JP2007526214A - 発癌性細胞の転移を阻害するモリンダ・シトリフォリアに基づく製剤 - Google Patents

Abstract

本発明は植物ヤエヤマアオキ、特に、モリンダ・シトリフォリア（Morinda citrifolia ）果汁から加工処理された成分であって、発癌性細胞の転移を阻害および防止するための、ならびに転移した細胞を破壊するための成分を特徴とする。少なくとも本発明の一部の実施は、加工処理したモリンダ・シトリフォリアを含有する食品または医薬製品または組成物を消費することからなる。

Description

本発明は発癌性細胞の転移の阻害に関する。特に、本発明は医薬品、ならびに健康と快適な暮らしのための食品、とりわけ、癌原発部位からの発癌性細胞の転移を阻害、遮断、および／または予防するために設計した医薬品または健康と快適な暮らしのための食品に関する。

転移とは癌細胞が癌原発部位から身体の別の領域に拡散または移動することである。より詳しくは、転移は悪性癌細胞がその最初の部位から離れた臓器に移動または拡散することである。このことは特定の白血球細胞以外、殆どの正常細胞がなし得ないことであり、癌の最も死につながる特性である。この領域に焦点を絞った膨大な研究にもかかわらず、転移癌の疾患をもつ患者が利用し得る薬物または治療処置は非常にわずかであり、この死に至る病いを征服するための新しい因子を探索することが、研究者および医師双方にとっての数十年来の緊急課題であった。癌患者の５０％以上が転移により死亡している。

転移に際して、腫瘍細胞は、組織が正常に互いに分離している繊維性境界部に侵入する。腫瘍はまた血管またはリンパ管の壁に浸透し、癌細胞を循環系に放出する。血中において、これらの腫瘍細胞は下流に搬送され、次の毛細血管床に居を構える。例えば、大腸癌から放出された腫瘍細胞は、循環系により肝臓に搬送され、そこで二次的腫瘍を立ち上げる。身体の他の領域からの腫瘍細胞は心臓を経由して血液により肺に搬送され、そこで腫瘍細胞は転移性肺腫瘍を発生させる。リンパ系に放出された腫瘍細胞は、しばしば最も近いリンパ節で腫瘍細胞を確立し、そこで成長した後に身体のさらに離れた部分に拡散する。原発性腫瘍から放出され生き残る細胞は１０,０００個の内、１個に満たないと考えられるが、これらは身体の他の場所で二次的腫瘍を引き起こすのに十分である。

固形腫瘍をもつ新規患者の約３０パーセントが検出可能な転移をもつ。残り患者の約半数はこの腫瘍のみを処置することで治癒するであろう。残りは検出不能の転移を有し、これは結局腫瘍に発展する。腫瘍の分類は、悪性度が原発性腫瘍の範囲を超えて広がったかどうかの判断基準を含む。これは患者の予後を判定する上での主要因子である。

早期検出の目的は転移が起こる前に原発腫瘍を除去することである。残念なことに、一部の腫瘍は明らかにそれが発見されるために十分な大きさとなるまでに転移する。かかる微小転移の拡散は、その原発性腫瘍を早期に発見した後でさえ何故多くの女性が乳癌のため死に至るか、その理由を説明する。

従って、癌の転移とはその当初の部位から悪性癌細胞が離れた臓器に移動または拡散することである。癌患者の５０％以上が転移のために死に至る。この領域に焦点を絞った膨大な量の研究にもかかわらず、転移癌の疾患をもつ患者が利用し得る薬物または治療処置は非常にわずかであり、この死に至る病いを征服するための新しい因子を探索することが、研究者および医師双方にとっての数十年来の緊急課題であった。従って、転移を効果的に阻害することは技術上の改善となる。

発明の要約
本発明は発癌性細胞の転移を阻害することに関する。特に、本発明は医薬品、ならびに健康と快適な暮らしに関わる食品、とりわけ、癌原発部位からの発癌性細胞の転移を阻害、遮断、および／または予防するために設計した医薬品または健康と快適な暮らしのための食品に関する。

本発明の実施は、発癌性細胞の転移を処置するため、とりわけ、転移の阻害、遮断、および／または予防に使用するために、１種以上の形状の加工処理したモリンダ・シトリフォリア（Morinda citrifolia）を含有してなる製剤との関連で行う。少なくとも本発明の一部の実施態様は、転移処置用の天然医薬製剤を含み、この製剤は約０.０１ないし１００重量パーセントの量で存在する１種以上の加工処理したモリンダ・シトリフォリア製品を含有してなる。一部の実施態様において、モリンダ・シトリフォリア産物はモリンダ・シトリフォリアの果汁または果汁濃縮物を含有してなる。他の実施態様において、モリンダ・シトリフォリア製品はピューレ果汁またはピューレ濃縮物を含有してなる。また、これらを他の天然成分と組合わせるか、および／または混合することも企図される。

本発明はさらに発癌性細胞の転移を阻害および予防する方法、ならびに初期段階の転移した発癌性細胞を破壊する方法を特徴とする。この方法は、加工処理したモリンダ・シトリフォリア製品をアルコール系溶液に添加し；溶液からモリンダ・シトリフォリアの有効成分を単離および抽出し；および抽出した有効成分を発癌性細胞に罹患している領域に導入し、それによって抽出有効成分が発癌性細胞のさらなる増殖を阻害および防止し、ならびに早期段階の転移発癌性細胞を破壊する、の各工程を含む。

少なくとも一部の実施態様は、モリンダ・シトリフォリア果汁からのエタノール不溶性沈殿物の腫瘍転移阻害に関する。モリンダ・シトリフォリアＬ.（Morinda citrifolia L.“モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴ”）からのエタノール不溶性沈殿物（多糖類）を用いて、メラノーマＢ１６−ＦＯ細胞の同系間腫瘍転移モデルにおいて抗転移活性を与える。マウスでの研究の結果、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴがマウス１匹あたり０.８ｍｇで２２％の阻害効果（ｐ＜０.００５）を示した。

ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）分析は、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが、８７９、２０４５、１４,４６１、および８４,０７６ダルトンそれぞれに４種の異なる分子量の分子を含むことを示した。イオン交換クロマトグラフィーを用い、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴを０.１Ｎ−ＮａＣｌにより溶出することによりＭＷ８４,０７６のフラクションを誘導した。モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴおよびＭＷ８４,０７６のフラクションは、それぞれ１０ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌで、フィブロネクチン被覆ウエルへのＮＲＫ２細胞の接着に対し、３６％および３７％の阻害を示した。

フィブロネクチン接着の阻害はモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴの抗転移作用のメカニズムの一つでありうるが、フィブロネクチン仲介接着実験における比較的弱い接着作用は、そこに関与する２つ以上のメカニズムが存在し得ることを示唆している。炭水化物含量分析は、ＵＶ分光計で定量して、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが７０％のガラクツロン酸を含有することを示した。この知見はモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが、肺内皮細胞表面分子にＬｕ−ＥＣＡＭ−１−ａガラクトシド結合タンパク質が結合することにより、肺組織に対するメラノーマＢ１６−ＦＯの接着を抑制することを示唆している。また、このことは、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが、多くの悪性細胞表面発現ガレクチン−ガラクトシド結合タンパク質に対し、細胞−細胞および細胞−基質結合の遮断を介して、抗転移作用を示すことをも示唆する。

少なくとも一部の研究では、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴは内皮細胞管の形成阻害作用を示さなかった。従って、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴの抗転移作用は、腫瘍細胞塞栓の形成および腫瘍細胞−細胞相互作用を阻害する抗接着因子として作用している。

本発明の諸々の特徴および利点は、以下の記載および添付の請求項に説明されており、またそこからより明らかなものとなろう。この特徴および利点は添付の請求項に特に指摘した装置類と組合わせることにより実現かつ取得可能である。さらに、本発明の特徴および利点は本発明の実施により知り得るものであり、また本明細書に説明するように、その記載から明らかとなろう。

発明の詳細な説明
本発明は発癌性細胞の転移の阻害に関する。特に、本発明は医薬品、ならびに健康と快適な暮しのための食品、とりわけ、癌原発部位からの発癌性細胞の転移を阻害、遮断、および／または予防するために設計した医薬品または健康と快適な暮しのための食品に関する。

本発明の以下の開示は２つの副標題、すなわち、“モリンダ・シトリフォリアの一般説明”および“転移の阻害”に分ける。副標題の利用は読者の便宜のためのみのものであり、いかなる意味でも制限と解釈されるべきではない。

“モリンダ・シトリフォリアの一般説明”
本発明の態様は、発癌性細胞の転移の処置のため、特に、転移の阻害、遮断、および／または予防に使用するための１種以上の形状の加工処理したモリンダ・シトリフォリアを含有してなる製剤を含む。従って、モリンダ・シトリフォリアの一般説明には、以下のように、その起源、加工手法、および健康上の利益を含む。転移の治療に使用されるモリンダ・シトリフォリアに基づく製剤と組成物、および被験者にこれらを投与するために使用される方法につき、実験研究の例および得られる結果を含め、以下に提供する。

ヤエヤマアオキまたはモリンダ・シトリフォリア植物（学名、モリンダ・シトリフォリアＬ．（Morinda citrifolia L.））（“モリンダ・シトリフォリア”）は、高さ１０ｍまでの低木または小型の樹木である。葉は長楕円または卵形で対生に並ぶ。小型の白い花は肉質、球形の頭花様のクラスターに含まれている。果実は大きく、肉質で卵形である。成熟時、果実はクリームないし白色で食用とし得るが、不快な味と臭気を有する。この植物は東南アジア原産であり、早期にインドから東部ポリネシアの広い地域に広がった。これは野生種として何処にでも成長し、また農場や小さな個人の菜園で栽培されてもいる。モリンダ・シトリフォリアの花は小さく白色であり、３ないし５の浅裂を有し、管状、芳香性で、長さが約１.２５ｃｍである。花は複果実に発達し、卵形、長楕円形または球形の塊状体に融合した多くの小さな石果から構成され、ワックス状の白色または緑白色または黄色の半透明の表皮をもつ。果実はその表面に“芽”をもち、ジャガイモに似ている。果実は果汁に富み、苦味があり、にぶい黄色または黄色−白色であり、多数の赤褐色の硬い長方形−三角形の翼状の２細胞核を含み、それぞれの核は４個の種子を含む。

果実は完熟すると腐ったチーズ様の明瞭な臭気を有する。この果実はいくつかの民族が食物として食しているが、モリンダ・シトリフォリア植物の最も一般的用法は赤色および黄色の色素源としてであった。最近、モリンダ・シトリフォリア植物の栄養的および健康的便益性に興味が持たれているので、以下にさらに考察する。

モリンダ・シトリフォリア果実はすべての実用化目的にとって食用に適さないので、ヒトの消費に適した味とするために加工処理しなければならず、カンジダ症の処置に使用する食品に含有されている。加工処理したモリンダ・シトリフォリア果汁は、完熟したモリンダ・シトリフォリア果実の果汁と果肉から種子と皮を分離し；果汁から果肉を濾去し；果汁をパッケージに入れることにより調製し得る。別法として、果汁をパッケージに入れずに、むしろそのままを１成分として他の食品に含有させ、凍結または滅菌する。一部の態様において、果汁と果肉は他の成分と混合するために、均一な混合物にピューレとすることができる。他のプロセスは果実と果汁を凍結乾燥することである。果汁は最終的な果汁製品の生産に際し、再構築し得る。さらに他のプロセスでは果肉と果汁を空気乾燥した後にどろどろにする。

本発明では、モリンダ・シトリフォリア植物から抽出される果汁と油を利用する。モリンダ・シトリフォリア果汁を製造するための現在好ましいプロセスでは、果実を手で摘み取るか、または機械装置により摘み取る。果実は直径が少なくとも１インチ（２〜３ｃｍ）から１２インチ（２４〜３６ｃｍ）となったときに収穫し得る。果実は、好ましくは、その色が暗緑色から黄緑色ないし白色にまで及び、その間で徐々に変化する。果実は収穫後および何らかの加工を始める前に、完全に洗浄する。

果実は０〜１４日、成熟または熟成させるが、殆どの果実は２〜３日保存される。果実は地面に接触しないように装置上に置いて、成熟または熟成させる。このましくは熟成の間、布地または網状物で覆うが、覆いがなくても熟成させ得る。さらなる加工の準備が整ったとき、果実は淡緑色、淡黄色、白色または半透明などわずかに着色する。果実は損傷物について、または過度に緑色および堅く硬化したものについて検査する。損傷硬化した緑色果実は合格品から選別する。

成熟および熟成した果実は、好ましくは、さらなる加工および移送のために、樹脂の内張りをした容器に入れる。熟成果実の容器は０〜３０日間保存する。殆どの果実容器は加工前に７〜１４日間保存する。選択肢として、容器はさらなる加工の前に、冷凍条件下に貯蔵する。果実を貯蔵容器から取り出し、手動または機械式セパレーターを経て加工処理する。種子と皮は果汁と果肉から分離する。

果汁と果肉は貯蔵および移送用容器に詰めることができる。あるいは、果汁と果肉はそのまま果汁製品に加工処理することができる。容器は冷蔵、冷凍、または室温の条件で保存し得る。モリンダ・シトリフォリアの果汁とピューレは、好ましくは、均一な混合物として混合し、その後、他の成分、例えば、着香料、甘味剤、栄養成分、植物性薬品、および着色料などと混合し得る。果汁製品は、好ましくは、最低１８１^ｏＦ（８３℃）の温度またはより高い２１２^ｏＦ（１００℃）までの温度で加熱および滅菌する。

製品は加工温度に耐えられるプラスチック、ガラス、または他の適当な材料の最終容器に詰め、封印する。容器は充填温度で維持するか、または急速に冷却し、次いで搬送容器に入れる。搬送用容器は、好ましくは、最終容器中の製品の温度を維持または制御する材料と様式で包装する。

果汁と果肉はさらに濾過装置により果肉を果汁から分離することにより加工処理し得る。濾過装置は、限定されるものではないが、好ましくは、遠心分離デカンター、１ミクロンから２０００ミクロンまでのサイズの、より好ましくは５００ミクロン未満のサイズのスクリーンフィルター、フィルタープレス、逆浸透濾過、および他の標準的市販濾過装置からなる。操作濾過圧は、好ましくは、０.１ｐｓｉｇないし約１０００ｐｓｉｇの範囲である。流速は、好ましくは、０.１ｇ.ｐ.ｍ．ないし１０００ｇ.ｐ.ｍ．の範囲であり、より好ましくは５〜５０ｇ.ｐ.ｍ．である。含水果肉は少なくとも１回ないし１０回まで洗浄濾過し、果肉から果汁を除く。含水果肉は一般にその繊維含量が１０〜４０重量パーセントである。含水果肉は、好ましくは、最低１８１^ｏＦ（８３℃）の温度で滅菌し、次いでさらに加工処理するためのドラムに詰めるか、または高繊維製品とする。

油の抽出と加工の方法は、１９９９年８月２７日出願の同時継続出願番号０９／３８４,７８５（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。モリンダ・シトリフォリア油は一般に数種の異なる脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、およびリノレン酸などの脂肪酸およびその他の少量存在する脂肪酸のトリグリセリドとしての混合物である。加えて、油は好ましくは、油の劣化を阻止するための抗酸化剤を含む。常套の食品等級の抗酸化剤が好ましく使用される。

モリンダ・シトリフォリア植物は天然の成分に富んでいる。発見されたそれらの成分は以下のとおりである：葉部から：アラニン、アントラキノン、アルギニン、アスコルビン酸、アスパラギン酸、カルシウム、ベータ−カロテン、システイン、シスチン、グリシン、グルタミン酸、グリコシド、ヒスチジン、鉄、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、ナイアシン、フェニルアラニン、リン、プロリン、レジン、リボフラビン、セリン、ベータ−シトステロール、チアミン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、ウルソール酸、およびバリン；花部から：アカセチン−７−ｏ−ベータ−ｄ(＋)−グルコピラノシド、７−ジメチルアピゲニン−４’−ｏ−ベータ−ｄ(＋)−ガラクトピラノシド、および６,８−ジメトキシ−３−メチルアントラキノン−１−ｏ−ベータ−ラムノシル−グルコピラノシド；果実から：酢酸、アスペルロシド、ブタン酸、安息香酸、ベンジルアルコール、１−ブタノール、カプリル酸、デカン酸、（Ｅ）−６−ドデセノ−ガンマ−ラクトン、（Ｚ,Ｚ,Ｚ）−８,１１,１４−エイコサトリエン酸、エラジン酸、デカン酸エチル、へキサン酸エチル、オクタン酸エチル、パルミチン酸エチル、（Ｚ）−６−（エチルチオメチル）ベンゼン、オイゲノール、グルコース、ヘプタン酸、２−ヘプタノン、ヘキサナール、へキサンアミド、ヘキサン二酸、ヘキサン酸（ヘキソイック酸）、１−ヘキサノール、３−ヒドロキシ−２−ブタノン、ラウリン酸、リモネン、リノレン酸、２−メチルブタン酸、３−メチル−２−ブテン−１−オール、３−メチル−３−ブテン−１−オール、デカン酸メチル、エライジン酸メチル、ヘキサン酸メチル、３−メチルチオ−プロパン酸メチル、オクタン酸メチル、オレイン酸メチル、パルミチン酸メチル、２−メチルプロパン酸、３−メチルチオプロパン酸、ミリスチン酸、ノナン酸、オクタン酸（オクトイック酸）、オレイン酸、パルミチン酸、カリウム、スコポレチン、ウンデカン酸、（Ｚ,Ｚ）−２,５−ウンデカジエン−１−オール、およびボミホール；根部から：アントラキノン、アスペルロシド（ルビクロン酸）、ダムナカンタール、グリコシド、モリンダジオール、モリンジン、モリンドン、粘液状物質、ノル−ダムナカンタール、ルビアジン、ルビアジン・モノメチルエーテル、レジン、ソランジジオール、ステロール、およびトリヒドロキシメチルアントラキノン−モノメチルエーテル；根部樹皮から：アリザリン、クロロルビン、グリコシド（ペントース、ヘキソース）、モリンダジオール、モリンダニグリン、モリンジン、モリンドン、樹脂状物、ルビアジン・モノメチルエーテル、およびソランジジオール；木部から：アントラガロール−２,３−ジメチルエーテル；組織培養物から：ダムナカンタール、ルシジン、ルシジン−３−プリメベロシド、およびモリンドン−６ベータ−プリメベロシド；植物から：アリザリン、アリザリン−アルファ−メチルエーテル、アントラキノン、アスペルロシド、ヘキサン酸、モリンダジオール、モリンドン、モリンドゲニン、オクタン酸、およびウルソール酸；などである。

最近、多くの健康上の有益性がモリンダ・シトリフォリア含有製品の使用に由来することが発見された。モリンダ・シトリフォリアの一つの有益性は、ゼロニンを単離および産生するその能力に見出されたが、ゼロニンは身体内で生理的に活性な比較的小型のアルカロイドである。ゼロニンは植物、動物および微生物の実際上すべての健康な細胞に存在する。たとえ、モリンダ・シトリフォリアが有する遊離のゼロニンが無視し得る量であるとしても、評価し得る量のプロゼロニンと呼称されるゼロニンの前駆体を含んでいる。さらに、モリンダ・シトリフォリアはプロゼロニンからゼロニンを放出する不活性型の酵素プロキセロナーゼを含む。標題“モリンダ・シトリフォリアの薬理学的に活性な成分”とする報文（ハワイ大学、R.M. Heinicke）は、モリンダ・シトリフォリアがプロゼロニンとプロキセロナーゼの構築ブロックであるために、“ゼロニンの単離に使用する最良の原材料”であると述べている。これらの構築ブロックは体内のゼロニンの単離と産生の一助となる。

本質的な栄養分ゼロニンの機能は４倍である。第一に、ゼロニンは小腸に見出される休眠酵素を活性化する役割を持つ。これらの酵素は、効率的な消化、静神経、および全体の物理的および情動的エネルギーに必須である。第二に、ゼロニンはタンパク質分子の形状と柔軟性を保護し、維持して、結果として細胞壁の通過が可能となり、健常組織の形成に使用され得る。これら栄養分の細胞内への侵入なくして、細胞はその役目を効率的に遂行し得ない。ゼロニンを産生するプロゼロニンがなければ、われわれの細胞、従って、身体は病気になる。第三に、ゼロニンは細胞の膜細孔を拡張する助けとなる。この拡張は巨大なペプチド鎖（アミノ酸またはタンパク質）の細胞への侵入を可能とする。もしこれらの鎖が使用されなければ、その鎖は廃棄物となる。第四に、プロゼロニンから作られるゼロニンは細孔を拡張して良好な栄養吸収を可能とする助けとなる。

各組織はゼロニン吸収のための受容体部位をもつタンパク質を含む細胞を有する。これらタンパク質のあるものは、吸収されたゼロニンが活性となるために必要な酵素の不活性型である。従って、ゼロニンは身体のプロコラゲナーゼ系を特定のプロテアーゼに変換することにより、死んだ組織を皮膚から迅速に、かつ安全に除去する。他のタンパク質はゼロニンと反応した後、ホルモン用の潜在的な受容体となる。従って、人に幸せな感覚を与えるモリンダ・シトリフォリアの作用は、恐らくある種脳の受容体タンパク質を幸福ホルモンであるエンドルフィン吸収用活性部位に変換するゼロニンにより惹起されている。他のタンパク質は腸管、血管、その他の身体器官の膜を貫く細孔を形成する。これらのタンパク質上にゼロニンが吸収されると、細孔の形状が変化し、膜を通過する分子の通り道に影響を与える。

多くの有益性の故に、モリンダ・シトリフォリアは、癌、関節炎、頭痛、消化不良、悪性腫瘍、骨折、高血圧、糖尿病、疼痛、感染症、喘息、歯痛、斑点、免疫系不全、等々をもつ個体の多くの事例効果を提供することが知られている。

多くの健康上の有益性に加えて、モリンダ・シトリフォリアは皮膚に対しても有意な有益性を提供する。モリンダ・シトリフォリアは、太陽およびその他の変化する環境の状況と要素が原因となるフリーラジカルによる損傷と闘う助けとなる抗酸化剤に富む。健康を維持するために、皮膚はこれらの要素および状況に対抗し、同時に起こる損傷を修復しなければならない。皮膚はその表面の死んだ細胞をそぎ落とし、下層を補充するので、常時修復の状態にある。モリンダ・シトリフォリアはまたとりわけリノール酸に富む；リノール酸は皮膚の健康をはぐくむ特別の能力を有する必須の脂肪酸である。

“転移阻害”
上記のように、本発明の態様は発癌性細胞の転移の阻害に関する。とりわけ、本発明の態様は医薬品、ならびに健康と快適な暮しのための食品、特に、癌原発部位からの発癌性細胞の転移を阻害、遮断、および／または予防するために設計した医薬品または健康と快適な暮しのための食品に関する。以下に、転移の治療に使用されるモリンダ・シトリフォリアに基づく製剤と組成物、および被験者にこれらを投与するために使用される方法につき、実験研究の例および得られる結果を含め、より詳細な説明を提供する。

癌の転移とはその当初の部位から悪性癌細胞が離れた臓器に移動または拡散することである。癌患者の５０％以上が転移のために死に至る。この領域に焦点を絞った膨大な量の研究にもかかわらず、転移癌の疾患をもつ患者が利用し得る薬物または治療処置は非常にわずかであり、この死に至る病いを征服するための新しい因子を探索することが、研究者および医師双方にとっての数十年来の緊急課題であった。

本発明の少なくとも一部の態様は、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴの転移作用を包含する。以下に考察するように、少なくとも一部態様における研究では、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが抗転移性であることを確認するために、Ｃ５７ＢＩ／６ＪマウスメラノーマＢ１６−ＦＯ細胞の同系間腫瘍転移モデルを使用する。本発明に関与している可能性のあるメカニズムを見出すために、ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）によりモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴについて、またＵＶ分光計によりそのガラクツロン酸含量について検討を行った。２種類のインビトロ試験を実施し、モリンダ・シトリフォリアＰＰＴの抗転移作用、フィブロネクチン接着の阻害および内皮細胞管形成の阻害などの可能な経路について検討した。実験データおよび他の研究に基づき、我々はモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴの抗転移作用について数種の可能と思われるメカニズムを示唆することができる。

以下は抗転移作用を得るために使用される代表的な方法と材料に関する。当業者は以下のことが本発明の１種以上の態様の代表であることを認識するであろう。

先ず、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴを調製した。モリンダ・シトリフォリアの黄緑色果実を摘み取り、カバーで覆い、陽光下におおよそ１週間または収穫まで遮蔽テーブル上に置いた。収穫した果実は果実処理装置によりピューレに加工処理し、ここで、粗大残留物と種子を篩い分けた。得られたピューレを遠心分離し、澄明な果汁を得た。

等容量のエタノール（純度９９.９％、シグマ）を果汁に加え、内容物を混合した。混合物を遠心分離し、残渣を廃棄した。得られた液体にさらに等容量のエタノール（純度９９.９％、シグマ）を加え、混合した。混合物を遠心分離し、沈殿残渣を空気乾燥した。乾燥残渣はモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴであった。

インビボ転移試験を実施した；この研究では、免疫能を有する（６〜８週令）無菌（ＳＰＦ）のＣ５７ＢＬ／６オスマウスを使用し、６匹（陽性対照）、６匹（モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴ試験群）、および９匹（ベヒクル対照）にグループ分けし、特定病原菌無菌（ＳＰＦ）、２３±１℃の条件下、動物アイソレーター（ＩＶＣラック）にて飼育した。生存Ｂ１６−ＦＯマウスメラノーマ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−６３２２、０.２ｍＬ中６×１０^４）を実験マウスに尾部血管から静脈内接種した。マウスには飲料水中１％のモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴを、腫瘍細胞移植前１週間、およびその後３週間、適宜投与した。さらに、マウス１匹あたり０.８ｍｇのモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴを、腫瘍細胞移植後２１日間連続して腹腔内（ＩＰ）注射した。同時に、対照薬剤であるマイトマイシン１ｍｇ／ｋｇを週あたり２回、腫瘍細胞移植後６回、ＩＰ投与した。

ベヒクル対照群には、蒸留水１０ｍｌ／ｋｇを３週連続ＩＰ投与した。すべてのマウスについて、腫瘍細胞移植後、第１日、８日、１５日、および２２日目に体重を記録した。腫瘍移植後２１日目に肺を摘出し、固定した。肺表面の転移結節を解剖顕微鏡で計数した。スチューデントｔ検定を用い、統計解析により、処置群とベヒクル対照群との統計的差を決定した。

モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴのアニオン交換クロマトグラフィーを実施した；１０ｇのモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴを蒸留水１Ｌに溶かし、０.４μＭ濾紙（フィッシャー・サイエンティフィック）で濾過した。調製したモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴ溶液２００μＬをアニオン交換カラム（ハイ・ロード２６／１０ＱセファロースＨＰ、アマシャム・ファルマシア・バイオテク）に、ペリスタポンプ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）を用いて、０.５ｍｌ／分で負荷した。モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴ溶液を適用する前に、カラムにはカラム５本に相当する容量の１Ｎ−ＮａＣｌおよび蒸留水を通過させた。カラム５本分の蒸留水と０.１Ｎ−ＮａＣｌを連続的にカラムに通し、０.１Ｎ−ＮａＣｌのフラクションを集めた。このフラクションをミリポア（Millipore）攪拌セル（フィッシャー・サイエンティフィック）中でＰＥＳ−５０限外濾過膜で、９９.９％窒素ガス加圧下に濾過し、Ｎａ^＋Ｃｌ⁻を除去した。濾過物を蒸留水で３回洗浄し、凍結乾燥した。

１つのアッセイではフィブロネクチン被覆ウエルに対するＮＲＫ２細胞（正常ラット腎臓細胞、ＡＴＣＣＣＲＬ−６５０９）の接着を測定した。修飾ＭＥＭ−ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７.４（ハイクロン（Hyclone））中、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴ、０.１Ｎ−ＮａＣｌモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴフラクション、ＧＲＧＤＳＰペプチド（シグマ）、および０.４％ＤＭＳＯ（シグマ、ベヒクル対照）を別個のウエルで３０分間３７℃でインキュベートした。反応はＮＲＫ２細胞（２×１０^６／ｍｌ）の添加により開始し、３０分間行った。次いで、各ウエルをダルベッコＰＢＳ（ハイクロン）で６回洗浄し、次いで、５μＭカルセインＡＭ（シグマ）を加え、さらに２時間インキュベーションした。カルセインＡＭと、フィブロネクチン被覆プレートに付着した細胞との相互作用から生じる蛍光強度の定量は、スペクトルフルオル・プラス・プレートリーダー（ＡＧＦ）により、励起４８５ｎｍおよび発光５３５で読み取った。

１ミリグラムのモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴおよび０.１Ｎ−ＮａＣｌモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴフラクションをＧＰＣ分析用ＤＤＩ水に溶かした。分子量範囲５,２００〜４１０,０００のデキストラン（デキストラン標準キット、ウオーターズ）を用いて校正曲線を作成した。ＧＰＣ条件：装置−ウオーターズ・アライアンス分離モジュール２６９０および２４１０屈折率検出計；カラム−ウルトラヒドロゲル５００およびウルトラヒドロゲルリニア６〜１３μＭ；７.８×３００ｍｍ直列；カラム温度−４０℃；移動相−０.１Ｍ硝酸ナトリウム；流速−０.６ｍｌ／分；インジェクション容積−５０μＬ；屈折率検出計内部温度−５０℃；標準曲線はウオーターズソフトウエア（エンパワー、バージョン１.０）によりフィットさせ、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴと０.１Ｎ−ＮａＣｌフラクションの分子量をこの曲線により分析した。

炭水化物含量の分析では、顆粒化したモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴ０.０１５ｇを秤量し、均一に拡散した。蒸留水１０.０ｍｌを加え、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが溶解するまで激しく振盪する。その１.０ｍｌ部分をチューブに量りこみ、冷却した濃硫酸３.５ｍｌを加えた。この溶液を５０℃に１０分間加熱し、室温に冷却し、１０.０ｍｌメスフラスコに移し、洗浄して、蒸留水によりその容量まで希釈した。この溶液０.６ｍｌを冷却した試験管に移し、冷却した０.０１２５Ｍ四ホウ酸ナトリウム（シグマ）試薬３.６ｍｌを加え、よく混合した。試験管内容物を沸騰水浴中で１０分間加熱し、次いで室温に冷却し、０.１５％ｍ−ヒドロキシビフェニル試薬６０μＬを加えた。内容物を素早く混合し、３分間放置した；吸光度をＵＶ分光計（バリアン）により５２０ｎｍで読み取った。標準曲線はそれぞれ０.０５ｍｇ／ｍｌ、０.１０ｍｇ／ｍｌ、０.１５ｍｇ／ｍｌ、および０.２ｍｇ／ｍｌ濃度のガラクツロン酸（ＶＷＲサイエンティフィック）を用いて作成した。

血管形成に関しては、ＨＵＶＥＣ（１.０×１０^４／ウエル、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７３０）を最初に調製した９６穴マトリゲルに容れた。モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴを１０００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、および０.１μｇ／ｍｌとして加えた。パクリタキセル（Paclitaxel）を陽性対照として使用し、それぞれ０.１μＭ、０.０１μＭ、０.００１μＭ、０.０００１μＭ、および０.００００１μＭで加えた。次いで、このプレートを５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で１８時間インキュベートした。内皮細胞管の形態は毛細血管網に似ており、光学顕微鏡にて評価した。各ウエルについて管の破壊を評点した。最小阻止濃度（ＭＩＣ）を決定し、それを使用してモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが血管形成を阻害したかどうかを評価し得た。各濃度は二重に試験した。

以下の表と図表はモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴの抗転移作用を説明する：

上記表１に関して、生存Ｂ１６−ＦＯマウスメラノーマ細胞を、Ｃ５７Ｂ１／６３マウスに接種した。マウスには移植前の１週間および実験の全般で、１％モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴを随時投与した。蒸留水（ベヒクル対照）１０ｍｌ／マウス、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴ０.８ｍｇ／マウスおよび４ｍｇ／マウスを、接種後２１日間連続してマウスにＩＰ投与した。マイトマイシンを陽性対照として用い、その１ｍｇ／ｋｇを週に２回、合計６回注射した。肺を摘出し、実験終了時に固定した；肺表面の転移結節を解剖顕微鏡下で計数した。本試験を用いて処置群とベヒクル対照群間の有意差を決定した。（ＳＥＭ＝平均値の標準誤差；^ｂｐ＜０.００６；^ｃｐ＜０.００５）。

表２に関して、マウスの体重は移植後に記録した。モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴ処置群は、ベヒクル対照群に比較して体重増加があった（^ａｐ＜０.０５；^ｂＰ＜０.０５）。

表３に関して、ＮＲＫ２細胞はフィブロネクチン被覆ウエルへの接着に使用した。カルセインＡＭと、フィブロネクチン被覆プレートに付着した細胞との相互作用から生じる蛍光強度量は、スペクトルフルオル・プラス・プレートリーダーにより読み取った。

以下の図面はクロマトグラフィーに関するものであり、図１Ａはモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴＧＰＣ分析のクロマトグラフィー（数値はそれぞれ対応するピークについて分子量をダルトンで表す）を説明し、図１Ｂは０.１Ｍ−ＮａＣｌフラクションのＧＰＣ分析のクロマトグラフィーを説明する。

図２は、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴ、ベヒクル、および陽性対照パクリタキセルについての管形成の写真を示す。図２に説明するように、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴ（ＰＰＴとして）は試験濃度で、内皮細胞管の連続する網を破壊しなかった。

モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴは、Ｃ５７Ｂ１／６ＪマウスにおけるメラノーマＢ１６−Ｆ０細胞で同系腫瘍転移モデルを用いるインビボの転移試験において、転移阻害作用を示した。実験全体を通して自由摂取可能な飲料と組合わせ、０.８ｍｇ／マウスで、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴは２２％の阻害を示した（Ｐ＜０.００６）。体重の増加は観察されなかった（表１〜２参照）。化学療法剤マイトマイシンは陽性対照として使用され、１ｍｇ／ｋｇの用量で５５％の転移阻害を示した。同様に、陽性対照においても体重増加はなかった。

フィブロネクチンの仲介する接着に関して、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴは、１０ｍｇ／ｍｌで、フィブロネクチン被覆ウエルに対するＮＲＫ２細胞の接着を３６％阻害した。モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴの０.１Ｎ−ＮａＣｌフラクションは、１ｍｇ／ｍｌで、フィブロネクチン仲介の接着について３７％の阻害を示した（表３参照）。

モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴの成分についてのＧＰＣ分析に関しては、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いることにより、４種の主要ピークが見出され、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが、ＭＷ８６２、ＭＷ２,０４５、ＭＷ１４,４６１、およびＭＷ８４,０７６ダルトンのそれぞれ４種の異なる分子量の分子で構成されていることが明らかになった（図１Ａ参照）。０.１Ｎ−ＮａＣｌフラクションはＧＰＣにより分析して、９０,１２７ダルトンに分子量を有することが見出された（図１Ｂ参照）。これはモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴのＭＷ８４,０５８ダルトンのピークに相当するが、この分子量のずれは実験誤差によるものであった。面積を解析すると、ＭＷ８４,０５８のピークは誘導された４つのピークの総面積の１２.５％を占めることを示した。

炭水化物の分析に関しては、ＵＶ分光計により定量し、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴは７０％のガラクツロン酸を含有することを示した。

血管形成に関しては、インビトロの管形成アッセイによると、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴについて試験した濃度すべてにおいて、管の破損は観察されなかった（図２参照）。

上に考察した研究においては、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴがＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスにおいて、メラノーマＢ１６−ＦＯ細胞に対して抗転移性であることが示された。モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴの抗転移作用は、この試験においてモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが１０ｍｇ／ｍｌで接着を３６％阻害することにより示されるように、フィブロネクチンに対する腫瘍細胞接着の予防に関わっていた。フィブロネクチンは細胞外マトリックスと体液中に見出される大型の接着糖タンパク質である。フィブロネクチン特異インテグリンはα_５およびβ_１サブユニットからなり、殆どの細胞における主要なフィブロネクチン受容体である。このインテグリンはフィブロネクチンのＲＧＤ部位に結合し、接着、移動、細胞骨格の組織化、およびフィブロネクチン細胞外マトリックスの集合など、結合に対する細胞性応答を仲介する。研究では抗−β_１および抗−α_５抗体が、数種の癌細胞、例えば、ＨＴ−１０８０繊維肉腫、５６３７膀胱癌、およびＭＤＡ−２３１乳癌などについて、フィブロネクチン上の細胞移動を阻害することを示す。フィブロネクチンのＲＧＤ部位ではなくＰＨＳＲＮ部位が、ラットの前立腺転移性癌細胞ＭＬＬの侵入を誘発した。この知見は、ＰＨＳＲＮ部位が、両部位が相対的配向に共存する場合にのみ細胞接着の実質的な活性が達成され得るという理由で、ＲＧＤの相乗作用部位であると規定した他の研究と矛盾がない。

上記で考察した実験において、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴは１０ｍｇ／ｍｌでフィブロネクチン仲介接着に対し、３６％の阻害を示した。モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴの０.１Ｎ−ＮａＣｌフラクション（ＭＷ８４,０７６Ｄａ）は１ｍｇ／ｍｌで３７％の接着阻害活性を示した。このフラクションがモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴ約１２.５％であったことを考慮すると、これはその殆ど全部が総抗接着活性に寄与していた。しかし、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴの比較的弱い活性はまた、他の関与する抗転移作用のメカニズムが存在することをも示唆する。

ここで提供されるもう一つのメカニズムは、特定の細胞型が特定の標的臓器に転移することを好むという理論と、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが７０％のガラクツロン酸から構成されるという観察に基づいている。転移の標的臓器の選択は癌細胞とその標的臓器の内皮細胞間の特別の相互作用により仲介されることを示す証拠がますます増えている。かかる相互作用には細胞表面分子が関わっており、この分子は１つ以上の臓器の血管に限定された分布を有する構成的に発現される膜糖タンパク質から構成される。内皮細胞表面分子、肺由来内皮細胞接着分子−１（Ｌｕ−ＥＣＡＭ−１）は単離され、メラノーマ細胞の肺転移を仲介し、阻止することが知られている。Ｂ１６−Ｆ１０細胞の静脈注射の１時間前に、抗−Ｌｕ−ＥＣＡＭ−１ｍＡｂ６Ｄ３で免疫した同系マウスは、対照に比較して、肺コロニーの数が９０％を超える低下を示した。Ｌｕ−ＥＣＡＭ−１構造を解析すると、それは糖含量３％の糖タンパク質であることを示した。一連の炭水化物について、Ｌｕ−ＥＣＡＭ−１に対するＢ１６−Ｆ１０の接着阻害を試験した。結果は、ラクト−Ｎ−フコペントースＩが最も効果的にＬｕ−ＥＣＡＭ−１に対するＢ１６−Ｆ１０の接着を遮断することを示した。この知見はＬｕ−ＥＣＡＭ−１がガラクトシド結合タンパク質であることを暗示した。

我々の糖分析において、我々はモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが７０％のガラクツロン酸を含んでいることを見出した。それ故、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴがＬｕ−ＥＣＡＭ−１分子に結合し、メラノーマＢ１６−ＦＯ細胞がＬｕ−ＥＣＡＭ−１に付着するのを遮断することによりその抗転移作用を発揮しているのかもしれない。Ｌｕ−ＥＣＡＭ−１と同じファミリーの類似のタンパク質、例えば、ｈＣＬＣＡ３などが発見されている（Gruber et al., 1999）。ｈＣＬＣＡ３は数種の組織、例えば、肺、気管、膵臓、胸腺、および乳腺などで発現され、これらの組織に対するモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴの抗転移作用の可能性を示している。

モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴのガラクツロン酸含量は、その抗転移作用が細胞−細胞および細胞−基質の結合を阻害することに関わっていることを示唆している。多くの悪性細胞が外来性炭水化物含有リガンドに結合する能力を有する。ガレクチン−ガラクトシド結合タンパク質の発現は、ヒトのメラノーマ、結腸、胃、および乳頭甲状腺癌に見出されている。これら細胞表面のガレクチンは、細胞凝集および原質への細胞付着を誘発し、腫瘍細胞侵入において中心的な役割を演じる。細胞凝集と付着は、モノクローナル抗−ガレクチン抗体が細胞表面に結合することにより抑制されることが判明した。Ｄ−ガラクトースおよびアラビノガラクトースなどの単純糖は、Ｌ−１サルコーマ細胞の肝臓転移を阻害する。ガラクツロン酸に富む改良柑橘類ペクチンは、オスのコペンハーゲンラットにおいて、ラットのＭＡＴ−ＬｙＬｕ前立腺腫瘍細胞の肺転移を阻害することを示した。同じ研究において、ラットＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞におけるガラクチン−３の発現により、インビボの転移阻害とインビトロの接着阻害間に濃度相関性のあることが判明した。

モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴはＢ１６−ＦＯ腫瘍増殖（実験時、体重増加は観察されなかった）および血管内皮細胞増殖（結果参照）に対しては効果を有しないので、抗転移作用は抗接着剤として作用し、腫瘍細胞塞栓の形成と腫瘍細胞−細胞相互作用を阻害することによると思われる。

従って、この研究から、またインビボとインビトロの試験から分かるように、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴには阻害作用が存在し、この抗転移作用は血管と腫瘍転移の減少に至らしめる。

上記のように、これまでの考察は本発明による一つ以上の代表的な態様に関するものであった。当業者は本発明が発癌性細胞の転移を阻害することに関係する他の態様をも包含することを認識しよう。従って、以下は本発明のさらなる態様に関する。

製剤 １
成分 重量パーセント
モリンダ・シトリフォリア果汁 １００％
製剤 ２
成分 重量パーセント
モリンダ・シトリフォリア果汁 ８５〜９９.９９％
水 ０.１〜１５％
製剤 ３
成分 重量パーセント
モリンダ・シトリフォリア果汁 ８５〜９９.９９％
他の果汁 ０.１〜１５％
製剤 ４
成分 重量パーセント
モリンダ・シトリフォリア果汁 ５０〜９０％
水 ０.１〜５０％
他の果汁 ０.１〜３０％

一態様において、上記の転移に遭遇した人は、少なくとも１オンスの製剤１を朝の空腹時に、また少なくとも１オンスを夜、就寝直前の空腹時に服用する。一例において（いかなる意味でも制限を意味するものではない）、有益なモリンダ・シトリフォリアはユタ州オレムのモリンダ・インコーポレーションが製造するタヒチ・モリンダ・シトリフォリア（登録商標）果汁として加工処理されたものである。

もう一つの態様において、転移を経験している人は、少なくとも１オンスの製剤２を過剰増殖が減少するまで１日２回服用する。

以下の実施例は発癌性細胞の転移に対するモリンダ・シトリフォリアの効果を明らかにし、提示するものである。これらの実施例はいかなる意味でも制限することを意図するものではなく、ここで処理加工し、製造したモリンダ・シトリフォリアの有益な効果を説明するだけのものである。本発明の他の非制限的例示が以下に記載される。

本実施例においては、原発性もしくは初期癌の位置または部位からの発癌性細胞の転移を患者が経験している。転移に遭遇している個体は、非調剤薬局での製剤でその症状を処置することを要望する。その感染を処置するために、個体は処理加工したモリンダ・シトリフォリア果汁を含有する処方量の食品組成物を消費する。当人は転移が阻害され、遮断され、および／または防止されれるまで、または転移細胞が破壊され、また感染が削減または除去されるまで、処理加工したモリンダ・シトリフォリア果汁を含有する食品を断続的に消費する。

本実施例は発癌性細胞の転移に対するＭＤＡ−４またはＰＰＴとコード化されたモリンダ・シトリフォリアの効果を提示する。具体的には、以下の実施例はＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるマウスのメラノーマＢ１６−ＦＯ細胞の同系間腫瘍モデルに対するモリンダ・シトリフォリア（ＭＤＡ−４）の抗転移活性を提示する。

Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるマウスのメラノーマＢ１６−ＦＯ細胞の同系間腫瘍転移モデルにおいて、ＭＤＡ−４は、前処理１週間、腫瘍細胞移植後３週間、研究期間また実験期間中総計２８回処置することで、飲用法により１％（１０ｍｇ／ｍｌ）を投与した。さらに、用量０.８ｍｇ／マウスのＭＤＡ−４を、腫瘍細胞をマウスに移植後、総計連続２１日間、毎日腹腔内（ＩＰ）投与した。

転移指標としての腫瘍転移モジュールの測定において、ＭＤＡ−４で処置した動物のベヒクル対照群に比較する肺結節のデータを表４に示す。

本試験は処置した試験物質とベヒクル対照間の有意差を決定するために使用する（群；^＊＊Ｐ＜０.０１）。

得られた結果にもとづき、用量０.８ｍｇ／マウスのＭＤＡ−４は腹腔内注射により、１％ＭＤＡ−４の自由な飲用法と組合わせて、腫瘍転移のわずかな阻害を示した（表５参照）。研究の期間、体重もモニターしたが、ベヒクル対照群と比較してその変化に有意差は認めなかった（表６参照）。実験の期間中、動物は試験化合物の投与後、毒性による症候は示さないことが注目された。

実験期間中、試験物質ＭＤＡ−４はモリンダ・インクが提供し、インビボ抗転移の研究のために使用した。ＭＤＡ−４は無菌蒸留水に溶解し、既述のように、１％（１０ｍｇ／ｍｌ）飲用法により、前処置の１週間、および腫瘍細胞移植後の３週間、実験全般の研究期間中合計２８回の処置のため投与した。さらに、既述のように、ＭＤＡ−４は０.８ｍｇ／マウスの用量で、腫瘍細胞移植後、連続総計２１日間毎日、腹腔内（ＩＰ）投与した。

マウス・メラノーマ細胞株Ｂ１６−ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６３２２）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入し、ウシ胎児細胞９０％を含むダルベッコ修飾イーグル培地１０％を培地として用いた。腫瘍細胞は５％ＣＯ_２含有雰囲気中、３７℃で培養した。培地には１％アンチビオティック−アンチマイコティック（抗生−抗真菌剤）を加えた。

特定病原菌フリーのオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６〜８週令、体重２４〜２８ｇ）は国立台湾大学動物センターから提供された。動物は実験全般を通して、特定病原菌フリー（ＳＰＦ）条件下で、個々に換気したケージラック（ＩＶＣラック、３６ミニアイソレーターシステム）に収容した。

各ＡＰＥＣ（登録商標）はオートクレーブで滅菌し、３匹のマウスを容れ（長さ２６.７ｃｍ×幅２０.７ｃｍ×高さ１４.０ｃｍ）、衛生環境にて、制御温度（２２℃〜２４℃）と湿度（６０％〜８０％）条件下、１２時間の明暗サイクルで維持した。動物には無菌蒸留水に随時自由に接近するようにした。本作業のすべての側面、すなわち、動物の収容、実験および廃棄などは、一般的に、動物の関与する生物医学研究のための国際基準（ＣＩＯＭＳ公開Ｎｏ．ＩＳＢＮ９２９０３６０１９４、１９８５）に従って実施した。

使用した化学物質はアンチビオティック−アンチマイコティック（ギブコＢＲＬ、ＵＳＡ）、ウシ胎児血清（ハイクローン、ＵＳＡ）、ダルベッコ修飾イーグル培地（ハイクローン、ＵＳＡ）およびマイトマイシン（協和、日本）であった。

使用した一部の装置は遠心分離機セントリフュージ５８１０Ｒ（エッペンドルフ、ドイツ）、ＣＯ_２インキュベーター（フォーマ（Forma）サイエンティフィック・インク、ＵＳＡ）、ヘマサイトメーター（ホウサー・サイエンティフィック・ホーシャム（Hausser Scientific Horsham）、ＵＳＡ）、個々に換気したケージラック（ＩＶＣラック、３６ミニアイソレーターシステム）（テクニプラスト（Techniplast）、イタリア）、倒立顕微鏡ＣＫ−４０（オリンパス、日本）、システム顕微鏡Ｅ−４００（ニコン、日本）および垂直層流（ツアオ−シン（Tsao-Hsin）、Ｒ.Ｏ.Ｃ.）であった。

好適な評価方法に従い、特定病原菌フリー（ＳＰＦ）条件下に２３±１℃で動物アイソレーター（ＩＶＣラック）中で飼育した３匹または６匹のＳＰＦ−Ｃ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス（６〜８週令）の群を使用した。生存Ｂ１６−ＦＯマウスメラノーマ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−６３２２、６×１０ｒ、０.２ｍｌ中）を実験マウスに尾部血管から静脈内接種した。

１％の試験化合物ＭＤＡ−４を飲用法により動物に与え、腫瘍接種（０日として）１週間前に処置を開始し、腫瘍細胞移植後、連続合計２１日間の２１日目まで毎日投与し、連続処置した。同時に、対照薬剤マイトマイシンを週あたり２回、腫瘍細胞移植後６回、腹腔内投与した。腫瘍接種後２１日目に肺を切除し、固定した。次いで、肺表面上の転移結節を解剖顕微鏡下に計数した。以下の結果を得た：

本実施例または結果の表において、Ｒは転移腫瘍結節の直径を表し、以下のように評点する：ａ＝（Ｒ＜１ｍｍ）の結節の数；ｂ＝（１ｍｍ≦Ｒ＜２ｍｍ）の結節の数；ｃ＝（Ｒ≧２ｍｍ）の結節の数。スチューデントｔ検定を用い、処置した試験物質とベヒクル対照群間の有意差を決定する。

本研究はモリンダ・シトリフォリア果汁からのエタノール不溶性沈殿物につき、腫瘍転移の阻害に焦点を当て、その可能なメカニズムについて提示または明らかにする。本研究では、フランス領ポリネシア、タヒチのモリンダ・シトリフォリア果実からのエタノール不溶性沈殿物（多糖類）、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスにおいて、メラノーマＢ１６−ＦＯ細胞の同系間腫瘍転移モデルに抗転移活性を有することが見出された。モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴは０.８ｍｇ／マウスで２２％の阻害活性（ｐ＜０.００５）を示した。モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴの抗転移作用の可能なメカニズムを探求した。

ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）分析は、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが、８７９、２０４５、１４,４６１、および８４,０７６ダルトンそれぞれに４種の異なる分子量の分子から構成されることを示した。アニオン交換クロマトグラフィーを用い、ＭＷ８４,０７６のフラクションはモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴを０.１Ｎ−ＮａＣｌにより溶出することにより誘導した。モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴおよびＭＷ８４,０７６のフラクションは、それぞれ１０ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌで、フィブロネクチン被覆ウエルへのＮＲＫ２細胞接着に対し、３６％および３７％の阻害を示した。フィブロネクチン接着阻害はモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴの抗転移作用についての可能なメカニズムの一つであり得るが、フィブロネクチン媒介接着実験における比較的弱い接着作用は、一つ以上の関与するメカニズムの存在し得ることを示唆した。炭水化物含量分析は、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが、ＵＶ分光計で定量して、７０％のガラクツロン酸を含有することを示した。

この知見はモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが肺内皮細胞表面分子Ｌｕ−ＥＣＡＭ−１−ａガラコシド結合タンパク質に結合することにより、肺組織にメラノーマＢ１６−ＦＯが接着するのを抑制し得ることを暗示する。これはまたモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴが多くの悪性細胞表面発現ガラクチン−ガラクトシド結合タンパク質に対し、細胞−細胞および細胞−基質結合を遮断することにより、抗転移作用を発揮し得ることを示唆した。モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴは内皮細胞管形成の阻害作用を全く示さなかった。従って、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴの抗転移作用は抗接着剤として作用し、腫瘍細胞塞栓の形成と腫瘍細胞−細胞相互作用を阻害することによると思われるということであった。研究の詳細は本明細書にで明らかにする。

従って、本明細書で考察するように、本発明の態様は発癌性細胞の転移阻害を包含する。特に、本発明は医薬品、ならびに健康と快適な暮らしのための食品、とりわけ、癌原発部位からの発癌性細胞の転移を阻害、遮断、および／または予防するために設計した医薬品または健康と快適な暮らしのための食品に関する。

本発明はその精神または本質的な特性から外れることなく、他の特定の形状でも実施化し得る。記載された態様は、あらゆる観点で説明のみのものであって、限定するものではないと考えるべきである。従って、本発明の範囲は本文の記載によらず、添付の請求項により示される。請求項の意味および等価の範囲内に入る変更はすべて請求項の範囲内に包含される。

図１は、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴおよび０.１Ｍ−ＮａＣｌフラクションのＧＰＣ分析のクロマトグラフィーを示す。 図２は、モリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴ、ベヒクル、および陽性対照パシタキセルについての管形成を示す。

Claims (20)

1. 発癌性細胞の転移を処置、阻害、および予防するための天然医薬製剤であって、約０.０１ないし１００重量パーセントの量で存在する加工処理したモリンダ・シトリフォリア製品を含有してなる製剤。
2. 加工処理したモリンダ・シトリフォリアが、加工処理したモリンダ・シトリフォリア果汁である請求項１記載の天然医薬製剤。
3. さらに水を含有してなる請求項２記載の天然医薬製剤。
4. モリンダ・シトリフォリア果汁が、約８５重量％ないし９９.９９重量％の量で存在する請求項３記載の天然医薬製剤。
5. モリンダ・シトリフォリア果汁が、約５０重量％ないし９０重量％の量で存在する請求項３記載の天然医薬製剤。
6. さらにもう一種の果汁を含有してなる請求項２記載の天然医薬製剤。
7. モリンダ・シトリフォリアがモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴである請求項１記載の天然医薬製剤。
8. 発癌性細胞の転移を阻害および予防し、ならびに早期段階の転移発癌性細胞を破壊する方法であって、
   加工処理したモリンダ・シトリフォリア製品をアルコール系溶液に添加し；
   前記溶液からモリンダ・シトリフォリアの有効成分を単離および抽出し；そして
   前記抽出した有効成分を前記発癌性細胞に罹患している領域に導入し、それによって前記抽出した有効成分が前記発癌性細胞のさらなる増殖を阻害および予防し、ならびに早期段階の転移発癌性細胞を破壊する、
   の各工程を含む方法。
9. 前記加工処理したモリンダ・シトリフォリア製品が、加工処理したモリンダ・シトリフォリアの果汁を含有してなる請求項８記載の方法。
10. 前記加工処理したモリンダ・シトリフォリア製品が、加工処理したモリンダ・シトリフォリアのピューレを含有してなる請求項８記載の方法。
11. 前記加工処理したモリンダ・シトリフォリア製品が、加工処理したモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴを含有してなる請求項８記載の方法。
12. 前記アルコール系溶液が、実質的に、メタノール、エタノール、および酢酸エチル、およびその他のアルコール系誘導体からなる群より選択されるものである請求項１１記載の方法。
13. 前記有効成分がケルセチンである請求項１２記載の方法。
14. 前記有効成分が、前記ケルセチンと共に相乗的に作用して前記発癌性細胞の転移を阻害および予防するルチンである請求項１３記載の方法。
15. 転移した癌細胞のさらなる増殖を阻害、予防、および破壊する方法であって、
    加工処理したモリンダ・シトリフォリアの果汁を含有してなる天然医薬製剤の少なくとも１オンスを、朝の空腹時に経口投与し；そして
    前記天然医薬製剤の少なくとも１オンスを、夜の就寝前に経口投与する、
    の各工程を含む方法。
16. モリンダ・シトリフォリアがモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴを含む請求項１５記載の方法。
17. 前記天然医薬製剤が、１００重量パーセントまでの量で存在するモリンダ・シトリフォリア−ＰＰＴを含有してなる請求項１６記載の方法。
18. 前記天然医薬製剤が、
    約８５〜９９.９９重量パーセントの量で存在する加工処理したモリンダ・シトリフォリアの果汁；および
    ０.１〜１５重量％の量で存在する水；
    を含有してなる請求項１４記載の方法。
19. 前記天然医薬製剤が、
    約８５〜９９.９９重量パーセントの量で存在する加工処理したモリンダ・シトリフォリアの果汁；および
    ０.１〜１５重量％の量で存在する他の果汁；
    を含有してなる請求項１４記載の方法。
20. 前記天然医薬製剤が前記食品２オンスを毎日２回経口投与することにより消費される、請求項１４記載の方法。
    
    

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