JP2007525656A - 生きた反応媒体の分析のための方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
Description
− 光学的なシグナル:蛍光、ルミネセンス、比色。
− 文献US−2002/0160420は、幾つかの精製ステップを経たヒトの血清のサンプルの質量分析法による分析を記載する。
− 同一のチップ上に配列される種々の細胞の分類(assortment)に働く可能性、
− 同時に配置される種々の細胞系
− 分析に偏りを生じさせる傾向のあるステップの除去又は制限(例えば、精製、細胞溶解、1つの媒体からもう1つへのサンプルの移動)、
− 少ない時間での非常に多くのサンプルを分析する可能性、
− 細胞によって発せられる情報に関してゆがみのないデータを得ること。
(i) 該細胞Cは、実質的に平坦な表面を含む支持体S上に、前記表面上の水滴の形態で配置される;
(ii) 該細胞Cを含む水滴が配置された支持体Sの実質的に平坦な表面は、必要に応じて分離フィルムFで覆われ、これは、ガスの通過を可能にし、支持体S上に配置された水滴の蒸発を妨げる;
(iii) 該細胞Cは、必要に応じて刺激に供される;
(iv) 該反応媒体は、調製され、質量分析計中に導入される;
(v) 該反応媒体は、脱着され、イオン化される;
(vi) 該反応媒体のマススペクトルは、記録され、分析される。
− 支持体Sは、必要に応じて、ガスが通過することを可能にし、支持体S上に置かれた液滴の蒸発を防ぐ分離フィルムFで覆われる実質的に平坦な表面含む、
− 前記の表面上、及び必要に応じて、フィルムFの下に、細胞Cを含む水滴を配置するための手段、
− 該反応媒体を脱着及びイオン化するための手段、
− 質量分析計。
− 試薬Rの導入、
− 1つ以上の細胞と接触させられること、
− エネルギーの供給、
− 電場又は磁場の適用、
− 光学的処理による刺激。
第一のバリアントに従うと、細胞Cを含む水滴は、支持体S上に配置され、試薬Rを含む第二の水滴が、任意の適した注入手段を用いて、細胞Cを含む液滴中に直接的に注入される。このようなバリアントは、図1に図示される。
− Ciphergen Inc.社によって販売されるSELDIチップ(“ProteinChip(登録商標)アレイ”)(例えば、NP20モデル)は、表面が活性のある(親水性)ホールをあけられた薄い疎水性層を含む;
− BrukerDaltonics Inc.社によって販売される“AnchorChipTM”支持体は、親水性のアウトグロースが配置された疎水性の表面を含む。
− Eisen M.B., Spellmann P.T., Brown P.O., Botstein D. Cluster analysis and display of genome−wide expression patterns, Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Dec. 8; 95(25) 14863−8;
− Haab B.B., Dunham M.J., Brown P.O., Protein microarrays for highly parallel detecting and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions, Genome Biol. 2001 Jan 22; 2(2): RESEARCH 0004.1−0004.13;
− Livache T., Bazin H., Caillat P., Roget A., Electroconducting Polymers for the construction of DNA or peptide arrays on silicon chips, Biosens Bioelectron. 1998 Sep 15; 13(6): 629−34.
同一の原理が、ポリヌクレオチド以外の分子に応用し得る。分子チップは、以下において記載される:Kuruvilla et al., Glucose signalling with small molecule microarrays, Nature (2002), 416 p. 653.全ての場合において、試薬分子は、第一にチップに付着される(例えば、スライドガラスへの共有結合(covalent attachment)による)。本発明に従って、分子は、必要に応じて、細胞を含む水滴を分子チップ上に配置した後に、脱着され得る。
− 支持体に試薬を結合させるためのサイトを使用するUV−光開裂(UV-photocleavage)であり、これは、図5において図示されるように、光開裂可能である(photocleavable)。
− 制限酵素又は他のヌクレアーゼを用いた、二本鎖DNAの開裂、
− ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー(stringency)の変更:塩濃度、温度、又は媒体の酸化還元条件における変化は、2つのDNA鎖を分離することを可能にする。
− それは、水滴の所望されない融合を防止しなければならない、
− それは、支持体上に配置された水滴の蒸発を防止する、
− それは、ガス、特にO2及びCO2が通過することを可能にし、後者2つの機能は、細胞がそれらの液滴中で生き延びることを可能にするためである。
− それは、例えば、油等の水非混和性の液体であり得る。現在まで、特定の細胞を保存するために、油をどのように使用するのか知られていた;しかし、それは細胞上で反応を実施するために、決して使用されなかった。本発明に従った方法及び装置において、使用され得る油の中で、特に鉱油及びシリコーン油が挙げられ得る。液体として、例えば、オクタンなどの、処理される化合物(細胞及び試薬)と非混和性である有機溶媒を使用することも可能である。好ましくは、軽油が使用される;
− それは、例えば水分で飽和された空気等のガスでもあり得る;
− それは、例えば、PDMS(ポリジメチルシロキサン)フィルム、又はニトロセルロースフィルム等の、後に柔軟性のある(flexible)、固体のフィルムであり得る;
− 最後に、それは、多孔性材料で作られるハニカム状のカバーであり得、キャビティのサイズは、細胞及び、必要に応じて、試薬の液滴を包含し得るように、調節される。本発明のバリアントに従って、硬いハニカム状のカバーは、各々のキャビティにおいて、試薬分子を用いて官能化され得、従って、細胞の液滴がキャビティに対して対称的な(symmetric)様式で配置された支持体と接触するように定められた分子チップ又はヌクレオチドチップを構成し得る。本発明のこのバリアントは、図7において図示される。
各々が、少なくとも1つの細胞を含む幾つかの水滴が、支持体S上に配置され得、前記の液滴は、互いに分離されている。好ましくは、これらの液滴の各々は、異なる受取り手段に配置される。全ての細胞が同一であり得るが、異なる細胞(少なくとも2種類の異なる細胞)を種々の液滴中に配置することを想定することも可能である。適切な試薬を含む1つの液滴と目的の細胞を含む液滴との融合を可能にするために、試薬を含む液滴は、細胞を含む各々の液滴の近傍に配置される。試薬の液滴を、細胞の液滴各々の中に直接的に注入することを想定することも可能である。多数の反応を実施するために、マトリクスの形態において、均一に配列された、液滴を受取るための手段を含む支持体が、有利なことに、この方法を自動化させるために想定される。
− 初代細胞(primary cells)、
− ハイブリドーマ、
− 細胞系:細胞は、際限なく永続し、このようにして、系を形成し得る、
− 幹細胞:それらは、動物又はバイオプシーから採取したサンプルから得られる。
− 上記の示される種々のタイプの細胞の混合物。
全ての性質の化学分子、特に無機分子、天然の有機分子、有機合成及びコンビナトリアル合成から誘導される分子、生物学的サンプルから抽出される分子、並びに合成によって修飾された、生物学的サンプルから抽出される分子。特に、以下のポリヌクレオチドが挙げられ得る:一本鎖及び二本鎖のRNA分子、一本鎖及び二本鎖DNA分子;ペプチド−核酸キメラであるPNA(ペプチド核酸)分子;リボザイム;二本鎖干渉RNA又はタンパク質及びペプチド。タンパク質の中で、転写因子が最も特別に挙げられ得る。
同一の細胞をトランスフェクトすることを意図した幾つかの試薬を連続的に配置すること、及びそれらの累積的な効果を観察することを想定することが可能である;
インビボで遭遇する条件に可能な限り近づけるために、同一または異なる細胞の細胞ネットワークを再構成するために、幾つかの細胞の液滴を配置すること、及びそれらを融合させることを想定することも可能である。例えば、数個の細胞のスケールで、ニューロンのネットワークを再構成することは、図4において図示されるように、同一の液滴中でこれらを連絡させるために、ニューロンに遭遇する(encountering)グリア細胞か、又は細胞スケールでその挙動(behavior)を模倣するために、皮膚を構成する種々のタイプの細胞の間の相互作用を用いて可能である。
・ MALDI:マトリクス支援レーザー脱着イオン化及びその対応物
・ SELDI:表面増強レーザー脱着イオン化
・ SIMS:二次イオン質量分析
・ SNMS:二次中性質量分析
・ ESI:エレクトロスプレーイオン化
・ FAB:高速原子衝撃
・ APCI:大気圧化学イオン化。
・ TOF:飛行時間、
・ MS/MS:MS/MS/MS等について、タンデム質量分析計又は多次元MS
・ 四重極(又は、イオントラップ)
・ FT−MS又はFT−ICR: フーリエ変換質量分析計−イオンサイクロトロン共鳴。
細胞培養物は、それらの分光計への導入のために調製される(例えば、乾燥、低温処理、脱着/イオン化を促進するためのマトリクスの添加)。サンプルは、ビームによって全体がスキャンされる。数多くのスペクトルが記録され、これはサンプル中の種々の物質の存在量の平均を与えるために、合算される。
表面の全体のスキャニング時に得られるスペクトルの分析を促進するために、それが分光計に導入される前に、活性表面を使用して、チップの上で直接的にサンプルを単純化することが可能である。これらの表面は、図9において図示されるように、洗浄の後、サンプルの特定の物質を多少特異的に保持することを可能にし得る。
− 分析されるために準備されたサンプルを生成するために、脱着を促進する手段を用いた、支持体S上に配置される生きた反応媒体の処理;
− 支持体S上に配置されるサンプル(反応媒体)の質量分析計チューブ中への導入;加速電位を形成するために、分光計導入チューブ(spectrometer introduction tube)におけるバキューム及び電場の適用;サンプルへの、制御された連続した様式での、脱着及びイオン化処理の適用;形成されたイオンの質量の検出、必要に応じた、マススペクトルバンクと記録されたデータの比較。
この技術は、実際、小型フォーマットにおいて、数千の独立した実験条件を実現することを可能にする。
実施例1:Tリンパ球分泌の分析:サイトカインIL−2
利点:種々のウイルス(例えば、C型肝炎、HIV)又は癌を患う患者からのサンプルのキャラクタリゼーション。分析されるサイトカイン(IL−2)は、Tリンパ球増殖のプロモーターである;それは、免疫システムを強化するための治療として使用され得る。サイトカインの量の測定は、疾患及び又は治療の進行の指標である。
− マトリクスは、細胞の前に配置される、
− デポジットが作製される前の、抗−サイトカイン抗体を用いた表面の機能化、そして細胞は、おそらく、刺激の後に溶解される、
− マトリクスは、配置されない。
この実験の目的は、チップフォーマット上の細胞培養物を分析すること、より詳細には、分子シグネチャーを区別することが可能であることを実証することである。
・ Ciphergenによって販売されるマトリクス(商業的リファレンス“EAM SPA”)、シナピン酸、は75μlのアセトニトリル及び75μlの1%TFA中に溶解される。
・ 1μlの“オールインワンペプチドミックス”及び1μlのマトリクスの混合物が、チップのスポット上に配置される。
・ スライドは、蒸留水を用いてプレインキュベートされる(スポット毎に5μlで、1分間)、
・ スポットは、吸取り紙を使用して乾燥される(表面を触ることなく)、
・ 5μlのサンプルはスポット毎に配置される、
・ これは、オープンエアーにおいて、乾燥される、
・ 蒸留水を用いてすすぎが実施される(液体は、ピペットを用いて、幾度か、スポットの端から採取される)、
・ スポットは、乾燥される、
・ 脱着/イオン化を促進するためのマトリクス(0.8μl)が添加される、
・ それは、乾燥される、
・ 脱着/イオン化マトリクスを添加し、引続く乾燥するステップが繰り返される。
高質量 100000Da
デフレクター 自動(10000Da)
感度 10
最適化範囲 10000−20000Da
センター質量 15400Da
スペクトルは、ProteinChip(登録商標)Softwareを使用して測定される。
目的:UV照射に対する皮膚細胞の反応における薬剤の効果を非常に迅速に測定するため、及びこれらの薬剤を特定の細胞区画に標的化することを補助するために、これらの細胞によって発現される幾つかのタンパク質の分布を研究することは有利である。
細胞(3T3繊維芽細胞)は、ステンレス鋼MALDIターゲット(例えば、Bruker Daltonics Inc.から入手可能である)上の液滴中で培養される。細胞のない培養培地の液滴は、コントロールとして、同様の様式でチップ上に配置される。このチップは、制御雰囲気及び制御温度のチャンバ(37℃、100%、H2O、5%CO2)中に配置される。
利点: カルシウムイオンは、損傷を受けた細胞中に蓄積する傾向がある。
細胞は、シリコンチップ上で培養され、1以上の機械的ストレスに供されるか、供されず、次いでサンプルは低温処理される。
この実験の目的は、細胞培養液滴上の質量分析法による幾つかの表現型間の識別を明示することである。我々は、CDDP(シスプラチン=CIS−DIAMINEDICHLOROPLATINUM,INSERMユニット318の所有物)(これは化学療法において使用される抗癌剤である)を使用して細胞毒性現象を、またTNF(腫瘍壊死因子)を使用してアポトーシス(プログラム細胞死)を研究した。
チップは次いで、Ciphergen SELDI−TOF質量分析計において分析された。
Claims (34)
- 少なくとも1つの細胞Cを含む少なくとも1つの反応媒体を分析するための方法であり、前記方法は、以下において特徴付けられる:
(i) 該細胞Cは、実質的に平坦な表面を含む支持体S上に、前記表面上の水滴の形態で配置される;
(iv) 該反応媒体は、調製され、質量分析計中に導入される;
(v) 該反応媒体は、脱着され、イオン化される;
(vi) 該反応媒体のマススペクトルは、記録され、分析される。 - 第二ステップ(ii)において、該細胞Cを含む水滴が配置される該支持体Sの実質的に平坦な表面が、ガスの通過を可能にし、かつ、該支持体S上に配置される水滴の蒸発を防ぐ分離フィルムFで覆われることにおいて特徴付けられる、請求項1に記載の方法。
- 第三ステップ(iii)において、該細胞Cが、刺激に供されることにおいて特徴付けられる、請求項1又は2に記載の方法。
- 該細胞Cが供される該刺激が、以下から選択されることにおいて特徴付けられる、請求項3に記載の方法:
− 試薬Rの導入
− 1つ以上の細胞と接触させられること、
− エネルギーの供給、
− 電場又は磁場の適用
− 光学的処理。 - 該滴の該支持体Sへの付着が、表面張力に起因して起こることにおいて特徴付けられる、請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法。
- 支持体S上への試薬又は細胞を含む水滴を配置することが、必要に応じて、該分離フィルム下で、ファインキャピラリー(fine capillaries)を用いて実施されることにおいて特徴付けられる、請求項1〜5のいずれか1つに記載される方法。
- 該支持体S上への試薬又は細胞を含む水滴の配置が、圧電システムを用いて実施されることにおいて特徴付けられる、請求項1〜5のいずれか1つに記載される方法。
- 無機分子、天然有機分子、有機合成又はコンビナトリアル(combinatorial)合成から誘導される分子、生物学的サンプルから抽出された分子、合成によって改質された生物学的サンプルから抽出された分子、特に、一本鎖及び二本鎖のDNA,一本鎖及び二本鎖のRNA、タンパク質、及びペプチド:
以上から該試薬Rが選択されることにおいて特徴付けられる、請求項4〜7のいずれか1つに記載の方法。 - 該支持体S上の該反応媒体を直接的に、それが該質量分析計に導入される前に、処理することを包含する1つ以上のステップを含むことにおいて特徴付けられる、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞溶解、1以上の洗浄、分子の吸着又は付着:
以上から選択される少なくとも1つの処理ステップを含むことにおいて特徴付けられる、請求項9に記載の方法。 - 該支持体S上に配置される該反応媒体を、脱着を促進する分子の溶液を用いて処理することを包含する少なくとも1つのステップを含むことにおいて特徴付けられる、請求項1〜10のいずれか1つに記載の方法。
- 該質量分析計への導入を目的とした調製が、以下から選択される少なくとも1つのステップを含むことにおいて特徴付けられる請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法:
該反応媒体を凍結すること;熱処理を用いて、又は用いないで、そしてバキュームを用いて、又は用いないで乾燥すること;メタノール又はホルムアルデヒド等の薬剤を用いた処理で固定すること(fixing)。 - 該質量分析計への導入を目的とした該調製が、サイズが小さく、光を吸収する1つ以上の酸分子を該反応媒体へ添加し、乾燥が続くことを含むことにおいて特徴付けられる、請求項1〜12のいずれか1つに記載される方法。
- 以下のステップ:
− 該支持体S上に配置される該反応媒体の質量分析計チューブへの導入;
− 該分析計チューブにおける、バキューム及び電場の適用;
− 該サンプル上の、制御され且つ連続的な様式での、脱着/イオン化処理の適用;
− 形成されるイオンの質量の検出
を少なくとも含むことにおいて特徴付けられる、請求項1〜13のいずれか1つに記載の方法。 - 記録されるデータをマススペクトルバンクと比較することを包含する少なくとも1つのステップを含むことにおいて特徴付けられる、請求項1〜14のいずれか1つに記載の方法。
- 少なくとも1つの細胞Cを含む、少なくとも1つの反応媒体を分析するための装置であって、この装置は、以下を備えることにおいて特徴付けられる。
− 実質的に平坦な表面を備える支持体S、
− 該細胞Cを含む水滴を前記表面上に配置するための手段、
− 該反応媒体を脱着及びイオン化するための手段、
− 質量分析計。 - 該細胞Cの生存を可能にするために、該支持体Sが配置される制御雰囲気(controlled-atmosphere)のチャンバも備えることにおいて特徴付けられる、請求項16に記載の装置。
- 該制御雰囲気チャンバが、35〜42℃、好ましくは、36.5〜37.5℃の範囲の温度で、CO2レベルが、好ましくは、3〜5%に維持され、酸素O2レベルが、好ましくは、周囲空気のものであるインキュベータであることにおいて特徴付けられる、請求項17に記載の装置。
- 該支持体Sの該表面が、ガスの通過を可能にし、そして該支持体S上に配置される水滴の蒸発を防止する、分離フィルムFで覆われることにおいて特徴付けられる、請求項16〜18のいずれか1つに記載の装置。
- 該フィルムFが、以下から選択されることにおいて特徴付けられる、請求項19に記載の装置:
− 非水混和性の液体;
− ガス;
− 可撓性の固形フィルム;
− 多孔質材料で作られる固いハニカム状のカバーであり、該細胞の液滴及び、必要に応じて、試薬の液滴を含むことができるように、キャビティーのサイズが調節される。 - 該支持体Sが、シリコン、ガラス、又はポリマーから作製されるプレートからなることにおいて特徴付けられる、請求項16〜20のいずれか1つに記載の装置。
- 該支持体が、電導性層を含むことにおいて特徴付けられる、請求項16〜21のいずれか1つに記載の装置。
- 該支持体Sが、該水滴を受容するための少なくとも1つの手段を備えた、実質的に平坦な表面を有することにおいて特徴付けられる、請求項16〜22のいずれか1つに記載の装置。
- 該水滴を受容するための該手段が、以下の手段の1つからなることにおいて特徴付けられる、請求項23に記載の装置:
− 該支持体Sが、その平坦な表面上に疎水性を示し、且つ1つ以上の親水性の領域を含む;
− 該支持体Sが、その平坦な平面上に1ミクロン〜1ミリメーターの範囲の深さのキャビティーを含む;
− 該支持体Sが、1ミクロン〜1ミリメーターの小さな厚みであり、その表面上に配列され、且つ該液滴の付着を促進することを目的とした、アウトグロース(outgrowth)を備えたプレートである;
− 該支持体Sが、少なくとも1つのワイヤー(その上に該液滴が付着する)を備えたプレートである - 該装置の該支持体Sが、可動性であることにおいて特徴付けられる、請求項16〜24のいずれか1つに記載の装置。
- 1つ以上の細胞を含む該水滴が、培養培地を含むことにおいて特徴付けられる、請求項16〜25のいずれか1つに記載の装置。
- 該手段が、それが自動化されることを可能にする制御装置に接続されることにおいて特徴付けられる、請求項16〜26のいずれか1つに記載の装置。
- 該支持体Sが、マトリクスの形態で、規則正しく整列した、該液滴を受容するための手段を備えることにおいて特徴付けられる、請求項16〜27のいずれか1つに記載の装置。
- 質量分析計を用いてサンプルの質量を測定するための少なくとも1つの器具(前記器具は分光計チューブを含む)、前記チューブにおいてバキュームを生み出すための装置、分析されるサンプルの分子を加速するために、該チューブにおいて、加速電位を印加するための電気的手段、形成されるイオンの質量を検出するための手段、該支持体Sを該チューブ中に導入する手段、及び処理されるサンプルの脱着及びイオン化するための手段を含むことにおいて特徴付けられる、請求項16〜28のいずれか1つに記載の装置。
- 該脱着手段が、以下から選択されることにおいて特徴付けられる、請求項16〜29のいずれか1つに記載の装置:レーザービーム、イオンビーム、中性原子ビーム、電子ビーム、及び液体サンプルのスプレー。
- 該脱着/イオン化手段が、以下から選択されることにおいて特徴付けられる、請求項16〜30のいずれか1つに記載の装置:
・ MALDI:マトリクス支援レーザー脱着イオン化
・ SELDI:表面増強レーザー脱着イオン化
・ SIMS:二次イオン質量分析
・ SNMS:二次中性質量分析
・ ESI:エレクトロスプレーイオン化
・ FAB:高速原子衝撃
・ APCI:大気圧化学イオン化。 - 該質量を測定する該手段が、以下から選択されることにおいて特徴付けられる、請求項16〜31のいずれか1つに記載の装置:
・ TOF:飛行時間、
・ MS/MS:タンデム質量分析又は多次元質量分析
・ 四重極(又は、イオントラップ)
・ FT−MS又はFT−ICR: フーリエ変換(Fourrier-Transform)質量分析−イオンサイクロトロン共鳴(ion cyclotron resonance)。 - 刺激の後、細胞培養物に関する変化を同定するための、請求項16〜32のいずれか1つに記載の装置の使用。
- 1つの細胞又は、1セットの細胞の刺激に対する応答の、時間経過における変化を研究するための、請求項16〜32のいずれか1つに記載の装置の使用。
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