JP2007515157A - サイトカインアンタゴニスト分子 - Google Patents
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
【選択図】なし
Description
本明細書に引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、引用により完全に本明細書に含まれるものとする。
バイオインフォマティクスツールの潜在能力及び精度が高まっているために、前記ツールは通常の生化学的特徴付け技術と急速に置き換えられつつある。実際、本発明の同定に用いた高度なバイオインフォマティクスツールは、今や、高い信頼性をもった結果を出力する能力を有する。
配列データが利用可能になるにつれ、種々の研究機関及び企業組織がそれらを調査し、重要な発見が絶え間なく達成され続けている。しかしながら、研究及び薬剤発見のための標的として、更なる遺伝子及びそれらがコードするポリペプチドを同定し特徴付ける必要性は引き続き存在している。
個々のデータリソース由来のタンパク質及び核酸配列データを統合することの背後に存在する目的は、配列自体及び各配列に関連する情報について、可能な限り多くのデータを一つの統合リソースにまとめることである。コード化タンパク質の三次元構造に関するデータを含め、各配列に関する利用可能な全てのデータが、利用可能である場合、各配列についての既知情報を利用するために一緒に統合されることによって、前記配列の比較から最も知識に基づく予測を行うことが可能となる。データベースにおいて得られる、各配列エントリーに伴って生じる注釈付け(アノテーション)は、生物学的に関連性がある状況を配列情報に与える。
前記データリソースは、タンパク質機能を配列のみから精密に予測することを可能にしている。そのような予測は、通常の技術を用いるのであれば、同じ機能性ファミリーの他のタンパク質に対して高度な配列同一性(約20%〜30%より高い同一性)を示すタンパク質についてのみ可能である。機能が既知な他の近縁タンパク質に対して非常に低度の配列相同性を示すタンパク質については、精密な予測が不可能である。
細胞が細胞外タンパク質を作って分泌する能力は、多くの生物学的過程の中心となる。酵素、増殖因子、細胞外基質タンパク質及びシグナル分子は、全て細胞によって分泌されている。このような分泌は、分泌小胞と形質膜との融合を介している。全部ではないが、ほとんどの場合、タンパク質は、シグナルペプチドによって、小胞体に方向付けられて分泌小胞内へと移動させられる。シグナルペプチドは、細胞質から分泌小胞のような膜結合区画へのペプチド鎖輸送に影響を与えるシス作用性配列である。分泌小胞を標的とするポリペプチドは、細胞外基質へと分泌されるか、又は形質膜内に保持される。形質膜内に保持されているポリペプチドは、1又はそれより多くの膜貫通ドメインを有するであろう。
細胞の機能において中心的な役割を果たしているシグナルペプチド含有タンパク質の例は、サイトカイン、ホルモン、細胞外基質タンパク質、接着分子、受容体、プロテアーゼ、成長因子及び分化因子である。
免疫グロブリンドメインを含有する細胞表面認識分子は、多様な生理学的機能において役割を果たすことが示されており、そのような分子の大部分は、疾患過程において役割を果たし得る。前記分子の活性の変化は疾患表現型を変える手段であり、多くの疾患、特に炎症性疾患、腫瘍学及び心疾患において役割を果たし得ることから、新規な免疫グロブリンドメインを含有する細胞表面認識分子の同定それ自体が高度に関連している。免疫グロブリンドメインを含有する細胞表面認識分子は生物学的過程の範囲に関与しており、前記生物学的過程としては、次のようなものが挙げられる:胚発生(Martin-Bermudo, M.D. et al, Development. 2000 127(12):2607-15; Chen, L.M., et al., J Neurosci. 2000 20(10):3776-84; Zweegman, S., et al, Exp Hematol. 2000 28(4):401-10; Darribere, T., et al., Biol Cell. 2000 92(1):5-25)、組織完全性の維持(Eckes, B., et al., J Cell Sci. 2000 113(Pt 13):2455-2462; Buckwalter, J.A., et al., Instr Course Lect. 2000 49:481-9; Frenette, P.S., et al.,. J Exp Med. 2000 191(8):1413-22; Delmas, V., et al, Dev Biol. 1999 216(2):491-506; Humphries, M.J., et al., Trends Pharmacol Sci. 2000 21(1):29-32; Miosge, N., et al, Lab Invest. 1999 79(12):1591-9; Nagaoka T, et al. Am J Pathol 2000 Jul 157:1 237-47; Nwariaku FE, et al. J Trauma 1995 39(2): 285-8; Zhu X, et al. Zhonghua Zheng Xing Shao Shang Wai Ke Za Zhi 1999 15(1): 53-5)、白血球血管外遊走/炎症(Lim, L.H., et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000 22(6):693-701; Johnston, B., et al., Microcirculation. 2000 7(2):109-18; Mertens, A.V., et al., Clin Exp Allergy. 1993 23(10):868-73; Chcialowski, A., et al., Pol Merkuriusz Lek. 2000 7(43):13-7; Rojas, A.I., et al, Crit Rev Oral Biol Med. 1999 10(3):337-58; Marinova-Mutafchieva, L., et al., Arthritis Rheum. 2000 43(3):638-44; Vijayan, K.V., et al, J Clin Invest. 2000 105(6):793-802; Currie, A.J., et al,. J Immunol. 2000 164(7):3878-86; Rowin, M.E., et al., Inflammation. 2000 24(2):157-73; Johnston, B., et al., J Immunol. 2000 164(6):3337-44; Gerst, J.L., et al., J Neurosci Res. 2000 59(5):680-4; Kagawa, T.F., et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 97(5):2235-40; Hillan, K.J., et al., Liver. 1999 19(6):509-18; Panes, J., 1999 22(10):514-24; Arao, T., et al., J Clin Endocrinol Metab. 2000 85(1):382-9; Souza, H.S., et al., Gut. 1999 45(6):856-63; Grunstein, M.M., et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000 278(6):L1154-63; Mertens, A.V., et al., Clin Exp Allergy. 1993 23(10):868-73; Berends, C., et al., Clin Exp Allergy. 1993 23(11):926-33; Fernvik, E., et al., Inflammation. 2000 24(1):73-87; Bocchino, V., et al., J Allergy Clin Immunol. 2000 105(1 Pt 1):65-70; Jones SC, et al, Gut 1995 36(5):724-30; Liu CM, et al, Ann Allergy Asthma Immunol 1998 81(2):176-80; McMurray RW Semin Arthritis Rheum 1996 25(4):215-33; Takahashi H, et al Eur J Immunol 1992 22(11): 2879-85; Carlos T, et al J Heart Lung Transplant 1992 11(6): 1103-8; Fabrega E, et al, Transplantation 2000 69(4): 569-73; Zohrens G, et al, Hepatology 1993 18(4): 798-802; Montefort S, et al. Am J Respir Crit Care Med 1994 149(5): 1149-52)、腫瘍形成(Orr, F.W., et al., Cancer. 2000 88(S12):2912-2918; Zeller, W., et al., J Hematother Stem Cell Res. 1999 8(5):539-46; Okada, T., et al., Clin Exp Metastasis. 1999 17(7):623-9; Mateo, V., et al., Nat Med. 1999 5(11):1277-84; Yamaguchi, K., et al., J Exp Clin Cancer Res. 2000 19(1):113-20; Maeshima, Y., et al., J Biol Chem. 2000 275(28):21340-8; Van Waes, C., et al., Int J Oncol. 2000 16(6):1189-95; Damiano, J.S., et al., Leuk Lymphoma. 2000 38(1-2):71-81; Seftor, R.E., et al., Cancer Metastasis Rev. 1999 18(3):359-75; Shaw, L.M., J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1999 4(4):367-76; Weyant, M.J., et al., Clin Cancer Res. 2000 6(3):949-56)、脈管形成(Koch AE, et al Nature 1995 376 (6540): 517-9; Wagener C & Ergun S. Exp Cell Res 2000 261(1): 19-24; Ergun S, et al. Mol Cell 2000 5(2): 311-20)、骨吸収(Hartman GD, & Duggan ME. Expert Opin Investig Drugs 2000 9(6): 1281-91; Tanaka Y, et al. J Bone Miner Res 1995 10(10): 1462-9; Lark MW, et al. J Pharmacol Exp Ther 1999 291(2): 612-7; Raynal C, et al. Endocrinology 1996 137(6):2347-54; Ilvesaro JM, et al. Exp Cell Res 1998 242(1): 75-83)、神経機能不全(Ossege LM, et al. Int Immunopharmacol 2001 1:1085-100; Bitsch A, et al, Stroke 1998 29:2129-35; Iadecola C & Alexander M. Curr Opin Neurol 2001 14:89-94; Becker K, et al Stroke 2001 32(1): 206-11; Relton JK, et al Stroke 2001 32(1): 199-205; Hamada Y, et al J Neurochem 1996 66:1525-31)、血栓形成(Wang, Y.G., et al., J Physiol (Lond). 2000 526(Pt 1):57-68; Matsuno, H., et al., Nippon Yakurigaku Zasshi. 2000 115(3):143-50; Eliceiri, B.P., et al., Cancer J Sci Am. 2000 6(Suppl 3):S245-9; von Beckerath, N., et al., Blood. 2000 95(11):3297-301; Topol, E.J., et al., Am Heart J. 2000 139(6):927-33; Kroll, H., et al., Thromb Haemost. 2000 83(3):392-6)、及び宿主細胞に対する細菌性病原体の侵入/付着(Dersch P, et al. EMBO J 1999 18(5): 1199-1213)。
1.インテグリンに対する対(counter)受容体を代表する免疫グロブリン接着分子であり、細胞内接着分子(ICAM)及び脈管細胞接着分子(VCAM)が含まれる。そのメンバーは、変動し得る数の球状免疫グロブリン様細胞外ドメインで構成されている。このファミリーの幾つかのメンバー、例えばPECAM-1(CD31)及びNCAMは、ホモタイプな接着を媒介する。このファミリーの幾つかのメンバー、例えばICAM-1及びVCAM-1は、インテグリンとの相互作用を介する接着を媒介する。
2.細胞表面増殖因子受容体。増殖因子は、細胞外に存在しており、生物学的効果を示す目的で、標的細胞の形質膜上に位置する特異的な高親和性受容体と相互作用する。種々の異なる増殖因子受容体の分子特徴は、それら受容体が規定されるファミリー(チロシンキナーゼ受容体、Gタンパク質結合7回膜貫通受容体、及びセリン/トレオニンキナーゼ受容体)に分類されることを明らかにした。チロシンキナーゼ受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及びチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインによって、特徴付けられている。VEGFR、PDGFR、FGFR、CSF-1R及びc-KITも、細胞外部分に免疫グロブリンドメインを含んでいるチロシンキナーゼ増殖因子受容体の例である。増殖因子機能の調節不全は、数多くの様々な疾患表現型をもたらす。そのような疾患表現型としては、次のものが挙げられるが、これだけに限られない:腫瘍疾患(Bartucci M et al, (2001) Cancer Res. Sep 15;61(18):6747-54, Dias S et al., (2001) Proc Natl Acad Sci U S A. Sep 11;98(19):10857-62, Djavan B et al., (2001) World J Urol. 19(4):225-33)、炎症疾患(Fiocchi C. (2001) J Clin Invest. Aug;108(4):523-6, Hodge S et al., (2001) Respirology. Sep;6(3):205-211, Fenwick SA et al., (2001) J Anat. Sep;199(Pt 3):231-40)、神経疾患(Cooper JD et al., (2001) Proc Natl Acad Sci U S A 98(18):10439-44, Fahnestock M et al, (2001) Mol Cell Neurosci 18(2):210-20)、及び代謝性疾患(Vickers MH et al., (2001) Endocrinology. 142(9):3964-73)。
本発明の第1局面の一態様では、以下のポリペプチドが提供される:
(i) 配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24若しくは配列番号26で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はそれらのアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(ii) (i)のポリペプチドの活性を有するか、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント;又は
(iii) (i)又は(ii)の機能的等価物。
“(i)のポリペプチドの活性”という表現によって、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子の活性を表す。“免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子活性”という表現によって、免疫グロブリンドメインを含有する細胞表面認識分子ファミリーの範囲内の保存的特徴として同定され得るアミノ酸配列又は構造的特徴を含むポリペプチドを表す。
好ましくは、本発明のサイトカインアンタゴニストは、免疫調節活性を有する。“免疫調節活性”とは、免疫反応に作用するin vitro又はin vivoで検出されるいずれの活性をも意味する。免疫調節活性の例としては、免疫抑制活性、抗炎症活性、アポトーシス促進活性、抗アポトーシス活性及び抗腫瘍活性が挙げられる。
本発明のサイトカインアンタゴニストによって阻害され得るサイトカインとしては、以下のものが挙げられる:TGF-α;EGF;4α-ヘリックスバンドルサイトカインファミリーのメンバー(例えば、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-13、G-CSF、GM-CSF、CNTF、OSM、EPO、IL-10、IFN-α、IFN-β、IFN-γ及びM-CSF);システインノットサイトカインファミリーのメンバー(例えば、NGF、TGF-β、PDGF及びVEGF);ケモカイン(例えば、IL-8、MIP-1-α、MIP-1-β、MIP-2、PF-4、PBP、I-309/TCA-3、MCP-1、MCP-2、MCP3及びIP-10)、TNFサイトカインファミリーのメンバー(例えば、TNF-α、TNF-β及びLT-β);及びβ-トレフォイル(三つ葉:trefoil)サイトカインファミリーのメンバー(例えばFGF-α、FGF-β、IL-1-α、IL-1-β及びIL-1ra)。本発明の好ましいサイトカインアンタゴニストは、TNF-α、IL-4及び/又はIL-2の活性を阻害する。
サイトカインを代表するものとして主に、配列相同性、構造要素、発現細胞、及び/又は結合活性のような基準に基づいて歴史的にいくつかの群に分類されてきた非酵素的糖タンパク質が挙げられる。このようなファミリーの配列の例は、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、インターフェロンであるが、最近、多くの他の配列がサイトカイン活性を有するとして特徴づけられており(例えば、いくつかの成長因子又はケモカイン)、網羅的な分類を与えることを難しくしている(Haddad JJ, 2002, Biochem Biophys Res Commun, 297:700-13)。
サイトカインは、大部分が単球、マクロファージ及びリンパ球によって産生され、また他の細胞型(例えば、白血球、骨芽細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、神経細胞、内皮細胞、又は線維芽細胞)によっても産生されるが、構成性の様式で普通には産生されない。サイトカインは、通常、細胞からのサイトカインの新規な(de novo)発現及び分泌を刺激し得る攻撃(offending)因子(例えば、細菌、ウイルス、又は他の病原体)に応答して、サイトカイン自体の機能を変更する結果(自己分泌(オートクリン)/細胞内分泌効果)を伴って、又は隣接細胞の機能及び局部的微小環境を変更する結果(傍分泌(パラクリン)/近接分泌(ジャクスタクリン:juxtacrine)効果)を伴って、免疫細胞によって分泌される。
観察されるサイトカインの生理学的効果は、細胞の動員及び凝集につながる炎症性応答に関連して、サイトカインが数多くのタンパク質の産生(他のサイトカイン及び/又はサイトカイン受容体の産生を含む)を協調的様式で誘導(又は抑制)できるという事実による。従って、多くの生理的応答(生理的条件下及び病理学的条件下での)は、サイトカイン間の相乗的又は拮抗的相互作用の相互連絡した重複的ネットワークの結果である。
サイトカイン及びその受容体のクローニング及び生物学的分析は、その多面性及び重複性の背後にある分子的機序の一般的理解をもたらしてきた。この特性は、サイトカインファミリーの全メンバーによって用いられるシグナル伝達された受容体サブユニットと、各サイトカインに特異的な結合サブユニットとを含むサイトカイン受容体複合体の組成に帰することが多い。従って、サイトカイン誘導性のシグナル伝達カスケードは、該細胞表面で同時に受け取られる複数の異なったメッセージ(伝達暗号)によって決定される、特定の細胞又は組織についての最終結果を有する機構を提示する。
サイトカインネットワークの機能性の詳細は未だ完全には理解されていないが、サイトカインが重要なメディエーターであり、多くの疾患の発生に関与しており、先天性免疫応答及び適応的免疫応答の両方に直接的又は間接的に関係していることは明らかである。特に、サイトカインの主な病態生理学的効果は、患者の状態に負の影響を及ぼす炎症状態を誘導する、サイトカインの過剰な又は不適切な局在化した産生に起因する。従って、1以上のサイトカイン、特に炎症誘導性サイトカインを効率的に阻害するいずれの機構も、特定のサイトカインの不適切な又は長期的な産生に関連する細胞事象の有害なカスケードを制御することによってヒト疾患の治療に正の効果を有し得ることが一般的に認められている。
上述のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(ASAT) レベル及びアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALAT)レベルの低減は、TNF-αレベルとIL-4レベルの両方の低減によるのかもしれない。TNF-αとIL-4は、ConA注射後に誘導される肝臓障害に関与している重要なサイトカインである。この肝炎のマウスモデルでは、TNF-αは肝臓マクロファージ、いわゆるKupfer細胞によって主に産生されるが、IL-4は肝臓の(ナチュラルキラーT)NKT細胞によって産生される。抗TNF-α抗体は、疾患に対する保護を与えることが示されており(Seino et al. 2001, Annals of surgery 234, 681)、NKT細胞によるIL-4産生の阻害は、マウスのT細胞媒介肝炎において肝臓保護的であることが示された(Ajuebor et al. 2003 J. Immunology 170, 5252-9)。
さらに、マウスのLPS誘導性サイトカイン放出モデルでは、INSP052ECがLPS誘導性のTNFα又はIL-6放出を下方制御する可能性が実証された。
また、炎症性皮膚疾患のマウスモデルであるハプテン誘導性接触過敏症(CHS)について、INSP052ECを試験した。INSP052ECが有意かつ用量依存的な様式で耳腫脹を低減することが示され、これにより白血球浸潤及びその結果としての炎症の減少が示唆されることから、INSP052ECが皮膚のT細胞媒介炎症の治療、例えばアレルギー性接触皮膚炎及び乾癬の治療に有用であることが実証される。
本明細書では、INSP052(INSP052EC)(それ自体或いはこのタンパク質配列若しくは完全長タンパク質を含有する変異体又は融合タンパク質として)の単離した細胞外ドメインが、サイトカイン活性の調節、特にサイトカインの分泌及び/又は発現のアンタゴニストとしての機能に使用でき、また先天的免疫反応又は適応性免疫反応の両方に直接的又は間接的に関連する疾患において治療的役割を有し得ることを明白に示す。INSP052の細胞外ドメインを用いて得られたこれらの結果により、完全長ポリペプチド配列だけでなく、INSP052ポリペプチドの他の変異体もおそらく、実証された機能に等価な機能を共有することが推測できる。従って、INSP052、INSP052EC(配列番号20及び配列番号22)及びそれらに関連する機能的に等価なタンパク質は、自己免疫疾患、ウイルス性肝臓疾患又は急性肝臓疾患並びにアルコール性肝不全の治療で有用だろう。おそらく、これらは他の炎症性疾患の治療でも有効なはずである。
配列番号20で示される配列を有するポリペプチドは、INSP052の細胞外ドメインである。配列番号22で示される配列を有するポリペプチドを、これ以降は“成熟INSP052ポリペプチド細胞外ドメイン”と呼ぶ。配列番号24で示される配列を有するポリペプチドを、これ以降は“成熟INSP052エクソン2ポリペプチド”と呼ぶ。配列番号26で示される配列を有するポリペプチドを、これ以降は“成熟INSP052ポリペプチド”と呼ぶ。配列番号29で示される配列を有するポリペプチドを、これ以降は“ヒスチジンタグ付きの成熟INSP052細胞外ドメイン”と呼ぶ。配列番号30で示される配列を有するポリペプチドを、これ以降は“成熟INSP052細胞外ドメインのFc融合体”と呼ぶ。配列番号31で示される配列を有するポリペプチドを、これ以降は“INSP052のIgドメイン含有フラグメント(INSP052Ig2)”と呼ぶ。
ある態様では、本態様のポリペプチドが、配列番号16で示されるアミノ酸配列からなるか(INSP052ポリペプチド)、又はそのフラグメント若しくは機能的等価物である。別の態様では、ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12若しくは配列番号14のいずれか1つで示されるアミノ酸配列からなるか、又はそれらの変異体である。
(i) 配列番号20若しくは配列番号22で示されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号20若しくは配列番号22で示されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド;
(ii) (i)のポリペプチドの活性を有するか、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント;又は
(iii) (i)又は(ii)の機能的等価物。
配列番号20で示されるアミノ酸配列は、INSP052の細胞外ドメインを表し、該完全長タンパク質の1〜240番目のアミノ酸に対応する(実施例のセクションを参照)。配列番号22は成熟INSP052の細胞外ドメインを表す。INSP052の細胞外ドメインについては、図7も参照されたい。
ポリペプチド配列のこのような境界域のC末端及び/又はN末端の付加的な残基が該ポリペプチドフラグメントに含まれる場合、細胞外ドメインは正確に折りたたみ且つ生物学的活性を示す可能性が高いと考えられる。例えば、INSP052ポリペプチド配列由来又は相同配列由来の付加的な5、10、20、30、40、50若しくは100のアミノ酸残基が、正確に折りたたみ且つ生物学的活性を示す該ポリペプチドフラグメントの能力を害することなく、受容体結合ドメインの境界域のC末端及び/又はN末端の一方又は両方に含まれてもよい。二次構造エレメント間に大きなループが存在するため、100残基又は200残基といった大きな延長が必要な場合もある。
INSP052細胞外ドメインの切り詰め型(truncated)変異体については、1又は数個のアミノ酸残基(例えば、2、3、4、5、10、15、20、25、30又はそれより多く)が、生物学的活性を害することなく、該ドメインのC末端又はN末端の一方又は両方で欠失し得る。
INSP052細胞外ドメインの好ましい切り詰め型変異体は、配列番号31で示される配列を有するINSP052のIgドメイン含有フラグメント(INSP052Ig2)である。本発明は、以下のポリペプチドを提供する:
(i) 配列番号31で示されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号31で示されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド;
(ii) (i)のポリペプチドの活性を有するか、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント;又は
(iii) (i)又は(ii)の機能的等価物。
従って、本発明のなおさらなる態様は、ポリペプチドが以下の2つの配列(a)及び(b)を含むポリペプチドか、又はこれら2つの配列(a)及び(b)からなるポリペプチドを包含する。ここで、
(a)は、以下の(i)〜(iii)のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列であり:
(i) 配列番号20、配列番号22又は配列番号31で示されるアミノ酸配列;
(ii) (i)のポリペプチドの活性を有するか、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント;又は
(iii) (iii) (i)又は(ii)の機能的等価物;かつ
(b)は、シグナル配列、精製タグ、膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、分泌タンパク質、開始メチオニン、エンドペプチダーゼ認識部位を含有するリンカー領域、及び免疫グロブリン分子由来のFc領域からなる群より選択される、異種アミノ酸配列である。
このような融合タンパク質は、上述するINSP052ポリペプチドのいずれか1つとそのポリペプチドの長さにわたって少なくとも90%の相同性、好ましくは少なくとも95%の相同性、少なくとも97%の相同性、少なくとも98%の相同性又は少なくとも99%の相同性を有する配列を異種タンパク質配列のコード配列と共にインフレームで含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをクローニングすることによって得ることができる。
本明細書で使用する場合、用語“異種”は、ヒトINSP052ポリペプチド以外のポリペプチドのいずれをも表すことを意図する。N末端又はC末端のいずれかで融合タンパク質に含まれ得る異種配列の例としては、以下のものが挙げられる:膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常部(Fc領域)、多量体化ドメイン、細胞外タンパク質ドメイン、シグナル配列、エクスポート配列、及びアフィニティークロマトグラフィーで精製可能な配列。
このような追加の特性の例としては、体液中でのより長い永続性半減期、より簡単な精製手順、付加的な結合部分、細胞内タンパク質分解消化による成熟、組換え体産生の間の安定性増加、又は細胞外局在化である。この最後の特徴、細胞外局在化は、これらポリペプチドの単離と精製が容易になる空間にポリペプチドを局在化させることができるので、特に重要である。
融合タンパク質の一部分、リガンド及びリンカーの設計、並びに融合タンパク質の構築、精製、検出、成熟及び使用についての方法及び戦略は、文献で広範に議論されている (Nilsson J et al., Protein Expr Purif, 11: 1-16, 1997; “Applications of chimeric genes and hybrid proteins“ Methods Enzymol. Vol. 326-328, Academic Press, 2000)。
必要な場合は、タンパク質の精製後又はin vivoでのタンパク質分解切断によって、異種配列を除去することができる。例えば、タンパク質と異種配列との間にタンパク質分解切断部位を挿入し、融合タンパク質を適切なエンドペプチダーゼ/エキソペプチダーゼに曝露することによって達成することができる。これらの特徴は、融合タンパク質の産生と、医薬組成物の調製での融合タンパク質の使用とを容易にする。
例えば、異種配列を、in vivo又はin vitroのどちらかで異種配列から所望のタンパク質をはずすために使用できるエンドペプチダーゼ(例えば、カスパーゼ)の認識部位を含有するリンカー配列によってタンパク質に連結することができる。或いは、発現されるタンパク質が開始メチオニンを含まない場合(例えば、それがシグナルペプチドのない成熟配列の場合)、該異種配列が、宿主細胞内での正確な発現を可能にするための開始メチオニンであってもよい。この付加的なアミノ酸は、文献に開示されている方法に従って、引き続き、エキソペプチダーゼ、例えばメチオニンアミノペプチダーゼによって除去し得る(Van Valkenburgh HA and Kahn RA, Methods Enzymol, 344: 186-193, 2002; Ben-Bassat A, BioProccess Technol, 12:147-159, 1991)。
或いは、融合タンパク質中の異種配列は、該タンパク質のより簡単な精製を可能にし得る。例えば、INSP052のC末端に融合させたヘキサ-ヒスチジンペプチドによってINSP052ポリペプチドを精製することができる。このような融合ポリペプチドの例を配列番号29に示す。このヘキサ-ヒスチジンペプチドが、いわゆる“ヒスチジンタグ”を形成し、精製を容易にする(Gentz et al. 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:821-4)。インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から誘導されるエピトープである“HA”タグ(Wilson et al. 1994, Cell, 37:767-78)又は他のアフィニティー精製タグ、例えばGST、FLAG若しくはMBPをヒスチジンタグの代わりに使用し得る。
融合タンパク質の異種配列は、さらなる機能的活性を提供し得る。例えば、サイトカインアンタゴニスト活性を有するINSP052の細胞外ドメインは、抗炎症活性、又は一般的に免疫調節活性をも有する異種配列、例えば、さらなるサイトカインアンタゴニスト、コラーゲンII結合薬(例えば、WO01/37861に開示されているもの)及びサイトカイン自体(例えば、WO03/095488、WO03/014359及びWO03/035105に開示されているもの)と融合し得る。
異種配列は、本発明のポリペプチドの安定性を高め、半減期を延長し、ひいてはその治療活性を高め得る。例えば、ポリペプチドをヒト血清アルブミンに融合させ、又は循環ヒト血清アルブミンに結合する他の配列に融合させ得る(Chuang VT et al., Pharm Res. 2002; 19: 569-577; Graslund T et al., Protein Expr Purif. 1997, 9: 125-32; WO 01/77137参照)。或いは、付加的な配列は、脳内におけるような特異的局在性のためのターゲティングを助け得る(WO 03/32913)。
異種配列は、タンパク質の多量体の形成を可能にすることによって、安定性を高めることができる。多量体化を促進する異種配列の例としては、hCG(WO 97/30161)、コラーゲンX(WO 04/33486)、C4BP(WO 04/20639)、Erbタンパク質(WO 98/02540)、又はコイルドコイルペプチド(WO 01/00814)などのタンパク質から単離されるドメインが挙げられる。
タンパク質と免疫グロブリンフラグメントとを含む融合タンパク質を生成するための戦略の例は、文献に開示されている(WO 91/08298; WO 96/08570; WO 93/22332; WO 04/085478; WO 01/03737, WO 02/66514)。
例えば、成熟INSP052細胞外ドメインをコードする核酸配列は、その5’末端で本来のINSP052シグナル配列(又は他のいずれかの適切なシグナル/エクスポート配列)をコードする核酸配列に融合し、かつその3’末端でヒト免疫グロブリンλ重鎖IgG1の定常部をコードする核酸配列(NCBI Acc. No. CAA75302;セグメント246-477)に融合して、発現ベクター内でクローニングされ得る。結果として生成されるベクターを用いてCHO若しくはHEK293宿主細胞を形質転換することができ、N末端にINSP052細胞外ドメインを有し且つC末端にIgG1配列を有する組換え融合タンパク質を安定に発現かつ分泌するクローンを選択することができる。次に、このクローンを、生産のスケールアップや、培地から組換え融合タンパク質を精製するために使用することができる。或いは、ヒト免疫グロブリンλ重鎖IgG1の定常部をコードする核酸の位置とINSP052細胞外ドメインをコードする核酸の位置とが逆であってもよく、その結果得られるタンパク質は、INSP052の本来のシグナル配列、又は他のいずれかの適切なシグナル/エクスポート配列によって、それでも発現かつ分泌させることができる。
この技術を用いて、2つの異なる融合タンパク質を同一細胞内でコードする構築物を共発現させることによって、ヘテロダイマーを生成することもできる(WO00/18932)。例えば、Fcドメインに融合したINSP052細胞外ドメインを含む第1の融合タンパク質と、異なる活性のタンパク質、例えば、さらなるサイトカインアンタゴニスト、コラーゲンII結合薬(例えば、WO01/37861に開示されているもの)及び/又はサイトカイン(例えばWO03/095488、WO03/014359及びWO03/035105に開示されているもの)に融合したFcドメインを含む第2の融合タンパク質とを発現し得る。
融合タンパク質が免疫グロブリン領域を含む場合、融合は直接的であってもよく、或いは短いリンカーペプチドを介していてもよく、前記リンカーペプチドは長さが1〜3個以上のアミノ酸残基程度の短さ、例えば長さが13個アミノ酸残基長であってもよい。前記リンカーは、例えば配列E-F-M(Glu-Phe-Met)のトリペプチドであってもよく、或いは本発明の物質の配列と免疫グロブリン配列との間に導入されたGlu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Metを含む13アミノ酸リンカー配列であってもよい。結果として生じる融合タンパク質は、体液内での滞留時間の延長(すなわち、半減期の増加)、特異的活性の増加、発現レベルの増加のような改良された性質を有し、又は融合タンパク質の精製を容易にする。
例えば、直接的なPEG化を可能にする追加のシステインを、INSP052の細胞外ドメインのN末端又はC末端に付加させ得る。或いは、例えばグリコシル化部位に対応させて、残基の置き換えによりシステインを該タンパク質に含め得る。さらに、遺伝的にコードされているアミノ酸の側鎖をポリマー付加用に化学的に改変することができ、或いは適切な側鎖官能基を有する天然でないアミノ酸を利用できる。ポリマーを、標的位置でアミノ酸の側鎖に付加される炭水化物又は他の部分に付加させてもよい。
これらの目的に適するポリマーは生体系に無毒である。このようなポリマーは、天然において疎水性であっても若しくは親水性であってもよく、生分解性、非生分解性、又はこれらの組合せであってもよい。これらポリマーには、天然ポリマー(例えば、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ヒアルロン酸)のみならず、合成ポリマー(ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリアンヒドリド)が含まれる。疎水性の非生分解性ポリマーの例としては、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル及びポリメチルメタクリレートが挙げられる。親水性の非生分解性ポリマーの例として、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリビニルアルコール、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、及びこれらのコポリマーが挙げられる。好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)のように、連続的な繰返し単位としてエチレンオキシドを含む。好ましい付加方法は、ペプチド合成と化学連結とを併用する。有利には、水溶性ポリマーの付加は、特にタンパク質のアミノ末端領域で、生分解性リンカーを介している。このような改変が前駆体(つまり“プロドラッグ”)形態のタンパク質を提供するために働き、この前駆体形態のタンパク質は、該リンカーが分解すると、ポリマー改変することなく該タンパク質を遊離する。
好ましくは、本精製核酸分子は、配列番号1(INSP052エクソン1ポリペプチドをコードする)、配列番号3(INSP052エクソン2ポリペプチドをコードする)、配列番号5(INSP052エクソン3ポリペプチドをコードする)、配列番号7(INSP052エクソン4ポリペプチドをコードする)、配列番号9(INSP052エクソン5ポリペプチドをコードする)、配列番号11(INSP052エクソン6ポリペプチドをコードする)、配列番号13(INSP052エクソン7ポリペプチドをコードする)、配列番号15(INSP052ポリペプチドをコードする)、配列番号17(INSP055ポリペプチドをコードする)、配列番号20(INSP052ポリペプチドの細胞外ドメインをコードする)、配列番号22(INSP052成熟ポリペプチドの細胞外ドメインをコードする)、配列番号24(成熟INSP052エクソン2ポリペプチドをコードする)、配列番号26(成熟INSP052ポリペプチドをコードする)で示される核酸配列を含むか又はこの核酸配列から成るか、或いはそれらの配列のいずれかの余剰的(redundant)等価物又はフラグメントである。
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11及び配列番号13で示される配列を組合せて、配列番号15で示される配列が生じる。
配列番号23、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11及び配列番号13で示される配列を組合せて、配列番号25で示される配列が生じる。
本発明の第2局面の一態様では、INSP052細胞外ドメインを含むか、又はINSP052細胞外ドメインから成るポリペプチドをコードする核酸分子が提供される(配列番号20)。好ましくは、該核酸分子は、配列番号19で示される核酸配列を含むか、又は配列番号19で示される核酸配列から成る。該核酸分子は、同時係属特許出願WO03/093316の図7にも記載されているが、記載されたそれら配列は、C末端に付加されたヒスチジン残基を含む。
本発明の第2局面の一態様では、成熟INSP052の細胞外ドメインを含むか、又は成熟INSP052の細胞外ドメインから成るポリペプチドをコードする核酸分子が提供される(配列番号22)。好ましくは、該核酸分子は、配列番号21で示される核酸配列を含むか、又は配列番号21で示される核酸配列から成る。該核酸分子は、同時係属特許出願WO03/093316の図7にも記載されているが、記載されたそれら配列は、C末端に付加されたヒスチジン残基を含む。
本発明の第2局面の一態様では、INSP052のIgドメイン含有フラグメントである成熟INSP052の細胞外ドメインの変種を含むか、又は前記成熟INSP052の細胞外ドメインの変種から成るポリペプチドをコードする核酸分子が提供される(配列番号31)。
第4局面では、本発明は、本発明の第2又は第3局面の核酸分子を含むベクター、例えば発現ベクターを提供する。
第5局面では、本発明は、本発明の第4局面のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
第6局面では、本発明は、本発明の第1局面のポリペプチドに特異的に結合し、好ましくは本発明の第1局面のポリペプチドの活性を阻害するリガンドを提供する。当業者であれば、用語“リガンド”が、例えば抗体及びオーファン受容体といった本発明の第1局面のポリペプチドに特異的に結合するいずれの成分をも包含することを理解するだろう。
“本発明のポリペプチドの活性”及び同様の表現によって、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子の特有な活性を意味する。特に、この定義には、上で定義したようなサイトカインアンタゴニストとしての活性、特にサイトカインの発現及び/又は分泌のアンタゴニストとして、特にTNF-α、IL-4及びIL-2に対しての活性が含まれる。好ましくは、本発明のサイトカインアンタゴニストは免疫調節活性を有する。この観点における本発明のポリペプチドの用途の例は、アレルギー性接触性皮膚炎及び乾癬の治療のような、皮膚のT細胞媒介炎症の治療である。
本発明の第6局面のリガンドの同定方法は後で詳述する。特に、本発明は、配列番号20又は配列番号22のポリペプチドに特異的に結合するリガンドである化合物の同定方法であって、本発明の第1局面のポリペプチドを、そのポリペプチドに対する結合アフィニティーを持っていると推測される1以上の化合物と接触させる工程と、前記ポリペプチドに特異的に結合する化合物を選択する工程とを含む方法を提供する。該方法で同定された本発明のポリペプチドのリガンドを用いて、さらなるサイトカインアンタゴニストを同定することができる。例えば、スクリーニング方法と連係させて、該リガンド、例えば抗体に結合し、サイトカインアンタゴニストとしても役立ち得る化合物を同定することができる。
本発明の第7局面の化合物は、前記ポリペプチドの遺伝子発現又は活性のレベルを増加させ得るか(アゴニスト作用)、又は低下させ得る(アンタゴニスト作用)。
重要なことに、INSP052ポリペプチド及びINSP055ポリペプチドの機能を同定することによって、疾患の治療及び/又は診断に有効な化合物を同定し得るスクリーニング方法の設計が可能となる。本発明の第6及び第7の局面のリガンド及び化合物は、該方法を用いて同定され得る。これらの方法は、本発明の局面として包含される。
後述する実施例において、INSP052の細胞外ドメインを用いて炎症性疾患、自己免疫疾患、皮膚疾患、肝臓疾患及び肝不全を予防又は治療できるという証拠を示す。従って、INSP052の細胞外ドメインを立体配置的に模倣し、或いはINSP052の細胞外ドメインのアゴニストである本発明の第7局面の化合物を供給することは、上述したような炎症性疾患、自己免疫疾患、肝臓疾患又は肝不全の予防又は治療において有用性を見い出し得るので特に好ましい。
本発明の第1、第2、第3、第4、第5及び第6局面の成分は、疾患の治療又は予防用薬物の製造においても用いることができ、前記疾患には、限定するものではないが、細胞増殖性疾患、自己免疫/炎症性疾患、心脈管系疾患、神経疾患、精神疾患、発育異常、遺伝子疾患、代謝性疾患、感染及び他の病的状態が挙げられる。
好ましくは、これらの疾患には、新生物、癌、脳腫瘍、神経膠腫、骨腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、結腸腫瘍、血管腫、骨髄増殖性疾患、白血病、血液疾患、好中球減少症、血小板減少症、新脈管形成疾患、皮膚疾患、老化、創傷、熱傷、繊維症、心脈管系疾患、再狭窄、心臓病、末梢血管疾患、冠状動脈疾患、浮腫、血栓塞栓症、月経困難症、子宮内膜症、子癇前症、肺疾患、COPD、喘息骨疾患(asthma bone disease)、腎疾患、糸球体腎炎、肝臓疾患、クローン病、胃炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍、免疫不全、自己免疫疾患、関節炎、慢性関節リウマチ、乾癬、表皮水疱症、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、ライム病、多発性硬化症、神経変性、脳卒中、脳/脊髄損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、神経筋疾患、HIV、AIDS、サイトメガロウイルス感染、真菌感染、眼疾患、黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、高眼圧症、及び免疫グロブリンドメインを含有する細胞表面認識分子、特にサイトカインアンタゴニストが関与している他の病的状態が含まれる。
炎症性疾患、自己免疫疾患、皮膚疾患、肝臓疾患(ウイルス性又は急性肝臓疾患を含む)及び肝不全(アルコール性肝不全を含む)の治療用薬物の製造で本発明の第1、第2、第3、第4、第5及び第6局面の成分を使用することが特に好ましい。
本発明の第1、第2、第3、第4、第5及び第6局面の成分は、上述した疾患を治療するための他の治療薬と併用し得る。特に、サイトカインアンタゴニスト活性を有する本発明のポリペプチド(融合タンパク質を含む)をさらなる治療薬と併用することができる。
従って、本発明は、サイトカイン、好ましくはTNF、IL-2及び/又はIL-4が関係する疾患又は病的状態の治療用薬物の製造における、i) 本発明の第1、第2、第3、第4、第5及び第6局面の成分、特にINSP052の細胞外ドメインを含むポリペプチド又は融合タンパク質の使用と、ii) さらなる治療薬の使用とを提供する。好ましくは、そのような疾患又は病的状態は、炎症性疾患、自己免疫疾患、皮膚疾患、肝臓疾患(ウイルス性又は急性肝臓疾患を含む)及び肝不全(アルコール性肝不全を含む)から選択される。
さらなる治療薬は、本発明のポリペプチドと同じサイトカインに拮抗し得るか、又は該疾患を引き起こす生理学的経路の別の部分に拮抗し得るか、又は該疾患に起因する症状を緩和し得る。
好ましくは、該治療薬はサイトカインアンタゴニスト(好ましくはTNF、IL-2及び/又はIL-4のアンタゴニスト)、又は抗炎症薬である。
さらなる治療薬として使用し得るサイトカインアンタゴニストの例としては、TNF-αアンタゴニスト、例えばエタネルセプト、TNFα変換酵素インヒビター(TACEインヒビター)であるインフリキシマブ、及び慢性関節リウマチの治療で用いられるレフルノミド;並びにIL-2アンタゴニスト、例えば移植片拒絶の予防で用いられるバシリマブ(basilimab)及びダクリズマブ(daclizumab)が挙げられる。さらなる治療薬は、抗炎症薬、例えばステロイド性若しくは非ステロイド性抗炎症薬であってもよく、或いは自己免疫疾患、皮膚疾患、肝臓疾患又は肝不全の治療で既に使用されている別の薬剤であってもよい。
さらなる治療薬は、本発明の第1、第2、第3、第4、第5及び第6局面の成分と同時、すなわち混合物として患者に投与してよい。或いは、既に該治療薬を投与された患者に本発明の第1、第2、第3、第4、第5及び第6局面の成分を投与してもよく、又は既に本発明の第1、第2、第3、第4、第5及び第6局面の成分を投与された患者に該治療薬を投与してもよい。従って、併用は同時、連続又は個別の投与でよい。
患者における疾患の治療的処置のモニタリングに同様の方法を使用し得る。この場合、時間の経過にしたがってポリペプチド又は核酸分子の発現若しくは活性レベルがコントロールレベルに向かって変化することは、疾患の緩解を示している。
本発明の第1局面のポリペプチドを検出する好ましい方法は以下の工程を含む:(a)本発明の第6局面のリガンド(例えば抗体)と生物学的サンプルとを、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で接触させる工程;及び(b)前記複合体を検出する工程。
熟練者には明らかなように、短いプローブによる核酸ハイブリダイゼーション法、点変異分析、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、及び抗体を用いて異常なタンパク質レベルを検出する方法のような、本発明の第9局面に従ういくつかの異なる方法が存在する。同様の方法を短期又は長期ベースで用いて、モニターされる疾患の治療的処置を可能にし得る。本発明は、これらの疾患診断方法に有用なキットをも提供する。
本発明の第9局面の方法によって診断される好ましい疾患は、炎症性疾患、自己免疫疾患、皮膚疾患、肝臓疾患(ウイルス性又は急性肝臓疾患を含む)及び肝不全(アルコール性肝不全を含む)である。
第10局面では、本発明は、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子としての、本発明の第1局面のポリペプチドの使用を提供する。細胞表面受容体におけるIgドメインの重要性は、Lokker NAらの論文“Functional importance of platelet-derived growth factor (PDGF) receptor extracellular immunoglobulin-like domains. Identification of PDGF binding site and neutralizing monoclonal antibodies”(J Biol Chem 1997 Dec 26;272(52):33037-44)に記載されている。
本発明は、上述したように、本発明の第1局面のポリペプチドのサイトカインアンタゴニスト、特にTNF-α、IL-4及びIL-2分泌のアンタゴニストとしての使用を提供する。この観点では、本発明のポリペプチドは、サイトカインの発現レベル、サイトカインの活性レベル、サイトカインの分泌レベル等を下げることによって、サイトカインのアンタゴニストとして役立ち得る。
本発明は、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子活性を有するタンパク質を発現させるための、本発明の第2又は第3局面の核酸分子の使用をも提供する。本発明は、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子活性をもたらす方法をも提供し、前記方法は、本発明の第1局面のポリペプチドを利用する。
本発明の第11局面の一態様によれば、本発明の医薬組成物は、さらなる治療薬を付加的に含んでよい。さらなる治療薬は、本発明のポリペプチドと同じサイトカインに拮抗し、又は該疾患を引き起こす生理学的経路の別の部分に拮抗し、又は該疾患に起因する症状を緩和し得る。
好ましくは、該治療薬はサイトカインアンタゴニスト(好ましくはTNF、IL-2及び/又はIL-4のアンタゴニスト)、又は抗炎症薬である。
さらなる治療薬として使用し得るサイトカインアンタゴニストの例としては、TNF-αアンタゴニスト、例えばエタネルセプト、TNFα変換酵素インヒビター(TACEインヒビター)であるインフリキシマブ、及び慢性関節リウマチの治療で用いられるレフルノミド;及びIL-2アンタゴニスト、例えば移植片拒絶の予防で用いられるバシリマブ(basilimab)及びダクリズマブ(daclizumab)が挙げられる。さらなる治療薬は抗炎症薬、例えばステロイド若しくは非ステロイド抗炎症薬であってもよく、或いは自己免疫疾患、皮膚疾患、肝臓疾患又は肝不全の治療で既に使用されている別の薬剤であってもよい。
炎症性疾患、自己免疫疾患、肝臓疾患又は肝不全の治療用薬物の製造で本発明の第1、第2、第3、第4、第5及び第6局面の成分を使用することが特に好ましい。
本発明の第1局面のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現、又は本発明の第1局面のポリペプチドの活性が、健常な対象者の発現又は活性レベルと比較したとき罹患対象者で低下する疾患については、前記患者に投与される前記ポリペプチド、核酸分子、リガンド又は化合物はアゴニストであるべきである。逆に、前記天然遺伝子の発現、又は前記ポリペプチドの活性が、健常な対象者の発現又は活性レベルと比較したとき罹患対象者で上昇する疾患については、前記患者に投与される前記ポリペプチド、核酸分子、リガンド又は化合物はアンタゴニストであるべきである。このようなアンタゴニストの例として、アンチセンス核酸分子、リボザイム及びリガンド(例えば抗体)が挙げられる。
好ましくは、該疾患は、上述したような、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子が関与する疾患である。
該疾患が炎症性疾患、自己免疫疾患、肝臓疾患又は肝不全であることが特に好ましい。
好ましくは、該疾患は、上述したような、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子が関与する疾患である。
該疾患が炎症性疾患、自己免疫疾患、肝臓疾患又は肝不全であることが特に好ましい。
“単離(されている)”及び“精製(されている)”という用語は、ポリペプチド若しくは核酸が得られる方法、又は調製物の純度レベルを示さないことが注記されるべきである。従って、前記単離若しくは精製されている種が、組換え的に生成されてもよく、対象の細胞若しくは組織から直接的に単離されてもよく、又は決定された配列に基づいて合成的に生成されてもよい。
本明細書では、ヌクレオチド及びアミノ酸についての標準的な略語が用いられる。
本発明の実施では別に指示がなければ、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術及び免疫学の通常の技術が用いられるであろう。前記技術は当業者の技術範囲内である。
前記のような技術は、文献で完全に説明されている。特に適切な解説書の例には以下が含まれる:Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), 特にvolumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N.Y.); and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds. 1986)。
本発明のポリペプチドは成熟タンパク質の形態を有するものでもよく、またプレ-、プロ-又はプレプロ-タンパク質であってプレ-、プロ-又はプレプロ-部分の切断によって活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生じるタンパク質でもよい。そのようなポリペプチドでは、プレ-、プロ-又はプレプロ-配列がリーダー配列若しくは分泌配列であっても、又は成熟ポリペプチド配列の精製のために用いられる配列であってもよい。
本発明の第1局面のポリペプチドは、融合タンパク質の一部分を形成し得る。例えば、1つ又は2つ以上の付加アミノ酸配列を含むことがしばしば有利である。前記付加アミノ酸配列は、分泌若しくはリーダー配列、プロ-配列、精製に役立つ配列、又は例えば組換え生成の間により高いタンパク質安定性を付与する配列を含んでもよい。代替的又はさらに、前記成熟ポリペプチドを別の化合物、例えば前記ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えばポリエチレングリコール)と融合させることができる。
本明細書では、用語“異種”はヒトINSP052ポリペプチド以外のいずれのポリペプチドをも表すことを意図する。N末端又はC末端のいずれかで融合タンパク質に含まれ得る異種配列の例として、以下のものが挙げられる:膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常部(Fc領域)、多量体化ドメイン、細胞外タンパク質のドメイン、シグナル配列、エクスポート配列、及びアフィニティークロマトグラフィーで精製可能な配列。必要な場合、上述したように、タンパク分解性切断によって異種配列を除去することができる。
好ましい態様では、タンパク質をIg分子の定常部に融合させる。好ましくは、例えば、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインのような重鎖部にタンパク質を融合させる。Ig分子の他のイソ型、例えばイソ型IgG2若しくはIgG4、又はIgM若しくはIgAのような他のIgクラスも本発明の融合タンパク質の生成に適する。融合タンパク質は単量体若しくは多量体でよく、又はヘテロ多量体若しくはホモ多量体でよい。
さらに好ましい態様では、前記機能性誘導体は、該アミノ酸残基上に1以上の側鎖として存在する、1以上の官能基に付加した少なくとも1の部分を含む。好ましくは、この部分はポリエチレン(PEG)部分である。例えばWO99/55377に記載されているもののような既知の方法でPEG化を行うことができる。
これらの変更は、改良された精製、効力及び/又は薬物動態学的特徴を本発明のポリペプチドに与えることを意図している。例えば、対象者に注入後、該ペプチドがペプチダーゼによって開裂しやすいことが問題であるとき、特に感受性のペプチド結合を非開裂性ペプチド模倣物質と置き換えてペプチドをより安定にし、治療薬としてより有用にすることができる。同様に、L-アミノ酸残基の置換は、該ペプチドをタンパク質分解に対して感受性でなくさせ、最終的にはペプチド以外の有機化合物に似せる標準的な方法である。アミノ末端閉塞(blocking)基、例えばt-ブチルオキシカルボニル、アセチル、テニル(theyl)、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル、アジピル、アゼライル、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼライル、メトキシアジピル、メトキシスベリル、及び2,4-ジニトロフェニルを用いて本発明のポリペプチドを改変することもできる。
効力を高め、活性を持続させ、精製を容易にし、及び/又は半減期を増加させる他の多くの改変や、ペプチド模倣物質の合成及び開発技術は、技術的に公知である(WO 02/10195; Villain M et al., Chem Biol, 8: 673-679, 2001; Hruby VJ and Balse PM, Curr Med Chem, 7: 945-970, 2000; Golebiowski A et al., Curr Opin Drug Discov Devel, 4: 428-34, 2001)。in vitro及びin vivoの両翻訳系を用いて非天然アミノ酸をタンパク質に組み入れてタンパク質の構造と機能を探査及び/又は改良する方法論も文献に開示されている(Dougherty DA, Curr Opin Chem Biol, 4: 645-52, 2000)。
ポリペプチド内に生じる改変は、多くの場合ポリペプチドが生成される方法の関数であろう。組換えによって生成されるポリペプチドでは、改変の性質及び程度は大部分が、特定の宿主細胞の翻訳後改変能力及び問題のポリペプチドのアミノ酸配列に存在している改変シグナルによって決定されるであろう。例えば、グリコシル化パターンは、異なる種類の宿主細胞間で変動する。
本発明のポリペプチドは、任意の適切な様式で調製することができる。そのようなポリペプチドには、単離された天然に存在するポリペプチド(例えば、細胞培養物から精製される)、組換え的に生成されたポリペプチド(融合タンパク質を含む)、合成的に生成されたポリペプチド、又は前記方法の組合せによって生成されたポリペプチドが含まれる。
本発明の第1局面の機能的に等価なポリペプチドは、INSP052ポリペプチド及びINSP055ポリペプチド、好ましくはINSP052細胞外ドメイン(すなわち配列番号20又は配列番号22)と相同なポリペプチドであり得る。本明細書では、2つのポリペプチドの一方のポリペプチドの配列が他方のポリペプチドの配列に対して充分に高い同一性又は類似性を有する場合、2つのポリペプチドを“相同である”という。“同一性”とは、アラインメントを施した配列のどの特定の場所においても、アミノ酸残基が前記配列間で同一であることを示す。“類似性”は、アラインメントを施した配列のいずれの特定の場所においても、アミノ酸残基が前記配列間で類似の種類であることを示す。同一性及び類似性の度合いは容易に計算できる(Computational Molecular Biology, A.M. Lesk ed., Oxford University Press, New York, 1988;Biocomputing. Informatics and Genome Projects, D.W. Smith ed., Academic Press, New York, 1993;Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, A.M. Griffin and H.G. Griffin eds., Humana Press, New Jersey, 1994;Sequence Analysis in Molecular Biology, G. von Heinje, Academic Press, 1987;及びSequence Analysis Primer, M. Gribskov and J. Devereux eds., M. Stockton Press, New York, 1991)。
本発明の第1局面の機能的に等価なポリペプチドは、構造的アラインメントの1つ又は2つ以上の技術を用いて同定されたポリペプチドであってもよい。例えば、バイオペンジウム検索データベースの作製に用いられる検索ツールの一局面を構成するインファーマティカ=ゲノムスレッダー(Inpharmatica Genome Threader)(商標)技術を用いて(国際公開第01/69507号パンフレットとして公開されている同時係属PCT特許出願(PCT/GB01/01105)を参照されたい)、INSP052ポリペプチド及びINSP055ポリペプチドと比較して低い配列同一性しかもたないが、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子であると予測される、現在のところ機能が未知なポリペプチドを同定することができ、前記方法は、INSP052及びINSP055ポリペプチド配列と有意な構造的相同性を共有するという理由から、本発明の第1局面のポリペプチドを利用する。“有意な構造的相同性”とは、インファーマティカ=ゲノムスレッダー(商標)が、2つのタンパク質は少なくとも10%、より好ましくは少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上の確実性を有して構造的相同性を共有すると予測することを意味する。
本発明の第1局面のポリペプチドは、INSP052ポリペプチド及びINSP055ポリペプチドのフラグメント並びにINSP052ポリペプチド及びINSP055ポリペプチドの機能的等価物のフラグメントをも含むが、ただし、これらフラグメントが、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子活性を保持すること又はINSP052ポリペプチド及びINSP055ポリペプチドと共通の抗原決定基を有することを条件とする。
そのようなフラグメントは、“独立的存在(free-standing)”(すなわち、他のアミノ酸若しくはポリペプチドの一部でもなく、他のアミノ酸若しくはポリペプチドの一部に融合されているのでもない)であってもよく、又はより大きなポリペプチドに含まれて、前記ポリペプチドの一部分又は領域を形成してもよい。より大きなポリペプチドの内部に含まれている場合、本発明のフラグメントは、最も好ましくは連続するただ1つの領域を形成する。例えば、ある種の好ましい態様は、前記フラグメントのアミノ末端に融合したプレ−及び/又はプロ−ポリペプチド領域を有するフラグメント、及び/又は前記フラグメントのカルボキシル末端に融合した付加的領域を有するフラグメントに関する。しかしながら、いくつかのフラグメントがただ1つのより大きなポリペプチドの内部に含まれていてもよい。
本発明のポリペプチド又はその免疫原性フラグメント(少なくとも1つの抗原決定基を含む)を用いて、例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体といった、前記ポリペプチドに免疫特異的なリガンドを作製することができる。そのような抗体を用いて、本発明のポリペプチドを発現しているクローンを単離若しくは同定するか、又はアフィニティークロマトグラフィーで本発明のポリペプチドを精製することができる。前記抗体は、当業者には明らかなように、他の用途のうち診断的又は治療的補助としても用いることができる。
“実質的に強い親和性”という表現によって、本発明のポリペプチドに対する親和性が、既知の免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子に対する親和性と比較して、測定可能に増加することを意味している。
好ましくは、本発明のポリペプチドに対する親和性が、既知の免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子に対する親和性よりも、少なくとも1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍強い。
本発明の第1局面のポリペプチドに対するモノクローナル抗体も、当業者は容易に生成できる。ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を作製する一般的な方法論は、周知である(例えば以下を参照されたい:G. Kohler & C. Milstein, Nature 256:495−497(1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72(1983); Cole et al., 77−96 “Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, Alan R. Liss, Inc. (1985))。
また、非ヒト可変部がヒト定常部と結合又は融合しているキメラ抗体(例えば以下を参照されたい:Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3439(1987))も有用であり得る。
抗体は、例えばヒト化により、改変して個体での免疫原性を減少させ得る(例えば以下を参照されたい:Jones et al., Nature,321:522(1986); Verhoeyen et al., Science, 239:1534(1988); Kabat et al., J. Immunol., 147:1709(1991); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029(1989); Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:34181(1991); Hodgson et al., Bio/Technology 9:421(1991))。本明細書で用いられる“ヒト化抗体”という用語は、非ヒトドナー抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変ドメイン中のCDRアミノ酸及び選択した他のアミノ酸がヒト抗体の等価なアミノ酸に代えて置換されている抗体分子を指す。従って、ヒト化抗体はヒトの抗体とよく似ているが、ドナー抗体の結合能力を有する。
ファージディスプレー技術を用いて、本発明のポリペプチドに対する結合活性を有する抗体をコードしている遺伝子を、関連する抗体の保有についてスクリーニングされたヒト由来のリンパ球のPCR増幅V-遺伝子レパートリー、又は未感作ライブラリーのいずれかから選択することができる(J. McCafferty et al., (1990) Nature 348:552−554; J. Marks et al., (1992) Biotechnology 10:779−783)。前記抗体の親和性は、鎖のシャッフリングによって改善することもできる(T. Clackson et al., (1991) Nature 352:624−628)。
上記の技術によって作製された抗体は、ポリクローナルであれモノクローナルであれ、免疫アッセイ、ラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で試薬として用いることができるという点で、更なる有用性を有する。これらの用途では、これら抗体を、分析的に検出可能な試薬(例えば放射性同位元素、蛍光分子又は酵素)で標識することができる。
本発明の第2及び第3局面の好ましい核酸分子は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14及び/又は配列番号16、配列番号18、INSP052の細胞外ドメイン(配列番号20及び配列番号22)、配列番号24、又は配列番号26で示されるポリペプチド配列、並びに機能的に等価なポリペプチド、例えばINSP052細胞外ドメインの変種(例えばINSP052のIgドメイン含有フラグメント(配列番号31))、又はINSP052の細胞外ドメインから成る融合タンパク質若しくは1以上の付加ポリペプチド配列に融合されているその変種をコードするものである。これら核酸分子は、本明細書に記載した方法及び用途で用いることができる。本発明の核酸分子は、好ましくは本明細書で開示される配列に由来する少なくともn個の連続するヌクレオチドを含み、この場合、前記個々の配列に応じてnは10又はそれより大きい(例えば12、14、15、18、20、25、30、35、40又はそれより大きい)。
本発明の核酸分子は、RNA(例えばmRNA)、又はDNA(例えばcDNA、合成DNA又はゲノムDNAを含む)の形態であってもよい。そのような核酸分子は、クローニングによって、化学合成によって、又はそれらの組合せによって得ることができる。前記核酸分子は、固相ホスホルアミダイト化学合成のような技術を用いる化学合成によって、ゲノム又はcDNAライブラリーから、又は生物体からの分離によって調製することができる。RNA分子は、一般的にはDNA配列のin vitro又はin vivo転写によって作製され得る。
核酸分子は、二本鎖でも一本鎖でもよい。一本鎖DNAは、コード鎖(センス鎖としても知られる)でも、非コード鎖(アンチセンス鎖とも称される)でもよい。
“核酸分子”という用語には、DNA及びRNAの類似体(例えば改変骨格を含むもの)、並びにペプチド核酸(PNA)も含まれる。本明細書で用いられる“PNA”という用語は、アンチセンス分子又は抗遺伝子作用因子を指し、長さが少なくとも5ヌクレオチドであってアミノ酸残基のペプチド骨格に結合されたオリゴヌクレオチドを含む。前記ペプチド骨格は、好ましくはリジンで終わり、この末端リジンは当該組成物に可溶性を付与する。PNAは、PEG化(pegylated)されて細胞内での寿命が延長されてもよい{細胞内では、PNAは優先的に相補性一本鎖DNA及びRNAと結合して転写物の伸長を停止させる(P.E. Nielsen et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53−63)}。
この点に関する変種の中では、特にヌクレオチドの置換、欠失又は挿入によって前述の核酸分子と異なる変種が挙げられる。置換、欠失又は挿入には、1つ又は2つ以上のヌクレオチドが関与し得る。変種は、コード領域若しくは非コード領域又はその両方において変化していてもよい。コード領域における変化は、保存的又は非保存的なアミノ酸置換、欠失又は挿入を生成し得る。
また、遺伝子産物(該ポリペプチド)のクローニング、プロセッシング、及び/又は発現を改変するといった、種々の理由のため、当技術分野で一般的に知られている方法を用いて本発明の核酸分子を操作することもできる。ランダムフラグメント化によるDNAシャッフリング並びに遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドのPCRリアッセンブリーは、ヌクレオチド配列の操作に使用し得る技術として含まれる。部位特異的突然変異誘導を用いて、新規な制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドンの優先性の変化、スプライシング変種の生成、変異の導入などを行うことができる。
本発明の核酸分子には、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子と部分的に相補的であり、従ってそのコード核酸分子とハイブリダイズする(ハイブリダイゼーション)アンチセンス分子も含まれる。そのようなアンチセンス分子(例えばオリゴヌクレオチド)は、当業者にはよく知られるように、本発明のポリペプチドをコードする標的核酸を認識し、その標的核酸と特異的に結合してその転写を妨げるようにデザインすることができる(例えば以下の文献を参照されたい:J.S. Cohen, Trends in Pharm. Sci., 10:435(1989); J. Okano, Neurochem. 56:560(1991); J. O’ Connor, Neurochem. 56:560(1991); Lee et al., Nucleic Acids Res. 6:3073(1979); Cooney et al., Science 241:456(1988); Dervan et al., Science 251:1360(1991))。
完全に相補的な分子と標的分子とのハイブリダイゼーションの阻害は、当業者に知られるハイブリダイゼーションアッセイを用いて調べることができる(例えばSambrook et al.(上掲書)を参照されたい)。従って、実質的に相同な分子は、文献(G.M. Wahl and S.L. Berger, 1987, Methods Enzymol. 152:399−407; A.R. Kimmel, 1987, Methods Enzymol. 152:507−511)で教示されるように、完全に相同な分子と標的分子との結合を種々のストリンジェンシー条件下で競合させ阻害するであろう。
“ストリンジェンシー”とは、異なる分子の会合よりも非常に類似した分子の会合に適したハイブリダイゼーション反応の条件を指す。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、以下を含む溶液(50%のホルムアミド、5倍のSSC(150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5倍のデンハルト溶液、10%の硫酸デキストラン、及び20μg/mLの変性せん断サケ精子DNA)中で42℃にて一晩インキュベーションし、続いてフィルターを約65℃にて0.1倍のSSC中で洗滌すると定義される。低ストリンジェンシー条件は、35℃にて実施されるハイブリダイゼーション反応を含む(Sambrook et al.(上掲書)を参照されたい)。好ましくは、ハイブリダイゼーションに用いられる条件が高ストリンジェンシー条件である。
本発明に従って利用し得るアッセイに関連して下記でさらに考察するように、上述の核酸分子をRNA、cDNA又はゲノムDNAに対するハイブリダイゼーションプローブとして用いて、INSP052及びINSP055ポリペプチドをコードする完全長cDNA及びゲノムクローンを単離し、さらにINSP052及びINSP055ポリペプチドをコードする遺伝子と高い配列類似性を有する相同遺伝子又はオーソログ遺伝子のcDNA及びゲノムクローンを単離することができる。
これに関しては、当技術分野で既知の他の技術のうち、特に以下の技術を利用することができる。これらの技術は、例示として下記で考察される。DNAのシークエンシング及び解析の方法は周知であって、当技術分野では一般的に利用可能であり、本明細書で考察される本発明の態様の多くを実施するために実際に用いることができる。そのような方法では、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、シークエナーゼ(US Biochemical Corp., Cleaveland, OH)、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer)、耐熱性T7ポリメラーゼ(Amersham, Chicago, IL)、又はポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼの組合せ(例えば市販(Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)のELONGASE増幅システムで見出されるようなもの)のような酵素を利用することができる。好ましくは、シークエンシング過程は、例えばハミルトンマイクロラブ(Hamilton Micro Lab)2200(Hamilton, Reno, NV)、ペルティエサーマルサイクラー(Peltier Thermal Cycler)PTC200(MJ Research, Watertown, MA)、ABIカタリスト並びに373及び377DNAシークエンサー(Perkin Elmer)のような機器を用いて自動化することができる。
逆PCRも、既知の領域に基づく多様なプライマーを用いて、配列を増幅すること又は伸長することに用いられ得る(T. Triglia et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186)。
使用し得る別の方法は捕捉PCRで、この方法は、ヒト及び酵母の人工染色体DNAにおける既知配列に近接しているDNAフラグメントのPCR増幅を含む(M. Lagerstrom et al. (1991) PCR Methods Applic. 1:111−119)。未知配列を検索するために使用し得る別の方法は、パーカーの方法である(J.D. Parker et al.(1991) Nucleic Acids Res. 19:3055−3060)。さらに、ゲノムDNAを少しずつ移動して調べるためにPCR、入れ子(nested)プライマー及びプロモーターファインダーTM(PromoterFinderTM)ライブラリー(Clontech, Palo Alto, CA)を用いてもよい。この方法ではライブラリーのスクリーニングが不要で、イントロン/エクソン接合部の発見に有用である。
本発明のある態様では、染色体上の位置特定のために、本発明の核酸分子を用いることができる。この技術では、核酸分子は個々のヒト染色体上の特定の位置に対して特異的に標的化され、個々のヒト染色体上の特定の位置とハイブリダイズさせることができる。本発明の関連配列の染色体へのマッピングは、遺伝子関連疾患に関する配列の相関性確認において重要な工程である。いったん染色体の正確な位置に配列がマッピングされたら、該配列の染色体上の物理的な位置を遺伝子地図データと相関させることができる。そのようなデータは例えば以下で見出すことができる:V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man(ジョーンズホプキンス大学、ウェルチ医学図書館を通じてオンラインで利用可能である)。次に、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係を連鎖解析(物理的に近接する遺伝子の同時遺伝(coinheritance))によって同定する。これにより、ポジショナルクローニング又は他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報が提供される。いったん疾患又は症候群の位置が遺伝連鎖によって特定のゲノム領域に大まかに限局されたら、前記領域にマッピングされるいずれの配列も、更なる解析のための関連遺伝子又は調節遺伝子となることができる。前記核酸分子はまた、正常な個体、キャリア個体又は罹患個体間で転座、逆位などによる染色体位置上の相違を検出するために用いることができる。
そのような技術は、ポリペプチドをコードするmRNAの検出によって、組織中の前記ポリペプチドの発現パターンの決定を可能にする。これらの技術には、in situハイブリダイゼーション技術及びヌクレオチド増幅技術(例えばPCR)が含まれる。これらの研究から得られる結果は、生物内での前記ポリペプチドの正常な機能を示唆する。さらに、変異遺伝子によってコードされるmRNAの発現パターンと正常mRNA発現パターンとの比較研究によって、変異ポリペプチドの疾患における役割に対する貴重な洞察が提供される。そのような不適切な発現は時間的、位置的又は量的性質を有する場合もある。
遺伝子サイレンシングアプローチを実施して、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の内在性発現をダウンレギュレートすることもできる。RNA干渉(RNAi)(S.M. Elbashir et al. Nature 2001, 411, 494-498)は、使用可能な配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのための1つの方法である。短いdsRNAオリゴヌクレオチドをin vitroで合成して細胞内に導入する。これらdsRNAの配列特異的結合によって標的mRNAの分解が開始され、標的タンパク質の発現が減少又は阻害される。
上述した遺伝子サイレンシングの有効性は、ポリペプチド発現の測定(例えばウェスタンブロッティングによる)、又はタックマン(TaqMan)に基づく方法を用いるRNAレベルの測定によって評価することができる。
本発明のポリペプチドは、宿主細胞内に含まれるベクター中の前記ポリペプチドをコードする核酸分子の発現によって、組換え形態で調製することができる。前記のような発現方法は当業者によく知られており、多くは以下の文献でより詳細に記述されている:Sambrook et al.(上掲書)及びFernandez & Hoeffler(1998, eds. “Gene expression systems. Using nature for the art of expression”, Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto)。
適切な発現系の例には、例えば染色体系、エピソーム系及びウイルス由来系、例えば以下に由来するベクターが含まれる:細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス(例えばSV40)、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス、又は上記の組合せ、例えばプラスミドとバクテリオファージの遺伝子エレメントに由来するもの(例えばコスミド及びファージミドを含む)。ヒト人工染色体(HAC)もまた、プラスミドに包含させ発現させ得るよりも大きいDNAフラグメントを搬送するのに用いることができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸分子の宿主細胞への導入は、多くの標準的な実験室マニュアル(例えば、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)及び上掲書(Sambrook et al.))に記載された方法によって達成できる。特に適切な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン仲介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、陽イオン脂質仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、擦過ローディング(scrape loading)、弾道導入又は感染が含まれる(以下を参照されたい:Sambrook et al.(1989)上掲書;Ausubel et al.(1991)上掲書;Spector, Goldman & Leinwald,(1998))。真核細胞では、発現系は、その系の要求に応じて一過性(例えば、エピソーム性)又は永続的(染色体組込み)であり得る。
制御配列の他に、宿主細胞の増殖に関連して前記ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することが望ましい場合がある。調節配列の例は、化学的又は物理的刺激(調節化合物の存在を含む)又は多様な温度若しくは代謝条件に応答して遺伝子の発現を増加させたり低下させたりする配列である。調節配列は、ベクターの非翻訳領域、例えばエンハンサー、プロモーター並びに5’及び3’非翻訳領域である。これらは、宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写及び翻訳を実行する。そのような調節配列は、その強度及び特異性を変化させることができる。利用されるベクター系及び宿主に依存して、多くの適切な転写及び翻訳エレメント(構成性及び誘導性プロモーターを含む)を用いることができる。例えば、細菌系でクローニングするときは、誘導性プロモーター、例えばBluescriptファージミド(Stratagene, La Jolla, CA)又はpSportl(商標)プラスミド(Gibco BRL)などのハイブリッドlacZプロモーターを用いることができる。バキュロウイルスポリヘドリン(polyhedrin)プロモーターは、昆虫細胞で用いることができる。植物細胞ゲノムに由来するプロモーター又はエンハンサー(例えば熱ショック、RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子)又は植物ウイルスに由来するプロモーター又はエンハンサー(例えばウイルスプロモーター又はリーダー配列)は、ベクターへクローニングすることができる。哺乳類細胞系では、哺乳類遺伝子由来又は哺乳類ウイルス由来のプロモーターが好ましい。配列の多数コピーを含む細胞株の作製が必要な場合、SV40又はEBVをベースとするベクターが、適切な選択マーカーとともに用いられ得る。
制御配列及び他の調節配列は、ベクターへの挿入の前に核酸コード配列に連結させることができる。あるいは、制御配列及び適切な制限部位を既に含む発現ベクターへ、コード配列を直接クローニングすることができる。
組換えポリペプチドの長期的かつ高収量の生成のためには、安定な発現が好ましい。例えば、対象のポリペプチドを安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点及び/又は内因性発現エレメント並びに選択マーカー遺伝子を同じ又は別個のベクター上に含む発現ベクターを用いて形質転換させることができる。ベクターの導入に続き、選択培地に切り替える前に細胞を栄養(enriched)培地で1〜2日間増殖させることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することで、選択マーカーの存在によって、導入された配列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能になる。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞の種類に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
バキュロウイルス系では、バキュロウイルス/昆虫細胞発現系のための材料は、特にインビトロジェン(Invitrogen, San Diego, CA)からキットの形態で(“MaxBac”キット)商業的に入手可能である。そのような技術は一般的に当業者に知られており、文献には完全に記載されている(Summers & Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987))。この系での使用に特に適切な宿主細胞には、昆虫細胞、例えばドロソフィラ(Drosophila)S2細胞及びスポドプテラ(Spodoptera)Sf9細胞が含まれる。
当技術分野で公知である多くの植物細胞培養及び植物体(whole plant)遺伝子発現系が存在する。適切な植物細胞遺伝子発現系の例には、米国特許第5,693,506号、5,659,122号及び5,608,143号に記載されるものが含まれる。植物細胞培養における遺伝子発現の更なる例は、文献に記載されている(Zenk (1991) Phytochemistry 30:3861−3863)。
特に、プロトプラストを単離し、これを培養して完全な再生植物を形成することが可能な植物は全て利用することができ、それによって移入遺伝子を含む完全な植物が回収できる。特に、サトウキビ、サトウダイコン、綿花、果実及び他の樹木、マメ類及び野菜の主要な種の全てを含む(ただしこれらに限定されない)全ての植物は、培養細胞又は培養組織から再生させることができる。
真菌での発現に特に適切な宿主細胞の例には、酵母細胞(例えばS.セレビシエ(cerevisiae))及びアスペルギルス細胞が含まれる。
形質転換細胞株の回収に用いることができる多くの選択系は当技術分野で公知である。そのような例として、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(M. Wigler et al.(1977) Cell 11:223−32)及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(I. Lowy et al.(1980) Cell 22:817−23)の遺伝子が挙げられ、これらはそれぞれtk−又はaprt±細胞で用いることができる。
さらにまた、抗代謝物質耐性、抗生物質耐性又は除草剤耐性を選択基準として用いてもよい。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)はメトトレキセートに対する耐性を付与し(M. Wigler et al.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567−70)、nptはアミノグリコシド系ネオマイシン及びG−418に対する耐性を付与し(F. Colbere−Garapin et al.(1981) J. Mol. Biol. 150:1−14)、さらにals又はpatはそれぞれクロロスルフロン(chlorsulfuron)及びホスフィノトリシン(phosphinotricin)アセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する。さらに別の選択可能な遺伝子が報告されており、それらの例は当業者には明白であろう。
あるいは、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含み、前記ポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られている多様な手法で同定することができる。前記手法には、DNA−DNA又はDNA−RNAハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイ、例えば蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)又はイムノアッセイ技術(例えば酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)及び放射性イムノアッセイ(RIA))が含まれ(ただしこれらに限定されない)、核酸又はタンパク質の検出及び/又は定量のためにメンブレン、溶液又はチップをベースとする技術が含まれる(例えば以下を参照されたい:R. Hampton et al.(1990) Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN;及びD.E. Maddox et al.(1983) J. Exp. Med. 158:1211−1216)。
検出を容易にするために用いられ得る適切なレポーター分子又は標識には、放射性核種、酵素及び蛍光、化学発光又は色素生産性物質、基質、コファクター、インヒビター、磁性粒子などが挙げられる。
ポリペプチドは、周知の方法によって組換え細胞培養物から回収し精製することができる。前記周知の方法には、硫酸アンモニウム又はエタノール沈澱、酸性抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸化セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーが含まれる。高性能液体クロマトグラフィーは、精製に特に有用である。単離及び精製の間にポリペプチドが変性した場合には、タンパク質のリフォールディングのためによく知られている技術を用いて活性な高次構造を再生することができる。
本発明のポリペプチドを用いて、種々の薬剤スクリーニング技術のいずれかで化合物ライブラリーをスクリーニングすることができる。そのような化合物は、本発明のポリペプチドの遺伝子発現レベル又は活性レベルを活性化させる(アゴニスト作用)か、又は阻害する(アンタゴニスト作用)ことができ、本発明のさらなる局面を形成し得る。好ましい化合物は、本発明の第1局面のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現を変化させることに有効であるか、又は本発明の第1局面のポリペプチドの活性を調節することに有効である。
アゴニスト化合物又はアンタゴニスト化合物は、例えば細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリー又は天然物混合物から単離することができる。これらのアゴニスト又はアンタゴニストは、天然の又は改変された、基質、リガンド、酵素、受容体、構造的模倣物質若しくは機能的模倣物質であってもよい。前記のようなスクリーニング技術の適切な概論については、以下を参照されたい:Coligan et al.(1991) Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5。
このようなスクリーニング技術で用いられる本発明のポリペプチドは、溶液中で遊離していても、固相支持体に固定されていても、細胞表面に保持されていても、又は細胞内に位置していてもよい。一般に、このようなスクリーニングの方法は、前記のポリペプチドを発現している適切な細胞又は細胞膜を用いることを含み、前記細胞又は細胞膜をテスト化合物と接触させて、結合又は機能的応答の刺激若しくは阻害を観察する。続いて前記テスト化合物と接触させた細胞の機能的応答を、前記テスト化合物と接触させなかったコントロール細胞と比較する。このようなアッセイによって、前記ポリペプチドの活性化によって生じるシグナルをテスト化合物がもたらすか否かを、適切な検出系を用いて評価することができる。活性化のインヒビターは、一般的には既知のアゴニストの存在下でアッセイを行われ、テスト化合物の存在下でのアゴニストによる活性化の影響が観察される。
(a)本発明の第1局面のポリペプチドをその表面に発現している細胞を、前記ポリペプチドとの結合を許容する条件下で被検化合物と接触させる工程であって、前記ポリペプチドは、前記化合物とポリペプチドとの結合に応答して検出可能なシグナルを提供することができる第二の成分と結合されており;さらに
(b)前記化合物と前記ポリペプチドとの相互作用によって生じるシグナルのレベルを測定することにより、前記化合物が前記ポリペプチドと結合しこれを活性化するか又は阻害するかを決定する工程。
本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するさらに好ましい方法は、以下の工程を含む:
(a)前記ポリペプチドをその表面に発現している細胞を、前記ポリペプチドとの結合を許容する条件下で被検化合物と接触させる工程であって、前記ポリペプチドは、前記化合物とポリペプチドとの結合に応答して検出可能なシグナルを提供することができる第二の成分と結合されており;さらに
(b)前記化合物と前記ポリペプチドとの相互作用によって生じるシグナルレベルを前記化合物が存在しないときのシグナルレベルと比較することにより、前記化合物が前記ポリペプチドと結合しこれを活性化するか又は阻害するかを決定する工程。
本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法の別の態様は、以下の工程を含む:
本発明のポリペプチドをその表面に有する細胞とリガンドとの結合又は前記ポリペプチドを含む細胞膜とリガンドとの結合の阻害を、前記ポリペプチドとの結合を許容する条件下で候補化合物を存在させて決定する工程、及び前記ポリペプチドに結合したリガンドの量を決定する工程。リガンドの結合の減少を引き起こし得る化合物は、アゴニスト又はアンタゴニストであると考えられる。好ましくは、前記リガンドが標識されている。
より詳しくは、アンタゴニスト又はアゴニスト化合物をポリペプチドについてスクリーニングする方法は以下の工程を含む:
(a)本発明のポリペプチドをその表面に発現している全細胞又は本発明のポリペプチドを含む細胞膜と、標識リガンドとをインキュベートする工程;
(b)前記全細胞又は細胞膜と結合した標識リガンドの量を測定する工程;
(c)工程(a)の標識リガンドと前記全細胞又は細胞膜の混合物に候補化合物を添加し、前記混合物を平衡化させる工程;
(d)前記全細胞又は細胞膜と結合した標識リガンドの量を工程(c)の後に測定する工程;及び
(e)工程(b)及び工程(d)で結合した標識リガンドの相違を比較する工程であって、工程(d)において結合の減少を引き起こす化合物がアゴニスト又はアンタゴニストであると考える前記工程。
上述のある態様では、単純な結合アッセイを用いてもよい。この場合、テスト化合物のポリペプチド保持表面への付加が、直接的又は間接的にテスト化合物と結合させた標識手段によって検出されるか、又は標識競合物質との競合を含むアッセイで検出される。別の態様では、競合薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この場合、ポリペプチドと特異的に結合することができる中和抗体が、結合についてテスト化合物と競合する。このようにして、前記抗体を用いて、前記ポリペプチドに対し特異的な結合親和性を保有する一切のテスト化合物の存在を検出することができる。
当業者であれば、本発明のポリペプチドのモジュレーターを同定するためのアッセイを工夫し得るであろう。これに関連して、アンタゴニスト(この場合では、中和抗体)を同定するためのアッセイ例を報告しているLokker NAらの文献(J Biol Chem 1997 Dec 26;272(52):33037-44)が興味深い。
さらにまた本発明の範囲内に含まれるアッセイ方法は、過剰発現アッセイ又は除去(ablation)アッセイで本発明の遺伝子及びポリペプチドの使用を必要とするものである。このようなアッセイは、これら遺伝子/ポリペプチドの細胞内レベルの操作及びこの操作事象による前記被操作細胞の生理機能に対する影響の評価を含む。例えばそのような実験によって、特定の遺伝子/ポリペプチドが関与するシグナル伝達経路及び代謝経路の詳細が明らかにされ、本研究対象のポリペプチドが相互作用するポリペプチドのアイデンティティーに関する情報がもたらされ、さらに関連遺伝子及びタンパク質を調節する方法についての手がかりが提供される。
本発明のポリペプチドを用いて、当技術分野で公知の標準的な受容体結合技術により膜結合受容体又は可溶性受容体を同定することができる。前記標準的な技術は、例えばリガンド結合アッセイ及び架橋アッセイであり、そのようなアッセイでは、ポリペプチドを放射性同位体で標識し、化学的に改変し、又はその検出若しくは精製を容易にするペプチド配列に融合して、推定上の受容体供給源(例えば細胞の組成物、細胞膜、細胞上清、組織抽出物又は体液)とインキュベートする。結合の有効性は、生物物理的技術、例えば表面プラズモン共鳴及び分光法を用いて測定することができる。結合アッセイは、受容体の精製及びクローニングのために使用し得るが、ポリペプチドのその受容体への結合と競合する、該ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを同定することもできる。スクリーニングアッセイを実施する標準的方法は、当技術分野ではよく理解されている。
本発明は、前記アゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質及び酵素、並びに上記方法で発見された、本発明のポリペプチドの活性又は抗原性を調節する他の化合物を含む。
本発明は、本発明のポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物を適切な医薬担体と組合せて含む医薬組成物をも提供する。これらの組成物は、以下に詳細に説明するように、治療用若しくは診断用試薬として、ワクチンとして、又は他の免疫原性組成物として適切であり得る。
本明細書で用いられる専門用語にしたがえば、ポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物[X]を含む組成物は、組成物中のX+Yの合計の少なくとも85質量%がXである場合に不純物(本明細書中ではY)を“実質的に含まない”。好ましくは、Xが組成物中のX+Yの合計の少なくとも約90質量%、より好ましくは少なくとも約95質量%、98質量%又は99質量%を構成する。
ヒト対象者に対する正確な有効量は、疾患状態の重篤度、対象者の全身の健康状態、対象者の年齢、体重及び性別、食事、投与時間及び投与回数、併用薬剤、反応感受性及び療法に対する許容性/応答性に依存するであろう。この量は日常的検査により決定することができ、それは臨床医の判断の範囲内である。一般には、有効用量は0.01mg/kgから50mg/kg、好ましくは0.05mg/kgから10mg/kgであろう。患者に個別に組成物を投与してもよく、又は他の薬剤、医薬品又はホルモンと併用して投与してもよい。
医薬組成物に、医薬的に許容できる塩、例えば鉱酸塩(塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような);及び有機酸の塩(酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような)を用いることができる。医薬的に許容できる担体についての綿密な考察は以下のテキストで入手可能である:Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)。
治療用組成物中の医薬的に許容できる担体は、さらに液体、例えば水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールを含むことができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝物質などのような助剤が、前記組成物中に存在していてもよい。そのような担体は、患者が摂取できるように、前記医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することを可能にする。
本発明で用いられる医薬組成物は、多数の経路(経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜下腔内、心室内、経皮的アプリケーション(例えばWO98/20734を参照)、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸的手段が挙げられるが、ただしこれらに限定されない)によって投与できる。遺伝子銃又はハイポスプレーも本発明の医薬組成物の投与に用いることができる。典型的には、本治療用組成物は、注射用物質(液体溶液又は懸濁剤のいずれか)として調製できる。注射に先立ち液体ビヒクルで溶液又は懸濁液とするのに適する固体を調製することもできる。
本組成物の直接的デリバリーは一般に、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内に注射することによって達成されるか、又は組織の間隙腔に送達されるであろう。前記組成物を病巣に投与してもよい。投薬治療は、単回投与スケジュールでも複数回投与スケジュールでもよい。
本発明のポリペプチドの活性が特定の疾患状態において過剰である場合には、いくつかのアプローチが利用可能である。あるアプローチは、医薬的に許容できる担体とともに上記のような阻害化合物(アンタゴニスト)を、前記ポリペプチドの機能を阻害するのに有効な量で対象者に投与することを含む。前記ポリペプチドの機能の阻害は、例えばリガンド、基質、酵素、受容体の結合を遮断することによって、又は二次のシグナルを阻害することによって成され、それによって異常な症状が緩和される。好ましくは、前記アンタゴニストが抗体である。最も好ましくは、該抗体は、前述したように、その免疫原性を最少にするキメラ抗体及び/又はヒト化抗体である。
また別のアプローチでは、内部で生成される又は別個に投与されるアンチセンス核酸分子(上述したような)の使用といった発現遮断技術を用いて、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害することができる。遺伝子発現の改変は、該ポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域、5’領域又は調節領域(シグナル配列、プロモーター、エンハンサー及びイントロン)に対して相補的な配列又はアンチセンス分子(DNA、RNA又はPNA)を設計することによって達成できる。同様に、阻害は“三重らせん”塩基対方法論を用いて達成することができる。三重らせん対形成は、ポリメラーゼ、転写因子又は調節分子の結合のために二重らせんが充分に開く能力を阻害することから有用である。三重らせんDNAを用いる近年の治療上の進歩は文献に記載されている(J.E. Gee et al.(1994) In:B.E. Huber & B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY)。相補的配列又はアンチセンス分子を設計し、リボソームに対する結合を妨げて転写を妨害することによってmRNAの翻訳を遮断することもできる。このようなオリゴヌクレオチドを投与してもよいし、in vivo発現によりin situ生成され得る。
RNA分子を改変して、細胞内の安定性及び半減期を増加させることができる。可能な改変として、限定するものではないが、RNA分子の5’及び/又は3’末端へのフランキング配列の付加、又は該分子の骨格内でホスホジエステル結合に代わるホスホロチオエート若しくは2’-O-メチルの使用が挙げられる。この概念はPNAの生成に固有であり、内因性エンドヌクレアーゼによって同様に容易には認識されないイノシン、ケオシン(queosine)及びブトシン(butosine)のような非慣用塩基、並びにアセチル-、メチル-、チオ-及び同様な改変形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンを含めることによってPNA分子の全てに拡張することができる。
遺伝子治療を用い、対象者の関連細胞によって本ポリペプチドの内因性産生を果たすことができる。遺伝子治療を用いて、欠陥のある遺伝子を修正した治療用遺伝子と置き換えることによって、該ポリペプチドの不適切な生成を永久的に治療する。
本発明の遺伝子治療は、in vivo又はex vivoで実施することができる。ex vivo遺伝子治療は、患者の細胞の単離及び精製、治療用遺伝子の導入、及び遺伝的に改変した細胞を患者に戻して導入することを必要とする。対照的に、in vivo遺伝子治療は、患者の細胞の単離及び精製を必要としない。
遺伝子デリバリービヒクルは、リポソームのような非ウイルス性、又は、例えばK.L. Berkner (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:39−66に記載されているアデノウイルスのような複製欠損ウイルス若しくはN. Muzyczka (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:97−129及び米国特許第5,252,479号に記載されているアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであり得る。例えば、複製欠損レトロウイルスベクターで発現させるために、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を操作することができる。次に、この発現構築物を単離し、前記ポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージング細胞に導入することができる。その結果、前記パッケージング細胞は、対象の遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生できるようになる。in vivoで細胞を操作するため及びin vivoでポリペプチドを発現させるため、これらのプロデューサー細胞を対象者に投与することができる(以下を参照されたい:Gene Therapy and Other Molecular Genetic−based Therapeutic Approaches, Chapter 20(及びその中に引用された文献), “Human Molecular Genetics” (1996) T. Strachan & A.P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd.)。
本発明のポリペプチド又は核酸分子が疾患を引き起こす原因物質である場合には、本発明は、前記疾患を引き起こす原因物質に対する抗体を産生させるワクチンとして用いることができる前記ポリペプチド又は核酸分子を提供する。
本発明のワクチンは、予防的(すなわち、感染を防ぐ)であっても治療的(すなわち、感染後の疾患を治療する)であってもよい。そのようなワクチンは、免疫性を付与する抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質又は核酸を、通常は上述した医薬的に許容できる担体と組合せて含む。前記担体には、組成物を投与される個体に対して有害な抗体の産生をそれ自体で誘導しない担体のいずれもが含まれる。さらに、これらの担体は免疫刺激剤(“アジュバント”)として機能し得る。さらに、前記抗原又は免疫原は、細菌の類毒素(例えばジフテリア、破傷風、コレラ、H.ピロリ菌(pyroli)由来の類毒素)及び他の病原体と結合されてもよい。
ポリペプチドは胃で分解されるので、ポリペプチドを含むワクチンは、好ましくは非経口的に(例えば、皮下、筋肉内、静脈内又は皮内注射)投与される。非経口投与に適した製剤として、水性及び非水性の無菌注射溶液、並びに水性及び非水性の無菌懸濁剤が含まれる。前記無菌注射溶液は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤をレシピエントの血液に対して等張にする溶質を含んでいてもよく、前記無菌懸濁剤は、懸濁剤又は増粘剤を含んでもよい。
本発明のポリペプチドに結合する抗体の遺伝子デリバリーは、例えば国際特許出願WO98/55607に記載されているように達成しうる。
ジェット式注射(jet injection)と呼ばれている技術(例えば、www.powderject.comを参照)もワクチン組成物の処方で有用であり得る。
ワクチン接種及びワクチンデリバリーシステムに適切ないくつかの方法が国際特許出願WO 00/29428に記載されている。
診断のための核酸分子は、対象者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検又は剖検材料から入手できる。ゲノムDNAを直接検出に用いてもよいし、又はPCR、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)若しくは他の増幅技術を分析に先立って用いることによって、ゲノムDNAを酵素的に増幅してもよい(以下の文献を参照されたい:Saiki et al., Nature 324:163−166(1986); Bej et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26:301−334(1991); Birkenmeyer et al., J. Virol. Meth., 35:117−126(1991); Van Brunt, J., Bio/Technology, 8:291−294(1990))。
a)本発明の核酸分子と核酸プローブとの間でハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で、患者由来の組織サンプルを前記核酸プローブと接触させる工程;
b)工程a)で用いた条件と同じ条件下で、コントロールサンプルを前記プローブと接触させる工程;及び、
c)前記サンプル中のハイブリッド複合体の存在を検出する工程;
この場合、コントロールサンプル中のハイブリッド複合体レベルと異なるハイブリッド複合体レベルが患者サンプルで検出されることは、疾患を示唆する。
本発明のさらなる局面は、以下の工程を含む診断方法を含む:
a)疾患について検査される患者から、組織サンプルを入手する工程;
b)前記組織サンプルから、本発明の核酸分子を単離する工程;及び、
c)疾患に付随する前記核酸分子における変異の存在を検出することによって、患者を疾患について診断する工程。
正常な遺伝子型と比較すると、増幅産物のサイズの変化によって、欠失及び挿入を検出できる。増幅DNAを本発明の標識RNAとハイブリダイズさせるか、あるいは本発明の標識アンチセンスDNA配列とハイブリダイズさせることによって、点変異を同定することができる。完全にマッチングした配列は、RNase消化によって、又は融解温度の差異を評価することによって、ミスマッチを有する二重鎖と区別することができる。DNAをストリンジェントな条件下で前記DNAとハイブリダイズする核酸プローブと接触させてハイブリッド二本鎖分子を形成させること(前記ハイブリッド二本鎖は、疾患に付随する変異に対応するいずれかの部分で前記核酸プローブ鎖のハイブリダイズしていない部分を有する)、及び、前記プローブ鎖のハイブリダイズしていない部分の有無を前記DNA鎖の対応部分における疾患付随変異の有無を示すものとして検出することによって、患者における変異の有無を検出することができる。
このような診断は特に出生前検査で有用であり、新生児検査でもなお有用である。
DNA配列の相違は、変性剤の存在下又は非存在下でのゲル内のDNAフラグメントの電気泳動移動度における変化によって、又は直接DNAシークエンシング(例えば、Myers et al., Science (1985) 230:1242)によっても検出することができる。特定の位置における配列の変化は、RNase及びS1保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイによって、又は化学切断法(Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401を参照)によっても明らかにすることができる。
本発明の別の態様では、本発明の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して、遺伝的変種、変異及び多型性の効率的スクリーニングを実施することができる。アレイ技法は周知であり、一般的適用性を有しており、遺伝子発現、遺伝連鎖及び遺伝的可変性を含む分子遺伝学における種々の疑問に取り組むのに用いることができる(例えば以下を参照されたい:M. Chee et al., Science (1996) , Vol 274, pp610-613)。
宿主に由来するサンプルで本発明のポリペプチドのレベルを決定することに使用できるアッセイ技術は当業者によく知られており、また上記でいくらか詳細に考察されている(ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析及びELISAアッセイを含む)。本発明のこの局面は、以下の工程を含む診断方法を提供する:(a)上記のようなリガンドを、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適する条件下で生物学的サンプルと接触させる工程;及び(b)前記複合体を検出する工程。
ELISA、RIA及びFACSのようなポリペプチドレベルを測定するためのプロトコルは、ポリペプチド発現の変化レベル又は異常レベルを診断するための基礎をさらに提供することができる。ポリペプチド発現の正常値又は標準値は、正常な哺乳類対象体(好ましくはヒト)から得られた体液又は細胞抽出物を、複合体形成に適した条件下で、前記ポリペプチドに対する抗体と混合することによって確立される。標準的な複合体形成量は、種々の方法、例えば分光測定手段によって定量することができる。
生検組織由来の、対象者、コントロール及び疾患サンプルで発現されているポリペプチドの量を標準値と比較する。標準値と対象者の値との間の偏差は疾患診断のためのパラメータを確立する。診断アッセイを用いて、ポリペプチド発現の有無及び過剰を識別し、治療的処置の間のポリペプチドレベルの調節をモニターすることができる。このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験又は個々の患者の治療モニタリングにおける特定の治療的処置方法の有効性を評価することもできる。
(a)本発明の核酸分子;
(b)本発明のポリペプチド;又は
(c)本発明のリガンド。
本発明のある局面では、診断キットが、ストリンジェントな条件下で本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブを含む第1の容器;前記核酸分子を増幅させるために有用なプライマーを含む第2の容器;及び、疾患の診断を容易にするために前記プローブ及びプライマーの使用説明書を含み得る。前記キットは、ハイブリダイズしていないRNAを消化するための薬剤を保持している第3の容器をさらに含んでもよい。
本発明の別の局面では、診断キットが核酸分子のアレイを含んでもよく、前記核酸分子の少なくとも1つが本発明の核酸分子であってもよい。
本発明のポリペプチドを検出するために、診断キットは、本発明のポリペプチドと結合する1つ又は2つ以上の抗体;及び、前記抗体と前記ポリペプチドとの間の結合反応の検出に有用な試薬;を含み得る。
以下、特にINSP052ポリペプチド及びINSP055ポリペプチドに関連する実施例を介して、本発明の種々の局面及び態様をより詳細に説明する。
本発明の範囲から逸脱することなく細部の改変を為し得ることが理解されるであろう。
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12及び配列番号14の組合せによって得られたポリペプチド配列、並びにINSP052に由来する連続する複数のエクソンの翻訳物を表している配列番号16は、ヒトゲノムDNA配列に由来している。INSP055を表しているポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列である配列番号17及び配列番号18は、それぞれINSP052のマウスオーソログのポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列である。配列番号16及び配列番号18によって表されているINSP052ポリペプチド配列及びINSP055ポリペプチド配列は、それぞれシグナルペプチド配列及び膜貫通ドメインを含むことが予測される。特に、その細胞外ドメインの完全配列及び成熟配列がDNAレベル及びタンパク質レベルで同定された(配列番号19〜22)。
WO 03/93316に示されるように、INSP052完全長予測物は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属しVEGF/PDGF受容体に関連する416個のアミノ酸のI型膜タンパク質をコードする。推定上のシグナル配列は、INSP052のアミノ酸1〜33から成る。予測される膜貫通(TM)ドメインは、INSP052のアミノ酸241〜263から成る。従って、INSP052の成熟細胞外ドメインは、INSP052のアミノ酸34〜240から成る。この後者の配列は、前記文献でSEQIDNO(配列番号)434及びSEQIDNO 880として開示されている2つの配列に類似する(WO 04/009834;配列番号27及び配列番号28)。
このような融合タンパク質の他の例は、別のタンパク質由来のシグナル配列(例えば、ヒト成長ホルモン又はβ2-ミクログロブリン)、精製タグ(例えば、ヒスチジンタグ又はHAタグ)、異なる膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、分泌タンパク質(例えば、サイトカイン又はアルブミン様血清タンパク質)、開始メチオニン(例えば、大腸菌において直接発現を可能にするため)、エンドペプチダーゼの認識部位を含有するリンカー領域(異種タンパク質配列の除去を容易にする)、又はヒト免疫グロブリンのFc領域を含むものである(図1B)。
INSP052ECに融合させる1又は2以上のこれら配列の選択は、前記タンパク質の組換えタンパク質としての特異的な使用法及び/又は精製プロトコルに有効である。例えば、INSP052ECの活性は、アルブミン配列を含む融合タンパク質を用いて、又はINSP052EC-6HIS(配列番号29)を用いる実施例で示されるように、検出及び精製を容易にするヒスチジンタグ配列を含む融合タンパク質を用いて、テストすることもできる。
免疫グロブリンフラグメントを含む融合タンパク質を生成するための種々の戦略が文献に開示されている(WO 91/08298; WO 96/08570; WO 93/22332; WO 04/085478; WO 02/66514)。例えば、成熟INSP052ECをコードする核酸配列は、5’末端で本来のINSP052ECシグナル配列(又は、任意の他の適切なシグナル配列)をコードする核酸配列に融合し、かつ3’末端でヒト免疫グロブリンλ重鎖IgG1(NCBI Acc. No. CAA75302)の定常部をコードする核酸配列に融合するように(配列番号30)、発現ベクターでクローン化することができる。その結果得られたベクターを用いて、CHO細胞株又はHEK293細胞株を形質転換させて、N末端にINSP052ECを有しC末端にIgG1配列を有する組換え融合タンパク質を安定して発現かつ分泌するクローンを選択することができる。次に、このクローンを用いて、生産をスケールアップさせること及び培地から組換え融合タンパク質を精製することができる。或いは、ヒト免疫グロブリンλ重鎖IgG1の定常部及びINSP052ECをコードする核酸の位置を逆にすることができ、やはりINSP052の本来のシグナル配列又は任意の他の適切なシグナル配列を用いて、その結果得られるタンパク質を発現かつ分泌させることができる。
INSP052ECの多量体化を可能にする他のタンパク質配列は、hCG(WO 97/30161)、コラーゲンX(WO 04/33486)、C4BP(WO 04/20639)、Erbタンパク質(WO 98/02540)、コイルドコイルペプチド(WO 01/00814)のようなタンパク質から単離されるドメインである。
WO 03/093316に記載されているようなヒトゲノムDNAから、エクソンアッセンブリーによって、INSP052の細胞外領域全体(アミノ酸1〜240)をコードするDNAをクローン化した。次に、そのタンパク質をヒスチジンタグ付き融合タンパク質として発現させて精製した(INSP052EC-6His;配列番号29)。
INSP052細胞外ドメインのHisタグ付き変形(INSP052EC-6His-V1)用の発現ベクターの構築、エプスタイン-バーウイルス核抗原(HEK293-EBNA, Invitrogen)を発現するヒト胎児腎臓293細胞をトランスフェクトするための構築物のトランスフェクション、及び組換えタンパク質INSP052EC-6Hisの精製は、WO 03/93316に記載されているとおりに行った。次に、このタンパク質を一連の機能テストに用いた。
4.1:序論
以下のin vitro細胞をベースとするアッセイは、精製を容易にするためヒスチジンタグ付き変形(INSP052EC-6His;実施例2及び3参照)で発現させたINSP052EC(クローン化INSP052細胞外ドメイン)の、ヒト末梢血単核細胞(hPBMC)において種々の刺激で誘導されたサイトカイン分泌に及ぼす効果を測定する。IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-5、IL-4及びIL-10についてはサイトカインビーズアレイ(CBA)を確立した。特に、タンパク質を3つの異なる濃度で用い、各濃度について3つの異なる時点を検討した(刺激後24、48、及び72時間)。
最良の条件は、96ウェルプレートに100,000細胞/ウェル、2%グリセロールで最終100μlであった(MERCK)。最適濃度は、ConAについて5ng/mlだった。アッセイの最適時間は48時間である。サイトカイン分泌/発現のインヒビター(正のコントロール)であるデキサメタゾンの最適濃度は、10-6Mである。サイトカイン分泌/発現の刺激物質(負のコントロール)であるヒトインターロイキン18(hIL-18)の最適濃度は、100ng/mlである。
バフィーコートをDMEM(GIBCO)で1〜2倍希釈した。その後、50mlのファルコンチューブ中の15mlのフィコール(Ficoll)(PHARMACIA)層上にゆっくり25mlの希釈した血液を加え、そのチューブを遠心分離機にかけた(2000rpm,20分,RTでブレーキをかけずに)。間期細胞(環状(ring))を収集し、該細胞を25mlのDMEMで洗浄後、遠心分離工程を行った(1200rpm,5分)。この手順を3回繰り返した。バフィーコートから全部で約600×106個の細胞を得た。
4.3:スクリーニング
80μlの1.25×106細胞/mlをDMEM(GIBCO)+2.5%ヒト血清(AB型;SIGMA)+1%L-グルタミン(GIBCO)+1%ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)に希釈後、96ウェルマイクロタイタープレート(NUNC, COSTAR)に添加した。
1ウェル当たり10μl添加し(ウェル毎に1条件):タンパク質をPBS+20%グリセロールに希釈した(タンパク質の最終希釈率は1/10)。タンパク質の段階希釈を用いて、レプリカで(in replica)アッセイを行った。1ウェル当たり10μlのConA 50μg/ml(ConAの最終濃度は5μg/ml)を添加した(ウェル毎に1条件)。
STIMはConA(5μg/ml)を示し;ProtはINSP052EC-6Hisを示し;Dexaはデキサメタゾンであり;IL-18はヒトインターロイキン18である。
48時間後、細胞上清を収集し、ヒトTh1/Th2サイトカインCBAキット(Becton-Dickinson)でヒトサイトカインを測定した。
i) 混合ヒトTh1/Th2捕獲ビーズの調製
実験に必要なアッセイチューブの数を決定した。各捕獲ビーズ懸濁液を数秒間激しくボルテックス後、混合した。分析する各アッセイについて、各捕獲ビーズの10μlアリコートを“混合捕獲ビーズ”というラベルを貼った単一のチューブに添加した。このビーズ混合物を完全にボルテックスした。
ii) テストサンプルの調製
アッセイ希釈剤を用いて上清を希釈(1:4)した(20μlの上清+60μlのアッセイ希釈剤)。サンプル希釈物を混合してから、96ウェルマイクロタイタープレート円錐底(Nunc)にサンプルを移した。
iii) ヒトTh1/Th2サイトカインCBAアッセイ手順
50μlの希釈上清を96ウェルマイクロタイタープレート円錐底(Nunc)に添加した。50μlの混合捕獲ビーズを添加後、50μlのヒトTh1/Th2 PE検出試薬を加えた。プレートを、直接の露光から保護してRTで3時間インキュベートし、1500rpmで5分間遠心分離した。慎重に上清を捨てた。次工程では、各ウェルに200μlの洗浄緩衝液を2回添加し、1500rpmで5分間遠心分離し、慎重に上清を捨てた。その後、各ウェルに130μlの洗浄緩衝液を加えてビーズペレットを再懸濁させた。最終的にこれらサンプルをフローサイトメーター(Becton-Dickinson)で分析した。データは、CBAアプリケーションソフトウェア、Activity Base及びMicrosoft Excelソフトウェアを用いて分析した。
4.5:結果
図2、3及び4に示されるように、INSP052EC-6Hisは、該タンパク質の2つの異なるロットを用いて、ConA刺激したhPBMCからのサイトカイン(例えば、TNF-α、IL-4及びIL-2)の分泌を用量依存様式で下方制御することができた。この結果は、抗炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療におけるINSP052ECの潜在的な治療有効性を確信させる。
IC50、すなわち、観察された最大値の50%までサイトカインの分泌を減らすのに必要なINSP052EC-6Hisの濃度(pg/mLで計算)について、サイトカイン分泌に対する用量反応効果を計算することによって、さらに詳細な分析を行った。得られた阻害曲線(図5でIL-5及びIL-2について例示される)は、INSP052EC-6Hisがサイトカインアンタゴニストとして、特にサイトカインの分泌及び/又は発現のインヒビターとして、以下の濃度範囲で活性であることを実証している:TNF-α(IC50:6〜10μg/ml)、IFN-γ(IC50:3〜9μg/ml)、IL-2(IC50:12〜14μg/ml)、IL-4(IC50:14μg/ml)、IL-10(IC50:10〜15μg/ml)及びIL-5(IC50:18μg/ml)。
5.1:材料と方法:
製造業者の使用説明書に従ってMACS細胞単離キット(Miltenyl Biotec)を用い、白血球の亜集団を調製した。実施例4で述べたように、バフィーコートからhPBMCを単離した。単細胞懸濁液になるように注意を払った。CD4+T細胞の調製では、CD4+T細胞単離キットIIを用いた(カタログ番号130-091-155)。PBMCを数え、10分間遠心分離し、1ml当たり2.5×108個の細胞濃度で冷却PBS緩衝液(0.5%ウシ血清アルブミン、BSA及び2mM EDTAを補充したリン酸緩衝生理食塩水pH7.2)に再懸濁させた(107個の細胞当たり40μl緩衝液)。合計107個の細胞当たり10μlのビオチン-抗体カクテル(キットで供給される)を添加した。この懸濁液をよく混合して4〜8℃で10分間インキュベートした。107個の細胞当たり30μlの緩衝液を添加後、合計107個の細胞当たり20μlの抗ビオチンマイクロビーズを加えた。この懸濁液をよく混合して、さらに15分間4〜8℃でインキュベートした。標識化した体積の10〜20倍の緩衝液で細胞を洗滌し、300xgで10分間遠心分離した。上清を完全に除去し、緩衝液500μl中に細胞を108個まで再懸濁させた。自動MACSTM分離器で磁気分離を行った。自動MACSTM分離器は、製造業者の使用説明書に従って整備かつ準備した。磁気的に標識化した細胞を含有するチューブを自動MACSTM分離器に入れ、 “デリート(delete)”プログラムを選択した。ネガティブ画分を収集した(出口ポート“neg1”)。この画分は濃縮CD4+T細胞に相当する。必要に応じて、引き続きポジティブ画分を収集した(出口ポート“pos1”)。この画分は磁気的に標識された非CD4+T細胞に相当する。
hPBMCについて上述したとおりにスクリーニング及びCBAアッセイを行った。
5.2:結果
INSP052EC-6Hisによって導かれるhPBMCからのサイトカイン分泌の減少は、ConAで刺激後の精製CD4+T細胞でも観察された。サイトカインの分泌に及ぼす効果は、hPBMCで測定した効果と一致しており、サンプルに添加するタンパク質の量に比例し、かつ通常の抗炎症性化合物で観察される減少に匹敵していた(図6)。
6.1:序論
INSP052ECタンパク質(組換え型INSP052EC-6Hisで発現したもの)は、ConA刺激したヒト末梢血単核細胞(hPBMC;実施例4参照)による種々のサイトカイン分泌だけでなくCD4+T細胞(実施例5)でも種々のサイトカインの分泌を阻害することがin vitroで示されたので、エレクトロトランスファーによるin vivo ConAモデルでINSP052ECの活性をテストすることを決めた。
中毒性肝臓病は、未だ薬理学的治療が発見されるべき人類の世界的健康問題を代表する。例えば、肝硬変の原因となる進行中の慢性肝炎は、肝臓の実質細胞が活性化T細胞によって累進的に破壊される病理状態である。ConA誘導性肝臓中毒症は、マウスで説明されたT細胞依存性アポトーシス及び壊死性肝臓損傷の3つの実験モデルの1つである。抗CD3モノクローナルABを活性化することによって、又は超抗原SEBを用いて曝露されたGal N(D-ガラクトサミン)感作マウスは、重症のアポトーシス及び二次的な壊死性肝臓傷害を発生する(Kusters S, Gastroenterology. 1996 Aug;111(2):462-71)。T細胞ミトゲン植物レクチンConAの非感作マウスへの注射も肝臓のアポトーシスをもたらし、壊死に進行する。ConAは、TNF-α、INF-γ及び他の種々のサイトカインの全身的な放出を誘導する。TNF-αとINF-γは両方とも肝臓傷害の重大なメディエーターである。発作8時間後のトランスアミナーゼ放出は重篤な肝臓破壊を示している。
CD4 T細胞、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞といった幾つかの細胞型が肝臓損傷に関与することが示されている(Kaneko J Exp Med 2000, 191, 105-114)。抗CD4抗体はT細胞の活性化を遮断し、結果として肝臓損傷を妨げる(Tiegs et al. 1992, J Clin Invest 90, 196-203)。CD8に対するモノクローナル抗体を用いたマウスの前処理は保護に失敗したが、マクロファージの欠失は肝炎の誘導を阻止した。
INSP052EC、すなわちIgG様ドメインを含有するTNF-α/IL-4サイトカインアンタゴニストタンパク質のConA誘導性肝炎における役割を調査するため本研究を行った。いくつかのサイトカインが、ConA誘導性肝臓損傷の誘導に重要であり、又はConA誘導性肝臓損傷の保護に重要であることが分かった。例えば、TNF-αはConA注射後産生される最初のサイトカインの1つであり、抗TNF-α抗体は疾患に対する保護を与える(Seino et al. 2001, Annals of surgery 234, 681-688)。抗INF-γ抗血清は、ConA処理した動物の血中のトランスアミナーゼの濃度減少によって測定した場合、マウスを有意に保護するので、IFN-γも肝臓傷害の重大なメディエーターであると考えられる(上記Kusters et al.参照)。肝臓傷害では、自己免疫性肝炎又はウイルス肝炎の患者でINF-γ産生の増加が観察された。さらに、肝臓でINF-γを発現しているトランスジェニックマウスは、慢性の進行性肝炎に似た肝臓傷害を発生する(Toyonaga et al. 1994, PNAS 91, 614-618)。IFN-γはin vitroでマウス肝細胞の細胞死を誘導し、これがTNFαによって加速されるので、INF-γも肝細胞にとって細胞障害性であろう(Morita et al. 1995, Hepatology 21, 1585-1593)。
他の分子は、ConAモデルにおいて保護的であると記載されている。rhIL-6(組換えヒトインターロイキン6)の単回投与は、トランスアミナーゼの放出を完全に阻害した(Mizuhara et al. 1994, J. Exp. Med. 179, 1529-1537)。
非ウイルス性のin vivo遺伝子導入技術のうち、プラスミドDNAの筋肉への直接注入に続くエレクトロポレーションが簡単、安価かつ安全である。トランスフェクションされたDNAは常に染色体への組込みを受けるわけではないが、筋線維の有糸分裂後の性質及び長命がトランスフェクションされた遺伝子の安定した発現を可能にする(Somiari et al. 2000, Molecular Therapy 2,178-187)。血流への筋肉産生タンパク質の分泌が、対応するcDNAのエレクトロポレーション後に達成されることを実証した報告が幾つかある(Aihara H and Miyazaki J, 1998, Nature Biotech 16, 867-870)。さらに、疾患モデルにおける筋肉発現EPO及びIL-8BPのin vivo有効性が示されている(Rizzuto et al., 2000, Human Gene Therapy 41, 1891-1900; Mallat Z et al., 2001, Circulation Research 89, E41-45)。
6.4:材料と方法
6.4.1:動物
すべての研究で、オスのC57/BL6マウス(8週齢)を用いた。一般に、1実験群につき7匹の動物を使用する。マウスは、標準的条件で12時間の明暗サイクル下、照射食品と水を任意に与えて維持した。
6.4.2:筋肉エレクトロトランスファー
6.4.2.1:ベクターの選択
StrepIIタグ付きヒトIL6(hIL6-SII)遺伝子及びINSP052EC-6His遺伝子を別個のゲートウエイ適合性pDEST12.2ベクターでクローン化した。このベクターでは、タンパク質の発現はCMVプロモーターの制御下にある。
6.4.2.2:エレクトロポレーションプロトコル
マウスをガスで麻酔した(イソフルラン Baxter, Ref: ZDG962)。後肢の毛をそって超音波検査用ゲルを塗布した。ヒアルロニダーゼを後脛骨筋に(50μlの無菌NaCl 0.9%中20U, Sigma Ref. H3631)で注射した。10分後、100μgのプラスミド(1脚当たり50μg,25μlの無菌NaCl 0.9%中)を同じ筋肉に注射した。筋肉内注射前にPBS-L-グルタメート(6mg/ml;L-Glutamate Sigma P4761)緩衝液でDNAを調製した。エレクトロトランスファーのため、ElectroSquarePorator BTX ref ECM830で各脚に75ボルトの電場を施した(各パルスについて20ms間、1秒間隔で10パルス、単極法で2ラウンド電極(大きさ:直径0.5mm))。
6.4.3.1:ConAの静脈内注射及び血液サンプリング
8週齢のメスのマウスC57/Bl6をIFFA CREDOから購入した。ConA(Sigma ref.C7275)を18mg/kgで静脈内注射し、注射後1.30時間及び8時間に血液サンプルを採取した。屠殺時に、心臓から血液を採取した。
6.4.3.2:血液サンプル中のサイトカインとトランスアミナーゼの検出
TH1/TH2 CBAアッセイを用いてIL-2、IL-5、IL-4、TNF-α及びIFN-γのサイトカインレベルを測定した。炎症CBAアッセイを用いてTNF-α、IL-6、MCP1、IFN-α、IL-10及びIL-12を検出した。COBAS機器(Hitachi)を用いてトランスアミナーゼ(ALAT及びASAT)血液パラメータを決定した。
6.4.3.3:ヒトINSP052EC-6His及びhIL-6-SIIを発現するベクターのエレクトロトランスファー
0日目に、pDEST12.2.-INSP052EC、pDEST12.2-hIL-6、及び空ベクターのコントロールのエレクトロトランスファー(エレクトロトランスファーのプロトコルは上記参照)を行った。エレクトロトランスファー後、5日目にConA(18mg/kg)を静脈内注射し、2つの時点で血液をサンプリングした(1.30、8時間)。
6.4.3.4:ConAモデルにおけるINSP052及びIL-6タンパク質前処理
ConA注射の30分前に、CHO細胞産生組換えhIL-6又はHEK293細胞産生組換えINSP052-6Hisを皮下注射した。
6.5:結果
INSP052EC-6Hisタンパク質を発現したHEK293細胞が、用量依存様式でConA刺激したhPBMCのTNF-α及びIL-4分泌(他のサイトカインの中で特に)をin vitroで下方制御することは、先に示した(実施例4及び5;図2〜6参照)。この2つのサイトカインは、T細胞誘導性ConA誘導性肝炎で重大な役割を果たすので、このモデルでINSP052ECのcDNA及びタンパク質をテストした。
INSP052EC-6Hisは、エレクトロトランスファーを用いて該タンパク質の全身送達後、劇症肝炎を模倣するマウスモデルを肝臓傷害から保護する。図7は、INSP052EC-6Hisをエレクトロトランスファーした動物が、ConA曝露8時間後、空ベクターのコントロール動物に比べ、トランスアミナーゼレベルの減少を示すことを示している。さらに、これらの動物において、TNF-α及びIL-6の両サイトカインレベルが有意に減少する(図8)。この効果は、正のコントロールベクターpDEST12.2hIL-6-SIIで得られる結果と同様であり、又はなおさらに重要であることに留意されたい(図7及び8)。
ConAの注射前に精製組換えタンパク質を投与することによっても、INSP052EC-6Hisの保護効果をテストした。皮下注射した場合、INSP052ECタンパク質(1mg/kg、又は0.3mg/kg)は、ConA注射8時間後のASATレベル及びALATレベルを有意に低下させた(図9)。
我々の実験は、既に、INSP052ECがConA刺激hPBMCアッセイでTNF-α、IL-4及びIL-2のようなサイトカインの分泌及び/又は発現をin vitroで下方制御することを示した。さらに、劇症肝炎のin vivoモデルにINSP052ECのcDNAを送達すると、血清中のTNF-α及びm-IL-6レベルを下げ、血清中のトランスアミナーゼの減少に対して有意な効果があることをINSP052ECタンパク質の皮下注射で確認した。
ASATレベル及びALATレベルの減少は、TNF-αとIL-4の両レベルの減少に起因するだろう。TNF-α及びIL-4は、ConA注射後の肝臓損傷に関与する重要なサイトカインである。この肝炎のマウスモデルでは、TNF-αは、いわゆるクッパー細胞である肝マクロファージによって主として産生され、一方IL-4は肝臓(ナチュラルキラーT)NKT細胞によって産生される。抗TNF-α抗体は疾患に対する保護を与え(Seino et al. 2001, Annals of surgery 234, 681-688)、またNKT細胞によるIL-4産生の阻害は、マウスのT細胞媒介肝炎において肝保護的であることが分かった(Ajuebor et al. 2003 J. Immunology 170, 5252-9)。
INSP052ECは、自己免疫性、ウイルス性又は急性肝臓疾患のみならずアルコール性肝不全にも有用であろう。またINSP052ECは、他の炎症性疾患でも有効だろう。
7.1:序論
マウスのLPS誘導性TNFα及びIL-6放出モデルに、組換えタンパク質か、又は一時的にトランスフェクションされINSP052EC-6Hisを発現しているカプセル化されたHEK293細胞のいずれかを注射することによって、サイトカインのin vivo放出の影響から保護するINSP052ECの能力もテストした。
組換えタンパク質を発現している細胞のカプセル化は、例えば腫瘍抑制機能を有するタンパク質で示されるように(Visted T et al., 2003, Hum Gene Ther., 14, 1429-40)、該タンパク質のin vivo連続的投与の治療効果の可能性を理解できるようにする。
LPS(リポ多糖類)は、グラム陰性菌の外膜の重要成分であり、かつそのCD14及びTollレセプター4への結合を介してマクロファージ又はミクログリア細胞による健全な炎症反応につながる生得的認識の最もよく特徴づけされた例である(Lehnardt S et al., 2002, J Neurosci., 22, 2478-2486)。LPSは、特に肝臓疾患に関連して、マクロファージ、ミクログリア細胞及び内皮細胞に似ている種々の細胞型を活性化するために文献で広く利用されている(Jirillo E et al., 2002, J Endotoxin Res., 8, 319-327)。
7.2.1:一時的にトランスフェクションされ、INSP052EC-6Hisを発現しているHEK293細胞のカプセル化
7.2.1.1:細胞の維持
エプスタイン-バーウイルス核抗原(HEK293-EBNA, Invitrogen)を発現しているヒト胎児腎臓293細胞を、撹拌フラスコ(Techne, UK)内で、4mM L-グルタミン(Invitrogen)及び1ml/Lのフェノール-レッド溶液(水中0.5%w/v,フェノールレッド:Sigma, USA)を補充したEx-cell VPRO 無血清培地(維持培地, JRH, UK)中の懸濁液で維持した。
7.2.1.2:細胞のトランスフェクション
トランスフェクション当日、細胞を遠心分離して撹拌容器(DasGip, D)内、1% FBS及び4ml/l ITS-X補充物を含む250mLのDMEM/F12(1:1)培地(接種培地,すべてInvitrogen)中1×106細胞/mlの密度で再懸濁させた。PEI法を用いて、2:1の比のPEI:DNAで細胞へトランスフェクションした。100mLの接種培地中、対応するプラスミド(pDEST12.2-INSP052EC) 500μgを1mgのPEI(Polysciences, USA)と混合し、室温で10分間インキュベートした。この混合物を細胞懸濁液に加え、37℃で90分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞懸濁液を遠心分離し(200xg,4℃で10分)、細胞ペレットを500mlの維持培地内で再懸濁させた。カプセル化されるまで37℃にて5% CO2の湿潤雰囲気内で細胞をインキュベートした。
Inotech研究所カプセル化機(Inotech, CH)でpDEST12.2-INSP052ECでトランスフェクションしたHEK293EBNA細胞又は非トランスフェクション細胞(コントロール細胞)をアルギナート-ポリ-L-リジン-アルギナート(APA)カプセルに封入した。細胞を遠心分離し(200xg, 4℃で10分)、2mlの洗浄緩衝液に再懸濁させた(全化学薬品はInotech, CH)。この懸濁液に1.5%のアルギナート溶液をゆっくり加えて最終濃度2.5×10e6細胞/mlの溶液を得た。カプセル化機に接続された注射器(Braun Omnifit, Braun, D)にアルギナート-細胞懸濁液を詰めた。
以下のパラメータを用いてカプセル化を行った。
−注射器ポンプ:275(50ml注射器)又は456(20ml注射器)
−アノード電圧:1.16kV
−振動数:1943Hz
−振幅:3
カプセル化のプロトコルは以下のとおり:
−重合緩衝液:10分(体積250ml)
−ポリ-L-リジン:10分(体積150ml)
−洗浄緩衝液:1分(体積150ml)
−洗浄緩衝液:5分(体積150ml)
−0.03%アルギナート:5分(体積150ml)
−洗浄緩衝液:1分(体積150ml)
−解重合緩衝液:10分(体積300ml)
−洗浄緩衝液:1分(体積150ml)
−洗浄緩衝液:5分(体積150ml)
培地(Excell-V-Pro):体積100ml
製造業者マニュアルに従い、無菌条件下で無菌蒸留水で全緩衝液を調製した。カプセル化の最終工程でカプセルを100mlの維持培地に再懸濁させ、無菌撹拌容器(Dasgip, D)に移した。カプセルを5% CO2の湿潤雰囲気内37℃にて、一晩又は動物に注入されるまでインキュベートした。
WO98/38179に従ってマウスのLPS誘導性TNF-α及びIL-6放出のモデルを作った。要約すると、オスのC57/BL6又はC3H/HeNマウス(8週齢;Charles River, France)を用いた。一般に、1実験群につき10匹の動物を使用する。12時間の明暗サイクル下、照射食品と水を適宜与えて標準的条件でマウスを維持した。
LPS(O111:B4(Sigma, Switzerland),0.3mg/kg)をマウスに皮下注射した。90分後、血液を採取し、ELISAキット(R&D)で血漿TNFαを定量した。150分後、市販のELISAキット(R&D Duoset ref. DY206)でIL-6レベルを測定した。標準化合物であるデキサメタゾンをPBSに可溶化し、LPSの15分前にデキサメタゾン(0.1mg/kg,皮下)を注射した。
HEK293細胞(コントロール細胞又は一時的にINSP052EC-6Hisを発現する細胞)を含有するマイクロカプセルを含む懸濁液をインキュベーターから取り出して層流フードに置いてカプセルを沈降させた。清澄な上清を除去し、濃縮カプセルを慎重に注射器に取った。1匹のマウスにつき700μlのカプセルを0.7mm針(ref 53158.01 Polylabo, CH)でゆっくり腹腔内注射した。カプセルの注射3日後、LPS注射を行った。
7.3:結果
INSP052EC投与の両モデルにおいて、INSP052ECが血中でのLPS誘導性のTNFα又はIL-6放出を下方制御する可能性を実証した。
LPS注射15分前のINSP052EC-6Hisの注射は、標準化合物デキサメタゾンと同様、統計的に有意な様式で、IL-6(INSP052EC-6Hisを少なくとも0.1mg/kgで投与した場合)及びTNFα(INSP052EC-6Hisを少なくとも1mg/kgで投与した場合)のLPS誘導性放出を減らす。注射用ビヒクル溶液(PBS-BSAと0.02%グリセロール)を注射したマウスを負のコントロールとして用いた(図10)。
一時的にINSP052EC-6Hisを発現するHEK293細胞を注射した場合、すべてのテストしたカプセル体積において、同様の正の効果が観察された(図11)。
8.1:序論
炎症性皮膚疾患のマウスモデルであるハプテン誘導性接触過敏症(CHS)についてINSP052ECをテストした。CHSは皮膚のT細胞媒介炎症モデルであり、過剰なサイトカインの産生に関連する医療ニーズが満たされていない皮膚科学の問題であるアレルギー性接触皮膚炎や乾癬のような疾患に付随する同様の炎症についてよく確立されたモデルに相当する(Nakae S et al., 2003, Int Immunol., 15: 251-260; Gorbachev AV and Fairchild RL, 2001, Crit Rev Immunol., 21: 451-72)。
8.2:材料と方法
使用直前にハプテンDNFB(2,4-ジニトロフルオロベンゼン;Sigma Chemical Co.)をアセトン/オリーブ油(4:1)に希釈した。毛をそった背側皮膚に30μlの0.5% DNFB溶液を塗布することによってマウスを感作し、或いは未処理のままとした。5日後マウスを誘導試験した。すなわち、右耳の両側に10μlという非刺激的用量の0.2% DNFBを適用してCHSを誘導し、左耳には同量の溶媒のみを適用した。6日目に、カリパス(Mitutoya)で耳の厚さをモニターした。
耳腫脹を下記式のように計算した:
((T6-T5)右耳)−((T6-T5)左耳)
式中、T6及びT5は、それぞれ感作誘導後、6日目及び5日目の耳厚の値を表す。観察される腫脹が、非特異的刺激ではなくDNFB特異的炎症に起因することを保証するため、未感作であるが誘導したマウス群を各実験に含めた。
5日目に、指定量のINSP052EC-6His、デキサメタゾン(1mg/kg)、又はPBSのみ(コントロール群)をマウスに皮下注射した。
我々は、INSP052ECが有意かつ用量依存様式で耳腫脹を減少させることを示し、これは白血球浸潤、引き続く炎症の減少を示唆している(図12)。このことは、アレルギー性接触皮膚炎及び乾癬のような皮膚のT細胞媒介炎症の治療にINSP052ECが有用であり得ることを実証している。
これら実施例は、INSP052(INSP052EC)の単離された細胞外ドメインが、(そのまま又は変種として又はこのタンパク質配列を含む融合タンパク質若しくは完全長タンパク質として)サイトカイン活性を調節するため、特にサイトカインの分泌及び/又は発現のアンタゴニストとして使用でき、かつ生得的免疫反応及び適応免疫反応の両方に直接又は間接的に関連する疾患において治療的役割を有し得ることを明白に示している。
種々の細胞をベースとするアッセイ及び動物モデルでテストした、INSP052ECをベースとする分子によって示される活性を阻害する範囲は、この分子を用いてサイトカインの過剰な産生又は不適切に局所化した産生に起因するサイトカインの病態生理学的効果を遮断できることを確信させる。INSP052ECをベースとする分子によって、炎症誘導性サイトカインの持続的な産生に付随する細胞事象の制御が得られるので、特に種々の組織及び器官(例えば、肝臓、皮膚、肺、中枢神経系)に影響を及ぼす自己免疫疾患及び炎症性疾患に関連する異常な炎症状態に拮抗するためにINSP052ECをベースとする分子を使用することができ、腫瘍学的、神経学的、心臓血管系及び感染性の障害のための新規な治療機会を提供する。他の病気に罹っている患者から得たサンプル中のサイトカインの過剰な発現及び/又は分泌を示すサイトカインアッセイを利用し(Wong CK and Lam CW, Adv Clin Chem. 2003, 37:1-46; Whiteside TL, Biotechniques, 2002, Oct. Suppl:4-8, 10, 12-5)、次いで、INSP052ECをベースとする分子のサイトカインアンタゴニストとしての治療的使用が正当であることを証明することによって、INSP052ECをベースとする分子のさらなる臨床用途を特定することができる。
注釈:エクソン-エクソン接合部にコードされているアミノ酸については、より5’側のエクソンに割り当てられる。
配列番号1:(INSP052エクソン1のヌクレオチド配列)
1 ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCCAGA GCCTCCAGGG CCCTGCGCCT TGCTCCTTTT
61 GTCTACCTTC TTCTGATCCA GACAG
配列番号2: (INSP052エクソン1のポリペプチド配列)
1 MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTD
配列番号3: (INSP052エクソン2のヌクレオチド配列)
1 ACCCCCTGGA GGGGGTGAAC ATCACCAGCC CCGTGCGCCT GATCCATGGC ACCGTGGGGA
61 AGTCGGCTCT GCTTTCTGTG CAGTACAGCA GTACCAGCAG CGACAGGCCT GTAGTGAAGT
121 GGCAGCTGAA GCGGGACAAG CCAGTGACCG TGGTGCAGTC CATTGGCACA GAGGTCATCG
181 GCACCCTGCG GCCTGACTAT CGAGACCGTA TCCGACTCTT TGAAAATGGC TCCCTGCTTC
241 TCAGCGACCT GCAGCTGGCC GATGAGGGCA CCTATGAGGT CGAGATCTCC ATCACCGACG
301 ACACCTTCAC TGGGGAGAAG ACCATCAACC TTACTGTAGA TG
配列番号4: (INSP052エクソン2のポリペプチド配列)
1 PLEGVNITSP VRLIHGTVGK SALLSVQYSS TSSDRPVVKW QLKRDKPVTV VQSIGTEVIG
61 TLRPDYRDRI RLFENGSLLL SDLQLADEGT YEVEISITDD TFTGEKTINL TVDV
1 TGCCCATTTC GAGGCCACAG GTGTTGGTGG CTTCAACCAC TGTGCTGGAG CTCAGCGAGG
61 CCTTCACCTT GAACTGCTCA CATGAGAATG GCACCAAGCC CAGCTACACC TGGCTGAAGG
121 ATGGCAAGCC CCTCCTCAAT GACTCGAGAA TGCTCCTGTC CCCCGACCAA AAGGTGCTCA
181 CCATCACCCG CGTGCTCATG GAGGATGACG ACCTGTACAG CTGCATGGTG GAGAACCCCA
241 TCAGCCAGGG CCGCAGCCTG CCTGTCAAGA TCACCGTATA CA
配列番号6: (INSP052エクソン3のポリペプチド配列)
1 PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT
61 ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI TVYR
配列番号7: (INSP052エクソン4のヌクレオチド配列)
1 GAAGAAGCTC CCTTTACATC ATCTTGTCTA CAGGAGGCAT CTTCCTCCTT GTGACCTTGG
61 TGACAGTCTG TGCCTGCTGG AAACCCTCCA AAAG
配列番号8: (INSP052エクソン4のポリペプチド配列)
1 RSSLYIILST GGIFLLVTLV TVCACWKPSK R
1 GAAACAGAAG AAGCTAGAAA AGCAAAACTC CCTGGAATAC ATGGATCAGA ATGATGACCG
61 CCTGAAACCA GAAG
配列番号10: (INSP052エクソン5のポリペプチド配列)
1 KQKKLEKQNS LEYMDQNDDR LKPEA
配列番号11: (INSP052エクソン6のヌクレオチド配列)
1 CAGACACCCT CCCTCGAAGT GGTGAGCAGG AACGGAAGAA CCCCATGGCA CTCTATATCC
61 TGAAGGACAA G
配列番号12: (INSP052エクソン6のポリペプチド配列)
1 DTLPRSGEQE RKNPMALYIL KDK
1 GACTCCCCGG AGACCGAGGA GAACCCGGCC CCGGAGCCTC GAAGCGCGAC GGAGCCCGGC
61 CCGCCCGGCT ACTCCGTGTC TCCCGCCGTG CCCGGCCGCT CGCCGGGGCT GCCCATCCGC
121 TCTGCCCGCC GCTACCCGCG CTCCCCAGCG CGCTCCCCAG CCACCGGCCG GACACACTCG
181 TCGCCGCCCA GGGCCCCGAG CTCGCCCGGC CGCTCGCGCA GCGCCTCGCG CACACTGCGG
241 ACTGCGGGCG TGCACATAAT CCGCGAGCAA GACGAGGCCG GCCCGGTGGA GATCAGCGCC
301 TGA
配列番号14: (INSP052エクソン7のポリペプチド配列)
1 DSPETEENPA PEPRSATEPG PPGYSVSPAV PGRSPGLPIR SARRYPRSPA RSPATGRTHS
61 SPPRAPSSPG RSRSASRTLR TAGVHIIREQ DEAGPVEISA
配列番号15 (INSP052エクソン1,2,3,4,5,6及び7の複合ヌクレオチド配列)
1 ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCCAGA GCCTCCAGGG CCCTGCGCCT TGCTCCTTTT
61 GTCTACCTTC TTCTGATCCA GACAGACCCC CTGGAGGGGG TGAACATCAC CAGCCCCGTG
121 CGCCTGATCC ATGGCACCGT GGGGAAGTCG GCTCTGCTTT CTGTGCAGTA CAGCAGTACC
181 AGCAGCGACA GGCCTGTAGT GAAGTGGCAG CTGAAGCGGG ACAAGCCAGT GACCGTGGTG
241 CAGTCCATTG GCACAGAGGT CATCGGCACC CTGCGGCCTG ACTATCGAGA CCGTATCCGA
301 CTCTTTGAAA ATGGCTCCCT GCTTCTCAGC GACCTGCAGC TGGCCGATGA GGGCACCTAT
361 GAGGTCGAGA TCTCCATCAC CGACGACACC TTCACTGGGG AGAAGACCAT CAACCTTACT
421 GTAGATGTGC CCATTTCGAG GCCACAGGTG TTGGTGGCTT CAACCACTGT GCTGGAGCTC
481 AGCGAGGCCT TCACCTTGAA CTGCTCACAT GAGAATGGCA CCAAGCCCAG CTACACCTGG
541 CTGAAGGATG GCAAGCCCCT CCTCAATGAC TCGAGAATGC TCCTGTCCCC CGACCAAAAG
601 GTGCTCACCA TCACCCGCGT GCTCATGGAG GATGACGACC TGTACAGCTG CATGGTGGAG
661 AACCCCATCA GCCAGGGCCG CAGCCTGCCT GTCAAGATCA CCGTATACAG AAGAAGCTCC
721 CTTTACATCA TCTTGTCTAC AGGAGGCATC TTCCTCCTTG TGACCTTGGT GACAGTCTGT
781 GCCTGCTGGA AACCCTCCAA AAGGAAACAG AAGAAGCTAG AAAAGCAAAA CTCCCTGGAA
841 TACATGGATC AGAATGATGA CCGCCTGAAA CCAGAAGCAG ACACCCTCCC TCGAAGTGGT
901 GAGCAGGAAC GGAAGAACCC CATGGCACTC TATATCCTGA AGGACAAGGA CTCCCCGGAG
961 ACCGAGGAGA ACCCGGCCCC GGAGCCTCGA AGCGCGACGG AGCCCGGCCC GCCCGGCTAC
1021 TCCGTGTCTC CCGCCGTGCC CGGCCGCTCG CCGGGGCTGC CCATCCGCTC TGCCCGCCGC
1081 TACCCGCGCT CCCCAGCGCG CTCCCCAGCC ACCGGCCGGA CACACTCGTC GCCGCCCAGG
1141 GCCCCGAGCT CGCCCGGCCG CTCGCGCAGC GCCTCGCGCA CACTGCGGAC TGCGGGCGTG
1201 CACATAATCC GCGAGCAAGA CGAGGCCGGC CCGGTGGAGA TCAGCGCCTG A
配列番号16 (INSP052エクソン1,2,3,4,5,6及び7の複合ポリペプチド配列)
1 MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS ALLSVQYSST
61 SSDRPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR LFENGSLLLS DLQLADEGTY
121 EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW
181 LKDGKPLLND SRMLLSPDQK VLTITRVLME DDDLYSCMVE NPISQGRSLP VKITVYRRSS
241 LYIILSTGGI FLLVTLVTVC ACWKPSKRKQ KKLEKQNSLE YMDQNDDRLK PEADTLPRSG
301 EQERKNPMAL YILKDKDSPE TEENPAPEPR SATEPGPPGY SVSPAVPGRS PGLPIRSARR
361 YPRSPARSPA TGRTHSSPPR APSSPGRSRS ASRTLRTAGV HIIREQDEAG PVEISA
1 ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCAAGA GCCTCCAGGG CTCTGCGCCT CTCTCCTTTT
61 GTCTACCTGC TTCTCATCCA GCCAGTCCCC CTGGAGGGGG TGAACATCAC CAGCCCAGTA
121 CGTCTGATCC ACGGCACAGT GGGGAAGTCG GCCCTGCTTT CCGTGCAGTA CAGTAGCACC
181 AGCAGCGACA AGCCCGTGGT GAAGTGGCAG CTGAAGCGTG ACAAGCCAGT GACCGTGGTG
241 CAGTCTATAG GCACAGAGGT CATTGGCACT CTGCGGCCTG ACTATCGAGA CCGTATCCGG
301 CTCTTTGAAA ATGGCTCCTT GCTTCTCAGC GACCTGCAGC TGGCGGATGA GGGAACCTAT
361 GAAGTGGAGA TTTCCATCAC TGACGACACC TTCACCGGGG AGAAGACCAT CAACCTCACC
421 GTGGATGTGC CCATTTCAAG GCCGCAGGTA TTAGTGGCTT CAACCACTGT GCTGGAGCTC
481 AGTGAGGCCT TCACCCTCAA CTGCTCCCAT GAGAATGGCA CCAAGCCTAG CTACACGTGG
541 CTGAAGGATG GCAAACCCCT CCTCAATGAC TCCCGAATGC TCCTGTCCCC TGACCAAAAG
601 GTGCTCACCA TCACCCGAGT ACTCATGGAA GATGACGACC TGTACAGCTG TGTGGTGGAG
661 AACCCCATCA GCCAGGTCCG CAGCCTGCCT GTCAAGATCA CTGTGTATAG AAGAAGCTCC
721 CTCTATATCA TCTTGTCTAC AGGAGGCATC TTCCTCCTTG TGACCCTGGT GACAGTTTGT
781 GCCTGCTGGA AACCCTCAAA AAAGTCTAGG AAGAAGAGGA AGTTGGAGAA GCAAAACTCC
841 TTGGAATACA TGGATCAGAA TGATGACCGC CTAAAATCAG AAGCAGATAC CCTACCCCGA
901 AGTGGAGAAC AGGAGCGGAA GAACCCAATG GCACTCTATA TCCTGAAGGA TAAGGATTCC
961 TCAGAGCCAG ATGAAAACCC TGCTACAGAG CCACGGAGCA CCACAGAACC CGGTCCCCCT
1021 GGCTACTCCG TGTCGCCGCC CGTGCCCGGC CGCTCTCCGG GGCTTCCCAT CCGCTCAGCC
1081 CGCCGCTACC CGCGCTCCCC AGCACGTTCC CCTGCCACTG GCCGGACGCA CACGTCGCCA
1141 CCGCGGGCCC CGAGCTCGCC AGGCCGCTCG CGCAGCTCTT CGCGCTCACT GCGGACTGCA
1201 GGCGTGCAGA GAATCCGGGA GCAGGACGAG TCAGGGCAGG TGGAGATCAG TGCCTGA
配列番号18 (INSP055マウス予測タンパク質)
1 MKRERGALSR ASRALRLSPF VYLLLIQPVP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS ALLSVQYSST
61 SSDKPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR LFENGSLLLS DLQLADEGTY
121 EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW
181 LKDGKPLLND SRMLLSPDQK VLTITRVLME DDDLYSCVVE NPISQVRSLP VKITVYRRSS
241 LYIILSTGGI FLLVTLVTVC ACWKPSKKSR KKRKLEKQNS LEYMDQNDDR LKSEADTLPR
301 SGEQERKNPM ALYILKDKDS SEPDENPATE PRSTTEPGPP GYSVSPPVPG RSPGLPIRSA
361 RRYPRSPARS PATGRTHTSP PRAPSSPGRS RSSSRSLRTA GVQRIREQDE SGQVEISA
1 ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCCAGA GCCTCCAGGG CCCTGCGCCT TGCTCCTTTT
61 GTCTACCTTC TTCTGATCCA GACAGACCCC CTGGAGGGGG TGAACATCAC CAGCCCCGTG
121 CGCCTGATCC ATGGCACCGT GGGGAAGTCG GCTCTGCTTT CTGTGCAGTA CAGCAGTACC
181 AGCAGCGACA GGCCTGTAGT GAAGTGGCAG CTGAAGCGGG ACAAGCCAGT GACCGTGGTG
241 CAGTCCATTG GCACAGAGGT CATCGGCACC CTGCGGCCTG ACTATCGAGA CCGTATCCGA
301 CTCTTTGAAA ATGGCTCCCT GCTTCTCAGC GACCTGCAGC TGGCCGATGA GGGCACCTAT
361 GAGGTCGAGA TCTCCATCAC CGACGACACC TTCACTGGGG AGAAGACCAT CAACCTTACT
421 GTAGATGTGC CCATTTCGAG GCCACAGGTG TTGGTGGCTT CAACCACTGT GCTGGAGCTC
481 AGCGAGGCCT TCACCTTGAA CTGCTCACAT GAGAATGGCA CCAAGCCCAG CTACACCTGG
541 CTGAAGGATG GCAAGCCCCT CCTCAATGAC TCGAGAATGC TCCTGTCCCC CGACCAAAAG
601 GTGCTCACCA TCACCCGCGT GCTCATGGAG GATGACGACC TGTACAGCTG CATGGTGGAG
661 AACCCCATCA GCCAGGGCCG CAGCCTGCCT GTCAAGATCA CCGTATACAG AAGAAGCTCC
配列番号20 (INSP052細胞外ドメイン)
1 MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS ALLSVQYSST
61 SSDRPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR LFENGSLLLS DLQLADEGTY
121 EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW
181 LKDGKPLLND SRMLLSPDQK VLTITRVLME DDDLYSCMVE NPISQGRSLP VKITVYRRSS
1 GTGAACATCA CCAGCCCCGT GCGCCTGATC CATGGCACCG TGGGGAAGTC
51 GGCTCTGCTT TCTGTGCAGT ACAGCAGTAC CAGCAGCGAC AGGCCTGTAG
101 TGAAGTGGCA GCTGAAGCGG GACAAGCCAG TGACCGTGGT GCAGTCCATT
151 GGCACAGAGG TCATCGGCAC CCTGCGGCCT GACTATCGAG ACCGTATCCG
201 ACTCTTTGAA AATGGCTCCC TGCTTCTCAG CGACCTGCAG CTGGCCGATG
251 AGGGCACCTA TGAGGTCGAG ATCTCCATCA CCGACGACAC CTTCACTGGG
301 GAGAAGACCA TCAACCTTAC TGTAGATGTG CCCATTTCGA GGCCACAGGT
351 GTTGGTGGCT TCAACCACTG TGCTGGAGCT CAGCGAGGCC TTCACCTTGA
401 ACTGCTCACA TGAGAATGGC ACCAAGCCCA GCTACACCTG GCTGAAGGAT
451 GGCAAGCCCC TCCTCAATGA CTCGAGAATG CTCCTGTCCC CCGACCAAAA
501 GGTGCTCACC ATCACCCGCG TGCTCATGGA GGATGACGAC CTGTACAGCT
551 GCATGGTGGA GAACCCCATC AGCCAGGGCC GCAGCCTGCC TGTCAAGATC
601 ACCGTATACA GAAGAAGCTC C
配列番号22 (成熟INSP052細胞外ドメイン)
1 VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI
51 GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG
101 EKTINLTVDV PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD
151 GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI
201 TVYRRSS
1 GTGAACATCA CCAGCCCCGT GCGCCTGATC CATGGCACCG TGGGGAAGTC
51 GGCTCTGCTT TCTGTGCAGT ACAGCAGTAC CAGCAGCGAC AGGCCTGTAG
101 TGAAGTGGCA GCTGAAGCGG GACAAGCCAG TGACCGTGGT GCAGTCCATT
151 GGCACAGAGG TCATCGGCAC CCTGCGGCCT GACTATCGAG ACCGTATCCG
201 ACTCTTTGAA AATGGCTCCC TGCTTCTCAG CGACCTGCAG CTGGCCGATG
251 AGGGCACCTA TGAGGTCGAG ATCTCCATCA CCGACGACAC CTTCACTGGG
301 GAGAAGACCA TCAACCTTAC TGTAGATG
配列番号24: (成熟INSP052エクソン2のタンパク質配列)
1 VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI
51 GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG
101 EKTINLTVDV
1 GTGAACATCA CCAGCCCCGT GCGCCTGATC CATGGCACCG TGGGGAAGTC
51 GGCTCTGCTT TCTGTGCAGT ACAGCAGTAC CAGCAGCGAC AGGCCTGTAG
101 TGAAGTGGCA GCTGAAGCGG GACAAGCCAG TGACCGTGGT GCAGTCCATT
151 GGCACAGAGG TCATCGGCAC CCTGCGGCCT GACTATCGAG ACCGTATCCG
201 ACTCTTTGAA AATGGCTCCC TGCTTCTCAG CGACCTGCAG CTGGCCGATG
251 AGGGCACCTA TGAGGTCGAG ATCTCCATCA CCGACGACAC CTTCACTGGG
301 GAGAAGACCA TCAACCTTAC TGTAGATGTG CCCATTTCGA GGCCACAGGT
351 GTTGGTGGCT TCAACCACTG TGCTGGAGCT CAGCGAGGCC TTCACCTTGA
401 ACTGCTCACA TGAGAATGGC ACCAAGCCCA GCTACACCTG GCTGAAGGAT
451 GGCAAGCCCC TCCTCAATGA CTCGAGAATG CTCCTGTCCC CCGACCAAAA
501 GGTGCTCACC ATCACCCGCG TGCTCATGGA GGATGACGAC CTGTACAGCT
551 GCATGGTGGA GAACCCCATC AGCCAGGGCC GCAGCCTGCC TGTCAAGATC
601 ACCGTATACA GAAGAAGCTC CCTTTACATC ATCTTGTCTA CAGGAGGCAT
651 CTTCCTCCTT GTGACCTTGG TGACAGTCTG TGCCTGCTGG AAACCCTCCA
701 AAAGGAAACA GAAGAAGCTA GAAAAGCAAA ACTCCCTGGA ATACATGGAT
751 CAGAATGATG ACCGCCTGAA ACCAGAAGCA GACACCCTCC CTCGAAGTGG
801 TGAGCAGGAA CGGAAGAACC CCATGGCACT CTATATCCTG AAGGACAAGG
851 ACTCCCCGGA GACCGAGGAG AACCCGGCCC CGGAGCCTCG AAGCGCGACG
901 GAGCCCGGCC CGCCCGGCTA CTCCGTGTCT CCCGCCGTGC CCGGCCGCTC
951 GCCGGGGCTG CCCATCCGCT CTGCCCGCCG CTACCCGCGC TCCCCAGCGC
1001 GCTCCCCAGC CACCGGCCGG ACACACTCGT CGCCGCCCAG GGCCCCGAGC
1051 TCGCCCGGCC GCTCGCGCAG CGCCTCGCGC ACACTGCGGA CTGCGGGCGT
1101 GCACATAATC CGCGAGCAAG ACGAGGCCGG CCCGGTGGAG ATCAGCGCCT
1151 GA
配列番号26 (INSP052成熟ポリペプチド配列)
1 VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI
51 GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG
101 EKTINLTVDV PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD
151 GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI
201 TVYRRSSLYI ILSTGGIFLL VTLVTVCACW KPSKRKQKKL EKQNSLEYMD
251 QNDDRLKPEA DTLPRSGEQE RKNPMALYIL KDKDSPETEE NPAPEPRSAT
301 EPGPPGYSVS PAVPGRSPGL PIRSARRYPR SPARSPATGR THSSPPRAPS
351 SPGRSRSASR TLRTAGVHII REQDEAGPVE ISA
1 MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS
51 ALLSVQYSST SSDRPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR
101 LFENGSLLLS DLQLADEGTY EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV
151 LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW LKDGKPLLND SRMLLSPDQK
201 VLTITRVLME DDDLDSCVVE NPINQGRTLP CKITVYKKSS LSSIWLQEAF
251 SSLGPW
配列番号28 (SEQIDNO 434)
1 MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS
51 ALLSVQYSST SSDRPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR
101 LFENGSLLLS DLQLADEGTY EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV
151 LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW LKDGKPLLND SRMLLSPDQK
201 VLTITRVLME DDDLDSCVVE NPINQGRTLP CKITVYKKSS FYIICLKEAS
251 SSFGPW
1 VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI
51 GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG
101 EKTINLTVDV PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD
151 GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI
201 TVYRRSSHHH HHH
配列番号30 (成熟INSP052細胞外ドメインのFc融合体)
1 VNITSPVRLI HGTVGKSALL SVQYSSTSSD RPVVKWQLKR DKPVTVVQSI
51 GTEVIGTLRP DYRDRIRLFE NGSLLLSDLQ LADEGTYEVE ISITDDTFTG
101 EKTINLTVDV PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD
151 GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI
201 TVYRRSSEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE
251 VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV
301 LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM
351 TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS
401 KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
配列番号31 (INSP052Ig2)
1 VRLIHGTVGK SALLSVQYSS TSSDRPVVKW QLKRDKPVTV VQSIGTEVIG
51 TLRPDYRDRI RLFENGSLLL SDLQLADEGT YEVEISITDD TFTGEKTINL
101 TVDVPISRPQ VLVASTTVLE LSEAFTLNCS HENGTKPSYT WLKDGKPLLN
151 DSRMLLSPDQ KVLTITRVLM EDDDLYSCMV ENPISQ
Claims (29)
- 以下の2つの配列(a)及び(b)を含むか、又は前記2つの配列(a)及び(b)からなる、ポリペプチドであって、
(a)は、以下の(i)〜(iii)のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列:
(i) 配列番号20若しくは配列番号22で示されるアミノ酸配列;
(ii) (i)のポリペプチドの活性を有する(i)のフラグメント;又は
(iii) (i) 若しくは(ii)の機能的等価物;かつ
(b)は、シグナル配列、精製タグ、膜結合型タンパク質の細胞外ドメイン、分泌タンパク質、開始メチオニン、エンドペプチダーゼ認識部位を含有するリンカー領域、及び免疫グロブリン由来Fc領域からなる群より選択される異種アミノ酸配列である、前記ポリペプチド。 - 配列番号20、配列番号22、配列番号27又は配列番号28で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載のポリペプチド。
- 配列番号20又は配列番号22で示されるアミノ酸配列に相同的であり、かつサイトカインの発現及び/又は分泌のアンタゴニストとしての活性を有することを特徴とする、請求項1記載の機能的等価物であるポリペプチド。
- 配列番号29若しくは配列番号30のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号29若しくは配列番号30のアミノ酸配列からなる、請求項3記載のポリペプチド。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする精製核酸分子。
- 配列番号19若しくは配列番号21で示される核酸配列を含むか、又は配列番号19若しくは配列番号21で示される核酸配列の余剰的等価物若しくはフラグメントである、請求項5記載の精製核酸分子。
- 高ストリンジェンシー条件下で、請求項5又は6記載の核酸分子とハイブリダイズする、精製核酸分子。
- 請求項5〜7のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項8記載のベクターで形質転換されている、宿主細胞。
- 疾患の治療又は診断に使用するための、配列番号20又は配列番号22で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 疾患の治療又は診断に使用するための、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項5〜7のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項8記載のベクター、又は請求項9記載の宿主細胞。
- 配列番号20又は配列番号22で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドの、サイトカインの発現及び/又は分泌のアンタゴニストとしての使用。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項5〜7のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項8記載のベクター又は請求項9記載の宿主細胞の、サイトカインの発現及び/又は分泌のアンタゴニストとしての使用。
- 配列番号20又は配列番号22で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含んでなる、医薬組成物。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項5〜7のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項8記載のベクター又は請求項9記載の宿主細胞を含んでなる、医薬組成物。
- サイトカインアンタゴニスト又は抗炎症薬である追加の治療薬をさらに含む、請求項15記載の医薬組成物。
- 配列番号20又は配列番号22で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドの、アルコール性肝不全、皮膚疾患若しくは炎症性疾患を含む自己免疫疾患、ウイルス性肝臓疾患又は急性肝臓疾患の治療用薬物の製造での使用。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項5〜7のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項8記載のベクター、又は請求項9記載の宿主細胞の、アルコール性肝不全、皮膚疾患若しくは炎症性疾患を含む自己免疫疾患、ウイルス性肝臓疾患又は急性肝臓疾患の治療用薬物の製造での使用。
- (i)配列番号20又は配列番号22で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び(ii)サイトカインアンタゴニスト又は抗炎症薬の、アルコール性肝不全、皮膚疾患若しくは炎症性疾患を含む自己免疫疾患、ウイルス性肝臓疾患又は急性肝臓疾患の治療用薬物の製造での使用。
- 配列番号20又は配列番号22で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドの、アルコール性肝不全、皮膚疾患若しくは炎症性疾患を含む自己免疫疾患、ウイルス性肝臓疾患又は急性肝臓疾患の治療のため患者に投与するための薬物の製造での使用であって、
前記患者が、あらかじめ、サイトカインアンタゴニスト又は抗炎症薬を投与されている、前記使用。 - サイトカインアンタゴニスト又は抗炎症薬の、アルコール性肝不全、皮膚疾患若しくは炎症性疾患を含む自己免疫疾患、ウイルス性肝臓疾患又は急性肝臓疾患の治療のため患者に投与するための薬物の製造での使用であって、
前記患者が、あらかじめ、配列番号20又は配列番号22で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与されている、前記使用。 - (i)請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項5〜7のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項8記載のベクター、又は請求項9記載の宿主細胞、及び(ii)サイトカインアンタゴニスト又は抗炎症薬の、アルコール性肝不全、皮膚疾患若しくは炎症性疾患を含む自己免疫疾患、ウイルス性肝臓疾患又は急性肝臓疾患の治療用薬物の製造での使用。
- (i)請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項5〜7のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項8記載のベクター、又は請求項9記載の宿主細胞の、アルコール性肝不全、皮膚疾患若しくは炎症性疾患を含む自己免疫疾患、ウイルス性肝臓疾患又は急性肝臓疾患の治療のため患者に投与するための薬物の製造での使用であって、
前記患者が、あらかじめ、サイトカインアンタゴニスト又は抗炎症薬を投与されている、前記使用。 - サイトカインアンタゴニスト又は抗炎症薬の、アルコール性肝不全、皮膚疾患若しくは炎症性疾患を含む自己免疫疾患、ウイルス性肝臓疾患又は急性肝臓疾患の治療のため患者に投与するための薬物の製造での使用であって、
前記患者が、あらかじめ、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項5〜7のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項8記載のベクター又は請求項9記載の宿主細胞を投与されている、前記使用。 - 患者の疾患を治療する方法であって、
配列番号20又は配列番号22で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを前記患者に投与することを含む、前記方法。 - サイトカインアンタゴニスト又は抗炎症薬を投与することをさらに含む、請求項25記載の方法。
- 疾患の疾患を治療する方法であって、
請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項5〜7のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項8記載のベクター、請求項9記載の宿主細胞、又は請求項14〜16のいずれか1項に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、前記方法。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチドを、前記ポリペプチド分子に対し結合親和性を有すると疑われる1又は2以上の化合物と接触させること;及び
前記ポリペプチドと特異的に結合する化合物を選択すること;
を含む、配列番号20又は配列番号22のリガンドである化合物を同定する方法。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチドを発現するように形質転換されている、非ヒトトランスジェニック動物。
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