JP2007312621A - Method for detecting base pair mismatch - Google Patents
Method for detecting base pair mismatch Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007312621A JP2007312621A JP2006143040A JP2006143040A JP2007312621A JP 2007312621 A JP2007312621 A JP 2007312621A JP 2006143040 A JP2006143040 A JP 2006143040A JP 2006143040 A JP2006143040 A JP 2006143040A JP 2007312621 A JP2007312621 A JP 2007312621A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid molecule
- stranded nucleic
- strand
- double
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、医薬品や検査薬、診断薬等の分野において利用し得る、DNAやRNAなどの核酸の配列情報を解析するための方法に関する。より詳しくは、疾病や病変の原因を突き止め、その修復処置を講じるための、例えば、検体核酸の一塩基変異、一塩基挿入、一塩基欠損等の微少の核酸配列の違いを検出するための方法に関する。 The present invention relates to a method for analyzing sequence information of nucleic acids such as DNA and RNA, which can be used in the fields of pharmaceuticals, test drugs, diagnostic drugs and the like. More specifically, a method for detecting the cause of a disease or lesion and taking a repair procedure thereof, for example, detecting a slight difference in nucleic acid sequence such as a single base mutation, single base insertion, single base deletion, etc. of a sample nucleic acid. About.
近年、ヒトゲノムプロジェクトを代表とする研究の遂行により、多数の遺伝子の塩基配列情報が明らかにされてきた。なかでも将来可能とされているテーラーメイド医療（患者の体質に応じて薬を使い分ける医療）と関連して、ゲノムレベルでの個体差の代表である一塩基多型（SNPｓ）の解読とその応用が注目されている。ヒトゲノムDNAの一塩基変異配列を効率よく識別・検出する手法の開拓は、疾患の診断・治療のみならず、望みのテーラーメイド医療の実現に向けて極めて重要な研究課題である。 In recent years, the base sequence information of a large number of genes has been clarified by performing research represented by the Human Genome Project. In particular, in connection with tailor-made medicine (medicine that uses different drugs depending on the patient's constitution), which is possible in the future, decoding of single nucleotide polymorphisms (SNPs), which are representative of individual differences at the genome level, and its application Attention has been paid. The development of a method for efficiently identifying and detecting single-base mutation sequences in human genomic DNA is an extremely important research subject not only for the diagnosis and treatment of diseases but also for the realization of desired tailor-made medicine.
プローブとなる核酸鎖を表面に修飾した電極を作製し、検体核酸鎖とのハイブリダイゼーション過程を利用して、検体核酸鎖とプローブ核酸鎖間のミスマッチ塩基対を検出する手法は従来から知られている（非特許文献１、非特許文献２）。しかしながら、それらの方法は、検体核酸鎖とプローブ核酸鎖により形成された二重鎖に特異的に結合する電気化学的活性分子の添加が必要であるか、あるいはプローブ核酸鎖への電気化学活性分子の修飾が必要とされ、さらに検体核酸鎖と結合したプローブ核酸鎖と、結合していないプローブ核酸鎖を、測定前に分離するいわゆるB/F分離過程が必要とされた。そのためプローブの合成や測定過程が複雑化されるか、あるいは特殊な装置の利用が不可欠であるという欠点があった。 A method for detecting a mismatched base pair between a sample nucleic acid strand and a probe nucleic acid strand by using a hybridization process with the sample nucleic acid strand by preparing an electrode with a probe-modified nucleic acid strand on the surface has been conventionally known. (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2). However, these methods require the addition of an electrochemically active molecule that specifically binds to the duplex formed by the analyte nucleic acid strand and the probe nucleic acid strand, or the electrochemically active molecule to the probe nucleic acid strand. In addition, a so-called B / F separation process for separating the probe nucleic acid chain bound to the sample nucleic acid chain and the probe nucleic acid chain not bound to the sample nucleic acid chain before measurement is required. For this reason, there has been a drawback that the probe synthesis and measurement process are complicated, or the use of a special device is indispensable.
本発明は、検体核酸鎖とプローブ核酸鎖から形成された二重鎖に特異的に結合する電気化学的活性分子の添加、あるいはプローブ核酸鎖への電気化学活性分子の修飾、さらに検体核酸鎖と結合したプローブ核酸鎖と、結合していないプローブ核酸鎖を、測定前に分離するいわゆるB/F分離過程を必要としない新たなミスマッチ塩基対の検出手段を提供することを目的とする。 The present invention includes addition of an electrochemically active molecule that specifically binds to a duplex formed from a sample nucleic acid chain and a probe nucleic acid chain, or modification of the electrochemically active molecule to the probe nucleic acid chain, It is an object of the present invention to provide a new mismatch base pair detection means that does not require a so-called B / F separation process for separating a bound probe nucleic acid chain and an unbound probe nucleic acid chain before measurement.
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、二重鎖核酸分子と単鎖核酸分子間の鎖交換反応において、単鎖核酸分子が二重鎖核酸分子の完全相補鎖である場合とミスマッチ鎖である場合とで鎖交換反応の速度に差があることに着目し、この鎖交換反応速度の差を利用することにより、簡易かつ高精度に検体核酸鎖とプローブ核酸鎖間のミスマッチ塩基対を検出できることを見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の（１）〜（９）を提供するものである。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has found that a single-stranded nucleic acid molecule is a completely complementary strand of a double-stranded nucleic acid molecule in a strand exchange reaction between a double-stranded nucleic acid molecule and a single-stranded nucleic acid molecule. Paying attention to the difference in the speed of the strand exchange reaction between the case where there is a mismatched strand and the case where it is a mismatched strand, by utilizing this difference in the speed of the strand exchange reaction, it is easy and highly accurate between the sample nucleic acid strand and the probe nucleic acid strand. It was found that a mismatched base pair can be detected, and the present invention has been completed based on this finding.
That is, the present invention provides the following (1) to (9).
（１）担体に固定されている一の単鎖核酸分子とそれと結合する他の単鎖核酸分子からなる二重鎖核酸分子を、検出対象とする核酸分子と共存させ、その後、当該一の単鎖核酸分子から解離する当該他の単鎖核酸分子の量又は一の単鎖核酸分子と他の単鎖核酸分子からなる二重鎖核酸分子の残存量を測定することを特徴とする当該他の単鎖核酸分子と当該検出対象とする核酸分子との間のミスマッチ塩基対を検出する方法。 (1) A double-stranded nucleic acid molecule composed of one single-stranded nucleic acid molecule immobilized on a carrier and another single-stranded nucleic acid molecule that binds to the single-stranded nucleic acid molecule is allowed to coexist with a nucleic acid molecule to be detected, and then the single Measuring the amount of the other single-stranded nucleic acid molecule dissociated from the single-stranded nucleic acid molecule or the remaining amount of the double-stranded nucleic acid molecule composed of one single-stranded nucleic acid molecule and another single-stranded nucleic acid molecule. A method for detecting mismatched base pairs between a single-stranded nucleic acid molecule and a nucleic acid molecule to be detected.
（２）他の単鎖核酸分子が、一の単鎖核酸分子よりも鎖長の長い核酸分子であることを特徴とする（１）に記載のミスマッチ塩基対を検出する方法。 (2) The method for detecting mismatched base pairs according to (1), wherein the other single-stranded nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule having a chain length longer than that of one single-stranded nucleic acid molecule.
（３）一の単鎖核酸分子が担体上に配置された電極と結合しており、二重鎖核酸分子に電気化学活性を有するインタカレーターが導入されており、一の単鎖核酸分子と他の単鎖核酸分子からなる二重鎖核酸分子の残存量を当該電極表面上に存在する当該電気化学活性を有するインタカレーターの量に基づいて測定することを特徴とする（１）又は（２）に記載のミスマッチ塩基対を検出する方法。 (3) One single-stranded nucleic acid molecule is bound to an electrode disposed on a carrier, and an intercalator having electrochemical activity is introduced into the double-stranded nucleic acid molecule. (1) or (2), wherein the remaining amount of the double-stranded nucleic acid molecule comprising the single-stranded nucleic acid molecule is measured based on the amount of the intercalator having the electrochemical activity present on the electrode surface. A method for detecting a mismatched base pair described in 1.
（４）電極表面上に存在する電気化学活性を有するインターカレーターの量を、電極に電位を与え、発生する電流値に基づいて測定することを特徴とする（３）に記載のミスマッチ塩基対を検出する方法。 (4) The amount of the intercalator having electrochemical activity present on the electrode surface is measured on the basis of a current value generated by applying a potential to the electrode. How to detect.
（５）電気化学活性を有するインターカレーターが、キノン類、メタロセン類、ポルフィリン類、又は金属錯体類であることを特徴とする（３）又は（４）に記載のミスマッチ塩基対を検出する方法。 (5) The method for detecting a mismatched base pair according to (3) or (4), wherein the intercalator having electrochemical activity is a quinone, a metallocene, a porphyrin, or a metal complex.
（６）一の単鎖核酸分子とそれと結合する他の単鎖核酸分子とからなる二重鎖核酸分子と、当該一の単鎖核酸分子が固定されている担体とを有することを特徴とする核酸チップ。 (6) A double-stranded nucleic acid molecule composed of one single-stranded nucleic acid molecule and another single-stranded nucleic acid molecule that binds to the single-stranded nucleic acid molecule, and a carrier on which the single-stranded nucleic acid molecule is fixed. Nucleic acid chip.
（７）他の単鎖核酸分子が、一の単鎖核酸分子よりも鎖長の長い核酸分子であることを特徴とする（６）に記載の核酸チップ。 (7) The nucleic acid chip according to (6), wherein the other single-stranded nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule having a longer chain length than one single-stranded nucleic acid molecule.
（８）一の単鎖核酸分子が担体上に配置された電極と結合しており、二重鎖核酸分子に電気化学活性を有するインタカレーターが導入されていることを特徴とする（６）又は（７）（９）電気化学活性を有するインターカレーターが、キノン類、メタロセン類、ポルフィリン類、又は金属錯体類であることを特徴とする（８）に記載の核酸チップ。 (8) One single-stranded nucleic acid molecule is bound to an electrode disposed on a carrier, and an intercalator having electrochemical activity is introduced into the double-stranded nucleic acid molecule (6) or (7) (9) The nucleic acid chip according to (8), wherein the intercalator having electrochemical activity is a quinone, a metallocene, a porphyrin, or a metal complex.
核酸配列の微細な変化が遺伝子機能に強く影響を及ぼすことが知られている。とりわけ遺伝子内の一塩基多型は、疾病に対する罹患率、医薬作用および副作用の個人差に関連し、この解析がテーラーメイド医療（患者の体質に応じて薬を使い分ける医療）の実現に不可欠である。微細な核酸配列の違いを検出する手法は、これまでにも種々検討されているが、操作が複雑であるなどの欠点を有している。一塩基多型などの微細な遺伝子配列の変化は、その総数が極めて多く、迅速、安価、簡便な検査手法が強く求められている。 It is known that minute changes in nucleic acid sequence strongly affect gene function. In particular, single nucleotide polymorphisms in genes are related to individual morbidity, pharmacological effects, and side effects of diseases, and this analysis is indispensable for the realization of tailor-made medical care (medical use depending on the patient's constitution). Various techniques for detecting a difference in a minute nucleic acid sequence have been studied so far, but have drawbacks such as complicated operation. The number of minute gene sequence changes such as single nucleotide polymorphisms is extremely large, and there is a strong demand for rapid, inexpensive, and simple testing techniques.
電極に固定化されたプローブ二重鎖と検体核酸との鎖交換速度に依存して電気化学応答が変化する本発明の検出方法によれば、検体核酸の一塩基変異、一塩基挿入、一塩基欠損等の微少の核酸配列の違いを容易に検出することができ、また核酸配列を厳密にかつ迅速、簡便に精査できる。このことは、単なる疾患の診断・予防・治療のみならず、テーラーメイド医療の実現に向けて、極めて重要且つ意義のあることである。 According to the detection method of the present invention in which the electrochemical response changes depending on the strand exchange rate between the probe duplex immobilized on the electrode and the sample nucleic acid, single base mutation, single base insertion, single base of the sample nucleic acid A minute difference in nucleic acid sequence such as a defect can be easily detected, and the nucleic acid sequence can be scrutinized strictly, rapidly and simply. This is extremely important and meaningful not only for the diagnosis, prevention and treatment of diseases but also for the realization of tailor-made medicine.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のミスマッチ塩基対を検出する方法は、担体に固定されている一の単鎖核酸分子とそれと結合する他の単鎖核酸分子からなる二重鎖核酸分子を、検出対象とする核酸分子と共存させ、その後、当該一の単鎖核酸分子から解離する当該他の単鎖核酸分子の量又は一の単鎖核酸分子と他の単鎖核酸分子からなる二重鎖核酸分子の残存量を測定することを特徴とするものである。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The method for detecting mismatched base pairs of the present invention comprises a single-stranded nucleic acid molecule immobilized on a carrier and a double-stranded nucleic acid molecule consisting of another single-stranded nucleic acid molecule bound to the single-stranded nucleic acid molecule, Measure the amount of other single-stranded nucleic acid molecules that coexist and then dissociate from the single-stranded nucleic acid molecule or the remaining amount of double-stranded nucleic acid molecules composed of one single-stranded nucleic acid molecule and another single-stranded nucleic acid molecule It is characterized by doing.
最初に本発明のミスマッチ塩基対の検出方法の原理を説明する。担体に固定されている一の単鎖核酸分子とそれと結合する他の単鎖核酸分子とからなる二重鎖核酸分子を、検出対象とする核酸分子と共存させると、他の単鎖核酸分子と検出対象とする核酸分子の間に一定の相補性がある場合には、二重鎖核酸分子と検出対象とする核酸分子との間に鎖交換反応が起こる。鎖交換反応は、検出対象とする核酸分子が他の単鎖核酸分子の完全相補鎖である場合の方が、ミスマッチ鎖である場合よりも早く進行することが知られている。従って、一の単鎖核酸分子から解離する他の単鎖核酸分子の量は、完全相補鎖である場合の方がミスマッチ鎖である場合よりも多くなり、逆に、残存している一の単鎖核酸分子と他の単鎖核酸分子からなる二重鎖核酸分子の量は、完全相補鎖である場合の方がミスマッチ鎖である場合よりも少なくなる。よって、他の単鎖核酸分子の解離量又は二重鎖核酸分子の残存量を測定することにより、検出対象とする核酸分子が他の単鎖核酸分子の完全相補鎖であったか、ミスマッチ鎖であったかがわかる。 First, the principle of the mismatch base pair detection method of the present invention will be described. When a double-stranded nucleic acid molecule consisting of one single-stranded nucleic acid molecule fixed to a carrier and another single-stranded nucleic acid molecule that binds to it is coexisted with a nucleic acid molecule to be detected, other single-stranded nucleic acid molecules When there is a certain degree of complementarity between the nucleic acid molecules to be detected, a strand exchange reaction occurs between the double-stranded nucleic acid molecule and the nucleic acid molecule to be detected. It is known that the strand exchange reaction proceeds faster when the nucleic acid molecule to be detected is a completely complementary strand of another single-stranded nucleic acid molecule than when it is a mismatched strand. Therefore, the amount of other single-stranded nucleic acid molecules dissociated from one single-stranded nucleic acid molecule is larger in the case of a completely complementary strand than in the case of a mismatched strand. The amount of a double-stranded nucleic acid molecule composed of a single-stranded nucleic acid molecule and another single-stranded nucleic acid molecule is smaller when it is a completely complementary strand than when it is a mismatched strand. Therefore, by measuring the dissociation amount of other single-stranded nucleic acid molecules or the remaining amount of double-stranded nucleic acid molecules, whether the nucleic acid molecule to be detected was a completely complementary strand or a mismatched strand of other single-stranded nucleic acid molecules I understand.
本発明において「核酸分子」とは、主としてDNAを意味するが、RNAや核酸類似分子（例えば、ペプチド核酸、LNA、モルフォリノヌクレオチドなど）なども含む。
一の単鎖核酸分子の鎖長は特に限定されないが、核酸チップに利用する場合は10〜50塩基であることが好ましく、10〜30塩基であることが好ましい。
他の単鎖核酸分子の鎖長も特に限定されないが、核酸チップに利用する場合は10〜50塩基であることが好ましく、10〜30塩基であることが好ましい。
In the present invention, “nucleic acid molecule” mainly means DNA, but also includes RNA and nucleic acid-like molecules (for example, peptide nucleic acid, LNA, morpholino nucleotide, etc.).
The chain length of one single-stranded nucleic acid molecule is not particularly limited, but when used for a nucleic acid chip, it is preferably 10 to 50 bases, and preferably 10 to 30 bases.
The chain length of other single-stranded nucleic acid molecules is not particularly limited, but when used for a nucleic acid chip, it is preferably 10 to 50 bases, and preferably 10 to 30 bases.
一の単鎖核酸分子と他の単鎖核酸分子は同じ鎖長であってもよいが、他の単鎖核酸分子が一の単鎖核酸分子よりも鎖長の長いものであることが好ましい。また、このように一の単鎖核酸分子と他の単鎖核酸分子の鎖長が異なる場合、これらによって形成される核酸分子は、単鎖部分と二重鎖部分とを持つ部分二重鎖構造をとるが、検出しようとするミスマッチ塩基対が単鎖部分に対応するようにすることが好ましい。このように部分二重鎖構造の単鎖部分にミスマッチ塩基対が対応するようにすることにより、完全相補鎖の鎖交換速度とミスマッチ鎖の鎖交換速度の差がより大きくなり（国際公開第2005/012571号パンフレット）、高い精度でミスマッチ塩基対を検出することが可能になる。部分二重鎖構造における単鎖部分の長さは特に限定されないが、3 〜20塩基であることが好ましく、3 〜10塩基であることが好ましい。 One single-stranded nucleic acid molecule and the other single-stranded nucleic acid molecule may have the same chain length, but it is preferable that the other single-stranded nucleic acid molecule has a longer chain length than one single-stranded nucleic acid molecule. In addition, when the chain lengths of one single-stranded nucleic acid molecule and another single-stranded nucleic acid molecule are different in this way, the nucleic acid molecule formed by them has a partial double-stranded structure having a single-stranded part and a double-stranded part. However, it is preferable that the mismatched base pair to be detected corresponds to the single-stranded portion. Thus, by making the mismatch base pair correspond to the single-stranded part of the partial double-stranded structure, the difference between the strand exchange rate of the completely complementary strand and the strand exchange rate of the mismatched strand becomes larger (International Publication No. 2005). / 012571 pamphlet), it becomes possible to detect mismatched base pairs with high accuracy. Although the length of the single chain part in a partial double chain structure is not specifically limited, It is preferable that it is 3-20 bases, and it is preferable that it is 3-10 bases.
検出対象とする核酸分子は特に限定されないが、本発明の核酸分子は１塩基変異の識別に有効なので、１塩基変異を含む遺伝子などを検出対象とするのが好ましい。
二重鎖核酸分子と検出対象とする核酸分子を共存させる方法は両核酸分子間の鎖交換反応が起こり得る方法であれば特に限定されない。
The nucleic acid molecule to be detected is not particularly limited. However, since the nucleic acid molecule of the present invention is effective for identifying a single base mutation, it is preferable to detect a gene containing a single base mutation.
The method for allowing the double-stranded nucleic acid molecule and the nucleic acid molecule to be detected to coexist is not particularly limited as long as the strand exchange reaction between the two nucleic acid molecules can occur.
担体としては、一の単鎖核酸分子を固定できるものであれば特に限定されず、例えば、核酸チップなどに用いられている一般的な基板などを使用することができる。
他の単鎖核酸分子の解離量や二重鎖核酸分子の残存量を測定する方法は特に限定されない。
The carrier is not particularly limited as long as it can immobilize one single-stranded nucleic acid molecule, and for example, a general substrate used for a nucleic acid chip or the like can be used.
The method for measuring the dissociation amount of other single-stranded nucleic acid molecules and the remaining amount of double-stranded nucleic acid molecules is not particularly limited.
二重鎖核酸分子の残存量を測定する場合は、一の単鎖核酸分子を担体上に配置された電極と結合させ、二重鎖核酸分子に電気化学活性を有するインターカレーターを導入し、当該電極表面上に存在する当該電気化学活性を有するインターカレーターに基づいて二重鎖核酸分子の残存量を測定することが好ましい。このように電気化学的に二重鎖核酸分子の残存量を測定する方法の原理を図１を用いて説明する。電極と結合している一の単鎖核酸分子とそれと結合する他の単鎖核酸分子とからなる二重鎖核酸分子を、検出対象とする核酸分子と共存させると、鎖交換反応が起こる。この鎖交換反応により、他の単鎖核酸分子は一の単鎖核酸分子から解離し、検出対象とする核酸分子と新たな二重鎖核酸分子を形成する。このとき、インターカレーターは、他の単鎖核酸分子とともに電極表面上から遊離し、新たに形成される二重鎖核酸分子へと移行する。従って、電極表面上に残存するインターカレーターの量は、電極表面上に残存する一の単鎖核酸分子と他の単鎖核酸分子とからなる二重鎖核酸分子の量と対応する。よって、電極表面上に残存するインターカレーターの量に基づいて二重鎖核酸分子の残存量を測定することが可能である。 When measuring the remaining amount of the double-stranded nucleic acid molecule, one single-stranded nucleic acid molecule is bound to an electrode arranged on a carrier, an intercalator having electrochemical activity is introduced into the double-stranded nucleic acid molecule, It is preferable to measure the remaining amount of the double-stranded nucleic acid molecule based on the intercalator having the electrochemical activity present on the electrode surface. The principle of such a method for electrochemically measuring the remaining amount of double-stranded nucleic acid molecules will be described with reference to FIG. When a double-stranded nucleic acid molecule composed of one single-stranded nucleic acid molecule bonded to an electrode and another single-stranded nucleic acid molecule bonded to the electrode coexists with a nucleic acid molecule to be detected, a strand exchange reaction occurs. By this strand exchange reaction, other single-stranded nucleic acid molecules are dissociated from one single-stranded nucleic acid molecule to form a new double-stranded nucleic acid molecule with the nucleic acid molecule to be detected. At this time, the intercalator is released from the surface of the electrode together with other single-stranded nucleic acid molecules, and migrates to newly formed double-stranded nucleic acid molecules. Therefore, the amount of intercalator remaining on the electrode surface corresponds to the amount of double-stranded nucleic acid molecules composed of one single-stranded nucleic acid molecule and another single-stranded nucleic acid molecule remaining on the electrode surface. Therefore, it is possible to measure the remaining amount of the double-stranded nucleic acid molecule based on the amount of intercalator remaining on the electrode surface.
この方法において、一の単鎖核酸分子を結合させる電極としては、金電極が好ましいが、これ以外のものであってもよい。金電極以外の電極としては、グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電極、白金、パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等の半導体電極などを例示できる。 In this method, a gold electrode is preferable as an electrode to which one single-stranded nucleic acid molecule is bound, but other electrodes may be used. As electrodes other than the gold electrode, carbon electrodes such as graphite and glassy carbon, noble metal electrodes such as platinum, palladium and rhodium, oxide electrodes such as titanium oxide, tin oxide, manganese oxide and lead oxide, Si, Ge, ZnO And semiconductor electrodes such as CdS.
電極表面への一の単鎖核酸分子の結合法は特に限定されず、共有結合を利用した結合方法などを例示できる。共有結合を利用した結合方法としては、例えば、一の単鎖核酸分子の末端をチオール基やジスルフィド基を含む化合物で修飾しておき、活性化した金電極などの表面にチオール結合やジスルフィド結合させる方法が挙げられる。このような結合の際、一の単鎖核酸分子と電極表面の活性基との間に適当な大きさのスペーサー分子を介在させてもよい。 The method for binding one single-stranded nucleic acid molecule to the electrode surface is not particularly limited, and examples include a binding method using a covalent bond. As a binding method using a covalent bond, for example, the end of one single-stranded nucleic acid molecule is modified with a compound containing a thiol group or a disulfide group, and the thiol bond or disulfide bond is formed on the surface of an activated gold electrode or the like. A method is mentioned. In such binding, a spacer molecule of an appropriate size may be interposed between one single-stranded nucleic acid molecule and the active group on the electrode surface.
二重鎖核酸分子に導入する電気化学活性を有するインターカレーターは特に限定されず、例えば、＋１．０〜−１．０Ｖ程度の酸化還元電位を有する物質であって、塩基配列の中に比較的安定にインターカレートできる平面構造をとる物質を使用することができる。このような物質としては、アントラキノンなどのキノン類、フェロセンなどのメタロセン類、リボフラビンなどのフラビン類、ポルフィリン類、金属錯体類などを例示できる。本発明に使用する好ましい電気化学活性を有するインターカレーターとしては、下記式（Ｉ）で表されるアントラキノン誘導体を例示できる。 The intercalator having electrochemical activity to be introduced into the double-stranded nucleic acid molecule is not particularly limited. For example, it is a substance having an oxidation-reduction potential of about +1.0 to −1.0 V, A material having a planar structure that can be stably intercalated can be used. Examples of such substances include quinones such as anthraquinone, metallocenes such as ferrocene, flavins such as riboflavin, porphyrins, and metal complexes. Examples of preferred intercalators having electrochemical activity used in the present invention include anthraquinone derivatives represented by the following formula (I).
他の単鎖核酸分子の解離量や二重鎖核酸分子の残存量の測定は、以上のような方法以外にも、蛍光物質などを用いて行うことも可能である。例えば、一の単鎖核酸分子をドナー蛍光色素（例えば、フルオレスセインイソチオシアネートなど）で標識し、他の単鎖核酸分子をアクセプター蛍光色素（例えば、テトラメチルローダミン、ダブシルなど）で標識しておけば、鎖交換反応に伴い他の単鎖核酸分子が一の単鎖核酸分子から解離することによって蛍光が生じるので、蛍光強度に基づいて他の単鎖核酸分子の解離量や二重鎖核酸分子の残存量を測定できる。 Measurement of the amount of dissociation of other single-stranded nucleic acid molecules and the remaining amount of double-stranded nucleic acid molecules can be performed using a fluorescent substance or the like in addition to the methods described above. For example, one single-stranded nucleic acid molecule is labeled with a donor fluorescent dye (eg, fluorescein isothiocyanate) and the other single-stranded nucleic acid molecule is labeled with an acceptor fluorescent dye (eg, tetramethylrhodamine, dabsyl). In this case, since fluorescence is generated by dissociating other single-stranded nucleic acid molecules from one single-stranded nucleic acid molecule during the strand exchange reaction, the amount of dissociation of other single-stranded nucleic acid molecules and double-stranded nucleic acids are based on the fluorescence intensity. The remaining amount of molecules can be measured.
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited at all by these Examples.
〔実施例１〕 DNAオリゴマーの合成
下記の表１に示すDNAオリゴマーの合成を、ABI社製のDNA自動合成機を用いて1.0μmolスケールで行った。表中のProbe 1は、3’-末端にアルキルリンカーを介してジスルフィド基を有し、Probe 2と７塩基のダングリングエンドをもつ部分二重鎖を形成する。DNAオリゴマーの3’-末端へのジスルフィドユニットの導入は、市販のCPG担体を用いることにより行った。また、ジスルフィドユニットを持たないProbe 1配列をControlとした。Probe 2の塩基配列は検体核酸鎖であるODN 1と相補的であり、ODN 2はODN 1の一塩基変異体である。
[Example 1] Synthesis of DNA oligomers Synthesis of DNA oligomers shown in Table 1 below was performed on a 1.0 µmol scale using an automatic DNA synthesizer manufactured by ABI. Probe 1 in the table has a disulfide group via an alkyl linker at the 3′-end, and forms a partial duplex with Probe 2 and a dangling end of 7 bases. Introduction of a disulfide unit at the 3′-end of the DNA oligomer was performed by using a commercially available CPG carrier. In addition, Probe 1 sequence having no disulfide unit was defined as Control. The base sequence of Probe 2 is complementary to ODN 1 which is a sample nucleic acid chain, and ODN 2 is a single base variant of ODN 1.
合成したDNAオリゴマーは、28 ％アンモニア水中55 ℃で１１時間処理することにより塩基部の脱保護を行った。その後、すべてのDNAオリゴマーは逆相高速液体クロマトグラフィー [カラム：逆相コスモシール5C18AR300（4.6×150 mm2）、溶出液：A：5 ％ CH3CN in 50 mMトリエチルアンモニウム−酢酸緩衝液（TEAA、pH = 7.0）及びB：50 ％ CH3CN in 50 mM TEAA（pH = 7.0）、グラジエントは６０分で0 ％Bから100 ％Bのグラジエントをかけて流速：1.0 mL / minで行った] を用いて精製した。DNAオリゴマーの5’-末端の脱トリチル化は80 ％酢酸水溶液中で常温で１時間静置することにより行った。各DNAオリゴマーのシークエンスを表１に示す。 The synthesized DNA oligomer was deprotected by treating it with 28% aqueous ammonia at 55 ° C. for 11 hours. Thereafter, all the DNA oligomers were subjected to reversed-phase high performance liquid chromatography [column: reversed-phase Cosmo seal 5C18AR300 (4.6 × 150 mm 2 ), eluent: A: 5% CH 3 CN in 50 mM triethylammonium-acetate buffer (TEAA , PH = 7.0) and B: 50% CH 3 CN in 50 mM TEAA (pH = 7.0), gradient was performed at a flow rate of 1.0 mL / min with a gradient of 0% B to 100% B in 60 minutes] The product was purified using Detritylation of the 5′-end of the DNA oligomer was carried out by leaving it in an 80% acetic acid aqueous solution at room temperature for 1 hour. The sequence of each DNA oligomer is shown in Table 1.
Probe 2に対して形成されるControl, ODN 1, ODN 2との二重鎖に関して、260 nmにおける温度に対する吸光度を測定し、それぞれの半解離温度を求めた。表２にそれぞれの半解離温度を示す。
For the duplex formed with Control, ODN 1 and ODN 2 formed with respect to Probe 2, the absorbance with respect to the temperature at 260 nm was measured, and the respective half-dissociation temperatures were determined. Table 2 shows the respective half-dissociation temperatures.
〔実施例３〕 DNA修飾電極の作製と表面物性の評価
（１）DNA修飾金電極の作製
金電極としては、スライドガラス上に金を蒸着した電極（φ= 8 mm、蒸着膜の厚み：Cr 300 Å + Au 1 μm）を用いた。金電極へのDNAの固定は、アニーリング処理（試料を80 ℃に昇温し、室温まで徐冷）を行った二重鎖DNA溶液（0.1 mM 二重鎖DNA（Probe 1 + Probe 2）を含むリン酸緩衝液）を、ピランハ溶液（30% H2O2 : H2SO4 = 1 : 3）で洗浄（15分×2回）した金電極表面に添加したのち12 時間静置することにより行った。またDNA修飾金電極のマスキング処理は2.5 mM メルカプトプロパノールを含むリン酸緩衝液を電極上に添加したのち2 時間静置することにより行った。
[Example 3] Preparation of DNA-modified electrode and evaluation of surface properties (1) Preparation of DNA-modified gold electrode As a gold electrode, an electrode obtained by vapor-depositing gold on a slide glass (φ = 8 mm, thickness of deposited film: Cr 300 Å + Au 1 μm) was used. DNA immobilization on a gold electrode includes a double-stranded DNA solution (0.1 mM double-stranded DNA (Probe 1 + Probe 2)) that has been annealed (the sample is heated to 80 ° C and slowly cooled to room temperature) After adding phosphate buffer) to the surface of the gold electrode washed with Piranha solution (30% H 2 O 2 : H 2 SO 4 = 1: 3) (15 minutes × 2 times), let stand for 12 hours went. The DNA-modified gold electrode was masked by adding a phosphate buffer containing 2.5 mM mercaptopropanol on the electrode and allowing it to stand for 2 hours.
（２）DNA表面密度の定量
修飾電極における表面DNA密度の定量は、Tarlovらによって〔Anal. Chem., 1998, 70, 4670-4677.〕に報告された方法により行った。DNA修飾電極について10 mM Tris緩衝液( pH = 7.4 )中で初期電位+100 mVから-400 mVへ電位ステップを行い、時間の平方根に対する電荷量としてプロットしたクロノクーログラムを得た。このクロノクーログラムにおける直線領域の接線のｙ切片は、この修飾電極の電気二重層の充電に用いられる電荷量に相当する。また50 μM Ru(NH3)6 3+ を含む10 mM Tris緩衝液( pH = 7.4 )中で同様の測定を行って得たクロノクーログラムの直線領域の接線におけるｙ切片は電気二重層の充電と電極上のDNAに結合したRu(NH3)6 3+ の還元に要した電荷量の和に相当する。この値からすでに得られた電気二重層の電荷を差し引いてRu(NH3)6 3+ の還元に用いられた電荷量を求めた。この電荷量より概算されたRu(NH3)6 3+ の表面密度Γ0から、以下の関係式によりDNAの表面密度ΓDNAを概算した。
(2) Quantification of DNA surface density The surface DNA density at the modified electrode was quantified by the method reported by Tarlov et al. [Anal. Chem., 1998, 70, 4670-4677.]. The DNA-modified electrode was subjected to a potential step from an initial potential of +100 mV to −400 mV in 10 mM Tris buffer (pH = 7.4) to obtain a chronocoulogram plotted as the amount of charge against the square root of time. The y-intercept of the tangent of the straight line region in this chronochronogram corresponds to the amount of charge used for charging the electric double layer of this modified electrode. In addition, the y-intercept at the tangent line in the linear region of the chronocoulogram obtained by performing the same measurement in 10 mM Tris buffer (pH = 7.4) containing 50 μM Ru (NH 3 ) 6 3+ is the charge of the electric double layer. And the sum of the charge required for the reduction of Ru (NH 3 ) 6 3+ bound to the DNA on the electrode. The electric charge used for the reduction of Ru (NH 3 ) 6 3+ was determined by subtracting the electric charge of the electric double layer already obtained from this value. From the surface density Γ 0 of Ru (NH 3 ) 6 3+ estimated from this charge amount, the surface density Γ DNA of DNA was estimated by the following relational expression.
ΓDNA =Γ0 ( z / m )
ここでzはレドックス分子の電荷数、mは単位となるオリゴヌクレオチドあたりのリン酸基の数である。
測定の結果、DNA二重鎖の表面密度は3.87×10-12 (mol/cm2) と概算された。作製したすべての修飾電極についてpmol/cm2オーダーの表面修飾密度が得られ、一般に報告されているDNA修飾電極と同等の表面修飾密度が一定して得られていることが確認された。
Γ DNA = Γ 0 (z / m)
Here, z is the number of charges of the redox molecule, and m is the number of phosphate groups per oligonucleotide as a unit.
As a result of the measurement, the surface density of the DNA double strand was estimated to be 3.87 × 10 −12 (mol / cm 2 ). It was confirmed that a surface modification density of the order of pmol / cm 2 was obtained for all the fabricated modified electrodes, and a surface modification density equivalent to that of a generally reported DNA modified electrode was obtained.
（３）インターカレーターの添加
電気化学活性とインターカレーターの両性質を合わせ持つ化合物としては、Schusterらによって〔J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 2311.〕に報告されたアントラキノン誘導体を用いた。アントラキノン誘導体の化学構造を以下に示す。
(3) Addition of intercalator Anthraquinone derivatives reported by Schuster et al. In [J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 2311.] were used as compounds having both electrochemical activity and intercalator properties. Using. The chemical structure of the anthraquinone derivative is shown below.
〔実施例４〕 DNA鎖交換反応に関する実験
鎖交換反応に伴う電気化学応答の変化を下記の操作手順により測定した。
DNA鎖交換反応は、DNA二重鎖修飾電極を0.1 mM ODN 1 （または ODN 2）を含むリン酸緩衝液中に浸漬して行った。電気化学測定には微分パルスボルタンメトリー（DPV）を用い、鎖交換反応開始から一定の時間ごとに鎖交換反応溶液中で直接測定を行った。
[Example 4] Experiment on DNA strand exchange reaction The change in electrochemical response accompanying the strand exchange reaction was measured by the following procedure.
The DNA strand exchange reaction was performed by immersing the DNA double-stranded modified electrode in a phosphate buffer containing 0.1 mM ODN 1 (or ODN 2). For the electrochemical measurement, differential pulse voltammetry (DPV) was used, and the measurement was performed directly in the chain exchange reaction solution at regular intervals from the start of the chain exchange reaction.
鎖交換時間に対するDPV電流値の減少を相対的な鎖交換率に換算したプロットを図２に示した。鎖交換反応の開始後3 時間において、完全相補鎖ODN 1との鎖交換率を１とした場合、一塩基ミスマッチ鎖ODN 2での鎖交換率は0.4に留まり、半解離温度から予想されたように、完全相補鎖での鎖交換反応がミスマッチ鎖での鎖交換反応よりも効率的に進行していることが観察された。 A plot in which the decrease in the DPV current value with respect to the chain exchange time is converted into a relative chain exchange rate is shown in FIG. 3 hours after the start of the strand exchange reaction, assuming that the strand exchange rate with the fully complementary strand ODN 1 is 1, the strand exchange rate with the single base mismatched ODN 2 stays at 0.4, as expected from the semi-dissociation temperature. In addition, it was observed that the strand exchange reaction with the completely complementary strand proceeded more efficiently than the strand exchange reaction with the mismatched strand.
これらの事実から、結論として言えることは、
（１）一塩基のミスマッチをもつDNAは、完全相補鎖より鎖交換反応が遅いため、電気化学応答の変化が少ない。
（２）鎖交換反応がDNA二重鎖の熱安定性に依存することから、シークエンスの設定によってさらなる識別能の向上が期待できる。
等々である。
From these facts, the conclusion is that
(1) A DNA having a single-base mismatch has a slower change in electrochemical response because the strand exchange reaction is slower than a completely complementary strand.
(2) Since the strand exchange reaction depends on the thermal stability of the DNA double strand, further improvement in discrimination ability can be expected by setting the sequence.
And so on.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006143040A JP2007312621A (en) | 2006-05-23 | 2006-05-23 | Method for detecting base pair mismatch |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006143040A JP2007312621A (en) | 2006-05-23 | 2006-05-23 | Method for detecting base pair mismatch |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007312621A true JP2007312621A (en) | 2007-12-06 |
Family
ID=38847070
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006143040A Withdrawn JP2007312621A (en) | 2006-05-23 | 2006-05-23 | Method for detecting base pair mismatch |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2007312621A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008307046A (en) * | 2007-05-11 | 2008-12-25 | Asahi Kasei Corp | Method for promoting chain exchange reaction between nucleic acid molecules |
-
2006
- 2006-05-23 JP JP2006143040A patent/JP2007312621A/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008307046A (en) * | 2007-05-11 | 2008-12-25 | Asahi Kasei Corp | Method for promoting chain exchange reaction between nucleic acid molecules |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6221586B1 (en) | Electrochemical sensor using intercalative, redox-active moieties | |
| Erdem et al. | Electrochemical DNA biosensors based on DNA‐drug interactions | |
| An et al. | Nanopore detection of 8-oxoguanine in the human telomere repeat sequence | |
| Xiao et al. | An electrochemical sensor for single nucleotide polymorphism detection in serum based on a triple-stem DNA probe | |
| Hall et al. | Long-Range and Short-Range Oxidative Damage to DNA: Photoinduced Damage to Guanines in Ethidium− DNA Assemblies | |
| Holmlin et al. | Synthesis of Metallointercalator− DNA Conjugates on a Solid Support | |
| US6649350B2 (en) | Electrochemical sensor using intercalative, redox-active moieties | |
| JPH06153997A (en) | Method for detecting target nucleic acid by amplification of detected signal | |
| JP2002513916A (en) | Electronic detection of analytes using monolayers | |
| JP2002513592A (en) | Electronic detection of nucleic acids using a monolayer | |
| Johnson et al. | The effect of base-pair sequence on electrochemically driven denaturation | |
| Chen et al. | DNA nanosieve-based regenerative electrochemical biosensor utilizing nucleic acid flexibility for accurate allele typing in clinical samples | |
| JP3665707B2 (en) | DNA sensor and method for detecting DNA | |
| KR20020065241A (en) | Mixed intercalators, electrochemical detection method of dna using same and detection kit therefor | |
| JP2006170615A (en) | Method of, device for, and chip of detecting gene | |
| US20060275756A1 (en) | Displacement assay for detecting ligate-ligand association events | |
| JP4301941B2 (en) | Nucleic acid probe immobilization substrate | |
| CN107735498A (en) | System for detecting simultaneously quantitative nucleic acid | |
| JP4706074B2 (en) | Tripod-type functional interface molecules for immobilization of biomolecules and gene detection devices using them | |
| JP2007312621A (en) | Method for detecting base pair mismatch | |
| JP4272800B2 (en) | Gene expression analysis using multiple potentials | |
| US20040152091A1 (en) | Biosensor, device and method for detecting nucleic acids by means of at least two units for immobilizing nucleic acids | |
| JP4320104B2 (en) | Method for detecting partially complementary nucleic acid fragments | |
| Shi et al. | Generation and Single-Molecule Characterization of a Sequence-Selective Covalent Cross-Link Mediated by Mechlorethamine at a C–C Mismatch in Duplex DNA for Discrimination of a Disease-Relevant Single Nucleotide Polymorphism | |
| US20030152958A1 (en) | Nucleic acid fragment-fixed electrode and its use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20071122 |