JP2007508274A - 細胞毒性ｔ細胞応答を増強するためのアジュバントとしてｈｉｖｔａｔタンパク質を含むワクチン - Google Patents

Abstract

Ｔａｔは、ワクチンにおいて使用した場合、ＭＨＣ−Ｉが、抗原内に存在する亜優性エピトープを露出するように促し、これにより、ＨＩＶまたはインフルエンザウイルスで見られるような抗原および抗原の変異種に対して、個体内における最適な免疫応答を発生させることができる。

Description

発明の分野
本発明は、Ｔａｔ、その生物学的に活性な誘導体、またはその前駆体（前記をコードする核酸を含む）を含むワクチン、並びに、このようなワクチンの使用を含むワクチン接種の方法に関する。

発明の背景
ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質は、ウイルス進入時に非常に迅速に産生され、ウイルスの複製および感染性に必要とされる。近年、我々は、生物学的に活性なＴａｔは、樹状細胞により非常に効率的に取り込まれ、樹状細胞を活性化し、異種抗原に対するＴｈ−１型の応答を増加させることを示した。さらに、サルにおいてＴａｔを基礎とするワクチンが安全であり、Ｔｈ−１型の免疫応答の発生に関連した防御免疫を誘導することが示された。

Ｔａｔは、ＨＩＶ−１の調節タンパク質であり、感染後に非常に迅速に産生される。Ｔａｔは、ＨＩＶ−１遺伝子の発現、複製、および感染性において必須である。ＨＩＶ−１によるＴ細胞の急性感染中に、Ｔａｔは、細胞外環境に、生物学的に活性な形態で、細胞死または細胞透過性変化がなければ放出される^１、２。細胞外Ｔａｔは、隣接細胞により取り込まれ、ここで、濃度、酸化状態、および細胞型に応じて、細胞機能を変調する。

欧州特許第Ａ−１２７９４０４号明細書において、我々は、生物学的に活性な単量体Ｔａｔタンパク質は、単核細胞に由来する樹状細胞（ＤＣ）により効率的に取り込まれ、内部移行後に、ＤＣの成熟を誘導し、ＤＣによる同種および抗原特異的提示を増大させ、リコール抗原に対するＴｈ−１応答を増加させることを示している^３。Fanales-Belasioら(Journal of Immunology 2002、vol 168(1)、pp.197-206)もまた、Ｔａｔが提示を増大できることを開示している。

さらに、マウスおよびサルにおける研究により、Ｔａｔを基礎としたワクチンが安全であり、Ｔｈ−１型免疫応答および細胞毒性Ｔ細胞に関連した、病原性ウイルス攻撃に対する防御免疫を誘導することが示された^４，５。

細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）は、ＨＩＶを含む細胞内病原体の制御において不可欠な役割を果たしており、このことは、最適なＣＴＬ応答を誘発するワクチンは、ウイルス関連疾患および腫瘍の予防および／またはその制御に適用できることを示唆する。

ＣＴＬは、ＭＨＣクラスＩ分子と会合して標的細胞の表面に発現されるペプチドエピトープを認識する^６。エピトープは、抗原の分解により細胞質ゾルにおいて産生され、そこから小胞体へと輸送され、そこで新しく合成されたクラスＩ分子と会合する。ＣＴＬ応答は、同抗原内の数多くの可能性あるエピトープの中で、単一の免疫優性ペプチドに指向されることが多い。免疫優性として知られるこの現象は、依然としてあまり解明されていない。しかし、ペプチドの産生および提示、応答性Ｔ細胞の出現可能性、およびあまり解明されていない免疫調節効果は、全て、特定のエピトープに対する効率的な免疫応答の活性化に影響を及ぼし得る。

クラスＩに会合したペプチドの産生に関与する主要な酵素活性は、細胞内タンパク質の分解および細胞生存の維持に必須である大きな多触媒プロテアーゼである、プロテアソームである^７，８。

プロテアソームは、４つの七量体の環として配置された２０Ｓの触媒コアからなる。２つの外側の環は、構造的α−サブユニット（α１〜α７）を含み、内側の環は、βサブユニット（β１〜β７）を含み、その中の３つ（β１、β２、β５）が、Ｎ末端トレオニンによるペプチド結合上での求核攻撃を通して触媒活性を奏功する^９。プロテアソームの特異性に関する生化学的研究により、３つの別個のタンパク質分解成分が判明し、これは、キモトリプシン、トリプシン、および酸性後（カスパーゼ様とも呼ばれる）加水分解活性に関与している。個々のβ−サブユニットの寄与の解析により、個々のサブユニットと、好ましいアミノ酸の後の切断との間の明確な相関が実証された^１０。細胞をＩＦＮ−γに暴露すると、３つの触媒β−サブユニットは、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、およびＭＥＣＬ１（ＬＭＰ１０とも称される）により置き換えられる。これらのサブユニットはまた、構成的に、樹状細胞およびＢ細胞などの特定の細胞型において発現され^{１１、１２}、プロテアソームへのその取り込みにより、その活性を変化させ、特定のペプチドの産生を増強する^１３。

ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、およびＭＥＣＬ１を備えたプロテアソームは、イムノプロテアソームと呼ばれ、構成的に発現される標準的なプロテアソームとは異なる。イムノプロテアソームの触媒活性は、酸性アミノ酸の後の切断の減少、並びに、疎水性および塩基性残基の後の切断の増加を特徴とし、最も頻繁な残基は、ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドのＣＯＯＨ末端に見られる^１４。プロテアソームは、ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドの正にＣＯＯＨ末端を産生し、一方、ＮＨ_２末端切断は、常に正確であるわけではなく、小胞体に位置するアミノペプチダーゼが、ＮＨ_２伸張を切断して、正しいペプチドエピトープを産生し得ることが実証された^{１５〜１８}。

完全な、且つ調節されたプロテアソーム機能とするためには、２０Ｓプロテアソームコアは、１９Ｓキャップ複合体などの他のプロテアソーム成分と会合しなければならず、これにより２６Ｓプロテアソームが形成され、これはユビキチンコンジュゲートタンパク質および／またはＰＡ２８プロテアソーム調節物質を分解して、ＰＡ２８−プロテアソーム複合体を形成できる。ＰＡ２８と２０Ｓプロテアソームの会合により、免疫原性ペプチドの産生へと傾くようである^１９。免疫原性ペプチドの産生は、エピトープ特異的ＣＴＬ応答の活性化において重要なステップである。実際に、プロテアソーム媒介タンパク質分解が、ＭＨＣクラスＩ分子により提示されるエピトープの階層に寄与するという証拠がある。亜優性Ｔ細胞エピトープは、免疫優性エピトープとは対照的に、より低い効率で産生されるか、または、エピトープ内に位置する切断部位において破壊される^{２０、２１}。

Cafaroら(Nature Medicine(1999)、Vol 5、pp.643-650)は、サル用のＨＩＶ−１ワクチンにおける生物学的に活性なＴａｔの使用は安全であり、広範であるが（細胞性および体液性の両方）特異的な免疫応答を誘発し、ＳＩＶによる感染を低減することを示す。

国際公開第００／４３０３７号パンフレットは、ＴａｔおよびＮｅｆが、ＣＤ４＋細胞の走化剤であり、ワクチンにＴａｔおよびＮｅｆを補充した場合、ＣＤ４＋細胞をワクチン注射部位に補足することによりワクチン効力を高め得ることを開示する。

国際公開第０２／０１９９６８号パンフレットは、免疫原性特性を示す、共発現ＤＮＡワクチン（ＣＥＤ）を開示する。特に、抗原およびＴａｔの両方をコードするワクチンを開示し、抗原は、Ｔａｔ媒介免疫偏向または免疫変調／免疫調節から利点を得る。

我々は、今回、驚くべきことに、Ｔａｔを発現しているか、または、外来性の生物学的に活性なＴａｔタンパク質に暴露されている細胞において、Ｔａｔタンパク質が、イムノプロテアソームのサブユニット組成の修飾を誘導することを見出した。特に、Ｔａｔは、ＩＦＮ−γ誘導性触媒サブユニットＬＭＰ７およびＭＥＣＬ１の発現をアップレギュレートするが、ＬＭＰ２はダウンレギュレートする。これらの変化は、プロテアソームの３つ全ての主要なタンパク質分解活性の増加に相関する。プロテアソームは、ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドの産生に重要な役割を果たしており、我々は、Ｔａｔが、亜優性Ｔ細胞エピトープの産生および提示を増加させつつ、免疫優性エピトープの産生および提示を減少させることを見出した。

我々はまた、プロテアソームサブユニット組成の変調は、野生型Ｔａｔだけでなく、変異体ＴａｔおよびＴａｔ由来ペプチドによっても達成され得ることを見出した。

発明の概要
従って、第一の態様において、本発明は、複数のエピトープを有する抗原性物質に対する免疫応答を誘発するのに適したワクチンの調製における、Ｔａｔ、生物学的に活性な等価体、またはその前駆体の使用を提供し、エピトープは、免疫優性エピトープおよび亜優性エピトープの両方を含み、ワクチンは、その亜優性エピトープをコードするまたは含む抗原性物質の少なくとも一部を含む。

従って、Ｔａｔは、ワクチンにおいて使用した場合、ＭＨＣ−Ｉが、可変抗原の亜優性エピトープを露出するように促し、これにより、ＨＩＶまたはインフルエンザウイルスで見られるような、抗原の変異種に対しての個体内での持続的な免疫応答を発生させることができる。

好ましい実施形態において、複数の感染性生物株に対する免疫応答を誘発するのに適したワクチンの調製における、Ｔａｔ、その生物学的に活性な等価体、またはその前駆体の使用が提供され、ワクチンは、少なくとも１種類の生物株からの抗原性材料を含み、材料は、亜優性エピトープをコードするまたは含む。

「前駆体」は、アジュバントとして作用するのに適した様式で、患者においてＴａｔの存在をもたらす、任意の適切な材料を含むと理解する。これは、シグナルペプチドとの融合を含む、融合タンパク質などの、ペプチド前駆体を含み得、これは、切断されて活性なＴａｔを生成するか、または、切断されなくても活性であり得るか、または、ｉｎ ｓｉｔｕで発現されるに適した形態の核酸配列を含み得る。

好ましくは、使用されるＴａｔは、配列番号２８４に示された野生型Ｔａｔであるか、または、その変異体および／または断片である。

１つの態様において、Ｔａｔは、変異している。置換、欠失、または挿入によるなどの任意の数の変異が考えられるが、ただし、変異体は、好ましくは、上記したようなプロテアソームサブユニットの変調により、提示された亜優性エピトープの数を増加できる。

好ましくは、変異体は、ＢＬＡＳＴプログラムなどの既知の方法により測定したところ、配列番号２８４に記載の、野生型Ｔａｔに対して９０％の相同性、好ましくは９５％、より好ましくは９９％の相同性または配列同一性を有する。

特定の好ましい実施形態において、Ｔａｔは、２２位で変異している。好ましくは、野生型Ｔａｔのこの位置に存在するシステイン残基は、好ましくはグリシンにより置き換えられている。アラニンまたは任意の他の非極性アミノ酸などの、他の適切なアミノ酸も使用し得る。

１つの実施形態において、Ｔａｔの断片を本発明において使用することが好ましい。上記の効果が見られる限り、任意の長さのペプチドを使用し得る。しかし、断片は、配列番号２８４の少なくともアミノ酸番号４７〜８６（これは別に配列番号２８５として記載されている）を含むまたはコードすることが特に好ましい。好ましくは、前駆体は、少なくとも上記のアミノ酸をコードしているポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡである。また断片は、これらのアミノ酸を含むポリペプチドであることが好ましい。より好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２８４のアミノ酸４７〜８６からなる。

しかし、好ましくは、断片は、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、もしくは２００またはそれ以上のアミノ酸を含むかコードする。

好ましくは、Ｔａｔは、ｉｎ ｓｉｔｕで、好ましくは標的細胞において発現され得る。細胞は、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏで、またはより好ましくはｉｎ ｖｉｖｏで標的化され得る。代替的に、形質転換された良性の生物を患者に導入し得、該生物は、好ましくは、Ｔａｔおよび抗原（これに対する免疫応答の発生を望む）の両方を発現しているが、少なくともＴａｔを発現している。該生物は、適切にはウイルスまたは細菌であり、減弱形態の生物（これに対する免疫応答の刺激を望む）であってもよい。

好ましくは、Ｔａｔは、ｉｎ ｓｉｔｕで、誘導性プロモーターの制御下で発現され、よって、標的細胞におけるＴａｔの発現は、使用者により、抗原の投与または発現と同時または近い時期に誘導できる。適切な誘導性プロモーターは公知であるが、熱ショックプロモーターなどの物理的手段により活性化されたもの（これは一般的に好ましくないが）、または、ＩＰＴＧもしくはテトラサイクリン（Ｔｅｔ）などの化学物質により活性化されたものを含む。Ｔｅｔプロモーター系は、発現のオン／オフ制御および発現レベル制御の両方が可能となるので、特に好ましい。

Ｔａｔを標的細胞において発現するためには、ワクチンが発現配列を含むことが好ましい。この配列、エレメント、またはベクターは、細胞においてＴａｔを発現でき、標的細胞においてＴａｔの発現を誘導できるウイルスベクター、好ましくは減弱化した、好ましくはアデノウイルスベクターキャプシドであり得る。標的細胞において遺伝子発現を誘導する他の方法は、当分野において既知であり、以下にも記載している。

それ故、抗原を、誘導性プロモーターからのＴａｔの発現を制御または誘導する因子と共に投与することが好ましい。

代替的に、抗原は、抗原をコードするポリヌクレオチド配列を投与することにより発現させ、Ｔａｔをコードするさらなるポリヌクレオチド配列またはＴａｔの発現を誘導できる因子をコードするポリヌクレオチドも、好ましくは実質的に同時に提供されることが好ましい。

ｉｎ ｓｉｔｕでの発現は、宿主における外来ＤＮＡまたはＲＮＡの発現をもたらす、ベクターの使用、好ましくはウイルスベクターの使用などの、既知の遺伝子発現法により達成できる。好ましくは、Ｔａｔをコードするポリヌクレオチドは、アデノウイルスまたは減弱ＨＩＶ系により送達および発現される。代替的に、ポリヌクレオチドは、いわゆる「遺伝子銃」の使用などの方法により送達および発現できる。従って、Ｔａｔは、患者またはワクチン接種を受ける人により内因的に発現されることが好ましい。

本出願でＴａｔへの言及がなされる場合、当業者には別様であると明らかである以外は、本明細書に考察したような、その変異体および断片も含むものとする。例えば、Ｔａｔは、野生型Ｔａｔまたは短縮したＴａｔポリペプチド配列断片であっても、または、ｔａｔ変異体であってもよい。

また、Ｔａｔは、外来的に産生されペプチドとして提供されることが好ましい。好ましくは、Ｔａｔは前駆体として投与され、これがｉｎ ｖｉｖｏで切断されて活性Ｔａｔを提供し得る。

患者またはワクチン接種を受ける人は、好ましくは哺乳動物、好ましくは類人猿またはサルであり、最も好ましくはヒトである。しかし、代替的な実施形態においては、方法、使用、またはワクチンは、ヒトに適用または投与しないことも好ましい。

さらなる態様において、本発明はまた、プロテアソームサブユニット組成を変調する、好ましくは特定のサブユニットまたはサブユニット群、好ましくはＬＭＰ２サブユニットをダウンレギュレートするための、ワクチンまたは方法を提供する。

さらに他の態様において、本発明はまた、複数のエピトープを有する抗原性物質に対する免疫応答を誘発するための、または、上記に考察したような、複数の感染性生物株に対する免疫応答を誘発するためのワクチンを提供する。１つの実施形態において、ワクチンは、好ましくは、Ｔａｔ、生物学的に活性な等価体、またはその前駆体を含み、エピトープは、免疫優性および亜優性エピトープの両方を含み、抗原性物質の少なくとも一部は、その亜優性エピトープをコードするまたは含む。

さらなる実施形態において、ワクチンは、好ましくは、Ｔａｔ、その生物学的に活性な等価体、またはその前駆体、および少なくとも１種類の生物株からの抗原性材料を含み、材料は、亜優性エピトープをコードするまたは含む。

上記に考察したように、Ｔａｔは、好ましくは、配列番号２８４に示されているものである。さらに、Ｔａｔおよび抗原は、タンパク質またはペプチドとして提供されることが好ましい。

本発明はまた、疾患、好ましくはＨＩＶまたはインフルエンザの処置において、好ましくは株間免疫性を刺激するための、これらのワクチンの使用を提供する。

好ましくは、ワクチンは、Ｔａｔおよび抗原の送達のための適切なビヒクルを含む。このようなワクチンは、当分野で公知である。

発明の詳細な説明
本発明の主要な適用は、エスケープ変異体を産生することが公知であるウイルスに対する戦いにおいてであるが、癌および免疫介在性疾患に対する使用においても等しく重要であり、ここでは亜優性エピトープを標的化できることが、重要な利点である。

さらに、Ｔａｔは、本発明のワクチンと共に使用すると、特に疾患形態の、任意の抗原の亜優性エピトープの同定が可能となり得ることが理解されるだろう。同定は、効率的には、サブトラクティブ解析の形態をとり得る。この一例は、同一動物を取り出し、標準的なワクチンを使用して腫瘍に対して一方を免疫化し、Ｔａｔを含む類似ワクチンを用いて他方を免疫化し、その後、第一動物と比較することにより、第二動物が余分にいくつのＣＴＬエピトープを有していたかを同定することであり得る。このように同定されたエピトープは、同定および単離でき、ワクチン接種プログラムまたはスクリーニングにおいて使用できる。

亜優性エピトープは、一般的に、感染性生物だけでなく、腫瘍および免疫介在性疾患抗原においても見出される。理論に拘束されるものではないが、Ｔａｔの存在により、このような抗原の多数の領域が露出するようであり、これにより、亜優性エピトープに対するより強力な免疫応答が発生する。

特に驚くべきなのは、Ｔａｔの使用により実際に免疫優性エピトープに対するＣＴＬ応答が、これらのエピトープが依然として存在し効果的であるという事実にも関わらず、減少したことが判明したことである。実際に、これらのエピトープに対する応答は減少し、一方で、亜優性エピトープに対する応答は、非常に高くなっている。免疫優性エピトープに対するＣＴＬ応答の減少は、エスケープ変異体の形成を避けるまたは減少させるのに有用である。

一般に、Ｔａｔの効果は、抗原のエピトープに対するＣＴＬ応答を「平衡化」することのようであり、任意の抗原に対するより広範な免疫優性／亜優性エピトープ特異的ＣＴＬ応答セットへと傾く。さらに、上記したように、免疫優性ＣＴＬエピトープの免疫原性の低下は、エスケープ変異体を避け得る。

Ｔａｔを用いた動物における以前のワクチン研究により、このタンパク質が免疫応答を刺激でき、Ｔａｔタンパク質は、抗原としてアジュバントとしての両方で作用することが示された。しかし、Ｔａｔをアジュバントまたは共抗原として使用したどの研究においても、本発明により実証されたような亜優性エピトープに対する免疫応答を刺激する、意外で予測不可能な傑出したＴＡＴの能力が示されたりまたは示唆されたりしたことはなかった。事実、Ｔａｔまたは実際に任意の他のタンパク質が、エピトープ産生および提示をそんなにも大きく変化させるとは誰も予想していなかっただろう。

代わりに、我々は今回、Ｔａｔを広範な抗原性材料と共に使用でき、大半の個体において希にしか応答を発生しないか、またはさらには全く応答を発生しない、亜優性エピトープに対して、強力な免疫応答を刺激および観察できることを見出した。

亜優性エピトープは、優性エピトープも含む抗原性材料上に観察される場合もあり、または、優性エピトープとは会合していない分子に含まれている場合もある。亜優性エピトープの位置は、本発明においては重要ではないが、発生する免疫応答が感染の経過に影響を及ぼすことができるように、この生物の生活環の間にＣＴＬによる認識が可能であることが一般に好ましい。好ましくは、感染は、発生する免疫応答により制御または排除されるだろう。

優性エピトープのエスケープ変異は非常によくおこることであり、大半の疾患生物において観察されている。例えば、インフルエンザおよびＨＩＶは両方共、優性エピトープが変異した多くの株を仲間に有している。このような変異は、防御機序であると広く考えられており、変異はウイルスに対して殆どまたは全く作用を及ぼさないが、１種類の生物株に対して免疫のある個体が、新しい変異を有する生物に対して効果的な免疫が全くないことで十分である。

これに対して、亜優性エピトープには変異できなければならないという進化的圧力が全くなく、よって、また、これらのエピトープには生物中の活性機能から解離するようになることに対する圧力も全くない。従って、亜優性エピトープは、実質的に保存され、生物を損なうことなく変異することができない。

従って、Ｔａｔを本発明のワクチンに使用することにより、優性エピトープによりともすると目立たない亜優性エピトープに対する免疫を発生させることが可能であり、これにより、特定の抗原内の、亜優性および優性の両方のＣＴＬエピトープに対する免疫を発生させることができ、免疫化目的の病原体株に対してだけでなく、全てではなくても大半の将来および既存の病原体の変異種に対して免疫応答を発生させることができる。

本明細書に使用したような「変異種」なる用語は、問題の疾患形態により提示され得る全ての形態の抗原を含み、ただし、問題の抗原は、依然として疾患形態により提示されている。この用語をより正確に定義することは容易に可能ではないが、エスケープ変異は、実質的に免疫優性エピトープを変異させることが多いと考えられ、よって、１形態の変異種には、免疫優性エピトープのみが変化し、抗原の残りは、９９％、好ましくは１００％未変化であるものが含まれ得る。

本発明の抗原は、植物、寄生虫、および真菌を含む、多くの入手源から得られ得る。しかし、抗原または抗原群は、細菌、好ましくはマイコバクテリア、好ましくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、またはＭ．ａｆｒｉｃａｎｕｍから得られる。抗原はまた、好ましくは、スタフィロコッカスまたは桿状細菌から得られ得る。

得られたこの用語は、エピトープが提供される限りにおいて、生物もしくはウイルスからの抗原性ペプチド断片またはさらには生物もしくはウイルスそれ自体を含むと理解されたい。

抗原は、ウイルス源、好ましくはヘルペスウイルスから、またはｐｏｘ ｖｉｒｉｄａｅ属から、好ましくは呼吸器疾患を引き起こすウイルス、特にアデノウイルスピコルナウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、およびコクサッキーウイルス、好ましくはインフルエンザに関与するウイルスから得られることが特に好ましい。

実際に全ての感冒の約３０〜５０％が、ライノウイルスの１００を超える血清型の中の１つにより引き起こされる。任意の一時期においては、僅かな数のウイルスしか蔓延していない。しばしば１つのウイルスが、学校または兵舎などの比較的閉じられた個体群における突発に関与している。しかし、免疫化または耐性個体が迅速に反応できない、疾患を引き起こす新規な株が急速に進化する。本発明は、より高度に保存されていることが多い、亜優性エピトープの数を増加させることにより、この克服に助力する。

好ましくは、抗原は、急性呼吸器症候群ウイルス、例えばＳＡＲＳをもたらすウイルスから得られる。

抗原が、免疫不全ウイルス、好ましくはＳＩＶ、しかし最も好ましくはＨＩＶから得られるか、またはその断片であるか、またはそれを含むことがさらにより好ましい。Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、およびＥｎｖを含む、様々なＨＩＶ抗原が知られている。好ましくは、抗原は、ＧａｇまたはＥｎｖから得られる。実際に、我々は、添付の実施例において、ＧａｇまたはＥｎｖが宿主免疫系により認識するエピトープの数は、Ｔａｔの存在下でより多くなるので、Ｔａｔが、ＧａｇおよびＥｎｖの両方に対して特に有用であることを示した。

好ましくは、抗原は、癌または腫瘍、好ましくは腸、胃、肺、大腸、または膵臓の腫瘍、またはメラノーマから得られる。

Ｔａｔは、免疫介在性疾患、好ましくはアレルギー、喘息、気管支炎、自己免疫疾患、関節炎、痛風、および同類の症状、感染、胃腸炎、赤痢、便秘症、新生物、または免疫抑制に関連した症状の処置に有用であることも好ましい。

Ｔａｔを共抗原として使用できることも好ましく、すなわち、Ｔａｔは、抗原と一緒に投与または発現させることができ、Ｔａｔは、エピトープの数、特に抗原の亜優性エピトープの数を増加させるという有利な効果を有する。

好ましくはさらなる抗原と共に、Ｔａｔを投与または発現するさらなる利点は、免疫応答が、Ｔａｔ自体に対しても生じるであろうことであり、抗原およびＴａｔの両方に対する免疫応答を誘導できると考えられる。

好ましくは、抗原は、タンパク質またはペプチドとして投与される。上記に考察したように、タンパク質またはペプチドは、例えばグリコシル化の使用による、消化または分解から保護されるように修飾されていてもよく、ただし、保護は、後に、適切な部位で、例えば血流で、例えば血液由来のグリコシラーゼまたは血液に投与したグリコシラーゼにより除去できる。

好ましい投与経路は、以下に考察しており、経口、静脈内、筋肉内、または皮下が含まれる。好ましくは、抗原は、このような送達に適応した形態で提供され、錠剤、丸剤、坐剤、または注射用液体の形態であっても、または、多糖球または粒子またはナノ粒子と共に含まれていてもよい。

本発明のワクチンは、Ｔａｔ、生物学的に活性な等価な変異体もしくはその断片、またはその前駆体を含む。添付の実施例で示したように、酸化Ｔａｔは、殆どまたは全く効果がなく、よって、Ｔａｔの生物活性を保持することが重要である。この必要条件を踏まえて、イムノプロテアソームの増強されたタンパク質分解活性が保存されている限りにおいて、Ｔａｔ分子を変化させることが可能である。この活性レベルは、各タンパク質活性について、添付の実施例において示された活性の少なくとも３０％であるべきである。好ましくは、タンパク質分解活性は、実施例に示された活性の少なくとも５０％、好ましくは８０％、より好ましくは実施例で示された活性の少なくとも９０％とすべきである。疑いを回避するために、２レベル以上の増加したタンパク質分解活性が添付実施例において実証された場合には、上記の定義を、列挙された活性の最も低い活性に適用するが、他の任意の活性にも適用し得、好ましくは最大活性に適用する。

Ｔａｔは、４つのドメインを含む。酸性ドメイン（アミノ酸残基１〜２１）が、細胞タンパク質との相互作用に重要である。システインに富んだ領域（アミノ酸２２〜３７）は、トランス活性化ドメインに相当し、初期単離株の間で高度に保存されている。例えば、システイン２２をグリシン残基で置換すると、いわゆるＴａｔ２２変異体となり、Ｔａｔが、ＨＩＶ−ＬＴＲをトランス活性化する能力が消失する。同様に、コアドメイン（アミノ酸残基３８〜４８）も高度に保存されており、リジン４１をトレオニンで単純に置換すると、ＴａｔがＨＩＶ−ＬＴＲをトランス活性化する能力が失われる。第四ドメインは、塩基性ドメインであり（アミノ酸残基４９〜５７）、これはアルギニンおよびリジンに富んでおり、標的ＲＮＡに特異的に結合して、Ｔａｔの核内局在に関与する。この第四ドメインも、細胞外Ｔａｔが、ヘパリンおよびヘパランサルフェートプロテオグリカンに結合するのに関与している。カルボキシ末端領域は、ＬＴＲトランス活性化には必要ではないが、Ｔａｔが、インテグリン受容体α_５β_１およびαｖβ_３と相互作用および結合するのに関与している、細胞外マトリックスタンパク質に共通したアルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列（ＲＧＤ）を含む。

任意のドメインまたはカルボキシ末端の変異は、得られる生物学的に活性なＴａｔが、上記に定義したようなイムノプロテアソームのタンパク質分解活性を刺激するのに依然として十分である限り、本発明に包含される。

Ｔａｔまたはその生物学的に活性な等価体の代わりに、Ｔａｔまたはその生物学的に活性な等価体をコードする核酸配列を使用することも可能である。特に、Ｔａｔは、ワクチンの一部として投与しない場合には、ｉｎ ｓｉｔｕで、ワクチン中の微生物系により、または、患者への適切な発現配列の投与の結果として発現し得る。

同様に、ワクチンに含まれる抗原もまた、抗原をコードする核酸配列の形態で、または、元々の抗原すなわちペプチドの元々の状態もしくは部分消化された状態の形態で提示してもよい。亜優性エピトープは、それ自体ワクチン内に取り込み得るが、Ｔａｔは、ＭＨＣ−１による亜優性エピトープの提示を引き起こすことができるので、Ｔａｔを使用する場合にはこれは一般的に必要ではない。

Ｔａｔのユニークな活性は、亜優性エピトープまたはエピトープ群に対する免疫応答を実質的に増加させつつ、優性エピトープに対する免疫応答を減少させるのに十分であるので、ワクチンに、所望の生物からの抗原性材料を単に取り込むことが簡便である。ワクチンのために感染性生物を完全に不活性化することは必須ではないが、それは非常に好ましく、これは、例えば、熱処理または減弱化により達成され得る。さらなる精製も、例えばＨＰＬＣ、超ろ過、または遠心分離などにより行ない得る。イムノソルベントカラムも使用して成分を分離し得る。

本発明のワクチンは、免疫応答を開始および高めるための両方に使用し得、一般に、初回ワクチンおよびブースターの両方の組成が同じであることが好ましいが、これは必要ではなく、ただし、亜優性エピトープは種内で保存されているので、初回ワクチンおよびブースターの両方が、同じ感染性生物種である。

その後のブースターは、当業者により推奨されるように適用し得、効果的なワクチンを提供するために、現在の病原性のある感染性生物株の使用は必要ではないことが利点である。

本発明はさらに、
少なくとも１種類の生物株からの抗原性材料であって、亜優性エピトープをコードするまたは含む抗原性材料；および
Ｔａｔ、その生物学的に活性な等価体、またはその前駆体
を含むワクチンを投与することを含む、複数の感染性生物株に対する免疫応答を提供する方法を提供する。

好ましくは、Ｔａｔは、配列番号２８４に開示された通りであるか、または、本明細書の何処かに考察したような、その変異体および／または断片であり、Ｔａｔおよび関連用語への言及は、特記しない限り、それに従って捉えるべきである。

感染性生物は、疾患生物であることが好ましく、生物は、ウイルスであることが特に好ましいが、これは必要ではない。適切な抗原源は公知であり、さらに上記に考察している。

本発明で使用するワクチンは、任意の適切な形態で提供され得、任意の適切な経路により投与し得る。例えば、本発明のワクチンは、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、または目薬の形態、またはさらにはペッサリーもしくは坐剤として提供し得る。

本発明のワクチンは、Ｔａｔおよび抗原成分の他に、例えば、安定剤、緩衝剤、食塩水、および注射用等張剤を含む、任意の適切な成分、並びに、乳化剤、およびペッサリーおよび坐剤などの適用のための固体ビヒクルなどの任意の適切な成分を含み得る。抗菌剤および滅菌剤も所望により使用し得る。

添付実施例１において、我々は、ＨＩＶ感染細胞の早期産物である天然ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質が、プロテアソームのサブユニット組成および活性を修飾することを示す。特に、内因性Ｔａｔを発現しているかまたは生物学的に活性なＴａｔタンパク質に暴露されている、ＢおよびＴ細胞起源の細胞におけるプロテアソームは、ＬＭＰ７およびＭＥＣＬ１サブユニットのアップレギュレーション、並びに、ＬＭＰ２サブユニットのダウン変調を示す。ＬＭＰ２サブユニットの強力なダウンレギュレーションが、天然Ｔａｔで処置した後のマウスから単離した脾臓細胞において起こることが示されたが、酸化Ｔａｔタンパク質で処置したものでは起こらず、ウイルス遺伝子産物による選択的なＬＭＰ２のダウンレギュレーションが報告されている^{３５、３６}。標準的なβ−サブユニットをＩＦＮ−γ誘導性サブユニットで置換すると、トリおよびテトラペプチドに向けたプロテアソームの加水分解活性、並びに、ポリペプチドから得られたペプチド産物の品質が変化することが知られている^{１０、２３〜２５}。我々はここで、Ｔａｔにより誘導されたプロテアソームサブユニット組成の変化により、３つ全てのプロテアソームタンパク質分解活性が増加することを実証する^{１０、２３〜２５}。

ウイルス感染、細胞形質転換、または薬理学的処置によるプロテアソーム系の撹乱は、しばしば、病原体に対する免疫応答の変調における重要な事象である^{３７〜４４}。なぜなら、プロテアソームは、ＭＨＣクラスＩ分子により提示される抗原性ペプチドの大半の産生に中心的な役割を果たしているからである^８。特に、イムノプロテアソームは、特異的ＣＴＬエピトープの産生に非常に効率的であり、標準的なβ−サブユニットをＬＭＰ２、ＬＭＰ７、およびＭＥＣＬ１サブユニットで置換することにより、ＭＨＣクラスＩへの結合のための正しいＣ末端を有するペプチド抗原の産生が向上することが示されている^{４５〜４８}。対照するために、ヒトおよびマウスの両方において、ＬＭＰ２の存在は、特異的ペプチド抗原の提示を阻害し得るという証拠がある^{１２、４９、５０}。

我々は、今回、Ｔａｔ発現細胞またはＴａｔタンパク質に暴露されている細胞におけるプロテアソームのタンパク質分解活性の変動は、例えば、ＥＢＶ由来エピトープの異なる提示に相関することを示す。添付実施例において、我々は、Ｔａｔが、ＨＬＡ−Ａ１１分子により提示される２つの免疫優性ＣＴＬエピトープ（ＩＶＴおよびＡＶＦ）の提示を減少させ、ＨＬＡ−Ａ２により提示される２つの亜優性エピトープ（ＹＬＱおよびＣＬＧ）の提示を増加させることを示す。ＨＬＡ−Ａ２−会合ペプチドは、Ｃ末端においてバリンを提示し、イムノプロテアソームにおいてＬＭＰ２により置換されたβ１サブユニットが、酸性残基を超えたおよび分岐鎖を有する残基を超えた、例えばバリンを超えた切断に関与していることが実証された^{１０、５１}。

それ故、本発明は、ＬＭＰ２サブユニットのダウンレギュレーションまたは置換、好ましくはプロテアソームにおけるβ１サブユニットのアップレギュレーションを刺激することが好ましい。また、本発明は、バリンで切断されたペプチドの数の増加を刺激することが好ましい。また、認識するエピトープの数、好ましくは亜優性エピトープの数を増加させるワクチンまたは方法が好ましい。

好ましくは、Ｔａｔ、その等価変異体または断片、または前駆体は、目的のワクチンレシピエントにおいてＬＭＰ２のレベルをダウンレギュレートできる。

Ｔａｔ発現／処置細胞におけるプロテアソームは、非処置細胞またはＴａｔを発現しない細胞と比べて、低レベルのＬＭＰ２およびより高い酸性後活性を提示し、これは、Ｃ末端バリンを提示するＹＬＱおよびＣＬＧＣＴＬエピトープの産生および提示の大きな増強を説明し得る^{１０、５１}。我々はまた、Ｔａｔ発現細胞のプロテアソームが、ＣＬＧペプチド前駆体の分解において非常に効率的であり、対照細胞から単離したプロテアソームとは対照的に、それから免疫原性ペプチド断片を産生できることを示す。

類似の現象が、メラノーマ細胞で発現されるＨＬＡ−Ａ２提示エピトープにおいて観察され^１２、これは、ＬＭＰ２の存在が、ＨＬＡ−Ａ２などのいくつかのＨＬＡクラスＩ対立遺伝子により提示される一連のペプチドに特に影響を及ぼし得ることを示唆する。これは、ＬＭＰ２の存在が、ＣＴＬエピトープの産生に重要であることを示唆する。実際に、２つの最も優性な決定基に対するインフルエンザ特異的ＣＴＬ応答は、ＬＭＰ２ノックアウトマウスにおいて減少し、一方、２つの亜優性エピトープに対する応答は、大いに増強されることが実証された^５０。同様に、我々は、Ｔａｔ依存的ＬＭＰ２ダウン変調は、Ｏｖａ由来ＣＴＬエピトープに指向されたＣＴＬ応答の階層の変化を誘導することを実証した。

我々が初めて実証したのは、Ｔａｔが、亜優性エピトープに指向されたＣＴＬ応答を増加させ、免疫優性ＳＩＩペプチドに指向された応答を減少させることである。

これは、Ｔａｔを発現しているかまたは生物学的に活性な外来性Ｔａｔタンパク質で処置された、ＢおよびＴ細胞における、イムノプロテアソームの触媒サブユニット組成および活性を修飾することにより達成される。これにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＴＬエピトープ階層が変調される。特に、細胞内で発現されるＴａｔタンパク質および外来的な天然Ｔａｔタンパク質の両方が、ＬＭＰ７およびＭＥＣＬ１サブユニットをアップレギュレートし、ＬＭＰ２サブユニットをダウン変調することにより、プロテアソームの主要なタンパク質分解活性を増加させる。これにより、亜優性ＣＴＬエピトープのより効率的な産生および提示がなされる。

亜優性エピトープの提示を増加させつつ、免疫優性エピトープの提示を減少することは、ウイルス感染細胞の排除に特に有利である。なぜなら、免疫優性エピトープは、変異およびウイルス回避を非常に受けやすく、一方、亜優性エピトープはより安定であり、防御を誘導できることが確立されているからである^５２。

従って、Ｔａｔタンパク質は、ＭＨＣ−Ｉ制限免疫応答の誘導を駆動するのに有用であり、認識されるエピトープのスペクトルを広げ、ウイルス回避の出現を防ぐ機会を増やす。

上記したように、我々は、Ｔａｔの存在により、亜優性ＣＴＬエピトープのより効率的な産生および提示がなされることを示した。ＭＨＣ−Ｉ／エピトープ複合体の量は、エピトープ特異的ＣＴＬ応答の存在および強度を決定する上で、そして、ワクチン接種戦略のためのこれらの知見の生物学的関連性を確証するために重要であるが、Ｔａｔおよび卵白アルブミンの両方でワクチン接種したマウスにおける卵白アルブミンに対するエピトープ特異的ＣＴＬ応答を評価し続けた。

驚くべきことに、我々はまた、Ｔａｔが、卵白アルブミンのみでワクチン接種したマウスには存在しない亜優性および潜在性Ｔ細胞エピトープに指向されたＣＴＬ応答を誘導しつつ、免疫優性エピトープに指向されたＣＴＬ応答を減少させることを見出した。

この知見により、Ｔａｔは、「弱い」ＣＴＬエピトープに指向されたＣＴＬ応答の発生を好み、それ故、異種抗原に対するＣＴＬ応答を増加させるツールとして使用できることが示唆される。

さらに、我々は、システイン２２の代わりにグリシンを有する（Ｔａｔｃｙｓ２２）（配列番号２８６）、変異形態のＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質が、野生型Ｔａｔと同様に、プロテアソームのサブユニット組成を修飾することを見出した。Ｔａｔｃｙｓ２２変異体は、野生型Ｔａｔとは対照的に、ＨＩＶ−１ＬＴＲのトランス活性化に対して全く効果がなく、潜伏感染の再活性化は誘発しない。これは、生物学的に不活性なｔａｔの投与または発現が、状況によっては適切であり得るために、特に有利である。

従って、我々はまた、２２位のＣｙｓ残基は、野生型Ｔａｔの機能に対しては重要であるが、プロテアソームサブユニット組成に対するＴａｔの効果には必要とされないことを示した。

ＴａｔＣｙｓ２２変異体（配列番号２８６）が野生型Ｔａｔと比べて高い効果を示すことは特に利点である。すなわち、ＴａｔＣｙｓ２２変異体は、実際に、加工されそれにより提示される亜優性エピトープの数を増加させることが示された。

実際に、実験３における我々の結果は、Ｇａｇ＋Ｔａｔｃｙｓ２２を用いたワクチン接種により誘導したＴ細胞応答が、１１個の異なるＴ細胞エピトープに指向され、これはＧａｇのみで免疫化したマウスよりも７個多く、Ｇａｇおよび野生型Ｔａｔで免疫化したマウスよりも４個多いことを示す。

我々はまた、野生型Ｔａｔタンパク質から得られたペプチド４７〜８６は、ＬＭＰ２サブユニットをダウン変調するのに十分であることを実証する。

それ故、変異形態のＴａｔまたはＴａｔ由来ペプチドは、異種抗原に指向されたエピトープ特異的Ｔ細胞応答を増加させることを目的としたワクチン接種戦略において、野生型Ｔａｔの使用の重要な代替手段を示す。

我々は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、構造的ＨＩＶ遺伝子産物に対するＴ細胞応答に対するＴａｔ（野生型Ｔａｔタンパク質および変異体Ｔａｔｃｙｓ２２タンパク質の両方）の効果を活用した。我々は、驚くべきことに、Ｔａｔが、ＨＩＶ ＧａｇおよびＥｎｖ抗原内のＣＴＬエピトープの数を増加させることを示した。

Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、ＨＩＶ−１ＧａｇまたはＥｎｖタンパク質抗原で、単独で、または、野生型Ｔａｔもしくは変異体Ｔａｔｃｙｓ２２と組み合わせて免疫化した。我々は、野生型Ｔａｔおよび変異体Ｔａｔｃｙｓ２２の両方が、ＧａｇおよびＥｎｖ抗原に対するエピトープ特異的Ｔ細胞応答の数を増加させることを見出した。特に、我々は、野生型Ｔａｔまたは変異体Ｔａｔｃｙｓ２２と組み合わせたＧａｇでワクチン接種したマウスは、７または１１個のＴ細胞Ｇａｇ由来エピトープにそれぞれ応答し、これに対し、Ｇａｇのみでワクチン接種したマウスは、４個のＴ細胞Ｇａｇ由来エピトープに応答したことを実証した。同様に、野生型Ｔａｔまたは変異体Ｔａｔｃｙｓ２２と組み合わせたＥｎｖでワクチン接種したマウスは、１２個のＥｎｖ由来エピトーププールに応答し、これに対し、Ｅｎｖのみでワクチン接種したマウスは、８個のＴ細胞由来ペプチドプールに応答した。

我々の結果により、Ｔａｔは、抗原であるだけでなく、異種抗原に対するＴ細胞応答を増加させることのできるアジュバントであることが示される。それ故、Ｔａｔタンパク質並びに変異体Ｔａｔｃｙｓ２２は、Ｔ細胞により認識されるエピトープのスペクトルを広げることを目的としたＨＩＶ−１ワクチン戦略において重要なツールを示す。

従って、Ｔａｔは、ＨＩＶ抗原に対するエピトープ特異的ＣＴＬ応答を誘導するための有用なツールであり、エイズに対する新しいワクチン接種戦略の開発のための共抗原として使用できる。

以下の実施例において、添付の図面を参照する。

本発明は、添付の特許請求の範囲により示される事柄を除き、具体的に示され記載されている事柄により限定されない。実際に、本発明は、ここで、以下の実施例に関連して説明されているが、本発明は、これらの具体的な実施形態には限定されないことが理解されるだろう。逆に、添付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の範囲内に含まれるように、全ての代替的な改変および等価体を網羅するものとする。

実施例１
以下の方法は、本実施例および以下の実施例において使用した。

細胞
ＰＧ１３マウス両種指向性パッケージング細胞系^５４を、１０％ＦＣＳで補充したＤＭＥＭ中で培養した。ジャーカットＴ細胞トランスフェクト体（ｐＲＰｎｅｏ−ｃおよびｐＲＰｎｅｏ−ｃ−Ｔａｔ）^２２を、１０％ＦＣＳおよび８００μｇ／ｍｌネオマイシン（Sigma社）で補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。リンパ芽球腫細胞系（ＬＣＬ）は、健康ドナーからの正常Ｂリンパ球を、Ｂ９５．８ＥＢＶ株によりｉｎ ｖｉｔｒｏ感染することにより確立した。ＬＣＬ細胞は１０％ＦＣＳで補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。

プラスミド
ＨＩＶ−１ Ｔａｔ ｃＤＮＡ配列を、ＰＣＲにより、ｐＧＥＭ−３−Ｔａｔプラスミド^２２から、プライマーＴａｔＡ：５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＧＡＴ−３’（フォワード）（配列番号２７１）およびＴａｔＢ：５’−ＣＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＣＣ−３’（リバース）（配列番号２７２）（アニーリング温度５７℃）を使用して増幅した。精製ＰＣＲ産物をシークエンスし、ｐＢａｂｅＰｕｒｏベクターのＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ−Ｔａｔ^５５を作成した。

パッケージング細胞系
ｐＢａｂｅＰｕｒｏおよびｐＢａｂｅＰｕｒｏ−Ｔａｔベクターを、リン酸カルシウム法によりＰＧ１３パッケージング細胞系にトランスフェクトした^５６。トランスフェクトした細胞を、３μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Sigma社）を含む選択培地中で培養した。選択培養液からの組換えレトロウイルスの産生を、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、細胞非含有ＤＮａｓｅ処置上清について、プライマーＰｕｒｏＡ／ＰｕｒｏＢ（ＰｕｒｏＡ：５’−ＣＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＣ−３’（フォワード）（配列番号２７３）、ＰｕｒｏＢ：５’−ＡＧＧＣＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＴＧ−３’（リバース）（配列番号２７４）；アニーリング温度５７℃）およびＴａｔＡ／ＴａｔＢをそれぞれ使用して試験した。

細胞形質導入
ＭＩＮおよびＭＯＮ ＬＣＬ細胞を、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ−Ｔａｔ（ＭＩＮ−ＴａｔおよびＭＯＮ−Ｔａｔ）またはｐＢａｂｅＰｕｒｏ（ＭＩＮ−０およびＭＯＮ−０）組換えレトロウイルスを用いて、トランスウェル透明組織培養メンブランを使用して、パッケージング細胞系と一緒に共培養することにより形質導入した。下部チャンバーで増殖させた、亜集密なＰＧ１３ ｐＢａｂｅＰｕｒｏおよびＰＧ１３ ｐＢａｂｅＰｕｒｏ−Ｔａｔ細胞を、１０％ＦＣＳで補充した２．５ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地中の、上部チャンバーに加えた、ＭＩＮまたはＭＯＮ ＬＣＬ細胞（３×１０^６／ウェル）と共に、８μｇ／ｍｌのポリブレン（Sigma社）の存在下で共培養した。４８時間の共培養後、細胞を、メンブランから収集し、ピューロマイシン（０．３μｇ／ｍｌ）を含む培養培地中で６週間増殖した。全ての細胞系を、ＤＮＡ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、およびノーザンブロット解析により特徴づけた。

形質導入細胞系の特徴づけ
全ＤＮＡを、製造業者の説明に従って、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄキット（Macherey-Nagel社）を用いて５×１０^６個の細胞から抽出した。ピューロマイシンおよびＴａｔ遺伝子の増幅のために、プライマーＰｕｒｏＡ／ＰｕｒｏＢを、上記した条件下で使用した。
Ｔａｔ１：５’−ｇＡＡｇＣＡＴＣＣＡｇｇＡＡｇＴＣＡｇＣＣ−３’（配列番号２７５）
Ｔａｔ２：５’−ＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＴＴＣＣｇｇｇ−３’（配列番号２７６）（アニーリング温度５５℃）。

ＲＮＡは、製造業者の説明に従って、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩ（Macherey-Nagel社）を用いて、パッケージング細胞、ＭＩＮおよびＭＯＮ ＬＣＬ細胞、ＭＩＮ−０およびＭＯＮ−０、ＭＩＮ−ＴａｔおよびＭＯＮ−Ｔａｔ細胞（５×１０^６）の細胞非含有上清から抽出した。全ＲＮＡ（１μｇ）を、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２および５００ＩＵ／ｍｌの膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ（Boehringer Mannheim社）と共に、３７℃で１時間インキュベートし、フェノール−クロロホルムにより精製した。ＤＮａｓｅ消化を、新しいＤＮａｓｅ Ｉの添加時に３回繰り返した。

ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、ＲＴ−ＰＣＲシステムズ（Promega社）を用いるランダムヘキサマー法を使用して逆転写した。ｃＤＮＡを、アクチン特異的プライマーを使用してＰＣＲにより試験した：
正：５’−ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡ−３’（配列番号２７７）；
逆：５’−ＡＧＴＣＡＴＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴ−３’（配列番号２７８）；
アニーリング温度６３℃）。ピューロマイシンおよびＴａｔ遺伝子のＰＣＲは、記載の通りに実施した。

ノーザンブロット
等量の全ＲＮＡ（４０μｇ）を、ホルムアルデヒド−アガロースゲル（１．５％）上で１２時間電気泳動し、ナイロンメンブラン（Hybond N;Amersham社）に転写し、ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。プローブは、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩキット（Stratagene社）を使用して、無作為に［^３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。

ウェスタンブロット
等量のタンパク質を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにのせ、プロトランニトロセルロースメンブラン（Schleicher&Schuell社、米国ハンプシャー州Keene所在）上にエレクトロブロットした。ブロットを、α２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＭＥＣＬ１、およびＰＡ２８αサブユニットに特異的な抗体（Affinity社、英国Exeter所在）で標識し、増強化学発光（ECL、Amersham Pharmacia Biotech社、スウェーデンのUppsala所在）により展開した。

ＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質
ヒトＴリンパ指向性ウイルス型ＩＩＩＢ単離株（サブタイプＢ）からのＨＩＶ−１Ｔａｔを、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、以前に記載^３されたような優良試験所基準（ＧＬＰ）製造産物として、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣにより精製した。Ｔａｔタンパク質は、−８０℃で凍結乾燥保存して酸化を防ぎ、記載されたように^２使用前に脱ガスした緩衝液で復元した。異なるＧＬＰロットのＴａｔを使用しても再現性のある結果が得られ、全ての場合において、エンドトキシン濃度は、０．０５ＥＵ／μｇを下回っていた。

プロテアソームの精製
細胞（５×１０^７）を、冷ＰＢＳ中で洗浄し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオトレイトール（DTT、Sigma社）、２ｍＭのＡＴＰ、２５０ｍＭのスクロースを含む緩衝液中に再懸濁した。細胞懸濁液の容量と等しいガラスビーズを加え、細胞を１分間４℃でボルテックスにかけた。ビーズおよび細胞破壊片を、１０００×ｇでの５分間の遠心分離、次いで１０，０００×ｇでの２０分間の遠心分離により除去した。上清を、１時間、１００，０００×ｇで超遠心分離した^４４。上清を、プロテアソームのα２サブユニットに特異的なＭＣＰ２１ ｍＡｂで誘導体化したアガロースマトリックスを含むアフィニティカラムにのせた（Affinity社、英国Exeter所在）。カラムを洗浄し、２ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．５で溶出し、０．５ｍｌの画分を回収した。プロテアソームを含む画分を合わせ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５に対して透析した。タンパク質濃度を、ＢＣＡプロトコル（Pierce Chemical社）を使用して決定した。

酵素アッセイ
蛍光発生基質Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣ、およびＡｃ−ＹＶＡＤ−ＡＭＣを使用して、キモトリプシン様、トリプシン様、および酸性後プロテアソーム活性をそれぞれ測定した。ペプチド基質（１００μＭ）を、３７℃で３０分間、精製プロテアソームと共に、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５００μＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１ｍＭジチオトレイトール、および２ｍＭ ＡＴＰを含む７５μｌの緩衝液中でインキュベートした。蛍光を、蛍光測定計（Spectrafluor plus、Tecan社、オーストリアのSalzburg所在）により、励起３６０ｎｍおよび発光４６５ｎｍを使用して決定した。プロテアソーム活性は、任意の蛍光単位で表現する^１１。

合成ペプチド
全てのペプチドは、固相法により合成した^５７。粗脱保護ペプチドを、ＨＰＬＣにより、９８％を超える純度まで精製した。構造確証は、元素分析およびアミノ酸分析および質量分析により実施した。ペプチドストック液を、ＤＭＳＯ中に、１０^−２Ｍの濃度で溶解し、−２０℃で保存し、使用前にＰＢＳで希釈した。

合成基質の消化
合成ペプチドＣＬＧＧＬＬＴＭＶＡＧＡＶＷ（ＣＬＧ＋５）（配列番号２７９）を、ＤＭＳＯ中に、２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解した。５００μｇの合成ペプチドを、１２７μｇの精製プロテアソームと共に、３００μｌの緩衝液（２５ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５００μＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＡＴＰ）中で３７℃でインキュベートした。指定した時点で、６０μｌの試料を回収し、２容量のエタノールを０℃で添加することにより反応を終結した。

消化混合物を、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。８０μｌの上清を回収し、ペプチド消化物を、逆相ＨＰＬＣにより流速０．７ｍｌ／分で以下のように分離した：溶液Ｂの０〜１００％の線形勾配（０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル１００％）で２５分間、次いで溶液Ａの０〜１００％の線形勾配（０．１％ＴＦＡを含む水１００％）で５分間。分画は、２１０および２８０ｎｍで同時にモニタリングした。画分は３０秒毎に回収し、＋４℃で保存し、エリスポットで試験した。

ＣＴＬ培養液の作成
アミノ酸４１６〜４２４および３９９〜４０８に対応する^２７、ＥＢＮＡ４由来ＩＶＴＤＦＳＶＩＫ（配列番号２８０）（ＩＶＴ）およびＡＶＦＳＲＫＳＤＡＫ（配列番号２８１）（ＡＶＦ）エピトープに対して反応するＨＬＡ Ａ１１制限ＥＢＶ特異的ＣＴＬ培養液は、ＨＬＡ−Ａ１１陽性ＥＢＶ血清陽性ドナーＭＣからの単核細胞枯渇ＰＢＬを、自己Ｂ９５．８ウイルス形質転換ＬＣＬで刺激することにより得られた。アミノ酸２４６〜４３４に対応する^２８、Ｌｍｐ２由来ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号２８２）（ＣＬＧ）エピトープ、および、アミノ酸４２６〜１６７に対応する^２９、Ｌｍｐ１由来ＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号２８３）（ＹＬＱ）エピトープに対して反応する、ＨＬＡ Ａ２制限ＥＢＶ特異的ＣＴＬ培養液は、ＨＬＡ−Ａ２陽性ＥＢＶ血清陽性ドナーＲＧからの単核細胞枯渇ＰＢＬを、以前に記載^３２されたように、ペプチドで衝撃を与えたＴ２細胞で刺激することにより得られた。最初の刺激は、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０中で実施した。第二および第三の刺激は、同じ条件で７日目および１４日目に実施した。８日目から開始して、培地を、１０Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２（Chiron社、イタリアのMilan所在）で補充した。

細胞毒性アッセイ
標的細胞を、Ｎａ_２ ^５１ＣｒＯ_４で９０分間３７℃で標識した。細胞毒性試験を、異なるエフェクター：標的比で三重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）に慣用的に行なった。特異的溶解％は、１００×（試料のｃｐｍ−培地のｃｐｍ）／（トリトンＸ−１００のｃｐｍ−培地のｃｐｍ）として計算した^２７。自発的放出は、常に、２０％未満であった。

エリスポットアッセイ
ＣＴＬ（４×１０^４細胞）を、１００μｌの抗ＩＦＮ−γｍＡｂ（Endogen社、メイン州Woburn所在）で前もってコーティングしたマイクロプレート９６ウェルユニフィルター（Whatman社）上に一晩４℃で三重に播種した。ＣＴＬを、ネガティブ・コントロールとして培地のみと共に、またはポジティブ・コントロールとしての植物性血球凝集素（ＰＨＡ）と共に、またはエピトープ前駆体のプロテアソームによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの消化から得られた２０μｌの各ＨＰＬＣ画分と共にインキュベートした。

プレートを、２４時間、３７℃で５％ＣＯ_２でインキュベートし、その後、３回ＰＢＳで、３回洗浄緩衝液（ＰＢＳ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、その後、１００μｌのビオチニル化抗ＩＦＮ−γＭＡｂ（１μｇ／ｍｌ；Endogen社、メイン州Woburn所在）を加え、３７℃で６０分間インキュベートした。プレートを再度洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Endogen社、メイン州Woburn所在）を加え、プレートを室温で４５分間インキュベートした。ウェルを洗浄し、個々のＩＦＮ−γ産生細胞を、ＡＥＣ色素原キット（Sigma社、ミズーリ州Saint Louise所在）を使用して検出した。ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞を、直接眼で見て計測した。１０^６個の細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表現した、特異的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞の数を、ネガティブ・コントロール値を差し引くことにより計算した。ネガティブ・コントロール値は、常に、１０^６個の投入細胞あたりＳＦＣは５００未満であった。

動物の使用は、国立および施設ガイドラインに従った。７週齢から８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Nossan社、イタリアのMilan所在）に、脱ガス化した滅菌ＰＢＳ中に再懸濁した、天然で単量体の生物学的に活性なＴａｔタンパク質（１μｇ）を注射した。対照マウスに、酸化Ｔａｔ（１μｇ）またはＰＢＳのみを注射した。試料（１００μｌ）を、後ろ足の四頭筋に筋肉内注射（ｉ．ｍ．）により投与した。各実験グループは３匹のマウスからなり、実験は２回繰り返した。マウスに、最初の注射後の１１日目および２０日目にブースター投与した。最後の注射から７日後に、動物を、１ｍｇのイノケタン（Ｉｎｏｋｅｔａｎ）（Virbac社、イタリアのMilan所在）および２００μｇのロンパン（Ｒｏｍｐｕｎ）（Bayer社、イタリアのMilan所在）を含む１００μｌの等張溶液で腹腔内（ｉ．ｐ．）麻酔し、屠殺し、脾臓を回収した。個々の脾臓からの単核細胞を、細胞ろ過器を使用して精製し、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中に再懸濁し、赤血球溶解緩衝液で４分間室温で処置した。細胞を、２回、ＰＢＳ中で洗浄し、溶解し、上記したようなウェスタンブロット解析に使用した。

７週齢から８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２^ｂ）（Nossan社）に、２５μｇの卵白アルブミン（Sigma社、ミズーリ州St. Louis所在）のみで、または、天然で単量体の生物学的に活性なＴａｔタンパク質（５および１０μｇ）と組み合わせて注射し、フロイントアジュバント（最初の注射ではＣＦＡ、その後の注射ではＩＦＡ）中の脱ガスした滅菌ＰＢＳ中に再懸濁した。対照マウスに、フロイントアジュバント中のＰＢＳのみを注射した。

試料（１００μｌ）を、皮下（ｓ．ｃ．）注射により、背中の１部位に投与した。各実験グループは、５匹のマウスからなり、実験は２回繰り返した。マウスに、２４日目にブースター投与した。最後の注射から２週間後に、動物を上記したように腹腔内麻酔し、屠殺して脾臓を回収した。個々の脾臓からの単核細胞を、上記のように精製し、プールし、ペプチドで衝撃を与えたＥＬ４細胞に対しての細胞毒性アッセイで試験した。

内因的に発現されるＴａｔは、プロテアソームの組成および活性を変調する。内因的Ｔａｔの存在下におけるプロテアソームの発現を評価するために、Ｔａｔ（ＭＩＮ−ＴａｔおよびＭＯＮ−Ｔａｔ）を発現しているリンパ芽球腫細胞系（ＬＣＬ）を、レトロウイルス形質導入により調製し、ベクター形質導入細胞（ＭＩＮ−０およびＭＯＮ−０）と比較して、取り込まれたプラスミドの存在についておよびＴａｔＲＮＡの発現についてアッセイした。

その後、プロテアソームの発現レベルを、対照細胞と比較して、両方のＴａｔ発現細胞において、ウェスタンブロット解析により解析した。プロテアソーム発現における差異は、α２−サブユニットに特異的なモノクローナル抗体の使用により、これらの細胞においては検出されなかった（図２）。ＬＣＬ細胞は構成的にイムノプロテアソームを発現しているので^１１、その後、我々は、ＩＦＮγ誘導性ＰＡ２８α調節物質の発現および触媒βサブユニットＬＭＰ２、ＬＭＰ７、およびＭＥＣＬ１の発現を評価した。両方のＴａｔ−Ｔａｔは、対照細胞に比べて、ＰＡ２８α調節物質の発現において差異は全く示さなかった。これに対し、ＬＭＰ２の顕著なダウンレギュレーション並びにＬＭＰ７およびＭＥＣＬ１サブユニットのアップレギュレーションが、対照細胞に比べて、両方のＴａｔ発現細胞系において観察された（図２）。ＬＭＰ７およびＭＥＣＬ１の同じような増加、および、ＬＭＰ２の減少が、空の対照ベクターでトランスフェクトしたジャーカット細胞と比べて、Ｔａｔ^２２で安定にトランスフェクトしたジャーカットＴ細胞系において検出された（図１０、実施例２）。これらの知見は、イムノプロテアソームのサブユニット組成が、内因的に発現されるＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質により影響を受けることを実証する。

ウェスタンブロット解析により検出されたサブユニット組成の差異が、酵素活性の差異と関連しているかどうかを調べるために、我々は、ＭＩＮ−ＴａｔおよびＭＯＮ−Ｔａｔ細胞または対照細胞から単離した等量のプロテアソームの切断特異性を解析した。我々は、基質としてそれぞれＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣ、およびＡｃ−ＹＶＡＤ−ＡＭＣを使用して、キモトリプシン様、トリプシン様、および酸性後活性を試験した。３つ全ての酵素活性は、対照細胞から精製したプロテアソームの活性と比べて、Ｔａｔを発現している細胞から精製したプロテアソームを使用した方が高かった（図３）。この観察は、３つの触媒サブユニットの発現の結果と一致している。なぜなら、ＬＭＰ７およびＭＥＣＬ１の発現は、キモトリプシンおよびトリプシン活性の上昇と関連し、一方、ＬＭＰ２発現は、酸性後活性の低下と関連していることが実証されているからである^{１０、２３〜２５}。実際に、Ｔａｔを発現しているＬＣＬ細胞は、対照細胞と比べて、ＬＭＰ７およびＭＥＣＬ１の発現の増加、および、ＬＭＰ２の発現の減少を示した。

内因的な生物学的に活性なＴａｔは、プロテアソームの組成および活性を変調する
外来性Ｔａｔタンパク質の取り込み後の細胞におけるプロテアソームに対する効果を試験するために、ＭＩＮおよびＭＯＮ ＬＣＬ細胞を、漸増する濃度の生物学的に活性なＴａｔタンパク質の非存在下および存在下で、２４時間、３７℃で培養した。処置後、種々のサブユニットの発現を解析し、未処置細胞と比較した。α２サブユニットの発現の差異は、ウェスタンブロット解析により全く検出されず、このことは、外来性Ｔａｔは、内因的Ｔａｔを発現している細胞ですでに観察されているように（図２）、プロテアソームの発現を変化させないことを示唆する（図４）。しかし、０．１〜１μｇ／ｍｌのＴａｔでの処置により、未処置細胞と比較して、ＬＭＰ２のダウンレギュレーション並びにＬＭＰ７およびＭＥＣＬ１のアップレギュレーションが決定された（図４）。さらに、０．１μｇ／ｍｌのＴａｔで処置したＭＩＮおよびＭＯＮ ＬＣＬ細胞から単離したプロテアソームは、特異的蛍光発生ペプチドを使用して検出されたように、３つ全てのタンパク質分解活性の増加を提示した（データは示していない）。これらの結果により、内因的にＴａｔを発現している細胞において実証されたように、外来的Ｔａｔタンパク質は、細胞におけるイムノプロテアソームのサブユニット組成およびタンパク質分解活性を変化させることが実証される。

生物学的に活性なＴａｔによるプロテアソーム組成のｉｎ ｖｉｖｏでの変調
Ｔａｔのｉｎ ｖｉｖｏでの効果を評価するために、我々は、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、生物学的に活性なＴａｔまたは酸化Ｔａｔで処置した。３回の連続的な処置の後、脾臓細胞を単離し、全細胞溶解液を、ＩＦＮ−γ誘導性触媒サブユニットの発現について試験した。

天然Ｔａｔで処置した全てのマウスから単離した脾臓細胞は、ＬＭＰ２のダウンレギュレーションを実証したが、酸化Ｔａｔで処置したマウスから単離した脾臓細胞においては全く効果が観察されなかった（図５）。これらの結果により、Ｔａｔが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、プロテアソームのサブユニット組成を調節することが実証される。

Ｔａｔは、ＥＢＶ潜伏抗原から得られたＣＴＬペプチドエピトープの産生を修飾する
プロテアソームは、ＣＴＬエピトープの産生に重要な役割を果たしているので、我々は、内因的にＴａｔを発現しているかまたはＴａｔタンパク質に暴露されているＬＣＬ細胞においての、ＣＴＬエピトープの産生および提示に対する、Ｔａｔにより誘導されるプロテアソーム変種の効果を調べた。

ＬＣＬ細胞は、核抗原（ＥＢＮＡ）１、２、３、４、５、６、並びに潜伏膜抗タンパク質（ＬＭＰ）１および２を含む、全セットのＥＢＶ潜伏抗原を発現している。これらの抗原は、核抗原１を除いて、細胞毒性Ｔリンパ球の標的であり、多くのＣＴＬエピトープが同定されている^２６。この実験セットにおいて、我々は、ＥＢＮＡ４抗原から得られた^２７、免疫優性ＩＶＴおよびＡＶＦ ＨＬＡ−Ａ１１提示エピトープ、並びに、潜伏膜タンパク質１（Ｌｍｐ１）および２（Ｌｍｐ２）からそれぞれ得られた^{２８、２９}２つのＨＬＡ−Ａ２提示エピトープである亜優性ＹＬＱおよびＣＬＧエピトープを評価した。近年、これらのエピトープの産生は、プロテアソーム活性に依存していることが示された^{３０、３１}。この目的のために、Ｔａｔで形質導入したまたは形質導入していない、ＨＬＡ−２およびＡ１１陽性ＭＩＮ ＬＣＬおよびＨＬＡ−Ａ２陽性ＭＯＮ ＬＣＬを、ＩＶＴ、ＡＶＦ、ＣＬＧ、およびＹＬＱエピトープに特異的なＣＴＬ培養液を使用して、細胞毒性アッセイにおいて標的として試験した（図６）。以前に実証されているように^２７、ＩＶＴおよびＡＶＦ特異的ＣＴＬは、効率的に、Ａ１１適合ＬＣＬを溶解し、一方、ＹＬＱおよびＣＬＧ特異的ＣＴＬでは低レベルの特異的殺滅しか得られなかった^{２８、２９、３２}。これは、ＥＢＶ感染Ｂ細胞の細胞表面上において、これらの２つのＨＬＡ−Ａ２提示エピトープがあまり発現されていないためである^２６。

内因的Ｔａｔの発現は、空ベクターで形質導入した対照細胞と比べて、ＩＶＴおよびＡＶＦ特異的ＣＴＬ殺滅の減少並びにＹＬＱおよびＣＬＧ特異的殺滅の増加を引き起こした（図６）。Ｔａｔまたは空ベクターを発現している、ＨＬＡ−Ａ１１陰性ＭＯＮ ＬＣＬは、ＩＶＴおよびＡＶＦ特異的ＣＴＬ培養液により認識されなかった。

第二の実験セットにおいて、我々は、０．１μｇ／ｍｌのＴａｔタンパク質で２４時間処置していないまたは処置した、ＭＩＮ ＬＣＬのＣＴＬ感度を評価した。以前の実験の結果と一致して、Ｔａｔで処置したＬＣＬ細胞は、ＩＶＴおよびＡＶＦ特異的ＣＴＬ殺滅に対してより感度が低かったが、ＹＬＱおよびＣＬＧ特異的ＣＴＬによってより効率的に溶解した（図７）。

これらの知見により、プロテアソームの組成および活性に対するＴａｔの効果により、ウイルス感染細胞の表面におけるエピトープの提示が変化することが示唆される。

Ｔａｔ発現細胞から精製したプロテアソームによるＣＬＧエピトープのｉｎ ｖｉｔｒｏでの効率的な産生
Ｔａｔ発現細胞からのプロテアソームが、より高い効率でＣＬＧエピトープを産生するかどうかを試験するために、我々は、ＬＭＰ２抗原の野生型配列に対応するＣ末端における５つのアミノ酸（ＣＬＧ＋５）を含むＣＬＧペプチド前駆体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分解を解析した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイは、ＭＩＮ−Ｔａｔから精製したプロテアソームおよびＭＩＮ−０から精製したプロテアソームを使用して実施した。前駆体分解は、種々の時点で追跡し、ＨＰＬＣ分析により評価した。我々は、Ｔａｔ発現細胞から単離したプロテアソームは、空ベクターを発現している細胞から精製したプロテアソームよりも、より効率的に、ＣＬＧ＋５ペプチド前駆体を分解したことを見出した（図８ａ）。

消化産物を特徴づけるために、我々は、ＨＰＬＣにより、種々の時点で得られた消化物を分離した。全ての画分を回収し、エリスポットに使用して、ＣＬＧ特異的ＣＴＬを活性化した。３０、６０、および９０分間のインキュベート後に得られた消化物から精製した画分は、ＣＴＬ応答を活性化しなかった（示していない）。ＭＩＮ−Ｔａｔから精製したプロテアソームによる１２０分間の分解後に得られたＨＰＬＣ画分４および８のみが、ＣＬＧ特異的ＣＴＬ応答を刺激しなかった。このことにより、これらの画分は、ＣＬＧエピトープまたはより長いが免疫原性であるエピトープを含むことが実証される。弱いＣＬＧ特異的ＣＴＬ応答もまた、ＭＩＮ−０から単離したプロテアソームを使用して１２０分間の分解後に得られたＨＰＬＣ画分８において観察された。これらの結果により、Ｔａｔ発現細胞から精製したプロテアソームは、異なるタンパク質分解活性を示し、より効率的に、免疫原性ＣＬＧペプチドを産生することがここでも実証される。

ＴａｔによるＣＴＬ応答のｉｎ ｖｉｖｏでの変調
上記に示したように、Ｔａｔは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において、プロテアソームのサブユニット組成を変化させ、次いで、ＥＢＶ感染Ｂ細胞の細胞表面におけるＥＢＶ由来ＣＴＬエピトープの提示を変調する。２つの免疫優性ＣＴＬエピトープのダウンレギュレーションおよび２つの亜優性ＣＴＬエピトープのアップレギュレーション（図５および６）が観察され、このことは、Ｔａｔが、抗原加工機械を変化させることにより、抗原提示細胞上のエピトープ提示に影響を及ぼし、ＣＴＬ応答の免疫優性および亜優性に影響を及ぼし得ることを示唆する。従って、我々は、エピトープ特異的ＣＴＬ応答の誘導に対する、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴａｔの効果を評価することを決めた。我々は、モデルとして、Ｋ^ｂバックグラウンドで、卵白アルブミン（Ｏｖａ）に指向したＣＴＬ応答を使用した。Ｋ^ｂ制限ＣＴＬ応答は、免疫優性ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＩＩ）（配列番号２６８）エピトープおよび亜優性ＫＶＶＲＦＤＫＬ（ＫＶＶ）（配列番号２６９）および潜在性ＣＦＤＶＦＫＥＬ（ＣＦＤ）（配列番号２７０）エピトープに指向している^{３３、３４}。ＫＶＶに特異的なＣＴＬは、ＯｖａによるＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫化時には見出されず、ＫＶＶおよびＣＦＤエピトープの亜優性は、エピトープにフランキングし、プロテアソーム媒介加工並びにＫＶＶおよびＣＦＤ ＣＴＬエピトープの産生に影響を及ぼすアミノ酸配列の存在に起因したことが示されている^{２０、２１}。Ｔａｔがｉｎ ｖｉｖｏにおいてＫ^ｂ制限Ｏｖａ由来エピトープの産生に影響を及ぼすかどうかを解決するために、我々は、Ｏｖａのみ、またはＴａｔと組み合わせてマウスにワクチン接種した。

３つのＯｖａ由来エピトープに指向した特異的ＣＴＬ応答の存在を、関連ＣＴＬエピトープで衝撃を与えたまたは与えなかったＥＬ４標的細胞を使用して、新しい脾臓細胞において評価した（図９）。Ｏｖａのみで免疫化したマウスから単離した脾臓細胞は、ＳＩＩエピトープで衝撃を与えた標的細胞を認識したが、ＫＶＶまたはＣＦＤエピトープで衝撃を与えた細胞は認識せず、これにより、ＣＴＬ応答は、主に、免疫優性ＳＩＩペプチドエピトープに対して指向することが確認された。これに対し、Ｏｖａ／Ｔａｔの組合せでワクチン接種したマウスから単離された脾臓細胞は、免疫優性ＳＩＩエピトープをより低い効率で認識したが、亜優性ＫＶＶおよび潜在性ＣＦＤエピトープを提示する標的細胞は明らかに認識した。対照マウスは、どのペプチドで衝撃を与えたＥＬ４細胞も全く認識しなかった。

実験１および発明の説明のための参考文献
1. Frankel, A. D. & Pabo, C.O. Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiency virus. Cell 55, 1189-1193 (1988).
2. Ensoli, B. et al. Release, uptake, and effect of extracellular human immunodeficiency virus type 1 Tat protein on cell growth and viral transactivation. J. Virol. 67,277-287 (1993).
3. Fanales-Belasio, E. et al. Native HIV-1 Tat protein is selectively taken up by monocyte-derived dendritic cells and induces their maturation,Th-1 cytokine production and antigen presenting function. J Immunol 168,197-206 (2002).
4. Cafaro, A. et al. Control of SHIV-89. 6P-infection of cynomolgus monkeys by HIV-1 Tat protein vaccine. Nat. Med. 5,643-650 (1999).
5. Cafaro, A. et al. Vaccination with DNA containing tat coding sequences and unmethylated CpG motifs protects cynomolgus monkeys upon infection with simian/human immunodeficiency virus(SHIV89. 6P). Vaccine 19, 2862-2877 (2001).
6. Pamer, E. & Cresswell, P. Mechanisms of MHC cass I-restricted antigen processing. Annu. Rev. Immunol. 16,323-358(1998).
7. Rock, K. L. et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell 78,761-771 (1994).
8. Rock, K. L. & Goldberg, A. L. Degradation of cell proteins and the generation of MHC class I-presented peptides. Anne. Rev. Immunol. 17,739-779 (1999).
9. Voges, D., Zwickl, P. & Baumeister, W. The 26S proteasome: a molecular machine designed for controlled proteolysis. Annu. Rev. Biochem. 68, 1015-1068 (1999).
10. Dick, T. P. et al. Contribution of proteasomal p-subunits to the cleavage of peptide substrates analysed with yeast mutants. J. Biol. Chem. 273,25637-25646 (1998).
11. Frisan, T., Levitsky, V. , Polack, A. & Masucci, M. Phenotype-dependent differences in proteasome subunit composition and cleavage specificity in B cell lines. J. Immunol. 160,3281-3289(1998).
12. Morel, S. et al. Processing of some antigens by the standard proteasome but not immunoproteasomes results in poor presentation by dendritic cells. Immunity 12,
107-117 (2000).
13. Sijts, A. J. A. M. et al. Efficient generation of a hepatitis B virus cytotoxic T lymphocyte epitope requires the structural features of immunoproteasomes. J. Exp. Med. 191,503-513 (2000).
14. Gaczynska, M. , Rock, K. L. & Goldberg, A. L. y-Interferon and expression of
MHC genes regulate peptide hydrolysis by proteasomes. Nature immunogenicity: implications for immunotherapy of Epstein-Barr virus-associated malignancies. Eu7 : J. Immunol. 29,2579-2589 (1999).
33. Chen, W., Khilko, S. , Fecondo, J. , Margulies, D. H. & McCluskey, J. Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues.J. Exp.Med. 180, 1471-1483 (1994).
34. Lipford, G. B., Hoffman, M. , Wagner, H. & Heeg, K. Primary in vivo responses to ovalbumin. J. Immunol. 150,1212-1222 (1993).
35. Zeidler, R. etal. Downregulation of TAP1 in B lymphocytes by cellular and Epstein-Barr virus-encoded interleukin-10. Blood 90,2390-2397 (1997).
36. Chatterjee-Kishore, M. , van den Akker, F. & Stark, G. R. Adenovirus El A down-regulates LMP2 transcription by interfering with the binding of Statl to IRF1. J. Biol. Chem. 275,20406-20411 (2000).
37. Turnell, A. S. etal. Regulation of the 26S proteasome by adenovirus ElA. EMBO J. 19,4759-4773 (2000).
38. Andre, P. etal. An inhibitor of HIV-1 protease modulates proteasome activity, antigen presentation, and T cell responses.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,13120- 13124 (1998).
39. Berezutskaya, E. & Bagchi, S. The human papillomavirus E7 oncoprotein functionally interacts with the S4 subunit of the 26S proteasome.J.Biol. Chem. 272, 30135-30140 (1997).
40. Ehrlich, R. Modulation of antigen processing and presentation by persistent virus infections and in tumors. Hum. Immunol. 54,104-116 (1997).
41.Schmidtke, G. et al. How an inhibitor of theHIV-1 protease modulates proteasome activity.J.Biol. Chem. 274,35734-35740 (1999).
42. Hu, Z. etal. Hepatitis B virus X protein is both substrate and a potential inhibitor of the proteasome complex. J.Virol. 73,7231-7240 (1999).
43. Wing, S. S. & Goldberg, A. L. Glucocorticoids activate the ATP-ubiquitin- dependent proteolytic system in skeletal muscle during fasting. American Journal of Physiology 264,668-676 (1993).
44. Gavioli, R. , Frisan, T. , Vertuani, S., Bornkamm, G. W. & Masucci, M. G. c- Myc overexpression activates alternative pathways for intracellular proteolysis in lymphoma cells.
45. Cerundolo, V. , Kelly, A. , Elliot, T. , Trowsdale, J. & Townsend, A. Genes encoded in the major histocompatibility complex affecting the generation of peptides for TAP transport. Eur. J. Immunol. 25,554-562 (1995).
46. Sewell, A. K.et al. IFN-y exposes a cryptic cytotoxic T lymphocyte epitope in
HIV-1 reverse transcriptase. J. Immunol. 162,7075-7079 (1999).
47. van Hall, T. etal. Differential influence on cytotoxic T lymphocyte epitope presentation by controlled expression of either proteasome immunosubunits or PA28. J. Exp. Med. 192, 483-494 (2000).
48. Sijts, A. J. A. M. etal. MHC class I antigen processing of an adenovirus CTL epitope is linked to the levels of immunoproteasomes in infected cells.J. Immunol. 164,4500-4506 (2000).
49. Schmidtke, G. etal. Inactivation of a defined active site in the mouse 20S proteasome complex enhances major histocompatibility complex class I antigen presentation of a murine cytomegalovirus protein.J. Exp. Med. 187,1641-1646 (1998).
50. Chen, W. , Norbury, C. C. , Cho, Y. , Yewdell, J. W. & Bennink, J. R. Immunoproteasomes shape immunodominance hierarchies of antiviral CD8+ T cells at the levels of T cell repertoire and presentation of viral antigens. J. Exp. Med. 193, 1319-1326 (2001).
51. Groll, M. etal. The catalytic sites of 20S proteasomes and their role in subunit maturation: a mutational and crystallographic study. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 96,10976-10983 (1999).
52. Feltkamp, M. C. W. etal. Cytotoxic T lymphocytes raised against a subdominant epitope offered as a synthetic peptide eradicate human papilloma virus type 16-induced tumors. Eur.J. Immunol. 25,2638-2642 (1995).
53.Rubartelli, A., Poggi ; A. ; Sifia, R : & Zocchi ; M : R : H1V=I Tat : wa-polypeptide for all seasons. Immunol. Today 19,543-545 (1998).
54. Miller, A. D. etal. Construction and properties of retrovirus packaging cells based on gibbon ape leukemia virus.J.Virol. 65,2220-2224 (1991).
55. Morgenstern, J. P. & Land, H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with nultiple drug selection markers and a complementary helper- free packaging cell line. Nucleic Acids Res. 18,3587-3596 (1990).
56. Graham, F. L. & van der Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52,456-467 (1973).
57. Micheletti, F. etal. Supra-agonist peptides enhance the reactivation of memory cytotoxic T lymphocyte responses. J.17nnzunoL 165,4264-4271 (2000).

実施例２
ＨＩＶ−１ Ｔａｔ変異体およびＨＩＶ Ｔａｔ由来ペプチドは、プロテアソームの組成および酵素活性を変調する
材料および方法
細胞
Ｔａｔまたは変異体Ｔａｔ（Ｔａｔ２２と称する、ここで２２位のＣｙｓは変異している）を発現しているジャーカットＴ細胞は、以前に記載されている（１）。細胞を、８００μｇ／ｍｌのネオマイシン（Sigma社、ミシガン州St. Louise所在）を補充した培地で培養した。

ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質
ヒトＴリンパ指向性ウイルス型ＩＩＩＢ単離株（ＢＨ１０クローン）からのＨＩＶ−１Ｔａｔを、Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて発現させ、以前に記載（２）されたようにヘパリンアフィニティクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣにより精製した。凍結乾燥したＴａｔタンパク質を−８０℃で保存して、酸化を防ぎ、使用前に脱ガス緩衝液中で復元し、記載（３）のように取り扱った。異なるロットのＴａｔを使用しても再現性のある結果が得られ、全ての場合において、エンドトキシン濃度は、検出不可能であった（検出閾値：０．０５ＥＵ／μｇ）。

プロテアソームの精製
細胞を、以前に記載（４）されたようにガラスビーズを用いて溶解した。上清を、１時間、１００，０００ｇで超遠心分離し、プロテアソームのα２サブユニットに特異的なＭＣＰ２１ｍＡｂで誘導体化したマトリックスを含むアフィニティカラムにのせた（Affinity社、英国Exeter所在）。プロテアソームは、２ＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５で溶出し、０．５ｍｌの画分を回収した。溶出材料の均一性は、ＳＤＳ１２％ＰＡＧＥおよびゲルのクーマシーブルー染色により、アリコートを解析することにより確認した。プロテアソームを含む画分を合わせ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．５に対して透析した。タンパク質濃度を、ＢＣＡ法（Pierce Chemical社、イリノイ州Rockford所在）を使用して決定した。

ウェスタンブロットアッセイ
等量のタンパク質、すなわち等量の精製プロテアソームを、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにのせ、プロトラン・ニトロセルロースメンブラン（Schleicher&Schuell社、米国ハンプシャー州Keene所在）上にエレクトロブロットした。ブロットを、α２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＭＥＣＬ１、およびＰＡ２８αサブユニットに特異的な抗体（Affinity社）でプローブし、増強化学発光（ECL、Amersham Pharmacia Biotech社、スウェーデンのUppsala所在）により展開した。

酵素アッセイ
精製プロテアソームのキモトリプシン様、トリプシン様、および酸性後活性を、蛍光発生基質Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣおよびＡｃ−ＹＶＡＤ−ＡＭＣをそれぞれ使用して、以前に記載（４）されたように試験した。蛍光は、蛍光測定計（Spectrafluor plus、Tecan社、オーストリアのSalzburg所在）により決定した。プロテアソーム活性は、任意の蛍光単位として表現する。

合成ペプチド
ペプチドは、以前に記載（５）されたように、固相法により合成し、ＨＰＬＣにより９８％を超える純度まで精製した。構造の確認は、元素分析およびアミノ酸分析および質量分析により実施した。ペプチドを、ＤＭＳＯ中に１０^−２Ｍで溶解し、−２０℃で保存し、使用前にＰＢＳで希釈した。

結果および考察
内因的に発現されるＴａｔまたは外来的な天然Ｔａｔタンパク質は、ジャーカット細胞におけるプロテアソームの組成および活性を変調する
我々は、実施例１において、ＨＩＶ−１Ｔａｔは、Ｔａｔを発現しているかまたは外来的な生物学的に活性なＴａｔタンパク質で処置した、リンパ芽球腫細胞系におけるイムノプロテアソームの触媒サブユニット組成および活性を修飾することを示した。同様に、ジャーカット細胞におけるＴａｔの内因的発現は、ＬＭＰ２のダウンレギュレート並びにＬＭＰ７およびＭＥＣＬ１のアップレギュレーションを誘導する（実施例１および図１０を参照）。

外来的Ｔａｔタンパク質が、ジャーカット細胞におけるプロテアソームの触媒サブユニットの発現を変調するかどうかをアッセイするために、我々は、漸増濃度の天然Ｔａｔタンパク質の非存在下および存在下で、１２時間（図１１Ａ）および２４時間（図１１Ｂ）培養したジャーカット細胞からのプロテアソームの発現を評価した。処置後、精製プロテアソームからのＬＭＰ２サブユニットの発現を、Ｔａｔ誘導プロテアソーム修飾のマーカーとして評価した。図１１に示したように、ＬＭＰ２サブユニットの最大のダウンレギュレーションが、０．１〜１μｇ／ｍｌのＴａｔによる処置の２４時間後に観察された。

これらの結果により、内因的に発現されるＴａｔおよび外来的な天然Ｔａｔタンパク質の両方が、ジャーカット細胞におけるイムノプロテアソームのサブユニット組成を修飾することが実証される。

サブユニット組成の差異が、酵素活性の差異と相関するかどうかを調べるために、我々は、１μｇ／ｍｌのＴａｔタンパク質で２４時間処置したジャーカット細胞、または、対照細胞から精製した、等量のプロテアソームの切断特異性を解析した。キモトリプシン様、トリプシン様、および酸性後活性は、対照細胞と比べて、Ｔａｔで処置したジャーカット細胞から精製したプロテアソームにおいて増大していた（図１２）。

Ｔａｔは、プロテアソームの組成および活性を変調するために、システイン２２を必要としない。

次の実験セットにおいて、我々は、ジャーカット細胞で安定に発現されたＴａｔ変異体の効果を評価した。２２位および／または３７位のシステインをそれぞれグリシンおよびセリンで置換して、３つの変異体Ｔａｔ分子（Ｔａｔ２２、Ｔａｔ３７、およびＴａｔ２２／３７）を得た。Ｔａｔ２２およびＴａｔ２２／３７変異体は、野生型Ｔａｔとは対照的に、ＨＩＶ−１ＬＴＲのトランス活性化に対して全く効果がなく、潜伏感染の再活性化を誘発しない。

その後、プロテアソームの発現レベルを、Ｔａｔ発現細胞において解析し、Ｔａｔ変異体を発現している細胞と比較した。これらの細胞において、α２サブユニットに特異的なモノクローナル抗体の使用により、プロテアソーム発現の差異は全く検出されなかった（図１３）。これに対し、ＬＭＰ２サブユニットの顕著なダウンレギュレーションが、野生型Ｔａｔを発現している細胞において以前に実証されたように、Ｔａｔ変異体を発現している細胞から精製したプロテアソームにおいて観察された。

Ｔａｔ由来４７〜８６ペプチドは、ＬＭＰ２サブユニットをダウン変調するのに十分である。

イムノプロテアソームの触媒サブユニットの変調に関与するＴａｔの領域を同定するために、我々は、Ｔａｔの野生型配列を網羅している、ペプチド１〜３８、２１〜５８、および４７〜８６の効果を試験した。ジャーカット細胞を、２４時間、０．１μｇ／ｍｌのＴａｔ由来ペプチドで処置し、処置後、全細胞溶解液を、ウェスタンブロットにより、プロテアソーム発現についてアッセイした。図１４に示したように、Ｔａｔタンパク質およびペプチド４７〜８６は、ＬＭＰ２のダウンレギュレーションを誘導したが、一方、他のペプチドは、全く認識可能な効果を示さなかった。

結論
我々は、システイン２２の代わりにグリシンを有する（Ｔａｔ２２）、変異形態のＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質は、野生型Ｔａｔと同様に、プロテアソームのサブユニット組成を修飾することを示した。さらに、我々は、野生型Ｔａｔタンパク質から得られたペプチド４７〜８６は、ＬＭＰ２サブユニットをダウン変調するのに十分であることを実証した。我々は、近年、野生型ＴａｔによるＬＭＰ２ダウンレギュレーションにより、ウイルス感染細胞におけるＣＴＬエピトープの産生が異なることを示した（６）。さらに、我々は、Ｔａｔが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、異種抗原に対するＣＴＬ応答を修飾し、亜優性ＣＴＬエピトープの産生に傾くという証拠を得た（未公表の結果）。それ故、変異形態のＴａｔまたはＴａｔ由来ペプチドは、異種抗原に指向されたエピトープ特異的Ｔ細胞応答を増加させることを目的としたワクチン接種戦略において、野生型Ｔａｔの使用の重要な代替手段を提示し得る。

実施例２のための参考文献
1. Caputo, A. , J. G. Sodroski, and W. A. Haseltine. 1990. Constitutive expression'HTv-Ttafproteih inhuman Jurkat T'cclls using a BK virus vector. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome 3 : 372.
2. Fanales-Belasio, E. , S. Moretti, F. Nappi, G. Barillari, F. Micheletti, A. Cafaro, and B. Ensoli. 2002. Native HIV-1 Tat protein is selectively taken up by monocyte-derived dendritic cells and induces their maturation, Th-1 cytokine production and antigen presenting function.J : Immunol. 168 : 197.
3. Ensoli, B. , L. Buonaguro, G. Barillari, V. Fiorelli, R. Gendelman, R. A. Morgan, P. Wingfield, and R. C. Gallo. 1993. Release, uptake, and effect of extracellular human immunodeficiency virus type 1 Tat protein on cell growth and viral transactivation. J. Virol.67 : 277.
4. Gavioli, R. , T. Frisan, S. Vertuani, G. W. Bornkamm, and M. G. Masucci. 2001. c-Mycoverexpression activates alternative pathways for intracellular proteolysis in lymphoma cells.Nat. CellBiol. 3 : 283.
5. Micheletti, F., A. Canella, S. Vertuani, M. Marastoni, L. Tosi, S. Volinia, S. Traniello, and R. Gavioli. 2000. Supra-agonist peptides enhance the reactivation of memory cytotoxic T lymphocyte responses.J. Immunol. 165 : 4264.
6. Gavioli, R. , E. Gallerani, C. Fortini, M. Fabris, A. Bottoni, A. Canella, A. Bonaccorsi, M. Marastoni, F. Micheletti, A. Cafaro, P. Rimessi, A. Caputo, and B. Ensoli. 2004. HIV-1 Tat protein modulates cytotoxic T cell epitopes by modifying proteasome composition and enzymatic activity. J. Immunol. 173 : 3838.

実施例３
ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質は、異種ＨＩＶ−１構造ＧａｇおよびＥｎｖ抗原内の認識される細胞毒性Ｔ細胞エピトープを増加させる
序論
我々は、ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、イムノプロテアソームの触媒サブユニット組成を修飾することにより、ＣＴＬエピトープ階層を変調することを上記に示した。特に、ＬＭＰ７およびＭＥＣＬ１サブユニットのアップレギュレーション並びにＬＭＰ２サブユニットのダウン変調により、細胞内に発現されるかまたは外来の天然のＴａｔタンパク質の両方が、プロテアソームの主要なタンパク質分解活性を増加させ、結果として、亜優性ＣＴＬエピトープのより効率的な産生および提示がなされる。ＭＨＣ−Ｉ／エピトープ複合体の量は、エピトープ特異的ＣＴＬ応答の存在および強度を決定する上で、そして、ワクチン接種戦略のためのこれらの知見の生物学的関連性を確証するために重要であるので、我々は、Ｔａｔおよび卵白アルブミンの両方でワクチン接種したマウスにおける卵白アルブミンに対するエピトープ特異的ＣＴＬ応答を評価した。

我々は、Ｔａｔが、免疫優性エピトープに指向されたＣＴＬ応答を僅かに減少させ、一方で、卵白アルブミンのみでワクチン接種したマウスには存在しなかった亜優性および潜在性Ｔ細胞エピトープに指向されたＣＴＬ応答を誘導したことを見出した。これらの効果により、我々は、構造的ＨＩＶ遺伝子産物に対するＴ細胞応答に対するＴａｔの効果を活用した。我々は、Ｔａｔが、ＧａｇおよびＥｎｖ抗原内のＣＴＬエピトープの数を増加させることを見出した。従って、Ｔａｔは、ＨＩＶ抗原に対する新しいエピトープ特異的ＣＴＬ応答を誘導する新しいツールを提示し得、エイズに対する新しいワクチン接種戦略の開発のための共抗原として使用できる。

材料および方法
ＨＩＶ−１タンパク質
ヒトＴリンパ指向性ウイルス型ＩＩＩＢ単離株（ＢＨ１０クローン）からのＨＩＶ−１Ｔａｔおよび変異体Ｔａｔｃｙｓ２２（Ｃ→Ｇ）を、Ｅ．Ｃｏｌｉで発現させ、以前に記載（２）されたようにヘパリンアフィニティクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣにより精製した。Ｔａｔタンパク質を−８０℃で凍結乾燥して保存して酸化を防ぎ、使用前に脱ガス緩衝液中で復元し、記載（４）のように取り扱った。異なるロットのＴａｔを使用しても再現性のある結果が得られ、全ての場合において、エンドトキシン濃度は、検出不可能であった（検出閾値：０．０５ＥＵ／μｇ）。ＨＩＶ−１ＧａｇＳＦ２およびＨＩＶ−１ＥｎｖＳＦ２タンパク質は、それぞれ、Chiron社およびNIH AIDS Reagent Programから入手した（ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ ＳＦ１６２；７３６３番）。Ｇａｇ配列（ＨＩＶＳＦ ｐ５５）は、配列番号２６６に示す。Ｅｎｖ配列（ＨＩＶ−１ ＳＦ１６２ ｇｐ１２０）は、配列番号２６７（リンカーを含まず）および２８８（リンカーを含む）に示す。全ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ ｇｐ１６０ ＳＦ１６２配列を、配列番号２８７に示す。

合成ペプチド
ペプチドを、以前に記載（５）されたように、固相法により合成し、ＨＰＬＣにより９８％を超える純度まで精製した。構造確証は、元素分析およびアミノ酸分析および質量分析により実施した。

全Ｇａｇ（ＨＩＶ−１共通サブタイプＢＧａｇ完全セット、８１１７番）およびＥｎｖ配列（ＳＨＩＶ ＳＦ１６２Ｐ３ ｅｎｖセット；７６１９番およびＨＩＶ−１共通サブタイプＢＥｎｖ完全セット、９８４０番）に及び、１５アミノ酸長であり、１０〜１１アミノ酸が重複している、ＧａｇおよびＥｎｖペプチドは、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍにより提供された。ペプチドを、ＤＭＳＯに１０^−３Ｍで溶解し、−２０℃で維持し、使用前にＰＢＳで希釈した。Ｇａｇペプチドを表１に列挙し、Ｅｎｖペプチドを表２に列挙する。全配列に対するアミノ酸番号を、配列表からの適切な配列番号と一緒に示す。

マウスの免疫
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２^ｂ）（Harlan Nossan社、イタリアのUdine所在）を、フロイントアジュバント（初回注射ではＣＦＡ、その後の注射ではＩＦＡ）中の、２５μｇの卵白アルブミン（Sigma社）のみまたは天然の単量体の生物学的に活性なＴａｔタンパク質（それぞれ５および１０μｇ）と組み合わせて、背中の１部位の皮下に免疫した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２^ｄ）（Harlan社、イタリアのUdine所在）を、フロイントアジュバントまたはミョウバン中の、５μｇのＨＩＶ−１ＧａｇまたはＥｎｖタンパク質のみ、または、５μｇの天然の単量体の生物学的に活性なＴａｔタンパク質または変異体Ｔａｔｃｙｓ２２タンパク質と組み合わせて、背中の１部位の皮下に免疫した。各グループは、５匹の動物から構成された。免疫原は、１００μｌで、１、１４、および２８日目に皮下投与した。マウスを、最後のブースターの１０日後に屠殺した（３８日目）。実験の経過中に、動物を、１週間に２回、注射部位において、その全身状態について制御した（例えば、活発さ、食物摂取、バイタリティ、体重、運動性、毛の光沢）。対照または非処置マウスと比べて、免疫原を受けたマウスにおいては、局所有害反応の徴候も全身有害反応の徴候も観察されなかった。動物の使用は、欧州および施設ガイドラインに従った。

脾臓細胞精製
脾臓細胞は、フィルター（細胞ろ過器、７０μｍ、ナイロン、Becton Dickinson社）上に圧搾した脾臓から精製した。各実験グループの脾臓をプールした。１５４ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ_３、および０．１Ｍ ＥＤＴＡ（５ｍｌ／脾臓）で４分間室温で赤血球を溶解した後、細胞を、３％ＦＢＳ（Hyclone社）を含むＲＰＭＩ １６４０で希釈し、１０分間１２００ｒｐｍで遠心し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、抗原特異的細胞免疫応答の解析について直接使用した（新しい）。細胞応答は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再刺激後にも測定した。それ故、１４ｍｌ中の細胞（３〜５×１０^６／ｍｌ）を、Ｅｎｖ１０−ｍｅｒ（３μｇ／ｍｌ）で、またはＥｎｖペプチド（１５−ｍｅｒ）（１０^−６Ｍ）プールで５日間刺激し、その後、エリスポット解析した。

細胞毒性アッセイ
標的細胞を、Ｎａ_２ ^５１ＣｒＯ_４で９０分間３７℃で標識した。細胞毒性試験を、異なるエフェクター：標的比で三重に慣用的に行なった。特異的溶解％は、１００×（試料のｃｐｍ−培地のｃｐｍ）／（トリトンＸ−１００のｃｐｍ−培地のｃｐｍ）として計算した（６）。自発的放出は、常に、２０％未満であった。

エリスポットアッセイ
エリスポット（ＩＦＮ−γ）は、製造業者の指示に従って、ベクトン・ディッキンソン（マウスＩＦＮγエリスポットセット；５５１０８３番）により提供される商業的に入手可能なキットを使用して実施した。簡潔には、ニトロセルロース９６ウェルプレートを、５μｇ／ｍｌの抗ＩＦＮ−γで一晩４℃でコーティングした。次の日、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、１０％胎児ウシ血清を補充したＲＰＭＩ １６４０で２時間３７℃で遮断した。脾臓細胞（新しい細胞のアッセイでは２．５および５×１０^５／２００μｌ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激した細胞のアッセイでは５×１０^４／２００μｌ）を、ウェル（二重ウェル）に加え、ペプチド（１０^−６Ｍ）と共に１６時間３７℃でインキュベートした。対照は、コンカナバリンＡ（Sigma社；５μｇ／ｍｌ）（ポジティブ・コントロール）または培地のみ（ネガティブ・コントロール）と共にインキュベートした細胞により示された。スポットは、エリスポット解読器（Elivis社、ドイツ）を使用して解読した。結果は、１０^６個の細胞あたりのスポット形成単位（ＳＦＵ）の実際の数として表現する：［ペプチド処置ウェルのＳＦＵの平均数から、ネガティブ・コントロールのＳＦＵの平均数を差し引く］。

結果および考察
ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質による卵白アルブミンに対するエピトープ特異的ＣＴＬ応答のｉｎ ｖｉｖｏでの変調
我々は、実施例１において、Ｔａｔが、抗原加工機械を変化させることにより、抗原提示細胞の細胞表面におけるＭＨＣクラスＩ−エピトープ複合体の数に影響を及ぼし、それにより、異種抗原内の免疫優性および亜優性エピトープに対して指向されるＣＴＬ応答を変調することを実証した。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏでの知見の関連性を決定するために、エピトープ特異的ＣＴＬ応答の誘導に対するＴａｔの効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで調べた。

このために、免疫優性ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＩＩ）エピトープ（配列番号２６８）および可能性があるのは亜優性ＫＶＶＲＦＤＫＬ（ＫＶＶ）（配列番号２６９）および潜在性ＣＦＤＶＦＫＥＬ（ＣＦＤ）（配列番号２７０）エピトープ（７、８）に対して指向される卵白アルブミン（Ｏｖａ）に対するＫ^ｂ制限ＣＴＬ応答を、モデル系として使用した。事実、ＫＶＶおよびＣＦＤ特異的ＣＴＬは、Ｏｖａを用いたＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫化時には見出されておらず、これらの応答の欠失は、プロテアソームによるＫＶＶおよびＣＦＤエピトープの産生が低いことに起因することが示された（９、１０）。

Ｋ^ｂ制限Ｏｖａ由来エピトープに対するＣＴＬ応答の発生を解決するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｏｖａのみ、または、Ｔａｔタンパク質と組み合わせてワクチン接種した。その後、我々は、関連ペプチドで衝撃を与えたＥＬ４標的細胞に対して試験した新しい脾臓細胞におけるエピトープ特異的ＣＴＬ応答の存在を評価した（図２０）。Ｏｖａのみで免疫化したマウスから単離した脾臓細胞は、ＳＩＩエピトープで衝撃を与えた標的細胞は認識したが、ＫＶＶまたはＣＦＤエピトープで衝撃を与えた細胞は認識せず、このことは、ＣＴＬ応答が、主に、免疫優性ＳＩＩペプチドエピトープに対して指向されていることを確認する。これに対し、Ｏｖａ／Ｔａｔの組合せでワクチン接種したマウスから単離した脾臓細胞は、免疫優性ＳＩＩエピトープをより低い効率で認識し、一方で、亜優性ＫＶＶおよび潜在性ＣＦＤエピトープをそれぞれ提示している標的細胞を明確に認識した。対照マウスは、どのペプチドで衝撃を与えたＥＬ４細胞も全く認識しなかった。

ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質によるＥｎｖおよびＧａｇに対するエピトープ特異的Ｔ細胞応答のｉｎ ｖｉｖｏでの変調
ＧａｇおよびＥｎｖ抗原に指向されたエピトープ特異的Ｔ細胞応答に対するＴａｔの効果を解決するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＨＩＶ−１ＥｎｖもしくはＨＩＶ−１Ｇａｇタンパク質のみ、または、Ｔａｔタンパク質と組み合わせてワクチン接種した。ペプチド特異的Ｔ細胞応答の存在は、ＥｎｖおよびＧａｇタンパク質の全配列に及ぶペプチドプールで刺激した新しい脾臓細胞を使用して、ＩＦＮ−γエリスポットアッセイにより評価した。

ＥｎｖのみまたはＴａｔと組み合わせて免疫化したマウスから単離した新しい脾臓細胞は、どのＥｎｖ由来ペプチドプールを用いた刺激に対しても応答しなかった（データは示していない）。続いて、Ｅｎｖでワクチン接種したマウスの脾臓細胞を、免疫優性Ｋ^ｄ制限ＲＧＰ ＣＴＬエピトープ（アミノ酸３１１〜３２０）で、または、全Ｅｎｖ配列を網羅するペプチドプールで刺激した。５日後、細胞培養液を、ペプチドを基礎としたマトリックスアプローチを使用してペプチドプールで刺激した後、ＩＦＮ−γエリスポットにより特異性について試験した。マトリックスは、各ペプチドが、２つの別々のプールに存在するというペプチドプールからなる（図２１参照）。

図１６に示したように、Ｅｎｖのみで免疫化した後、ＩＦＮγ応答が、Ｅｎｖプール１、５、１６、１７、２１、２２、２５、および２６に対して検出された。同様に、Ｔａｔ＋ＥｎｖおよびＴａｔＣｙｓ２２＋Ｅｎｖでの免疫化後、ＩＦＮγ応答が、同じＥｎｖプール１、５、１６、１７、２１、２２、２５、および２６に対して検出された。しかし、Ｔａｔ野生型およびＴａｔＣｙｓ２２の存在下で、Ｅｎｖプール４、７、１４、１５、１８、１９、２３、および２７に対する追加の応答が検出された。

これらの結果により、ＴａｔおよびＴａｔＣｙｓ２２は、一般に、Ｅｎｖに対する免疫応答を広げることが示される。

ＧａｇのみまたはＧａｇおよびＴａｔで免疫化したマウスから単離した新しい脾臓細胞を、ペプチドを基礎としたマトリックスアプローチを使用してペプチドプールで刺激し、ＩＦＮ−γエリスポットによりアッセイした。マトリックスは、各ペプチドが、２つの別々のプールで存在するようなペプチドプールからなり（図２２参照）、従って、内部ポジティブ・コントロールが提供される。

応答は、対照ウェルのＳＦＵの平均数の少なくとも３倍であった場合には陽性と考え、１０^６個の細胞あたりＳＦＵは５０以上でなければならなかった。

図１７に示したように、Ｇａｇのみで免疫化したマウスは、プール５、６、９、１０、１５、１６、１７、および１８に対して応答し、一方、ＧａｇおよびＴａｔの両方で免疫化したマウスは、プール３、５、６、９、１０、１３、１５、１６、１８、および１９に対して応答した。対照マウスは、どのプールにも応答しなかった（示していない）。以前の研究において、Ｇａｇに対する主要なＫ^ｄ制限ＣＴＬ応答は、プール５、６、および１６に含まれるＡＭＱペプチド（アミノ酸１９７〜２０５）に、並びに、プール４、５、および１７に含まれるＴＴＳペプチド（アミノ酸２３９〜２４７）に指向されることが実証されている。

興味深いことに、ＴａｔおよびＧａｇでワクチン接種したマウスの脾臓細胞は、Ｇａｇのみでワクチン接種したマウスに比べて、プール１７（ＴＴＳペプチドを含む）には応答せず、一方、プール１３および１９は認識した。その後、我々は、マトリックスアプローチにより、可能性ある標的として同定した３６個の個々のペプチドをアッセイした。図１８に示したように、Ｇａｇのみで免疫化したマウスの脾臓細胞は、６個の異なるペプチド（Ｇａｇ４２、Ｇａｇ４９、Ｇａｇ５０、Ｇａｇ６５、Ｇａｇ７５、Ｇａｇ７６）に応答し、その４個（Ｇａｇ４９およびＧａｇ５０；Ｇａｇ７５およびＧａｇ７６）は、２個の異なる重複ペプチドを含み得、このことは、Ｇａｇワクチン接種により誘導されるＴ細胞応答が、４個の異なるＴ細胞エピトープに指向されることを示唆する。これに対し、ＧａｇおよびＴａｔで免疫化したマウスは、７個の異なるペプチド（Ｇａｇ２０、Ｇａｇ３９、Ｇａｇ４２、Ｇａｇ４９、Ｇａｇ６９、Ｇａｇ７６、Ｇａｇ８０）に応答し、このことは、Ｇａｇ＋Ｔａｔワクチン接種により誘導されるＴ細胞応答が、７個の異なるＴ細胞エピトープに指向し、これはＧａｇのみでのワクチン接種よりも３個多い。

変異体Ｔａｔタンパク質（Ｔａｔｃｙｓ２２）によるＥｎｖおよびＧａｇに対するエピトープ特異的Ｔ細胞応答のｉｎ ｖｉｖｏでの変調
次の実験セットにおいて、我々は、２２位においてシステインの代わりにグリシンを有するＴａｔ変異体（Ｔａｔｃｙｓ２２と称する）の効果を評価した。Ｔａｔｃｙｓ２２は、野生型Ｔａｔと比べて、ＨＩＶ−１ＬＴＲのトランス活性化には全く効果を及ぼさず、潜伏感染の再活性化も誘導しない。

Ｇａｇに指向されたエピトープ特異的Ｔ細胞応答に対するＴａｔｃｙｓ２２の効果を解決するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスもまた、ＨＩＶ−１Ｇａｇタンパク質のみ、または、Ｔａｔｃｙｓ２２タンパク質と組み合わせてワクチン接種し、上記したようにアッセイした。

図１９に示したように、ＧａｇおよびＴａｔｃｙｓ２２で免疫化したマウスから単離した脾臓細胞は、Ｇａｇのみで免疫化したマウスの脾臓細胞よりも多くのペプチドプールを認識した。特に、Ｔａｔｃｙｓ２２は、プール３、８、１３、および１９に指向されたＧａｇ特異的応答を誘導し、これは、Ｇａｇのみでの免疫化後には認識されなかった。以前のように、その後、我々は、マトリックスアプローチにより同定した３６個の個々のペプチド（図２０）をアッセイし、我々は、ＧａｇをＴａｔｃｙｓ２２と組み合わせて免疫化したマウスが、１６個の異なるペプチドを認識し（Ｇａｇ２０、Ｇａｇ２１、Ｇａｇ３９、Ｇａｇ４２、Ｇａｇ４９、Ｇａｇ５０、Ｇａｇ５３、Ｇａｇ６０、Ｇａｇ６１、Ｇａｇ６４、Ｇａｇ６５、Ｇａｇ６９、Ｇａｇ７４、Ｇａｇ７５、Ｇａｇ７６、Ｇａｇ８０）、その中の１０個（Ｇａｇ２０およびＧａｇ２１；Ｇａｇ４９およびＧａｇ５０；Ｇａｇ６０およびＧａｇ６１；Ｇａｇ６４およびＧａｇ６５；Ｇａｇ７５およびＧａｇ７６）は、５個の異なる重複ペプチドを含み得、このことは、Ｇａｇ＋Ｔａｔｃｙｓ２２でのワクチン接種により誘導されるＴ細胞応答が、１１個の異なるＴ細胞エピトープに指向し、これはＧａｇのみで免疫化したマウスよりも７個多く、Ｇａｇおよび野生型Ｔａｔで免疫化したマウスよりも４個多い。

結論
我々は、天然ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質および変異体Ｔａｔｃｙｓ２２タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＨＩＶ−１ＧａｇおよびＥｎｖ抗原に対するエピトープ特異的Ｔ細胞応答を変調することを示した。特に、我々は、Ｇａｇを野生型Ｔａｔまたは変異体Ｔａｔｃｙｓ２２と組み合わせてワクチン接種したマウスは、それぞれ７個または１１個のＴ細胞Ｇａｇ由来エピトープに応答し、これに対して、Ｇａｇのみでワクチン接種したマウスでは、４個のＴ細胞Ｇａｇ由来エピトープに応答した。同様に、Ｅｎｖを、野生型Ｔａｔまたは変異体Ｔａｔｃｙｓ２２と組み合わせてワクチン接種したマウスは、１２個のＥｎｖ由来ペプチドエピトーププールに応答し、これに対し、Ｅｎｖのみでワクチン接種したマウスでは、８個のＥｎｖ由来ペプチドプールに応答した。

これらの観察は、我々の以前の知見（２、３、１１、１２）と合わせて考えると、Ｔａｔが、抗原であるだけではなく、異種抗原に対するＴ細胞応答を増加させることのできる新規アジュバントでもあることを示唆する。それ故、Ｔａｔタンパク質並びに変異体Ｔａｔｃｙｓ２２は、Ｔ細胞により認識されるエピトープのスペクトルを広げることを目的としたＨＩＶ−１ワクチン戦略における重要なツールを示し得る。

実施例３のための参考文献
1. Wu, Y., and J. W. Marsh. 2003. Gene transcription in HIV infection. Microbes
Infect. 5: 1023.
2. Fanales-Belasio, E. , S. Moretti, F. Nappi, G. Barillari, F. Micheletti, A. Cafaro, and B. Ensoli. 2002. Native HIV-1 Tat protein is selectively taken up by monocyte-derived dendritic cells and induces their maturation,Th-1 cytokine production andantigen presenting function. J. Immunol. 168 : 197.
3. Gavioli, R. , E. Gallerani, C. Fortini, M. Fabris, A. Bottoni, A. Canella, A. Bonaccorsi, M. Marastoni, F. Micheletti, A. Cafaro, P. Rimessi, A. Caputo, and B. Ensoli. 2004. HIV-1 Tat protein modulates cytotoxic T cell epitopes by modifying proteasome composition and enzymatic activity. J.Immunol. 173 : 3838.
4. Ensoli, B. , L. Buonaguro, G. Barillari, V. Fiorelli, R. Gendelman, R. A. Morgan, P. Wingfield, and R. C. Gallo. 1993. Release, uptake, and effect of extracellular human immunodeficiency virus type 1 Tat protein on cell growth and viral transactivation.J.ViroZ. 67 :277.
5. Micheletti, F. , A. Canella, S. Vertuani, M. Marastoni, L. Tosi, S. Volinia, S. Traniello, and R. Gavioli. 2000. Supra-agonist peptides enhance the reactivation of memory cytotoxic T lymphocyte responses.J.Immunol. 165 : 4264.
6. Gavioli, R. , M. G. Kurilla, P. O. de Campos-Lima, L. E. Wallace, R. Dolcetti,
R. J. Murray, A. B. Rickinson, and M. G. Masucci. 1993. Multiple HLA Al 1- restricted cytotoxic T-lymphocyte epitopes of different immunogenicities in the Epstein-Barr virus-encoded nuclear antigen 4. J. Virol. 67 : 1572.
7. Chen, W. , S. Khilko, J. Fecondo, D. H. Margulies, and J. McCluskey. 1994. Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide-affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues.J. Exp.Med. 180 : 1471.
8. Lipford, G. B. , M. Hoffman, H. Wagner, and K. Heeg. 1993. Primary in vivo responses to ovalbumin. J. ImmunoL 150 : 1212.
9. Niedermann, G. , S. Butz, H. G. Ihlenfeldt, R. Grimm, M. Lucchiari, H. Hoschutzky, G. Jung, B. Maier, and K. Eichmann. 1995. Contribution of proteasome- mediated proteolysis to the hierarchy of epitopes presented by major histocompatibility complex class I molecules. Immunity 2:289.
10. Mo, A. X. Y., S. F. L. van Lelyveld, A. Craiu, and K. L. Rock. 2000. Sequences that flank subdominant and cryptic epitopes influence the proteolytic generation of MHC class I-presented peptides.J.Immunol. 164 : 4003.
11. Cafaro, A. , A. Caputo, C. Fracasso, M. T. Maggiorella, D. Goletti, S. Baroncelli, M. Pace, L.Sernicola, M. L. Koanga-Mogtomo, M. Betti, A. Borsetti, R. Belli, L. Akerblom, F. Corrias, S. Butto, J. Heeney, P. Verani, F. Titti, and B. Ensoli. 1999. Control of SHIV-89. 6P-infection of cynomolgus monkeys by HIV-1 Tat protein vaccine. Nat. Med. 5 : 643.
12. Cafaro, A. , F. Titti, C. Fracasso, M. T. Maggiorella, S. Baroncelli, A. Caputo, D. Goletti, A. Borsetti, M. Pace, E. Fanales-Belasio, B. Ridolfi, D. R. Negri, L. Sernicola, R. Belli, F. Corrias, I. Macchia, P. Leone, Z. Michelini, P. ten Haaft, S. Butto, P. Verani, and B. Ensoli. 2001. Vaccination with DNA containing tat coding sequences andunmethylated CpG motifs protects cynomolgus monkeys upon infection with simian/human immunodeficiency virus(SHIV89.6P). Vaccine19 : 2862.

図面の説明
図１は、形質導入ＭＩＮおよびＭＯＮ ＬＣＬ細胞におけるＴａｔＤＮＡおよびＲＮＡ解析を示す。 図１Ａ：ＰＣＲ解析を、Ｔａｔ１およびＴａｔ２プライマーを使用して、形質導入したおよび形質導入していないＭＩＮおよびＭＯＮ−ＬＣＬ細胞からのゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ）で実施した。ｐＣＶ−ｔａｔプラスミドＤＮＡ（０．１ｎｇ）を、ポジティブ・コントロールとして増幅した。増幅産物は２４０ｂｐである。分子量マーカー（ＭＷ）：ジーンルーラー１００ｂｐＤＮＡラダー（MBI Fermentas社）。 図１Ｂ：ＲＴ−ＰＣＲ解析を、Ｔａｔ１およびＴａｔ２プライマーを使用して、形質導入したおよび形質導入していないＬＣＬ細胞からのｃＤＮＡで実施した。ｐＣＶ−ＴａｔプラスミドＤＮＡ（０．１ｎｇ）を、ポジティブ・コントロールとして増幅した。分子量マーカー（ＭＷ）：ジーンルーラー１００ｂｐＤＮＡラダー（MBI Fermentas社）。パネルｃ：ノーザンブロット解析：形質導入したおよび形質導入していないＭＩＮおよびＭＯＮ−ＬＣＬ細胞から精製した全ＲＮＡ（４０μｇ）を、プローブとして^３２Ｐ標識ＴａｔＰＣＲ産物を用いてハイブリダイズした。分子サイズマーカーとしての２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡの位置を示す。 図２は、ＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子で形質導入した細胞におけるプロテアソームサブユニットの発現を示す。 左パネル：ｐＢａｂｅＰ（ＭＩＮ−０およびＭＯＮ−０）またはｐＢａｂｅＰ−Ｔａｔ（ＭＩＮ−ＴａｔおよびＭＯＮ−Ｔａｔ）で形質導入したＭＩＮおよびＭＯＮ ＬＣＬ細胞からの細胞溶解液からの等量の全タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロースフィルターに転写し、α−２サブユニット、ＰＡ２８α、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、およびＭＥＣＬ１に特異的なｍＡｂまたはポリクローナル抗血清を用いてプローブした。右パネル：特異的バンドの強度は、密度測定計により測定した。データは、対照細胞と比較して、Ｔａｔ発現細胞の光学密度の増加％として表現する。実施した４回の中の１回の代表的な実験を示す。 図３は、ＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子で形質導入した細胞から精製したプロテアソームの活性を示す。ｐＢａｂｅＰ（ＭＩＮ−０およびＭＯＮ−０）またはｐＢａｂｅＰ−Ｔａｔ（ＭＩＮ−ＴａｔおよびＭＯＮ−Ｔａｔ）で形質導入したＭＩＮおよびＭＯＮ ＬＣＬ細胞の細胞溶解液からの精製プロテアソームを、基質としてＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣおよびＡｃ−ＹＶＡＤ−ＡＭＣを使用して、キモトリプシン様、トリプシン様、および酸性後活性について試験した。ペプチド基質（１００μＭ）を、５μｇの精製プロテアソームと共に、３７℃で、３０分間インキュベートした。データは、任意の蛍光単位として表現する。実施した３回の中の１回の代表的な実験を示す。 図４は、ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質で処置した細胞におけるプロテアソームサブユニットの発現を示す。 左パネル：指定した濃度の天然Ｔａｔタンパク質で処置したＭＩＮおよびＭＯＮ ＬＣＬ細胞からの細胞溶解液からの等量の全タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロースフィルターに転写し、α−２サブユニット、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、およびＭＥＣＬ１に特異的なｍＡｂまたはポリクローナル抗血清を用いてプローブした。右パネル：特異的バンドの強度は、密度測定計により測定した。データは、対照細胞と比較して、Ｔａｔ発現細胞の光学密度の増加％として表現する。実施した３回の中の１回の代表的な実験を示す。 図５は、Ｔａｔタンパク質で処置したマウスから単離した脾臓細胞におけるＬＭＰ２サブユニットの発現を示す。 マウスを、天然Ｔａｔタンパク質（パネルａ）または酸化Ｔａｔ（パネルｂ）で処置し、３回の筋肉内処置の後、脾臓細胞を単離および溶解した。細胞溶解液からの等量の全タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロースフィルターに転写し、ＬＭＰ２に特異的な抗体を用いてプローブした。ＬＭＰ２バンドの強度は、密度測定計により評価し、α−サブユニットに特異的なポリクローナル血清を用いて評価した対応するプロテアソームの発現に対して標準化した。データは、６匹の未処置マウスからの対照脾臓細胞におけるＬＭＰ２発現の平均と比較した、光学密度の増加％として表現する。 図６は、ＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子で形質導入した細胞のＣＴＬによる殺滅を示す。 ｐＢａｂｅＰ（ＭＩＮ−０およびＭＯＮ−０）またはｐＢａｂｅＰ−Ｔａｔ（ＭＩＮ−ＴａｔおよびＭＯＮ−Ｔａｔ）で形質導入したＨＬＡ−Ａ２、−Ａ１１陽性ＭＩＮおよびＭＯＮ ＬＣＬ細胞を、ＨＬＡ−Ａ１１提示、ＥＢＮＡ４由来ＩＶＴおよびＡＶＦエピトープ、ＨＬＡ−Ａ２提示Ｌｍｐ１由来ＹＬＱエピトープ、およびＨＬＡ−Ａ２提示Ｌｍｐ２由来ＣＬＧエピトープにそれぞれ特異的なＣＴＬの細胞毒性アッセイにおいて標的として使用した。結果は、特異的溶解％として表現する。実施した３回の中の１回の代表的な実験を示す。 図７は、外来性ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質で処置した細胞のＣＴＬによる殺滅を示す。 Ｔａｔで処置したまたは処置していない、ＨＬＡ−Ａ２、−Ａ１１陽性ＭＩＮ ＬＣＬ細胞を、ＨＬＡ−Ａ１１提示、ＥＢＮＡ４由来ＩＶＴおよびＡＶＦエピトープ、ＨＬＡ−Ａ２提示Ｌｍｐ１由来ＹＬＱエピトープ、およびＨＬＡ−Ａ２提示Ｌｍｐ２由来ＣＬＧエピトープに特異的なＣＴＬの細胞毒性アッセイにおいて標的として使用した。結果は、特異的溶解％として表現する。実施した３回の中の１回の代表的な実験を示す。 Ｔａｔ発現細胞から精製したプロテアソームによるＣＬＧエピトープ前駆体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分解。 パネルＡ：ＣＬＧ＋５ペプチドを、ＭＩＮ−ＴａｔからまたはＭＩＮ−０ＬＣＬから精製したプロテアソームと共にインキュベートした。前駆体分解は、種々の時点で追跡し、ＣＬＧ＋５の分解は、ＨＬＰＣ分析により評価した。データは、分解％として表現する。３回の独立した実験の結果の平均を示す。 パネルＢ：１２０分間の分解の後に得られた消化産物を、ＨＰＬＣにより精製し、指定した画分を回収し、ＣＬＧ特異的ＣＴＬを活性化する能力について、ＩＦＮ−γエリスポットにより試験した。データは、１０^６個の細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表現する。３重に実施した、３回の独立した実験の結果の平均を示す。 図９は、ＯｖａおよびＴａｔタンパク質でワクチン接種したマウスにおけるＯｖａ特異的ＣＴＬ応答を示す。 マウスを、ＯｖａのみまたはＯｖａおよびＴａｔタンパク質を用いてワクチン接種した。２回の免疫化後、新しい脾臓細胞をプールし、ＳＩＩ、ＫＶＶ、またはＣＦＤペプチドで衝撃を与えたＥＬ４細胞に対する細胞毒性について試験した。データは、未処置ＥＬ４細胞の溶解を差し引くことにより計算した特異的溶解％として表現する（常に１０％を下回る）。２回の独立した実験の平均は三重に実施した。 図１０は、ＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子を発現するジャーカット細胞におけるプロテアソームの発現を示す。 図１０Ａ：ベクターのみ（ＪＳＬ３−０）またはｔａｔ遺伝子（ＪＳＬ３−Ｔａｔ）でトランスフェクトしたジャーカット細胞からの等量の精製プロテアソーム（１μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロースフィルターに転写し、α−２サブユニット、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、およびＭＥＣＬ１に特異的なｍＡｂまたはポリクローナル抗血清を用いてプローブした。実施した４回の中の１回の代表的な実験を示す。 図１０Ｂ：特異的バンドの強度を、密度測定計により測定した。データは、対照細胞からのプロテアソームと比較した、Ｔａｔ発現細胞から精製したプロテアソームで検出された特異的バンドの光学密度の増加％として表現する。３回の独立した実験の平均＋／−ＳＥＭを示す。 ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質で処置したジャーカット細胞におけるプロテアソームサブユニットの発現。 ジャーカット細胞を、１２時間（図１１Ａ）または２４時間（図１１Ｂ）、３７℃で、０．０１、０．１、または１μｇ／ｍｌの天然Ｔａｔタンパク質で処置した。等量のプロテアソーム（１μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロースフィルターに転写し、α−２およびＬＭＰ２サブユニットに特異的なｍＡｂを用いてプローブした。実施した３回の中の１回の代表的な実験を示す。特異的バンドの強度は、密度測定計により測定した。データは、対照細胞（ＮＴ）およびＴａｔ処置細胞で検出された特異的バンドの光学密度で表現する。 ２４時間１μｇ／ｍｌのＴａｔで処置したまたは処置していないジャーカット細胞におけるプロテアソームの酵素活性。 指定した細胞系の細胞溶解液から精製したプロテアソーム（２．５μｇ）を、３０分間、３７℃で、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣ、およびＡｃ−ＹＶＡＤ−ＡＭＣと共にインキュベートし、キモトリプシン様、トリプシン様、および酸性後活性をそれぞれ評価した。データは、任意の蛍光単位として表現する。 野生型または変異体ＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子を発現しているジャーカット細胞におけるプロテアソームの発現。 図１３Ａ：ベクターのみ（Ｖｅｃｔ）でトランスフェクトした、または野生型Ｔａｔ（Ｔａｔ）、変異体Ｔａｔ２２（ｇｌｙで置換したｃｙｓ２２）、変異体３７（ｓｅｒで置換したｃｙｓ３７）、または二重変異体Ｔａｔ２２／３７を発現しているジャーカット細胞からの等量の精製プロテアソーム（１μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロースフィルターに転写し、α−２サブユニットおよびＬＭＰ２サブユニット特異的ｍＡｂを用いてプローブした。実施した４回の中の１回の代表的な実験を示す。 図１３Ｂ：特異的バンドの強度を、密度測定計により測定した。データは、対照細胞からのプロテアソームと比較した、Ｔａｔ発現細胞から精製したプロテアソームで検出された特異的バンドの光学密度の増加％として表現する。 Ｔａｔ由来４７〜８６ペプチドは、ＬＭＰ２サブユニットをダウン変調するのに十分である。 ジャーカット細胞を、２４時間、０．１μｇ／ｍｌで、Ｔａｔで、または、Ｔａｔの野生型配列を網羅するペプチド１〜３８、２１〜５８、および４７〜８６で処置した。全細胞溶解液からの等量のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロースフィルターに転写し、α−２サブユニットおよびＬＭＰ２サブユニット特異的ｍＡｂを用いてプローブした。実施した３回の中の１回の代表的な実験を示す。 ＯｖａのみまたはＴａｔタンパク質と組み合わせてワクチン接種したマウスにおけるＯｖａ特異的ＣＴＬ応答。 マウスを、２５μｇの卵白アルブミンのみ、または、５および１０μｇのＴａｔタンパク質と組み合わせて免疫化した。２回の免疫化の後、新しい脾臓細胞をプールし、ＳＩＩ、ＫＶＶ、またはＣＦＤペプチドで衝撃を与えたＥＬ４細胞に対して細胞毒性を試験した。データは、未処置ＥＬ４細胞の溶解を差し引くことにより計算した特異的溶解％として表現する（常に１０％を下回る）。三重に実施した、３回の独立した実験の結果の平均を示す。 Ｔａｔは、Ｅｎｖに対する免疫応答を広げる。 マウス（ｎ＝５）を、Ｔａｔ、ＴａｔＣｙｓ２２、およびＥｎｖタンパク質のみ、または、材料および方法で記載したように組み合わせて皮下に免疫化した。免疫化マウスの脾臓細胞（脾臓のプール）を、Ｅｎｖペプチドプールで刺激し、各プール、媒体のみ（ネガティブ・コントロール）、またはコンカナバリンＡ（ポジティブ・コントロール）の存在下でＩＦＮγ産生について試験した。結果を、実施例３に記載したように、ネガティブ・コントロールのＳＦＵ／１０^６個の細胞から差し引いた、スポット形成単位（ＳＦＵ）／１０^６個の細胞の数として表現する。１０^６個の細胞あたり５０以上のＳＦＵの応答を陽性と考える。黒いボックスは反応性プールを示す。 ＧａｇのみまたはＴａｔタンパク質と組み合わせてワクチン接種したマウスにおけるＧａｇ特異的ＩＦＮγＴ細胞応答。 マウス（ｎ＝５）を、５μｇのＧａｇのみまたは５μｇのＴａｔタンパク質と組み合わせて免疫化した。３回の免疫化後、新しい脾臓細胞をプールし、指定したＧａｇペプチドプールで刺激し、エリスポットアッセイによりＩＦＮγ放出について試験した。結果は、実施例３に記載したように、ネガティブ・コントロールのＳＦＵ／１０^６個の細胞から差し引いた、ＳＦＵ／１０^６個の細胞として表現する。１０^６個の細胞あたり５０以上のＳＦＵの応答を陽性と考える。 ＧａｇのみまたはＴａｔタンパク質と組み合わせてワクチン接種したマウスにおけるＧａｇ特異的ＩＦＮγＴ細胞応答。 マウス（ｎ＝５）を、５μｇのＧａｇのみまたは５μｇのＴａｔタンパク質と組み合わせて免疫化した。３回の免疫化後、新しい脾臓細胞をプールし、指定したＧａｇペプチドプールで刺激し、エリスポットアッセイによりＩＦＮγ放出について試験した。結果は、実施例３に記載したように、ネガティブ・コントロールのＳＦＵ／１０^６個の細胞から差し引いた、ＳＦＵ／１０^６個の細胞として表現する。１０^６個の細胞あたり５０以上のＳＦＵの応答を陽性と考える。 ＧａｇのみまたはＴａｔｃｙｓ２２タンパク質と組み合わせてワクチン接種したマウスにおけるＧａｇ特異的ＩＦＮγＴ細胞応答。 マウス（ｎ＝５）を、５μｇのＧａｇのみまたは５μｇのＴａｔｃｙｓ２２タンパク質と組み合わせて免疫化した。３回の免疫化後、新しい脾臓細胞をプールし、指定したＧａｇペプチドプールで刺激し、エリスポットアッセイによりＩＦＮγ放出について試験した。結果は、実施例３に記載したように、ネガティブ・コントロールのＳＦＵ／１０^６個の細胞から差し引いた、ＳＦＵ／１０^６個の細胞として表現する。１０^６個の細胞あたり５０以上のＳＦＵの応答を陽性と考える。 ＧａｇのみまたはＴａｔｃｙｓ２２タンパク質と組み合わせてワクチン接種したマウスにおけるＧａｇ特異的ＩＦＮγＴ細胞応答。 マウス（ｎ＝５）を、５μｇのＧａｇのみまたは５μｇのＴａｔｃｙｓ２２タンパク質と組み合わせて免疫化した。３回の免疫化後、新しい脾臓細胞をプールし、指定したＧａｇペプチドプールで刺激し、エリスポットアッセイによりＩＦＮγ放出について試験した。結果は、実施例３に記載したように、ネガティブ・コントロールのＳＦＵ／１０^６個の細胞から差し引いた、ＳＦＵ／１０^６個の細胞として表現する。１０^６個の細胞あたり５０以上のＳＦＵの応答を陽性と考える。 ＨＩＶ−１Ｅｎｖペプチドのためのペプチドマトリックス準備。 プール１〜７およびプール１２〜３０は、２つの独立したプールが１つのペプチドを共通して含むように設計した。 プール１は、Ｅｎｖ１〜Ｅｎｖ１９＋Ｅｎｖ８７７１、８７７２、８７７３を含む。 プール２は、Ｅｎｖ２０〜Ｅｎｖ３８＋Ｅｎｖ８７８９、８７９０、８７９１を含む。 プール３は、Ｅｎｖ３９〜Ｅｎｖ５７＋Ｅｎｖ８８０５、８８０６を含む。 プール４は、Ｅｎｖ５８〜Ｅｎｖ７６＋Ｅｎｖ８８２２を含む。 ＨＩＶ−１Ｇａｇペプチドのためのペプチドマトリックス準備。実施例３においてＧａｇペプチドと共に使用するために使用されるマトリックスを示す。

Claims (34)

1. 免疫優性エピトープおよび亜優性エピトープの両方を含む複数のエピトープを有する抗原性物質の亜優性エピトープおよび免疫優性エピトープの両方に対する免疫応答を誘発するのに適したワクチンの調製における、Ｔａｔ、生物学的に活性な等価体、またはそれらの前駆体の使用であって、前記ワクチンは、その亜優性エピトープをコードするまたは含む抗原性物質の少なくとも一部を含む、使用。
2. 複数の感染性生物株の亜優性エピトープおよび免疫優性エピトープの両方に対する免疫応答を誘発するのに適したワクチンの調製における、Ｔａｔ、その生物学的に活性な等価体、またはその前駆体の使用であって、前記ワクチンは少なくとも１種類の前記生物株の抗原性材料を含み、該材料は亜優性エピトープをコードするまたは含む、使用。
3. 前記亜優性エピトープは、クリプティック・エピトープである、請求項１または２に記載の使用。
4. 前記Ｔａｔは、配列番号２８４に示されたものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
5. 前記Ｔａｔは、配列番号２８４に示されたものの変異体および／または断片である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
6. 前記変異体Ｔａｔは、配列番号２８４に９０％の相同性を有する、請求項５に記載の使用。
7. 前記Ｔａｔは、配列番号２８４の２２位で変異している、請求項５または６に記載の使用。
8. システイン残基が２２位に存在し、グリシンにより置き換えられている、請求項７に記載の使用。
9. 配列番号２８４のアミノ酸番号４７〜８６を含むまたはコードする、前記Ｔａｔの断片を使用する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
10. 前記断片は、配列番号２８４のアミノ酸番号４７〜８６からなるポリペプチドである、請求項９に記載の使用。
11. 前記ワクチンは、前記Ｔａｔの発現配列を、そのベクターと一緒に含み、前記発現配列は、標的細胞において前記Ｔａｔを発現させるのに適したものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
12. 前記Ｔａｔは、誘導性プロモーターの制御下にある、請求項１１に記載の使用。
13. 前記Ｔａｔは、ペプチドまたはタンパク質として提供される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
14. 前記抗原は、ＨＩＶから得られるかまたはＨＩＶを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
15. 前記抗原は、インフルエンザまたはＳＡＲＳから得られるかまたはインフルエンザまたはＳＡＲＳを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
16. 前記抗原性物質は、腫瘍または免疫介在性疾患に関連している、請求項１に記載の使用。
17. 前記抗原は、植物、寄生虫、真菌、細菌またはウイルスから得られる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
18. 前記抗原は、細胞内病原体から得られるかまたは細胞内病原体を含む、請求項１６に記載の使用。
19. 前記ペプチドは、Ｇａｇまたはその断片から得られるかまたはＧａｇまたはその断片を含む、請求項１４に記載の使用。
20. 前記ペプチドは、Ｅｎｖまたはその断片から得られるかまたはＥｎｖまたはその断片を含む、請求項１４に記載の使用。
21. 前記ワクチンは、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、または皮下に投与される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用。
22. 前記ワクチンは、プライムブースト治療法において使用される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用。
23. 前記Ｔａｔ、その等価体、または前駆体は、目的とするワクチンのレシピエントにおいて、ＬＭＰ２のレベルをダウンレギュレートできる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の使用。
24. 前記Ｔａｔを投与して、前記ＬＭＰ２サブユニットの発現をダウンレギュレートすることにより、プロテアソームサブユニット組成物を変調するためのワクチンの使用。
25. 複数のエピトープを有する抗原性物質の亜優性エピトープおよび免疫優性エピトープの両方に対する免疫応答を誘発するためのワクチンであって、前記ワクチンは、Ｔａｔ、生物学的に活性な等価体、またはその前駆体を含み、前記エピトープは、免疫優性エピトープおよび亜優性エピトープの両方を含み、前記抗原性物質の少なくとも一部は、その亜優性エピトープをコードするまたは含む、前記ワクチン。
26. 複数の感染性生物株の亜優性エピトープおよび免疫優性エピトープの両方に対する免疫応答を誘発するためのワクチンであって、前記ワクチンは、Ｔａｔ、その生物学的に活性な等価体、またはその前駆体、および少なくとも１種類の生物株由来の抗原性材料を含み、該材料は、亜優性エピトープをコードするまたは含む、前記ワクチン。
27. 前記Ｔａｔは、配列番号２８４に示されたものである、請求項２５または２６に記載のワクチン。
28. 亜優性エピトープは、クリプティック・エピトープである、請求項２６または２７に記載のワクチン。
29. 請求項１〜２４のいずれかにおいて使用するためのワクチン。
30. 前記Ｔａｔおよび前記抗原は、タンパク質またはペプチドとして提供される、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のワクチン。
31. 株間の免疫を刺激するための、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のワクチンの使用。
32. 請求項１〜２４のいずれか一項に定義したような前記Ｔａｔおよび前記抗原並びにそのビヒクルを含む、ワクチン。
33. 複数の感染性生物株に対する免疫応答を提供する方法であって、
    少なくとも１種類の前記生物株由来の抗原性材料であって、亜優性エピトープをコードするまたは含んでいる抗原性材料；および
    Ｔａｔ、その生物学的に活性な等価体、またはその前駆体、を含むワクチンを投与することを含む、方法。
34. 前記Ｔａｔは、配列番号２８４の変異体または断片である、請求項３３に記載の方法。