JP2007524382A - 心血管障害の処置のためのヒトgタンパク質共役型レセプターおよびそのモジュレーター - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、候補化合物がGタンパク質共役型レセプター(GPCR)のモジュレーターであるか否かを同定する方法に関する。いくつかの実施形態において、GPCRは哺乳動物、好ましくはヒトである。いくつかの実施形態において、GPCRは心筋細胞によって内因的に発現される。いくつかの実施形態において、GPCRはGqにカップリングする。いくつかの実施形態において、GPCRはイノシトール1,4,5−三リン酸(IP3)の細胞内レベルを増加させる。いくつかの実施形態において、GPCRのモジュレーターは心筋細胞肥大のモジュレーターである。本発明は、さらに、GPCRのモジュレーターを使用する方法に関する。好ましいモジュレーターは逆アゴニストおよびアンタゴニストである。本発明の逆アゴニストおよびアンタゴニストは肥大性心筋障害および鬱血性心不全、特に、心筋梗塞後再形成、心臓弁疾患、維持された心臓後負荷、心筋炎および家族性肥大性心筋障害に由来する肥大性心筋障害を含めた心臓病の予防または治療用の治療剤として有用である。
(A.鬱血性心不全)
鬱血性心不全(CHF)は毎年500,000を超える新しい症例が診断されるほぼ500万人のアメリカ人に罹る。定義によると、CHFは、心臓病が拍出を低下させ、静脈圧を増加させ、不全となる心臓の進行性劣化を引き起こす分子異常を伴う臨床的症候群である(心臓病:Pathophysiology、 Molecular Biology、およびClinical Management、 Katz、AM、Lippincott Williams and Wilkils、2000から)。数十年の研究にもかかわらず、CHFの原因の詳細な理解は依然として不明瞭である。しかしながら、科学的および臨床的知見は、該病気のプロセスの初期相が「心臓肥大」(また、「肥大性心筋障害」)として知られたストレスに対する心筋の適合不良応答よりなることを明瞭に示している。軽減されない高血圧の状況における心臓への慢性的過剰負荷、弁疾患、または組織損傷(心筋梗塞)は肥大性増殖応答をもたらし、これは、心臓拍出が一時的に回復する限りは最初は適合するが、減時に徐々に適合不良となり、その結果、収縮機能が減少し、心臓が拡張され、不全となる。5年の生存率は、一旦心不全が兆候的になれば、50%未満であるので、心筋肥大を加速させる分子的プロセスをコードしない心不全のいずれの定義も、この症候群の主な臨床的特徴を見逃している。
多数のレセプタークラスがヒトに存在するが、現在までに、最も豊富であって治療的に関連するのはGタンパク質共役型レセプター(GPCR)クラスによって示される。ヒトゲノム内に30,000〜40,000程の遺伝子があると見積もられ、これらのうち、ほぼ2%がGPCRをコードすると見積もられる。
RUP40は、セクレチンファミリーのそれと同様なヘプタラセンドメインを含むクラスIIのGPCRである。ヒトRUP40ポリペプチドを高度するヌクレオチド配列は配列番号1に与えられる。該コードされたヒトRUP40ポリペプチドのアミノ酸配列はアミノ酸配列番号2に与えられる。ラットRUP40ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号3に与えられる。該コードされたラットRUP40ポリペプチドのアミノ酸配列番号4に与えられる。部分的マウスRUP40ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号5に与えられる。該コードされた部分マウスRUP40ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号6に与えられる。
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1,346
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸配列にコードされたアミノ酸配列であって、その核酸配列は、配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーと配列番号8に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーとを使用して、ヒトcDNAサンプルについて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことにより得られる、アミノ酸配列。
(g)配列番号4のアミノ酸1〜993
(h)配列番号4のアミノ酸994〜1,349
(i)配列番号4のアミノ酸954〜1,000
(j)配列番号6のアミノ酸1〜141;
または配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸配列の生物学的活性フラグメント;または配列番号2もしくは配列番号4の構成的に活性化された変異体、またはその生物学的活性フラグメント。
上記の方法は、以下の工程:
(i)上記候補化合物を上記レセプターに接触させる工程;
(ii)上記レセプター機能が、調節されているか否かを決定する工程;
を包含し、ここでレセプター機能の変化は、上記候補化合物がRUP40 GPCRの調節因子であることを示す。
いくつかの実施形態では、上記レセプターは、シグナルペプチドのタンパク質分解切断を、さらに包含する。
(a)候補化合物とRUP40 GPCRとを接触させる工程(上記レセプターがGタンパク質に結合し、上記レセプターは、以下の群:
(i)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(ii)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(iii)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(iv)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(v)内因性RUP40レセプターをコードする核酸にコードされたアミノ酸配列であって、その核酸配列は、配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーと配列番号8に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーとを使用して、ヒトcDNAサンプルについてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことにより得られる、アミノ酸配列;
(vi)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(vii)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(viii)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(ix)配列番号4のアミノ酸954〜1,000;
(x)配列番号6のアミノ酸1〜141;
または配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸配列の生物学的活性フラグメント;または配列番号2もしくは配列番号4の構成的に活性化された変異体、またはその生物学的活性フラグメント;
から選択されるアミノ酸配列を含む)。
を包含し、ここでレセプター機能の変化は、上記候補化合物が、心血管障害の調節因子であることを示す。
いくつかの実施形態では、上記レセプターは、シグナルペプチドのタンパク質分解切断を、さらに包含する。
(a)心筋梗塞後のリモデリング;
(b)弁疾患;
(c)持続性心後負荷(sustained cardiac afterload)
(d)心筋炎;および
(e)家族性肥大性心筋症
からなる群より選択される障害から発症する、肥大性心筋症である。
(a)組換えRUP40 GPCRの発現が可能な条件下で、RUP40 GPCR発現宿主細胞を培養する工程(上記宿主細胞は、
(i)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(ii)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(iii)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(iv)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(v)内因性RUP40レセプターをコードする核酸にコードされたアミノ酸配列であって、その核酸配列は、配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーと配列番号8に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーとを使用して、ヒトcDNAサンプルについてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことにより得られる、アミノ酸配列;
(vi)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(vii)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(viii)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(ix)配列番号4のアミノ酸954〜1,000;
(x)配列番号6のアミノ酸1〜141;
または配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸配列の生物学的活性フラグメント;または配列番号2もしくは配列番号4の構成的に活性化された変異体、またはその生物学的活性フラグメント;
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、上記組換えRUP40 GPCRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされる);
(b)工程(a)のRUP40 GPCR発現宿主細胞と候補化合物とを接触させる工程;
(c)コントロール宿主細胞と工程(b)の候補化合物とを接触させる工程であって、上記コントロール宿主細胞は、組換えRUP40 GPCRタンパク質を発現しない、工程;
(d)工程(a)の宿主細胞および工程(c)のコントロール宿主細胞からの上記組換えRUP40 GPCRと相互作用する上記候補化合物の調節作用を測定する工程;ならびに
(e)上記宿主細胞に対する候補化合物の調節効果をコントロール宿主細胞に対する候補化合物の調節効果と比較する工程
を包含する、方法。
(a)組換えRUP40 GPCRの発現を可能とするであろう条件下でRUP40 GPCR−発現宿主細胞を培養し、該宿主細胞は:
(i)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(ii)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(iii)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(iv)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(v)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列および配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得ることができ;
(vi)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(vii)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(viii)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(ix)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(x)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;または配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む該組換えRUP40 GPCRをコードするヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされており;
(b)工程(a)のRUP40 GPCR−発現細胞の第一の集団を該RUP40 GPCRの公知のリガンドと接触させ;
(c)工程(a)のRUP40 GPCR−発現細胞の第二の集団を候補化合物と、およびヒトRUP40 GPCRリガンドと接触させ;
(d)工程(c)の候補化合物とコントロール宿主細胞を接触させ、ここで、該コントロール宿主細胞は組換えRUP40 GPCRタンパク質を発現せず;
(e)工程(b)、工程(c)および工程(d)の細胞からの、既知のRUP40 GPCRリガンドの存在下または不存在下で、組換えRUP40 GPCRと相互作用する候補化合物の調節効果を測定し;次いで
(f)工程(b)、工程(c)および工程(d)から決定された候補化合物の調節効果を比較する;
工程を含む、候補化合物がRUP40 GPCRのモジュレーターであるか否かを決定する方法に関する。
(a)組換えRUP40 GPCRの発現を可能とするであろう条件下でRUP40 GPCR−発現宿主細胞を培養し、該宿主細胞は:
(i)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(ii)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(iii)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(iv)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(v)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得ることができ;
(vi)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(vii)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(viii)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(ix)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(x)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;または配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む該組換えRUP40 GPCRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされており;
(b)工程(a)のRUP40 GPCR−発現宿主細胞の第一の集団を候補化合物と接触させ;
(c)工程(a)のRUP40 GPCR−発現細胞の第二の集団を工程(b)の候補化合物と接触させず;
(d)工程(b)の候補化合物にコントロール宿主細胞を接触させ、ここで、該コントロール宿主細胞は組換えRUP40 GPCRタンパク質を発現せず;
(e)工程(b)および工程(c)の細胞からの、および工程(d)の細胞からの、組換えRUP40 GPCRタンパク質と相互作用する、候補化合物の調節効果を測定し;次いで、
(f)工程(b)および工程(c)から、および工程(d)から決定された候補化合物の調節効果を比較する;
工程を含む、候補化合物がRUP40 GPCRのモジュレーターであるかないかを決定する方法に関する。
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得ることができ;
(f)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(g)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(h)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(i)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(j)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント、または配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含み;該方法はレセプターを第二の局面のモジュレーターと接触させる工程を含む。
(a)心梗塞後再形成;
(b)心臓弁疾患;
(c)維持された心臓後負荷;
(d)心筋炎;および
(e)家族性肥大性心筋障害
からなる群より選択される障害に由来する肥大性心筋障害に対する予防または治療を必要とするものである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得ることができ;
(f)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(g)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(h)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(i)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(j)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;または配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化されて変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む。
いくつかの実施形態において、該個体は:
(a)心筋梗塞後再形成;
(b)心臓弁疾患;
(c)維持された心臓後負荷;
(d)心筋炎;および
(e)家族性肥大性心筋障害
からなる群より選択される障害に由来する肥大性心筋障害に対する予防または治療を必要とするものである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターはアゴニストまたはアンタゴニストである。
(a)心筋梗塞後再形成;
(b)心臓弁疾患;
(c)維持された心臓後負荷;
(d)心筋炎;および
(e)家族性肥大性心筋障害
からなる群より選択される障害に由来する。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
(a)心筋梗塞後再形成;
(b)心臓弁疾患;
(c)維持された心臓後負荷;
(d)心筋炎;および
(e)家族性肥大性心筋障害
からなる群より選択される障害に由来する。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得ることができ;
(f)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(g)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(h)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(i)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(j)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体;またはその該生物学的に活性なフラグメントを含み;該方法は
(a)候補化合物の存在下、または不存在下でレセプターをGPCRの標識された既知のリガンドと接触させ;次いで、
(b)該標識された既知のリガンドの結合が候補化合物の存在下で阻害されるか否かを決定する;
工程を含み、ここで、該阻害はRUP40 GPCRのリガンドである候補化合物を示す。
(a)組換えRUP40 GPCRの発現を可能とするであろう条件下でRUP40 GPCR−発現宿主細胞を培養し、該宿主細胞は:
(i)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(ii)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(iii)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(iv)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(v)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得ることができ;
(vi)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(vii)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(viii)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(ix)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(x)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;または配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む該組換えRUP40 GPCRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされており;
(b)工程(a)のRUP40 GPCR−発現細胞の第1の集団を該RUP40 GPCRの標識された既知のリガンドに暴露し;
(c)工程(a)のRUP40 GPCR−発現細胞の第2の集団を該化合物および工程(b)の該RUP40 GPCRの標識された既知のリガンドに暴露し;
(d)工程(b)および工程(c)の該RUP40 GPCR−発現細胞の標識された既知のリガンドの結合を測定し;次いで、
(e)該RUP40 GPCRへの標識された既知のリガンドの結合を、工程(b)および工程(c)のRUP40 GPCR−発現細胞と比較する;
工程を含み、ここで、該化合物の存在下における該RUP40 GPCRの標識された既知のリガンドの結合の阻害はRUP40 GPCRのリガンドである該化合物を示すことを特徴とする候補化合物がRUP40 GPCRのリガンドであるか否かを決定する方法に関する。
(a)組換えRUP40 GPCRの発現を可能とするであろう条件下でRUP40 GPCR−発現宿主細胞を培養し、該宿主細胞は;
(i)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(ii)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(iii)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(iv)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(v)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得ることができ;
(vi)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(vii)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(viii)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(ix)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(x)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント、または配列番号2または4のアミノ酸配列のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む該組換えRUP40 GPCRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされており;
(b)工程(a)のRUP40 GPCR−発現細胞からの膜を調製し;
(c)工程(b)の膜調製物の第1の集団を工程(b)の該RUP40 GPCRの標識された既知のリガンドに暴露し;
(d)工程(b)の膜調製物の第2の集団を候補化合物および該RUP40 GPCRの標識された既知のリガンドに暴露し;
(e)工程(c)および工程(d)の膜調製物への該RUP40 GPCRの標識された既知のリガンドの結合を測定し;次いで、
(f)該RUP40 GPCRの標識された既知のリガンドの、工程(c)および工程(d)の膜調製物への結合を比較する;工程を含み、ここで、該化合物の存在下における該RUP40 GPCRの標識された既知のリガンドの結合の阻害はRUP40 GPCRのリガンドである該化合物を示すことを特徴とする、候補化合物がRUP40 GPCRのリガンドであるか否かを決定する方法に関する。
(a)放射性同位体;
(b)酵素;および
(c)フルオロフォア
からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、該標識は放射性同位体である。なおいくつかの実施形態において、該標識は3H、14C、35S、および125Iからなる群より選択される。
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;および
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得ることができ;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;または配列番号2のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む。
(a)第2の局面のモジュレーターをトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与し、または投与せず;
(b)該モジュレーターの投与が;
(i)湿潤または乾燥心臓重量の低下;
(ii)湿潤または乾燥心臓重量/体重の比率の低下;
(iii)心筋細胞の断面積の低下;および
(iv)ANF遺伝子の誘導のレベルの低下;
からなる群より選択される効果を有するか否かを決定する;
工程を含む、ここで、該決定は、鬱血性心不全または肥大性心筋障害に対する予防または治療で効果を有するモジュレーターを示すことを特徴とする、第2の局面のモジュレーターが鬱血性心不全または肥大性心筋障害に対する予防または治療で効果を有するか否かを同定するための、鬱血性心不全または肥大性心筋障害に対する該素因を呈し、または鬱血性心不全または肥大性心筋障害を発現する第10の局面のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の使用方法をその要旨とする。
(a)請求項1の方法による上記モジュレーターを同定し;次いで、
(b)(a)で同定されたモジュレーターを合成する;
工程を含む、RUP40 GPCRのモジュレーターの製法をその要旨とする。
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得ることができ;
(f)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(g)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(h)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(i)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(j)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント、または配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含むレセプターである。
(a)所望により、化合物の構造を決定し、次いで、
(b)化合物または薬学的薬剤、または化合物の名称または構造を供する;
ことを含む。
(a)所望により、化合物の構造を決定し;
(b)所望により、化合物の名称または構造を供し;次いで、
(c)化合物を供し、または合成する;
ことを含む。
(定義)
レセプターに関連する科学文献は、レセプターに対して種々の効果を有するリガンドに言及するのに多数の用語を採用している。明瞭性および整合性のため、以下の定義を本特許書類を通じて用いる。これらの定義がこれらの用語についての他の定義とコンフリクトする程度に、以下の定義が支配する。
心筋梗塞による心筋組織の喪失は、心室に課される維持された過剰の血行動態負荷をもたらす。心室肥大は、心臓が増大した負荷を補償する主なメカニズムの一つを構成する。しかしながら、血行動態過剰負荷に直面して心臓性能を維持するためのこの適合の能力は有限であり、慢性的に維持される場合、適合不良となる。徐々に、適合した肥大表現型は、肥大した心室が暫時膨張し、収縮機能が弱まるにつれ、明白な心不全に転じる。心臓における心筋梗塞に対する適合したおよび適合不良の応答の自然歴を「リモデリング」という。
後負荷は、心臓から循環系への血液の流れに対する抵抗性の尺度である。高い全身血圧または大動脈の異常な狭化(縮窄)は心臓に課される後負荷を増加させる。
(1)病気の予防;例えば、病気、疾患または障害に対して素因があり得るが、病気の病理学または徴候学を未だ経験または表示しない個体において病気、疾患または障害を予防すること、
(2)病気の阻害;例えば、病気、疾患または障害の病理学または徴候学を経験している、または表示している個体において病気、疾患、または障害を阻害すること(すなわち、病理学および/または徴候学のさらなる発展の組織)、および
(3)病気の軽減;例えば、病気、疾患または障害の病理学または徴候学を経験または表示している個体において病気、疾患または障害を軽減すること(すなわち、病理学および/または徴候学の逆行)。
以下のセクションの順序は表象的な効率のために記載され、開示または後の請求の範囲を制限することを意図せず、またはそのように解釈されるべきではない。
(1.注目するGPCRポリペプチド)
本発明のRUP40 GPCRは:
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得ることでき;
(f)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(g)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(h)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(i)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(j)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得ることができ;
(f)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(g)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(h)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(i)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(j)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.1%、少なくとも99.2%、少なくとも99.3%、少なくとも99.4%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%、または少なくとも99.9%同一であるアミノ酸配列を含む該RUP40 GPCRの改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。パーセント同一性は公知コンピュータプログラムを用いて慣用的に決定することができる。
いくつかの実施形態において、2つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性を決定するための方法は、Brutlag et al.[Comp App Biosci(1990)6:237−245;その開示をここで引用してその全体を援用する]のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータプログラムを用いて、全体的配列整列ともいう、問い合わせ配列(例えば、配列番号2のアミノ酸配列)および質問すべき配列の間の最良の総じてのマッチを決定する方法である。配列整列においては、問い合わせおよび質問配列は共にアミノ酸配列である。該全体的配列整列の結果は、パーセント同一性で表される。FASTDBアミノ酸整列で用いられる好ましいパラメータは:マトリックス=PAM 0、k−tuple=2、ミスマッチペナルティ=1、接合ペナルティ=20、ランダム化グループ25、長さ=0、カットオフスコア=1、ウィンドウサイズ=配列の長さ、ギャップペナルティ=5、ギャップサイズペナルティ=0.05、ウィンドウサイズ=247または質問されたアミノ酸配列の長さのいずれか短い方である。
ある実施形態において、注目するポリペプチドは融合タンパク質であって、例えば、アフィニティータグドメインまたはレポータードメインを含むことができる。適当なアフィニティータグは、もう1つの部位、通常はもう1つのポリペプチド、最も通常には抗体に対して特異的に結合することができるいずれかのアミノ酸配列を含む。適当なアフィニティータグは、上記分野で知られているように、エピトープタグ、例えば、V5タグ、FLAGタグ、(ヘマグルチミンインフルエンザウィルスからの)HAタグ、mycタグ等を含む。適当なアフィニティータグは、上記分野で知られているように、結合基質が知られているドメイン、例えば、HIS、GSTおよびMBPタグ、および特異的結合パートナー、例えば、抗体、特にモノクローナル抗体が入手できる他のタンパク質からのドメインも含む。適当なアフィニティータグは、特異的に結合することができ、適当な結合パートナー、例えば、IgG Fcレセプターを用いて検出することができる、IgG Fc領域のようないずれかのタンパク質−タンパク質相互作用ドメインも含む。そのような融合タンパク質が、欠失された、または別のアミノ酸で置換されたいずれかのそのN末端メチオニン残基を有するGPCRとイン−フレーム融合した異種N末端ドメイン(例えば、エピトープタグ)を含むことができると明示的に考えられる。
核酸を操作するための遺伝子暗号および組換え技術、および前記したように注目するGPCRポリペプチドのアミノ酸配列は公知であるため、注目するGPCRポリペプチドをコードする核酸の組換えおよび生産は当業者の十分に技量内のものである。ある実施形態においては、標準的な組換えDNA技術(Ausubel,et al.,Short Protocols in Molecular Biology, 第3版, Wiley & Sons,(1995);Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第二版,(1989) Cold Spring Harbor, N.Y.)方法が用いられる。例えば、GPCRコーディング配列は、本明細書中に記載する必要がない種々の組換え方法のいずれか1つ、またはその組合せを用いてGPCRコーディング配列のライブラリーから単離することができる。また、タンパク質をコードする核酸配列におけるヌクレオチドの引き続いての置換、欠失および/または付加を標準的な組換えDNA技術を用いて行うこともできる。
本発明は、さらに、対象の核酸を含む(「構築体」ともいう)ベクターを提供する。本発明の多くの実施形態において、対象の核酸配列は、該配列が、例えば、プロモーターを含めた発現制御配列に連結された後、宿主において発現される。また、対象の核酸は、典型的には、エピソームとして、または宿主の染色体DNAの一体的部分として宿主細胞中で複製することができる発現ベクターに入れられる。通常、発現ベクターは、所望のDNA配列で形質転換された細胞の検出を可能とするために選択マーカー、例えば、テトラサイクリンまたはネオマイシンを含む(例えば、ここで引用して援用する米国特許第4,704,362号参照)。単一およびデュアル発現カセットベクターを含めたベクターは上記分野でよく知られている(Ausubel,et al.,Short Protocols in Molecular Biology, 第3版, Wiley & Sons,(1995);Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第二版,(1989) Cold Spring Harbor, N.Y.)。適当なベクターはウィルスベクター、プラスミド、コスミド、人工染色体(ヒト人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体等)、ミニ−染色体等を含む。レトロウィルス、アデノウイルスおよびアデノ−関連ウィルスベクターを用いることができる。
本発明は、さらに、対象の核酸を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。適当な宿主細胞は原核生物、例えば、細菌細胞(例えば、E.coli)、ならびに真核生物細胞、例えば、動物細胞(例えば、昆虫、哺乳動物、魚類、両生類、鳥類または爬虫類細胞)、植物細胞(例えば、トウモロコシまたはArabidopsis細胞)、真菌細胞(例えば、S.cerevisiae細胞)を含む。ある実施形態においては、注目するポリペプチドをコードする核酸を発現するのに適したいずれの細胞も宿主細胞として用いることができる。通常、動物宿主細胞系が用いられ、その例は以下の通りである:サル腎臓細胞(COS細胞)、SV40によって形質転換されたサル腎臓CVI細胞(COS−7、ATCC CRL 165 1);ヒト胚腎臓細胞(HEK−293[「293」]、Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977));HEK−293T[「293T」]細胞;ベビーハムスター腎臓細胞(BHK,ATCC CCL 10);チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO,Urlaup and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77:4216,(1980);シリアンゴールデンハムスター細胞MCB3901(ATCC CRL−9595);マウスsertoli細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243−251(1980));サル腎臓細胞(CVI ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76,ATCC CRL−1587);ヒト頸部癌腫細胞(HELA,ATCC CCL 2);イヌ腎臓細胞(MDCK,ATCC CCL 34);バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138,ATCC CCL 75);ヒト肝臓細胞(hep G2,HB 8065);マウス乳癌(MMT 060562、ATCC CCL 51);TRI細胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44−68(1982));NIH/3T3細胞(ATCC CRL−1658);およびマウスL細胞(ATCC CCL−1)。ある実施形態においては、メラノフォアを用いる。メラノフォアは下等脊椎動物で見出される皮膚細胞である。関連する材料および方法は米国特許第5,462,856号および米国特許第6,051,386号の開示に従うであろう。これらの特許の開示をここで引用してその全体を援用する。さらなる細胞系は当業者に明らかであり、広く種々の細胞系がAmerican Type Culture Collection,10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110−2209から入手できる。
(1.遺伝的GPCRスクリーニングアッセイ技術)
Gタンパク質レセプターが活性となると、それはGタンパク質(例えば、Gq、Gs、Gi、Go、Gz)に結合し、GTPのGタンパク質への結合を刺激する。次いで、Gタンパク質はGTPaseとして作用し、GTPをGDPにゆっくりと加水分解し、それにより、正常な条件下では、レセプターは脱活性化されるようになる。しかしながら、活性化されたレセプターはGDPをGTPに変化させ続ける。GTPの非−加水分解性アナログ(35S)GTPγSを用いて、活性化されたレセプターを発現する膜への増強された結合をモニターすることができる。(35S)GTPγSを用いて、リガンドの不存在下および存在下において膜へのGタンパク質カップリングをモニターすることができる、と報告されている。とりわけ、当業者によく知られかつ入手可能なこのモニタリングの例は、1995年にTraynorおよびNahorskiによって報告された。このアッセイシステムの好ましい使用は候補化合物の最初のスクリーニングである。なぜならば、該システムは、レセプターの細胞内ドメインと相互作用する特定のGタンパク質にかかわらず、全てのGタンパク質共役型レセプターに一般に適用できるためである。
「ジェネリック」Gタンパク質共役型レセプターアッセイ(すなわち、アゴニスト、逆アゴニストまたはアンタゴニストである化合物を選択するためのアッセイ)を用いて一旦候補化合物が同定されれば、いくつかの実施形態においては、レセプター部位に該化合物が相互作用したことを確認するためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「ジェネリック」アッセイによって同定された化合物はレセプターに結合しないであろうが、その代わり、細胞内ドメインからのGタンパク質を単に「カップリング解除」させることができる。
Gsは酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。他方、Gi(およびGzおよびGo)はアデニリルシクラーゼを阻害する。アデニリルシクラーゼはATPのcAMPへの変換を触媒し;かくして、Gsタンパク質にカップリングする活性化されたGPCRはcAMPの増大した細胞レベルと関連する。他方、Gi(またはGz、Go)タンパク質にカップリングする活性化されたGPCRはcAMPの減少した細胞レベルに関連する。一般に、「Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission」,第8章,From Neuron To Brain(第3版) Nichols,J.G.et al.編,Sinauer Associates,Inc.(1992)参照。かくして、cAMPを検出するアッセイを利用して、候補化合物が、例えば、レセプターに対して逆アゴニストであるかを決定することができる(すなわち、そのような化合物はcAMPのレベルを減少させるであろう)。cAMPを測定するための上記分野で知られた種々のアプローチを利用することができ;いくつかの実施形態においては、好ましいアプローチはELISAベースのフォーマットでの抗cAMP抗体の使用に頼る。利用できるもう1つのタイプのアッセイは全細胞二次メッセンジャーレポーターシステムアッセイである。遺伝子に対するプロモーターは特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を駆動する。環状AMPは、次いで、cAMP応答エレメントと呼ばれる特異的部位におけるプロモーターに結合し、遺伝子の発現を駆動するcAMP−応答性DNA結合タンパク質または転写因子(CREB)の結合を促進することによって遺伝子発現を駆動する。レポーター遺伝子、例えば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ前に多数のcAMP応答エレメントを含有するプロモーターを有するレポーターシステムを構築することができる。かくして、活性化されたGs−連結レセプターは、次いで、遺伝子を活性化するcAMPの蓄積、およびレポータータンパク質の発現を引き起こす。次いで、標準的な生化学アッセイ(Chen et al.1995)を用いて、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を検出することができる。
Gqは酵素ホスホリパーゼCの活性化に関連し、これは、今度は、リン脂質PIP2を加水分解し、2つの細胞内メッセンジャー:ジアシルグリセロール(DAG)およびイノシトール1,4,5−三リン酸(IP3)を放出する。IP3の増加した蓄積はGq−およびGo−関連レセプターの活性化に関連する。一般に、「Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission」,第8章,From Neuron To Brain(第3版) Nichols,J.G.et al編,Sinauer Associates,Inc.(1992)参照。IP3蓄積を検出するアッセイを利用して、候補化合物が、例えば、Gq関連レセプターに対する逆アゴニストであるかを決定することができる(すなわち、そのような化合物はIP3のレベルを低下させるであろう)。また、Gq−関連レセプターを、Gq−依存性ホスホリパーゼCがAP1エレメントを含有する遺伝子の活性化を引き起こす点で、AP1レポーターアッセイを用いて調査することができ;かくして、活性化されたGq−関連レセプターはそのような遺伝子の発現の増加の証拠となり、それにより、それに対する逆アゴニストはそのような発現の減少の証拠となり、およびアゴニストはそのような発現の増加の証拠となる。そのような検出のための商業的に入手可能なアッセイが利用できる。
逆アゴニストまたはアゴニストの直接的同定用の候補化合物のスクリーニングで用いられる内因性の構成的に活性なGPCRまたは非−内因性の構成的に活性化されたGPCRの使用は、定義により、レセプターはそれに結合した内因性リガンドの不存在下においてでさえ活性化である点で、興味深いスクリーニング挑戦を提供する。かくして、そのような化合物が逆アゴニストまたはアゴニストであり得るか、あるいはそのようなレセプターに対して効果を有しないか否かに関する理解を可能とするためのそのような差別化を目的として、候補化合物の存在下における非−内因性レセプターおよびその化合物の不存在下における非−内因性レセプターの間を区別するために、いくつかの実施形態においては、そのような区別を増強することができるアプローチを利用するのが好ましい。いくつかの実施形態において、好ましいアプローチはGPCR融合タンパク質の使用である。
Gi共役型レセプターはアデニリルシクラーゼを阻害し、従って、cAMP生産のレベルを減少させ、これはcAMPレベルの挑戦の評価をなすことができることが知られている。いくつかの実施形態においては、活性化に際して圧倒的にGiにカップリングするレセプターの活性化の指標としてcAMPの生産の減少を測定する効果的な技術は、シグナルエンハンサー、例えば、活性化に際してGsと圧倒的にカップリングする非−内因性の構成的に活性化されたレセプター(例えば、TSHR−A623I;前記参照)を、Gi連結GPCRで共トランスフェクトすることによって達成することができる。明らかなように、Gs共役型レセプターの活性化は、cAMPの生産の増加に基づいて決定することができる。Gi共役型レセプターの活性化は、cAMP生産の減少に導く。かくして、共トランスフェクションアプローチはこれらの「反対」効果を有利に開発することを意図する。例えば、発現ベクター単独での、非−内因性の構成的に活性化されたGs共役型レセプター(「シグナルエンハンサー」)の共トランスフェクションはベースラインcAMPシグナルを生じる(すなわち、Gi共役型レセプターはcAMPレベルを減少させるが、これは、構成的に活性化されたGs共役型シグナルエンハンサーによって確立されたcAMPレベルの実質的増加に対するものである)。次いで、シグナルエンハンサーを「標的レポーター」で共トランスフェクトすることによって、Gi共役型標的レセプターの逆アゴニストは測定されたcAMPシグナルを増加させ、他方、Gi共役型標的レセプターのアゴニストはこのシグナルを減少する。
(候補化合物)
上記分野で知られたいずれの分子も、本発明のGPCRの活性を調節する(増加させる、または減少させる)その能力につきテストすることができる。活性を調節する化合物を同定するためには、候補化合物を、レセプターを発現する細胞に直接的に供することができる。
一般に、そのようなスクリーニングの結果はユニークなコア構造を有する化合物であろう;然る後、これらの化合物を好ましいコア構造(類)の周りの追加の化学的修飾に付して、その医学的特性をさらに増強することができる。そのような技術は当業者に知られており、本特許処理においては詳細には取り扱わない。
本発明は、治療上有効量の本発明のモジュレーターを治療(または予防)を必要とする個体に投与することによる治療(および予防)の方法を提供する[また、例えば、2002年8月29日にWO 02/066505として公開されたPCT出願番号PCT/IB02/01461参照;その開示をここで引用してその全体を援用する]。好ましい局面において、モジュレーターは精製されている。該個体は、好ましくは、限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、マウスなどを含めた動物であり、好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトである。
適当な投与の経路は、上記分野で知られた方法を用いる、経口、鼻腔内、直腸、経粘膜、または腸投与、筋肉内、皮下、髄質内注射を含めた非経口送達、ならびにクモ膜下腔、直接的心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、肺内(吸入)または眼内注射を含む。他の特に好ましい投与経路はエアロゾルおよびデポ処方である。本発明の医薬の徐放性処方、特にデポ剤は明示的に考えられる。いくつかの実施形態において、投与の経路は経口である。
本発明に従って用いられる薬学的または生理学的に受容可能な組成物および医薬は、賦形剤および補助剤を含む1以上の生理学的に受容可能なキャリアを用いて便宜な方法で処方することができる。適切な処方は選択された投与の経路に依存する。
本発明で用いるのに適した薬学的または生理学的に受容可能な組成物は、有効成分がその意図した目的を達成するのに十分な量で含有された組成物を含む。より具体的には、治療上有効量は、治療すべき対象の現存する兆候の進展を予防し、またはそれを軽減するのに十分な量を意味する。効果的な量の決定は、特に、本明細書中に提供された詳細な開示に徴して当業者の能力の範囲内のものであろう。
本発明は、本発明のモジュレーターでの上記治療を必要とする個体に供することを含む、本発明の障害を予防または治療する方法にとりわけ向けられる。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は心臓病である。心臓病は、限定されるものではないが、鬱血性心不全、鬱血性心筋症、心肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂、心室中隔破裂、(細菌を含めた)心内膜炎、心臓動脈瘤、肺性心、リウマチ性心疾患、および心室機能障害を含む。また、心臓病は限定されるものではないが、大動脈弁不全症、大動脈弁狭窄、大動脈弁逸脱、僧帽弁逸脱、三尖弁逸脱、僧帽弁閉鎖不全、僧帽弁狭窄、および三尖弁狭窄を含む心臓弁疾患を含む。心臓病は、さらに、限定されるものではないが、肥大型心筋症、鬱血性心筋症、大動脈弁下狭窄、肺弁下狭窄、拘束型心筋症、シャガス心筋症を含む心筋障害を含む。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は血行動態または遺伝性疾患に由来する肥大型心筋症である。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は心筋梗塞後リモデリング、心臓弁疾患、持続した心後負荷、心筋炎、および家族性肥大型心筋症からなる群より選択される障害に由来する肥大型心筋症である。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は、先天性心臓欠陥である。先天性機能障害は、限定されるものではないが、大動脈縮窄、大動脈肺動脈中隔欠損、ファロー三徴症、心室中隔欠損症、および家族性肥大型心筋症を含む。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は、肥大した心臓と共に提示される障害である。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは経口的に生物学的利用可能である。いくつかの実施形態において、モジュレーターは経口的に摂取される薬学的組成物にて個体に供される。好ましくは、個体は哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
RUP40レセプターの機能を調節する(すなわち、増加させる、減少させる、またはブロックする)剤は、候補化合物をRUP40レセプターと接触させ、RUP40レセプターの機能に対する候補化合物の効果を測定することによって同定することができる。RUP40レセプターの機能を調節する化合物の選択性は、RUP40レセプターに対する効果を、RUP40以外の複数のGタンパク質共役型レセプターに対するその効果と比較することによって見積もることができる。いくつかの実施形態において、内因性ヒトRUP40レセプターの機能を調節する化合物の選択性は、内因性ヒトRUP40レセプターに対する効果を、RUP40以外の複数の内因性ヒトGタンパク質共役型レセプターに対するその効果と比較することによって見積もることができる。RUP40レセプターの機能を調節する化合物の同定に続き、そのような候補化合物は、さらに、限定されるものではないが、インビボモデルを含めた他のアッセイでテストして、それらの活性を確認または定量することができる。RUP40レセプターの機能のモジュレーターは、正常または異常RUP40レセプター機能が関連する病気および生理学的状態の予防または治療で治療上有用である。
(a)RUP40レセプターを含む複数の細胞を候補化合物と接触させ、または接触させず;
(b)候補化合物と接触させた細胞におけるRUP40レセプター発現のレベル、および候補化合物と接触させなかった細胞におけるRUP40レセプター発現のレベルを測定し;次いで、
(c)候補化合物と接触させた細胞におけるRUP40レセプター発現のレベルを、候補化合物と接触させなかった細胞におけるRUP40レセプター発現のレベルを比較する工程を含み;ここで、候補化合物と接触させなかった細胞におけるRUP40レセプター発現のレベルと比較した候補化合物と接触させた細胞におけるRUP40レセプター発現のレベルの低下は、候補化合物が細胞においてRUP40レセプターの発現を低下させる剤であることを示す。
(a)RUP40レセプターを含む複数の細胞を候補化合物と接触させ、または接触させず;
(b)候補化合物と接触させた細胞におけるRUP40レセプター発現のレベルおよび候補化合物と接触させなかった細胞におけるRUP40レセプター発現のレベルを測定し;次いで、
(c)候補化合物と接触させた細胞におけるRUP40レセプター発現のレベルを、候補化合物と接触させなかった細胞におけるRUP40レセプター発現のレベルと比較する工程を含み、ここで、候補化合物と接触させなかった細胞におけるRUP40レセプター発現のレベルと比較した、候補化合物と接触させた細胞におけるRUP40レセプター発現のレベルの低下は、候補化合物が心臓病を減少させる、またはブロックさせる剤であることを示す。
A.トリチウムガスでの接触還元−この手法は、通常、高い特異的活性の産物を生じ、ハロゲン化または不飽和前駆体を必要とする
B.ホウ水素化ナトリウム[3H]での還元−この手法はむしろ高価であって、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどのような還元可能な官能基を含む前駆体を必要とする
C.水素化アルミニウムリチウム[3H]での還元−この手法は、ほとんど理論的な特異的活性にて産物を供する。また、それは、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどのような還元可能な官能基を含有する前駆体を必要とする
D.トリチウムガス暴露標識−この手法は、適当な触媒の存在下で、交換可能なプロトンを含む前駆体をトリチウムガスに暴露することを含む
E.ヨウ化メチル[3H]を用いるN−メチル化−この手法は、通常、適当な前駆体を高い特異的活性のヨウ化メチル[3H]で処理することによってO−メチルまたはN−メチル(3H)産物を調製するのに使用される。この方法は、一般に、例えば、約70〜90Ci/ミリモルのようなより高い特異的活性を可能とする。
A.サンドマイヤー(Sandmeyer)および類似の反応−この手法は、アリールまたはヘテロアリールアミンを、テトラフルオロホウ酸塩のようなジアゾニウム塩に、引き続いて、Na125Iを用いて125I標識化合物に変換する。示された手法はJ. Org.Chem.2002,67,943−948においてZhu,D.−G.および共同研究者によって報告された
B.フェノールのオルト125ヨウ素化−この手法は、J.Labeled Compd Radiopharm.1999,42,S264−S266においてCollier,T.L.および共同研究者によって報告されているようにフェノールのオルト位置における125Iの取り込みを可能とする
C.125Iでの臭化アリールおよびヘテロアリール交換−この方法は、一般に、2工程プロセスである。最初の工程は、トリ−アルキルスズハライドまたはヘキサアルキルニスズ[例えば、(CH3)3SnSn(CH3)3]の存在下で、例えば、Pd触媒反応を用いる[すなわち、Pd(Ph3P)4]、またはアリールまたはヘテロアリールリチウムを介する、臭化アリールまたはヘテロアリールの対応するトリ−アルキルスズ中間体への変換である。示された手法は、J.Labeled Compd Radiopharm.2001,44,S280−S282においてBas,M.−D.および共同研究者によって報告された。
(内因性ヒトRUP40の全長クローニング)
内因性ヒトRUP40をコードするポリヌクレオチドはClontech多重組織cDNAパネル、カタログ番号K1425−1、具体的には、ヒト胎児脾臓第一鎖cDNA成分からクローン化した。
5’−ATATGGTACCATGAAATCCCCAAGGAGAACCACTTTGTGCC−3’(配列番号7;アンチセンス)
5’−ATATGCGGCCGCTTAGTTGAGCAACGAAGAAGCACTGGATGAG−3’(配列番号8センス)
を用い、Advantage HF−2ポリメラーゼ(Clontechカタログ番号K1914−y)を用いるポリメラーゼ連鎖反応によって生じさせた。アンチセンスプライマーは下線を施したKpn1制限部位、および太文字/イタリック体開始コドンを含む。センスプライマーは下線を施したNot1制限部位、および太文字/イタリック体の停止コドンを含む。
(レセプターの発現)
種々の細胞がタンパク質の発現のための技術で入手可能であるが、哺乳動物細胞またはメラノフォアを利用するのが最も好ましい。この一番の理由は現実性、すなわち、GPCRの発現のための例えば酵母細胞の利用に基づいて予測され、可能であれば、哺乳動物系で進化したレセプター−カップリング、遺伝的メカニズムおよび分泌経路を含まない(事実、酵母の場合には含まない)非−哺乳動物細胞をプロトコルに導入し;かくして、潜在的使用として、非−哺乳動物細胞で得られた結果は哺乳動物細胞またはメラノフォアから得られたのと同程度には好ましくない。哺乳動物細胞のうち、CHO、COS−7、293および293T細胞は特に好ましいが、利用される特異的哺乳動物細胞は当業者の特別な用語に基づいて予測できる。いくつかの実施形態において、心筋細胞が好ましい。実施例8を含めたメラノフォアに関連し、後記参照。
1日において、6×106/10cm皿の293細胞ウェルを平板培養する。2日に、2つの反応試験管を調製する(各試験管に従う割合はプレート当たりである):試験管Aは4μgDNA(例えば、pCMVベクター;レセプターcDNAを持つpCMVベクター)を0.5mLの無血清DMEM(Gibco BRL)中で混合することによって調製した;試験管Bは、0.5mLの無血清DMEM中で24μLのリポフェクタミン(Gibco BRL)を混合することによって調製した。試験管AおよびBを逆さにすることによって(数回)混合し、続いて、室温で30〜45分間インキュベートした。混合物を「トランスフェクション混合物」という。平板培養した293細胞を1×PBSで洗浄し、続いて、5mLの無血清DMEMを添加する。1mLのトランスフェクション混合物を細胞に加え、続いて、37℃/5%CO2にて4時間インキュベートする。トランスフェクション混合物を吸引によって除去し、続いて、10mLのDMEM/10%胎児ウシ血清を加えた。細胞を37℃/5%CO2でインキュベートする。48時間のインキュベーションの後、細胞を収穫し、分析のために利用する。
ほぼ12×106の293細胞を15cmの組織培養プレート上で平板培養する。10パーセントの胎児ウシ血清および1パーセントのピルビン酸ナトリウム、L−グルタミン、および抗生物質を含有するDME高グルコース培地中で増殖させる。293細胞の24時間の平板培養に続き(または〜80%密集まで)、12μgのDNA(例えば、レセプターcDNAを含むpCMVベクター)を用いて細胞をトランスフェクトする。12μgのDNAを60μLのリポフェクタミンおよび2mLのDME高グルコース培地(血清無し)と組合わせる。培地を平板から吸引し、細胞を血清を含まない培地で1回洗浄する。DNA、リポフェクタミンおよび培地混合物を10mLの血清を含まない培地と共にプレートに添加する。37℃における4〜5時間のインキュベーションに続き、培地を吸引し、血清を含有する25mLの培地を加える。トランスフェクションから24時間後に、培地を再度吸引し、血清を含む新鮮な培地を加える。トランスフェクションから48時間後、培地を吸引し、最終濃度500μg/mLのゲネチシン(G418薬物)を含有する血清を含む培地を加える。トランスフェクトされた細胞は、今や、G418抵抗性遺伝子を含有する積極的にトランスフェクトした細胞についての選択を受ける。培地は選択が起こるので4〜5日ごとに取り替える。選択の間、細胞を増殖させて安定なプールが得られ、安定なクローン選択のために分ける。
(GPCR活性化の評価のためのアッセイ)
種々のアプローチが、哺乳動物GPCRの活性化の評価で利用できる。以下に例示する;当業者であれば、当業者の用語に優先的に有益である技術を決定する能力が備わる。
Gタンパク質共役型レセプターが、リガンド結合または構成的活性化の結果のいずれかとして、その活性状態にある場合、レセプターはGタンパク質にカップリングし、GDPの放出、および引き続いてのGTPのGタンパク質への結合を刺激する。Gタンパク質−レセプター複合体のアルファサブユニットはGTPaseとして作用し、GTPをGDPへとゆっくりと加水分解し、その時点で、レセプターは正常には脱活性化される。活性化されたレセプターはGTPの代わりにGDPで交換を続ける。非−加水分解性GTPアナログ[35S]GTPγSを利用して、活性化されたレセプターを発現する膜への[35S]GTPγSの増強された結合を示すことができる。活性化を測定するために[35S]GTPγS結合を用いる利点は(a)それが全てのGタンパク質共役型レセプターに一般的に適用でき;(b)それは膜表面において基部側にあり、細胞内カスケードに影響する分子をあまり拾わないようにすることである。
細胞ベースのアッセイのために設計されたFlash PlateTMアデニリルシクラーゼキット(New England Nuclear;カタログ番号SMP004A)は、粗製原形質膜で用いるのに修飾することができる。該Flash Plateウェルは、cAMPを認識する特異的抗体も含むシンチラントコーティングを含むことができる。ウェルで生じたcAMPは、放射性cAMPトレーサーのcAMP抗体への結合につき直接的競合によって定量することができる。以下のものは、レセプターを発現する全細胞におけるcAMPレベルの変化の測定のための簡単なプロトコルとして働く。
TSHRは、活性化に際してcAMPの蓄積を引き起こすGs共役型GPCRである。TSHRは、アミノ酸残基623を突然変異することによって(すなわち、アラニン残基をイソロイシン残基に変化させることによって)構成的に活性化される。Gi共役型レセプターはアデニリルシクラーゼを阻害すると予測され、従って、cAMP生産のレベルを減少させ、これは、cAMPレベル挑戦の評価をなすことができる。Gi共役型レセプターの構成的活性化の指標としてのcAMPの生産の減少を測定するための効果的な技術は、最も好ましくは、Gi連結標的GPCRで、「シグナルエンハンサー」としての非−内因性の構成的に活性化されたTSHR(TSHR−A623I)(または内因性の構成的に活性なGs共役型レセプター)を共トランスフェクトして、cAMPのベースラインレベルを確立することによって達成することができる。Gi共役型レセプターの非−内因性バージョンを創製するに際して、次いで、標的GPCRのこの非−内因性バージョンをシグナルエンハンサーで共トランスフェクトし、スクリーニングで用いることができるのはこの物質である。我々は、そのようなアプローチを利用して、cAMPアッセイを用いる場合にシグナルを効果的に発生させ;このアプローチは、好ましくは、Gi共役型レセプターに対する候補化合物の直接的同定で用いられる。Gi共役型GPCRについては、シグナルエンハンサーのこのアプローチを内因性または構成的に活性化されたGi共役型GPCRいずれかと組み合わせて用いる場合に、標的GPCRの逆アゴニストはcAMPシグナルを増加させ、アゴニストはcAMPシグナルを減少させることに注意されたし。
(a.CRE−LUCレポーターアッセイ(Gs−関連レセプター))
293および293T細胞をウェル当たり2×104細胞の密度にて90ウェルプレート上で平板培養し、製造業者の指示に従って翌日にリポフェクタミン試薬(BRL)を用いてトランスフェクトする。DNA/脂質混合物を以下のようにして各6−ウェルトランスフェクションのために調製し:100μLのDMEM中の260ngのプラスミドDNAを100μLのDMEM中の2μLの脂質と温和に混合する{260ngのプラスミドDNAは200ngの8×CRE−Lucレポータープラスミド、内因性レセプターまたは非−内因性レセプターを含む50ngのpCMV、またはpCMV単独、および10ngのGPRS発現プラスミド[pcDNA3中のGPRS(Invitrogen)]よりなる}。8×CRE−Lucレポータープラスミドは以下のようにして調製した:pβgal−Basic Vector(Clontech)中のBglV−HindIII部位においてラットソマトスタチンプロモーター(−71/+51)をクローン化することによって、ベクターSRIF−β−galを得た。8コピーのcAMP応答エレメントは、アデノウイルス鋳型AdpCF126CCRE8[Suzuki et al.,Hum Gene Ther (1996)7:1883−1893参照;その開示をここで引用してその全体を援用する]からPCRによって得、Kpn−BglV部位にてSRIF−β−galベクターにクローン化し、その結果、8×CRE−β−galレポーターベクターが得られた。8×CRE−Lucレポータープラスミドは、8×CRE−β−galレポーターベクター中のベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子をHindIII−BamHI部位にて、pGL3−Basic Vector(Promega)から得られたルシフェラーゼ遺伝子で置き換えることによって生じた。室温での30分間のインキュベーションに続き、DNA/脂質混合物を400μLのDMEMで希釈し、100μLの希釈された混合物を各ウェルに加える。10%FCSを含む100μLのDMEMを細胞培養インキュベーター中での4時間のインキュベーションの後に各ウェルに加える。翌日、トランスフェクトされた細胞を200μL/ウェルの10%FCSを含むDMEMで変化させる。8時間後、ウェルは、PBSでの1回の洗浄の後に、フェノールレッド無くして100μL/ウェルのDMEMに変化させた。製造業者の指示に従って、LucLiteTMレポーター遺伝子アッセイキット(Packard)を用いてルシフェラーゼ活性を翌日に測定し、1450 MicroBetaTMシンチレーションおよびルミネッセンスカウンター(Wallac)で読む。
Gq刺激を検出するための方法は、そのプロモーターにAP1エレメントを含有する遺伝子の活性化を引き起こすGq−依存性ホスホリパーゼCの既知の特性に依存する。PathdetectTM AP−1シス−レポーティングシステム(Strategene,カタログ番号219073)を、リン酸カルシウム沈殿の成分が410ngのpAP1−lUC、80ngのpCMV−レセプター発現プラスミド、および20ng CMV−SEAPである以外は、CREDレポーターアッセイに関して前記したプロトコルに従って利用することができる。
Gq刺激を検出するための1つの方法は、そのプロモーター中に血清応答因子を含有する遺伝子の活性化を引き起こすGq−依存性ホスホリパーゼCの既知の特性に依存する。PathdetectTM SRF−Luc−レポーティングシステム(Strategene)を利用して、例えば、COS7細胞におけるGq共役型活性につきアッセイすることができる。細胞は、製造業者の指示に従い、Mammalian TransfectionTMキット(Strategene,カタログ番号200285)を用い、該システムのプラスミド成分、および内因性または非−内因性GPCRをコードする示された発現プラスミドでトランスフェクトする。簡単に述べれば、410ngのSRF−Luc、80ngのpCMV−レセプター発現プラスミドおよび20ngのCMV−SEAP(分泌されたアルカリ性ホスファターゼ発現プラスミド;アルカリ性ホスファターゼ活性はサンプル間のトランスフェクション効率の変動につき制御するためにトランスフェクトされた細胞の培地中で測定する)を、製造業者の指令に従って、リン酸カルシウム沈殿中で合わせる。沈殿の半分を96−ウェルプレート中の3ウェルに等しく分配し、無血清培地中で細胞を24時間保持する。示されれば、最後の5時間、細胞をテスト化合物または適当なコントロールと共にインキュベートする。次いで、細胞を溶解させ、製造業者の指示に従い、LucliteTMキット(Packard,カタログ番号6016911)および「Trilux 1450 Microbeta」液体シンチレーションおよびルミネッセンスカウンター(Wallac)を用いてルシフェラーゼ活性につきアッセイする。データはGraphPad PrismTM 2.0a(GraphPad Software Inc.)を用いて分析することができる。
1日に、レポーター(内因性および/または非−内因性)を含む細胞を通常1×105細胞/ウェルにて(この数は最適化することができる)24ウェルプレート上で平板培養することができる。2日に、まず50μLの無血清DMEM/ウェル中の0.25μgDNAおよび50μLの無血清DMEM/ウェル中の2μLのリポフェクタミンを混合することによって細胞をトランスフェクトすることができる。溶液を温和に混合し、室温にて15〜30分間インキュベートする。細胞を0.5mLのPBSで洗浄し、400μLの無血清培地をトランスフェクション培地と混合し、細胞に加える。次いで、細胞を37℃/5%CO2にて3〜4時間インキュベートし、次いで、トランスフェクション培地を除去し、1mL/ウェルの正規の増殖培地で置き換える。3日に、細胞を3H−myo−イノシトールで標識する。簡単に述べれば、培地を除去し、細胞を0.5mLのPBSで洗浄する。次いで、0.5mLの無イノシトール/無血清培地(Gibco BRL)を加え/0.25μCiの3H−myo−イノシトール/ウェルを含むウェルおよび細胞を37℃/5%CO2にて16〜18時間インキュベートする。4日に、細胞を0.5mLのPBSで洗浄し、無イノシトール/無血清培地、10μMパルギリン、10mM塩化リチウム、または0.4mLのアッセイ培地および50μLの10×ケタンセリン(ket)を最終濃度10μMまで含有する0.45mLのアッセイ培地を加える。次いで、細胞を37℃にて30分間インキュベートする。次いで、細胞を0.5mLのPBSで洗浄し、200μLの新鮮な/氷冷停止溶液(1M KOH;18mMホウ酸ナトリウム;3.8mM EDTA)を加える/ウェル。溶液を5〜10分間、または細胞が溶解するまで氷上に維持し、次いで、200μLの新鮮な/氷冷中和溶液(7.5%HCL)によって中和する。次いで、溶解物を1.5mLのエッペンドルフチューブに移し、1mLのクロロホルム/メタノール(1:2)を加える/チューブ。溶液を15秒間渦巻かせ、上相をBiorad AG1−X8TMアニオン交換樹脂(100〜200メッシュ)に適用する。まず、樹脂を1:1.25W/Vにて水で洗浄し、0.9mLの上相をカラムに負荷する。カラムを10mLの5mM myo−イノシトールおよび10mLの5mMホウ酸ナトリウム/60mMギ酸ナトリウムで洗浄する。イノシトール三リン酸を、2mLの0.1Mギ酸/1Mギ酸アンモニウムを含む10mLのシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアルに溶出させる。10mLの0.1Mギ酸/3Mギ酸アンモニウムで洗浄することによってカラムを再生させ、dd H2Oで2回濯ぎ、4℃にて水中に保存する。
(融合タンパク質の調製)
(a.GPCR:Gs融合構築体)
構成的に活性化されたGPCR−Gタンパク質融合構築体の設計は以下のように達成された:ラットGタンパク質Gsα(長形態;Itoh,H.et al.,83 PNAS 3776(1986))の5’および3’両末端は、その上にHindIII(5’−AAGCTT−3’)を含むように作製した。(フランキングHindIII配列を含めた)正しい配列の確認に続き、そのベクターのHindIII制限部位を用いるサブクローニングによって、全配列をpcDNA3.1(−)(Invitrogen,カタログ番号V795−20)にシャトルした。Gsα配列についての正しい向きはpcDNA3.1(−)へのサブクローニングの後に決定した。次いで、HindIII配列にラットGsα遺伝子を含む修飾されたpcDNA3.1(−)を確認した;このベクターは、今や、「ユニバーサル」Gsαタンパク質ベクターとして入手できた。pcDNA3.1(−)ベクターは、HindIII部位の上流に種々のよく知られた制限部位を含み、かくして、Gsタンパク質の上流に、内因性の構成的に活性なGPCRのコーディング配列を挿入する能力を便宜には供する。この同一アプローチを利用して、他の「ユニバーサル」Gタンパク質ベクターを作り出すことができ、勿論、当業者に知られた他の商業的に入手可能なまたは適当なベクターを利用することができ−重要な基準は、GPCRについての配列がGタンパク質のそれより上流であって、それとイン−フレームであることである。
Gq(DEL)/Gi融合構築体の設計は以下のようにして達成できる:N末端の6つのアミノ酸(TLESIM Cqγ−サブユニットの配列を有するアミノ酸2〜7)を欠失し、配列EYNL部位を有するC末端の5つのアミノ酸を、配列DCGLFを有するGiαタンパク質の対応するアミノ酸と置き換える。この融合構築体は以下のプライマー:
([35S]GTPγSアッセイ)
(膜調製)
いくつかの実施形態において、注目する標的GPCRを含み、例えば、逆アゴニスト、アゴニスト、またはアンタゴニストとして候補化合物の直接的同定で用いるための膜は、好ましくは、以下のように調製される:
(a.材料)
「膜掻取緩衝液」は20mM HEPESおよび10mM EDTA。pH7.4を含み;「膜洗浄緩衝液」は20mM HEPESおよび0.1mM EDTA、ph7.4を含み;「結合緩衝液」は20mM HEPES、100mM NaCl2および10mM MgCl2、pH7.4を含む。
全ての材料は該手法を通じて氷上に維持する。まず、培地を細胞の密集単層から吸引し、続いて、10mLの冷PBS濯ぎ、続いて、吸引する。しかる後、5mLの膜膜掻取緩衝液を加えて、細胞を掻取り;氷に続けて、細胞抽出物を50mLの遠心チューブに移す(20、000rpmにおいて4℃にて17分間遠心)。しかる後、上澄みを吸引し、ペレットを30mLの膜洗浄緩衝液に再懸濁させ、続いて、20、000rpmにおいて4℃にて17分間遠心する。次いで、上澄みを吸引し、ペレットを結合緩衝液に再懸濁させる。次いで、Brinkman PolytronTMホモゲナイザーを用いてホモゲナイズする(全ての材料が懸濁液となるまで15〜20秒間バースト)。これを、本明細書中においては、「膜タンパク質」という。
ホモゲナイゼーションに続き、Bradfordタンパク質アッセイを用い、膜のタンパク質濃度を測定する。(本明細書中タンパク質は約1.5mg/Lまで希釈し、アリコットし、後に用のために凍結することができる(−80℃);凍結する場合、用いるプロトコルは以下の通りである:アッセイの日、凍結された膜タンパク質を室温で解凍し、続いて、攪拌し、次いで、約12×1,000rpmにおいて約5〜10秒間、Polytronでホモゲナイズする;多数の調製では、異なる調製のホモゲナイゼーションの間にホモゲナイザーは徹底的に洗浄すべきである)。
結合緩衝液(前記);Bradford色素試薬;Bradfordタンパク質標準を製造業者の指令に従って利用する(Biorad、カタログ番号00〜0006)。
二連チューブを調製し、一つは膜を含み、一つはコントロール「ブランク」としてのものである。各々は800μLの結合緩衝液を含有した。しかる後、10μLのBradfordタンパク質標準(1mg/L)を各チューブに加え、次いで、10μLの膜タンパク質を丁度一つのチューブ(ブランクではない)に加える。しかる後、200μLのBradford色素試薬を各チューブに加え、続いて、各々を攪拌する。5分後、チューブを再度渦巻かせ、その中の材料をキュベットに移す。次いで、波長595において、CECIL3041分光光度計を用いてキュベットを読む。
(a.材料)
GDP緩衝液は37.5mLの結合緩衝液および2mgのGDP(Sigma、カタログ番号G−7127)よりなるものであって、続いて、結合緩衝液に系列希釈し、0.2μMのGDPを得た(各ウェル中のGDPの最終濃度は0.1μM GDPであった);候補化合物を含む各ウェルは、100μLのGDP緩衝液(最終濃度、0.1μM GDP)、結合緩衝液中の50μMの膜タンパク質、および結合緩衝液中の50μLの[35S]GTPγS(0.6nm)(10mLの結合緩衝液当たり2.5μLの[35S]GTPγS)よりなる200μLの最終容量を有する。
候補化合物は、好ましくは、96−ウェルプレートフォーマットを用いてスクリーニングする(これらは−80℃凍結することができる)。膜タンパク質(またはコントロールとしての、標的GPCRを排除する発現ベクターを含む膜)を懸濁するまで軽くホモゲナイズする。次いで、前記したBradfordタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を測定する。次いで、膜タンパク質(およびコントロール)を結合緩衝液中で0.25mg/Lまで希釈する(最終アッセイ濃度、12.5μgウェル)。しかる後、100μLのGDP緩衝液をWallac ScintitripTM(Wallac)の各ウェルに加える。次いで、5μLのピン−ツールを用いて、5μLの候補化合物をかかるウェルに移動する(すなわち、200μLの合計アッセイ容量中5μLは、候補化合物の最終スクリーニング濃度が10μMとなるように1:40の比率である)。再度、汚染を回避するために、各移動工程ののち、ピンツールは水(1×)、エタノール(1×)および水(2×)を含む三つの貯蔵器中で濯ぐべきであり−各濯ぎの後に過剰の液体はツールから振盪し、紙およびキムワイプ(kimwipe)で乾燥すべきである。しかる後、50μLの膜タンパク質を各ウェルに加え(標的GPCR無しの膜を含むコントロールウェルを利用した)、室温にて5〜10分間プレインキュベートした。しかる後、結合緩衝液中の50μLの[35S]GTPγS(0.6nM)を各ウェルに加え、続いて、室温にて60分間シェーカーでインキュベートする(再度、この例においては、プレートをホイルで被覆した)。次いで、4000RPMにおいて22℃にて15分間プレートを回転させることによって、アッセイを停止させた。次いで、プレートを8チャンネルのマニフォールドで吸引し、プレートカバーでシールする。次いで、(製造業者の指令に従い)設定「Prot.#37」を用いてプレートをWallac1450で読む。
(環状AMPアッセイ)
例えば、逆アゴニスト、アゴニストまたはアンタゴニストとしての候補化合物を直接的に同定するためのもう一つのアッセイアプローチは、シコラーゼーベースのアッセイを利用することによって達成される。直接的同定に加えて、このアッセイアプローチは独立したアプローチとして利用して、前記実施例に記載された[35S]GTPγSアプローチからの結果の確認を供することができる。
(細胞内カルシウム濃度の測定のための蛍光測定イメージングプレートリーダー(FLIPR)アッセイ(Gq関連レセプター))
各クローン系からの標的GPCR(実験)およびpCMV(陰性コントロール)により安定にトランスフェクトされた細胞を、翌日のアッセイのために、完全培養基(10%FBS、2mM L−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムを含むDMEM)を含むウェル当たり5.5×104細胞にてポリ−D−リシンでプレ処理した96−ウェルプレート(Becton−Dickinson、#356640)に蒔く。Fluo4−AM(Molecular Probe、#F14202)インキュベーション緩衝液ストックを調製するために、2mgのFluo4−AMO467μLのDMSOおよび467μLのプルオロン酸(Molecular Probe、#P3000)に溶解させて、1mMストック溶液が得られ、これは−20℃にて一ヶ月間貯蔵することができる。Fluo4−AMは蛍光カルシウムインジケータ色素である。
(メラノフォア技術)
メラノフォアは下等脊椎動物で見出される皮膚細胞である。それは色素を含むメラノソームと呼ばれるオルガネラを含む。メラノフォアは、Gタンパク質共役型レセプター(GPCR)活性化に際して、微小管ネットワークに沿ってこれらのメラノソームを再分布させることができる。この色素移動の結果は、細胞の明らかな明化または逆明化である。メラノフォアにおいて、Gi−共役型レセプターの活性化に由来する細胞内cAMPの減少したレベルはメラノソームを細胞の中心に移動させ、その結果、色が劇的に明るくなる。もしcAMPレベルが次いで上昇すれば、Gs−共役型レセプターの活性化に続き、メラノソームは再度分配され、細胞は再度暗く見える。また、Gq−共役型レセプターの活性化に由来するジアシルグリセロールの増大したレベルは、この再分布を誘導することができる。加えて、該技術は、ある種のレセプターチロシンキナーゼの研究にも適合する。メラノフォアの応答はレセプター活性から数分以内に送り、その結果、単純で頑強な色の変化が起こる。該応答は、慣用的な吸光度マイクロプレートリーダーまたは適当なビデオイメージングシステムを用いて容易に検出することができる。他の皮膚細胞とは異なり、メラノフォアは神経堤に由来し、シグナリングタンパク質の十分な補充を発現するようである。特に、該細胞は極端に広い範囲のGタンパク質を発現し、従って、機能的にほとんど全てのGPCRを発現することができる。
(MAPキナーゼアッセイ)
MAPキナーゼ(マイトジェン活性化キナーゼ)をモニターして、レセプターの活性化を見積もることができる。MAPキナーゼはいくつかのアプローチによって検出することができる。一つのアプローチは、未リン酸化(不活性)またはリン酸化(活性)いずれかにて、リン酸化の見積もりに基づく。リン酸化されたタンパク質はSDS−PAGE中でより遅い移動度を有し、従って、ウェスタンブロッティングを用いて未刺激タンパク質と比較することができる。別法として、リン酸化されたタンパク質に対して特異的な抗体が入手可能であり(New EnglandBiolabs)、これを用いて、リン酸化されたキナーゼの増加を検出することができる。いずれの方法においても、細胞をテスト化合物で刺激し、次いで、Laemmli緩衝液で抽出する。可溶性画分をSDS−PAGEゲルに適用し、タンパク質を電気泳動によりニトロセルロースまたはImmobilinに移動させる。免疫反応性バンドは標準的なウェスタンブロッティング技術によって測定される。目で見える、またはケミルミネセントシグナルをフィルム上に記録し、これは、デンシトメトリーによって定量することができる。
(MAPK/ERKキナーゼキナーゼ−1(MEKK1)アッセイ)
MEKK1のインビトロキナーゼ活性はMinamino et alによって記載されているように測定する。[Proc Natl et al.、 si USA(2002) 99:3866−3871;その開示をここで引用してその全体を援用する]。簡単に述べれば、細胞溶解物(400μg)をMEKK1(2μg)(カタログ番号sc−252、Sants Cruz Biotechnology、Sants Cruz、CA)に対する一次抗体で4時間免疫沈澱させ、続いて、タンパク質G−セファロース(50%wt/vol、Amersham Pharmacia)と共に4℃に2時間インキュベートする。GST−SEK1(Upstate Biotechnology、 Lake Placid、NY)を基質として用いる。サンプルをSDS/PAGEによって分解し、PhoshorImager(Molecular Probes)を用いることによって、リン酸化された基質を検出し、定量する。
(ヒトRUP40の組織分布)
(A.Affymetrix GeneChip(登録商標)技術)
オリゴヌクレオチドを含有するマイクロアレイの設計および製造のためのAffymetrixにヌクレオチド配列を提出して、それらのGeneChip(登録商標)技術を用いてGタンパク質共役型レセプター(GPCR)の発現レベルをモニターした。また、マイクロアレイには、Harvard Brane Bankからの、または商業的に入手可能な源から得られた特徴付けしたヒトの脳組織用のプローブが存在した。RNAサンプルを増幅し、標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせ、製造業者の指示に従ってデータを解析した。
(ラット心臓におけるRUP40の免疫染色)
配列番号4のアミノ酸964〜985に対応するペプチドNTGGWDSSGCTVEDDGRDNRDRを用い、ラットRUP40に対して向けられたアフィニティ−精製ポリクローナルウサギ抗体を調製した。(SynPep、Dublin、CA)。麻酔した成体雌Sprague−Dawleyラットからの単離された心臓組織をセクショニングのためにパラフィンに埋めた。左心室を通る系列的6ミクロンの横方向セクションを調製し、標準的な技術を用いて、ペルオキシダーゼ−ベースの免疫組織化学を行った。非−免疫化ウサギ(カタログ番号#N1699、DakoCytomation、Carpinteria、CA)からの免疫グロブリンを陰性コントロールとして用いた。心筋細胞は、サイトゾル全体に渡って散漫な染色を示し、原型質膜において染色はより強かった(図3)。
(新生ラット心室心筋細胞(NRVM)によるRUP40の発現)
(一次細胞培養)
新生ラット心室筋細胞(NRVM)を従前に記載されているように単離し、培養した[Adams、JV et al.、JBiolChem (1996) 271:1179−1186]。簡単に述べれば、1〜2日齢Sprague−Dawleyラット子供から心臓を得、コラゲナーゼで消化し、Percollグラジエントを通過させることによって筋細胞を精製した。細胞を、1%ゼラチンで予めコートした組織培養皿上で平板培養し、10%ウマ血清、5%胎児ウシ血清、および抗生物質(100ユニット/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシン)を補足した4:1 DMEM/培地−199中で一晩維持した。平板培養培地中での18時間後に、筋細胞を維持培地(DMEM/培地199+抗生物質)で洗浄して、死滅した細胞およびデブリスを除去し、実験の持続の間が維持培地を交換した。
前記したようにNRVMおよび線維芽細胞から単離した全RNAを、製造業者の指示に従って、PCRキット(Becton Dickinson、Franklin、NJ)用のRTを用い、逆転写されたDNA(RT−DNA)の生成のための鋳型として用いた。RUP40発現はPCRによってRT−DNAサンプルで検出した。PCR条件が:2分間の96℃;30秒間の96℃、30秒間の55℃、2分間の72℃の30サイクル;10分間の72℃であった。
RUP40は心筋細胞で発現することが判明した。結果は図4に示す。RT−PCRは、無血清(SFM)条件下に24時間維持した新生心室筋細胞(NRVM)におけるRUP40転写体の発現を示す。筋細胞におけるRUP40転写体レベルはフォルボール12−ミニステート13−アセテート(PMA)の添加から24時間後に劇的に降下したが、フェニレフリン(PE)またはプロスタグランジンF2アルファ(PG)の培地への添加の後には上昇したままであった。一次心室線線維芽細胞(Fibro)におけるRUP40発現のほとんど検出不可能なレベルに注意した。G3PDH PCR産物は、PCR反応で用いた鋳型の等しいレベル、およびゲル負荷の合致性を示す。増幅は、鋳型の不存在下における増幅に対応するゲルの「−」レーンによって示されるように、鋳型−依存性であった。ラット心室筋細胞によるRUP40の発現は、実施例11で決定され、図2に示されたヒトおよびマウス(図示せず)RUP40の発現プロフィールに合致する。
(増大したIP3蓄積における心筋細胞結果でのRUP40の過剰発現)
(一次細胞培養)
新生ラット心室筋細胞(NRVM)を従前に記載されているように単離し、培養した[Adams、JW et al.,J Bion Chem(1996)2719:86;その開示をここで引用してその全体を援用する]。簡単に述べれば、心臓を1〜2日齢Sprague−Dawleyラット子供から得、コラゲナーゼで消化し、筋細胞をPercollグラジエントを通すことによって生成した。細胞を0.2×106細胞/ウェルにて24ウェルゼラチンコートプレート上で平板培養し、10%ウマ血清、5%胎児ウシ血清、および抗生物質(100ユニット/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシン)を補足した4:1 DMEM/培地−199中で一晩維持した。平板培養培地中での18時間の後、筋細胞を維持培地(DMEM/培地199+抗生物質)で洗浄して、死滅した細胞およびデブリスを除去し、実験の継続中には維持培地を交換した。
アデノウイルスの実験では、配列番号2のヒトRUP40ポリペプチドをコードする配列番号1のポリヌクレオチドを、HEK293細胞における相同組換えによる組換え体RUP40(AdRUP40)の生成に先立ち、pShuttleCMV(Qpiogene、Carlsbad、CA)にサブクローンした。
平板培養の期間の後、筋細胞を前記した維持細胞にスイッチし、組換えアデノウイルスで直ちに感染させるか、または偽感染させた。アデノウイルスベクターでのNRVMの感染が従前に記載されているように行った[Adams、JW ET al.、Circ Res(2000)87:1180−7]。感染の最適多重度(MOI)は、0.1〜500PFU/細胞の用量範囲にわたって細胞当たり20〜50プラーク形成単位(PFU)であると測定された。20PFU/細胞のMOIの結果、GPFをコードするコントロールアデノウィルス(Adagfaでの感染のち最初の48時間の間にいずれの細胞傷害性なくして、[このコントロールウィルスに感染したNRVMにおける緑色蛍光タンパク質(GFP)発現によって測定して]95%を超える感染効率がもたらされた。
アデノウイルス感染筋細胞を、20mM HEPES−緩衝化培地中に10mM LiClを含有するアッセイ培地の添加に先立ち、2μCi/mLの[3H]ミオイノシトールを含有する維持倍地中で18〜24時間インキュベートした。アッセイ緩衝液中の30分の後、細胞を冷酸固定し、(0.1Mギ酸)、溶解物を、Dowex 100〜200メッシュ(ホルメート形態)樹脂ビーズを含有するカラムに移した。イノシトールリン酸を1Mギ酸アンモニウムおよび0.1Mギ酸で溶出させ、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。
Anova/Bonferroni adhoc統計解析によって判断して、心筋細胞におけるRUP40の過剰発現は増大したIP3蓄積を刺激した。従って、過剰発現されたRUP40は、アッセイの条件下で構成的Gqカップリング活性のレベルを発現した。結果を図5に示す。
(RUP40の過剰発現は心筋細胞において肥大および心房性ナトリウム利尿因子(ANF)発現を刺激する)
(一次細胞培養)
新生ラット心室筋細胞(NRVM)を従前に記載されているように[Adams、JW et al., JBiolChem(1996)271:1179−86]、実施例14に記載されているように調製した。
(アデノウイルス感染)
RUP40アデノウイルスベクター構築およびアデノウイルス感染は実施例11に記載されているように行った。
RUP40の過剰発現は心筋細胞における肥大を刺激した。結果を図6Aに示した。細胞当たり20プラーク形成単位(PFU)にてAdrup40で48時間感染させたNRMVは、AdGFPコントロールウィルスで感染させたコントロール細胞と比較して増大した細胞サイズを示した。
RUP40の過剰発現は、心筋細胞における心房性ナトリウム利尿因子(ANF)の発現を刺激した。結果を図6Bに示し、これは、内因性ANF転写体の発現のレベルおよび、組換えヒトRUP40転写体の発現のレベルを示す。NRVMを、20PFU/細胞の感染多重度にて、ヒトRUP40をコードする組換体アデノウイルスまたはコントロールアデノウィルス(Adgfp)で処理した。アデノウイルス感染の24時間の後に、全RNAを単離し、ノーザンブロット分析を行って、ウィルスにより発現されたRUP40のレベルを測定した。ヌクレオチド2,858〜3、606よりなるラットRUP40のcDNAフラグメントをプローブとして用いた。同一膜を、心房性ナトリウム利尿因子(ANF)の発現、心筋細胞肥大の遺伝子マーカーにつきプローブした[Rockman et al., Proc Natl Acad Sci USA(1991)88:8277−81]。プローブはランダムプライミングによって[32P]で標識した。加えて、膜をメチレンブルーで染色して、RNAの同等負荷および導入を確認した。
(横方向大動脈収縮(TAC)に由来する圧力過剰負荷の条件下でのRUP40の心筋発現)
(横方向大動脈収縮(TAC))
マウスにおける横方向大動脈の外科的収縮は従前に記載されているように行った[Rockman、HA et al., ProcNatlAcatSci USA(1991)88:8277−81]。簡単に述べれば、8週齢マウス(C57/BL6)をケタミンおよびキシラジンの混合物で麻酔した。解剖顕微鏡下で、中線頸部切開を行って、ミクロ外科技術によって気管および頚動脈を露出させた。成功した気管内挿管の後、0.2mLの時機容量での補足酸素および一分当たり110の呼吸速度にて、カニーレを容量サイクルドげっ歯類ベンティレータ(Harvard Apparatus)に連結させた。胸腔を小さな切開を通じて左上方胸骨縁の第二の肋間空間に入れ、27−ゲージの針に対する7−0ナイロン縫合結紮を結ぶことによって大動脈収縮を行って、針を抜いたときの直径の0.4mm狭化および60〜70%の再現性のある横方向大動脈収縮(TAC)が得られた。大動脈バンディングに続き、気胸を排気し、動物から抜管し、回復させる。コントロール偽−手術マウスは外科的処置を受けたが、横方向大動脈収縮(TAC)には付さない。外科的処置から7日後に、生存する動物を安楽死させ、逆方向灌流によって心臓をホルマリンで固定した。
配列番号5のマウスRUP40ポリヌクレオチドを、SP6およびT7プロモーターに近接挟まれた部位にてPCRII−TOPOベクター(Invitrogen、Carlsbad、CA)にサブクローンした。時節的には製造業者の指令に従い、Promega RiboProbe転写キット(#P1460;Madison、WI)からのSP6RNAポリメラーゼを用い、配列番号5のポリヌクレオチドに相補的な[35S]−放射性標識アンチセンスマウスRUP40 mRNAプローブを調製した。コントロール放射性標識センスプローブはT7 RNAポリメラーゼを用いて同様にして調製した。
横方向大動脈収縮(TAC)に由来する圧力過剰負荷の条件下で、RUP40の肥大レベルは維持される、またはわずかに増大した。結果を図7に示す。インサイチュハイブリダイゼーションは、成体マウス心臓における広い心筋発現を示した。アンチセンスRUP40放射性標識リボプローブは、心臓の全てのチャンバーにおけるRUP40発現を検出した。陰性コントロールとしての対象偽−操作マウスからのさらなるセクションについてセンスコントロールリボプローブを用いて、心臓セクションのプローブ標識のノイズ比率を示した。
(肥大心筋障害のインビボ動物モデル)
本発明の化合物は、限定されるものではなく例示する意図の、Rockman et al.のインビボ動物モデル[Proc Natl Acad Sci USA(1991)88:8277−81;その開示をここで引用してその全体を援用する]を用いる肥大心筋障害についての予防または治療の効果を有することが示すことができ、ここで、マウスは横方向大動脈収縮(TAC)に由来する圧力過剰負荷の条件に付される。いくつかの実施形態において、該化合物は逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該化合物は腹腔内注射によって投与される。好ましい用量は0.1〜100mg/kgである。他の好ましい用量は0.1mg/kg、0.3mg/kg;1.0mg/kg;3.0mg/kg;10mg/kg;30mg/kgおよび100mg/kgからなる群より選択される。プラセボ群にはビヒクルを単独で投与する。
(経口生物学的利用性)
経口生物学的利用性を直接的に評価するための物理化学的分析アプローチは当業者によく知られており、それを用いることができる[例えば、限定するものではないが:Wong PC et al., CardiovasCDrug Rev(200)20:137−52:およびP et al., Headache(2002)Suppl 2:S54−62;その各々の開示をここで引用してその全体を援用する]。限定されるものではなくさらに説明するために、該代替分析アプローチは液体クロマトグラフィー−タンデム質量測定を含むことができる[Chavez−Emg CM et al., J ChromatogrB Analyt Technol Biomed Life Sci(2002)767:117−29;Jettr A et al., Clil Pharmacol Ther(2002)71:21−9;Zimmerman JJ et al., J Clin Pharmacof(1999)39:1155−61;およびBarrish A et al., Rapid Commun Mass Spectrom(1996)10:1033−7;その各々の開示をここで引用してその全体を援用する]。
(ヒトRUP40 GPCRの発現を含むトランスジェニックマウス/ラット/ブタ)
また、本発明は、ヒトRUP40 GPCRの発現を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する方法および組成物を提供し、該レセプターは:
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;および
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;配列番号2のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、該非ヒト哺乳動物はマウス、ラットまたはブタである。
(肥大型心筋症のトランスジェニックインビボ動物モデル)
本発明の化合物は、実施例19に記載されたトランスジェニックインビボ動物モデルを用い、心血管障害の予防または治療の効果を有することが示すことができ、ここで、該トランスジェニック動物は野生型コントロール動物に対して肥大型心筋症に対する素因を呈し、または肥大型心筋症を発現する。該心血管障害は心臓病、さらに詳しくは肥大型心筋症および鬱血性心不全を含む。もしいずれかの年齢において、上記動物が年齢にマッチした野生型コントロール動物に対して、増大した湿潤または乾燥心臓重量、増大した湿潤または乾燥心臓重量/体重の比率、心筋細胞の増大した断面積、ANF遺伝子の誘導の増大したレベルを呈するならば、該トランスジェニック動物は肥大型心筋症に対する該素因を呈し、または肥大型心筋症を発現する。いくつかの実施形態において、該動物はマウスである。
(RUP40遺伝子中の破壊を含むトランスジェニックマウス/ラット/ブタ)
(マウス)
好ましいDNA構築体は、5’−末端から3’−末端へと:(a)マウスRUP40ゲノム配列に含まれる最初のヌクレオチド配列;(b)ネオマイシン抵抗性についてのマーカー(neo)のような陽性選択マーカーを含むヌクレオチド配列;および(c)マウスRUP40ゲノム配列に含まれ、最初のマウスRUP40ヌクレオチド配列(a)の下流のゲノムに位置する第2のヌクレオチド配列を含む。マウスRUP40ゲノム配列は、当業者によく知られた方法を用いて単離される(Maniatis T et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory;その開示をここで引用してその全体を援用する)。マウスRUP40ゲノム配列の該単離用のプローブは、マウスRUP40ポリペプチドをコードするcDNAに由来し、ここで、該cDNAはマウス心臓、肺または脂肪組織からのmRNAを鋳型として用いて得ることができる。
類似の、または別の[例えば、Zan et al.,Nature Biotechnology(2003)21:645−51;その開示をここで引用してその全体を援用する]方法を用いて、RUP40遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックラットを作製することができる。
類似の、または別の方法を用いて、RUP40遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックブタを作製することができる。[例えば、Lai et al.,Science(2002)295:1089−1092参照;その開示をここで引用してその全体を援用する]。
(RUP40遺伝子中に心筋細胞−選択的破壊を含むトランスジェニックマウス/ラット/ブタ)
(マウス)
これらの新しいDNA構築体は、P1ファージの部位特異的組換え系を用いる。該P1ファージは34塩基対loxP部位と相互作用するCreと呼ばれるレコンビナーゼを保有する。該loxP部位は8bpの保存された配列によって分離された13bpの2つの回文配列を含む[Hoess RH et al.,Nucleic Acids Res(1986)14;2287−300;その開示をここで引用してその全体を援用する]。同一の向きを有する2つのloxP部位の間のCre酵素による組換えは、DNAフラグメントの欠失に導く。
類似の、または別の[例えば、Zen et al.,Nature Biotechnology(2003)21:645−51参照;その開示をここで引用してその全体を援用する]方法を用いて、RUP40遺伝子に心筋細胞破壊を含むトランスジェニックラットを作製することができる。
類似の、または別の方法を用いて、RUP40遺伝子に心筋細胞−選択的破壊を含むトランスジェニックブタを作製することができる。[例えば、Lai et al.,Science(2002)295:1089−1092参照;その開示をここで引用してその全体を援用する]。
Claims (83)
- 候補化合物がRUP40 GPCRのモジュレーターであるか否かを同定する方法であって、ここで、該レセプターは、Gタンパク質にカップリングし、該レセプターは、以下:
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸配列は、配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって得られる、アミノ酸配列;
(f)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(g)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(h)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(i)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(j)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;または配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含み、該方法は、以下の工程:
(i)該候補化合物を該レセプターと接触させる工程;および
(ii)該レセプター機能性が調節されるか否かを決定する工程;
を包含し、ここで、レセプター機能の変化は、該候補化合物がRUP40 GPCRのモジュレーターであることを示す、方法。 - 候補化合物が心血管障害のモジュレーターであるか否かを同定する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)該候補化合物をRUP40 GPCRと接触させる工程であって、ここで、該レセプターは、Gタンパク質にカップリングし、該レセプターは、以下:
(i)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(ii)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(iii)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(iv)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(v)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸配列は、配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって得られる、アミノ酸配列;
(vi)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(vii)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(viii)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(ix)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(x)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;または配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む、工程;
(b)該レセプターの機能が調節されるか否かを決定する工程;
を包含し、
ここで、レセプター機能の変化は、該候補化合物が心血管障害のモジュレーターであることを示す、方法。 - 請求項1または2に記載の方法に従って同定されたモジュレーター。
- アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストおよびアンタゴニストからなる群より選択される請求項3に記載のモジュレーター。
- 逆アゴニストおよびアンタゴニストからなる群より選択される請求項3に記載のモジュレーター。
- RUP40 GPCRの活性を調節する方法であって、ここで、該レセプターは、Gタンパク質にカップリングし、該レセプターは、以下:
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸配列は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを用いてヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって得られる、アミノ酸配列;
(f)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(g)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(h)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(i)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(j)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;または配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含み;
該方法は、該レセプターを請求項3に記載のモジュレーターと接触させる工程を含む、方法。 - 前記接触させる工程が、前記モジュレーターを、前記レセプターを含む個体に投与する工程を包含し、ここで、該個体は、心臓病の予防または治療を必要としている、請求項6の記載の方法。
- 前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求項7記載の方法。
- 前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項7記載の方法。
- 前記肥大型心筋症が、以下:
(a)心筋梗塞後リモデリング;
(b)心臓弁疾患;
(c)持続した心後負荷;
(d)心筋炎;および
(e)家族性肥大型心筋症;
からなる群より選択される障害に由来する、請求項9に記載の方法。 - 前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項7に記載の方法。
- 心臓病の予防または治療を必要とする個体において該心臓病を予防するか、または治療する方法であって、該方法は、治療上有効量の請求項3に記載のモジュレーターをRUP40 GPCRと接触させる工程を包含し、該レセプターは、以下:
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸配列は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって得られる、アミノ酸配列;
(f)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(g)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(h)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(i)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(j)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;または配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む、方法。 - 前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求項12に記載の方法。
- 前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項12に記載の方法。
- 前記肥大型心筋症が:
(a)心筋梗塞後リモデリング;
(b)心臓弁疾患;
(c)持続した心後負荷;
(d)心筋炎;および
(e)家族性肥大型心筋症;
からなる群より選択される障害に由来する、請求項14に記載の方法。 - 前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項12に記載の方法。
- 組成物を調製する方法であって、該方法は、モジュレーターを同定する工程、次いで、キャリアおよびモジュレーターを混合する工程を包含し、ここで、モジュレーターは、請求項1または2に記載の方法によって同定可能である、方法。
- 前記モジュレーターが、逆アゴニストまたはアンタゴニストである、請求項17に記載の方法。
- 請求項3に記載のモジュレーターを含むか、請求項3に記載のモジュレーターで実質的に構成されるか、または請求項3に記載のモジュレーターで構成される薬学的または生理学的に受容可能な組成物。
- 前記モジュレーターが、逆アゴニストまたはアンタゴニストである、請求項19に記載の薬学的または生理学的に受容可能な組成物。
- 請求項19に記載の薬学的または生理学的に受容可能な組成物を心臓病の予防または治療を必要とする個体に提供する工程、または投与する工程を包含する、該心臓病を予防するか、または治療する方法。
- 前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求項21記載の方法。
- 前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項21記載の方法。
- 前記肥大型心筋症が、以下:
(a)心筋梗塞後リモデリング;
(b)心臓弁疾患;
(c)持続した心後負荷;
(d)心筋炎;および
(e)家族性肥大型心筋症;
からなる群より選択される障害に由来する、請求項23に記載の方法。 - 前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項21に記載の方法。
- 心臓病の予防または治療のための医薬の調製のための請求項3に記載のモジュレーターの使用方法。
- 前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求項26に記載の方法。
- 前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項26に記載の方法。
- 前記肥大型心筋症が、以下:
(a)心筋梗塞後リモデリング;
(b)心臓弁疾患;
(c)持続した心後負荷;
(d)心筋炎;および
(e)家族性肥大型心筋症;
からなる群より選択される障害に由来する、請求項28に記載の方法。 - 前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項26記載の方法。
- 候補化合物がRUP40 GPCRのリガンドであるか否かを同定する方法であって、該レセプターは、以下:
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1、346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得られる、アミノ酸配列;
(f)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(g)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(h)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(i)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(j)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;または配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含み、該方法は、以下の工程:
(i)該候補化合物の存在下または不存在下で、該レセプターを該GPCRの標識された既知のリガンドと接触させる工程;および
(ii)該標識された既知のリガンドの該レセプターへの結合が、該候補化合物の存在下で阻害されるか否かを決定する工程;
を包含し、ここで、該阻害は、候補化合物がRUP40 GPCRのリガンドであることを示す、方法。 - ヒトRUP40 GPCRの発現を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該レセプターは、以下:
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;および
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸配列は、配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得られる、アミノ酸配列;
からなる群より選択されるアミノ酸、または配列番号2のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;または配列番号2のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。 - 前記哺乳動物が、マウス、ラット、およびブタからなる群より選択される、請求項32に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記発現が、心筋細胞選択的である、請求項32に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、野生型コントロール哺乳動物に対して、鬱血性心不全または肥大型心筋症に対する素因を呈するか、または鬱血性心不全または肥大型心筋症を現す、請求項32に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 請求項3に記載のモジュレーターが鬱血性心不全または肥大型心筋症の予防または治療に効果を有するか否かを同定するために請求項35記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を使用する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)該モジュレーターをトランスジェニック非ヒト哺乳動物するか、または投与しない工程;
(b)該モジュラーターの投与が、以下;
(i)湿潤または乾燥心臓重量の低下;
(ii)湿潤または乾燥心臓重量/体重の比率の低下;
(iii)心筋細胞の断面積の低下;および
(iv)ANF遺伝子の誘導のレベルの低下;
からなる群より選択される効果を有するか否かを決定する工程;
を包含し、ここで、該決定は、該モジュレーターが鬱血性心不全または肥大型心筋症の予防または治療についての効果を有することを示す、方法。 - 該モジュレーターが、逆アゴニストまたはアンタゴニストである、請求項36記載の方法。
- RUP40遺伝子に破壊を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記破壊が、心筋細胞選択的である、請求項38に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記哺乳動物が、マウス、ラットおよびブタからなる群より選択される、請求項38に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記哺乳動物が、マウスであり、かつ前記RUP40遺伝子が、配列番号6のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項38に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記哺乳動物が、ラットであり、かつ前記RUP40遺伝子が、配列番号4のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項38に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記哺乳動物が、野生型コントロール哺乳動物に対して、横方向大動脈収縮(TAC)につき低下した肥大型心筋症を発現する請求項38〜42のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 心臓病のための薬学的薬剤としての候補化合物をスクリーニングするためのRUP40 GPCRの使用であって、ここで、該RUP40 GPCRは、以下:
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1,346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸は配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号8に記載されたヌクレオチド度配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得られる、アミノ酸配列;
(f)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(g)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(h)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(i)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(j)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;または配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含むレセプターである、使用。 - 前記心血管障害が、心臓病である、請求項44に記載の使用。
- 前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求候45に記載の方法。
- 前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項45に記載の方法。
- 前記肥大型心筋症が、以下:
(a)心筋梗塞後リモデリング;
(b)心臓弁疾患;
(c)持続した心後負荷;
(d)心筋炎;および
(e)家族性肥大型心筋症;
からなる群より選択される障害に由来する、請求項47に記載の方法。 - 前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項45に記載の方法。
- 前記薬学的薬剤が、前記レセプターのリガンドである、請求項44に記載の使用。
- 前記薬学的薬剤が、前記レセプターのモジュレーターである、請求項44に記載の使用。
- アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストおよびアンタゴニストからなる群より選択される請求項51に記載のモジュレーター。
- 逆アゴニストおよびアンタゴニストからなる群より選択される請求項51に記載のモジュレーター。
- RUP40 GPCRの活性を調節する方法であって、ここで、該レセプターは、Gタンパク質にカップリングし、該レセプターは、以下:
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1、346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸は、配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得られる、アミノ酸配列;
(f)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(g)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(h)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(i)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(j)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;または配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含み、該方法は、該レセプターを、請求項51に記載のモジュレーターと接触させる工程を包含する、方法。 - 前記接触させる工程が、前記モジュレーターを、前記レセプターを含む個体に投与する工程を包含し、ここで、該個体は、心臓病の予防または治療を必要とする、請求項54に記載の方法。
- 前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求項55に記載の方法。
- 前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項55に記載の方法。
- 前記肥大型心筋症が、以下:
(a)心筋梗塞後リモデリング;
(b)心臓弁疾患;
(c)持続した心後負荷;
(d)心筋炎;および
(e)家族性肥大型心筋症;
からなる群より選択される障害に由来する、請求項57に記載の方法。 - 前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項55に記載の方法。
- 心臓病の予防または治療を必要とする個体において該心臓病を予防するか、または治療する方法であって、該方法は、治療上有効量の請求項51に記載のモジュレーターをRUP40 GPCRと接触させる工程を包含し、該レセプターは、以下:
(a)配列番号2のアミノ酸1〜1、346;
(b)配列番号2のアミノ酸1〜990;
(c)配列番号2のアミノ酸991〜1,346;
(d)配列番号2のアミノ酸954〜997;
(e)内因性RUP40レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸は、配列番号7に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号8に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトcDNAサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得られる、アミノ酸配列;
(f)配列番号4のアミノ酸1〜1,349;
(g)配列番号4のアミノ酸1〜993;
(h)配列番号4のアミノ酸994〜1,349;
(i)配列番号4のアミノ酸954〜1000;および
(j)配列番号6のアミノ酸1〜141;
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号2または4のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント;または配列番号2または4のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む、方法。 - 前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求項60記載の方法。
- 前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項60記載の方法。
- 前記肥大型心筋症が、以下:
(a)心筋梗塞後リモデリング;
(b)心臓弁疾患;
(c)持続した心後負荷;
(d)心筋炎;および
(e)家族性肥大型心筋症;
からなる群より選択される障害に由来する、請求項62に記載の方法。 - 前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項60に記載の方法。
- 組成物を調製する方法であって、該方法は、モジュレーターを得る工程、次いで、キャリア、および該モジュレーターを混合する工程を包含し、ここで、該モジュレーターは、請求項51に記載の使用に従う、方法。
- 前記モジュレーターが、逆アゴニストまたはアンタゴニストである、請求項65に記載の方法。
- 請求項51に記載のモジュレーターを含むか、請求項51に記載のモジュレーターで実質的に構成されるか、または請求項51に記載のモジュレーターで構成される薬学的または生理学的に受容可能な組成物。
- 前記モジュレーターが、逆アゴニストまたはアンタゴニストである、請求項67に記載の薬学的または生理学的に受容可能な組成物。
- 心臓病について予防するか、または治療する方法であって、該方法は、該予防または治療を必要とする個体に請求項67に記載の薬学的または生理学的に受容可能な組成物を提供する工程または投与する工程を包含する、方法。
- 前記心臓病が、先天性心不全である、請求項69記載の方法。
- 前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項69記載の方法。
- 前記肥大型心筋症が、以下:
(a)心筋梗塞後リモデリング;
(b)心臓弁疾患;
(c)持続した心後負荷;
(d)心筋炎;および
(e)家族性肥大型心筋症;
からなる群より選択される障害に由来する、請求項71に記載の方法。 - 前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項69に記載の方法。
- 心臓病についての予防または治療のための医薬を調製するための請求項51に記載のモジュレーターを使用する方法。
- 前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求項74に記載の方法。
- 前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項74に記載の方法。
- 前記肥大型心筋症が、以下:
(a)心筋梗塞後リモデリング;
(b)心臓弁疾患;
(c)持続した心後負荷;
(d)心筋炎;および
(e)家族性肥大型心筋症;
からなる群より選択される障害に由来する、請求項76に記載の方法。 - 前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項74に記載の方法。
- 請求項51に記載の前記モジュレーターが鬱血性心不全または肥大型心筋症の予防または治療に対して効果を有するか否かを同定するために、請求項32に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を使用する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)該モジュレーターを請求項32記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与するか、または投与しない工程;
(b)該モジュレーターの投与が、以下:
(i)湿潤または乾燥心臓重量の低下;
(ii)湿潤または乾燥心臓重量/体重の比率の低下;
(iii)心筋細胞の断面積の低下;および
(iv)ANF遺伝子の誘導のレベルの低下;
からなる群より選択される効果を有するか否かを決定する工程;
を包含し、ここで、該決定は、該モジュレーターが鬱血性心不全または肥大型心筋症の予防または治療に効果を有することを示す、方法。 - 前記モジュレーターが、逆アゴニストまたはアンタゴニストである、請求項79に記載の方法。
- 前記個体が、哺乳動物である、請求項7〜16、21〜25、55〜64、および69〜73のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳動物が、非ヒト哺乳動物である、請求項81に記載の方法。
- 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項81に記載の方法。
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