JP2007523058A - Composition comprising Xantoceros sorbifolia extract, compound isolated from said extract, method of preparing it, and method of use thereof - Google Patents
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Abstract
【課題】 本発明はキサントセラス ソルビフォリア由来の純粋で、生物学的に活性な化合物を同定および生成する方法並びに行程を提供する。本発明はまた、キサントセラス ソルビフォリア由来の純粋な化合物、さらにサポニンを含む組成物も提供する。
【解決手段】組成物は、各種疾病を治療するために用いられる。トリテルペン骨格またはサポゲニンを含む化合物を提供し、その化合物においては糖部分がそのトリテルペン骨格の3位の炭素に結合していて、アセチルおよび/または糖部分が21位および22位の炭素に結合していて、そしてアンゲロイル基が糖部分に結合している。これらの官能基は機能的にトリテルペンまたはサポゲニンに機能的に結合することで化合物を形成する。
【選択図】なしPROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method and process for identifying and producing a pure and biologically active compound derived from Xantoceros sorbifolia. The present invention also provides a composition comprising a pure compound derived from Xantoceros sorbifolia, as well as a saponin.
The composition is used to treat various diseases. A compound comprising a triterpene skeleton or sapogenin is provided, wherein the sugar moiety is attached to the 3rd carbon of the triterpene skeleton, and the acetyl and / or sugar moiety is attached to the 21st and 22nd carbons. And an angeloyl group is attached to the sugar moiety. These functional groups functionally bind to a triterpene or sapogenin to form a compound.
[Selection figure] None
Description
本発明は、キサントセラス(Xanthoceras Sorbifolia)と言われる植物、即ち市販の中国医薬品では一般的にベングォングォ(Wenguanguo)と呼ばれている植物の抽出物から単離および/または精製される生物作用のある化合物と、それらの利用法および機能と、それらの調整方法に関する。 The present invention relates to a biologically active compound isolated and / or purified from an extract of a plant called Xanthoceras Sorbifolia, i.e. a plant commonly referred to as Wenguanguo in commercial Chinese medicines. And their use and function, and their adjustment methods.
この出願は、2003年12月23日に出願された米国特許出願第60/532,101号の恩恵を主張する2004年10月8日に提出された国際特許出願番号PCT/US04/33359号の優先権を主張し、また2004年10月8日に出願された米国特許出願番号第60/617,379号、2004年9月27日に出願された米国特許出願第60/613,811号、および2004年9月7日に出願された米国特許出願第60/607,858号の優先権を主張する。これらの先行出願の内容は、この出願に参照としてその全体が組み入れられる。 This application is the priority of International Patent Application No. PCT / US04 / 33359 filed on October 8, 2004, claiming the benefits of US Patent Application No. 60 / 532,101 filed on December 23, 2003. U.S. Patent Application No. 60 / 617,379 filed October 8, 2004, U.S. Patent Application No. 60 / 613,811 filed September 27, 2004, and September 7, 2004 Claims priority of US Patent Application No. 60 / 607,858, filed daily. The contents of these prior applications are hereby incorporated by reference in their entirety.
この出願を通して種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示事項は、本出願が関係する技術状況をより完全に説明するためにその全体がこの出願に参照として組み入れられる。 Throughout this application various publications are referenced. The disclosures of these publications are hereby incorporated by reference in their entirety to more fully describe the state of the art to which this application pertains.
本発明の背景、即ち関連技術のより詳細な記載については、2004年10月8日に出願され、その全体が参照として本明細書に組み入れられるPCT国際出願番号PCT/US04/33359号の第1頁第25-38行目から第13頁に満足できるほど記載されている。
For a more detailed description of the background of the invention, i.e. related art, the first of PCT International Application No. PCT / US04 / 33359, filed Oct. 8, 2004, which is incorporated herein by reference in its entirety. It is satisfactorily described on pages 25-38 on
本発明のこれら、および他の目的にしたがって本発明の簡単な概要が述べられる。幾分かの簡略化および省略が以下の概要ではなされているかもしれないが、それは本発明のいくらかの観点を強調しかつ導入することに意図があって、その範囲に限定する意図はない。本発明の概念を当業者が形成し、かつ利用できるようにするのに適した好適な例示的な態様の詳細な説明が、以下の段落に続く。 A brief summary of the present invention is set forth in accordance with these and other objects of the present invention. Some simplifications and omissions may be made in the following summary, which is intended to highlight and introduce some aspects of the invention, and not to limit its scope. A detailed description of preferred exemplary embodiments suitable to enable those skilled in the art to make and use the concepts of the invention follows in the following paragraphs.
本発明はベングォングォの抽出物から精製した化合物を利用することに関する。これらの化合物は夜尿症および頻尿から患者を救い、深い眠りから覚醒する際の膀胱からの信号を伝える中枢神経系の機能を改善するとともに、膀胱がより多くの尿を溜めることができるように膀胱を弛緩させる。 The present invention relates to the use of a compound purified from an extract of Benguongo. These compounds save the patient from nocturnal enuresis and frequent urination, improve the function of the central nervous system that carries signals from the bladder when waking from deep sleep, and allow the bladder to collect more urine Relax.
ベングォングォから同定されて精製される化合物は、老化、ストレス、神経質、過剰−活動性、不安定性、過−反射、および無抑制性膀胱によって起こる排尿筋の緊張を弛緩させるために用いることができる。別の態様ではベングォングォの抽出物は、アセチルコリン、即ちAchによって誘導された膀胱の収縮をゆるめるために用いられる場合もある。 The compounds identified and purified from Bengueongo can be used to relax the detrusor tension caused by aging, stress, nervousness, hyperactivity, instability, hyperreflexes, and uninhibited bladder. In another embodiment, bengunguo extract may be used to relax bladder contraction induced by acetylcholine, Ach.
ベングォングォから同定されて精製される化合物は、尿の容量を減少させる抗−炎症剤のような抗利尿ホルモン(ADH)を調節するためのAch阻害剤である、アセチルコリンエステラーゼとして用いることができる。 The compound identified and purified from Bengueongo can be used as acetylcholinesterase, an Ach inhibitor for modulating antidiuretic hormone (ADH) such as anti-inflammatory agents that reduce urine volume.
本発明は、ベングォングォの鞘、仁、葉、果柄、枝、茎、根、種子の殻、および樹皮からサポニンを生成する行程、並びにその適用法を提供する。本発明は、ベングォングォの鞘、仁、葉、果柄、枝、茎、根、種子の殻、および樹皮から得られるサポニンを含む組成物を提供する。 The present invention provides a process for producing saponins from bengwongo pods, pods, leaves, fruit stalks, branches, stems, roots, seed shells, and bark, and methods of application thereof. The present invention provides a composition comprising saponins obtained from bengwongo pods, vines, leaves, stalks, branches, stems, roots, seed shells, and bark.
ベングォングォのサポニンは、膀胱の成長を促進するため、深い睡眠を抑制するため、眠っている患者の覚醒を促すため、抗利尿ホルモン(ADH)とその受容体の遊離、分解および取り込みを調節するため、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)とその受容体の分泌、分解および取り込みを調節するため、5-ヒドロキシトリプタミンとその受容体の遊離、分解および取り込みを調節するため、アセチルコリン(Ach)とその受容体の遊離、分解および取り込みを調節するため、アドレナリン(AD)とその受容体の遊離、分解および取り込みを調節するため、ドーパミン(DA)とその受容体の遊離、分解および取り込みを調節するため、ノルエピネフリン(NE)とその受容体の遊離、分解および取り込みを調節するため、睡眠麻痺を抑制するため、神経ペプチドとそれらの受容体の形成、遊離、分解および活性を調節するため、限定するわけではないが、乳癌、白血球の癌、肝臓癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、および脳の癌などの癌を治癒するため、さらに肺および膀胱の機能を改善するために用いることができるであろう。 Bengonguo saponin promotes bladder growth, suppresses deep sleep, promotes awakening of sleeping patients, and regulates the release, degradation, and uptake of antidiuretic hormone (ADH) and its receptors Acetylcholine (Ach) and its receptors to regulate the release, degradation and uptake of 5-hydroxytryptamine and its receptors, to regulate the secretion, degradation and uptake of adrenocorticotropic hormone (ACTH) and its receptors Norepinephrine to regulate the release, degradation and uptake of adrenaline (AD) and its receptor, to regulate the release, degradation and uptake of dopamine (DA) and its receptor To regulate the release, degradation and uptake of (NE) and its receptors, and to suppress sleep paralysis, neuropeptides and their receptors To cure cancers such as, but not limited to, breast cancer, leukocyte cancer, liver cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, and brain cancer. It could also be used to improve lung and bladder function.
本発明はトリテルペン骨格、即ちサポゲニンを含む化合物を提供し、その化合物では糖部分がトリテルペン骨格の3位炭素に結合し、アセチルおよび/または糖部分が21位および22位の炭素に結合し、そしてアンゲロイル基が糖部分に結合している。これらの官能基はトリテルペン即ちサポゲニンに機能的に結合することによってこの化合物を形成している。 The present invention provides a compound comprising a triterpene skeleton, i.e., sapogenin, in which the sugar moiety is attached to the 3rd carbon of the triterpene skeleton, the acetyl and / or sugar moiety is attached to the 21st and 22nd carbons, and An angeloyl group is attached to the sugar moiety. These functional groups form this compound by functionally binding to a triterpene or sapogenin.
本発明は以下の構造式からなる化合物を提供する。
本発明は、上述した化合物の塩を提供する。本発明は上述した化合物および好適な担体を含む組成物を提供する。 The present invention provides salts of the compounds described above. The present invention provides a composition comprising a compound as described above and a suitable carrier.
本発明は、上述した化合物の有効量と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。 The present invention provides a pharmaceutical composition comprising an effective amount of the compound described above and a pharmaceutically acceptable carrier.
本発明はキサントセラス ソルビフォリア 薬用植物由来の化合物を単離するための方法を提供し、その方法は、適当な量の一種またはそれ以上の有機溶媒を用い、適当な時間キサントセラス ソルビフォリア粉末を抽出することによって有機抽出液を得る行程、その有機抽出液を集める行程、その有機抽出液を還流して二次抽出液を得る行程、その二次抽出液から有機溶媒を除去する行程、その二次抽出物を乾燥し、滅菌することによってキサントセラス ソルビフォリアの抽出物粉末を得る行程、その抽出物粉末を分画することによってその抽出物粉末の一つまたはそれ以上の成分を得る行程、その抽出物粉末の一つまたはそれ以上の生物活性のある成分を同定する行程、その抽出物粉末の一つまたはそれ以上の生物活性のある成分をFPLCを利用して精製することによってその生物活性のある成分の一つまたはそれ以上のフラクションを得る行程、およびプレパラティブHPLCを用いて前記化合物を単離する行程からなる。 The present invention provides a method for isolating a compound derived from a Xantoceros sorbifolia medicinal plant, the method using an appropriate amount of one or more organic solvents and extracting the Xantoceras sorbifolia powder for an appropriate time. The process of obtaining an organic extract, the process of collecting the organic extract, the process of refluxing the organic extract to obtain a secondary extract, the process of removing the organic solvent from the secondary extract, the secondary extraction The process of obtaining an extract powder of Xantoceros sorbifolia by drying and sterilizing the product, the process of obtaining one or more components of the extract powder by fractionating the extract powder, the extract powder The process of identifying one or more bioactive components of the extract, and using FPLC for one or more bioactive components of the extract powder. It consists step for isolating the compound was used to stroke to obtain one or more fractions of components with its biological activity by purified, and preparative HPLC.
本発明は、この明細書において以後化合物Y1と命名され、図7、8、9および10に示されているような1D-、2D-NMRスペクトルデータによって証明されている構造式を持つ化合物を提供する。 The present invention provides a compound having the structural formula which will hereinafter be named Compound Y1 and which is proven by 1D-, 2D-NMR spectral data as shown in FIGS. 7, 8, 9 and 10. To do.
本発明は、この明細書において以後化合物R1と命名され、1D-NMR(-NMR、C13-NMR)、2D-NMR(HMBC、HMQC)、およびMSスペクトル分析によって証明されている構造式を持つ化合物を提供する。この化合物のデータ、即ちプロフィールは図21、22、23、24および25に示されている。 The present invention is hereinafter referred to as Compound R1, and has a structural formula that has been proved by 1D-NMR (-NMR, C13-NMR), 2D-NMR (HMBC, HMQC), and MS spectrum analysis. I will provide a. The data, or profile, for this compound is shown in FIGS. 21, 22, 23, 24 and 25.
本発明は、化学式がC65H100O27であって、化学名が3-O-[β-D-ガラクトピラノシル(1→2)]-α-L-アラビノフラノシル(1→3)-β-D-グルクロノピラノシル-21-O-(3,4-ジアンゲロイル)-α-L-ラムノフィラノシル-22-O-アセチル-3β、16α、21β、22α、28-ペンタヒドロキシオレアン-12-エンである、癌に対して有効な化合物Y1、およびその誘導体の化学的特徴を提供する。 The present invention has a chemical formula of C65H100O27 and a chemical name of 3-O- [β-D-galactopyranosyl (1 → 2)]-α-L-arabinofuranosyl (1 → 3) -β- D-glucuronopyranosyl-21-O- (3,4-diangeloyl) -α-L-rhamnophyranosyl-22-O-acetyl-3β, 16α, 21β, 22α, 28-pentahydroxyolean The chemical characteristics of the compound Y1 effective against cancer, and its derivatives, which are -12-ene are provided.
本発明の化合物または組成物は、G-プロテイン受容体、Fasプロテイン、受容体チロシンキナーゼ、マイトジェン、マイトジェン受容体のような受容体または要素を調節する。この化合物はいわゆるキサントセラス ソルビフォリアから単離してもよいし、化学的に合成してもよく、あるいは他の生物起源から抽出することも可能である。 A compound or composition of the invention modulates a receptor or element such as a G-protein receptor, Fas protein, receptor tyrosine kinase, mitogen, mitogen receptor. This compound may be isolated from so-called Xantoceros sorbifolia, chemically synthesized, or extracted from other biological sources.
本発明は、キサントセラス ソルビフォリアから同定されて精製され、癌の増殖を抑える化合物Y1を提供する。癌には限定するわけではないが、膀胱癌、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、白血球の癌、大腸癌、肝臓癌、骨癌、脳癌、および卵巣癌が含まれる。 The present invention provides Compound Y1, identified and purified from Xantoceros sorbifolia, that suppresses cancer growth. Cancers include but are not limited to bladder cancer, cervical cancer, prostate cancer, lung cancer, breast cancer, leukocyte cancer, colon cancer, liver cancer, bone cancer, brain cancer, and ovarian cancer.
本発明のこれらの目的および他の目的にしたがって本発明の簡単な概要が述べられる。幾分かの簡略化および省略が以下の概要ではなされているかもしれないが、それは本発明のいくらかの観点を強調しかつ導入することに意図があって、その範囲に限定する意図はない。本発明の概念を当業者が形成し、かつ利用できるようにするのに適した好適な例示的な態様の詳細な説明が、以下の段落に続く。 In accordance with these and other objects of the invention, a brief summary of the invention is set forth. Some simplifications and omissions may be made in the following summary, which is intended to highlight and introduce some aspects of the invention, and not to limit its scope. A detailed description of preferred exemplary embodiments suitable to enable those skilled in the art to make and use the concepts of the invention follows in the following paragraphs.
本発明は、ベングォングォの粉末形状になっているベングォングォの鞘、果柄または種子の殻、葉、枝および茎、仁および根から粗のサポニンを提供する。ベングォングォから粗のサポニンを調製するための方法は以下の行程、即ちベングォングォの粉末を、例えばエタノール、メタノールなどの有機溶媒を1:2の比で用いて4-5回、各回20-35時間抽出することによって有機抽出液を作成する行程、その有機抽出液を集めて2-3回、80℃で還流することによって二次抽出液を作成する行程、その二次抽出液を水に溶解してn-ブタノールによって抽出することによってn-ブタノール抽出液を作成する行程、そのn-ブタノール抽出液をクロマトグラフィーにかけることによって粗のサポニンを得る行程からなる。この粗抽出物、即ちベングォングォ抽出物はサポニンを含む。 The present invention provides crude saponins from bengwongo pods, fruit stalks or seed shells, leaves, branches and stems, seeds and roots in the form of bengwungo powder. The method for preparing crude saponin from Benguongo is the following process: Extracting Benguungo powder 4-5 times using an organic solvent such as ethanol, methanol, etc. in a ratio of 1: 2, 20-35 hours each time The process of creating the organic extract, the process of collecting the organic extract and refluxing at 80 ° C. 2-3 times, the process of creating the secondary extract, dissolving the secondary extract in water It consists of a step of preparing an n-butanol extract by extraction with n-butanol, and a step of obtaining a crude saponin by subjecting the n-butanol extract to chromatography. This crude extract, or bengungo extract, contains saponin.
伝統的な中国医薬品の理論から言うと、夜尿症、頻尿および尿失禁は腎臓「シェン(shen)」の不完全によって起こる。従ってそれらは、ヤクヨウニンジン(Ginseng)、バジチアン(Bajitian)、ロウコングロング(Roucongrong)、ドゥゾング(Duzhong)または冬虫夏草(Cordyceps)のような腎臓を整えることのできる中国の薬用植物を用いて治療される。これらの強壮薬用植物は腎臓の機能を強くできるとともに、「腎臓経路」を介する人体の水分代謝を調節でき、それが夜尿症、頻尿および尿失禁を治す助けとなる。 According to the theory of traditional Chinese medicine, nocturnal enuresis, pollakiuria and urinary incontinence are caused by incomplete kidney “shen”. They are therefore treated with Chinese medicinal plants that can prepare the kidneys such as Ginseng, Bajitian, Roucongrong, Duzhong or Cordyceps. The These tonic plants can strengthen the function of the kidneys and regulate the body's water metabolism through the “kidney pathway”, which helps cure nocturnal enuresis, pollakiuria and urinary incontinence.
本発明のベングォングォの抽出物はまた、夜尿症、頻尿および尿失禁を治療するために用いることもできる。しかしながらベングォングォの抽出物は、人体の水分代謝と排尿を調節するための「膀胱経路」を介して夜尿症、頻尿および尿失禁を治療する。本発明のベングォングォの抽出物は膀胱の成長を刺激する。図9および図23B参照。本発明のベングォングォの抽出物は膀胱の容量を大きくするとともに、排尿を調節する膀胱の機能を良くする。例えば、国際PCT出願番号PCT/US04/33359における101頁14-29行目から106頁1-21行目に記載された実施例5参照。本発明の別の観点ではベングォングォの抽出物は、夜尿症、頻尿および尿失禁を治療するための「腎臓経路」薬用植物とともに用いた場合、腎臓経路と膀胱経路の両方の経路を強めることができ、より良い治療効果を生じさせるであろう。 The bengwongo extract of the present invention can also be used to treat nocturnal enuresis, pollakiuria and urinary incontinence. However, bengunguo extracts treat nocturnal enuresis, pollakiuria and urinary incontinence via the “bladder pathway” to regulate the body's water metabolism and urination. The bengunguo extract of the present invention stimulates bladder growth. See FIGS. 9 and 23B. The extract of Bengonguo of the present invention increases the capacity of the bladder and improves the function of the bladder that regulates urination. For example, see Example 5 described in International PCT Application No. PCT / US04 / 33359, page 101, lines 14-29 to page 106, lines 1-21. In another aspect of the invention, bengunguo extracts can enhance both the renal and bladder pathways when used with a “kidney pathway” medicinal plant to treat nocturnal enuresis, pollakiuria and urinary incontinence. , Will produce a better therapeutic effect.
本発明はさらに、ビタミンB、ビタミンD、ビタミンK、グレープ種子の抽出物および他の抗酸化剤、コルディセプス(Cordyceps)もしくはその抽出物、イチョウもしくはその抽出物、オタネニンジン(Panax ginseng)および西洋ニンジン(P. quinquefolium)もしくはそれらの抽出物、ワンピ(Huanpi)(クラウゼナ ランジューム(Clausena lansium))もしくはその抽出物、エキナセア(Echinacea)もしくはその抽出物、セント ジョーンズ ワート(St John's Wort)(ハイペリカム ペルフォラタム(Hypericum perforatum))もしくはその抽出物、ゲジェン(Gegen)(ペラリア ロバタ(Pueraria lobata))もしくはその抽出物、ティアンマ(Tianma)(ガストロディア エラタ(Gastrodia elata))もしくはその抽出物、アルミラリエラ メレア(Armillariella mellea)もしくはその抽出物、ダンシェン(Danshen)(サルビア ミルチオリザ(Salvia miltiorrhiza))もしくはその抽出物、サンキ(Sanqi)(パナックス ノトジンセン(Panax notoginsen))もしくはその抽出物、モナスカス(Monascus)もしくはホンク(Honqu)(レッド イースト ライス(Red Yeast rice))、フアンキ(Huanqi)(ヘディサルム ポリボトリイズ(Hedysarum polybotrys))もしくはその抽出物、ジフアング(Dihuang)(レーマニア グルチノーサ(Rehmannia glutinosa))もしくはその抽出液、ダングイ(Danggui)(アンジェリカ シネンシス(Angelica sinensis))、ユアンジー(Yuanzhi)(ポリガラ テヌイフォイラ(Polygala tenuifoila))もしくはその抽出物、リンジー(Lingzhi)(ガノデルマ spp.(Ganoderma spp.))もしくはその抽出物、フリング(Fuling)(ポリア ココス(Poria cocos))もしくはその抽出物、エノキタケ(フラムリナ ベルチペス(Flammulina velutipes))もしくはその抽出物、ガン カオ(Gan Cao)(グリシリザ ウラレンシス フィッシュ(Glycyrrhiza uralensis Fisch))もしくはその抽出物、フペルジン A(Huperzine A)、ラシチン(Lacithin)、メトリフォネート(Metrifonate)、ノースタイル(Nocetile)、葉酸、アミノ酸、クレアチン、繊維サプリメント、またはそれらのどれかの組み合わせを含む医薬品または健康食品を提供する。 The present invention further includes vitamin B, vitamin D, vitamin K, grape seed extract and other antioxidants, Cordyceps or extract thereof, Ginkgo or extract thereof, Panax ginseng and Western carrot ( P. quinquefolium) or extracts thereof, Huanpi (Clausena lansium) or extracts thereof, Echinacea or extracts thereof, St John's Wort (Hypericum perforatum) )) Or extracts thereof, Gegen (Pueraria lobata) or extracts thereof, Tianma (Gastrodia elata) or extracts thereof, Armillariella mellea or Its extract, Danshen (Salvia milti orrhiza)) or extract thereof, Sanqi (Panax notoginsen) or extract thereof, Monascus or Honqu (Red Yeast rice), Huanqi ( Hedysarum polybotrys) or extracts thereof, Dihuang (Rehmannia glutinosa) or extracts thereof, Danggui (Angelica sinensis), Yuanzhi Polygala tenuifoila)) or its extract, Lingzhi (Ganoderma spp.) Or its extract, Fling (Poria cocos) or its extract, Enokitake (Flamlina vertiipes ( Flammulina velutipes) or its extract, Gan Cao (Glyciliza uralensis fish) Glycyrrhiza uralensis Fisch) or an extract thereof, Huperzine A, Lacithin, Metrifonate, Nocetile, folic acid, amino acids, creatine, fiber supplements, or any of them Pharmaceuticals or health foods containing these combinations are provided.
本発明は、患者の5-ヒドロキシトリプタミン(5HT)の取り込みを阻害するためのベングォングォの抽出物を提供する。 The present invention provides an extract of bengungo for inhibiting the uptake of 5-hydroxytryptamine (5HT) in a patient.
5−HTは、深い睡眠を維持し、増強する睡眠因子をコントロールし、調整する。5HTの取り込みを阻害すると深い眠りが抑制されるであろう。SWS 3およびSWS 4にあまりにも長い時間入り込む人は、その人の眠りが深すぎるために膀胱がいっぱいになっていても眠りから目覚めることができない。これは、夜尿症がSWS 3およびSWS 4の時によく起こる理由である。国際PCT出願番号第PCT/US04/33359の第38頁第1-35行目参照。
5-HT controls and regulates sleep factors that maintain and enhance deep sleep. Inhibiting 5HT uptake may prevent deep sleep. A person who enters
本発明は、患者のドーパミンの活性を高め、それによってその患者の中枢神経系を機敏にするためのベングォングォの化合物を提供する。 The present invention provides Bengonguo compounds for enhancing dopamine activity in a patient, thereby aggregating the patient's central nervous system.
本発明は、尿量が減少している患者の抗利尿ホルモン(ADH)の分泌を高めるためのベングォングォの化合物を提供する。 The present invention provides Bengonguo compounds for increasing secretion of antidiuretic hormone (ADH) in patients with reduced urine output.
本発明は、患者のアセチルコリン(Ach)とその受容体の放出、分解および取り込みを調節するためのベングォングォの化合物を提供する。本発明の前記抽出物は5HTによって起こった深い眠りを抑制し、REM睡眠を強める。 The present invention provides Benguungo compounds for modulating the release, degradation and uptake of acetylcholine (Ach) and its receptors in patients. The extract of the present invention suppresses deep sleep caused by 5HT and enhances REM sleep.
本発明は、患者の睡眠麻痺を抑制するためのベングォングォの化合物を提供する。 The present invention provides a Benguungo compound for inhibiting sleep paralysis in a patient.
本発明は、眠っている患者に覚醒を起こさせるためのベングォングォの化合物を提供する。 The present invention provides Bengonguo compounds for awakening sleeping patients.
本発明は、膀胱および括約筋の成長をたすけるための化合物を提供する。未成熟な膀胱および括約筋は排尿の行程や行為を調節できない。膀胱および括約筋の成長を促すことによってこの問題は解決し、夜尿症が起こらなくなるであろう。 The present invention provides compounds for effecting bladder and sphincter growth. The immature bladder and sphincter cannot regulate the process and behavior of urination. By encouraging the growth of the bladder and sphincter, this problem will be solved and no nighturia will occur.
本発明は、癌の増殖に対抗するベングォングォの化合物を提供する。これらの癌には限定するわけではないが、膀胱癌、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、白血球の癌、大腸癌、肝臓癌、骨癌、脳癌、および卵巣癌が含まれる。 The present invention provides Benguungo compounds that combat cancer growth. These cancers include, but are not limited to, bladder cancer, cervical cancer, prostate cancer, lung cancer, breast cancer, leukocyte cancer, colon cancer, liver cancer, bone cancer, brain cancer, and ovarian cancer.
本発明は、トリテルペン骨格またはサポゲニンを含む化合物、即ちそのトリテルペン骨格の3位炭素に糖部分が結合し、21位および22位の炭素にアセチルおよび/または糖部分が結合し、その糖部分にアンゲロイル基が結合している化合物を提供する。これらの官能基はトリテルペンまたはサポゲニンに機能的に結合して化合物を形成している。 The present invention relates to a compound containing a triterpene skeleton or sapogenin, that is, a sugar moiety is bonded to the 3-position carbon of the triterpene skeleton, an acetyl and / or sugar moiety is bonded to the 21st and 22nd carbons, and Provided is a compound having a group attached thereto. These functional groups are functionally linked to triterpenes or sapogenins to form compounds.
本発明は以下の構造式からなる化合物を提供する。
本発明は次の構造式からなる化合物を提供する。
別の態様では本発明の化合物は、図15A、図15B、図15C、図15D、図27、図28、図29、図30、図31および図32に示されているような構造式からなる。 In another embodiment, the compounds of the invention consist of the structural formulas as shown in FIGS. 15A, 15B, 15C, 15D, 27, 28, 29, 30, 31, and 32. .
本発明は上述した化合物の塩を提供する。
本発明は、上述した化合物および好適な担体を含む組成物を提供する。
本発明は、上述した化合物の有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
本発明は、上述した組成物を含む抗−卵巣癌剤と組成物を提供する。
The present invention provides salts of the aforementioned compounds.
The present invention provides a composition comprising a compound as described above and a suitable carrier.
The present invention provides a pharmaceutical composition comprising an effective amount of the compound described above and a pharmaceutically acceptable carrier.
The present invention provides anti-ovarian cancer agents and compositions comprising the compositions described above.
以下の方法および材料は、この出願明細書に記載された実施例および/または実験で利用された。 The following methods and materials were utilized in the examples and / or experiments described in this application.
細胞: ヒト癌細胞系はアメリカン タイプ カルチャー コレクションから入手した。即ち、HTB-9(膀胱)、HeLa-S3(子宮頸部)、DU145(前立腺)、H460(肺)、MCF-7(胸部)、K562(白血球)、HCT116(大腸)、HepG2(肝臓)、U20S(骨)、T98G(脳)、およびOVCAR-3(卵巣)である。細胞は、10%の仔ウシ血清とグルタミンと抗生剤を補充した培養培地(HeLa-S3、DU145、MCF-7、Hep-G2およびT98GはMEM(アールの塩(Earle's salts))中、HTB-9、H460、K562、OVCAR-3はPMI-1640中、HCT-116、U2OSはMcCoy-5A中)において、5% CO2で加湿された37℃のインキュベータ内で増殖させた。
Cells: Human cancer cell lines were obtained from the American Type Culture Collection. That is, HTB-9 (bladder), HeLa-S3 (cervix), DU145 (prostate), H460 (lung), MCF-7 (chest), K562 (white blood cell), HCT116 (large intestine), HepG2 (liver), U20S (bone), T98G (brain), and OVCAR-3 (ovary). Cells were cultured in medium supplemented with 10% calf serum, glutamine and antibiotics (HeLa-S3, DU145, MCF-7, Hep-G2 and T98G in MEM (Earle's salts), HTB- 9, H460, K562, OVCAR-3 were grown in PMI-1640, HCT-116, U2OS in McCoy-5A) in a 37 ° C. incubator humidified with 5
MTT分析: MTT分析のための手法は、ほんのわずかな変形加えられたにすぎない(Carmichaelらの1987)に記載された方法に従う。細胞は、薬物−処理を行う24時間前に96−ウェルプレートに10,000個/ウェル(HTB-9、HeLa、H460、HCT116、T98G、OVCAR-3)、15,000個/ウェル(DU145、MCF-7、HepG2、U20S)、または40,000個/ウェル(K562)の濃度で植え付けた。続いて細胞は、48時間(HepG2、U20Sに対しては72時間、またMCF-7に対しては96時間)、薬物に接触させた。薬物−処理を行った後でMTT(0.5mg/ml)を加えて一時間培養した。フォルマザン(生存している細胞によってテトラゾリウムが還元された生成物)の形成物はDMSOで溶解し、490nmでのO.D.をELISA読みとり装置によって測定した。薬物−処理前の細胞のMTTレベルも測定した(T0)。細胞−増殖の%(%G)は、下式で計算される。
本発明は、キサントセラス ソルビフォリアから単離された化合物によって相互作用した細胞性シグナル経路を提供する。 The present invention provides a cellular signaling pathway that interacts with compounds isolated from Xantoceros sorbifolia.
別の態様では化合物は化学式がC65H100O27であって、化学名が、
3-O-[β-D-ガラクトピラノシル(1→2)]-α-L-アラビノフラノシル(1→3)-β-D-グルクロノピラノシル-21-O-(3,4-ジアンゲロイル)-α-L-ラムノフィラノシル-22-O-アセチル-3β、16α、21β、22α、28-ペンタヒドロキシオレアン-12-エンであり、この明細書では「構造式Y1」と示されていて、癌に対して有効な誘導性化合物である。更なる態様での本発明の化合物は、「構造式Y」、「構造式R1」、「構造式1から4」、「構造式Y-aからY-c」および「構造式Y1-aからY1-c」、「構造式Y1-3からY1-4」、並びにそれらの誘導体としてこの明細書に示された化学構造式を含む。図15、27−32参照。上述したこれらの成分は細胞の受容体または要素を調節する。これらの化合物はいわゆるキサントセラス ソルビフォリアという植物から単離してもよいし、合成してもよい。
In another embodiment, the compound has the chemical formula C65H100O27 and the chemical name is
3-O- [β-D-galactopyranosyl (1 → 2)]-α-L-arabinofuranosyl (1 → 3) -β-D-glucuronopyranosyl-21-O- (3 , 4-Diangeloyl) -α-L-rhamnophyranosyl-22-O-acetyl-3β, 16α, 21β, 22α, 28-pentahydroxyolean-12-ene, Y1 ”is an inducible compound effective against cancer. In further embodiments, the compounds of the present invention are represented by “Structural Formula Y”, “Structural Formula R1”, “
細胞の増殖をモニターするには多くの要素や経路がある。キサントセラス ソルビフォリア化合物またはその誘導体は、Wnt(ウィングレス−タイプのMMTV統合部位ファミリーメンバー)シグナル経路で働く。Wntシグナル経路は進化論上保存されており、胚発生期の数々のイベントを調節する。この経路は細胞の形態、増殖、運動性を調節するとともに、細胞のアポトーシスも調節する。それはまた、腫瘍の発生期でも重要な役割を果たしている。Wnt経路はまた、ヒトの数種の異なるタイプの癌で不適当に活性化されている場合が観察されている。 There are many factors and pathways for monitoring cell growth. Xantoceros sorbifolia compounds or derivatives thereof work in the Wnt (wingless-type MMTV integration site family member) signaling pathway. The Wnt signaling pathway is evolutionarily conserved and regulates numerous events during embryonic development. This pathway regulates cell morphology, proliferation and motility, as well as cell apoptosis. It also plays an important role in tumor development. The Wnt pathway has also been observed to be inappropriately activated in several different types of cancer in humans.
細胞核においてWnt信号を送る標的遺伝子は、遺伝子調節性タンパク質の阻害性複合体によって、例えば遺伝子調節性タンパク質であるLEF-I/TCFに結合したグルコ(Groucho)コリプレッサータンパク質によって通常はサイレントが保たれている。Wnt信号がないといくらかのβ-カテニンがカドヘリンタンパク質の細胞質末端に結合し、するとAPC-アキシン-GSK-3βによって結合できるようになった細胞質のβカテニンはプロテアソームにおけるユビキチン化と分解を引き起こすであろう。その結果、β-カテニンの細胞内の含有量が減少する。しかしながらフリズレッド(Frizzled)(7個の貫通受容体)およびLRP(低密度リポタンパク質受容体)に結合しているWntが機構によってディッシェベルド(Dishevelled)(細胞質シグナルタンパク質)を活性化すると、これによってカゼインキナーゼIとともにカゼインキナーゼIIを必要とする機構によって分解性の複合体におけるGSK-β3の不活性化が導かれる。β-カテニン-アキシン-アデノマトス-プロポシス コリ(APC)−グリコーゲン シンターゼ キナーゼ(GSK)-3βのマルチタンパク質複合体の活性は、プロテアソームによって分解する際のリン酸化によりβ−カテニンを標的としており、その時Dsh/Dv1(ディッシュベルド、dsh相同体1)によって阻害される。その際このことは、β-カテニンの開始を阻害しているのであるとともに、β-カテニンのGSK-3βリン酸化を非間接的に阻害している。Wntによって刺激されると、DvlはGSK-3結合性タンパク質であるGBPをβ-カテニン-アキシン-アデノマトス-プロポシス コリ(APC)−グリコーゲン シンターゼ キナーゼ(GSK)-3βのマルチタンパク質複合体に組み入れる。するとGBPはアキシンからGSK-βを滴定し、それによってβ−カテニンのリン酸化が阻害される。その際アキシンは、細胞膜でLRPによって押さえられる。これらの全てにより、結果に細胞質のβ−カテニンが蓄積する。核においてはβ−カテニンはLEF-I/TCFに結合し、グルコ(Groucho)に置き換わってコ−アクチベーターとして作用し、Wnt標的遺伝子の転写を刺激する。 Target genes that send Wnt signals in the cell nucleus are usually kept silent by inhibitory complexes of gene-regulatory proteins, such as the gluco (Groucho) corepressor protein bound to the gene-regulatory protein LEF-I / TCF. ing. In the absence of a Wnt signal, some β-catenin binds to the cytoplasmic terminus of the cadherin protein, which can then be bound by APC-Axin-GSK-3β causes ubiquitination and degradation in the proteasome. Let's go. As a result, the intracellular content of β-catenin decreases. However, when Wnt binding to Frizzled (7 penetrating receptors) and LRP (low density lipoprotein receptor) activates Dishevelled (cytoplasmic signal protein) by mechanism, this A mechanism that requires casein kinase II along with casein kinase I leads to inactivation of GSK-β3 in a degradable complex. The activity of the multiprotein complex of β-catenin-axin-adenomatos-proposis coli (APC) -glycogen synthase kinase (GSK) -3β targets β-catenin by phosphorylation upon degradation by the proteasome, and then Dsh Inhibited by / Dv1 (Dishveld, dsh homolog 1). In this case, this inhibits the initiation of β-catenin and indirectly inhibits GSK-3β phosphorylation of β-catenin. When stimulated by Wnt, Dvl incorporates the GSK-3 binding protein GBP into a multiprotein complex of β-catenin-axin-adenomatos-proposis coli (APC) -glycogen synthase kinase (GSK) -3β. GBP then titrates GSK-β from axin, thereby inhibiting β-catenin phosphorylation. Axin is suppressed by LRP at the cell membrane. All of these result in the accumulation of cytoplasmic β-catenin in the result. In the nucleus, β-catenin binds to LEF-I / TCF, replaces Groucho, acts as a co-activator, and stimulates transcription of the Wnt target gene.
キサントセラス ソルビフォリア組成物は、Wnt経路またはその受容体に関連する要素を調節し、それによって癌細胞の増殖を停止させる。 Xantoceras sorbifolia compositions modulate elements associated with the Wnt pathway or its receptors, thereby stopping the growth of cancer cells.
この化合物またはその誘導体は、マイトジェン、RasおよびMAP(微小管関連タンパク質)キナーゼ経路で働く。マイトジェンは細胞分割を刺激する。マイトジェンが細胞表面の受容体に結合すると、RasおよびMAPキナーゼカスケードの活性化を引き起こす。この経路の効果の一つは、遺伝子調節性タンパク質であるMycの産生を増加させることである。Mycは、サイクリンDおよびSCFユビキチン リガーゼのサブユニットをエンコードする遺伝子を含む数種の遺伝子の転写を増加させる。G1-CdkおよびG1/S-Cdkの活性が結果的に増加するため、Rbのリン酸化と遺伝子調節性タンパク質であるE2Fの活性化が促進され、その結果G1-Cdk活性がRbリン酸化を開始させてS-フェーズへの開始が起こり、そのためRbが不活性化されてE2FがフリーになることによってG1/S−サイクリン(サイクリンE)およびS-サイクリン(サイクリンA)に対する遺伝子などのS-フェーズ遺伝子の転写が活性化できる。G1/S-CdkおよびS-Cdkが出現すると結果的にRbのリン酸化がさらに高まって正のフィードバックループが形成され、E2Fが戻されて機能するためにそれ自身の遺伝子の転写を刺激することができ、別の正のフィードバックループが形成される。Mycはまた、E2F遺伝子の転写を刺激することによって直接的にE2Fの活性を促進できると思われる。その結果、Sフェーズに入る遺伝子の転写が増加する。しかしながらこの経路が過剰に働くと、癌細胞の増殖を引き起こすことになる。 This compound or its derivatives work in the mitogen, Ras and MAP (microtubule associated protein) kinase pathways. Mitogens stimulate cell division. When mitogens bind to cell surface receptors, they cause activation of the Ras and MAP kinase cascades. One effect of this pathway is to increase the production of the gene regulatory protein Myc. Myc increases transcription of several genes, including those encoding the subunits of cyclin D and SCF ubiquitin ligase. The resulting increase in G1-Cdk and G1 / S-Cdk activities promotes Rb phosphorylation and activation of the gene regulatory protein E2F, resulting in G1-Cdk activity initiating Rb phosphorylation S-phase such as genes for G1 / S-cyclin (cyclin E) and S-cyclin (cyclin A) by initiating S-phase and thus inactivating Rb and freeing E2F Gene transcription can be activated. Appearance of G1 / S-Cdk and S-Cdk results in further phosphorylation of Rb, forming a positive feedback loop, and stimulating transcription of its own gene for E2F to return and function And another positive feedback loop is formed. Myc may also directly promote E2F activity by stimulating transcription of the E2F gene. As a result, transcription of genes entering the S phase is increased. However, if this pathway works excessively, it will cause cancer cell growth.
植物キサントセラス ソルビフォリアから得られる化合物または組成物は、Ras-MAPキナーゼカスケードを調節し、その経路が過剰に作動しないようにしている。 The compound or composition obtained from the plant Xantoceros sorbifolia modulates the Ras-MAP kinase cascade, preventing the pathway from over-acting.
この化合物またはその誘導体はRas−依存性の、即ちMyc経路で働く。Rasにおけるアミノ酸の突然変異はしばしば不変的に過剰作動性となってしまうタンパク質を作り出し、マイトジェンの刺激がなくても過剰作動性のRas-依存性シグナル経路を刺激する。同様にMycの過剰発現を引き起こす突然変異は過度の細胞増殖を促進し、そのため癌の進行が速まる。 This compound or its derivative works in a Ras-dependent, ie Myc pathway. Amino acid mutations in Ras often create proteins that are invariably hyperactive and stimulate hyperactive Ras-dependent signaling pathways without mitogenic stimulation. Similarly, mutations that cause overexpression of Myc promote excessive cell proliferation and thus accelerate cancer progression.
植物キサントセラス ソルビフォリアから得られる化合物または組成物は、Ras-依存性またはMyc経路の要素を調節することによって、確実に過剰作動性にならないようにできる。 The compound or composition obtained from the plant Xantoceros sorbifolia can be ensured not to become over-operated by modulating elements of the Ras-dependent or Myc pathway.
この化合物またはその誘導体は、異常な細胞のチェックポイント機構を再活性化する。細胞内には異常な細胞分裂性の刺激を検出したり、アポトーシスに至る異常に過剰作動性の細胞を生じさせたりするチェックポイント機構がある。しかしながらこの機構は癌細胞においては、チェックポイントの反応に必須の要素をエンコードする遺伝子に突然変異があるために反応しない。突然変異がチェックポイント機構に起こると癌細胞は増殖し、際限なく分割する。 This compound or derivative thereof reactivates the abnormal cellular checkpoint mechanism. There is a checkpoint mechanism in the cell that detects abnormal mitotic stimuli and produces abnormally over-acting cells that lead to apoptosis. However, this mechanism does not respond in cancer cells due to mutations in genes that encode elements essential for checkpoint responses. When mutations occur in the checkpoint mechanism, cancer cells grow and divide indefinitely.
植物キサントセラス ソルビフォリアから得られる化合物または組成物は、癌細胞の増殖を停止させるためのチェックポイント機構と反応する。 The compound or composition obtained from the plant Xantoceros sorbifolia reacts with a checkpoint mechanism to stop the growth of cancer cells.
この化合物またはその誘導体は細胞外の増殖シグナル経路に影響を与える。細胞増殖を刺激する細胞外増殖因子は、細胞表面にある受容体に結合し、細胞内のシグナル経路を活性化する。それは少なくとも部分的にeif4eおよびホスホリル化S6キナーゼを活性化することによりタンパク質の合成を促進する酵素PI3-キマーゼを活性化し、その結果mRNAの翻訳を増加させ、続いて細胞増殖を促進する。植物キサントセラス ソルビフォリアから得られる化合物または組成物は、細胞外増殖に関連する要素または受容体を調節する。それは卵巣癌細胞の受容体と結合することによって癌細胞の増殖を停止させることができる。 This compound or derivative thereof affects the extracellular proliferation signal pathway. Extracellular growth factors that stimulate cell growth bind to receptors on the cell surface and activate intracellular signaling pathways. It activates the enzyme PI3-chymase, which promotes protein synthesis by at least partially activating eif4e and phosphorylated S6 kinase, resulting in increased mRNA translation and subsequent cell proliferation. The compound or composition obtained from the plant Xantoceros sorbifolia modulates elements or receptors associated with extracellular growth. It can stop the growth of cancer cells by binding to the receptors of ovarian cancer cells.
植物キサントセラス ソルビフォリアから得られる化合物または組成物は、卵巣癌細胞の増殖を停止させるRasおよびMAPキナーゼに関連する要素を調節する。 The compound or composition obtained from the plant Xantoceros sorbifolia modulates elements related to Ras and MAP kinases that stop the growth of ovarian cancer cells.
この化合物またはその誘導体は細胞外機構に影響を与える。細胞分割は、細胞増殖を制限することが可能な細胞外機構によっても調節される。正常な細胞ではMycタンパク質は、細胞増殖のためのシグナルとして核内で作用する。大量のMycは細胞の過剰な増殖や、腫瘍を発生させる。 This compound or its derivative affects the extracellular mechanism. Cell division is also regulated by extracellular mechanisms that can limit cell proliferation. In normal cells, Myc protein acts in the nucleus as a signal for cell proliferation. Large amounts of Myc cause excessive cell proliferation and tumors.
植物キサントセラス ソルビフォリアから得られる化合物または組成物は、Myc細胞の増殖に関する要素または受容体を調節することによって腫瘍細胞が分割するのを停止させることができる。 A compound or composition obtained from the plant Xantoceros sorbifolia can stop tumor cells from dividing by modulating elements or receptors related to the growth of Myc cells.
この化合物またはその誘導体はTGF-αシグナル経路に影響を与える。TGF-αは、角質細胞、マクロファージ、肝細胞、および血小板によって産生される。その合成はウイルス感染によって刺激される。TGF-αは、ネズミやチキンの未成熟な造血前駆細胞、例えば分化を生じさせることのないBFU-Eの長期間の増殖を誘導する。それは、BFU-E細胞が赤血球になるという最終的な分化も誘導する。TGF-αは培養中の内皮細胞の増殖も刺激する。それは腫瘍組織の血管新生においても重要な役割を果たしている。 This compound or its derivative affects the TGF-α signaling pathway. TGF-α is produced by corneocytes, macrophages, hepatocytes, and platelets. Its synthesis is stimulated by viral infection. TGF-α induces long-term proliferation of murine and chicken immature hematopoietic progenitors such as BFU-E without causing differentiation. It also induces the final differentiation that BFU-E cells become red blood cells. TGF-α also stimulates proliferation of endothelial cells in culture. It also plays an important role in tumor tissue angiogenesis.
植物キサントセラス ソルビフォリアから誘導される化合物または組成物はTGF-αの要素または受容体を調節することによって、卵巣癌や膀胱癌の細胞増殖を抑制できる。 A compound or composition derived from the plant Xantoceros sorbifolia can inhibit ovarian cancer and bladder cancer cell growth by modulating TGF-α elements or receptors.
この化合物またはその誘導体の化合物はTGF-βシグナル経路に影響を与える。TGF-βは細胞の成長と増殖を調節し、多くの細胞タイプの成長を遮断する。二種のTGF-β受容体、即ちタイプ1とタイプ2がある。それらは信号が転写調節器のSMAD(最初に二種、C. elegansのSmaとショウジョウバエのMadが同定された後で名付けられたタンパク質)ファミリーを通るセリン−スレオニンキナーゼである。TGF-β経路とSMADの突然変異はヒトの癌と関係がある。
This compound or its derivative affects the TGF-β signaling pathway. TGF-β regulates cell growth and proliferation and blocks the growth of many cell types. There are two types of TGF-β receptors,
植物キサントセラス ソルビフォリアから誘導された化合物または組成物は、TGF-βの要素または受容体を調節することによって卵巣癌と膀胱癌の細胞増殖を抑制できる。 A compound or composition derived from the plant Xantoceros sorbifolia can inhibit ovarian and bladder cancer cell growth by modulating TGF-β elements or receptors.
この化合物またはその誘導体は、DNAウイルスによって損傷を受けた細胞の機能と反応する。DNA腫瘍ウイルスは、細胞周期調節Rbタンパク質およびp53タンパク質を妨害することによって癌を引き起こす。p53遺伝子における突然変異は、癌細胞がDNAの損傷にかかわらず生き残り、増殖することを可能にする。パピローマニウスはタンパク質E6およびE7を配列p53およびRbにそれぞれ利用する。この作用は突然変異した細胞を活性化し、それらが生き残ってさらに分割し、蓄積されることを許容する。 This compound or derivative thereof reacts with the function of cells damaged by the DNA virus. DNA tumor viruses cause cancer by interfering with cell cycle regulatory Rb and p53 proteins. Mutations in the p53 gene allow cancer cells to survive and grow regardless of DNA damage. Papillomanius utilizes proteins E6 and E7 for sequences p53 and Rb, respectively. This action activates the mutated cells and allows them to survive, divide and accumulate.
植物キサントセラス ソルビフォリアから得られる化合物または組成物はE6およびE7を調節し、タンパク質Rbおよびp53を放出して異常な細胞が分割するのを阻止できるであろう。それはまた、タンパク質を調節、即ち反応して癌細胞死を引き起こす。 A compound or composition obtained from the plant Xantoceros sorbifolia may modulate E6 and E7 and release proteins Rb and p53 to prevent abnormal cells from dividing. It also regulates, ie reacts, causes cancer cell death.
この化合物またはその誘導体はp53シグナル経路に影響を与える。p53は多細胞性生物がDNAの損傷や他のストレスのある細胞性イベントを安全にうまく対処するのを助けており、危険であろうと思われる環境では細胞の増殖を停止させる。癌細胞は突然変異したp53タンパク質を大量に含有する傾向があり、それらが被った遺伝子上のアクシデントや不適切な環境で成長させるストレスにより、p53タンパク質を正常的に活性化するシグナルが作り出されたことを示唆している。したがってp53の活性がなくなると突然変異した細胞が細胞周期を通過し続けることが可能になるため、癌に関しては極めて危険になる可能性がある。それはまた、それらがアポトーシスを回避するのを可能にする。そのためそれらのDNAが損傷を受けるといくらかの細胞は死ぬが、生き残っている細胞は損傷を修復するために止まることなく分割を行うであろう。これは細胞を死に至らせるかもしれないし、あるいはそれらが生き残り、変性したゲノムを伴って増殖する可能性もあって、それによって腫瘍抑制遺伝子と癌遺伝子の活性化のどちらも、例えば遺伝子の増幅によってなくなってしまうことになるかもしれない。遺伝子の増幅は、細胞に治療用薬物に対する耐性を発現させる機会を与える。 This compound or its derivative affects the p53 signaling pathway. p53 helps multicellular organisms safely and successfully cope with DNA damage and other stressful cellular events, stopping cell growth in potentially dangerous environments. Cancer cells tend to contain large amounts of mutated p53 protein, and accidents on the genes they suffered and stress growing in an inappropriate environment produced signals that normally activate p53 protein Suggests that. Thus, when p53 activity is lost, mutated cells can continue to pass through the cell cycle, which can be extremely dangerous for cancer. It also allows them to avoid apoptosis. So if those DNAs are damaged, some cells will die, but surviving cells will divide without stopping to repair the damage. This may cause the cells to die, or they may survive and grow with a degenerated genome, thereby activating both tumor suppressor and oncogenes, for example by gene amplification. It may be lost. Gene amplification gives cells the opportunity to develop resistance to therapeutic drugs.
植物キサントセラス ソルビフォリアから誘導された化合物またはその組成物は、癌細胞の分割を停止させるp53経路の要素および受容体を調節する。 A compound derived from the plant Xantoceros sorbifolia or a composition thereof modulates the elements and receptors of the p53 pathway that stop the division of cancer cells.
化合物またはその誘導体は細胞自殺シグナル経路に影響を与える。核を持つ全ての細胞は、細胞が破壊される前の信号を待ち受ける種々の不活性なプロキャスペース(procaspase)を含んでいる。それぞれの自殺プロテアーゼは、プロキャスペースと言われる不活性なプロ酵素として作られる。それは通常、キャスペースファミリーとは別物によってタンパク質開裂することにより活性化される。開裂したフラグメントの二つはキャプペースの活性部分を形成するために出会い、活性酵素はこれらの二つの部分が二つあるテトラマーであるはずと考えられる。それぞれの活性化されたキャスペース分子は多くのプロキャスペース分子を開裂でき、その結果より多くの分子を活性化できる。連鎖反応またはカスケードを経てこれはかなり大量のプロキャスペース分子の爆発的な作用をもたらす。続いて活性化されたプロキャスペースの幾分かは細胞内にある多くのキータンパク質、即ち調節された細胞死に至らせる特定の細胞質タンパク質や核−ラミンなどのキータンパク質を開裂する。 The compound or derivative thereof affects the cell suicide signal pathway. All cells with nuclei contain various inactive procaspases that wait for signals before the cells are destroyed. Each suicide protease is made as an inactive proenzyme called procaspace. It is usually activated by protein cleavage by something separate from the caspase family. Two of the cleaved fragments meet to form the active part of the capacities, and the active enzyme is thought to be a tetramer with two of these two parts. Each activated caspase molecule can cleave many pro-caspase molecules and consequently activate more molecules. Through a chain reaction or cascade, this leads to the explosive action of a fairly large amount of procaspace molecules. Subsequently, some of the activated procaspace cleaves many key proteins in the cell, ie, specific cytoplasmic proteins that lead to regulated cell death and key proteins such as nucleus-lamin.
細胞の外部にある細胞死受容体を活性化しても不活性なプロキャスペースを刺激できる。例えばキラーリンパ球は標的細胞の表面でタンパク質Fasを産生することによってアポトーシスを引き起こすことができる。それからFasタンパク質のこれらのクラスターは、プロキャスペース-8分子と結合してその分子を集める細胞内のアダプタータンパク質を補充する。その後これらは開裂し、互いに活性化する。活性化されたキャスペース-8分子は続いて下流側のプロキャスペースを活性化することによりアポトーシスを誘導する。 Activation of a death receptor outside the cell can also stimulate inactive procaspace. For example, killer lymphocytes can cause apoptosis by producing the protein Fas on the surface of target cells. These clusters of Fas proteins then recruit the adapter protein in the cell that binds to and collects Procaspase-8 molecules. They then cleave and activate each other. The activated caspase-8 molecule subsequently induces apoptosis by activating the downstream procaspace.
しかしながら癌細胞では細胞を破壊する信号は、遺伝子の突然変異が原因で遮断される。これは癌細胞が分割し続け、それによって腫瘍を生じさせることを意味する。 However, in cancer cells, the signals that destroy the cells are blocked due to gene mutations. This means that the cancer cells continue to divide, thereby giving rise to a tumor.
植物キサントセラス ソルビフォリアから誘導される化合物または組成物は自殺信号を遮断せず、癌細胞が自分自身を破滅させるようにする。 The compound or composition derived from the plant Xantoceros sorbifolia does not block the suicide signal, allowing the cancer cells to destroy themselves.
本発明は、トリテルペン骨格、即ちサポゲニンを含む化合物を提供し、その化合物においては、糖部分がそのトリテルペン骨格の3位炭素に結合し、アセチルおよび/または糖部分が21位および22位の炭素に結合し、そしてアンゲロイル基がその糖部分に結合している。これらの官能基はトリテルペンまたはサポゲニンに機能的に結合して化合物を形成している。 The present invention provides a compound comprising a triterpene skeleton, i.e., sapogenin, in which the sugar moiety is attached to the 3-position carbon of the triterpene skeleton, and the acetyl and / or sugar moieties are at the 21- and 22-position carbons. And an angeloyl group is attached to the sugar moiety. These functional groups are functionally linked to triterpenes or sapogenins to form compounds.
本発明は、ある量の上述した化合物を接触させる行程を含む、腫瘍細胞の成長を阻害するための方法を提供する。 The present invention provides a method for inhibiting tumor cell growth comprising the step of contacting an amount of a compound as described above.
本発明は、上述した患者に投与する行程を含む、患者の腫瘍細胞の背長を阻害するための方法を提供する。 The present invention provides a method for inhibiting the length of tumor cells in a patient comprising the step of administering to the patient as described above.
本発明は、以下の実施例からよりよく理解できるであろう。しかしながら当業者は、以後に続く請求の範囲でより充分に説明されるように、ここで述べられた特定の方法および結果が本発明を単に例示しているにすぎないことを容易に認識するであろう。 The invention will be better understood from the following examples. However, one skilled in the art will readily recognize that the specific methods and results set forth herein are merely illustrative of the invention, as will be more fully described in the claims that follow. I will.
薬用植物の抽出
(a)キサントセラス ソルビフォリアの鞘、または枝、または茎、または葉、または仁、または根、または樹皮の粉末を、比が1:2の有機溶媒を用い、4-5回、各回20-35時間にて抽出することによって有機系抽出液を得る行程、(b)その有機抽出液を集める行程、(c)その有機抽出液を80℃で2-3回還流することによって二次抽出液を得る行程、(d)その二次抽出液から有機溶媒を除去する行程、および(e)その抽出物を乾燥し、滅菌することによってキサントセラス ソルビフォリア抽出物粉末を得る行程。
Extraction of medicinal plants
(a) Xantoceros sorbifolia pods, branches, stems, leaves, or seeds, roots, or bark powder, using an organic solvent in a ratio of 1: 2, 4-5 times, 20-35 each time The process of obtaining an organic extract by extracting with time, (b) the process of collecting the organic extract, (c) the secondary extract by refluxing the organic extract at 80 ° C. 2-3 times. (D) the process of removing the organic solvent from the secondary extract, and (e) the process of obtaining xantoceras sorbifolia extract powder by drying and sterilizing the extract.
HPLCクロマトグラフィーによるキサントセラス ソルビフォリア抽出成分の分析
方法
HPLC: C-18逆相μボンダパックカラム(水P/N 27324)は、10%のアセトニトリル、0.005%のトリフルオロ酢酸(平衡化溶液)で平衡化した。例えば上述した方法のような本発明の方法や、当業者に既知の別の方法を用いて調整したキサントセラス ソルビフォリアの抽出物は、カラムにかける前に平衡溶液に溶解した(1mg/ml)。20ugのサンプルをカラムにかけた。
Analysis of Xantoceras sorbifolia extract components by HPLC chromatography
HPLC: A C-18 reverse phase μ bonder pack column (water P / N 27324) was equilibrated with 10% acetonitrile, 0.005% trifluoroacetic acid (equilibrated solution). For example, an extract of Xantoceros sorbifolia prepared using the method of the present invention, such as the method described above, or other methods known to those skilled in the art, was dissolved in an equilibration solution (1 mg / ml) before being applied to the column. A 20 ug sample was applied to the column.
溶出条件: フラクションは、アセトニトリル(70分で10%から80%の濃度勾配)を用いて溶出し(流速0.5ml/分)、続いて10分間、80%で維持する(70-80分)。次にアセトニトリルを10%になるまで滴下し(80-85分)、25分間10%で維持した(85-110分)。そのフラクションをチャートスピードが0.25cm/分、ODのフルスケールが0.128で207nmにおいてモニターした。 Elution conditions: Fractions are eluted with acetonitrile (concentration gradient from 10% to 80% in 70 minutes) (flow rate 0.5 ml / min) and subsequently maintained at 80% for 10 minutes (70-80 minutes). Acetonitrile was then added dropwise to 10% (80-85 minutes) and maintained at 10% for 25 minutes (85-110 minutes). The fraction was monitored at 207 nm with a chart speed of 0.25 cm / min and an OD full scale of 0.128.
装置
ウォーターズ モデル 510 溶媒供給システム(Waters Model 510 Solvent Delivery System)、ウォーターズ 484 調整可能な吸収検出器(Waters 484 tunable Absorbance Retector)、ウォーターズ 745/745B データ モジュール(Waters 745/745B Data Module)。
Equipment Waters Model 510 Solvent Delivery System, Waters 484 tunable Absorbance Retector, Waters 745 / 745B Data Module.
結果
HPLC: プロフィールで約60-70のピークがカウントできる。それらの中で4個が主要なピークであって、10個が中間の大きさ、そして残りが小さなフラクションである。主要なピークは、アセトニトリル溶出の濃度を増加させるにつれてaからzでラベルされている。図1参照。
result
HPLC: About 60-70 peaks can be counted in the profile. Among them, 4 are major peaks, 10 are medium size, and the rest are small fractions. The main peaks are labeled a to z as the concentration of acetonitrile elution is increased. See FIG.
MTT分析を用いて別個のヒト臓器から誘導した癌細胞に対するキサントセラス ソルビフォリア抽出物の細胞毒性についてのスクリーニング
方法および材料
細胞: ヒト癌細胞系は、アメリカン タイプ カルチャー コレクションから入手した。即ち、HTB-9(膀胱)、HeLa-S3(子宮頸部)、DU145(前立腺)、H460(肺)、MCF-7(胸部)、K562(白血球)、HCT116(大腸)、HepG2(肝臓)、U20S(骨)、T98G(脳)、およびOVCAR-3(卵巣)である。細胞は、10%の仔ウシ血清とグルタミンと抗生剤を補充した培養培地(HeLa-S3、DU145、MCF-7、Hep-G2およびT98GはMEM(アールの塩(Earle's salts))中、HTB-9、H460、K562、OVCAR-3はPMI-1640中、HCT-116、U2OSはMcCoy-5A中)において、5% CO2で加湿された37℃のインキュベータ内で増殖させた。
Screening Methods and Materials for Cytotoxicity of Xantoceros sorbifolia Extracts against Cancer Cells Derived from Separate Human Organs Using MTT Analysis Methods and Materials Cells: Human cancer cell lines were obtained from the American Type Culture Collection. That is, HTB-9 (bladder), HeLa-S3 (cervix), DU145 (prostate), H460 (lung), MCF-7 (chest), K562 (white blood cell), HCT116 (large intestine), HepG2 (liver), U20S (bone), T98G (brain), and OVCAR-3 (ovary). Cells were cultured in medium supplemented with 10% calf serum, glutamine and antibiotics (HeLa-S3, DU145, MCF-7, Hep-G2 and T98G in MEM (Earle's salts), HTB- 9, H460, K562, OVCAR-3 were grown in PMI-1640, HCT-116, U2OS in McCoy-5A) in a 37 ° C. incubator humidified with 5
MTT分析: MTT分析のための手法は、ほんのわずかな変形加えられたにすぎない(Carmichaelらの1987)に記載された方法に従った。細胞は、薬物−処理を行う24時間前に96−ウェルプレートに10,000個/ウェル(HTB-9、HeLa、H460、HCT116、T98G、OVCAR-3)、15,000個/ウェル(DU145、MCF-7、HepG2、U20S)、または40,000個/ウェル(K562)の濃度で植え付けた。続いて細胞は、48時間(HepG2、U20Sに対しては72時間、またMCF-7に対しては96時間)、薬物に接触させた。薬物−処理を行った後でMTT(0.5mg/ml)を加えて一時間培養した。フォルマザン(生存している細胞によってテトラゾリウムが還元された生成物)の形成物はDMSOで溶解し、490nmでのO.D.をELISA読みとり装置[ダイナテックモデル MR700(Dynatech. Model MR700)]によって測定した。薬物−処理前の細胞のMTTレベルも測定した(T0)。細胞−増殖の%(%G)は、下式で計算される。
結果:10個の細胞系の研究で、キサントセラス ソルビフォリア抽出物に対するそれらの感受性は4つのグループに分けることができる(最高の感受性:卵巣。感受性が高い:膀胱、骨、前立腺、白血球。ぎりぎりの感受性:肝臓、胸、および脳。感受性がほとんどない:大腸、子宮頸、および肺)。国際出願番号PCT/US04/33359の図23および表8.1参照。 Results: In a study of 10 cell lines, their susceptibility to Xantoceros sorbifolia extracts can be divided into four groups (best sensitivity: ovaries. Highly sensitive: bladder, bone, prostate, white blood cells. Sensitivity: liver, breast, and brain; little sensitivity: large intestine, cervix, and lung). See FIG. 23 and Table 8.1 of International Application No. PCT / US04 / 33359.
キサントセラス ソルビフォリア抽出物に含まれる活性成分-Y1の精製および構造決定
(A)FPLCを用いたキサントセラス ソルビフォリア抽出物成分の分画
Purification and structure determination of active ingredient-Y1 contained in Xantoceras sorbifolia extract (A) Fractionation of Xantoceras sorbifolia extract component using FPLC
方法
カラム: オクタデシルで機能付けしたシリカゲル; カラムの寸法:2cm×28cm; 10%のアセトニトリル−0.005%のTFAを用いて平衡化。
サンプルの載置: 1-2ml、濃度:10%アセトニトリル/TFA中100mg/ml。
傾斜溶出: 全容量が500mlで10-80%のアセトニトリル。
モニター吸収波長: 254nm。
フラクションコレクター: 5ml/フラクション(10%から72%のアセトニトリルを集める。全部で90フラクション)。
装置: AKTA-FPLC、P920ポンプ; モニターUPC-900; Frac-900。
Methods Column: Silica gel functionalized with octadecyl; Column dimensions: 2 cm x 28 cm; equilibrated with 10% acetonitrile-0.005% TFA.
Sample loading: 1-2 ml, concentration: 100 mg / ml in 10% acetonitrile / TFA.
Gradient elution: 10-80% acetonitrile in a total volume of 500 ml.
Monitor absorption wavelength: 254nm.
Fraction collector: 5 ml / fraction (collect 10% to 72% acetonitrile. 90 fractions in total).
Equipment: AKTA-FPLC, P920 pump; Monitor UPC-900; Frac-900.
結果
溶出プロフィールは4-5個の広いフラクションを示す。図2A参照。これらのフラクションはHPLCを用いて分析した。それから特定の成分、即ち図1で特定化されたa-zがFPLCフラクションに割り当てられる。
Results The elution profile shows 4-5 broad fractions. See Figure 2A. These fractions were analyzed using HPLC. A specific component, ie az specified in FIG. 1, is then assigned to the FPLC fraction.
FPLCフラクションは7個のプールにグループ分けされ、MTT分析を用いて膀胱細胞の持つ細胞増殖作用に対して分析した。一つのプール(#5962)のみが阻害作用を有していることがわかった。図2B参照。本発明のキサントセラス ソルビフォリア植物抽出物から精製したフラクションY(5962)は、増殖刺激作用は持っていないが阻害作用は維持している。 The FPLC fractions were grouped into 7 pools and analyzed for the proliferative effects of bladder cells using MTT analysis. Only one pool (# 5962) was found to have an inhibitory effect. See Figure 2B. Fraction Y (5962) purified from the Xantoceros sorbifolia plant extract of the present invention does not have a growth stimulating action but maintains an inhibitory action.
(B)64%のアセトニトリルアイソクラティック溶出を用いたC18オープンカラムによるFPLCを用いたフラクション#5962の分画
方法
カラム: オクタデシルで機能付けしたシリカゲル; 50ml; 2cm×28cm; 64%のアセトニトリル−0.005%のTFAを用いて平衡化。
サンプルの載置: 0.2ml、濃度:65%アセトニトリル/TFA中1-2mg/ml。
溶出: 64%のアセトニトリルアイソクラティック溶出。
モニター吸収波長: 254nm
フラクションコレクター: 1ml/フラクション(はじめの90フラクションを集める)
装置: AKTA-FPLC、P920ポンプ; モニターUPC-900; Frac-900。
(B)
Sample loading: 0.2 ml, concentration: 1-2 mg / ml in 65% acetonitrile / TFA.
Elution: 64% acetonitrile isocratic elution.
Monitor absorption wavelength: 254nm
Fraction collector: 1ml / fraction (collect the first 90 fractions)
Equipment: AKTA-FPLC, P920 pump; Monitor UPC-900; Frac-900.
結果
フラクション5962は、オープンODS-C18カラムを用いて64%のアセトニトリルアイソクラティック溶出でさらに分離した。二つの主要なフラクション、即ちXおよびYが集められた。図3参照。MTT分析は、Yフラクションのみが阻害活性を有していることを示した。図4参照。
(C)HPLCを用いたフラクションYの分析
方法
カラム: ウォーターズμボンダパックC18(3.9mm×300cm)
溶出: 35%または45%のアイソクラティック溶出。
流速: 0.5ml/分; O.D.スケール、0.128で207nmにてモニター; チャート速度:0.25cm/分。
(C) Fraction Y analysis using HPLC Method Column: Waters µ Bonder Pack C18 (3.9mm x 300cm)
Elution: 35% or 45% isocratic elution.
Flow rate: 0.5 ml / min; OD scale, 0.128 monitored at 207 nm; Chart speed: 0.25 cm / min.
結果
35%のアイソクラティック分析では、Yフラクションは4-5個の成分(Y0、Y1、Y2、Y3、Y4およびY5)を含んでいる。図5参照。
result
In the 35% isocratic analysis, the Y fraction contains 4-5 components (Y0, Y1, Y2, Y3, Y4 and Y5). See FIG.
(D)活性なYs成分の最終的な単離がプレパラティブHPLCを用いて達成された
方法
カラム: プレパラティブHPLCカラム(ウォーターズ デルタ パック C18-300A)。
溶出: 流速1ml/分で45%のアセトニトリルアイソクラティック溶出。207nmにてモニター。
(D) Final isolation of active Ys component was achieved using preparative HPLC Method Column: Preparative HPLC column (Waters Delta Pack C18-300A).
Elution: 45% acetonitrile isocratic elution at a flow rate of 1 ml / min. Monitor at 207nm.
結果
Y1およびY2は互いにうまく分離し、個別に集められる。Y3/4およびY5はうまく分離できない。図6参照。Y1のピークのフラクションが集められて凍結乾燥された(化合物-Y1)。
result
Y1 and Y2 are well separated from each other and collected separately. Y3 / 4 and Y5 cannot be separated well. See FIG. The fraction of the Y1 peak was collected and lyophilized (compound-Y1).
外観および溶解度: 純粋な化合物であるY1は、アモルファスな白色粉末であって、水性アルコール(メタノール、エタノール)、50%アセトニトリル、および100%ピリジンに溶解する。 Appearance and Solubility: A pure compound, Y1, is an amorphous white powder that dissolves in aqueous alcohol (methanol, ethanol), 50% acetonitrile, and 100% pyridine.
MTT分析を用いた化合物Y1およびY2の阻害作用。結果は、Y1とY2のどちらも抗癌作用を有していることを示している。図17参照。 Inhibitory effect of compounds Y1 and Y2 using MTT assay. The results show that both Y1 and Y2 have anticancer effects. See FIG.
(E)キサントセラス ソルビフォリア抽出物である化合物Y1の化学構造の決定
方法
NMR分析: キサントセラスソルビフォリアの純粋化合物Y1は、0.05%v/vのTMSを入れたピリジン-D5に溶解した。全てのNMRスペクトルは、298KでQXIプローブ(1H/13C/15N/31P)を用いたブルッカー アバンス(Bruker Avance) 600 MHzを利用して獲得した。1D 1Hスペクトルについて行ったスキャン数は16から128であり、それはサンプル濃度に依存している。2D HMQCスペクトルは、スペクトル幅が6000×24,000Hzであって、データポイントがt2およびt1のディメンジョンに対してそれぞれ2024×256で記録した。スキャン数は4から128であった。2D HMBCは6000×30,000Hzのスペクトル幅と、t2およびt1のディメンジョンに対してそれぞれ2024×512のデータポイントとを必要とした。スキャン数は64であった。2Dデータは、データポイントを二倍にするためにt1ディメンジョンはゼロに合わせ、t1ディメンジョンとt2ディメンジョンの両方でコサイン−スクエア−ベル−ウインドウ(cosine-square-bell-window)関数によってかけ算してからソフトウェアXWIN-NMRを用いてフーリエ変換した。これらの2Dスペクトルの最終的な実質的マトリックスサイズは、HMQCおよびHMBCに対してそれぞれ2048×256および2048×512のデータポイント(F2×F1)である。
(E) Xantoceras Method for Determining the Chemical Structure of Compound Y1, an Extract of Sorbifolia
NMR analysis: The pure compound Y1 of Xantoceros sorbifolia was dissolved in pyridine-D5 containing 0.05% v / v TMS. All NMR spectra were acquired using a Bruker Avance 600 MHz with a QXI probe (1H / 13C / 15N / 31P) at 298K. The number of scans performed on the 1D 1H spectrum is 16 to 128, depending on the sample concentration. The 2D HMQC spectrum was recorded with a spectral width of 6000 × 24,000 Hz and data points of 2024 × 256 for the t2 and t1 dimensions, respectively. The number of scans was 4 to 128. 2D HMBC required a spectral width of 6000 × 30,000 Hz and 2024 × 512 data points for t2 and t1 dimensions, respectively. The number of scans was 64. 2D data is multiplied by the cosine-square-bell-window function for both t1 and t2 dimensions, with the t1 dimension set to zero to double the data points. Fourier transform was performed using the software XWIN-NMR. The final substantial matrix size of these 2D spectra is 2048 × 256 and 2048 × 512 data points (F2 × F1) for HMQC and HMBC, respectively.
マススペクトル分析: サンプルの質量は、MALDI-TOFマススペクトル分析装置によって分析した。 Mass spectrum analysis: The mass of the sample was analyzed with a MALDI-TOF mass spectrum analyzer.
MALDI-TOFのためのサンプルはまずアセトニトリルに溶解し、続いてマトリックスCHCA(アルファ-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸、採集濃度は、50:50の水/アセトニトリルと0.1%のTHFに入れた10mgのCHCA/mL)と混合した。このサンプルはアセトニトリルに完全に溶解し、マトリックスと混合した後溶解したままにした。分子量は、標準を用いた高分解能の質量スペクトル分析によって測定した。
Samples for MALDI-TOF were first dissolved in acetonitrile, followed by matrix CHCA (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid,
結果
Y1のプロトンNMRのプロフィールが図7に示されている。Y1の2D NMR(HMQC)のプロフィールは図8に示されている。Y1の2D NMR(HMBC)のプロフィールは図9に示されている。Y1の2D NMR(COSY)のプロフィールは図10に示されている。
result
The proton NMR profile of Y1 is shown in FIG. The YD 2D NMR (HMQC) profile is shown in FIG. The 2D NMR (HMBC) profile of Y1 is shown in FIG. The 2D NMR (COSY) profile of Y1 is shown in FIG.
結論
化学シフト分析データに基づくと表1に示されているように、キサントセラス ソルビフォリアの抽出物から単離された活性化合物Y1は4個の糖とその糖部分に結合した二個のアンゲロイル基とを持つトリテルペノイドのサポニンである。Y1の化学式はC65H100O27であって、その構造式およびY1の化学名は、
MALDI-TOFによって測定した場合Y1の質量は1358.71であり、それはY1(1312.64)に2個のNaと1個のプロトンを加えた(M+2Na+H)理論的質量に一致している。
The mass of Y1 as measured by MALDI-TOF is 1358.71, which is consistent with the theoretical mass of Y1 (1312.64) plus 2 Na and 1 proton (M + 2Na + H).
Y2分析の結果
Y2のプロトンNMRのプロフィールは図11に示されている。Y2の2D NMR(HMQC)のプロフィールは図12に示されている。
Results of Y2 analysis
The proton NMR profile of Y2 is shown in FIG. The 2D NMR (HMQC) profile of Y2 is shown in FIG.
Y5のプロトンNMRのプロフィールは図13に示されている。Y5の2D NMR(HMQC)のプロフィールは図14に示されている。 The proton NMR profile of Y5 is shown in FIG. The YD 2D NMR (HMQC) profile is shown in FIG.
化合物Yの酸加水分解
化合物Yは国際出願番号第PCT/US04/33359号においてキサントセラス ソルビフォリアから同定され、精製されている。第107頁第5-31行目から第108頁第1-10行目、および第110頁第15-30行目、および第136頁第1-14行目参照。
Acid Hydrolysis of Compound Y Compound Y has been identified and purified from Xantoceros sorbifolia in International Application No. PCT / US04 / 33359. See page 107, lines 5-31 to 108, lines 1-10, and
化合物Yを酸加水分解することによって、この明細書でY1-cとして指名された以下の構造式を持つ以下の化合物を生成する。 Compound Y is acid hydrolyzed to produce the following compound having the following structural formula designated herein as Y1-c.
方法: 5mgのYを3mlのMeOHに溶解し、続いて3NのHCl、3mlを用いて処理した。サポニンの加水分解は4時間還流することで誘導される。加水分解の後でその溶液を5%のNa2CO3で中和し、EtOAcを用いて抽出することによってそれぞれ糖とアグリコンを含む水層と有機層が形成された。有機層から得られるアグリコンは、シリカゲルクロマトグラフィーに載せて(CHCl3:MeOH、1:9)で更に精製してもよいし、またはC18 ODS HPLCクロマトグラフィーを用いて更に精製してもよい。下記に示されたような構造式Y-cの化合物を約2mg得ることができる。 Method: 5 mg Y was dissolved in 3 ml MeOH followed by treatment with 3N HCl, 3 ml. Saponin hydrolysis is induced by refluxing for 4 hours. After hydrolysis, the solution was neutralized with 5% Na2CO3 and extracted with EtOAc to form an aqueous layer and an organic layer containing sugar and aglycone, respectively. The aglycone obtained from the organic layer may be further purified by silica gel chromatography (CHCl3: MeOH, 1: 9) or may be further purified using C18 ODS HPLC chromatography. About 2 mg of the compound of structural formula Yc as shown below can be obtained.
方法の参照文献: 炭水化物化学の本質(Essentials of Carbohydrate Chemistry)。John F. Robyt, (Springer, 1998)による。 Method Reference: Essentials of Carbohydrate Chemistry. According to John F. Robyt, (Springer, 1998).
オリゴ糖のリンケージは部分的な酸加水分解によって、また特定の酵素による加水分解によって開裂できる。例えばアラビノフラノシルの1→4リンケージはα−アミラーゼによって除去できる。β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、マンナーゼ、およびプルラナーゼのような他の酵素は、サポニンに含まれる個々のサッカライドを開裂するために利用できる。 Oligosaccharide linkages can be cleaved by partial acid hydrolysis and by specific enzymatic hydrolysis. For example, the 1 → 4 linkage of arabinofuranosyl can be removed by α-amylase. Other enzymes such as β-amylase, isoamylase, glucose oxidase, mannase, and pullulanase can be used to cleave individual saccharides contained in saponins.
この構造のアンゲロイル基はアルカリ加水分解によって除去できる。例えば化合物Yを1M NaOHに溶解し、2-3時間室温で攪拌する。続いてその溶液を2M HClを用いて酸性または中性にしてから加水分解したサポニンを酢酸エチルで抽出することができる。更なる精製はC18カラムを用いたHPLCで達成できる。構造式Yの酵素加水分解によれば、以下の構造式が得られる。
キサントセラス ソルビフォリア抽出物から得られる化合物R1の精製および構造決定
(A)FPLC(傾斜溶出)を用いたキサントセラス ソルビフォリア抽出成分の分画
方法
カラム: オクタデシルで条件付けしたシリカゲル; カラムの寸法:2cm×28cm; 10%のアセトニトリル−0.05%のTFAを用いて平衡化。
サンプルの載置: 1-2ml、濃度:10%アセトニトリル/TFA中100mg/ml。
傾斜溶出: 全容量が500mlで10-80%のアセトニトリル。モニター吸収波長: 254nm。
フラクションコレクター: 5ml/フラクション(10%から72%のアセトニトリルを集める。全部で90フラクション)
装置: AKTA-FPLC、P920ポンプ; モニターUPC-900; Frac-900。
Purification and structure determination of compound R1 from Xantoceras sorbifolia extract
(A) Fractionation of Xantoceros sorbifolia extract components using FPLC (gradient elution) Column: Silica gel conditioned with octadecyl; Column dimensions: 2 cm x 28 cm; Equilibrated with 10% acetonitrile-0.05% TFA .
Sample loading: 1-2 ml, concentration: 100 mg / ml in 10% acetonitrile / TFA.
Gradient elution: 10-80% acetonitrile in a total volume of 500 ml. Monitor absorption wavelength: 254nm.
Fraction collector: 5 ml / fraction (collect 10% to 72% acetonitrile. 90 fractions in total)
Equipment: AKTA-FPLC, P920 pump; Monitor UPC-900; Frac-900.
結果
溶出プロフィールは4-5個の広いフラクションを示す。図2A参照。これらのフラクションはHPLCを用いて分析した。それから特定の成分、即ちa-zがFPLCプロフィールおよびフラクションに割り当てられる。図1参照。
Results The elution profile shows 4-5 broad fractions. See Figure 2A. These fractions were analyzed using HPLC. A particular component, ie az, is then assigned to the FPLC profile and fraction. See FIG.
(B)30%のアセトニトリルアイソクラティック溶出を用いたFPLCによるRの分画
方法
カラム: オクタデシルで機能付けしたシリカゲル; 50ml; 2cm×28cm; 30%のアセトニトリル−0.005%のTFAを用いて平衡化。
サンプルの載置: 0.2ml、濃度:30%アセトニトリル/TFA中1-2mg/ml。
溶出: 30%のアセトニトリルアイソクラティック溶出。
モニター吸収波長: 254nm。
フラクションコレクター: 5ml/フラクション(はじめの90フラクションを集める)
装置: AKTA-FPLC、P920ポンプ; モニターUPC-900; Frac-900。
(B) Fractionation of R by FPLC using 30% acetonitrile isocratic elution Column: Silica gel functionalized with octadecyl; 50ml; 2cm x 28cm; 30% acetonitrile-equilibrated with 0.005% TFA .
Sample loading: 0.2 ml, concentration: 1-2 mg / ml in 30% acetonitrile / TFA.
Elution: 30% acetonitrile isocratic elution.
Monitor absorption wavelength: 254nm.
Fraction collector: 5ml / fraction (collect the first 90 fractions)
Equipment: AKTA-FPLC, P920 pump; Monitor UPC-900; Frac-900.
結果
FPLCの傾斜溶出から得られるNo.39-41のフラクション(図2A)を集めて、オープンODS-C18カラムを用いて30%のアセトニトリルアイソクラティック溶出でさらに精製した。二つのグループに6個の同定可能なフラクションが集められた。図18参照。フラクション6-13はHPLCを用いてさらに特徴づけた。
result
The No. 39-41 fraction obtained from the gradient elution of FPLC (FIG. 2A) was collected and further purified with 30% acetonitrile isocratic elution using an open ODS-C18 column. Six identifiable fractions were collected in two groups. See FIG. Fractions 6-13 were further characterized using HPLC.
(C)HPLCを用いたRの分析および単離
方法
カラム: ウォーターズμボンダパックC18(3.9mm×300cm)、およびウォーターズデルタパック C18(7.8mm×30cm)。
溶出: 傾斜溶出(10-80%)および30%のアイソクラティック溶出。
流速: 0.5ml/分; 207nm; 減衰0.128; チャート速度:0.25cm/分。
(C) Analysis and isolation of R using HPLC Method Column: Waters μ Bonder Pack C18 (3.9 mm × 300 cm), and Waters Delta Pack C18 (7.8 mm × 30 cm).
Elution: Gradient elution (10-80%) and 30% isocratic elution.
Flow rate: 0.5 ml / min; 207 nm; Attenuation 0.128; Chart speed: 0.25 cm / min.
結果
HPLC傾斜溶出分析を行ったところフラクション9-11には、一個の主要な成分と数個の少量の成分が含まれている。図19参照。これらの成分はデルタパックカラムで30%アセトニトリルアイソクラティック溶出を行うと4-5個の成分にさらに分離した。「R1」としてここに命名されたフラクションが主要な成分である。図20A参照。このフラクションR1はカラムから集めることによって連続的に単離された。図20B参照。
result
When HPLC gradient elution analysis was performed, fraction 9-11 contained one major component and several minor components. See FIG. These components were further separated into 4-5 components by 30% acetonitrile isocratic elution on a Deltapack column. The fraction named here as “R1” is the main component. See FIG. 20A. This fraction R1 was continuously isolated by collecting from the column. See FIG. 20B.
外観および溶解度
純粋なR1はアモルファスな白色粉末であって、水性アルコール(メタノール、エタノール)、50%アセトニトリルおよび100%ピリジンに溶解する。
Appearance and Solubility Pure R1 is an amorphous white powder that dissolves in aqueous alcohol (methanol, ethanol), 50% acetonitrile and 100% pyridine.
(D)キサントセラス ソルビフォリア抽出物から単離されたR1の化学構造式の決定
方法
NMR分析: キサントセラス ソルビフォリアの純粋なR1フラクションについてNMR分析を行うための手法は、実験4に記載されたのと同じである。
マススペクトル分析: サンプルの質量は、前のセクションで記載されたような(A)MALDI-TOF質量分析法によって分析した。
結果
純粋なR1のプロトンNMRは、図21に示されている。R1の2D NMR(HMQC)スペクトルは図22に示された。R1の2D NMR(HMBC)スペクトルは図24に示された。カーボン13 NMRスペクトルは図25に示された。
(D) Xantoceras Method for determination of chemical structural formula of R1 isolated from sorbifolia extract
NMR analysis: The procedure for performing NMR analysis on the pure R1 fraction of Xantoceros sorbifolia is the same as described in
Mass spectral analysis: The mass of the samples was analyzed by (A) MALDI-TOF mass spectrometry as described in the previous section.
Results The proton NMR of pure R1 is shown in FIG. The 2D NMR (HMQC) spectrum of R1 is shown in FIG. The 2D NMR (HMBC) spectrum of R1 is shown in FIG. The
上記に示したデータ全てに基づいて以下の表、即ち表2には、化合物R1の官能基の構造分析と割り当ての結果がまとめられている。
a データは、COSY、HMQCおよびHMBCの相関関係に基づいて割り当てた。b、c、d、f 各カラムで同じラベルを付したデータはオーバーラップしていた。e 各カラムで同じラベルを付したデータは相互変換してもよい。 a Data assigned based on COSY, HMQC and HMBC correlations. b, c, d, f Data with the same label in each column overlapped. e Data with the same label in each column may be mutually converted.
結論
化学シフト分析に基づくと、キサントセラス ソルビフォリアの抽出物から単離された化合物R1は、5個の糖とその糖部分に結合した一個のアンゲロイル基とを持つトリテルペノイドサポニンである。化合物R1の化学式はC65H106O29であって、R1の化学名は、
キサントセラス ソルビフォリア抽出物から得られる成分-Oの精製
(A)FPLC(傾斜溶出)を用いたキサントセラス ソルビフォリア抽出成分の分画
方法
カラム: オクタデシルで条件付けしたシリカゲル; カラムの寸法:2cm×28cm; 10%のアセトニトリル−0.05%のTFAを用いて平衡化。
サンプルの載置: 1-2ml、濃度:10%アセトニトリル/TFA中100mg/ml。
傾斜溶出: 全容量が500mlで10-80%のアセトニトリル。
モニター吸収波長: 254nm。
フラクションコレクター: 5ml/フラクション(10%から72%のアセトニトリルを集め、全部で90フラクション)
装置: AKTA-FPLC、P920ポンプ; モニターUPC-900; Frac-900。
Purification of Component-O from Xantoceras sorbifolia extract
(A) Fractionation of Xantoceras sorbifolia extract components using FPLC (gradient elution) Column: Silica gel conditioned with octadecyl; Column dimensions: 2 cm x 28 cm; Equilibrated with 10% acetonitrile-0.05% TFA .
Sample loading: 1-2 ml, concentration: 100 mg / ml in 10% acetonitrile / TFA.
Gradient elution: 10-80% acetonitrile in a total volume of 500 ml.
Monitor absorption wavelength: 254nm.
Fraction collector: 5ml / fraction (collecting 10% to 72% acetonitrile, total 90 fractions)
Equipment: AKTA-FPLC, P920 pump; Monitor UPC-900; Frac-900.
結果
溶出プロフィールは4-5個の広いフラクションを示す(図2A参照)。これらのフラクションはHPLCを用いて分析した。それから特定の成分(a-z)がFPLCプロフィールおよびフラクションに割り当てられる。
Results The elution profile shows 4-5 broad fractions (see Figure 2A). These fractions were analyzed using HPLC. A specific component (az) is then assigned to the FPLC profile and fraction.
(B)20%のアセトニトリルアイソクラティック溶出を用いたHPLCによる成分-Oの分画
方法
カラム: プレパラティブHPLCカラム(ウォーターズ デルタ パック C18-300A)。
サンプル: FPLCの傾斜溶出によって得られたフラクション#28が集められ、HPLCにかけられた。
溶出: 流速1ml/分で20%のアセトニトリルアイソクラティック溶出。フラクションが集められた。207nmでモニターした。28、34、および54を含むフラクションが集められ、凍結乾燥された。これらのフラクションの再−クロマトグラフィーが同じ条件下で行われた。
(B) Method of fractionation of component-O by HPLC using 20% acetonitrile isocratic elution Column: Preparative HPLC column (Waters Delta Pack C18-300A).
Sample:
Elution: 20% acetonitrile isocratic elution at a flow rate of 1 ml / min. Fractions were collected. Monitored at 207 nm. Fractions containing 28, 34, and 54 were collected and lyophilized. Re-chromatography of these fractions was performed under the same conditions.
結果
16個の同定可能なフラクションが溶出プロフィールおいて見い出された(図33)。フラクション28、34および54は同じ条件のHPLCを用いて更に特徴を明らかにされた。図34、35および36はそれぞれフラクション28、34および54が単一のピークの溶出であることを示しており、それらが同一(純粋)であることを指示している。
result
Sixteen identifiable fractions were found in the elution profile (Figure 33).
外観および溶解度
精製されたO-28およびO-34は明るい黄色のアモルファス粉末であって、水性アルコール(メタノール、エタノール)、50%アセトニトリルおよび100%ピリジンに溶解する。精製されたO-54は白色のアモルファス粉末であって、水性アルコール(メタノール、エタノール)、50%アセトニトリルおよび100%ピリジンに溶解する。
Appearance and Solubility Purified O-28 and O-34 are bright yellow amorphous powders that are soluble in aqueous alcohol (methanol, ethanol), 50% acetonitrile and 100% pyridine. Purified O-54 is a white amorphous powder that dissolves in aqueous alcohol (methanol, ethanol), 50% acetonitrile and 100% pyridine.
(C)成分-Oから精製した化合物の構造分析
方法
NMR分析: キサントセラス ソルビフォリアの純粋なR1フラクションについてNMR分析を行うための手法は、実験4に記載されたのと同じである。
マススペクトル分析。 サンプルの質量は、実験4で記載されたような(A)MALDI-TOF質量分析法によって分析した。
(C) Structural analysis of compounds purified from component-O
NMR analysis: The procedure for performing NMR analysis on the pure R1 fraction of Xantoceros sorbifolia is the same as described in
Mass spectral analysis. Sample mass was analyzed by (A) MALDI-TOF mass spectrometry as described in
本発明は好適な態様に特定の参照文献を用いて詳細に説明したが、本発明が他の異なる態様でも可能であること、またその詳細がさまざまな明白な観点において修飾できることを理解すべきである。当業者にとって容易に明らかであるように、変形や修飾が本発明の精神および範囲内にとどまっているかぎり用いられてもよい。したがって前述した開示、説明、および図面は例示の目的しかなく、請求の範囲によってのみ定義される本発明を何ら制限するものではない。 Although the invention has been described in detail with reference to a preferred embodiment, it should be understood that the invention is capable of other and different embodiments, and that the details can be modified in various obvious respects. is there. As will be readily apparent to those skilled in the art, variations and modifications may be used so long as they remain within the spirit and scope of the invention. Accordingly, the foregoing disclosure, description, and drawings are for illustrative purposes only and are not intended to limit the invention as defined solely by the claims.
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Claims (122)
(a)ベングォングォの鞘、または果柄、または種子の殻、または葉、または枝、または茎、または根、または樹皮の粉末を、薬用植物と溶媒の比が1:2の有機溶媒を用い、4-5回、各回20-35時間にて抽出することによって有機溶媒抽出物を得る行程、
(b)前記有機溶媒抽出物を集めて80℃で2-3回還流することによって二次抽出物を得る行程、
(c)前記二次抽出物を水に溶解することによって水性溶液を得る行程、
(d)クロマトグラフィーによってn-ブタノール抽出物からサポニン類を分離することによって粗のサポニン類を得る行程
を含む方法によって得られる請求項2の組成物。 Crude saponins from Wenguanguo or Xanthceras sorbifolia pods, or stalks, or seed shells, or leaves, branches, stems, roots, or bark, have the following steps:
(a) using bengwongo pods, fruit stalks, seed shells, leaves, branches, stems, roots, or bark powder, using an organic solvent with a medicinal plant to solvent ratio of 1: 2, The process of obtaining the organic solvent extract by extracting 4-5 times, 20-35 hours each time,
(b) collecting the organic solvent extracts and refluxing them at 80 ° C. 2-3 times to obtain a secondary extract;
(c) a step of obtaining an aqueous solution by dissolving the secondary extract in water;
The composition of claim 2 obtained by a method comprising (d) a step of obtaining crude saponins by separating saponins from an n-butanol extract by chromatography.
(a)仁を加圧してその仁から油分を除去することによって仁の一塊を形成する行程、
(b)前記仁の一塊を根拠としてn-ヘキサンを用いて抽出することにより、n-ヘキサン抽出液を得る行程、
(c)前記n-ヘキサン抽出液からn-ヘキサンを除去する行程、
(d)前記n-ヘキサン抽出物を乾燥して仁の粉末を得る行程、
(e)前記仁の粉末を、有機溶媒との比が1:2の有機溶媒を用い、4-5回、各回20-35時間にて抽出することによって有機溶媒抽出物を得る行程、
(f)前記有機溶媒抽出物を集めて80℃で2-3回還流することによって二次抽出物を得る行程、
(g)前記二次抽出物を水に溶解することによって水性溶液を得る行程、
(h)前記水性溶液をn-ブタノールを用いて抽出することによってn-ブタノール抽出物を得る行程、および
(i)クロマトグラフィーによって前記n-ブタノール抽出物からサポニン類を分離することによって粗のサポニン類を得る行程
を含む方法によって得られる請求項2の組成物。 Crude saponin from bengwongo or xantoceras sorbifolia japonicum has the following process:
(a) a process of forming a lump of nin by pressurizing the nin and removing oil from the nin
(b) a step of obtaining an n-hexane extract by extracting with n-hexane on the basis of the lump of the seed;
(c) a step of removing n-hexane from the n-hexane extract,
(d) a step of drying the n-hexane extract to obtain a seed powder;
(e) a step of obtaining an organic solvent extract by extracting the seed powder with an organic solvent having a ratio of 1: 2 with the organic solvent, 4-5 times, 20-35 hours each time,
(f) collecting the organic solvent extracts and refluxing them at 80 ° C. 2-3 times to obtain a secondary extract;
(g) a step of obtaining an aqueous solution by dissolving the secondary extract in water;
(h) obtaining an n-butanol extract by extracting the aqueous solution with n-butanol; and
3. The composition of claim 2 obtained by a process comprising the step of (i) obtaining crude saponins by separating saponins from said n-butanol extract by chromatography.
3-o-[アンゲロイル-(1(3)-(-D-グルコピラノシル-(1(6)]-(-D-グルコピラノシル-28-o-[(-L-ラムノピラノシル-(1(2)-(-D-グルコピラノシル-(1(6)-(-D-グルコピラノシル-3(, 21(, 22(, 28-テトラヒドロキシオレアン-12-エン
を持つ構造式(構造式R1)からなる化合物。 The following chemical names:
3-o- [angeloyl- (1 (3)-(-D-glucopyranosyl- (1 (6)]-(-D-glucopyranosyl-28-o-[(-L-rhamnopyranosyl- (1 (2)-( A compound comprising the structural formula (Structural Formula R1) having -D-glucopyranosyl- (1 (6)-(-D-glucopyranosyl-3 (, 21 (, 22 (, 28-tetrahydroxyolean-12-ene).
からなる化合物。 The following structural formula,
A compound consisting of
(a)有機溶媒を用いてキサントセラス ソルビフォリア粉末を抽出する行程、
(b)その有機抽出液を集める行程、
(c)その有機抽出液を還流して二次抽出液を得る行程、
(d)その二次抽出液から有機溶媒を除去する行程、
(e)その二次抽出物を乾燥し、滅菌することによってキサントセラス ソルビフォリアの粗抽出物粉末を得る行程、
(f)その粗抽出物粉末を、シリカゲル、C18および他の等価の固相材料を用いたHPLCおよびFPLCクロマトグラフィーを利用して成分に分画する行程、
(g)207nmまたは254nmでの吸収波長をモニターする行程、
(h)前記粗抽出物粉末の生物活性のある成分を同定する行程、
(i)その粗抽出物粉末の一個またはそれ以上の生物活性のある成分を精製することによってその生物活性のある成分の一個またはそれ以上のフラクションを得る行程、および
(j)プレパラティブHPLCを用いて生物活性のある成分を単離する行程。 A method for isolating a compound derived from a medicinal plant comprising Xantoceras sorbifolia comprising the following steps.
(a) a process of extracting Xantoceras sorbifolia powder using an organic solvent,
(b) collecting the organic extract;
(c) a step of refluxing the organic extract to obtain a secondary extract,
(d) the step of removing the organic solvent from the secondary extract,
(e) the step of obtaining a crude extract powder of Xantoceros sorbifolia by drying and sterilizing the secondary extract;
(f) the step of fractionating the crude extract powder into components using HPLC and FPLC chromatography using silica gel, C18 and other equivalent solid phase materials;
(g) the process of monitoring the absorption wavelength at 207 nm or 254 nm,
(h) a step of identifying a biologically active component of the crude extract powder;
(i) the step of obtaining one or more fractions of the biologically active component by purifying one or more biologically active components of the crude extract powder; and
(j) The process of isolating biologically active components using preparative HPLC.
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