CN116092578A - 用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法、装置及模型 - Google Patents

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Abstract

本发明公开用于获得目标组学中生物分子空间分布的方法、装置及模型。本发明的方法基于微流控芯片的实验方法和迁移学习的计算方法，有效降低了需要检测的样本数目，提高实验效率以及可以高分辨率地获取目标分子在整个检测组织上的空间分布和表达量。例如，示例性技术方案中仅通过两个角度的一维目标组学信息即可通过迁移学习模型预测出目标组学分子在整个检测组织上的二维分布信息，显著降低了所需检测的目标组学的样本数目，同时以高通量和高空间分辨率的方式获取组学分子的空间信息。

Description

用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法、装置及模型
技术领域
本发明涉及组学方法，具体地涉及用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法、装置及模型。
背景技术
单细胞测序技术革命性地通过对单个细胞进行生物大分子检测来解释组织内细胞间的异质性，极大地促进了我们对生物学过程和疾病的认知。但是该技术首先要求对组织进行解离制备单细胞悬液，从而损失了细胞的原位信息，无法给出固态异质化组织中细胞空间排布信息。近些年开始发展的空间转录组学技术通过保留组织形态结构的基础上对组织原位的转录组进行检测解决了该问题。
然而，空间转录组技术主要局限于对细胞转录组进行测量，而转录组只是细胞状态的间接反映，而大多数生物过程都是由蛋白质控制。除此之外，蛋白质和转录本之间的丰度相关性较低，导致无法仅依靠转录组学来进行生物或者医学探索研究。此外，涉及大量生物过程的蛋白质翻译后修饰(PTM)的数目和类型远远超出了基因组学测量的范围。因此，不论是从基础细胞生物学的角度还是临床的角度，空间蛋白质组及下游的空间代谢组学分析有望彻底改变我们对生物过程的理解。
空间蛋白质组学为获得生物组织样本的二维空间中不同蛋白质空间丰度信息的科学，目前已报道的空间蛋白质组学主要分为两类：第一类是靶向的基于抗体的空间蛋白质组学，第二类是非靶向的基于激光显微切割技术和质谱检测技术的空间蛋白质组学。
第一类靶向的空间蛋白质组技术十分依赖于抗体的种类、价格、抗体的稳定性等。因为抗体制备过程复杂，所以这类技术的问题首先是价格非常昂贵。其次是可用的抗体种类非常少通常在几十种抗体，因此大部分基于抗体的空间蛋白质检测技术仅能检测几十种蛋白，无法应用于大规模的蛋白质的空间分布检测。
第二类是非靶向的基于激光显微切割的空间蛋白质组学检测技术。利用激光显微切割仪将组织切割为指定分辨率的小组织块，再利用质谱仪对切割获取的小组织块进行无偏差的蛋白质组检测。该方法存在的问题主要有：1)难以研究大面积的组织，如将一个5mmx 5mm的组织切片需要进行2500次切割实验以获得0.1mm x 0.1mm的小组织块，随后进行2500次质谱检测。但是由于质谱检测通量和仪器稳定性的限制，对上述2500个样本进行蛋白质组进行检测时无法保证定量的准确性和有效性；2)分辨率较低，由于质谱检测灵敏度的限制，无法对过小的组织块内的蛋白进行有效检出。目前已报道的可以检测的最小组织块为100μm，而对于更高分辨率的如25μm的组织块，该方案难以实现。虽然最近发展出来的“Deep Visual Proteomics(DVP)”技术通过利用图像识别技术对染色后组织中的细胞类型进行分类，再利用激光显微切割技术将类型相同的细胞切割到一个容器中进行蛋白质组分析。但是，该技术存在以下问题：1)通过图像可分类的细胞类型较少；2)无法知道具体细胞在空间上的位置信息；3)无法获取大视野的空间蛋白信息(如组织级别)。
目前空间代谢组信息主要通过质谱成像(MSI)的方式获得，主流的质谱成像技术包括：(1)基质辅助激光解析质谱成像技术(Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization-Mass Spectrometry Imaging，MALDI-MSI),(2)电喷雾解析电离成像技术(Desorption Electrospray Ionization-Mass Spectrometry Imaging，DESI-MSI)，次级离子质谱成像技术(Secondary Ion Mass Spectrometer-Mass Spectrometry Imaging，SIMS-MSI)等。上述方法均存在的问题包括：1)无法获得代谢物的准确信息。由于组织上的代谢物丰度非常低，并且化合物被电离后没有经过色谱分离直接被送入质谱检测器，因此难以区分分子量相同而结构不同的化合物，以及在进行一级质谱检测后难以进一步对化合物进行二级检测；2)对质谱仪有额外的要求，普通质谱仪无法满足。
目前的空间多组学检测技术只有DBiT-seq技术，该技术通过设计正交芯片对同一片组织进行空间组合标签和用核苷酸标记的抗体投递，实现了同时对组织原位的转录组和少数靶蛋白(25个)同时检测。该方法存在的问题是：1)无法以非靶向的方法对蛋白进行检测；2)无法检测其他的组学数据，例如：代谢组、蛋白修饰组、转录修饰等组学。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供基于参考组学数据获得目标组学中生物分子的空间分布的方法、装置和模型。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其包括以下步骤：
(1)获得目标样本的连续切片，按不同角度将所述切片中的部分切片进一步分割为条状子组织；
(2)同时或单独获得各条状子组织中的目标组学的生物分子的信息；
(3)获得所述切片中参考组学的生物分子的二维空间分布信息；和
(4)基于参考组学的生物分子的二维空间分布信息训练学习模型，然后利用训练的学习模型以及目标组学的生物分子的一维信息预测出目标组学分子的二维空间信息。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其中，所述步骤(1)包括：
获得目标样本的目标区域的x张连续切片，分别记为T1、T2、T3、…Tx，并分别将组织切片置于基板的感兴趣区域，其中，x为3以上的自然数，T1切片沿第一方向放置，T3切片沿第一方向放置，且所述第一方向和所述第二方向不同，即第一方向和第二方向能够形成夹角；
对所述连续切片T1、T2、T3、…Tx成像以产生样本图像；
分别将切片T1和T3进一步分隔为条状子组织，其中T1的第一个和第二个条状子组织记为T1-1、T1-2至第n个条状T1-n，T3的第一个和第二个条状子组织记为T3-1、T3-2至第n个条状T3-n，其中n为2至500的自然数。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其中，步骤(1)中通过激光显微切割或微流体装置将所述切片中的部分切片进一步分割为条状子组织。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其中，所述微流体装置包括切片分割区，其包括10-500个可变宽度微通道，各微通道之间存在通道壁且所述通道壁的宽度在500nm-200μm之间。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其中，所述激光显微切割得到的条状子组织宽度为5-200μm，相邻的连续所述条状子组织的间距在0-200μm之间。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其中，步骤(4)中，目标组学为蛋白组学，其生物分子的一维信息的获取包括：
分别将含参考肽的组织裂解试剂递送到至少切片T1和T3被分隔的条状子组织的区域，使组织裂解试剂在基板的感兴趣区域裂解条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3-n；
将条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n裂解后的裂解液从基板的感兴趣区递送至微流体装置出口，并分别将各条状子组织裂解物溶液转移至独立的容器中；
用液相色谱-质谱联用仪分别检测T1-1…T1-n和T3-1…T3-n的裂解物中的生物分子信息，进而获得切片T1在α角度和切片T3在β角度的蛋白质组一维理化信息。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，步骤(4)中，目标组学的生物分子的一维信息的获取包括：
分别将目标化合物的溶剂递送到条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n的区域，使所述溶剂在基板的感兴趣区域提取条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n中的化合物；
将提取了条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3-n化合物的溶剂从基板的感兴趣区递送至微流体装置出口，并分别将每个条状子组织溶液转移至独立的容器中；
用液相色谱-质谱联用仪分别检测T1-1…T1-n和T3-1…T3-n溶液中的化合物信息，进而获得切片T1在α角度和切片T3在β角度的代谢组一维理化信息。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，步骤(4)中，目标组学为代谢组学，其生物分子的一维信息的获取包括：
将逆转录试剂和条形码多核苷酸递送到条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n的区域，在基板的感兴趣区域条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3-n中产生cDNA；
将裂解缓冲液或变性试剂递送至所述条状子组织，以产生裂解或变性组织样本；
从所述裂解或变性组织样本中提取cDNA；和
对所述cDNA构建测序文库进行测序以产生cDNA读数。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其中，所述条形码多核苷酸包括PCR句柄末端序列、条状子组织条形码序列、唯一分子标识符序列和polyT序列，任选地，其中所述PCR句柄末端序列用生物素末端官能化。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，步骤(4)中，目标组学为转录组学，其生物分子的一维信息的获取包括：
将组蛋白移除试剂递送至条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n的区域，在基板感兴趣区域条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3-n中去除基因组中的组蛋白；
将断裂试剂递送至所述条状子组织，以产生片段化的基因组；
裂解条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3-n并将裂解后的液体从基板的感兴趣区递送至微流体装置出口，并分别将每个条状子组织溶液转移至独立的容器中；
对所述容器中的基因组片段进行扩增；和
对所述基因组扩增产物进行测序获得序列信息。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，步骤(4)中，目标组学为基因组学，其生物分子的一维信息的获取包括：
分别将目标化合物的溶剂递送至长条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n的区域，使化合物溶剂在基板的感兴趣区域提取条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n中的化合物；
将提取了条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3-n化合物溶剂从基板的感兴趣区递送至微流体装置出口，并分别将各条状子组织溶液转移至独立的容器中；
用液相色谱-质谱联用仪分别检测T1-1…T1-n和T3-1…T3-n溶液中的化合物信息，进而获得组织片T1在α角度和组织片T3在β角度的代谢组一维理化信息；
分别将复水试剂和清洗试剂分别递送至组织切片T1和T3被分隔的长条状子组织区域，并将各条状子组织流出溶液丢弃；
将逆转录试剂和条形码多核苷酸递送至条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n的区域，在基板的感兴趣区域条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3-n中产生cDNA；
将裂解缓冲液或变性试剂递送至所述条状子组织，以产生裂解或变性组织样本；
将所述条状子组织裂解后的裂解物液从基板的感兴趣区递送至微流体装置出口，并分别将每个条状子组织裂解物溶液转移至独立的容器中，并利用磁珠分离溶液中的cDNA和蛋白裂解物；
用液相色谱-质谱联用仪分别检测T1-1…T1-n和T3-1…T3-n的裂解物中包括蛋白的序列信息、蛋白修饰信息和丰度信息的生物信息，进而获得切片T1在α角度和切片T3在β角度的蛋白质组一维理化信息；和
对所述cDNA进行文库构建并测序以产生cDNA读数。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其中，所述步骤(3)获得所述切片中参考组学的生物分子的二维空间分布信息包括选自代谢组、转录组、蛋白质组和组织学信息中的至少之一。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其中，所述代谢组的二维信息通过质谱成像技术获得，其包括：基质辅助激光解析质谱成像技术、电喷雾解析电离成像技术、次级离子质谱成像技术中的至少之一。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其中，所述转录组的二维信息通过空间转录组技术获得，包括基于显微成像的空间转录组技术和/或基于空间核酸标签阵列的技术。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其中，所述蛋白质组的二维信息的获得包括基于抗体标签的蛋白质组技术、核酸序列标记的抗体标签和/或基于金属标签标记的抗体中的至少之一。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其中，所述组织学的二维信息的获得包括苏木精伊红染色法、乙酰胆碱酯酶染色法染色、尼氏染色法和Masson染色中的至少之一。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其中，步骤(4)包括：将参考组学当作训练集，采样过程模拟当作编码器，采样值重构当作解码器，其中训练好的解码器作为后续使用的重构模型。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其中，所述编码器包括平行切条模拟、随机取点模拟和激光切割模拟中的至少之一；所述解码器包括机器学习模型、深度学习模型和概率推断模型中的至少之一。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其中，步骤(4)包括：参考组学的生物分子的二维空间分布信息训练学习模型，然后利用训练的学习模型以及目标组学的生物分子的一维信息预测出目标组学分子的二维空间信息。
本发明的第二方面，提供一种用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其包括设置于基板的切片分割区，其包括10-500个可变宽度微通道，各微通道之间存在通道壁且所述通道壁的宽度在500nm-200μm之间，各微通道分别具有入口端和出口端。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其中，所述各微通道平行设置，且微通道长度相等。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其中，进一步包括盖片，通过固定结构将所述盖片和所述切片分割区可拆卸的压在一起。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其中，进一步包括试剂区，所述试剂区中的试剂通过与各微通道的入口端进入各微通道。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其中，所述试剂区设置多个试剂收纳腔，各试剂收纳腔的一端分别与对应的一微通道的入口端连通。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其中，进一步包括负压区，通过所述负压区驱动试剂由所述试剂区进入微通道，达到微通道中的切割组织区。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其中，所述负压区设置多个收集腔，各收集腔的一端分别与对应的一微通道的出口端连通。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其中，至少各试剂收纳腔经微通道与对应的收集腔连通的通路能够形成封闭连接。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其中，各试剂收纳腔经微通道与对应的收集腔连通的通路长度相等。
本发明的第三方面，提供一种用于获得目标组学中生物分子的空间分布的模型的构建方法，其包括：
a.获得由组织切片得到的多个条状子组织中的目标组学的生物分子的信息；
b.获得组织切片中参考组学的生物分子的二维空间分布信息；和
c.基于参考组学的生物分子的二维空间分布信息训练学习模型，然后利用训练的学习模型以及目标组学的生物分子的一维信息预测出目标组学分子的二维空间信息。
本发明的第四方面，提供一种用于获得目标组学中生物分子的空间分布的设备，其包括：
至少一个处理器；和
与所述至少一个处理器通信连接的存储器；其中，所述存储器存储有可被所述至少一个处理器执行的指令，所述指令被所述至少一个处理器执行，以使所述至少一个处理器能够执行本发明所述的构建方法。
本申请技术方案的优点包括如下：
本发明的方法为基于迁移学习的方法，有效降低了需要检测的样本数目，提高实验效率以及高分辨率地获取目标分子在整个检测组织上的空间分布和表达量。例如，示例性技术方案中仅通过两个角度的一维目标组学信息即可通过迁移学习模型预测出目标组学分子在整个检测组织上的二维分布信息，显著降低了所需检测的目标组学的样本数目，同时以高通量和高空间分辨率的方式获取组学分子的空间信息。
本申请的方法适用性广。例如本申请的方法可以用于组织细胞蛋白质、mRNA、代谢物、DNA、染色质以及糖类等组学分子的分析，进而实现空间蛋白质组、转录组、代谢组、基因组等的多组学检测。
可以获得传统方法难以获得的信息。对于蛋白质组和代谢组等组学，本申请的方法可以结合HPLC色谱分离、质谱二级检测等获得传统方法难以获得的目标分子的信息，包括目标分子的二级结构、区分同分异构体、更多的分子种类等。
本申请的方法中样本制备成本低、不需要复杂的设备辅助。例如，在示例性实施方案中，采用特定的微流控装置作为获取目标组学分子一维信息的手段，芯片和装置整体成本低，且不需要复杂的外接设备，有效降低了实验的成本。
本申请的方法产生的数据具有空间分辨率高的特点。例如本申请的方法采用了微流控装置，可以实现较高分辨率的一维信息取样，进而实现高分辨率的二维生物分子分析，最高可实现10μm分辨率的空间组学分析。
本申请的方法相对于传统空间蛋白质组学，在空间蛋白质组学中主要有一下几个优势：1)我们采用微流体装置来获取目标组学的一维信息，微流体装置的优势在于空间分辨率高、通量高、成本低、易于制备和操作、不需要复杂的激光显微切割设备辅助；2)本申请首先提出了利用深度学习中的迁移学习算法来进行空间生物分子重构的策略。可以显著降低检测样本的数目。例如同样是5mm x 5mm的组织块0.1mm x 0.1mm的空间分辨率，本申请的仅需50个蛋白样本即可实现重建重构，而传统基于激光显微切割的方案则需检测2500个蛋白样本；3)本申请的方案可以达到更高的空间分辨率，目前测试得到的最高空间分辨率是25μm，显著强于已报道的技术方案。
本申请的方法相对于传统的代谢组学的优势包括：1)目标组学的一维样本化合物浓度较高，在进行一级质谱检测后，可以进行化合物的二级检测，相比于质谱成像依赖一级质谱数据和数据库比对来获得分子的结构信息，我们的方法基于二级质谱信息可以获得更加准确的化合物分子结构；2)一维样本会经过色谱分离，可以将极性不同的同分异构体化合物分开后再进入质谱，进而可以有效区分同分异构体分子；3)可以针对研究需求对一维样本化合物进行特定衍生化，获取目标代谢物信息。
本申请的方法相对于传统空间多组学的优势在于可以同时实现多种组学的同时检出，包括基因组、转录组、蛋白组和代谢组，并且蛋白质组是以非靶向的方式获得，数目远大于基于靶向抗体捕获的方式。本申请的方法可以达到2万个基因、超过4000个蛋白和3500个代谢物的同时检测，是目前已经报道的技术无法实现的。
附图说明
图1示例性微流体装置的示意图。
图2为微流控芯设计及优化。其中，图2A为本专利所设计使用的通道长度相等的微流控芯片设计图。图2B为微流控装置的实物图。图2C为常见的通道长度不相等的微流控芯片设计图。图2D为等长和长度不相等的微通道流体阻力差异对比。
图3本发明示例性用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法的流程图。
图4基于已发表的空间转录组数据计算机模拟验证Flow2Spatial的可靠性。其中，图4A为Flow2Spatial算法流程图。图4B为利用slide-seq空间转录组数据验证Flow2Spatial算法的流程图。图4C为Flow2Spatial算差重构结果与真实值的对比。
图5为不同包埋剂样本的色谱峰，Cryo-gel没有观察到聚合物峰而OCT的样本有明显的聚合物峰。
图6为不用包埋剂包埋组织导致组织切片时组织边缘产生卷边进而影响微流控芯片的密封效果。
图7为红色荧光蛋白标记的小鼠小脑组织切片在芯片中经过原位消化后图片。
图8为不同的裂解液即在芯片中不同蛋白样本制备方式所获得的蛋白数目。
图9为不同通道预处理方式对于降低样本蛋白非特异性吸附的效果。
图10为质谱定量检测样本中蛋白组可靠性评估。图10A样本梯度稀释的示意图及对应蛋白组的质谱检测结果。图10B梯度稀释样本中蛋白丰度热图及样本间共有蛋白分布密度图。图10C梯度稀释样本中组内重复的蛋白质丰度变异系数分布。图10D梯度稀释样本实际检测蛋白质丰度比例与理论比例的偏差系数。图10E随机选取6个偏差系数及变异系数小于30％的蛋白丰度。图10F不同梯度样本间的相关性。图10G小脑样本蛋白采样及质谱检测示意图。图10H QC样本间蛋白丰度的变异系数。图10I持家蛋白Gapdh的丰度与组织量的相关性。
图11为利用大肠杆菌蛋白验证微通道间蛋白样本的交叉污染情况。
图12用小鼠小脑组织切片验证Flow2Spatial方法的可靠性。图12A分别将重构算法Flow2Spatial和Tomographer用于小鼠小脑空间蛋白组分析的示意图。图12B左侧为Allen Brain数据库的小鼠小脑脑区分布图，中间和右侧分别为不同聚类分辨率下Flow2Spatial重构的脑区分布图。图12C三种方法Slide-seq、Tomographer、Flow2Spatial找到的脑区特异表达基因的韦恩图。图12D脑区聚类UMAP图，星号代表不同脑区的标志基因。图12E免疫荧光染色代表基因验证重构结果的准确性。
图13为大鼠结肠绒毛空间蛋白质组图谱分析。其中，图13A为结肠绒毛的组织结构示意图。图13B左侧为芯片压在绒毛组织上显微图片，右侧为每个微流控通道所检测到的蛋白数目。图13C为空间蛋白质组数据在不同聚类分辨率下所鉴定到的组织结构。图13D为结肠绒毛的免疫荧光染色结果。图13E为差异转运蛋白在绒毛上的空间分布。
图14为利用80％乙醇作为溶剂从微通道中提取的代谢化合物的质谱峰。
图15为该空间多组学方法应用于空间转录组的验证。其中，图15A为同微通道中组织里的mRNA进行原位反转录和cDNA扩增的流程图。图15B为cDNA扩增产物的毛细管电泳检测结果。图15C为测序后每个微通道的组织所检测到的基因数以及通道间样本的相关性。
图16为该空间多组学方法应用于空间多组学的结果。其中，图16A为同微通道中组织里的代谢物检测结果。图16B为不同微通道检测到的蛋白数目结果。图16C为cDNA扩增产物的毛细管电泳检测结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本文中，术语“组学”是指一类生物学分子个体的系统集合，其实例包括但不限于基因组学、蛋白质组学、代谢组学、转录组学、蛋白修饰组、转录修饰组、脂类组学、免疫组学、糖组学和RNA组学等。
本文中，术语“目标组学”是指需要分析或待分析的组学。术语“参考组学”是指与目标组学属于同一类，但其中目标生物分子信息已知的组学。参考组学中目标生物分子的信息可以本领域已知的，也可以是通过任何方法获得的。这些方法包括本申请之前已知方法，如影像学方法、数据库收集等，或本申请或之后的新方法，本申请的方法等。
本文中，术语“目标样本”是指待分析或检测的生物样本，其非限制性示例包括哺乳动物如小鼠、大鼠、狗、猪，鸟类如鸡，人或其它动物，或者植物来源的组织或细胞。目标样本的形态不限定，例如在一些实施方案中，目标样本是固定的生物样本，如多聚甲醛固定样本。在一些实施方案中，目标样本是冰冻非固定样本。在另一些实施方案中，目标样本为生物组织，其采用质谱兼容的组织包埋剂例如Cryo-gel(Leica莱卡公司)包埋，可选的包埋剂还可选择OCT等。
本文中，术语“连续切片”是指对目标样本的目标区域依次切割而得到的由多张切片组成的切片组合。多个连续切片中每张切片的厚度以保证连续切片组合中各切片中生物分子的空间分布相同为宜。为此目的，连续切片中各切片的厚度一般控制为25μm以下，如20μm以下、15μm以下，例如1-15μm、2-12μm、5-10μm等。具体的切片厚度可根据例如待分析的生物分子、所需的切片组合中的切片数量等而在上述范围内自由选择。同一切片组合中，不同切片的厚度可以相同，也可以不同。连续切片中切片的数量x不特别限定，一般为2以上的自然数，如2、3、5、7、9、11、13、15等。另一方面，x一般为100以下的自然数，如50以下、30以下、20以下。
本文中，术语“参考切片”是指从连续切片中选择或指定的部分切片，如某一张切片，或几张切片。在选择或指定几张切片的情况，可是连续的不同切片，或间隔的不同切片。通常情况下，参考切片不进行实际地进一步分割为条状子组织的步骤。可选地，可对参考切片进行模拟切割或采样过程。
[用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法]
本发明的第一方面，提供用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，本文有时简称为“本发明的方法”，其至少包括以下步骤：
(1)获得目标样本的连续切片，按不同角度将所述切片中的部分切片进一步分割为条状子组织；
(2)同时或单独获得各条状子组织中的目标组学的生物分子的信息；
(3)获得所述切片中参考组学的生物分子的二维空间分布信息；和
(4)基于参考组学的生物分子的二维空间分布信息训练学习模型，然后利用训练的学习模型以及目标组学的生物分子的一维信息预测出目标组学分子的二维空间信息。
本领域技术人员应理解，步骤(1)、(2)、(3)、(4)等仅为了区别不同步骤目的，并没有表示步骤先后顺序的含义。只要能够实现本发明的目的，上述步骤的顺序并不特别限定。此外，两个以上的上述步骤可合并同时进行，例如两个以上的步骤可以同时分别进行，或者将两个以上的步骤合并为一个步骤进行。另外，本领域技术人员还应理解的是，在特定的步骤前后或这些任意步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。
步骤(1)
根据本发明的方法，步骤(1)为对目标样本进行切割的步骤，其包括对目标样本的两种不同切割，第一切割为获得目标样本的连续切片，第二切割为对连续切片中的至少部分切片进一步切割为条状子组织。两种切割的切割方法不特别限定，可以已知的任何方法，例如刀片切割、激光显微切割等。第一切割和第二切割的方法可以相同，也可以不同，对此不特别限定。
根据本发明的方法，步骤(1)中第一切割获得x张连续切片，分别记为T1、T2、T3、…Tx。每张切片的放置在载玻片上的角度各不同。例如，当T1切片沿第一方向放置，T3切片沿第二方向放置时，第一方向和第二方向不同，即两者之间能够形成夹角。夹角大小不限定，优选地，第一方向和第二方向之间的夹角大于0度至小于180度，优选的夹角为30-160度，更优选45-135度，如50度、60度、70度、80度、90度、100度、120度等。类似地，当切片数量更多时，对应地，存在第一方向、第二方向、第三方向……，此时这些方向均不相同，任意两个方向之间均能够形成夹角。这些夹角可以相同，也可以不同。
根据本发明的方法，步骤(1)中第二切割包括对至少两张切片的进一步切割，其中每张切片的进一步切割的角度不同。例如，针对第一切片的方向和针对第二切片的方向相互形成90度夹角。第二切割后获得的条状子组织的数量n不特别限定，n可以是例如2-500的自然数，优选5-400、10-300等，更优选20-200、30-100，如30、40、50、60、70、80、90等。为区别不同条状子组织，示例性地，将T1的第一个和第二个条状子组织记为T1-1、T1-2，类似地，第n个条状记为T1-n。类似地，将T3的第一个和第二个条状子组织记为T3-1、T3-2至第n个条状T3-n。第二切割后的条状子组织的宽度不限定，一般为5-200μm，优选10-150μm，如15-100μm、20-50μm等。相邻的连续条状子组织的间距在0-200μm之间，优选0.5-100μm，更优选1-80μm、1-50μm等，如2μm、4μm、5μm、6μm、8μm、10μm、15μm等。
在某些实施方案中，本发明的方法中步骤(1)的第二切割通过微液体装置进行切割。微液体装置的示例性结构如下文所述。
根据本发明的方法，步骤(1)还包括对连续切片中的各切片成像以产生样本图像的步骤。成像方式不限定，可以使用光学或荧光显微镜进行。
步骤(2)
根据本发明的方法，步骤(2)为同时或单独获得各条状子组织中的目标组学的生物分子的信息，特别是一维信息。一般而言，生物分子信息的获取包括提取或标记各条状子组织中生物分子的步骤和检测各条状子组织中生物分子的步骤。这些步骤可通过已知方法进行，并且不同的生物分子的信息获取方式不同。
在某些实施方案中，目标组学的生物分子信息的获取通过特定的微流体装置进行。关于微流体装置参见下述。
步骤(3)
根据本发明的方法，步骤(2)为获得切片中参考组学的生物分子的二维空间分布信息。参考组学的生物分子的二维空间分布信息需要通过对相邻组织切片检测获取，对此检测方法不特别限定。
在某些实施方案中，获得参考组学生物分子的二维分布信息包括代谢组学信息。其中，转录组的二维信息利用空间转录组组技术获得，其实例包括但不限于如下方式：基于显微成像的的空间转录组技术(imaging-based spatial transcriptomics methods)，如Multiplexed error-robust FISH(MERFISH)、in situ sequencing(ISS)、10x Genomics的Xenium等；基于空间核酸标签阵列的方法(spatial indexing strategies)，如10xVisium、Stereo-seq、DBiT-seq等。
在某些实施方案中，获得参考组学生物分子的二维分布信息包括蛋白质组学信息。其中，蛋白质组学的二维信息获取包括但不限于如下方式：基于抗体标签的蛋白质组技术，如荧光标记的抗体(multiplexed immunofluorescence(MxIF)、核酸序列标记的抗体标签(spatial cite-seq)、基于金属标签标记的抗体(CyTOF mass cytometry)；基于显微切割技术获得空间蛋白质组信息。
在某些实施方案中，获得参考组学生物分子的二维分布信息包括组织学信息。其中，组织学的二维信息获得包括但不限于如下方式：苏木精伊红染色法(hemotoxylineosin，HE)、乙酰胆碱酯酶染色法染色(Acetylcholinesterase,AchE)、尼氏染色法(Nisslstaining)、masson染色等。
步骤(4)
根据本发明的方法，步骤(4)为基于参考组学的生物分子的二维空间分布信息训练学习模型，然后利用训练的学习模型以及目标组学的生物分子的一维信息预测出目标组学分子的二维空间信息。
根据本发明的方法，步骤(4)中的学习模型不限定，其实例包括但不限于机器学习模型、深度学习模型、概率推断模型等。本明可以使用其中一种模型，也可以组合使用两种不同模型。在示例性实施方案中，本发明利用深度学习中的迁移学习算法来进行空间生物分子重构。
[微流体装置]
本发明的第二方面，提供一种用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，本文有时简称为“本发明的装置”，其包括设置于基板的切片分割区。该切片分割区用于对第一切割得到的切片进行第二切割，从而得到多个条状子组织。
根据本发明的装置，切片分割区一般包括多个微通道。可选地，微通道的宽度可变，微通道的数量不特别限定，一般为10-500个，如15个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、80个、100个、150个、200个、250个、300个、400个等。相邻微通道之间存在通道壁且所述通道壁的宽度在500nm-200μm之间。优选通道壁的宽度在800nm-100μm之间，更优选1-80μm，2-50μm。切片分割区的各微通道各自分别具有入口端和出口端。入口和出口的直径在1mm-4mm间，如2mm、3mm等。切片分割区中的各微通道的位置关系不限定，优选各微通道以平行方式设置。
根据本发明的装置，进一步包括盖片，通过固定结构将盖片和切片分割区可拆卸的压在一起。固定结构不限定，可以是夹具、卡扣结构等可拆卸结构。盖片不限定，可以是例如载玻片。
根据本发明的装置，进一步包括试剂区，试剂区通常设置多个试剂收纳腔。试剂收纳腔的数量不限定，一般与微通道的数量相等。各试剂收纳腔的一端分别与对应的一微通道的入口端连通。各试剂收纳腔与对应的微通道的连通为封闭式连通。各试剂收纳腔的排布方式不特别限定，可以是任何方式。例如以方形阵列式排布。
根据本发明的装置，进一步包括负压区，通过负压区驱动试剂由试剂区进入微通道，达到微通道中的切割组织区。优选地，在切割组织区进行反应或生物分子的提取。在某些实施方案中，负压区设置多个收集腔，各收集腔的数量不限定，一般与微通道的数量相等，各收集腔的一端分别与对应的一微通道的出口端连通。与试剂收纳腔类似，各收集腔与对应的微通道的连通为封闭式连通。各收集腔的排布方式不特别限定，可以是任何方式。例如以方形阵列式排布。
在某些实施方案中，根据本发明的装置中多个微通道的长度相等。此处，长度是指从例如试剂收纳腔到收集腔之间的距离。
根据本发明的装置，切片分割区、试剂区和负压区可以一体成形，也可以分开以独立的三结构设置。只要能够实现从试剂收纳腔经微通道到收集腔之间的连通封闭即可。切片分割区、试剂区和负压区可以设计为芯片形式。形成芯片的材料不限定，可以是例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、二氧化硅、硅、聚氯乙烯等。
[模型构建方法]
本发明的第三方面，提供用于获得目标组学中生物分子的空间分布的模型的构建方法，本文有时简称为“本发明的构建方法”，其通常包括：
a.获得由组织切片得到的多个条状子组织中的目标组学的生物分子的信息；
b.获得组织切片中参考组学的生物分子的二维空间分布信息；和
c.基于参考组学的生物分子的二维空间分布信息训练学习模型，然后利用训练的学习模型以及目标组学的生物分子的一维信息预测出目标组学分子的二维空间信息。
本领域技术人员应理解，步骤a、b、c等仅为了区别不同步骤目的，并没有表示步骤先后顺序的含义。只要能够实现本发明的目的，上述步骤的顺序并不特别限定。此外，两个以上的上述步骤可合并同时进行，例如两个以上的步骤可以同时分别进行，或者将两个以上的步骤合并为一个步骤进行。另外，本领域技术人员还应理解的是，在特定的步骤前后或这些任意步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。
根据本发明的构建方法，采用使用自编码器的训练策略，即把参考组学当作训练集，采样过程模拟当作编码器，采样值重构当作解码器，其中训练好的解码器就是后续使用的重构模型。编码器包括平行切条模拟、随机取点模拟、激光切割模拟。优选使用平行切条模拟。本发明的解码器包括机器学习模型、深度学习模型、概率推断模型。优选地，使用深度学习模型当作解码器。
[设备]
本发明的第四方面，提供用于获得目标组学中生物分子的空间分布的设备，本文有时简称为“本发明的设备”，其包括至少一个处理器；和与至少一个处理器通信连接的存储器。其中，
根据本发明的设置，所述存储器存储有可被至少一个处理器执行的指令，指令被所述至少一个处理器执行，以使至少一个处理器能够执行本发明第三方面所述的构建方法。
本发明的设备形式不限定，可以是例如计算机、处理器等。
实施例1
本实施例为示例性用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置。
1、微流体装置结构
如图1所示，本实施例的微流体装置设计为芯片形式，其包括试剂区100、切片分割区200和负压区300。其中试剂区100包括6X 8共48个试剂收纳腔110的阵列，各试剂收纳腔110为独立的容器，内部可收纳所需的试剂。各试剂收纳腔110与对应的微通道连通。
本实施例中，切片分割区200包括48个长度相等，且基本平行排列的微通道210。为了使各微通道长度相等，可适当调整微通道的排列方式。例如，微通道不是设计为直线形式，而是以折线方式设置。
本实施例中，负压区300包括6X 8共48个收集腔310的阵列，各试剂收纳腔310为独立的容器。
本实施例中，在试剂收纳腔110和微通道210之间设置过滤装置120，同时在微通道210和收集腔310之间设置过滤装置320。
2、微流体装置的制备
本实施例的微流体芯片可由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。芯片的模具由SU-8光胶经过曝光、显影和烘烤等步骤以产生用于PDMS复制的硅片模具。然后通过倒模工艺将硅片模具上的微通道图案复制到PDMS芯片上。PDMS通过将Dow Corning184PDMS的A试剂和B试剂以9:1的比例混合来制备PDMS前体，搅拌混匀、脱气半小时后，将该混合物倒入上述模具中，再次脱气30分钟，并在60℃下固化约4-5小时。将固化的PDMS板切割、剥离、并打孔入口和出口孔以完成制造。入口和出口孔的直径为2-4mm，最多可容纳13-50μL的溶液。
本实施例的微流体装置设计包括：
1)芯片设计包括48个位于中心的平行微通道，平行微通道的宽度为在10-200μm间，这些微通道连接到PDMS板两侧有相同数量的入口和出口。
2)微流控芯片的48个通道长度相等，这样的设计可以有效降低不同通道间的流体差异，使液体更加均匀的流过组织表面(图2B)。(图2C)对比展示了等通道长度和不等通道长度芯片(图2A)的流体阻力对比，结果表明微流体在等通道长度的芯片中流速更加均匀，更利于实验控制。
3)芯片与载玻片间没有采用永久键合的方式封接，因为这个方式使得装置的拆卸和使用难度明显增高。针对该问题，芯片是通过一个亚克力材料的夹具将PDMS芯片和载玻片压在一起，并通过负压驱动芯片入口的液体进入通道达到组织区域。针对芯片的每个入口和出口，在亚克力板子上设计有对应的圆孔，这样能有效的密封芯片的出口和入口，保证密封效果。
实施例2
本实施例为模拟数据验证算法可靠性。
Flow2Spatial算法的目标是根据目标组学的一维信息预测目标组学在组织切片上二维空间分布(图4A)。该算法利用参考组学分子的二维空间分布信息训练深度学习模型，及利用训练的深度学习模型以及目标组学分子的一维信息预测出目标组学分子的二维空间信息，具体为一种迁移参考组学的信息，使用人工智能的方法，将采样得到的值重构出原始二维分布的方法。具体步骤包括：计算模拟采样过程，得到参考组学的采样信息；训练人工智能模型(自编码器)，将参考组学的采样信息当作输入，参考组学的原始信息当作输出；将真实采样值输入到训练好的模型，即可得到具有精细空间结构的二维分布。
为了验证Flow2Spatial算法的可靠性，使用已发表文献的小鼠小脑的空间转录组数据集进行计算机模拟实验，其转录组的空间分布作为算法的标准对照(图4B)。简而言之，为了模仿基于微流控芯片的采样策略，组织被类似地沿两个正交轴切片。对于每个角度，组织切片被切成连续的25μm条带，横跨整个组织，在每个条带中，通过累积每个基因的表达数据获得基因表达。将原始的空间转录组分布与使用Flow2Spatial模拟实验中获得的预测结果进行了比较，与本实施例方法一起比较的还有断层扫描算法(Tomographer algorithm)。为了评估这两种算法预测的二维信息，确定了以不同稀疏性和分布模式为特征的基因的重建精度。计算所有基因Spearman相关系数、预测结果与真实分布的相对误差。评估这些指标的分布，得出结论，即本实施例在重构给定基因的空间模式方面显著优于断层扫描算法。此外，与重构分辨率较低的断层扫描仪算法不同，Flow2Spatial提供了更精细的空间分布信息，并表现出与真实空间分布更高的相关性(图4C)，这种高分辨率重构明显有助于后续的聚类分析。这些结果表明了本实施例的算法具有较高优越性。
实施例3
本实施例对小鼠小脑的组织切片进行空间重构，获得了小鼠小脑大约4200种蛋白的空间分布，证明了本申请方法的可靠性。
1、样本制备：
本实施例中样本的制备过程如下：
1)将目标样本从动物体内取出，如小鼠的大脑、小脑、结肠等；
2)用质谱兼容的包埋剂包埋组织并利用液氮速冻组织；
3)将样本冻存于-80℃冰箱，在需要切片时再取出。
值得注意的是，根据目标组学合理的选择包埋剂或不采用包埋剂。例如当目标组学为蛋白质组时，为了保证组织切片的一致性以及与下游质谱检测兼容，在上游样本制备时通常采用质谱兼容的包埋剂Cryo-gel。图5展示了不同包埋剂对下游质谱检测的影响，如图所示：OCT等非质谱兼容的包埋剂在下游质谱检测时会明显抑制质谱信号，而Cryo-gel则没有看到明显的质谱信号抑制。另外，从图6可以看出，在不使用包埋剂时组织容易出现卷边、相邻切片一致性差等问题，而Cryo-gel包埋的组织形态好且相邻切片的一致性高。
2、组织切片：
将样本从-80℃冰箱取出后在-18℃的切片机中平衡半小时。将组织修整到目标区域后连续切3片或4片厚度在8-10μm的组织切片。组织切片贴在载玻片上的方式如下：第一块组织切片水平贴于芯片载玻片的中心区域(组织片的几何长轴水平)，第三块组织切片垂直贴于芯片载玻片的中心区域(组织片的几何长轴垂直)。第二块组织切片根据参考组学选择载玻片，例如将空间转录组学作为参考组学时则第二块组织应贴于空间表达芯片的目标区域(例如10X Genomics公司的Visium表达芯片载波片)，若将空间代谢组作为参考组学则将组织贴于ITO(氧化铟锡)载玻片上，若以组织学染色为参考组学则将组织贴于普通粘附载玻片上。在以多组学为参考组学时，需要使用第四块组织切片，载玻片的种类根据参考组学选择合适的载玻片，具体参考上述第二块组织切片。获得切片后，尽快将对组织切片进行成像，获得组织的第一次成像图片。
3、蛋白样本制备：
将两块PDMS芯片分别与第一块组织和第三块组织贴合，确认组织都在平行通道以内，并用亚克力夹具将PDMS芯片和载玻片压紧。对压芯片后的第一块和第三块组织片进行成像，获得第二次成像图片。配制组织裂解液，裂解液的成分包括胰蛋白酶、iRT标准肽段、碳酸氢铵溶液等，裂解液中还可包括胞内蛋白酶(Lys-C)等以提高裂解效率。将裂解液逐个加入到第一块和第三块组织芯片入口的孔里，10-20μl/孔的裂解液。负压驱动入口的裂解液进入微通道并流经组织区域，负压持续1-10min后将芯片放进保湿盒里保湿，再将保湿盒放入37℃的培养箱孵育60min。在孵育结束后，进一步负压驱动使入口的裂解液完全流到芯片出口，将出口的裂解液逐个吸出转移到PCR管中，并进一步将这些PCR再在37℃的条件下进一步孵育3h。组织裂解液流经芯片微通道裂解组织，进而获得条状组织的蛋白质组溶液。图7展示了红色荧光蛋白标记小鼠的小脑切片在芯片中裂解前和裂解后的情况。
4、质谱检测：
裂解液样本先经过液相色谱分离后再注射进质谱仪进行检测，液相色谱仪的型号为EASY-nLC 1200(Thermo Scientific)，采用C18的反相色谱柱(75μm I.D.×20cm，1.9μm,Dr.Maisch GmbH)，色谱的最大压力为400bar。色谱梯度设置为：0-2分钟,6％-12％流动相B(80％乙腈,0.1％甲酸)；2-18分钟,12％-30％B相；18-22分钟,30％-42％B相；最后到95％ B相并持续4分钟。色谱分离后的分子质量分析采用Q Exactive HF质谱仪(ThermoScientific)完成。参数为：data-independent acquisition(DIA)检测模式，扫描区间为398到1202m/z，全谱扫描分辨率为120,000；DIA扫描分辨率为30,000，NCE:28％；AGC靶标:3e6；最大注射时间:100毫秒。蛋白的注释和定量通过利用Spectronaut(15.2.210819,Biognosys,Schlieren,Switzerland)软件分析。
5、蛋白样本制备条件优化：
由于裂解液的种类会影响下游的蛋白质组样本制备流程，图8展示了不同裂解液即不同蛋白样本制备方式所检测的蛋白数目，如图8所示，直接采用胰酶原位消化组织获取的蛋白数目是最高的，而采用AZO或DDM等质谱兼容表面活性剂对组织进行裂解再进行变形、还原烷基化、胰酶消化的方式获得的蛋白数目相对较少。
另一方面，用胰酶作为裂解液在微通道中直接进行组织原位消化的优势是可以降低样本蛋白在芯片表面的非特异性吸附。PDMS为聚二甲基硅氧烷具有疏水特性，因此容易非特异的吸附蛋白等大分子。而通道中用胰酶消化组织时胰酶会率先吸附到微通道表面，进而降低组织中蛋白在通道上的非特异性吸附，这对于芯片中的微量蛋白质组至关重要。如图9展示了蛋白样本流经BSA预处理的微通道、不做处理的微通道、胰酶处理的微通道后蛋白损失情况，结果表明胰酶可以有效降低样本蛋白的非特异性吸附。
另外，准确定量样本中蛋白的丰度信息对于后续准确预测蛋白的二维空间分布是重要的。因此在裂解液中添加了iRT标准肽段作为内标辅助蛋白质组定量，即每个微通道中的裂解液含有等量的iRT，根据样本中蛋白丰度和iRT的相对比较，可以更加准确地利用质谱对蛋白样本进行定量。图10展示了iRT蛋白样本随样本的梯度稀释呈现出良好的线性关系。
6、质谱成像：
从-80℃冰箱中取出第二块切片组织并迅速置于真空干燥器中干燥30min以上。配制质谱成像所需的基质溶液，基质溶液通常包括有机溶剂(如甲醇、乙腈等)、基质和三氟乙酸。基质的选择主要依据待成像的化合物的特性，可选的基质化合物包括但不限于：SA(4-羟基-3,5-二甲氧基肉桂酸，芥子酸)、CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)、DHB(2,5-二羟基苯甲酸)、1,5-DAN(1,5-二氨基萘)等。进一步将基质溶液均匀的覆盖到组织上，将基质覆盖到组织上的方法包括但不限于：喷雾法(Pneumatic spray)、大液滴滴加法(large droplet)、升华法(sublimation)。将制备好的载玻片放置于质谱仪进行质谱成像，选择合适的分辨率(如10μm、25μm、50μm、100μm)进行基质辅助激光解吸/电离(MALDI-MSI)质谱成像。
可选地，其他的质谱成像方式也可用于获得参考组学的二维信息，包括但不限于：电喷雾解析电离成像技术(Desorption Electrospray Ionization-Mass SpectrometryImaging，DESI-MSI)、次级离子质谱成像技术(Secondary Ion Mass Spectrometer-MassSpectrometry Imaging，SIMS-MSI)等。
7、组织学染色：
第二块组织或第三块组织除了可以进行质谱成像获得组织化合物的二维信息作为参考组学，相应地，还可以采用组织学染色的方式获得组织学的二维信息作为参考组学。组织学染色包括但不限于苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)、乙酰胆碱酯酶(AChE)染色等。HE染色可购买商业化的染色试剂盒进行(如G1120，solarbio)，基本步骤包括：组织固定、苏木素染细胞核、伊红染细胞质、脱水封片等。相应地，AChE染色也可购买商业化的染色试剂盒进行(如G2111，solarbio)。
8、通道间交叉污染评估：
为了验证在微通道中原位裂解消化组织时，平行通道间的样本是否存在串道即交叉污染。如图11所示使用大肠杆菌验证通道间的交叉污染，用三个相邻微通道测试组织在芯片中裂解后的交叉污染情况，质谱仅在中间通道检测到大肠杆菌蛋白而在两侧通道均未检测到，表明在组织切片在微通道中进行原位裂解时几乎不存在通道间蛋白样本的交叉污染问题。
9、小鼠小脑二维蛋白质组：
为了进一步说明Flow2Spatial分析复杂组织的潜力，获取小鼠小脑组织切片的空间蛋白质组证明方法的可靠性(图12A)。具体来说，对小鼠小脑进行切片获得5片连续的组织切片，其中第二个切片用做H&E染色，其他切片进芯片原位消化获得一维的蛋白质信息(微通道宽度＝100μm)，然后对每个微通道中的样本进行质谱鉴定。随后，前三个切片的数据用Flow2Spatial重构蛋白质组的二维信息，而前五个切片的所有数据用Tomographer重建蛋白质组的空间信息。本实施例中每个微通道检测的蛋白数大约在4000个，这比从基于抗体的空间蛋白质组获得的蛋白质数目(最高300个)至少高一个数量级。检测蛋白数目的显著提升为我们深度研究组织的空间蛋白质提供了基础。在空间蛋白分布重建时，使用Leiden检测算法(Leiden community detection algorithm)对每个像素点进行聚类(图12B)。聚类结果表明，蛋白分区优于Tomographer获得的区域(图12E)，其鉴定的脑区分布与Allen brain鉴定的脑区分布基本一致。此外，进一步用免疫荧光染色验证了本实施例方法获得的蛋白空间分布的真实性(图12E)(例如蛋白Mbp和Rbfox3)。这些结果表明Flow2Spatial可用于揭示组织中蛋白质组的异质性。
实施例4
本实施例对大鼠结肠绒毛的组织切片进行空间蛋白重构，获得了大鼠结肠绒毛大约2400种蛋白的空间分布，进一步证明了本申请方法分析不同组织类型的空间蛋白质组的可靠性。在本实施例中微流体芯片通道宽度为25微米，总共72个微流体通道；其他操作步骤如微流体装置设计、样本制备、组织切片、蛋白样本制备、质谱成像、质谱检测等同实施例1和实施例3。
为了验证我们的方法Spring能够进行高分辨率空间蛋白质组分析，并且使用于不同的组织类型，我们采用了25微米通道宽度的微流控芯片(图13B)对大鼠结肠绒毛进行高分辨率空间蛋白质组分析(图13A)，该方法可以在单个通道样本中检测出超过2400种蛋白，远高于已报导的方法。对绒毛的空间蛋白质组数据进行聚类分析，我们总共鉴定到4种基本的组织结构类型，包括肠上皮细胞、绒毛固有层、肌肉层等(图13C)，与绒毛的组织结构基本一致。为了验证上述结果的可靠性，我们进一步对结肠绒毛进行抗体染色，染色结果与Spring重构结果一致(图13D)。同时，我们在上皮细胞的子类群中也鉴定到了许多与物质转运相关的蛋白，这也进一步说明了我们方法的可靠性(图13E)。
实施例5
本实施例将组织切片分隔为条状子组织，并进一步获得组织代谢组学分子的一维信息，进而获得组织的空间代谢组信息。在本实施例中在样本制备时样本不用包埋剂包埋，其他操作步骤如微流体装置结构、微流体装置设计、样本制备、组织切片等同实施例3。
代谢物样本制备：将两块PDMS芯片分别与第一块组织和第三块组织贴合，确认组织都在平行通道以内，并用亚克力夹具将PDMS芯片和载玻片压紧。对压芯片后的第一块和第三块组织片进行成像，获得第二次成像图片。将代谢物溶剂液体逐个加入到第一块和第三块组织芯片入口的孔里，10-20μl/孔的溶剂。溶剂液体的种类包括但不限于：纯甲醇、80％甲醇、乙腈等，可选的，溶剂液体中还可加入适量的甲酸分子等。负压驱动入口的溶剂液体进入微通道并流经组织区域，负压持续1-10min后使入口的溶剂液体完全流到芯片出口，将出口的裂解液逐个吸出转移到对应的PCR管中。利用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)或者其他代谢物检测方式检测每个PCR管中化合物分子的结构、丰度等信息(图14)。
后续步骤同实施例3。
实施例6
本实施例将组织切片分隔为条状子组织，并进一步获得组织转录组学分子的一维信息，进而获得组织的空间转录组信息。在本实施例中，前处理步骤如微流体装置、微流体装置设计、样本制备、组织切片等同实施例3。
转录组样本制备：将两块PDMS芯片分别与第一块组织和第三块组织贴合，确认组织都在平行通道以内，并用亚克力夹具将PDMS芯片和载玻片压紧。对压芯片后的第一块和第三块组织片进行成像，获得第二次成像图片。将含有通道特异的条码核酸、反转录酶、dNTP等反转录溶液混合物逐个加入到第一块和第三块组织芯片入口的孔里。负压驱动入口的反转录溶液进入微通道并流经组织区域，负压持续1-10min后使反转录液体充满整个微通道。将微流体装置放于湿盒中并将湿盒放于65℃的恒温箱中，使mRNA分子在组织中原位反转录成cDNA分子。反转录结束后用PBS等洗涤微通道，将未反应的反转录溶液清洗干净。接下来用裂解液将整块组织消化，并进行后续步骤：cDNA纯化、链置换、cDNA扩增、NGS建库、测序仪测序等。(图15B和C)为cDNA扩增产物的毛细管电泳结果图，以及每个通道中所检测到的基因数目。
后续步骤同实施例3。
通道特异的条码核酸包括一个22聚体的用生物素末端官能化PCR句柄、10聚体的唯一分子标识符(UMI)、8聚体唯一空间条形码(Barcode)和一个16聚体的poly-T序列组成(图15A)。
实施例7
本实施例将组织切片分隔为条状子组织，并进一步获得组织转录组学分子的一维信息，进而获得组织的空间转录组信息。在本实施例中，前处理步骤如微流体装置、微流体装置设计、样本制备、组织切片等同实施例3。
代谢物样本制备同实施例5。将分别将复水试剂和清稀溶液加入到第一块和第三块组织芯片入口的孔里。负压持续1-10min后使入口的溶剂液体完全流到芯片出口，将出口的裂解液逐个吸出丢弃。准备反转录，转录组样品制备同实施例6。利用磁珠将转录组和蛋白组分离，随后利用质谱仪对蛋白组进行检测和利用测序对转录组进行检测(图16)。

Claims (30)

1.一种用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获得目标样本的连续切片，按不同角度将所述连续切片中的部分切片进一步分割为条状子组织；
(2)同时或单独获得各条状子组织中的目标组学的生物分子的一维信息；
(3)取所述连续切片的部分切片作为参考切片，获取所述参考切片中参考组学的生物分子的二维空间分布信息；
(4)基于参考组学的生物分子的二维空间分布信息训练深度学习模型，然后利用迁移学习策略基于训练后的模型以及目标组学的生物分子的一维信息预测出目标组学分子的二维空间信息。
2.根据权利要求1所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：
获得目标样本的目标区域的x张连续切片，分别记为T1、T2、T3、…Tx，并分别将组织切片置于基板的感兴趣区域，其中，x为3以上的自然数，T1切片沿第一方向放置，T3切片沿第一方向放置，且所述第一方向和所述第二方向不同；
对所述连续切片T1、T2、T3、…Tx成像以产生样本图像；
分别将切片T1和T3进一步分隔为条状子组织，其中T1的第一个和第二个条状子组织记为T1-1、T1-2至第n个条状T1-n，T3的第一个和第二个条状子组织记为T3-1、T3-2至第n个条状T3-n，其中n为2至500的自然数。
对所述分隔后的连续切片T1、T3、…Tx成像以产生样本图像。
3.根据权利要求1所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，步骤(1)中通过激光显微切割或微流体装置将所述切片中的部分切片进一步分割为条状子组织。
4.根据权利要求3所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，所述微流体装置包括切片分割区，其包括10-500个可变宽度微通道，各微通道之间存在通道壁且所述通道壁的宽度在500nm-200μm之间。
5.根据权利要求3所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，所述激光显微切割得到的条状子组织宽度为5-200μm，相邻的连续所述条状子组织的间距在0-200μm之间。
6.根据权利要求2所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，步骤(2)中，目标组学为蛋白组学，其生物分子的一维信息的获取包括：
分别将含参考肽的组织裂解试剂递送到至少切片T1和T3被分隔的条状子组织的区域，使组织裂解试剂在基板的感兴趣区域裂解条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3-n；
将条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n裂解后的裂解液从基板的感兴趣区递送至微流体装置出口，并分别将各条状子组织裂解物溶液转移至独立的容器中；
用液相色谱-质谱联用仪分别检测T1-1…T1-n和T3-1…T3-n的裂解物中的生物分子信息，进而获得切片T1在α角度和切片T3在β角度的蛋白质组一维理化信息。
7.根据权利要求2所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，步骤(2)中，目标组学为代谢组学，其生物分子的一维信息的获取包括：
分别将目标化合物的溶剂递送到条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n的区域，使所述溶剂在基板的感兴趣区域提取条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n中的化合物；
将提取了条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3-n化合物的溶剂从基板的感兴趣区递送至微流体装置出口，并分别将每个条状子组织溶液转移至独立的容器中；
用液相色谱-质谱联用仪分别检测T1-1…T1-n和T3-1…T3-n溶液中的化合物信息，进而获得切片T1在α角度和切片T3在β角度的代谢组一维理化信息。
8.根据权利要求2所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，步骤(2)中，目标组学为转录组学，其生物分子的一维信息的获取包括：
将逆转录试剂和条形码多核苷酸递送到条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n的区域，在基板的感兴趣区域条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3-n中产生cDNA；
将裂解缓冲液或变性试剂递送至所述条状子组织，以产生裂解或变性组织样本；
从所述裂解或变性组织样本中提取cDNA；和
对所述cDNA构建测序文库进行测序以产生cDNA读数。
9.根据权利要求8所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，所述条形码多核苷酸包括PCR句柄末端序列、条状子组织条形码序列、唯一分子标识符序列和polyT序列，任选地，其中所述PCR句柄末端序列用生物素末端官能化。
10.根据权利要求2所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，步骤(2)中，目标组学为基因组学，其生物分子的一维信息的获取包括：
将组蛋白移除试剂递送至条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n的区域，在基板感兴趣区域条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3-n中去除基因组中的组蛋白；
将断裂试剂递送至所述条状子组织，以产生片段化的基因组；
裂解条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3-n并将裂解后的液体从基板的感兴趣区递送至微流体装置出口，并分别将每个条状子组织溶液转移至独立的容器中；
对所述容器中的基因组片段进行扩增；和
对所述基因组扩增产物进行测序获得序列信息。
11.根据权利要求2所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，步骤(2)中，目标组学为多组学，其生物分子的一维信息的获取包括：
分别将目标化合物的溶剂递送至长条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n的区域，使化合物溶剂在基板的感兴趣区域提取条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n中的化合物；
将提取了条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3-n化合物溶剂从基板的感兴趣区递送至微流体装置出口，并分别将各条状子组织溶液转移至独立的容器中；
用液相色谱-质谱联用仪分别检测T1-1…T1-n和T3-1…T3-n溶液中的化合物信息，进而获得组织片T1在α角度和组织片T3在β角度的代谢组一维理化信息；
分别将复水试剂和清洗试剂分别递送至组织切片T1和T3被分隔的长条状子组织区域，并将各条状子组织流出溶液丢弃；
将逆转录试剂和条形码多核苷酸递送至条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3n的区域，在基板的感兴趣区域条状子组织T1-1…T1-n和T3-1…T3-n中产生cDNA；
将裂解缓冲液或变性试剂递送至所述条状子组织，以产生裂解或变性组织样本；
将所述条状子组织裂解后的裂解物液从基板的感兴趣区递送至微流体装置出口，并分别将每个条状子组织裂解物溶液转移至独立的容器中，并利用磁珠分离溶液中的cDNA和蛋白裂解物；
用液相色谱-质谱联用仪分别检测T1-1…T1-n和T3-1…T3-n的裂解物中包括蛋白的序列信息、蛋白修饰信息和丰度信息的生物信息，进而获得切片T1在α角度和切片T3在β角度的蛋白质组一维理化信息；和
对所述cDNA进行文库构建并测序以产生cDNA读数。
12.根据权利要求1所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，所述步骤(3)获得所述切片中参考组学的生物分子的二维空间分布信息包括选自代谢组、转录组、蛋白质组和组织学信息中的至少之一。
13.根据权利要求12所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，所述代谢组的二维信息通过质谱成像技术获得，其包括：基质辅助激光解析质谱成像技术、电喷雾解析电离成像技术、次级离子质谱成像技术中的至少之一。
14.根据权利要求12所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，所述转录组的二维信息通过空间转录组技术获得，包括基于显微成像的空间转录组技术和/或基于空间核酸标签阵列的技术。
15.根据权利要求12所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，其中，所述蛋白质组的二维信息的获得包括基于荧光抗体标签的蛋白质组技术、核酸序列标记的抗体标签和/或基于金属标签标记的抗体中的至少之一。
16.根据权利要求12所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，所述组织学的二维信息的获得包括苏木精伊红染色法、乙酰胆碱酯酶染色法染色、尼氏染色法和Masson染色中的至少之一。
17.根据权利要求1所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法(Flow2Spatial)，其特征在于，步骤(4)包括：将参考组学当作训练集，构建训练数据生成器。随后构建基于自编码器的深度学习模型，该模型通过对数据生成器模拟产生的每个空间数据进行电子切割产生条状子组织数据，进而构建空间数据和条状子组织数据间的连接。最后利用迁移学习的策略将由参考组学数据训练后的模型用于真实目标组学空间信息的重构。
18.根据权利要求17所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，所述编码器包括平行切条模拟、随机取点模拟和激光切割模拟中的至少之一；所述解码器包括机器学习模型、深度学习模型和概率推断模型中的至少之一。
19.根据权利要求1所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的方法，其特征在于，步骤(4)包括：参考组学的生物分子的二维空间分布信息训练学习模型，然后利用训练的学习模型以及目标组学的生物分子的一维信息预测出目标组学分子的二维空间信息。
20.一种用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其特征在于，其包括设置于基板的切片分割区，其包括10-500个微通道，各微通道之间存在通道壁且所述通道壁的宽度在500nm-200μm之间，各微通道分别具有入口端和出口端。
21.根据权利要求20所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其特征在于，所述各微通道平行设置，且微通道长度相等。
22.根据权利要求20所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其特征在于，进一步包括盖片，通过固定结构将所述盖片和所述切片分割区可拆卸的压在一起。
23.根据权利要求20所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其特征在于，进一步包括试剂区，所述试剂区中的试剂通过与各微通道的入口端进入各微通道。
24.根据权利要求23所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其特征在于，所述试剂区设置多个试剂收纳腔，各试剂收纳腔的一端分别与对应的一微通道的入口端连通。
25.根据权利要求23所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其特征在于，进一步包括负压区，通过所述负压区驱动试剂由所述试剂区进入微通道，达到微通道中的切割组织区。
26.根据权利要求25所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其特征在于，所述负压区设置多个收集腔，各收集腔的一端分别与对应的一微通道的出口端连通。
27.根据权利要求25所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其特征在于，至少各试剂收纳腔经微通道与对应的收集腔连通的通路能够形成封闭连接。
28.根据权利要求25所述的用于获得目标组学中生物分子的空间分布的微流体装置，其特征在于，各试剂收纳腔经微通道与对应的收集腔连通的通路长度相等。
29.一种用于获得目标组学中生物分子的空间分布的迁移学习模型的构建方法，其特征在于，包括：
a.获得由组织切片得到的多个条状子组织中的目标组学的生物分子的信息；
b.获得相邻组织切片中参考组学的生物分子的二维空间分布信息；和
c.基于参考组学的生物分子的二维空间分布信息训练学习模型，然后利用训练的学习模型以及目标组学的生物分子的一维信息预测出目标组学分子的二维空间信息。
30.一种用于获得目标组学中生物分子的空间分布的设备，其特征在于，
至少一个处理器；和
与所述至少一个处理器通信连接的存储器；其中，
所述存储器存储有可被所述至少一个处理器执行的指令，所述指令被所述至少一个处理器执行，以使所述至少一个处理器能够执行根据权利要求29所述的构建方法。
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