JP2007275004A - Method for producing gene recombinant birds by infection of lentivirus vector into spermary - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はウイルスベクターを鳥類生殖器にインジェクションすることで、鳥類生殖細胞にｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子導入を行う方法に関する。また、該手法により得られる目的遺伝子導入精子を用いて、自然交配あるいは人工交配により得られる、すべての細胞中に導入遺伝子を有するトランスジェニック鳥類及びその子孫に関する。 The present invention relates to a method for introducing a gene into an avian germ cell in vivo by injecting a viral vector into the avian genital organ. Further, the present invention relates to a transgenic bird having a transgene in all cells and its progeny obtained by natural mating or artificial mating using a target gene-introduced sperm obtained by this technique.
近年、組換えタンパク質生産技術が開発され多くの高機能性タンパク質製剤が次々と上市され、医薬品、食品業界で注目されている。ところが、生理活性の高いタンパク質医薬品は糖鎖修飾に代表される高度な翻訳後修飾が必要とされるため、一般的に動物培養細胞を用いた生産コストの高い発現システムおよび生産方法が用いられている。 In recent years, recombinant protein production technology has been developed, and many highly functional protein preparations have been put on the market one after another and attracting attention in the pharmaceutical and food industries. However, since protein drugs with high physiological activity require advanced post-translational modifications such as sugar chain modification, expression systems and production methods with high production costs using animal cultured cells are generally used. Yes.
従来動物培養細胞でしか生産できないタンパク質をより安価に大量に生産する方法として期待されているのがトランスジェニック動物の利用である。ウシ、ヤギ、ヒツジといった大型哺乳類動物をトランスジェニック動物にする手法開発が先行したが、大型の哺乳動物を大量に飼育するには広大なスペースを要し、また性成熟の期間も長いという問題点があり、いくつかのターゲットで実用化に至ってはいるものの、未だリスクが非常に高い。 The use of transgenic animals is expected as a method for producing a large amount of proteins that can be produced only in cultured animal cells at a low cost. The development of a method to convert large mammals such as cattle, goats and sheep into transgenic animals preceded, but it required a vast space to grow large mammals in large quantities, and the sexual maturation period was long. Although some targets have been put to practical use, the risk is still very high.
これに対し、ニワトリやウズラに代表される家禽類は、飼育スペースが小さく、性成熟期間が短いなどの利点がある。そのため、有用タンパク質生産へのトランスジェニック鳥類の利用は大いに期待が持たれる。
トランスジェニック鳥類作製技術に関しては、特許文献１および特許文献２に開示されている。特許文献１では、外来遺伝子が導入された細胞と、導入されていない細胞をモザイク状に有する個体（本明細書ではＧ０とする）の作製法を開示している。特許文献２では、ニワトリ胚への外来遺伝子の導入による効率的な子孫トランスジェニック鳥類作製法を開示している。また、Ｋａｍｉｈｉｒａらが報告したトランスジェニック鳥類作製技術からは、Ｇ１（本明細書ではＧ０を用いた交配によって得られる後代ですべての細胞に導入遺伝子を均一に有する個体をＧ１とする。）作製効率はわずかに数パーセントであった（非特許文献１）。特許文献３では、脊椎動物において雄性生殖器内へ外因性遺伝物質を導入することによるトランスジェニック動物の作製方法を開示しているが、背骨側深くに存在する鳥類の雄性生殖器に遺伝子導入する手法を開示も示唆もしない。
The transgenic bird production technique is disclosed in Patent Document 1 and Patent Document 2. Patent Document 1 discloses a method for producing an individual having a foreign gene introduced cell and a non-introduced cell in a mosaic pattern (referred to as G0 in this specification). Patent Document 2 discloses an efficient method for producing offspring transgenic birds by introducing a foreign gene into a chicken embryo. Further, from the transgenic bird production technique reported by Kamihira et al., G1 (in this specification, an individual having a transgene uniformly in all cells in a progeny obtained by mating using G0 is referred to as G1). Was only a few percent (Non-Patent Document 1). Patent Document 3 discloses a method for producing a transgenic animal by introducing exogenous genetic material into a male genital organ in a vertebrate. However, a method for introducing a gene into a male male genital organ existing deep in the spine side is disclosed. Neither disclosure nor suggestion.
これまでＧ０トランスジェニック鳥類において目的タンパク質の高生産法は開示されてきたが、実用化にはすべての細胞に導入遺伝子を均一に有するＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫において目的タンパク質の高生産が必要とされている。 So far, a high production method of the target protein has been disclosed in G0 transgenic birds. However, for practical use, high production of the target protein is required in G1 transgenic birds having the transgene uniformly in all cells and their progeny. Has been.
これまでＧ０トランスジェニック鳥類における目的タンパク質の高生産法は確立している。しかし、生産された目的タンパク質を医薬品タンパク質とする実用化に向けては、その品質が均一であることが必須であるため、すべての細胞に導入遺伝子を均一に有するＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫において目的タンパク質の高生産が必要とされている。
本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、幼雛期に雄鳥類の雄性生殖器である精巣内へウイルスベクターを導入することによって得られたＧ０トランスジェニック鳥類から、高効率にＧ１トランスジェニック鳥類を得ることができることを見出した。
Until now, a high production method of the target protein in G0 transgenic birds has been established. However, for the practical application of the produced target protein as a pharmaceutical protein, it is essential that its quality is uniform, so in G1 transgenic birds and their progeny that have the transgene uniformly in all cells. High production of the target protein is required.
As a result of intensive studies, the present inventors obtained G1 transgenic birds with high efficiency from G0 transgenic birds obtained by introducing a viral vector into the testis, which is the male reproductive organ of a male bird, at a young stage. Found that can be obtained.
よって、本発明が提供するのは、以下のとおりである。
（１）幼雛期の鳥類の雄性生殖器へ外来遺伝子を導入することによって、該雄性生殖器内において雄性生殖細胞及び／又は支持細胞のゲノムに外来遺伝子を挿入することからなるトランスジェニック鳥類作製法。
（２）外来遺伝子の導入に、外来遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはウイルスベクターを用いる（１）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（３）外来遺伝子の導入に、複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いる（２）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（４）複製能欠損型レトロウイルスベクターが、モロニーマウス白血病ウイルス及び／又はモロニーマウス肉腫ウイルス由来の配列を含む（２）又は（３）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（５）複製能欠損型レトロウイルスベクターが複製能欠損型レンチウイルスベクターである（３）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（６）複製能欠損型レンチウイルスベクターがヒト免疫不全ウイルス由来ウイルスベクター由来の配列を含む（５）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（７）複製能欠損型レトロウイルスベクターがＶＳＶ−Ｇエンベロープを含む（３）〜（６）いずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（８）外来遺伝子の導入に、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法又はマイクロインジェクション法を用いる（１）〜（７）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（９）雄性生殖細胞が、精原幹細胞、Ｂ型精原幹細胞、精母細胞又は精細胞である（１）〜（８）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１０）支持細胞が、セルトリ細胞又はライディッヒ細胞である（１）〜（８）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１１）外来遺伝子が、有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列である（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１２）有用タンパク質が、抗体、サイトカイン又は成長因子である（１１）に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１３）鳥類がニワトリまたはウズラである（１）〜（１２）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法。
（１４）（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で得られたＧ０トランスジェニック鳥類。
（１５）（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で得られた外来遺伝子が導入された精子を持つＧ０トランスジェニック鳥類との自然交配または人工交配により誕生したＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫。
（１６）鳥類がニワトリまたはウズラである（１５）に記載のＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫。
（１７）（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で外来遺伝子を導入した雄性生殖細胞。
（１８）（１７）に記載の雄性生殖細胞より分化した精子。
（１９）（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のトランスジェニック鳥類作製法で外来遺伝子を導入した支持細胞。
Therefore, the present invention provides the following.
(1) A method for producing a transgenic bird comprising introducing a foreign gene into the male reproductive cell and / or supporting cell genome in the male reproductive organ by introducing a foreign gene into the male reproductive organ of a young bird.
(2) The method for producing a transgenic bird according to (1), wherein a polynucleotide or viral vector encoding the foreign gene is used for introduction of the foreign gene.
(3) The method for producing a transgenic bird according to (2), wherein a replication-defective retrovirus vector is used for introduction of a foreign gene.
(4) The method for producing a transgenic bird according to (2) or (3), wherein the replication-defective retrovirus vector contains a sequence derived from Moloney murine leukemia virus and / or Moloney murine sarcoma virus.
(5) The method for producing a transgenic bird according to (3), wherein the replication-defective retrovirus vector is a replication-defective lentiviral vector.
(6) The method for producing a transgenic bird according to (5), wherein the replication-defective lentiviral vector contains a sequence derived from a human immunodeficiency virus-derived viral vector.
(7) The method for producing a transgenic bird according to any one of (3) to (6), wherein the replication-defective retrovirus vector contains a VSV-G envelope.
(8) The method for producing a transgenic bird according to any one of (1) to (7), wherein a calcium phosphate method, a lipofection method, a DEAE dextran method, an electroporation method or a microinjection method is used for introduction of a foreign gene.
(9) The method for producing a transgenic bird according to any one of (1) to (8), wherein the male germ cells are spermatogonial stem cells, B-type spermatogonial stem cells, spermatocytes or sperm cells.
(10) The method for producing a transgenic bird according to any one of (1) to (8), wherein the supporting cells are Sertoli cells or Leydig cells.
(11) The method for producing a transgenic bird according to any one of (1) to (10), wherein the foreign gene is a DNA sequence encoding a useful protein.
(12) The method for producing a transgenic bird according to (11), wherein the useful protein is an antibody, a cytokine or a growth factor.
(13) The method for producing a transgenic bird according to any one of (1) to (12), wherein the bird is a chicken or a quail.
(14) A G0 transgenic bird obtained by the method for producing a transgenic bird according to any one of (1) to (13).
(15) Born by natural mating or artificial mating with a G0 transgenic bird having a sperm introduced with a foreign gene obtained by the method for producing a transgenic bird according to any one of (1) to (13) G1 transgenic birds and their progeny.
(16) The G1 transgenic bird and its progeny according to (15), wherein the bird is a chicken or a quail.
(17) A male germ cell into which a foreign gene has been introduced by the method for producing a transgenic bird according to any one of (1) to (13).
(18) A sperm differentiated from the male germ cell according to (17).
(19) A feeder cell into which a foreign gene has been introduced by the method for producing a transgenic bird according to any one of (1) to (13).
以下に本発明を詳細に説明する。
まず、本発明によるトランスジェニック鳥類作製法について説明する。
本発明のトランスジェニック鳥類作製法は、幼雛期に雄鳥類の雄性生殖器へ外来遺伝子を導入することによって、該雄性生殖器内において雄性生殖細胞及び／又は支持細胞のゲノムに外来遺伝子を挿入することを特徴とする。
本発明で用いられる鳥類は特に限定されることはなく、例えばニワトリ、ウズラ、カモ、七面鳥等が挙げられる。中でもニワトリやウズラは入手が容易であり、産卵種として多産であり、長年の飼育経験から安全性が認められている点で特に好ましい。
The present invention is described in detail below.
First, a method for producing a transgenic bird according to the present invention will be described.
In the method for producing a transgenic bird of the present invention, a foreign gene is introduced into the male reproductive organ and / or supporting cell genome in the male reproductive organ by introducing a foreign gene into the male reproductive organ of a male bird at a young stage. It is characterized by.
Birds used in the present invention are not particularly limited, and examples thereof include chickens, quails, ducks, and turkeys. Among them, chickens and quails are particularly preferable because they are easily available, are prolific as egg-laying species, and have been recognized as safe from many years of breeding experience.
幼雛期とは、孵化後１日〜３０日までのことを示し、開腹して雄性生殖器である精巣内へ遺伝子導入できれば特に限定されないが、孵化後１〜３日が、雄性生殖細胞及び／又は支持細胞への遺伝子導入効率が良い観点、及び、体内の精巣へ遺伝子導入器具のアクセスが容易であることから好ましい。 The larval stage refers to 1 to 30 days after hatching, and is not particularly limited as long as the gene can be introduced into the testis, which is the male genital organ after laparotomy, but 1 to 3 days after hatching, male germ cells and / or Alternatively, it is preferable from the viewpoint of good gene transfer efficiency to the support cells and easy access of the gene transfer device to the testis in the body.
本発明では、外来遺伝子の導入に、外来遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたは外来遺伝子をコードするウイルスベクターを用いることが好ましい。上記ウイルスベクターとしては、例えばレトロウイルスが挙げられる。
レトロウイルスとしては特に限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、マウス肝細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、マウス胚性肝細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）等の他、レンチウイルスであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等が挙げられる。
安全性の観点からポリヌクレオチド、複製能欠損型レトロウイルスが好ましく、標的細胞である雄性生殖細胞及び／又は支持細胞のゲノムへの導入効率の観点から、複製能欠損型レトロウイルスがより好ましく、複製能欠損型レンチウイルスが特に好ましい。また、複製能欠損型レンチウイルス以外の複製能欠損型レトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス及び／又はモロニーマウス肉腫ウイルス由来の配列を含むものが好ましい。
本発明においては、鳥類細胞にこのウイルスベクターを効率的に感染させるため、外皮タンパクを人為的にウシ水疱性口内炎ウイルス由来のＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質とすることが好ましいが、このウイルスタイプに限定されるものではない。
In the present invention, it is preferable to use a polynucleotide encoding a foreign gene or a viral vector encoding a foreign gene for introduction of the foreign gene. An example of the viral vector is a retrovirus.
Although it does not specifically limit as retrovirus, In addition to Moloney murine leukemia virus, Moloney murine sarcoma virus, avian leukemia virus (ALV), mouse hepatocyte virus (MSCV), mouse embryonic hepatocyte virus (MESV), etc. A certain human immunodeficiency virus (HIV) etc. are mentioned.
From the viewpoint of safety, polynucleotides and replication-defective retroviruses are preferred, and from the viewpoint of efficiency of introduction into the genome of the target cell, male germ cells and / or supporting cells, replication-defective retroviruses are more preferred, and replication is possible. The ability-deficient lentivirus is particularly preferred. Moreover, as replication-defective retroviruses other than replication-defective lentiviruses, those containing sequences derived from Moloney murine leukemia virus and / or Moloney murine sarcoma virus are preferable.
In the present invention, in order to efficiently infect avian cells with this viral vector, it is preferable to artificially use the coat protein as a VSV-G envelope protein derived from bovine vesicular stomatitis virus, but it is limited to this virus type. It is not something.
上記外来遺伝子としては特に限定されないが、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ｄｓＲｅｄ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等をコードする既知のマーカー遺伝子；ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）等の成長因子やヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）、サイトカイン、抗体等の有用タンパク質をコードするＤＮＡ配列等が挙げられる。
上記マーカー遺伝子としては、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼ又はβ−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ配列が好ましい。
上記有用タンパク質としては、抗体、サイトカイン又は成長因子が好ましい。
The foreign gene is not particularly limited, but is a known marker gene encoding GFP, EGFP, dsRed, luciferase, β-galactosidase, etc .; growth factor such as human growth hormone (hGH), human erythropoietin (hEPO), cytokine, antibody DNA sequences encoding useful proteins such as
The marker gene is preferably a DNA sequence encoding GFP, EGFP, luciferase or β-galactosidase.
As the useful protein, an antibody, cytokine or growth factor is preferable.
上記ウイルスベクターにコードされる遺伝子は、上記外来遺伝子のほかにプロモーター、エンハンサー、調節因子等、特に限定されないが、鳥類細胞で外来遺伝子が発現するために、適切にデザインされたものを用いることが好ましい。
プロモーターとは遺伝子の転写開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節する、ＤＮＡ又はＲＮＡ上の領域のことである。プロモーターとしては鳥類で有効に機能するプロモーターであれば限定されないが、一般的によく用いられている、ＥＦ１αプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ミューリン・フォフフォグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターや、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウスザルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター等のウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導型プロモーターのような誘導型プロモーターを用いることができる。また、組織特異的なプロモーターを用いると、鳥類の特定の組織・細胞で特に強い導入タンパク質の発現が望める。その例として、オボアルブミンプロモーターが挙げられ、ユビキタス発現プロモーターとしてニワトリβアクチンプロモーターがあげられる。
The gene encoded by the viral vector is not particularly limited in addition to the foreign gene, such as a promoter, an enhancer, a regulatory factor, etc., but in order to express the foreign gene in avian cells, an appropriately designed gene can be used. preferable.
A promoter is a region on DNA or RNA that determines the transcription start site of a gene and directly regulates its frequency. The promoter is not limited as long as it is a promoter that functions effectively in birds, but the EF1α promoter, thymidine kinase promoter, simian virus 40 (SV40) promoter, murine fofoglycerokinase (PGK), which are commonly used, are commonly used. Promoters, viral promoters such as cytomegalovirus (CMV) promoter, Rous sarcoma virus (RSV) promoter, and inducible promoters such as tetracycline inducible promoters can be used. In addition, when a tissue-specific promoter is used, particularly strong expression of the introduced protein can be expected in specific tissues and cells of birds. An example is the ovalbumin promoter, and an example of a ubiquitous expression promoter is the chicken β-actin promoter.
エンハンサーとは、プロモーターからの転写を促進する配列であるが、単独では転写を起こせないＤＮＡ又はＲＮＡ上の領域を指す。本来機能しているものとは異なるプロモーターに連結した場合にも機能することが多いので、プロモーターとの組み合わせについては限定しない。エンハンサーとしては、特に限定されないが、ＳＶ４０、ＣＭＶ、チミジンキナーゼエンハンサー、ステロイド応答エレメントやリゾチームエンハンサー等が挙げられる。
調節因子は転写調節や、転写後のＲＮＡの安定化に寄与する、単独では転写を起こせないＤＮＡまたはＲＮＡ上の領域のことである。調節因子としては特に限定されないが、ウッドチャック肝炎ウイルス由来調節エレメント（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＷＰＲＥ、米国特許６１３６５９７号明細書）等が挙げられる。
上記外来遺伝子、プロモーター、エンハンサー、調節因子等はベクターコンストラクト上でプロウイルスの５´末端および３´末端の間に挿入される。
上記ウイルスベクターは、５’末端、３’末端に長い反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＬＴＲ）の少なくとも一部を含む。ＬＴＲは転写プロモーター遺伝子やｐｏｌｙＡ付加シグナルを持つことから、プロモーター遺伝子やターミネーター遺伝子として利用し得る。ウイルスベクターにおいて、目的タンパク質のコード配列、プロモーター遺伝子、転写エンハンサー及び／又は調節エレメントは、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に含まれる。ＬＴＲ以外のプロモーターを用いる差異は、プロモーターの下流に目的タンパク質のコード配列を接続した構造を有することが好ましい。ウイルスベクターが転写され、ウイルス粒子が作製されるためには、５’ＬＴＲから３’ＬＴＲの間にターミネーターやｐｏｌｙＡシグナルを含まないことが好ましい。
An enhancer is a sequence that promotes transcription from a promoter, but refers to a region on DNA or RNA that cannot cause transcription by itself. Since it often functions even when linked to a promoter different from that originally functioning, the combination with the promoter is not limited. Examples of the enhancer include, but are not limited to, SV40, CMV, thymidine kinase enhancer, steroid response element, lysozyme enhancer, and the like.
Regulatory factors are regions on DNA or RNA that cannot contribute to transcription by themselves, contributing to transcriptional regulation and stabilization of RNA after transcription. Although it does not specifically limit as a regulatory factor, Woodchuck hepatitis virus origin regulatory element (Woodchuck post-transcriptional regulatory element: WPRE, the US Patent 6136597 specification) etc. are mentioned.
The foreign gene, promoter, enhancer, regulatory factor, etc. are inserted between the 5 ′ end and 3 ′ end of the provirus on the vector construct.
The viral vector includes at least a part of a long terminal repeat (LTR) at the 5 ′ end and the 3 ′ end. Since the LTR has a transcription promoter gene and a polyA addition signal, it can be used as a promoter gene or a terminator gene. In the viral vector, the coding sequence of the target protein, promoter gene, transcription enhancer and / or regulatory element is contained between the 5 ′ LTR and the 3 ′ LTR. The difference in using a promoter other than LTR preferably has a structure in which the coding sequence of the target protein is connected downstream of the promoter. In order for a viral vector to be transcribed and a virus particle to be produced, it is preferable that no terminator or polyA signal is contained between the 5 ′ LTR and the 3 ′ LTR.
次に、本発明で好適に用いられる複製能欠損型レトロウイルスベクターの調製法について、好ましい一態様を説明する。
本発明で用いられる複製能欠損型レトロウイルスベクターは、複製に必要とされるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を欠失している。ｇａｇ、ｐｏｌ遺伝子を保有するパッケージング細胞に目的とする有用タンパク質を発現可能な複製能欠損型レトロウイルスプラスミドとＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを共導入し、培養上清をウイルス液とする。あるいは、望ましくは、上記ウイルス液を感染させたパッケージング細胞にＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを導入し、培養上清をウイルス液とする。ウイルス液は、必要に応じて濃縮することが好ましい。
複製能欠損型レトロウイルスベクターの調製は、このような方法に限定されるものではない。
Next, a preferred embodiment of a method for preparing a replication-defective retrovirus vector suitably used in the present invention will be described.
The replication-defective retrovirus vector used in the present invention lacks the gag, pol and env genes required for replication. A replication-deficient retrovirus plasmid capable of expressing a target useful protein and a VSV-G expression plasmid are co-introduced into a packaging cell carrying gag and pol genes, and the culture supernatant is used as a virus solution. Alternatively, desirably, the VSV-G expression plasmid is introduced into the packaging cells infected with the virus solution, and the culture supernatant is used as the virus solution. The virus solution is preferably concentrated as necessary.
The preparation of a replication-defective retrovirus vector is not limited to such a method.
上記ウイルス液において、ウイルスベクターの力価（タイター）は、１×１０８〜１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌが好ましく、１×１０９〜１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌがより好ましい。
上記ウイルス液の力価は、レンチウイルス以外のレトロウイルスベクターの場合、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＣＲＬ−１６５８）を使用し、レンチウイルスベクターの場合は、Ｈｅｌａ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＣＣＬ−２）を使用して、これら細胞にウイルス液を添加したとき、感染した細胞の数によって定義する。具体的には、２４ウェル培養プレートの各ウェル（底面積約１．９ｃｍ２）に存在する５×１０４のＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＨｅｌａ細胞に、１０２から１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、例えばマーカー遺伝子である蛍光タンパク質を発現している細胞の割合を調べることによりウイルス液の力価を測定する。
In the virus solution, the titer of the virus vector is preferably 1 × 10 8 to 1 × 10 10 cfu / ml, more preferably 1 × 10 9 to 1 × 10 10 cfu / ml.
The titer of the virus solution is NIH3T3 cells (American Type Culture Collection CRL-1658) in the case of retroviral vectors other than lentiviruses, and Hela cells (American type in the case of lentiviral vectors). When virus solution is added to these cells using Culture Collection CCL-2), it is defined by the number of infected cells. Specifically, a virus solution diluted at a dilution ratio of 10 2 to 10 6 in 5 × 10 4 NIH3T3 cells or Hela cells present in each well (bottom area of about 1.9 cm 2 ) of a 24-well culture plate The titer of the virus solution is measured by, for example, examining the ratio of cells expressing a fluorescent protein that is a marker gene.
外来遺伝子を導入する標的細胞としては、精巣内にある細胞であれば特に限定されず、精原幹細胞、Ｂ型精原幹細胞、精母細胞、精細胞等の雄性生殖細胞や、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞等の支持細胞等が挙げられ、これら細胞のゲノムに後述の手法によりインビボで外来遺伝子を導入する。 The target cell into which the foreign gene is introduced is not particularly limited as long as it is a cell in the testis. Male germ cells such as spermatogonial stem cells, B-type spermatogonial stem cells, spermatocytes, sperm cells, Sertoli cells, Leydig cells Examples include supporting cells such as cells, and foreign genes are introduced into the genome of these cells in vivo by the method described below.
遺伝子導入方法としてはリン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等の既知のあらゆる方法が可能であるが、マイクロインジェクション法が簡便で好ましい。
また遺伝子導入器具としては、特に限定されないが、ガラス製、プラスチック製素材が強度、再現性が良く、好ましい。遺伝子導入器具の形状としては限定されないが、先端の細いまたは鋭利である針または管状の形状が好ましく、精巣にアクセスするため必要に応じ先端を曲げたものも用いることが出来る。
As the gene introduction method, any known method such as calcium phosphate method, lipofection method, DEAE dextran method, electroporation method, microinjection method and the like can be used, but the microinjection method is simple and preferable.
Moreover, the gene introduction instrument is not particularly limited, but a glass or plastic material is preferable because of its good strength and reproducibility. Although the shape of the gene introduction device is not limited, a needle or a tubular shape having a thin tip or a sharp tip is preferable, and a tip having a bent tip can be used as needed to access the testis.
上述のトランスジェニック鳥類作製法で得られた鳥類は、一部の雄性生殖細胞及び／又は支持細胞に外来遺伝子を有するＧ０トランスジェニック鳥類であり、外来遺伝子を有する雄性生殖細胞が分化して、外来遺伝子を有する精子となる。そして、外来遺伝子が導入された精子を持つＧ０トランスジェニック鳥類との自然交配または人工交配により誕生したＧ１トランスジェニック鳥類とその子孫は、全ての体細胞に外来遺伝子を有することとなる。 Birds obtained by the above-described method for producing transgenic birds are G0 transgenic birds having foreign genes in some male germ cells and / or supporting cells, and the male germ cells having foreign genes are differentiated and foreign It becomes a sperm with a gene. And G1 transgenic birds and their offspring born by natural mating or artificial mating with G0 transgenic birds having sperm into which a foreign gene has been introduced will have the foreign gene in all somatic cells.
以下に、幼雛期に雄鳥類の雄性生殖器へ遺伝子を導入し、外来遺伝子が導入された精子を持つＧ０トランスジェニック鳥類を得た後、全身のすべての細胞に外来遺伝子を有する鳥類個体を作製する好ましい形態での手法を開示するが、記載の手法に限定されることはない。
幼雛期の雄性生殖器に遺伝子導入を行った雄鳥類個体を、公知の獣医学的または畜産学的方法によって性成熟させる。ここに言う性成熟とは、雄個体が精子を産生することを示す。性成熟した該雄個体を、雌鳥類個体と交配させ、得られうる子孫より外来遺伝子を有する個体を選抜する。
Below, after introducing a gene into the male reproductive organs of a male bird at a young stage to obtain a G0 transgenic bird having a sperm into which the foreign gene has been introduced, an individual bird having the foreign gene in all cells of the whole body is prepared. However, the present invention is not limited to the described technique.
A male bird individual introduced with a gene into the male reproductive organs at a young stage is sexually matured by a known veterinary or animal husbandry method. Sexual maturity here means that a male individual produces sperm. The sexually mature male individual is mated with a hen individual, and an individual having a foreign gene is selected from the progeny obtained.
交配方法としては、自然交配または人工交配を用いることが出来る。ここでいう人工交配としては、雄個体精子を雌卵子と受精させ得るあらゆる公知の手法を用いることができ、例として、精子を採取して雌生殖器へ導入する方法、卵子への体外受精等が挙げられるがこれに限定されない。
交配する雌個体としては特に限定しないが、同種の鳥類の他に、異種鳥類も可能である。野生型鳥類や外来遺伝子を導入したトランスジェニック鳥類を交配に用いることも可能であるが特に限定しない。
As a mating method, natural mating or artificial mating can be used. Artificial mating here can be any known technique that can fertilize male individual sperm with female egg, such as methods of collecting sperm and introducing them into the female genital organ, in vitro fertilization to eggs, etc. Although it is mentioned, it is not limited to this.
Although it does not specifically limit as a female individual | cross to cross, A heterogeneous bird is also possible other than the same kind of birds. Wild-type birds and transgenic birds introduced with a foreign gene can be used for mating, but are not particularly limited.
交配によって得られる個体について、導入した外来遺伝子を有する個体の選別方法は公知のあらゆる手法を用いることができる。例えば、鳥類体細胞ゲノムDNAを用いたＰＣＲにより目的遺伝子の導入確認が挙げられるが、これに限定しない。また、導入遺伝子が発現しているか否かの選別には公知のあらゆる手段を用いることができ、ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）やＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ等の免疫学的方法が挙げられるが、これに限定しない。
本発明によると、交配によって得られる全身に目的とする外来遺伝子を有する鳥類を得、該個体およびその子孫から得られる血液、体細胞及び／又は卵より、目的とする有用タンパク質を既知の抽出、精製法により回収し、医薬品原料としての供給が可能である。
抽出、精製に用いる方法としては特に限定されず、例えば、分別沈殿、遠心法、二相分離、限外濾過、膜分離、クロマトグラフィー、免疫化学的方法、結晶化することのいずれか及び／又はその組み合わせを含む方法などが挙げられる。
Any known method can be used as a method for selecting an individual having an introduced foreign gene for an individual obtained by mating. For example, the introduction of the target gene can be confirmed by PCR using avian somatic cell genomic DNA, but is not limited thereto. In addition, any known means can be used to select whether or not the transgene is expressed, and examples include, but are not limited to, immunological methods such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Western blotting. do not do.
According to the present invention, a bird having a target foreign gene in its whole body obtained by mating is obtained, and a target useful protein is extracted from blood, somatic cells and / or eggs obtained from the individual and its offspring, It can be recovered by a purification method and supplied as a raw material for pharmaceuticals.
The method used for extraction and purification is not particularly limited. For example, fractional precipitation, centrifugation, two-phase separation, ultrafiltration, membrane separation, chromatography, immunochemical method, crystallization, and / or Examples include a method including the combination.
本発明により、極めて高い確率で導入した外来遺伝子を後代へ伝播できるトランスジェニック鳥類作製が可能となり、すべての細胞に均一に外来遺伝子を有するＧ１トランスジェニック鳥類およびその子孫において有用タンパク質の高生産が可能となる。 The present invention makes it possible to produce a transgenic bird that can transmit a foreign gene introduced with a very high probability to progeny, and to produce a high production of useful proteins in G1 transgenic birds having a foreign gene uniformly in all cells and their progeny. It becomes.
本発明の実施例を以下に示すが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
以下、断りがない限りＰＣＲ反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、ライゲーションにはＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、プロメガ社製）、ＰＣＲ反応液および電気泳動により得たＤＮＡ断片精製にはＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ ｕｐ−（東洋紡社製）を使用した。操作は特に記載のない限り説明書の指示に従った。
（実施例１）複製能欠損型レトロウイルスベクターコンストラクトの構築
複製能欠損型レトロウイルスベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβを、ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｓｅｐｔ．２００５，ｐ．１０８６４−１０８７４に記載の方法に従って、構築した。構築方法を以下に示す。
複製能欠損型レトロウイルスベクタープラスミドｐＭＳＣＶｎｅｏ（クローンテック社製）から一連のミューリン・ホスホグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＮｅｏｒ遺伝子を含む断片を制限酵素ＢａｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩによって除去した。また、ｐＬＮＨＸ（クローンテック社製）由来Ｎｅｏｒ遺伝子、ｐｍｉｗＺ由来ニワトリβアクチンプロモーターおよびｐＣＭＶβ由来β−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−ｇａｌ）をｐＭＳＣＶのＢａｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入しｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβとした。本ベクターコンストラクトの概略図を図１に示す。
Examples of the present invention are shown below, but the present invention is not limited to these examples.
Unless otherwise indicated, KOD-Plus-DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) for PCR reactions, LigaFast Rapid DNA Ligation System (trade name, manufactured by Promega Corp.) for ligation, PCR reaction solution and DNA fragments obtained by electrophoresis MagExtractor-PCR & Gel Clean up- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used for purification. The operation was in accordance with the instructions in the manual unless otherwise specified.
(Example 1) Construction of a replication-defective retrovirus vector construct The replication-defective retrovirus vector construct pMSCV / NΔAβ was prepared as described in JOURNAL OF VIROLOGY, Sept. 2005, p. It was constructed according to the method described in 10864-10874. The construction method is shown below.
A fragment containing a series of murine phosphoglycerate kinase (PGK) promoter and Neo r gene was removed from the replication-defective retrovirus vector plasmid pMSCVneo (Clontech) by restriction enzymes BaglII and BamHI. In addition, it was inserted pLNHX the (Clontech) derived from the Neo r gene, pmiwZ derived from chicken β-actin promoter and pCMVβ derived from β- galactosidase gene (β-gal) to BaglII-BamHI site of pMSCV pMSCV / NΔAβ. A schematic diagram of this vector construct is shown in FIG.
（実施例２）複製能欠損型レンチウイルスベクターの作製
複製能欠損型レンチウイルスベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷベクターを構築した。構築方法を以下に示す。
ｐＷＨＶ８（ＡＴＣＣ ４５０９７）ベクターより、ＷＰＲＥ配列を合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡ−３’（配列番号１、下線部はＫｐｎＩ制限酵素サイト）、５’−ＡＴＡＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＣ−３’（配列番号２、下線部はＫｐｎＩ制限酵素サイト）をプライマーとして用いてＰＣＲ（９４℃１５秒、６３℃３０秒、６８℃４０秒；３５サイクル）で増幅した。これを制限酵素ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで処理し、ｐＥＴ−Ｂｌｕｅ２（ノバジェン社製）のＮｏｔＩ−ＫｐｎＩサイトに挿入し、このプラスミドをｐＥＴ−Ｂｌｕｅ２Ｗとした。
ｐＬＮΔＡβ（ＷＯ２００４／０１６０８１）の制限酵素ＮｏｔＩでβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子を切り出した。
ｐｃＤＮＡ４（インビトロジェン社製）のＮｏｔＩ−ＫｐｎＩサイトに、ｐＥＴ−Ｂｌｕｅ２Ｗを制限酵素ＮｏｔＩ、ＫｐｎＩで処理した断片およびβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子を挿入し、ｐｃＤＮＡ４／β−ｇａｌＷとした。
次いで、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＥを作製した。
ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃ（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５：２３１−２３８）を制限酵素ＮｈｅＩで処理し、ｓｃＦｖ−Ｆｃ遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）（東洋紡社製）の制限酵素ＸｂａＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ｓｃＦｖ−Ｆｃとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ｓｃＦｖ−Ｆｃから制限酵素ＸｈａＩ、ＮｏｔＩでｓｃＦｖ−Ｆｃ遺伝子を切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃから制限酵素ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩでニワトリβアクチンプロモーター遺伝子を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）の制限酵素ＮｏｔＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ΔＡｓとした。
ｐＬｅｎｔｉ／ＴＯＰＯ−ＧＦＰ（インビトロジェン社製）を制限酵素ＸｂａＩ、ＳｐｅＩでＧＦＰ遺伝子を切り取り、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）の制限酵素ＸｂａＩ−ＳｐｅＩサイトへ挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＧＦＰとした。
ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ（クローンテック社製）から制限酵素ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩでミューリン・ポスポグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター遺伝子を切り取り、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＧＦＰの制限酵素ＸｈｏＩ−ＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＰＧとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＰＧから制限酵素ＸｈｏＩでＰＧＫプロモーター遺伝子およびＧＦＰ遺伝子を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）の制限酵素ＸｈｏＩサイトに挿入しｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＧＰとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＧＰから制限酵素ＣｌａＩおよびＫｐｎＩでＰＧＫプロモーター遺伝子およびＧＦＰ遺伝子を切り出し、ｐＬｅｎｔｉ／ＴＯＰＯ−ＧＦＰの制限酵素ＣｌａＩ−ＫｐｎＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ＧＰとした。
ｐＬｅｎｔｉ／ＧＰを制限酵素ＸｈｏＩで処理し、再び２断片をライゲーションしてｐＬｅｎｔｉ／ＰＧとした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ΔＡｓから制限酵素ＣｌａＩでニワトリβアクチンプロモーター遺伝子およびｓｃＦｖ−Ｆｃ遺伝子を切り出し、ｐＬｅｎｔｉ／ＰＧの制限酵素ＣｌａＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＧとした。
ＥＧＦＰはｐＩＲＥＳＥＧＦＰ（クローンテック社製）を鋳型として、合成遺伝子５’−ＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣ−３’（配列番号３、下線部はＢａｍＨＩ制限酵素部位）、５’−ＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧ−３’（配列番号４、下線部はＫｐｎＩ制限酵素部位）をプライマーとして、ＰＣＲ（９４℃／１５秒、５２℃／３０秒、６８℃／４８秒；３５サイクル）により増幅し、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩで処理し、ｐＬｅｎｔｉ／ＰＧの制限酵素ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ＰＥとした。これを制限酵素ＨｐａＩ、ＢｌｎＩで処理しＰＧＫプロモーターおよびＥＧＦＰ断片を切りだし、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＧの制限酵素ＨｐａＩ−ＢｌｎＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＥとした。
次にｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥを作製した。
Ｔｈｅ ＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロ社製）のｐＬＰベクター（インビトロ社製）よりＣｅｎｔｒａｌ ＤＮＡ ｆｌａｐ（ウイルスゲノムを宿主核に移行するのを促進する配列、本明細書ではｃＤｆとする。）領域をプライマー５’−ＡＣＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＡＴＴ−３’（配列番号５、下線部はＸｂａＩ制限酵素サイト）および５’−ＡＡＧＴＣＴＡＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＴＣＣ−３’（配列番号６、下線部はＸｂａＩ制限酵素サイト）を用いてＰＣＲ（９４℃１５秒、５９℃３０秒、６８℃３０秒；３５サイクル）で増幅した。これを制限酵素ＸｂａＩで処理し、ｐＬｅｎｔｉ／ΔＡｓＰＥの制限酵素ＸｂａＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥとした。
ここで、ｐｃＤＮＡ４／β−ｇａｌＷを制限酵素ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩで処理し、β−ｇａｌおよびＷＰＲＥ遺伝子を切り出した。また、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥを制限酵素ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩで処理し、β−ｇａｌおよびＷＰＲＥ遺伝子を挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔΔＡβＷとした。また、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆ−ΔＡｓＰＥを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで処理し、ｃＤｆおよびアクチンプロモーター遺伝子を切り取り、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔΔＡβＷの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入し、ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷとした。本ベクターコンストラクトの概略図は図１に示す。
(Example 2) Production of replication-defective lentiviral vector A replication-defective lentiviral vector construct pLenti / cDfΔAβW vector was constructed. The construction method is shown below.
From the pWHV8 (ATCC 45097) vector, the WPRE sequence was synthesized from the oligonucleotide 5′-ACC GGTACC AATCAACCCTCGGATACAAA-3 ′ (SEQ ID NO: 1, underlined KpnI restriction enzyme site), 5′-ATA GGTACC CAGGCGGGGGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 2) The underlined portion was amplified by PCR (94 ° C. for 15 seconds, 63 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 40 seconds; 35 cycles) using KpnI restriction enzyme site) as a primer. This was treated with restriction enzymes NotI and KpnI and inserted into the NotI-KpnI site of pET-Blue2 (manufactured by Novagen), and this plasmid was designated as pET-Blue2W.
The β-galactosidase (β-gal) gene was excised with the restriction enzyme NotI of pLNΔAβ (WO2004 / 016081).
A fragment obtained by treating pET-Blue2W with restriction enzymes NotI and KpnI and a β-galactosidase (β-gal) gene were inserted into the NotI-KpnI site of pcDNA4 (manufactured by Invitrogen) to obtain pcDNA4 / β-galW.
Subsequently, pLenti / ΔAsPE was prepared.
pMSCV / GΔAscFv-Fc (J. Biosci. Bioeng. 95: 231-238) was treated with the restriction enzyme NheI, and the scFv-Fc gene was inserted into the restriction enzyme XbaI site of pBluescript KS (−) (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) pBluescript / scFv-Fc.
The scFv-Fc gene was excised from pBluescript / scFv-Fc with restriction enzymes XhaI and NotI, the restriction enzyme NheI and NotI were excised from pMSCV / GΔAscFv-Fc, and the restriction enzyme NotI site of pBluescript KS (−) was excised. Inserted into pBluescript / ΔAs.
pLenti / TOPO-GFP (manufactured by Invitrogen) was used to cut out the GFP gene with restriction enzymes XbaI and SpeI, and inserted into the restriction enzyme XbaI-SpeI site of pBluescript KS (-) to obtain pBluescript / GFP.
The murine pospoglycerate kinase (PGK) promoter gene was excised from pMSCVpuro (manufactured by Clontech) with restriction enzymes XhoI and PstI and inserted into the pBluescript / GFP restriction enzyme XhoI-PstI site to obtain pBluescript / PG.
The PGK promoter gene and the GFP gene were excised from pBluescript / PG with the restriction enzyme XhoI and inserted into the restriction enzyme XhoI site of pBluescript KS (-) to obtain pBluescript / GP.
The PGK promoter gene and GFP gene were excised from pBluescript / GP with restriction enzymes ClaI and KpnI, and inserted into the restriction enzyme ClaI-KpnI site of pLenti / TOPO-GFP to obtain pLenti / GP.
pLenti / GP was treated with the restriction enzyme XhoI, and the two fragments were ligated again to obtain pLenti / PG.
The chicken β actin promoter gene and the scFv-Fc gene were excised from pBluescript / ΔAs with the restriction enzyme ClaI and inserted into the restriction enzyme ClaI site of pLenti / PG to obtain pLenti / ΔAsPG.
EGFP is pIRESEGFP (manufactured by Clontech) as a template, synthetic gene 5'-ATT GGATCC ACACGATGATAATATGGCCAC-3 ' ( SEQ ID NO: 3, underlined BamHI restriction enzyme site), 5'- GGTACC AGGCCGCTTTACTTGTACAG-3' ( SEQ ID NO: 4 Amplified by PCR (94 ° C./15 seconds, 52 ° C./30 seconds, 68 ° C./48 seconds; 35 cycles) using the primer (KpnI restriction enzyme site) as a primer, treated with restriction enzymes BamHI and KpnI, and pLenti It was inserted into the restriction enzyme BamHI-KpnI site of / PG to obtain pLenti / PE. This was treated with restriction enzymes HpaI and BlnI, and the PGK promoter and EGFP fragment were excised and inserted into the restriction enzyme HpaI-BlnI site of pLenti / ΔAsPG to obtain pLenti / ΔAsPE.
Next, pLenti / cDf-ΔAsPE was prepared.
The central DNA flap (sequence for facilitating transfer of the viral genome to the host nucleus, referred to as cDf in this specification) from the pLP vector (manufactured by Invitro) of The ViraPower Lenticular Expression System (manufactured by Invitro) is the primer 5. PCR using '-ACG TCTAGA AGACAGCAGTACAAATGGCAGATTT-3' (SEQ ID NO: 5, underlined XbaI restriction enzyme site) and 5'-AAG TCTAGA CCAAACTGGATCTCTGCTGTCC-3 '(SEQ ID NO: 6, underlined XbaI restriction enzyme site) 94 15 seconds at 59 ° C., 30 seconds at 59 ° C., 30 seconds at 68 ° C .; 35 cycles). This was treated with the restriction enzyme XbaI and inserted into the restriction enzyme XbaI site of pLenti / ΔAsPE to obtain pLenti / cDf-ΔAsPE.
Here, pcDNA4 / β-galW was treated with the restriction enzyme XhoI-KpnI to cut out β-gal and WPRE genes. In addition, pLenti / cDf-ΔAsPE was treated with restriction enzyme XhoI-KpnI, and β-gal and WPRE genes were inserted to obtain pLenti / cDfΔΔAβW. Further, pLenti / cDf-ΔAsPE was treated with restriction enzymes EcoRI and SalI, cDf and actin promoter gene were excised, and inserted into pLenti / cDfΔΔAβW restriction enzyme EcoRI-XhoI site to obtain pLenti / cDfΔAβW. A schematic diagram of this vector construct is shown in FIG.
（実施例３）ｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβとｐＶＳＶ−Ｇを用いた複製能欠損型レトロウイルスベクターの調製
以後、特に記述のない限り、培地は１０％の牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ；ギブコ社製）を用いた。培養は３７℃、ＣＯ２５％で行った。
実施例１で構築したベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβより複製能欠損型レトロウイルスベクターを調製するため、パッケージング細胞ＧＰ２９３（クロンテック社製）を１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養ディッシュ（底面積６０ｃｍ２）に５×１０６細胞／ディッシュ（７０％コンフルエント）になるように播種した（翌日９０％コンフルエントになるようにする）。次の日、培地を取り除き、７ｍｌの培地を加えた。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００（インビトロジェン社製）を１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名、ギブコ社製）に懸濁し、室温で５分置いた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液）。１２μｇのｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβと１２μｇのｐＶＳＶ−Ｇを１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した（プラスミドＤＮＡ溶液）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とプラスミドＤＮＡ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを培養ディッシュに全量加え、６時間培養した。６時間後、培地を取り除き、９ｍｌの培地と２００μｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）を加え、さらに２４時間培養した。
培養上清を０．４５μｍセルロースアセテートフィルター（アドバンテック社製）に通し、遠心管に集め、５００００×ｇで９０分間遠心分離した。ウイルスの沈殿に約１０μ１のＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加して、一晩４℃で静置させ、翌日ウイルス粒子を懸濁し、ウイルス溶液とした。
(Example 3) After preparation of replication-defective retrovirus vector using pMSCV / NΔAβ and pVSV-G, unless otherwise stated, the medium was 10% fetal bovine serum (FBS) and 50 units / Dulbecco's Modified Eagle Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM; manufactured by Gibco) containing ml of penicillin and streptomycin was used. The culture was performed at 37 ° C. and 5% CO 2 .
In order to prepare a replication-defective retrovirus vector from the vector construct pMSCV / NΔAβ constructed in Example 1, packaging cell GP293 (Clontech) was added to a 100 mm collagen-coated culture dish (bottom area 60 cm 2 ). The cells were seeded to be 10 6 cells / dish (70% confluent) (the next day, 90% confluent). The next day, the medium was removed and 7 ml of medium was added. 56 μl of Lipofectamine. 2000 (manufactured by Invitrogen) was suspended in 1.5 ml of Opti-MEM I Reduced Medium (trade name, manufactured by Gibco) and placed at room temperature for 5 minutes (Lipofectamine.2000 solution). 12 μg of pMSCV / NΔAβ and 12 μg of pVSV-G were suspended in 1.5 ml of Opti-MEM I Reduced Medium (plasmid DNA solution). Lipofectamine. 2000 solution and plasmid DNA solution were mixed and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. This was added to the culture dish and cultured for 6 hours. After 6 hours, the medium was removed, 9 ml of medium and 200 μl of 1M HEPES Buffer Solution (manufactured by Gibco) were added, and further cultured for 24 hours.
The culture supernatant was passed through a 0.45 μm cellulose acetate filter (manufactured by Advantech), collected in a centrifuge tube, and centrifuged at 50000 × g for 90 minutes. About 10 μl of TNE buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 130 mM NaCl, 1 mM EDTA) was added to the virus precipitate, allowed to stand overnight at 4 ° C., and the virus particles were suspended the next day. It was.
（実施例４）ｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβ安定パッケージング細胞の選択
本発明では、高力価の複製能欠損型レトロウイルスベクターを得るために、一旦安定パッケージング細胞を作製し、それを用いて改めて複製能欠損型レトロウイルスベクターを作製した。
ウイルス感染の前日に２４ウェル培養プレート（底面積１．９ｃｍ２）にＧＰ２９３細胞を１．５×１０４細胞／ウェルとなるように播種し培養した。ウイルス感染の当日１０μｇ／ｍｌのポリプロピレンを含有する培地１ｍｌと交換した。これに実施例３で作製したウイルス液を感染させた。以後、細胞を限界希釈法によりクローン化した。具体的には、次の日、細胞を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ社製）を含む培地に懸濁し、同じ培地に１０細胞／ｍｌとなるように希釈した。希釈した細胞を９６ウェル培養プレートに１００μｌずつ播種し（ウェルに１個の細胞が入るようにする）、細胞増殖速度が速く、ＧＰ２９３と形態の近い細胞を選択し、ｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβ安定パッケージング細胞クローンを得た。
(Example 4) Selection of pMSCV / NΔAβ stable packaging cell In the present invention, in order to obtain a high-titer replication-deficient retrovirus vector, a stable packaging cell was once generated and used again to replicate. A defective retroviral vector was prepared.
The day before virus infection, GP293 cells were seeded at a density of 1.5 × 10 4 cells / well in a 24-well culture plate (bottom area 1.9 cm 2 ) and cultured. On the day of virus infection, the medium was replaced with 1 ml of medium containing 10 μg / ml polypropylene. This was infected with the virus solution prepared in Example 3. Thereafter, the cells were cloned by limiting dilution. Specifically, the next day, the cells were suspended in a medium containing 800 μg / ml G418 (manufactured by Gibco) and diluted to 10 cells / ml in the same medium. 100 μl of the diluted cells are seeded in a 96-well culture plate (so that one cell is contained in the well), and a cell with a high cell growth rate and a cell similar to GP293 is selected, and pMSCV / NΔAβ stable packaging cells A clone was obtained.
（実施例５）ｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβ安定パッケージング細胞とｐＶＳＶ−Ｇを用いた複製能欠損型レトロウイルスベクターの調製
実施例４で得られたｐＭＳＣＶ／ＮΔＡβ安定パッケージング細胞を１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養ディッシュに５×１０６細胞／ディッシュ（７０％コンフレント）になるように播種した（翌日９０％コンフルエントになるようにする）。次の日、培地を取り除き、７ｍｌの培地を加えた。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００を１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁し、室温で５分置いた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液）。１２μｇのｐＶＳＶ−Ｇを１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した（ｐＶＳＶ−Ｇ溶液）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とｐＶＳＶ−Ｇ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを培養ディッシュに全量加え、６時間培養した。６時間後、培地を取り除き、９ｍｌの培地と２００μｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、さらに２４時間培養した。
培養上清を０．４５μｍセルロースアセテートフィルターに通し、遠心管に集め、５００００×ｇで９０分間遠心分離し、約１０μ１のＴＮＥ緩衝液を添加して、一晩４℃で静置させ、翌日ウイルス粒子を懸濁し、複製能欠損型レトロウイルス溶液とした。
(Example 5) Preparation of replication-defective retrovirus vector using pMSCV / NΔAβ stable packaging cells and pVSV-G 100 mm collagen-coated culture of pMSCV / NΔAβ stable packaging cells obtained in Example 4 The dishes were seeded at 5 × 10 6 cells / dish (70% confluent) (becoming 90% confluent the next day). The next day, the medium was removed and 7 ml of medium was added. 56 μl of Lipofectamine. 2000 was suspended in 1.5 ml of Opti-MEM I Reduced Medium and left at room temperature for 5 minutes (Lipofectamine.2000 solution). 12 μg of pVSV-G was suspended in 1.5 ml of Opti-MEM I Reduced Medium (pVSV-G solution). Lipofectamine. 2000 solution and pVSV-G solution were mixed and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. This was added to the culture dish and cultured for 6 hours. After 6 hours, the medium was removed, 9 ml of medium and 200 μl of 1M HEPES Buffer Solution were added, and further cultured for 24 hours.
The culture supernatant is passed through a 0.45 μm cellulose acetate filter, collected in a centrifuge tube, centrifuged at 50000 × g for 90 minutes, added with about 10 μ1 of TNE buffer, and allowed to stand at 4 ° C. overnight. The particles were suspended to obtain a replication-defective retrovirus solution.
（実施例６）ｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷを用いた複製能欠損型レンチウイルスベクターの調製
本発明に用いた複製能欠損型レンチウイルスベクターは、インビトロジェン社製レンチウイルスベクターのプロトコールを参考に作製した。以下、特に断りがない限り、該プロトコールに従った。
複製能欠損型レンチウイルスベクターは以下の手法により調製した。
実施例２で構築したベクターコンストラクトｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷよりレンチウイルスベクターを調製するため、パッケージング細胞２９３ＦＴ細胞（インビトロジェン社製）を１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養ディッシュに５×１０６細胞／ディッシュ（７０％コンフルエント）になるように播種した（翌日９０％コンフルエントになるようにする）。次の日、培地を取り除き、２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、０．１ｍＭ ＭＥＭ Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；ギブコ社製）を加えた５ｍｌのＤ−ＭＥＭに交換した。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００を１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁し、室温で５分置いた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液）。２．２４μｇのｐＬＰ１、３．３６μｇのｐＬＰ２、２．２４μｇのｐＬＰ／ＶＳＶ−Ｇ、４．２μｇのｐＬｅｎｔｉ／ｃＤｆΔＡβＷを１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した（プラスミドＤＮＡ溶液）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とプラスミドＤＮＡ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを培養ディッシュに全量加え、６時間培養した。６時間後、培地を取り除き、１Ｍ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えた９ｍｌのＤ−ＭＥＭ培地を加え、さらに２４時間培養した。培養上清を０．４５μｍセルロースアセテートフィルターに通し、遠心管に集め、５００００×ｇで９０分間遠心分離し、約１０μ１のＴＮＥ緩衝液を添加して、一晩４℃で静置させ、翌日ウイルス粒子を懸濁し、複製能欠損型レンチウイルスベクター溶液とした。
(Example 6) Preparation of replication-defective lentiviral vector using pLenti / cDfΔAβW The replication-defective lentiviral vector used in the present invention was prepared with reference to the lentiviral vector protocol manufactured by Invitrogen. Hereinafter, the protocol was followed unless otherwise specified.
A replication-defective lentiviral vector was prepared by the following method.
In order to prepare a lentiviral vector from the vector construct pLenti / cDfΔAβW constructed in Example 2, 5 × 10 6 cells / dish (70%) of packaging cell 293FT cells (manufactured by Invitrogen) in a 100 mm collagen-coated culture dish. So as to be 90% confluent). On the next day, the medium was removed and replaced with 5 ml of D-MEM supplemented with 2 mM L-glutamine, 0.1 mM MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA; manufactured by Gibco). 56 μl of Lipofectamine. 2000 1.5ml Opti-MEM I suspended in Reduced Medium and left at room temperature for 5 minutes (Lipofectamine. 2000 solution). 2.24 μg pLP1, 3.36 μg pLP2, 2.24 μg pLP / VSV-G, 4.2 μg pLenti / cDfΔAβW were suspended in 1.5 ml Opti-MEM I Reduced Medium (plasmid DNA solution). Lipofectamine. 2000 solution and plasmid DNA solution were mixed and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. This was added to the culture dish and cultured for 6 hours. After 6 hours, the medium was removed, 9 ml of D-MEM medium supplemented with 1M HEPES Buffer Solution was added, and further cultured for 24 hours. The culture supernatant is passed through a 0.45 μm cellulose acetate filter, collected in a centrifuge tube, centrifuged at 50000 × g for 90 minutes, added with about 10 μ1 of TNE buffer, and allowed to stand at 4 ° C. overnight. The particles were suspended to obtain a replication-defective lentiviral vector solution.
（実施例７）複製能欠損型レトロウイルスベクターの力価測定
複製能欠損型レトロウイルス液の力価は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＣＲＬ−１６５８）にレトロウイルス液を添加したとき、感染し発現した細胞の数によって定義した。
２４ウェル培養プレートに１．５×１０４細胞／ウェルで播種した。翌日の細胞数３×１０４細胞／ウェルに対して、１０２〜１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、４８時間後にＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ；１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４）で３回洗浄し、０．２５％グルタルアルデヒド溶液を加え４℃で１０分間置いた。その後、ＰＢＳで４回洗浄し、Ｘ−ｇａｌ染色溶液（２００ｍＭ Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、２００ｍＭ Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］、２Ｍ ＭｇＣｌ、２０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ／Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を加え、室温で３〜６時間置いた後、β−ガラクトシダーゼの活性を示す細胞数を求めた。本発明では、ウイルス力価は５．６×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。
(Example 7) Measurement of titer of replication-deficient retrovirus vector The titer of replication-deficient retrovirus solution was determined when the retrovirus solution was added to NIH3T3 cells (American Type Culture Collection CRL-1658). , Defined by the number of infected and expressed cells.
A 24-well culture plate was seeded at 1.5 × 10 4 cells / well. 1 ml of virus solution diluted at a dilution ratio of 10 2 to 10 6 times is added to 3 × 10 4 cells / well on the next day, and after 48 hours, Phosphate-Buffered Saline (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl) , 8.1 mM Na 2 HPO 4 · 12H 2 O, 1.5 mM KH 2 PO 4 , pH 7.4) three times, and a 0.25% glutaraldehyde solution was added and left at 4 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the plate was washed 4 times with PBS, and X-gal staining solution (200 mM K 3 [Fe (CN) 6 ], 200 mM K 4 [Fe (CN) 6 ]), 2M MgCl, 20 mg / ml X-gal / N, N -Dimethylformamide) was added and allowed to stand at room temperature for 3 to 6 hours, and then the number of cells showing β-galactosidase activity was determined. In the present invention, the virus titer was 5.6 × 10 9 cfu / ml.
（実施例８）複製能欠損型レンチウイルスベクターの力価測定
複製能欠損型レンチウイルスベクター液の力価は、Ｈｅｌａ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＣＣＬ−２）に複製能欠損型レンチウイルスベクター液を添加したとき、感染し発現した細胞の数によって定義した。
２４ウェル培養プレートに２×１０４細胞／ウェルで播種した。翌日の細胞数４×１０４細胞／ウェルに対して、１０２〜１０６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、実施例７と同様にしてβ−ガラクトシダーゼの活性を示す細胞数を求めた。本発明では、ウイルス力価は１．５×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。
(Example 8) Measurement of titer of replication-defective lentiviral vector The titer of replication-defective lentiviral vector solution was determined to be replication-defective lentivirus in Hela cells (American Type Culture Collection CCL-2). It was defined by the number of cells that were infected and expressed when the vector solution was added.
A 24-well culture plate was seeded at 2 × 10 4 cells / well. 1 ml of the virus solution diluted at a dilution ratio of 10 2 to 10 6 times is added to 4 × 10 4 cells / well on the next day, and the number of cells showing β-galactosidase activity is determined in the same manner as in Example 7. Asked. In the present invention, the virus titer was 1.5 × 10 9 cfu / ml.
（実施例９）ニワトリ精巣への遺伝子導入のためのガラスマイクロピペットの作製
ウイルス溶液打ち込み用のガラスマイクロピペットは、ガラス管をマイクロピペット作製機で加工し、外径約２０μｍになるように作製した。また、精巣へウイルスを注入しやすいように、先を約４５度に曲げて使用した。
(Example 9) Production of glass micropipette for gene introduction into chicken testis A glass micropipette for driving virus solution was produced by processing a glass tube with a micropipette making machine to an outer diameter of about 20 μm. . In addition, the tip was bent at about 45 degrees for easy injection of virus into the testis.
（実施例１０）ニワトリ精巣へのウイルスベクターを用いた遺伝子導入
生後２日目のオスの雛（１２羽；うち、５羽に実施例５で調整した複製能欠損型レトロウイルスベクター溶液を注入。７羽に実施例６で調製した複製能欠損型レンチウイルス溶液を注入）の大腿部にベントバルビタール麻酔液を筋肉注射し、眠らせた。その後、左側を下に保定し、皮膚、腹腔を切開し、精巣を露出させた（左側の精巣にのみ遺伝子導入を行った）。ピンセットで精巣を固定し、マイクロインジェクター（Ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ ５２４６；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＨａｍＢｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、濃縮したウイルス溶液をそれぞれ約６〜８μｌ程度注入した。最後に腹腔、皮膚の順番でアロンアルファー（商品名、東亜合成社製）により接着した。
(Example 10) Gene transfer using a viral vector to a chicken testis Two days after birth, male chicks (12; 5 of them were injected with a replication-defective retrovirus vector solution prepared in Example 5). The bent barbital anesthetic solution was injected intramuscularly into the thighs of the replication-defective lentivirus solution prepared in Example 6 in 7 birds and allowed to sleep. Thereafter, the left side was held down, the skin and abdominal cavity were incised to expose the testis (gene transfer was performed only on the left testis). The testis was fixed with tweezers, and about 6 to 8 μl of each concentrated virus solution was injected using a microinjector (Transjector 5246; Eppendorf, Hamburg, Germany). Finally, it was adhered with Aron Alpha (trade name, manufactured by Toa Gosei Co., Ltd.) in the order of the abdominal cavity and skin.
（実施例１１）ニワトリ精巣ゲノムへの導入遺伝子の組込み検出による検定
ウイルス導入後７日目（生後９日目）の雄の雛から摘出した精巣より、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡社製）を用いてゲノムを精製した。これを鋳型としたＰＣＲ（９４℃／１５秒、６０℃／３０秒、６８℃／３０秒；３５サイクル）により遺伝子の導入を確認した。プライマーは５’−ＧＴＣＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＧＣ−３’（配列番号７）、５’−ＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＣＡＴＡＣＡＧ−３’（配列番号８）を用いた。結果を図２に示す。図２中のＲは右側精巣を示し、Ｌはインジェクションを行った左側精巣を示す。
図２の結果から、遺伝子導入をおこなった左側の精巣ゲノムに導入遺伝子が挿入されていることが分かる。しかしながら、対照実験として行った、右側の精巣のゲノムではその挿入が確認できない。
(Example 11) Assay by detecting integration of transgene into chicken testis genome From the testis excised from male chicks 7 days after introduction of virus (9 days after birth), the genome was extracted using MagExtractor (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). Purified. Gene introduction was confirmed by PCR using this as a template (94 ° C./15 seconds, 60 ° C./30 seconds, 68 ° C./30 seconds; 35 cycles). As the primer, 5′-GTCACGAGCATCATCCCTCTGC-3 ′ (SEQ ID NO: 7), 5′-GGCTTCATCCACCACATACAG-3 ′ (SEQ ID NO: 8) was used. The results are shown in FIG. In FIG. 2, R indicates the right testis, and L indicates the left testis after injection.
From the result of FIG. 2, it can be seen that the transgene is inserted into the testis genome on the left side after the gene transfer. However, the insertion cannot be confirmed in the right testis genome, which was performed as a control experiment.
（実施例１２）ニワトリ精巣での導入遺伝子の発現検出による検定
ウイルス導入後７日目（生後９日目）の雄の雛から摘出した精巣をＰＢＳで３回洗浄し、アルデヒド固定液（０．２％ ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ、２％ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、ＰＢＳ）を加え、４℃で６０分間固定した。その後、ＰＢＳで４回洗浄し、Ｘ−ｇａｌ染色溶液を加え、３７℃で３時間おいたところ、生殖腺への定着を確認することができた。結果を図３に示す。図３の結果から複製能欠損型レトロウイルス及び複製能欠損型レンチウイルスでの遺伝子導入で精巣に目的遺伝子が挿入され、発現していることが分かる。
(Example 12) Assay by detection of transgene expression in chicken testis Testes excised from male chicks 7 days after introduction of virus (9 days after birth) were washed 3 times with PBS, and aldehyde fixative (0. 2% globaldehyde, 2% formaldehyde, PBS) was added and fixed at 4 ° C. for 60 minutes. Thereafter, the plate was washed 4 times with PBS, an X-gal staining solution was added, and after standing at 37 ° C. for 3 hours, colonization in the gonads could be confirmed. The results are shown in FIG. From the results of FIG. 3, it can be seen that the gene of interest is inserted into the testis and expressed by gene transfer with a replication-defective retrovirus and a replication-defective lentivirus.
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