２１〜１２３℃を分離した；
Figure 2007530596
 。
２−アミノ−５−ヨードフェノール。３−ヨード−６−ニトロフェノール（０．９９３グラム、３．７５ｍｍｏｌ）を、水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍＬの水中に０．２３３ｇｍのＮａＯＨ）の中で攪拌した。ヒドロ亜硫酸ナトリウム（８５％の４．６２グラム、２２．６ｍｍｏｌ）を反応フラスコに添加し、これを室温で４０分間攪拌した。その後、反応フラスコの周囲を氷浴で取り囲んで冷却し、酢酸を、ｐＨが５〜６になるまで添加した。次いで、この反応物を２００ｍＬ部の塩化メチレンで３回抽出し、合わせた有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして濃縮して、粗６−アミノ−３−ヨードフェノール（０．５３３グラム、ｍ．ｐ．９９．５〜１００．５℃）を得た。これを、エチルエーテル／へキサンから再結晶化させて、純粋な生成物を得た（０．４６３グラム、１．９７ｍｍｏｌ、５３％の収率；ｍ．ｐ．１２６〜１２８℃（分解）（報告されているｍ．ｐ．１４１℃（Ｈｏｄｇｓｏｎ，ＨＨら、１９２８））；
Figure 2007530596
 。
５’−ヨードゲルダノキサジノン（１７）。氷酢酸（１．０ｍｌ）中の（＋）−ゲルダナマイシン（４．８ｍｇ、８．６μｍｏｌ）および２−アミノ−５−ヨードフェノール（４．０ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）の混合物を、窒素下で、７８℃で２０時間攪拌し、その後、冷却し、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）による深いオレンジ色の残渣の分離によって、未反応の（＋）−ゲルダナマイシンを一緒に含む粗生成物を得た。その後、これをクロロホルムに溶解させて、分配ＨＰＬＣ分離（Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａ−Ｐａｋ Ｓｉｌｉｃａ ６μｍ ７．８×３００ｍｍカラム、２．０ｍｌ／分、ＣＨＣｌ３／ＥｔＯＡｃ ２：３）に供して、生成物を明るいオレンジ色の粉末として得た（２．８ｍｇ、４４％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例１６）
（１１−Ｏ−アセチル−１７−（１−アゼチジニル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１８））
（Ｓｃｈｎｕｒら、１９９５ａ）。１７−（１−アゼチジニル）−１７−デメトキシゲルダノマイシン（３．２ｍｇ、５．５μｍｏｌ）を、無水酢酸（５．２μｌ、０．０５５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（７．３ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）とともに攪拌した。薄層クロマトグラフィーによって出発物質の完全な変換が示された（４０時間）際に、この混合物をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって分離することにより、生成物を紫色の固体として得た（３．２ｍｇ、９３％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例１７）
（１７−（１−アゼチジニル）−７−デカルバミル−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１９））
（Ｓｃｈｎｕｒら、１９９４、１９９５ａ、前出）。カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（５．３ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を、ｔｅｒｔ−ブタノール（４．０ｍｌ）中の１７−（１−アゼチジニル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン（５．０ｍｇ、８．５μｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下で添加した。この反応物を室温で１時間攪拌し、その後、酢酸エチルとブラインとの間での分配によってクエンチした。この有機相をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）による分離により、生成物を紫色の固体として得た（４．４ｍｇ、９５％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例１８）
（１７，２１−ジヒドロゲルダナマイシン（２０））
（Ｓｃｈｕｒら、１９９５ｂ）。（＋）−ゲルダナマイシン（３．５ｍｇ、６．２μｍｏｌ）を酢酸エチル（２．５ｍｌ）に溶解させ、その後、亜ジチオン酸ナトリウム（約８５％、０．５０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）の水溶液（２．５ｍｌ）を添加した。この混合物を室温で攪拌した。薄層クロマトグラフィーによってＧＡの完全な変換が示された際（１時間）に、有機層を分離させ、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって固体残渣を分離することにより、淡黄色の固体を得た（３．３ｍｇ、９４％）。
Figure 2007530596
 。
（実施例１９）
（化合物１５から調製した、ハロゲンで置換されたＧＡ誘導体：標識した１７−（２−ハロ−置換−エチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン誘導体）
１７−（２−ヨードエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＩＥＧ）。
Figure 2007530596
 リン酸溶液（３．０Ｍ、２０．０μｌ）を、ジメチルホルムアミド（０．２０ｍｌ）中の１７−（１−アジリジニル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＲＧ）（１．１ｍｇ、１．９２μｍｏｌ）とヨウ化カリウム（１７．４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）との溶液に添加した。１０分後、この混合物を、酢酸エチルとブラインとの間で分配させた。この有機相をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮して、紫色の固体を得た（１．３ｍｇ、９７％）。
Figure 2007530596
 。
１７−（２−ブロモエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン。（１７−ＢＥＧ）
Figure 2007530596
 リン酸溶液（３．０Ｍ、２０．０μｌ）を、ジメチルホルムアミド（０．２０ｍｌ）中の１７−（１−アジリジニル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＲＧ）（１．１ｍｇ、１．９２μｍｏｌ）と臭化カリウム（１２．８ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）との溶液に添加した。１０分後、この混合物を、酢酸エチルとブラインとの間で分配させた。この有機相をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして、濃縮して、紫色の固体を得た（１．２ｍｇ、９６％）。
Figure 2007530596
 。
１７−（２−クロロエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＣＥＧ）
Figure 2007530596
 塩酸溶液（１．０Ｍ、２０．０μｌ）を、ジメチルホルムアミド（０．１０ｍｌ）中の１７−（１−アジリジニル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＲＧ）（０．１ｍｇ、０．１７μｍｏｌ）の溶液に添加した。２時間後、この混合物を、酢酸エチルとブラインとの間で分配させた。この有機相をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして、濃縮して、紫色の固体を得た。この粗生成物のＴＬＣにより、出発物質が所望の表題化合物（主要部分）と１７−ＨＥＧ（副部分）とに完全に変換されたことが明らかになった。
１７−（２−フルオロエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＦＥＧ）
Figure 2007530596
 フッ化水素酸溶液（４８％、１０．０μｌ）を、ジメチルホルムアミド（０．１０ｍｌ）中の１７−（１−アジリジニル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＲＧ）（０．１ｍｇ、０．１７μｍｏｌ）の溶液に添加した。２時間後、この混合物を、酢酸エチルとブラインとの間で分配させた。この有機相をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして、濃縮して、紫色の固体を得た。この粗生成物のＴＬＣにより、出発物質が所望の表題化合物（主要部分）と１７−ＨＥＧ（副部分）とに完全に変換されたことが明らかになった。
１７−（２−ヒドロキシエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＨＥＧ）
Figure 2007530596
 リン酸溶液（３．０Ｍ、５．０μｌ）を、ＤＭＳＯ（０．２０ｍｌ）および水（０．０５ｍｌ）中の１７−（１−アジリジニル）−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＲＧ）（０．１ｍｇ、０．１７μｍｏｌ）の溶液に添加した。２時間後、この混合物を、酢酸エチルとブラインとの間で分配させた。この有機相をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして、濃縮して、紫色の固体を得た。この粗生成物のＴＬＣにより、出発物質が所望の表題化合物に完全に変換されたことが明らかになった。
（実施例２０）
（ゲルダナマイシン誘導体と、ＨＧＦ／ＳＦ−Ｍｅｔ−ｕＰＡ−プラスミン細胞ベースアッセイにおけるそれらの阻害活性）
ＧＡ誘導体のクラスであるゲルダノキサジノンの２つの誘導体を合成し、それらの阻害効果について試験した（化学構造は上記に示した）。このような誘導体は、ＧＡの２−アミノフェノールとの酸触媒による縮合によって調製され得る（上記の実施例を参照のこと）。５−ブロモ−２−アミノフェノールおよび５−ヨード−２−アミノフェノールを使用して、したがって、付加化合物１６および１７を、それぞれ６０％および４４％の収率で調製した。これらの後者の化合物のそれぞれは、ナノモル濃度（＜８ ＩＣ５０）でのみ、Ｍｅｔによるシグナル伝達経路を阻害することが見出された。表１を参照のこと。
活性に対するＧＡのアンサ環（ａｎｓａ ｒｉｎｇ）の修飾の効果を研究するために、活性な１７−アミノ置換−１７−デメトキシゲルダナマイシン誘導体である、１７−Ｎ−アゼチジニル−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１４）を、このような変化を作製するために使用した。
Figure 2007530596
 ＊ｕＰＡ−プラスミン阻害指数またはＩＣ５０は、ＭＤＣＫ細胞をＨＧＦ／ＳＦで処理した場合にｕＰＡの５０％の阻害が生じる薬物濃度の対数に負号をつけたものである。１２よりも大きいＩＣ５０を有する化合物は、ｆＭ−ＧＡｉ（ｆＭまたはそれより低い範囲でのインヒビター）と呼ばれ、一方、８未満の指数を有する化合物は、ｎＭ−Ｇａｉ（ｎＭ範囲のインヒビター）として知られる群に属する。
Figure 2007530596
 後者の化合物の１１−ヒドロキシル基は、酢酸無水物と４−ジメチルアミノピリジンでエステル化して、１１−Ｏ−アセチル−１７−Ｎ−アゼチジニル−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１８）を提供し得る。
化合物１４の７−ウレタン基は、（生成物のより低い収率を生じる溶媒であるジメチルスルホキシドの代わりに）ｔｅｒｔ−ブタノール中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドでの処理によって、Ｓｃｈｎｕｒら、（前出）の手順のわずかな修飾ごとに除去され、１７−Ｎ−アゼチジニル−７−デカルバモイル−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１９）を提供し得る。アンサ環に対する両方の修飾によって、＜８のＩＣ５０ Ｍｅｔ−ｕＰＡ−プラスミンシグナル伝達阻害活性しか示さない化合物が導かれる（表１）。
図２に示すように、化合物１４は、ＧＡの活性を上回る高い活性（＞１５ ＩＣ５０）を有しているが、修飾された化合物１９は、完全に不活性であった。化合物１８の活性は、＜８ ＩＣ５０であった。
最後に、ＧＡ関連アンサマイシンマクベシンＩ（３）の阻害活性、ならびに、ベンゾキノンアンサマイシン、ジヒドロゲルダナマイシン（２０）、およびマクベシン（ＩＩ）（２１）のヒドロキノン形態の阻害活性、ならびに、ラディシコール（３）の阻害活性を試験するための研究を行った。結果を表Ｉに示す。ラディシコール（Ｓｈａｒｍａ，ＳＶら、１９９８）、ならびに、マクベシンＩ（Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙら、前出）およびＩＩ（本明細書を参照のこと）がｈｓｐ９０に対して高い親和性を有しているという認識にもかかわらず、これらの化合物はそれぞれ、本発明のＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるｕＰＡ−プラスミンアッセイにおいては低い活性を示した。しかし、ジヒドロゲルダナマイシンは活性が高い（＞１２ ＩＣ５０）ことが見出された。
背景の節に述べたように、ＧＡおよびその誘導体の治療効力についての研究は、おもに、ｈｓｐ９０が重要な役割を果たす生物学的プロセスに焦点をあてている（Ｓａｕｓｖｉｌｌｅら、２００３；Ｗｏｒｋｍａｎ，２００３；Ｂａｎｅｒｊｉら、２００３）。ガン細胞の生存性および増殖に重要な多数のタンパク質は、このシャペロンタンパク質に依存している（Ｎｅｃｋｅｒｓ，Ｌら、２００３；Ｍａｌｏｎｅｙ，Ａら、２００３）。ｈｓｐ９０の機能を遮断するＧＡ誘導体の能力は、ガンの処置について、１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（４）を臨床試験へと導いた（前出）。仮報告書は、抗ガン治療薬としての効力を示したが、肝毒性が用量を制限することが報告された（用量を制限しない毒性としては、貧血、無食欲、吐き気、嘔吐、および下痢が挙げられる）。例えば、Ｎｅｃｋｅｒｓら、（前出）；およびＳａｕｓｖｉｌｌｅら、（前出）を参照のこと。
本明細書中で開示されるように、種々のＧＡ誘導体が、ガン細胞中のＭｅｔによるシグナル伝達経路のインヒビターとして、ｈｓｐ９０機能の阻害に必要な濃度よりもはるかに低い濃度で作用する。さらに、阻害活性は、ヒトα−ｈｓｐ９０に対する親和性と必ずしも相関関係にあるわけではないことが開示される。本明細書中で開示される活性なＧＡ誘導体の未知の標的は未だ同定されていないが、結果は、特定の構造−活性の関係を示唆している。
いくつかの１７−Ｎ−アミノ誘導体化−１７−デメトキシゲルダナマイシン化合物は、細胞をベースとするアッセイにおいて活性であったが、他の化合物は、特に、より長い１７−Ｎ−アミノ置換基を有している化合物（例えば化合物９、１０、１１、および１２、ならびにカルボン酸誘導体１３）はそうではなかった。
アンサ環の修飾については、７−ウレタン基が活性なＧＡ誘導体１４から除去される場合、得られるデカルバモイル化された化合物１９は不活性であった。ｈｓｐ９０のＮ末端ドメインとともに複合体を形成したＧＡ誘導体４および５の結晶学的分析（Ｓｔｅｂｂｉｎｓら、前出；Ｊｅｚら、前出）は、ウレタンの機能がｈｓｐ９０のいくつかのアミノ酸残基とともに水素結合相互作用を受けることを示した。さらに、Ｓｃｈｎｕｒら、（１９９５ａ）は、７−ウレタンが抗ｅｒｂＢ−２活性に必要であることを報告している。ＧＡ誘導体の７−ウレタンは、ｈｓｐ９０のＡＴＰ結合部位の中の深い位置に埋まっている。したがって、本発明者らは、Ｍｅｔ機能についての未知の標的のＧＡの結合部位が、ｈｓｐ９０のこの結合領域と類似性を共有していることを示唆する。活性なＧＡ誘導体１４の１１−ヒドロキシル基のアセチル化によって作製した化合物１８は、Ｍｅｔによるシグナル伝達についての細胞をベースとするアッセイにおいては不活性であった。
改めて、ＧＡは、ｈｓｐ９０に対するその直接的な効果が最もよく知られている。ＧＡについて報告されている細胞性の効果は、実施例２１（以下を参照のこと）に記載するように、インビトロでｈｓｐ９０が通常アップレギュレートされ、Ｍｅｔの発現がダウンレギュレートされることである。Ｎｉｍｍａｎａｐａｌｌｉ，Ｒら、２００１およびＭａｕｌｉｋ，Ｇら、２００２ａもまた参照のこと。ｈｓｐ９０およびＭｅｔの発現レベルに対するＧＡ’のこの効果は、より高濃度（＜８ ＩＣ５０）だけについて、本明細書中で開示される。ｕＰＡ活性が阻害されたままであるナノモル未満の濃度（＞１２ ＩＣ５０）では、ｈｓｐ９０およびＭｅｔの発現のいずれにも変化はない（以下の実施例）。活性のある化合物の標的は、以下に記載するように、ｈｓｐ９０とは異なる。ｕＰＡ活性を検出するために本明細書中で使用した細胞をベースとするアッセイは、ＭＤＣＫ細胞株を使用するＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるｕＰＡ−プラスミンネットワークに基づく。ＨＧＦ／ＳＦで処理すると、ＭＤＣＫ細胞のｕＰＡ活性は有意に増加する（図１および２；コントロール（「ｃｔｌ」） 対 ＋ＨＧＦ／ＳＦを比較する）。しかし、この活性は、本発明者らの高活性ＧＡ誘導体によって、フェムトモル濃度のレベルで劇的に阻害される。一方、ラディシコールは、ナノモルのレベルでしかこの活性を阻害しない（いくつかの高活性ＧＡ誘導体の阻害効果については図１を参照のこと）。
高活性ＧＡ誘導体は、ｆＭレベルでｕＰＡ活性を阻害するだけではなく、これらはまた、インビトロでは腫瘍細胞の浸潤も阻害する（以下の実施例を参照のこと）。しかし、増殖は、活性の低い誘導体または「ｎＭ−ＧＡ」誘導体と同じ濃度である、ｎＭレベルでしか阻害されなかった（Ｗｅｂｂら、前出）。このことは、ＧＡ’がいくつかの機構によって増殖および浸潤を阻害することを示唆する。例えば、増殖は、ｈｓｐ９０機能の阻害によって影響を受ける場合があるが、一方、浸潤は、１つ以上の未知の標的とのＧＡの相互作用によって影響を受ける。
この概念を支持するために、ＭＤＣＫ細胞を、ｎＭレベルで浸潤と増殖活性との両方を阻害するマクベシンＩＩ（２１）の存在下で意図的に培養した。ＭＤＣＫ細胞を、毒性のない最も高濃度のマクベシンＩＩ（２１）（３μＭ）で数ヶ月間維持した。これらの条件下では、Ｍｅｔとｈｓｐ９０はいずれも、もとの（「コントロール」）レベルに戻り、ＨＧＦ／ＳＦに対するＭｅｔの反応性は回復したが、ｈｓｐ９０はマクベシンと複合体化したままのようであった。明らかに、マクベシンＩＩで処理した細胞中でのＧＡ’に対するｕＰＡ−プラスミン感受性は、親のＭＤＣＫ細胞中での感受性と同じであった。ＨＧＦ／ＳＦは、なお顕著にｕＰＡ活性をアップレギュレートし得、これはまた、ｆＭレベルでＧＡ’ｓによっても阻害され得る。これらの発見は、ＧＡがｈｓｐ９０以外の標的を介してＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるｕＰＡ活性を阻害するという本発明者らの概念をさらに確認した。
本明細書中で観察される活性は、以前に公開された、ｈｓｐ９０とのこれらの化合物の相対的な親和性とは異なる。例えば、ｈｓｐ９０高親和性化合物であるラディシコール（３）（Ｒｏｅら、前出）は、本発明の細胞をベースとするアッセイにおいては不活性であったが、ｈｓｐ９０結合化合物であるＧＡおよび１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシＧＡ（４）は活性であった。これらの細胞をベースとするｕＰＡアッセイにおいては標的結合部位はなおも明らかではなかったが、この部位は、いくつかの相違があるにもかかわらず、ＡＴＰ結合部位でもあり得る。
Ｋａｍａｌら、（前出）は、腫瘍細胞中のｈｓｐ９０の高親和性立体構造が、１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシＧＡ（４）およびラディシコール（３）の腫瘍選択性の原因であることを報告している。腫瘍細胞のｈｓｐ９０は、マルチシャペロン複合体であり、一方、正常な組織のｈｓｐ９０はそのように複合体化はしていない。ここで作用している標的が同様に複合体化しているか否か、および、ＧＡ結合部位の立体構造を変化させるか否かは、未だ不明なままである。
本明細書中に記載される活性のある化合物に対するＭｅｔによるシグナル伝達経路のこの上なくすばらしい感受性により、この経路の崩壊における化合物の触媒的役割が示唆された。ジヒドロゲルダナマイシン（２０）は、ＧＡ自体よりもわずかに低いにもかかわらず、本発明のアッセイにおいて活性であることが見出された。しかし、化合物２０は、ＧＡへと空気中で酸化され得ることが報告されており（Ｓｃｈｎｕｒら、１９９５ｂ、前出）、そしてこのことは、本明細書中で開示する化合物２０の活性に寄与している可能性がある因子であるので、無視することはできない。しかし、関連するアンサマイシンマクべシンＩ（２）およびその還元産物であるマクベシンＩＩ（２１）は、いずれも不活性であることが見出された。後者の化合物はいずれもｈｓｐ９０に結合する。活性なアンサマイシン誘導体（「ｆＭ−ＧＡ’ｓ」）が触媒性の電子移動プロセスに関与していること、そしてジヒドロゲルダナマイシン（２０）とＧＡとの間での酸化−還元電位が、それを可能にするために重要であることが、本発明者らの見解である。２つのマクベシンの間での電位の差は、これが生じるために不適切である場合がある。
固形腫瘍の浸潤および転移の挙動に関与しているＭｅｔによるシグナル伝達を停止させるために必要であるのは、低濃度の高活性のＧＡ’であるので、これらの化合物は魅力的な薬剤候補である。活性である低い濃度によって、ＧＡ誘導体について報告されている用量依存性の毒性が排除されるはずである。このような誘導体の標的の首尾よい同定および単離によって、このＭｅｔによるシグナル伝達経路の有効なインヒビターであるさらに他の化合物のより良好なスクリーニングおよび設計が可能となる。
（実施例２１）
（ＨＧＦ／ＳＦによって媒介される腫瘍細胞の浸潤のゲルダナマイシンによる阻害：）
（Ａ．材料および方法）
細胞株および薬物：ＭＤＣＫ（イヌ腎臓上皮細胞）、ＤＢＴＲＧ、Ｕ３７３、Ｕ１１８、ＳＷ１７８３（ヒト膠芽腫細胞）、ＳＫ−ＬＭＳ−１（ヒト平滑筋肉腫細胞）を、ＡＴＣＣから入手した。ＤＵ１４５、ＰＣ−３（ヒト前立腺ガン細胞）は、Ｈａｎ−Ｍｏ Ｋｏｏ博士，Ｖａｎ Ａｎｄｅｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの研究室によるものである。Ｕ８７およびＳＮＢ１９ヒト膠芽腫細胞は、Ｊａｓｔｉ Ｒａｏ博士，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓによるものである。ＳＮＢ１９はＤＭＥＭ Ｆ１２倍地中で増殖させた。全ての他の細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の中で増殖させた（いずれも、Ｇｉｂｃｏ（登録商標），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．による）。増殖培地には、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）ならびにペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した。
ゲルダナマイシン、および化学的誘導体である１７−（Ｎ−アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）および１７−アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＤＧ）、ならびにマクベシンＩＩ（ＭＡ）は、国立癌研究所（ＮＣＩ）によって提供されたか、または本明細書中に記載するように合成した。ラディシコール（ＲＡ）はＳｉｇｍａから購入した。
１、２、および３×１０−６ＭのＭＡを含む増殖培地中でのＭＤＣＫ細胞の長期間の培養（＞３ヶ月）によって、ＭＤＣＫＧ１細胞、ＭＤＣＫＧ２細胞、およびＭＤＣＫＧ３細胞が得られた。全ての化合物を、最初に０．０１ＭでＤＭＳＯ中に稀釈し、小さいストックアリコート（５μｌ）に分けて、使用するまで−８０℃で維持した。使用する際には、ストックを融解させ、ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳで段階稀釈した。ＭＡを含む長期培養については、１、２、および３×１０−６Ｍの化合物を含む馴化培地を、少なくとも１週間に２回は交換した。
ＨＧＦ／ＳＦ−Ｍｅｔ−ｕＰＡ−プラスミン細胞をベースとするアッセイ（Ｗｅｂｂら、前出）。色強度を検出するために、細胞を、細胞増殖の決定のためのＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、またはｕＰＡ−プラスミン活性の測定のためのＣｈｒｏｍｏｚｙｍｅ ＰＬ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を介してのいずれかで、９６ウェルプレートに１５００個の細胞／ウェルで播種した（ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞は例外とし、これは５０００個の細胞／ウェルで播種した）。細胞を、上記に記載したように、ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ中で一晩増殖させた。薬物をＤＭＳＯに溶解させ、ストック濃縮物からＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ培地中に段階稀釈し、そして適切なウェルに添加した。薬物または試薬の添加の直後に、ＨＧＦ／ＳＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）をすべてのウェルに添加した（基底の増殖およびｕＰＡ−プラスミン活性のレベルを計算するためのコントロールとして使用したウェルを除く）。薬物およびＨＧＦ／ＳＦの添加の２４時間後に、プレートを以下のようにｕＰＡ−プラスミン活性の決定のために処理した；ウェルをＤＭＥＭ（フェノールレッドは含まない；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）で２回洗浄し、そして２００μｌの反応緩衝液［ＤＭＥＭ（フェノールレッドは含まない）中の５０％（ｖ／ｖ）の０．０５単位／ｍｌのプラスミノーゲン、４０％（ｖ／ｖ）の５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．２）、および１０％（ｖ／ｖ）の３ｍＭのＣｈｒｏｍｏｚｙｍｅ ＰＬ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む１００ｍＭのグリシン溶液］を、それぞれのウェルに添加した。その後、プレートを３７℃、５％のＣＯ２で４時間インキュベートした。この時点で、生じた吸光度を、４０５ｎｍの単一波長で、自動分光光度プレートリーダーで読み取った。ｕＰＡ−プラスミン阻害指数またはＩＣ５０は、ｕＰＡ−プラスミン活性が５０％阻害される濃度の対数に負号をつけたものである。
増殖アッセイ。ｕＰＡ−プラスミン検出アッセイと平行して、９６ウェルプレートの中での細胞増殖を、ＭＴＳを用いて検出した。細胞の調製は、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）溶液（０．２ｇのＫＣｌ、８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４、１．１５ｇのＮａ２ＨＰＯ４、１００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１３３ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ中の０．９２ｍｇ／ｍｌのＰＭＳ）中の１５μｌのＭＴＳを、薬物およびＨＧＦ／ＳＦの添加の２４時間後にそれぞれのウェルに添加したことを除いて、上記でｕＰＡ−プラスミンアッセイについて記載したものと同じであった。その後、このプレートを３７℃で、５％のＣＯ２雰囲気下で４時間インキュベートした。吸光度を、自動分光光度プレートリーダーで、４９０ｎｍで読み取った。
散乱アッセイ。ｕＰＡ活性の評価と平衡して、ＭＤＣＫ細胞の９６ウェルプレートを使用して、細胞の散乱を検出した。細胞の調製は、上記（プラスミンアッセイ）と同じであった。ｕＰＡ活性を測定したと同時に、散乱についてアッセイする細胞を固定し、染色し（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ Ｓｅｔ，Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ）、そして写真を撮影した。
インビトロでの細胞浸潤アッセイ。インビトロでの浸潤アッセイを、ＧＦＲ−Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でコーティングした２４−ウェル浸潤チャンバーを使用して、Ｊｅｆｆｅｒｓら、１９９６によって以前に記載されたように行った。細胞を、ＤＭＥＭ／０．１％のＢＳＡに懸濁し、浸潤（上部）チャンバー（５〜２５×１０３個の細胞／ウェル）（ＤＢＴＲＧ ５，０００、ＳＮＢ １９、およびＵ３７３ ２５，０００個の細胞／ウェル）にプレートした。下部チャンバーには、ＨＧＦ／ＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えたＤＭＥＭ／０．１％のＢＳＡ、またはＨＧＦ／ＳＦを加えていないＤＭＥＭ／０．１％のＢＳＡを充填した。ＧＡの阻害を評価するために、ＧＡを、示した最終濃度１μＭ〜１ｆＭになるように、上部および下部チャンバーの両方に段階稀釈し、直後にＨＧＦ／ＳＦを添加した。２４時間後、上部チャンバーに残っている細胞を、擦り取って除去した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）内に侵入し、挿入物の下部表面に付着した細胞を、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｃ．）を使用して染色し、光学顕微鏡下で計数した。
Ｍｅｔおよび他のタンパク質のウェスタンブロットならびに発現。細胞を、１０５個の細胞／皿で、６０×１５ｍｍの皿に播種した。２４時間後に、ＨＧＦ／ＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれの皿に添加した。その直後、段階稀釈したＧＡまたはＭＡを、示した濃度で適切な皿に添加し、溶解するまで示した時間の長さでインキュベートした。ＭｅｔとＭＡＰＫのリン酸化の検出のために、１０５個の細胞を６０×１５ｍｍの皿に播種し、２４時間かけて血清飢餓させた。ＨＧＦ／ＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）での刺激の後、細胞を、１０分および３０分溶解させた。コントロール細胞には、ＨＧＦ／ＳＦを添加しなかった。細胞の溶解後、タンパク質濃度を、ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって決定し、等量のタンパク質をロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ウェスタンブロットにおいてＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。５％の粉乳でブロックした後、膜を特異的抗体でブロッティングした。使用した抗体は以下である：Ｍｅｔ（ＭＤＣＫ細胞については、Ｍｅｔ ２５ＨＺ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した；ＤＢＴＲＧについては、Ｃ−２８，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ホスホ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ １２３４／１２３５ウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ホスホ ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／ｔｙｒ２０４ウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、またはβ−アクチン（ＡＣ−１５：ａｂ６２７６、Ａｂｃａｍ）（これは、ロードのコントロールの役目を果たした）。ＨＲＰ結合二次抗体への曝露の後、膜をＥＣＬ（「Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ」，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともにインキュベートし、化学発光シグナルの強度を画像分析によって検出した。
固相結合アッセイ。ＧＡを固定したアフィニティゲルビーズを、Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ ら、（１９９４）にしたがって調製し：ＧＡ（アフィニティゲルビーズに対して１．５等量）を、１，６−ジアミノへキサン（５〜１０等量）とともに、クロロホルム中で室温で攪拌した。ＧＡが完全に変換すると（ＴＬＣによってモニタリングした）、この混合物を、希水酸化ナトリウム水溶液およびブラインで連続して洗浄した。この有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして濃縮して、１７−（６−アミノヘキシルアミン）−１７−デメトキシゲルダナマイシンが、暗い紫色の固体（１Ｈ ＮＭＲによって純粋）が得られた。中間体をＤＭＳＯ中にとり、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０ビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とともに２時間攪拌した。得られた紫色のＧＡ−ビーズをＤＭＳＯで洗浄した。
コントロールのビーズは、ＨＳＰ９０に対する親和性を有していない、小さい鎖アナログと連結させたアフィニティーゲルからなる。Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０ビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）をＮ−（６−アミノヘキシル）アセトアミド（Ｌｅｅら、１９９５）（１．３等量）とともに、ＤＭＳＯ中で室温で２時間攪拌し、その後、ＤＭＳＯで十分に洗浄した。
上記によって得たＧＡ−ビーズおよびコントロールビーズを、５倍容量のＴＮＥＳＶ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＮａ２ＭｏＯ４、０．０９％のＮＰ−４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム）中で３回洗浄し、ＴＮＥＳＶ中で４℃で一晩回転させて、全ての未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを加水分解させ、その後、ＴＮＥＳＶ（１：１０）中１％のＢＳＡ中で、室温で少なくとも３時間の間振盪した。ＴＮＥＳＶでの３回以上の洗浄後、ビーズを５０％のＴＮＥＳＶ中に再懸濁させ、−７８℃で保存した。
親和性プルダウン実験を行うために、５×１０５個の細胞を、１００×２０ｍｍの皿に播種した。細胞を８０％のコンフルーエンスにまで増殖させた後、ＧＡまたはＭＡを、種々の濃度で皿に添加した。２４時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭプロテイナーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を補充したＴＮＥＳＶ緩衝液中で溶解させた。タンパク質濃度を、ＤＣタンパク質アッセイによって決定した。等量のタンパク質を、ＭｅｔおよびＨＳＰ９０αについてのウェスタンブロッティングに使用した。プルダウンアッセイについては、等濃度に調節した２０μｌのコントロールまたはＧＡビーズを５００Ｍμｌの抽出物に添加して、４℃で一晩回転させた。ビーズを低速での遠心分離によって回収し、ＴＮＥＳＶで３回洗浄した。６０μｌの２×試料緩衝液をビーズに添加し、１０分間煮沸した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後のウェスタンブロット分析に供した。
（実施例２２）
（ゲルダナマイシンはヒト細胞中ではＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるｕＰＡ活性の強力なインヒビターである）
本発明者らの研究室は、特定のＧＡ誘導体がＭＤＣＫ細胞中のＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるｕＰＡ活性を非常に低い濃度で阻害することを以前に報告した（Ｗｅｂｂら、２０００）。ほとんどの活性のある誘導体（「ｆＭ−ＧＡｉ」化合物と命名した）は、ＧＡの１７−メトキシ基がアミノ基またはアルキルアミノ基で置き換えられたものである（本明細書中で考察した）。
ＭＤＣＫ細胞と同様にヒトの腫瘍細胞がｆＭ−ＧＡｉ感受性を示すか否かを決定するために、いくつかの細胞株を、最初に、ＨＧＦ／ＳＦ誘導性のｕＰＡ活性についてスクリーニングした（表２）。高レベルのｕＰＡ活性が、ＨＧＦ／ＳＦによってＭＤＣＫ細胞中で誘導された。しかし、本発明者らはまた、ＨＧＦ／ＳＦ誘導性のｕＰＡ活性を示した４種のヒトの腫瘍細胞株、すなわち、３種の多形性膠芽腫（ＧＢＭ）細胞株（ＤＢＴＲＧ、Ｕ３７３，およびＳＮＢ１９）および浸潤性の高いＳＫ−ＬＭＳ−１平滑筋肉腫細胞（Ｊｅｆｆｅｒｓら、前出；Ｗｅｂｂら、２０００）も同定した。表１に列挙したこれらの化合物についての詳細なｆＭ−ＧＡｉ濃度−阻害試験は、表２に示した細胞株を使用して行った。ラディシコール（ＲＡ）およびマクベシンＩＩ（ＭＡ）は、ｎＭ範囲でｕＰＡ活性を阻害する薬物の例としての役目をした。ＭＤＣＫ細胞（Ｗｅｂｂら、（前出）によって以前に特徴付けられている）を、ｆＭ−ＧＡｉ薬物感受性についてのコントロールとして使用し、これは、以前の報告と同じ感受性を示した（図１、パネルＡ）。重要なことに、ＨＧＦ／ＳＦ（表２）に対する曝露後に少なくとも１．５倍のレベルのｕＰＡ活性を示したヒトの腫瘍細胞株のみが、ＭＤＣＫ細胞と同程度のｆＭ−ＧＡｉ感受性を示した（図１、パネルＢ（ＤＢＴＲＧ）、Ｃ（Ｕ３７３）、およびＤ（ＳＮＢ１９）、データは示さない）。いずれの化合物も、細胞増殖に対しては有意な効果は示さなかった（図１、パネルＥ、Ｆ、およびＧ）。ｆＭ−ＧＡｉ化合物は、それぞれの細胞株において、広い濃度範囲にわたって用量依存性曲線を示し、ＭＤＣＫ細胞およびＵ３７３細胞中では１７−ＡＡＧについて阻害効果が、１０−１７Ｍのような低い濃度で観察された。
これらの結果により、ｆＭ−ＧＡｉ化合物に対する感受性は、特定の細胞株の特定の特徴ではないことが確認された。しかし、ｆＭ−ＧＡｉ薬物は、ＨＧＦ／ＳＦへの曝露に応答してｕＰＡ活性の少なくとも５０％の誘導を達成する細胞においてのみ有効であるようでもある。感受性ＧＢＭ細胞株、特に、ＤＢＴＲＧ細胞およびＵ３７３細胞（図１、それぞれ、パネルＢおよびＣ）においては、ベースラインのｕＰＡ活性の低下が、ｆＭ−ＧＡｉ化合物に応答して観察された。これは、いくつかのＧＢＭ細胞中で見出される低いレベルの自己分泌ＨＧＦ／ＳＦ−Ｍｅｔシグナル伝達に関連し得る（Ｋｏｏｃｈｅｋｐｏｕｒ ら、１９９７）。
ＲＡおよびＭＡは、ｕＰＡ活性のＨＧＦ／ＳＦによって媒介される誘導を、ｎＭまたはそれよりも高い濃度でのみ阻害した。ＲＡ（これは、ＧＡよりもＨＳＰ９０に対してはるかに高い結合親和性を示す（Ｋｄ＝１９ｎＭ 対 １．２μＭ））（Ｒｏｅら、１９９９；Ｓｃｈｕｌｔｅら、１９９９）は、ＨＧＦ／ＳＦによって媒介されるｕＰＡ活性をｎＭ濃度でのみ阻害した。したがって、ＨＳＰ９０はｎＭ−ＧＡｉクラスの化合物についての分子標的であり得るが、これはこれらの感受性細胞中のｆＭ−ＧＡｉ活性の原因にはなり得ない。
Figure 2007530596
 １ＨＧＦ／ＳＦ誘導性のｕＰＡ活性を測定するために、細胞を９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、ＨＧＦ／ＳＦを、０、１０、２０、４０、および６０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で３連のウェルに添加し、さらに２４時間インキュベートした後に、ｕＰＡ活性を測定した。示した値は、それぞれの細胞株についての基底のｕＰＡ活性に対するＨＧＦ／ＳＦ曝露後に観察されたピークのｕＰＡの誘導の平均の割合である。アスタリスク（＊）は、ｆＭ−ＧＡｉ感受性を示した細胞株を示す（図１、データは示さない）。
（実施例２３）
（ｆＭ−ＧＡｉおよびＨＧＦ／ＳＦによって誘導される散乱および浸潤）
次の研究は、ｕＰＡ活性の阻害に加えて、ｆＭ−ＧＡｉ化合物がインビトロでの細胞の分散および腫瘍細胞の浸潤の生物学的活性に影響を与えるか否かを試験した。ＧＡ自体および１７−ＡＡＧは、ＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるＭＤＣＫ細胞の分散を、ｐＭからｆＭの範囲で阻害する（図１０）。さらに、図１１〜１３は、ｐＭ〜ｆＭの濃度でもなお、ＧＡは高度に浸潤性のＤＢＴＲＧ、ＳＮＢ１９、およびＵ３７３ヒトＧＢＭ細胞によるＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の浸潤を回避したことを示している。このような顕著な浸潤の阻害は、ｆＭの範囲でもなお、ｕＰＡ活性のＨＧＦ／ＳＦ誘導に対するｆＭ−ＧＡｉの阻害効果にほぼ匹敵していた（図３〜６を参照のこと）。
（実施例２４）
（ｆＭ−ＧＡｉ活性の原因であるＨＳＰ９０以外の分子標的についてのさらなる証拠）
本発明者らの研究室で以前に行われた研究により、ＧＡが、ｕＰＡ活性の阻害が生じるｆＭ範囲に対して、ＳＫ−ＬＭＳ−１細胞およびＭＤＣＫ細胞中のｕＰＡＲの発現およびＭｅｔの発現を、ｎＭまたはそれよりも高い濃度で阻害することが示された（Ｗｅｂｂら、前出）。１つの研究では、ｆＭ−ＧＡｉ化合物に感受性である細胞株中でのＭｅｔおよびＨＳＰ９０αの発現の、ＧＡおよびＭＡに対する感受性が試験された（図１４）。他の研究者らによって報告されているように、ｎＭレベルでは、ＧＡはＨＳＰ９０αをアップレギュレートし（Ｎｉｍｍａｎａｐａｌｌｉら、２００１）、そしてＭｅｔの発現をダウンレギュレートする（Ｍａｕｌｉｋら、２００２ａ；Ｗｅｂｂら、前出）（図３、ＭＤＣＫ細胞およびＤＢＴＲＧ細胞について、それぞれ、レーン５および１１）。しかし、ＧＡのようなｆＭ−ＧＡｉ化合物のｎＭ未満の濃度では、ＨＳＰ９０αまたはＭｅｔのいずれの相対的な量についても有意な変化は観察されなかった（図１４、レーン６および１２）。この濃度では、ｕＰＡ活性、分散、またはインビトロでの浸潤は、阻害された。
ＧＡによるＨＳＰ９０αのアップレギュレーションおよびＭｅｔのダウンレギュレーションが、１０−５ＭのＭＡで観察された（レーン３および９）が、１０−６Ｍでは、より低い応答が観察された（レーン４および１０）。重要なことに、無視できるレベルの全ＨＳＰ９０αは、それぞれ、１０−５ＭのＭＡおよび１０−６ＭのＧＡで、ＧＡ親和性ビーズを用いて回収され（レーン３、５、９、および１１）、そしてＧＡ親和性ビーズに対する利用可能なＨＳＰ９０αもまた、１０−６ＭのＭＡを用いた場合には減少した（レーン４および１０）。これらの結果は、いずれの薬物も、細胞溶解物中で、ＧＡのビーズ形態とのＨＳＰ９０の会合を妨げるように効率よく競合することを示しており、このことは、利用可能な結合部位がブロックされることを示している。これらの結果によって、ｎＭ未満のＧＡ濃度では、ＭｅｔまたはＨＳＰ９０αの発現に対しては効果が生じないとの結論が導かれた。さらに、ＭＡはｆＭ−ＧＡｉ活性を欠失しているにもかかわらず、ｎＭ−ＧＡｉ薬物であるＭＡは、ＧＡと同様に、ＧＡ親和性ビーズへのＨＳＰ９０αの結合と効率よく競合した。これらの結果は、ｆＭ−ＧＡｉ化合物のｎＭ未満での阻害効果が、ＨＳＰ９０αに対する化学量論的に有意ないずれの方法での結合にも関与し得ないことを示している。
（実施例２５）
（マクベシンＩＩに対して慢性的に曝露したＭＤＣＫ細胞の分析）
ＭＡで処理した細胞中のＨＳＰ９０αがＧＡ親和性ビーズに対しては利用され得ないことを示す先の実験から、ＭＤＣＫ培養物を最も高い非毒性のレベルでＭＡ上で慢性的に維持した場合に、ＨＳＰ９０αおよび他のｎＭ−ＧＡｉ標的分子上の結合部位が占有されて、これによってこれらの細胞がｆＭ−ＧＡｉ化合物に対してなおも感受性であるか否かを試験することができると予想した。
いくつかの高濃度でＭＡを試験したが、示した結果は、ＭＤＣＫ細胞が寛容化し得、なおも増殖できる最も高い非毒性レベルを使用したもののみである。ＭＤＣＫ細胞を、１×１０−６、２×１０−６、および３×１０−６Ｍの濃度のＭＡを含む培地中で長期間培養して、それぞれ、ＭＤＣＫＧ１、ＭＤＣＫＧ２、およびＭＤＣＫＧ３と命名した細胞を生成した。ＭＤＣＫ細胞は、３×１０−６ＭのＭＡ濃度までは増殖し続けたが、それよりも高い濃度では増殖しなかった。全ての細胞株は、親の細胞よりも速度はゆっくりであったが（示さず）、ＭＡの存在下で十分に増殖した。図１５には、ＭＡに対して慢性的に曝露した細胞株の応答を、１０−６ＭのＧＡまたは１０−５ＭのＭＡでの急激なチャレンジに対して表示する。１〜２×１０−６ＭのＭＡ（ＭＤＣＫＧ１〜Ｇ２）の中で維持した細胞は、ＭｅｔおよびＨＳＰ９０の両方について正常なレベルを示した（レーン２および５）が、一方、Ｍｅｔの量はＭＤＣＫＧ３細胞（３×１０−６ＭのＭＡ中で維持した）においては親の細胞よりも少なかった（レーン１および８を参照）。２４時間、急激にＧＡでチャレンジした際に、ＭＡに対して慢性的に曝露した細胞株の全てが、Ｍｅｔの量に関して劇的な減少を示したが、１０−５ＭのＭＡ自体でチャレンジした場合には、特に、ＭＤＣＫＧ２細胞およびＭＤＣＫＧ３細胞を用いた場合には、減少の兆候は少なかった（レーン３、６、および９）。ＨＳＰ９０αの急激な増加はＧＡでのチャレンジの際に、ＭＤＣＫＧ１細胞株およびＭＤＣＫＧ２細胞株において示唆されたが、ＭＤＣＫＧ３細胞においては示唆されなかった。これらの結果から、ＭＤＣＫＧ３は１０−６ＭのＧＡに対して少なくとも部分的に寛容化されるが、ＭＤＣＫＧ１およびＭＤＣＫＧ２は寛容化される程度が小さく、そして大部分では、親の細胞により似ている（図１４および１５を参照のこと）と結論付けた。
（実施例２６）
（マクベシンＩＩに対して慢性的に曝露した細胞中のＭｅｔ機能）
ＭＡで処理したＭＤＣＫＧ３細胞がＧＡに対するその感受性を保持しているか否かを評価するために、ＭｅｔがＭＡに対して慢性的に曝露された細胞において機能を維持しているか否かを最初に試験する実験を行った。Ｍｅｔ機能は、ＨＧＦ／ＳＦによって誘導される下流のシグナル伝達（図１６）、分散活性（図１７）、およびｕＰＡ活性の誘導（図１８）として測定した。親のＭＤＣＫ細胞およびＭＤＣＫＧ３細胞は、ＨＧＦ／ＳＦでの刺激後にＥｒｋ１およびＥｒｋ２のリン酸化について類似する経時変化を示し（図１６）、さらに、Ｍｅｔのリン酸化についても同様のレベルおよび経時変化を示した。したがって、ＭＤＣＫＧ３細胞中でのＭｅｔの発現はわずかに低いレベルであるにもかかわらず（図４および５）、ＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるＭｅｔ、ならびにＥｒｋ１およびＥｒｋ２のリン酸化パターンは、親のＭＤＣＫ細胞のものと類似している。
ＭＤＣＫＧ３細胞はなお、３×１０−６ＭのＭＡの存在下でもなお、ＨＧＦ／ＳＦに応答して分散した（図６Ａ、パネルｄおよびｅ）が、同じ濃度のＭＡは、ＭＤＣＫ細胞の分散を効率よくブロックした（図１７、パネルｃ）。
ＭＤＣＫＧ３細胞中のＨＧＦ／ＳＦによって誘導される細胞の分散に対する１０−７Ｍ〜１０−１５ＭでのＧＡの阻害活性を、次に試験した（図１７）。１０−１５ＭのＧＡでのみ再び散乱が完全に観察され（図６Ａ、パネルｉ）、このことは、３×１０−６ＭのＭＡ中で維持したＭＤＣＫＧ３細胞中でもなお、ｆＭ−ＧＡｉに対する優れた感受性が持続していることを示している。
次の実験では、ＭｅｔがＭＡに対して慢性的に曝露されたＭＤＣＫＧ３細胞中で機能を維持しているか否かを、ＨＧＦ／ＳＦによって誘導される下流でのｕＰＡの誘導によって測定して、試験した（図１８）。親のＭＤＣＫ細胞と同じように、ＧＡは、ＭＡよりもＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるｕＰＡ活性のはるかにより強力なインヒビターであった。これは、ＭＤＣＫＧ３細胞中では１０−１３Ｍで有効であった。まとめると、これらの発見は、ＭＤＣＫＧ３細胞中では、Ｍｅｔは、Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２を介するシグナル伝達（いずれも、散乱活性およびｕＰＡ誘導による）においてＨＧＦ／ＳＦに対して完全に応答性であることを示している。
（実施例２２〜２６の考察）
ＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるｕＰＡ活性は、多くのタイプの固形腫瘍において腫瘍の浸潤および転移に関係していることが知られている。Ｍｅｔによるシグナル伝達がＨＧＦ／ＳＦによって開始されると、ｕＰＡとｕＰＡＲとの両方の発現がアップレギュレートされ、プラスミノーゲンが切断されてプラスミンとなり、これによって細胞外マトリックスの分解が導かれる（Ｅｌｌｉｓら、１９９３）。高レベルのｕＰＡおよびｕＰＡＲの発現は、臨床的な予後不良に関係しており（Ｄｕｆｆｙ，１９９６；Ｄｕｆｆｙら、１９９６；Ｈａｒｂｅｃｋら、２００２）、そして実際に、ｕＰＡＲを標的化する抗ガン方法が開発されている（Ｇｏｎｄｉら、２００３；Ｌａｋｋａら、２００３；Ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚら、２００４）。本発明者らおよび共同研究者らは、ＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるｕＰＡプラスミンネットワークインヒビターをスクリーニングするための細胞をベースとする方法を以前に開発し、このアッセイを使用して、ｆＭ−ＧＡｉ化合物が、ＭＤＣＫ細胞中でｆＭ濃度でＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるｕＰＡプラスミンタンパク質分解を阻害し得ることを発見した（Ｗｅｂｂら、前出）。
上記の実施例は、ｕＰＡ−プラスミン活性だけではなく、ＨＧＦ／ＳＦによって誘導される散乱もまた、ｆＭレベルでｆＭ−ＧＡｉによって阻害されたことを示している（図２Ａ）。ＭＤＣＫ細胞は、ＨＧＦ／ＳＦによって誘導される散乱のアッセイおよびｕＰＡ−プラスミン誘導の両方において、これらの極めて強力な効果の最も感受性の高い指標のようである（表２）。
本発明者らは、マウスの乳ガン細胞株ＤＡ３およびヒトの前立腺細胞株ＤＵ１４５を用いて、いずれの細胞株も、ＨＧＦ／ＳＦに応答して散乱したが、ｕＰＡ活性はＨＧＦ／ＳＦによっては誘導されず、散乱はｎＭでしか阻害されなかったことを見出した。この結果についての説明は、ＨＧＦ／ＳＦによって誘導され得る散乱と、ｕＰＡ−プラスミンのアップレギュレーションとが、表２および図１の結果から示されるように、ｆＭ−ＧＡｉ感受性に関係しているということである。ＭＤＣＫ細胞は、依然として、散乱に対するｆＭ−ＧＡｉの効果の検出のためのより良好な試験システムである。
ＨＧＦ／ＳＦに応答する４種類のヒトの腫瘍細胞株中のｆＭ−ＧＡｉによって媒介されるｕＰＡの阻害もまた、本明細書中で最初に開示された。したがって、これらの強力な作用は、ヒトの腫瘍細胞の特性であると同時に、ＭＤＣＫ細胞に特有なものではない。感受性であるヒト細胞株においては、ｕＰＡ活性はＨＧＦ／ＳＦによって、少なくとも１．５倍アップレギュレートされ、このレベルは、ｆＭ−ＧＡｉ阻害を確実に測定するために必要であるようである。ｆＭ−ＧＡｉ感受性膠芽腫（ＧＢＭ）細胞株においては、基底のｕＰＡ活性に顕著な低下が生じ、基底のｕＰＡ活性は感受性の細胞株よりも高くあり得るにもかかわらず、この低下は、非感受性細胞株においては生じない。多くのＧＢＭ細胞株は、自己分泌様式でＨＧＦ／ＳＦおよびＭｅｔを発現し（Ｋｏｏｃｈｅｋｐｏｕｒら、前出）、一方、「非感受性」細胞にはこれらを発現するものはない。したがって、基底の低下は、ＨＧＦ／ＳＦによって誘導される経路に指向されるｆＭ−ＧＡｉ薬物の極めて強力な活性によって説明することができる。さらに、ｆＭ−ＧＡｉ化合物は、３種類の感受性ＧＢＭ細胞全てにおいて、ｕＰＡの阻害と同時に浸潤を阻害し（インビトロで）、このことによって、ｕＰＡの阻害と腫瘍の浸潤と転移の因果関係が確認される。
ｎＭ濃度では、ＧＡ薬物ファミリーのメンバーは、ＨＳＰ９０αシャペロン機能を妨害することによって腫瘍の増殖を阻害し、これによって不適切に折り畳まれた腫瘍タンパク質の分解を生じる（Ｃｈａｖａｎｙら、１９９６；Ｓｔｅｂｂｉｎｓら、１９９７；ＷｈｉｔｅｓｅｌｌおよびＣｏｏｋ、１９９６）。同定された細胞性の腫瘍タンパク質のほとんどは、アミノ末端のＡＴＰ結合ドメイン（これは、ＧＡ結合ドメインとも呼ばれる）を介してＨＳＰ９０に結合する（Ｃｈａｖａｎｙら、前出；Ｍｉｍｎａｕｇｈら、１９９６；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９６；Ｓｃｈｕｌｔｅら、１９９７）。代表的に、ｎＭ濃度のＧＡで処理した細胞中では、ＨＳＰ９０の発現はアップレギュレートされ、腫瘍タンパク質は２４時間以内に分解される。ＧＡでの処理によって、６時間から２４時間以内に腫瘍タンパク質の分解が誘導され（Ｌｉｕら、１９９６；Ｍａｕｌｉｋら、前出；Ｎｉｍｍａｎａｐａｌｌｉら、２００１；ＴｉｋｈｏｍｉｒｏｖおよびＣａｒｐｅｎｔｅｒ、２０００；Ｙａｎｇら、２００１）、これには、ＨＳＰ９０αの発現のアップレギュレーションが伴う（Ｎｉｍｍａｎａｐａｌｌｉ ら、．，２００１）。さらに、ヒトの小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）細胞株においては、ＧＡでの処置によって、ＨＳＰ９０の発現が変化しない場合にも、Ｍｅｔの分解を生じる（Ｍａｕｌｉｋら、前出）。
対照的に、散乱、浸潤、およびｕＰＡ活性が、ＨＳＰ９０のアップレギュレーションまたはＭｅｔのダウンレギュレーションのいずれを生じるにも低すぎる濃度でｆＭ−ＧＡｉ化合物によって阻害されることが本明細書中で示される。また、重要なシグナル伝達成分のリン酸化はＨＧＦ／ＳＦの添加後１０分のような早期に生じるにもかかわらず、ｆＭ−ＧＡｉ化合物は、ＨＧＦ／ＳＦの添加の４時間後までに添加された場合にもなお、ｕＰＡ活性を阻害する。したがって、ｆＭ−ＧＡｉ阻害は、Ｍｅｔによるシグナル伝達に対して下流で生じなければならないことが、本明細書中で示された。
ＲＡは、ＧＡよりもＨＳＰ９０に対して高い結合親和性を有しており、ｎＭ−ＧＡｉ ｕＰＡ阻害のみを示す。ＲＡはＧＡおよびｆＭ−ＧＡｉ化合物と同じように、ＨＳＰ９０の同じＡＴＰポケットに結合するが、より高い親和性を有している（Ｒｏｅら、１９９９；Ｓｃｈｕｌｔｅら、１９９９）。この発見は、ｆＭ−ＧＡｉ化合物がＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるｕＰＡ活性、細胞の散乱、および腫瘍細胞の浸潤を、ＨＳＰ９０以外の標的を介して阻害することを示唆している。これらの３つの活性の阻害が同時に生じることは、ｆＭ−ＧＡｉ薬物がＨＧＦ／ＳＦによって調節される転移／浸潤経路の共通の工程を標的とすることを示唆している。ＨＳＰ９０シャペロンの稀なサブセットがｆＭ−ＧＡｉ阻害を担っていることは想像できないことではない。例えば、Ｅｕｓｔａｃｅら、（２００４）は、ＨＳＰ９０αイソ型が、ガンの浸潤性に不可欠な役割を有しており、このイソ型が細胞外で発現され、そしてＭＭＰ２の活性化を促進するように細胞の外で相互作用することを報告している。
ＨＳＰ９０αのこの形態が本明細書中に記載した感受性ｕＰＡの効果の原因でもある可能性を試験するために、ｕＰＡアッセイにおいてＧＡ−ビーズを使用して実験を行った。ＨＧＦ−ＳＦによって誘導されるｕＰＡ活性の、細胞外ＧＡ親和性ビーズによる阻害は、１０−５Ｍでのみ生じるが、但し、ｕＰＡのｆＭレベルでの阻害は、そのようなＨＳＰ９０α細胞外イソ型には関係していない。本発明にしたがうと、ｆＭ−ＧＡｉ薬物についての新規の分子標的が存在している。
膠芽腫細胞は浸潤性の高い腫瘍であり、そしてｕＰＡ−プラスミンネットワークのＨＧＦ／ＳＦによる刺激がＧＢＭ浸潤における重要な工程である（Ｇｏｎｄｉら、２００３；Ｒａｏ、２００３）。これらの腫瘍は正常な脳組織に浸潤し、そして血管に沿って増殖し、その結果、それらを完全に切除することは不可能である。ＧＢＭ腫瘍のうちの８０％がＨＧＦ／ＳＦを発現し、それに対して、１００％がＭｅｔを過剰発現する（Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒら、前出）。ｕＰＡ活性は、正常な脳組織の中または悪性度の低い神経膠腫よりも、星状細胞（特に、膠芽腫）においてより高いこと（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、２００１；Ｇｌａｄｓｏｎら、１９９５；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９４）、そして、高いｕＰＡの発現は、予後不良の指標であること（Ｚｈａｎｇら、２０００）が見出されている。したがって、ＭｅｔおよびｕＰＡを標的化する薬物は、新しい治療ストラテジーに重要であり得る（Ｒａｏ，２００３）。本発明者らおよび共同研究者らの以前の研究のいくつかでは、いくつかのＧＢＭ細胞株の中での浸潤能力が測定された。ＤＢＴＲＧとＵ３７３は、最も浸潤性の高い株であった（Ｋｏｏｃｈｅｋｐｏｕｒら、１９９７）。ＳＮＢ１９細胞もまた、浸潤性の高いＧＢＭ細胞株である（Ｌａｋｋａら、２００３）。本明細書中に示すように、３つの浸潤性のＧＢＭ細胞株の全てが、ＨＧＦ／ＳＦによって誘導されるｕＰＡ活性および浸潤のｆＭ−ＧＡｉ阻害を、極めて低い濃度で示した。１７−ＡＡＧは、現在、膠芽腫ではないいくつかの異なるガンについて臨床試験の段階にある（Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ、２００２；Ｇｏｅｔｚら、２００３）。本発明にしたがうと、ｆＭ−ＧＡｉ薬物は、ＧＢＭ脳腫瘍の処置にも有用である。
（上記で引用した参考文献（省略した引用としての））
Figure 2007530596
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 上記で引用した全ての参考文献は、具体的に援用されているか否かにはかかわらず、その全体が参考として本明細書中に援用される。
本発明はここに十分に記載されるが、同じものを、広範囲の等価なパラメーター、濃度、および条件で、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、過度の実験を伴うことなく行うことができることは当業者に明らかである。
代表的なＧＡ誘導化合物の活性。吸光度は、試験される化合物が存在しない条件、または種々の濃度の試験される化合物の存在下で、ＨＧＦ／ＳＦに対する最初のＭＤＣＫ細胞の曝露の後、およびプラスミン−感受性発色団に対する２４時間の曝露の後に、４０５ｎｍで読み取った。表示した値は、各々の試験した化合物のそれぞれの濃度での３連のアッセイによる平均値±１ Ｓ．Ｄ．を示す。 代表的なＧＡ誘導化合物の活性。吸光度は、試験される化合物が存在しない条件、または種々の濃度の試験される化合物の存在下で、ＨＧＦ／ＳＦに対する最初のＭＤＣＫ細胞の曝露の後、およびプラスミン−感受性発色団に対する２４時間の曝露の後に、４０５ｎｍで読み取った。表示した値は、各々の試験した化合物のそれぞれの濃度での３連のアッセイによる平均値±１ Ｓ．Ｄ．を示す。 ヒトの腫瘍細胞株中でのｕＰＡの阻害に対するＧＡおよび関連化合物の効果。細胞を、ＧＡおよび関連化合物が存在しない条件、または示した種々の濃度のＧＡおよび関連化合物の存在下で、６０単位／ｍｌのＨＧＦ／ＳＦと共に２４時間インキュベートした。ｕＰＡ活性アッセイは、原則的には以前に記載された（Ｗｅｂｂら，２０００）とおりに、ＭＤＣＫ細胞上で行った。実施例。使用した細胞は以下のとおりである：図３−ＭＤＣＫ；図４−ＤＢＴＲＧ；図５−Ｕ３７３；図６−ＳＮＢ１９。ＲＡおよびＭＡを含む試験化合物を、示した濃度で使用した。ＧＡ誘導体は以下のように省略する：ＧＡ＝ゲルダナマイシン；１７−ＡＡＧ＝１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、および１７−ＡＤＧ＝１７−アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン。 ヒトの腫瘍細胞株中でのｕＰＡの阻害に対するＧＡおよび関連化合物の効果。細胞を、ＧＡおよび関連化合物が存在しない条件、または示した種々の濃度のＧＡおよび関連化合物の存在下で、６０単位／ｍｌのＨＧＦ／ＳＦと共に２４時間インキュベートした。ｕＰＡ活性アッセイは、原則的には以前に記載された（Ｗｅｂｂら，２０００）とおりに、ＭＤＣＫ細胞上で行った。実施例。使用した細胞は以下のとおりである：図３−ＭＤＣＫ；図４−ＤＢＴＲＧ；図５−Ｕ３７３；図６−ＳＮＢ１９。ＲＡおよびＭＡを含む試験化合物を、示した濃度で使用した。ＧＡ誘導体は以下のように省略する：ＧＡ＝ゲルダナマイシン；１７−ＡＡＧ＝１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、および１７−ＡＤＧ＝１７−アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン。 ヒトの腫瘍細胞株中でのｕＰＡの阻害に対するＧＡおよび関連化合物の効果。細胞を、ＧＡおよび関連化合物が存在しない条件、または示した種々の濃度のＧＡおよび関連化合物の存在下で、６０単位／ｍｌのＨＧＦ／ＳＦと共に２４時間インキュベートした。ｕＰＡ活性アッセイは、原則的には以前に記載された（Ｗｅｂｂら，２０００）とおりに、ＭＤＣＫ細胞上で行った。実施例。使用した細胞は以下のとおりである：図３−ＭＤＣＫ；図４−ＤＢＴＲＧ；図５−Ｕ３７３；図６−ＳＮＢ１９。ＲＡおよびＭＡを含む試験化合物を、示した濃度で使用した。ＧＡ誘導体は以下のように省略する：ＧＡ＝ゲルダナマイシン；１７−ＡＡＧ＝１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、および１７−ＡＤＧ＝１７−アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン。 ヒトの腫瘍細胞株中でのｕＰＡの阻害に対するＧＡおよび関連化合物の効果。細胞を、ＧＡおよび関連化合物が存在しない条件、または示した種々の濃度のＧＡおよび関連化合物の存在下で、６０単位／ｍｌのＨＧＦ／ＳＦと共に２４時間インキュベートした。ｕＰＡ活性アッセイは、原則的には以前に記載された（Ｗｅｂｂら，２０００）とおりに、ＭＤＣＫ細胞上で行った。実施例。使用した細胞は以下のとおりである：図３−ＭＤＣＫ；図４−ＤＢＴＲＧ；図５−Ｕ３７３；図６−ＳＮＢ１９。ＲＡおよびＭＡを含む試験化合物を、示した濃度で使用した。ＧＡ誘導体は以下のように省略する：ＧＡ＝ゲルダナマイシン；１７−ＡＡＧ＝１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、および１７−ＡＤＧ＝１７−アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン。 ＧＡおよび関連化合物のヒト腫瘍細胞株の増殖に対する効果。薬剤で処理した細胞による正規化した細胞増殖の結果を、薬剤が存在しない条件下でＨＧＦ／ＳＦで刺激した細胞から得られた平均値に対して正規化し、コントロールに対する百分率として表した。表示した値は、各々の試験化合物のそれぞれの濃度での３連のアッセイ（実施例に記載されるＭＴＳアッセイ）による平均値±１ ｓ．ｄ．を示す。使用した細胞は以下のとおりである：図７−ＢＴＲＧ；図８−Ｕ３７３；図９−ＳＮＢ１９。試験化合物と省略については、図３〜６について上記したとおりである。 ＧＡおよび関連化合物のヒト腫瘍細胞株の増殖に対する効果。薬剤で処理した細胞による正規化した細胞増殖の結果を、薬剤が存在しない条件下でＨＧＦ／ＳＦで刺激した細胞から得られた平均値に対して正規化し、コントロールに対する百分率として表した。表示した値は、各々の試験化合物のそれぞれの濃度での３連のアッセイ（実施例に記載されるＭＴＳアッセイ）による平均値±１ ｓ．ｄ．を示す。使用した細胞は以下のとおりである：図７−ＢＴＲＧ；図８−Ｕ３７３；図９−ＳＮＢ１９。試験化合物と省略については、図３〜６について上記したとおりである。 ＧＡおよび関連化合物のヒト腫瘍細胞株の増殖に対する効果。薬剤で処理した細胞による正規化した細胞増殖の結果を、薬剤が存在しない条件下でＨＧＦ／ＳＦで刺激した細胞から得られた平均値に対して正規化し、コントロールに対する百分率として表した。表示した値は、各々の試験化合物のそれぞれの濃度での３連のアッセイ（実施例に記載されるＭＴＳアッセイ）による平均値±１ ｓ．ｄ．を示す。使用した細胞は以下のとおりである：図７−ＢＴＲＧ；図８−Ｕ３７３；図９−ＳＮＢ１９。試験化合物と省略については、図３〜６について上記したとおりである。 細胞の散乱に対するＧＡの効果。ＭＤＣＫ細胞を、９６ウェルプレートに１５００細胞／ウェルで３連で播種し、２４時間後に、ＨＧＦ／ＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を単独で、またはＧＡの存在下で添加した。さらに２４時間後、細胞を固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色セットを使用して染色した。処理したＭＤＣＫ細胞調製物についての代表的な顕微鏡写真を以下のようにパネルに示した：（ａ〜ｊ）ＭＤＣＫ細胞；（ｂ〜ｊ）ＨＧＦ／ＳＦで処理した細胞；（ｃ）ＧＡを１０−７Ｍで添加した；（ｄ）ＧＡを１０−９Ｍで添加した；（ｅ）ＧＡを１０−１３Ｍで添加した；（ｆ）ＧＡを１０−１５Ｍで添加した；（ｇ）１７−ＡＡＧを１０−７Ｍで添加した；（ｈ）１７−ＡＡＧを１０−９Ｍで添加した；（ｉ）１７−ＡＡＧを１０−１３Ｍで添加した；（ｊ）１７−ＡＡＧを１０−１５Ｍで添加した。 インビトロでの細胞浸潤に対するＧＡの効果。ＤＢＴＲＧ細胞（図１１）、ＳＮＢ１９細胞（図１２）、およびＵ３７３細胞（図１３）を、実施例１９に記載するようなＭａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイによって測定した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）層に浸透している細胞を、薬剤への曝露の２４時間後に数えた。それぞれの棒は、３連の試料による細胞数についての平均±１ ｓ．ｄ．を示す。 インビトロでの細胞浸潤に対するＧＡの効果。ＤＢＴＲＧ細胞（図１１）、ＳＮＢ１９細胞（図１２）、およびＵ３７３細胞（図１３）を、実施例１９に記載するようなＭａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイによって測定した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）層に浸透している細胞を、薬剤への曝露の２４時間後に数えた。それぞれの棒は、３連の試料による細胞数についての平均±１ ｓ．ｄ．を示す。 インビトロでの細胞浸潤に対するＧＡの効果。ＤＢＴＲＧ細胞（図１１）、ＳＮＢ１９細胞（図１２）、およびＵ３７３細胞（図１３）を、実施例１９に記載するようなＭａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイによって測定した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）層に浸透している細胞を、薬剤への曝露の２４時間後に数えた。それぞれの棒は、３連の試料による細胞数についての平均±１ ｓ．ｄ．を示す。 ＨＳＰ９０αとＭｅｔの発現に対するＭＡおよびＧＡの曝露の効果。ＭＤＣＫ細胞およびＤＢＴＲＧ細胞を、示した濃度のマクベシン（ＭＡ）またはＧＡの存在下でＨＧＦ／ＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。細胞溶解物を、実施例１０に記載するように分析した。それぞれの細胞溶解物のアリコートもまた、記載するようにＧＡ−親和性ビーズとともにインキュベートし、ビーズからの溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その後、ＨＳＰ９０αに対する抗体で免疫ブロットした。コントロール培養物には、ＨＧＦ／ＳＦも試験化合物も加えなかった。得られた蛍光像の関連する領域を示す：レーン１〜６および７〜１０の試料は、それぞれ、ＭＤＣＫおよびＤＢＴＲＧの全細胞溶解物に由来する。ＨＳＰ９０αを、抗ＨＳＰ９０α抗体を用いたウェスタンブロットにおいて、ＧＡゲルビーズ（上段のパネル）を用いて、または全細胞溶解物（下段のパネル）中で、プルダウン実験において検出した。レーン２〜６および８〜１２の試料は、ＨＧＦ／ＳＦで処理した細胞に由来する試料である。レーン３，４、および９、１０の試料は、示したようにＭＡで処理した細胞に由来する試料である。レーン５、６、および１１、１２の試料は、示したようにＧＡで処理した細胞に由来する試料である。 ｎＭ−ＧＡｉおよびｆＭ−ＧＡｉ薬剤でのチャレンジに対するＭｅｔおよびＨＳＰ９０αの感受性に対するＭＡ中の長期ＭＤＣＫ細胞培養物の効果。ＭＤＣＫ細胞を、１、２、または３×１０−６Ｍの濃度のＭＡ中で２〜３ヶ月間維持して、それぞれ、ＭＤＣＫＧ１細胞、ＭＤＣＫＧ２細胞、およびＭＤＣＫＧ３細胞を作製した。１０６個の親のＭＤＣＫ細胞または長期曝露細胞（Ｇ１〜Ｇ３）を皿に播種し８０％のコンフルーエンシーまで増殖させ、その後、ＧＡ（＋ＧＡ、１０−６Ｍ）またはＭＡ（＋ＭＡ、１０−５Ｍ）のいずれかに２４時間曝露した。細胞を回収し、溶解させ、そして溶解物を、Ｍｅｔ、ＨＳＰ９０α、およびβ−アクチン（ローディングコントロール）の相対的な量について、ウェスタンブロットによって分析した（実施例１９を参照のこと）。得られた蛍光像の関連領域を示す。 ＭＡに長期間曝露した細胞培養物中でのＨＧＦ／ＳＦ−Ｍｅｔシグナル伝達。２．５×１０５個の親のＭＤＣＫ細胞およびＭＡ中で維持したＭＤＣＫＧ３細胞を、６０×１５ｍｍの皿に播種し、その２４時間後、ＨＧＦ／ＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）に曝露した。示したタイミングで、細胞を回収し、溶解させ、そして溶解物を、Ｍｅｔ、全Ｅｒｋ１またはリン酸化されたＥｒｋ１、全Ｅｒｋ２またはリン酸化されたＥｒｋ２、ならびにβ−アクチン（ローディングコントロール）の相対的な量について、適切な抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した（実施例１９を参照のこと）。得られた蛍光像の中のＭｅｔ、ｐ−Ｍｅｔ、Ｅｒｋ１、Ｅｒｋ２、およびｐ−Ｅｒｋ１、ｐ−Ｅｒｋ２を示す関連領域を示す。 ＭＤＣＫ細胞およびＭＤＣＫＧ３細胞中のＨＧＦ／ＳＦによって刺激される散乱に対するＭＡおよびＧＡの効果。１５００個の親のＭＤＣＫ細胞（パネルａ〜ｃ）または３×１０−６ＭのＭＡ中で維持したＭＤＣＫＧ３細胞（パネルｄ〜ｉ）を、９６ウェルプレートに播種した。ＨＧＦ／ＳＦを、単独で（ＨＧＦ／ＳＦ、１００ｎｇ／ｍｌ）、ＭＡ（３×１０−６Ｍ）と共に、またはＧＡ（１０−７から１０−１５Ｍ）と共に、２４時間後に添加した。２４時間後、散乱を顕微鏡で評価した。代表的な顕微鏡写真（１００倍）を示す：（ａ）コントロールＭＤＣＫ細胞；（ｂ）ＭＤＣＫ細胞＋ＨＧＦ／ＳＦ；（ｃ）ＭＤＣＫ細胞＋ＨＧＦ／ＳＦ＋ＭＡ（３×１０−６Ｍ）；（ｄ）コントロールＭＤＣＫＧ３細胞；（ｅ）ＭＤＣＫＧ３細胞＋ＨＧＦ／ＳＦ；（ｆ）ＭＤＣＫＧ３細胞＋ＨＧＦ／ＳＦ＋ＧＡ（１０−７Ｍ）；（ｇ）ＭＤＣＫＧ３細胞＋ＨＧＦ／ＳＦ＋ＧＡ（１０−９Ｍ）；（ｈ）ＭＤＣＫＧ３細胞＋ＨＧＦ／ＳＦ＋ＧＡ（１０−１３Ｍ）；（ｉ）ＭＤＣＫＧ３細胞＋ＨＧＦ／ＳＦ＋ＧＡ（１０−１５Ｍ）。 ＭＤＣＫ細胞およびＭＤＣＫＧ３細胞中でのＨＧＦ／ＳＦによって刺激されるｕＰＡの誘導に対するＭＡとＧＡの効果。１５００個の細胞を播種し、ＨＧＦ／ＳＦで、またはマクベシンＩＩ（ＭＡ）もしくはゲルダナマイシン（ＧＡ）で処理した。さらに２４時間のインキュベーションの後、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、それぞれのウェルに対して、プラスミン感受性発色団を含む２００μｌの反応緩衝液を添加した。その後、プレートを３７℃、５％のＣＯ２で４時間インキュベートし、この時点で、生じた吸光度を、自動分光光度プレート読み取り装置で４０５ｎｍの単一波長で読み取った。

Claims (31)

  1. 式Ｉまたは式ＩＩの化合物
    Figure 2007530596
     あるいはその薬学的に許容される塩であって；
    これらは、ガン細胞中のＨＧＦ／ＳＦによるＭｅｔの活性化を、１０−１１Ｍ未満の濃度で阻害する特性を有しており、式中、
    Ｒ１は、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、状況に応じて置換された低級アルキル、アルケニル、またはアルキニル；低級アルコキシ、アルケノキシ、およびアルキノキシ；直鎖または分岐したアルキルアミン、アルケニルアミン、およびアルキニルアミン；３〜６員複素環基であり、これは状況に応じて置換され；
    Ｒ２は、Ｈ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、状況に応じて置換された低級アルキル、アルケニル、またはアルキニル；低級アルコキシ、アルケノキシ、およびアルキノキシ；直鎖または分岐したアルキルアミン、アルケニルアミン、およびアルキニルアミン；３〜６員複素環基であり、これは状況に応じて置換され；
    Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、状況に応じて置換された低級アルキル、アルケニル、またはアルキニル；低級アルコキシ、アルケノキシ、およびアルキノキシ；直鎖または分岐したアルキルアミン、アルケニルアミン、アルキニルアミンであるか、あるいは、Ｎは、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロケニル、またはヘテロアリール環の構成要素であり、これは状況に応じて置換され；
    Ｒ４は、Ｈ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、状況に応じて置換された低級アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、そして式中、
    位置Ｃ２＝Ｃ３、Ｃ４＝Ｃ５、およびＣ８＝Ｃ９の間の環二重結合は、状況に応じて、単結合となるように水素化される、化合物あるいはその薬学的に許容される塩。
  2. 式Ｉのベンゾキノン化合物である、請求項１に記載の化合物。
  3. 式ＩＩのヒドロキノン化合物である、請求項１に記載の化合物。
  4. ガン細胞中のＨＧＦ／ＳＦによるＭｅｔの活性化を、１０−１３Ｍ未満の濃度で阻害する、請求項１に記載の化合物。
  5. ガン細胞中のＨＧＦ／ＳＦによるＭｅｔの活性化を、１０−１５Ｍ未満の濃度で阻害する、請求項４に記載の化合物。
  6. ガン細胞中のＨＧＦ／ＳＦによるＭｅｔの活性化を、１０−１７Ｍ未満の濃度で阻害する、請求項５に記載の化合物。
  7. 前記Ｒ１が３〜６員複素環であり、式中、Ｎはヘテロ原子である、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
  8. Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４がＨである、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
  9. 以下：
    （ａ）１７−（２−フルオロエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
    （ｂ）１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
    （ｃ）１７−Ｎ−アジリジニル−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
    （ｄ）１７−アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
    （ｅ）１７−Ｎ−アゼチジニル−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
    （ｆ）１７−（２−ジメチルアミノエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；
    （ｇ）１７−（２−クロロエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；および
    （ｈ）ジヒドロゲルダナマイシン
    からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
  10. （ａ）請求項１〜９のいずれかに記載の化合物；および
    （ｂ）薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む、薬学的組成物。
  11. Ｍｅｔを保有している腫瘍またはガン細胞の、ＨＧＦ／ＳＦによって誘導される、Ｍｅｔレセプターによって媒介される生物学的活性を阻害する方法であって、前記細胞に対して、前記生物学的活性の阻害について約１０−１３Ｍ未満のＩＣ５０を有している、有効量の請求項１〜９のいずれかに記載の化合物を提供する工程が含まれる、方法。
  12. 前記生物学的活性が前記細胞中のｕＰＡ活性の誘導である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記生物学的活性が前記細胞の増殖または散乱である、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記細胞の前記増殖がインビトロでの増殖である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記細胞の前記増殖がインビボでの増殖である、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記生物学的活性が前記細胞の浸潤である、請求項１１に記載の方法。
  17. 前記浸潤がインビトロでの浸潤である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記浸潤がインビボでの浸潤である、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記浸潤によって腫瘍の転移が生じる、請求項１６に記載の方法。
  20. ＨＧＦ／ＳＦによって誘導される、Ｍｅｔを保有している腫瘍またはガン細胞の被験体の中での転移を阻害する方法であって、前記被験体に対して、インビトロでのアッセイにおいて測定した場合に腫瘍細胞の浸潤の阻害について約１０−１２Ｍ未満のＩＣ５０を有している、有効量の請求項１〜９のいずれかに記載の化合物を提供する工程を含む、方法。
  21. ＨＧＦ／ＳＦによって誘導される、Ｍｅｔを保有している腫瘍またはガン細胞の被験体の中での転移を阻害する方法であって、前記被験体に対して、インビトロでのアッセイにおいて測定した場合に腫瘍細胞の浸潤の阻害について約１０−１２Ｍ未満のＩＣ５０を有している化合物を含む、有効量の請求項１０に記載の薬学的組成物を提供する工程を含む、方法。
  22. 前記阻害によって、前記細胞によって引き起こされる腫瘍の測定可能な退行、または前記被験体の中での腫瘍の増殖の測定可能な減衰が生じる、請求項１１〜１９のいずれかに記載の方法。
  23. 感受性の被験体をＭｅｔ陽性腫瘍の増殖または転移から防御する方法であって、
    （ａ）前記腫瘍を発症するリスクがある
    （ｂ）すでに処置された被験体の場合には、前記腫瘍を再発するリスクがある
    のいずれかである該被験体に対して、有効量の請求項１〜９のいずれかに記載の化合物、または請求項１０に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
  24. 前記被験体がヒトである、請求項２３に記載の方法。
  25. ＨＧＦ反応性のＭｅｔを発現する腫瘍を有している哺乳動物において抗腫瘍応答または抗ガン応答を誘導する方法であって、有効量の請求項１〜９のいずれかに記載の化合物、または請求項１０に記載の薬学的組成物を前記哺乳動物に投与し、それによって、
    （ａ）（ｉ）全ての測定可能な病変の最大垂直直径の積の和の少なくとも５０％の減少；
    （ｉｉ）新しい病変の兆候がないこと；および
    （ｉｉｉ）全ての既存の病変について進行がないこと
    を特徴とする部分的な応答、あるいは、
    （ｂ）少なくとも１ヶ月の間の、腫瘍またはガン疾患の全ての兆候の消滅を特徴とする完全な応答
    である、抗腫瘍応答または抗ガン応答が誘導される工程を含む、方法。
  26. 前記抗腫瘍応答または抗ガン応答が、部分的な抗腫瘍応答または抗ガン応答である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記哺乳動物がヒトである、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. ハロゲン放射性核種で検出可能に標識される、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物。
  29. 前記放射性核種がＲ１基に結合させられる、請求項２８に記載の化合物。
  30. 前記放射性核種が、１８Ｆ、７６Ｂｒ、７６Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉからなる群より選択される、請求項２８または２９に記載の化合物。
  31. 請求項１〜９のいずれかに記載の組成物の標的である被験体中の腫瘍を画像化する方法であって、有効量の請求項２８〜３０のいずれかに記載の標識された化合物を投与する工程と、画像化手段を用いて検出可能な標識を画像化する工程を含む、方法。
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