JP2006271266A - Highly expressing and efficient transgenic birds - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はウッドチャック・肝炎ウイルスの転写後制御因子（ＷＰＲＥ）配列などのｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子を有する自己複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いて鳥類受精卵の孵卵開始後２４時間以降の初期胚へ外来遺伝子を導入することを特徴としたＧ０トランスジェニックキメラ鳥類およびその子孫並びにその作製法に関する。 The present invention uses a retrovirus vector lacking self-replicating ability having a post-transcriptional regulator capable of stabilizing mRNA such as a woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulator (WPRE) sequence. The present invention relates to a G0 transgenic chimeric bird characterized by introducing a foreign gene into an early embryo after the time, its progeny, and a method for producing the same.
近年、抗体や生理活性タンパク質に代表される高機能性タンパク質製剤が数多く上市され、医薬品、食品業界で注目されている。しかし生理活性の高いタンパク質医薬品類は、例えば糖鎖修飾のように様々な翻訳後修飾が必要とされるため、生産コストの高い発現システムを用いて製造されているのが現状である。例として、リウマチ治療に用いられる抗ＴＮＦα抗体は臨床試験の結果より一回の投与で体重１ｋｇあたり３ｍｇもの量が必要となり、この量を投与するのに必要な数十万円もの費用が患者の負担となっている。また、別の例として、成長ホルモン分泌不全症の治療薬として用いられるヒト成長ホルモンの投与には、一週間あたりで数万円の費用が必要となっている。 In recent years, many highly functional protein preparations represented by antibodies and physiologically active proteins have been put on the market and attracted attention in the pharmaceutical and food industries. However, protein pharmaceuticals with high physiological activity require various post-translational modifications such as sugar chain modification, and are currently produced using an expression system with a high production cost. As an example, the anti-TNFα antibody used for the treatment of rheumatoid arthritis requires a dose of 3 mg per kg of body weight per administration based on the results of clinical trials. It is a burden. As another example, administration of human growth hormone used as a therapeutic agent for growth hormone secretion deficiency requires tens of thousands of yen per week.
このような現状の中、既存のタンパク質製剤生産方法の代わりとして期待されているのが、トランスジェニック動物にタンパク質を作らせるといういわゆる動物工場である。しかしウシなどの大型哺乳類では性成熟するのに時間がかかり、また大きな飼育スペースを要し、生産コストが大きくなる。また抗体を産生させる場合、ウシなどが本来持っている抗体と目的の抗体を分離することが困難であるという問題がある。 Under such circumstances, what is expected as an alternative to existing methods for producing protein preparations is a so-called animal factory that allows transgenic animals to produce proteins. However, large mammals such as cows take time to sexually mature, require a large breeding space, and increase production costs. Further, when producing antibodies, there is a problem that it is difficult to separate an antibody originally possessed by a cow or the like from a target antibody.
そこで我々の研究室では鳥類に着目した。ニワトリに代表される家禽鳥類は、食肉用、採卵用家畜としての飼育実績が長い。さらに性成熟までの時間が短く、小さなスペースで飼育可能なこと、また、卵に目的タンパク質を蓄積すればニワトリを殺す必要もなく安価なコストでタンパク質を生産できると考えられる。また、ニワトリで抗体を生産する場合、ニワトリ自身の抗体と目的の抗体とを分離することは比較的容易に行うことができるなどから鳥類でのタンパク質製剤生産は有効な手段として期待されている。 Therefore, we focused on birds in our laboratory. Poultry birds represented by chickens have a long history of breeding as meat and egg-collecting livestock. Furthermore, it is considered that the time until sexual maturity is short and can be raised in a small space, and if the target protein is accumulated in the egg, the protein can be produced at a low cost without the need to kill the chicken. In addition, when an antibody is produced in a chicken, the production of a protein preparation in birds is expected as an effective means because it is relatively easy to separate a chicken's own antibody and a target antibody.
ＷＯ２００４／０１６０８１および特開２００２−１７６８８０号は、レトロウイルスベクターによる遺伝子導入鳥類における、目的タンパク質の発現を開示する。しかし、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子の使用を開示も示唆もしない。 WO 2004/016081 and JP 2002-176880 disclose expression of a target protein in a transgenic bird using a retroviral vector. However, it does not disclose or suggest the use of post-transcriptional regulators that can stabilize mRNA.
Schambach et al, Molecular Therapy Vol. 2, No5., 435-445, 2000は、転写後エンハンサーモジュールの正確な選択が、発現されるべきｃＤＮＡの型に依存することを記載する。しかし、Schambach et alは、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子を鳥類に適用して目的タンパク質の生産することを開示も示唆もしない。 Schambach et al, Molecular Therapy Vol. 2, No5., 435-445, 2000, describes that the exact selection of post-transcriptional enhancer modules depends on the type of cDNA to be expressed. However, Schambach et al does not disclose or suggest the application of post-transcriptional regulators that can stabilize mRNA to birds to produce the target protein.
Kwon et al, Biochemical and Biophysical Research Communication 320(2004)442-448は、ＷＲＰＥ配列が導入されたトランスジェニックニワトリが、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現することを開示する。しかし、Kwon et alは、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子を含む自己複製能欠失型レトルウイルスベクターを、孵卵開始後２４時間以降に鳥類受精卵に導入することを開示も示唆もしない。 Kwon et al, Biochemical and Biophysical Research Communication 320 (2004) 442-448 discloses that transgenic chickens introduced with the WRPE sequence express enhanced green fluorescent protein (EGFP). However, Kwon et al does not disclose or suggest that a self-replicating deficient retor virus vector containing a post-transcriptional regulator that can stabilize mRNA is introduced into an avian fertilized egg 24 hours after the start of incubation.
Zufferey et al, Journal of Virology, 1999, 2886-2892は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子が、レトロウイルスベクターによって送達された導入遺伝子の発現を増強することを開示する。しかし、Zufferey et alは、ＷＰＲＥ配列を有するレトロウイルスベクターを鳥類に適用して目的タンパク質の生産することを開示も示唆もしない。
ＷＯ９９／１９４７２は、トランスジェニック鳥によるエリスロポエチンの生産を開示する。しかし、孵卵開始後２４時間以降にレトロウイルスベクターを感染させることは開示も示唆もされない。
Zufferey et al, Journal of Virology, 1999, 2886-2892 discloses that woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulators enhance the expression of transgenes delivered by retroviral vectors. However, Zufferey et al does not disclose or suggest that a retroviral vector having a WPRE sequence is applied to birds to produce the target protein.
WO 99/19472 discloses the production of erythropoietin by transgenic birds. However, there is no disclosure or suggestion that the retroviral vector is infected 24 hours after the start of incubation.
すでに、目的タンパク質を、トランスジェニック鳥類を用いて発現することはなされているが、いまだ発現効率が十分とはいえない。そこで、本願発明は、トランスジェニック鳥類における目的タンパク質の発現のさらなる発現の効率化を課題とする。 The target protein has already been expressed using transgenic birds, but the expression efficiency is still not sufficient. Then, this invention makes it a subject for the further efficiency improvement of the expression of the target protein in transgenic birds.
驚くべきことに、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子を組み込んだ自己複製能欠失型レトロウイルスベクターによって、本発明の課題は達成される。よって、本発明が提供するのは以下の通りである：
ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子および目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターをパッケージング細胞に導入し、組換えレトロウイルスを生産させ、該生産された組換えレトロウイルスを孵卵開始後24時間から120時間（放卵後温めてからの時間が24〜120時間）までの鳥受精卵の初期胚へ導入し、そしてその胚を孵化および成長させる手法により得られるトランスジェニック鳥類およびその作製方法。
Surprisingly, the object of the present invention is achieved by a self-replicating deficient retroviral vector incorporating a post-transcriptional regulator capable of stabilizing mRNA. Thus, the present invention provides the following:
A retroviral vector incorporating a gene encoding a post-transcriptional regulatory factor capable of stabilizing mRNA and a target protein is introduced into a packaging cell to produce a recombinant retrovirus, and the produced recombinant retrovirus is introduced after initiation of incubation. Transgenic birds obtained by the technique of introducing embryos into embryos from 24 to 120 hours (24 to 120 hours after warming and 24 to 120 hours after warming) and then hatching and growing the embryos and their production Method.
本発明により、極めて高い効率で導入遺伝子を発現するトランスジェニック鳥類作製が可能である。また本発明により、感染性ウイルスを放出しない安全なトランスジェニック鳥類による有用タンパク質の効率的、安価な提供が可能となる。 The present invention makes it possible to produce transgenic birds that express transgenes with extremely high efficiency. The present invention also makes it possible to efficiently and inexpensively provide useful proteins by safe transgenic birds that do not release infectious viruses.
１．定義:
本願明細書中においては、レトロウイルスベクターは、プロウイルス由来のDNA ベクターを意味し、レトロウイルスベクターコンストラクトと呼ばれることもあり、プラスミド中に組み入れられたものは、レトロウイルスベクタープラスミドと呼ばれることもある。本願明細書中で、組換えレトロウイルスは、前記レトロウイルスベクターが逆転写されたRNAがパッケージングされたウイルス粒子のことを意味し、単にウイルス又はウイルス粒子と呼ばれることもあり、他の出願又は刊行物中においては、本件明細書中における組換えレトロウイルスのことも、レトロウイルスベクターと呼ばれていることもある。
1. Definition:
In the present specification, a retroviral vector means a DNA vector derived from a provirus, and is sometimes referred to as a retroviral vector construct, and one incorporated into a plasmid is sometimes referred to as a retroviral vector plasmid. . In the present specification, a recombinant retrovirus means a virus particle in which RNA obtained by reverse transcription of the retrovirus vector is packaged, and may be simply referred to as a virus or a virus particle. In the publications, the recombinant retroviruses in this specification are sometimes referred to as retroviral vectors.
２．Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥およびその子孫並びにその生産方法
まず、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥およびその子孫並びにその生産方法について説明する。本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類は、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子および、目的タンパク質をコードする遺伝子配列を組み込んだ、好適には自己複製能欠失型である、組換えレトロウイルスを利用することを特徴とする生産方法により生産される。
2. G0 transgenic chimera bird and its offspring and production method thereof First, the G0 transgenic chimera bird and its offspring and production method thereof will be described. The G0 transgenic chimeric bird of the present invention utilizes a recombinant retrovirus that is preferably self-replicating-deficient, incorporating a post-transcriptional regulator capable of stabilizing mRNA and a gene sequence encoding the target protein. It is produced by a production method characterized by:
２−１．組換えレトロウイルス（概要）
本発明で用いられる組換えレトロウイルスとしては、外来遺伝子を鳥類に導入できる限り、特に限定されない。本発明で用いられる組換えレトロウイルスとしては、安全性の観点から、自己複製能欠失型の組換えレトロウイルスが望ましい。本願発明で用いることができる組換えレトロウイルスとしては、特に限定されるものではないが、例えば、複製能があるものとしては、avian sarcoma leukosis viruses (ASLVs)、特にRous sarcoma virus (RSV)に由来するものがあげられ、自己複製能が欠失した組換えレトロウイルスとしては、遺伝子治療にも用いられている安全でかつ哺乳動物細胞に遺伝子導入した際に比較的安定した発現が期待できる観点からモロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、またはレンチウイルスに由来するものが好ましい。
2-1. Recombinant retrovirus (overview)
The recombinant retrovirus used in the present invention is not particularly limited as long as a foreign gene can be introduced into birds. As the recombinant retrovirus used in the present invention, a recombinant retrovirus lacking self-replicating ability is desirable from the viewpoint of safety. The recombinant retrovirus that can be used in the present invention is not particularly limited. For example, the recombinant retrovirus is derived from avian sarcoma leukosis viruses (ASLVs), particularly Rous sarcoma virus (RSV). Recombinant retroviruses lacking self-replicating ability are safe and used for gene therapy, and can be expected to have relatively stable expression when introduced into mammalian cells. Those derived from Moloney Murin Leukemia virus (MoMLV) or lentivirus are preferred.
２−２．自己複製能が欠失した組換えレトロウイルスの調製
以下、自己複製能が欠失した組換えレトロウイルスを中心に説明するが、複製能がある組換えレトロウイルスについても、当業者に周知の変更をして同様に用いることができることは言うまでもない。
2-2. Preparation of recombinant retrovirus lacking self-replication ability The following description will focus on recombinant retroviruses lacking self-replication ability. Needless to say, it can be used similarly.
安全性を考慮し自己複製能を欠失させる方法としては、例えば遺伝子導入ベクターとして用いられるレトロウイルスベクターをプロウイルスから調製する際に、複製に必要なｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖのうちいずれか又は全てを除去することにより、自己複製能を欠失させる方法があり、自己複製能欠失レトロウイルスベクターと呼ぶ。
自己複製能欠失型レトロウイルスベクターは、目的タンパク質をコードする遺伝子配列、トランスジェニック鳥において該目的タンパク質の発現を駆動し得るプロモーター配列および、ｍＲＮＡを安定化し得る配列を含む。
As a method for eliminating the self-replication ability in consideration of safety, for example, when a retroviral vector used as a gene transfer vector is prepared from a provirus, any one of gag, pol, and env necessary for replication or There is a method of eliminating the self-replicating ability by removing all of them, which is referred to as a self-replicating-deficient retroviral vector.
The self-replicating-deficient retrovirus vector includes a gene sequence encoding a target protein, a promoter sequence capable of driving expression of the target protein in a transgenic bird, and a sequence capable of stabilizing mRNA.
２−２−１．パッケージング細胞
組換えレトロウイルスを生産するパッケージング細胞としては、真核細胞である限り特に限定されない。導入されたレトロウイルスベクターの自己複製能を回復させる観点から、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子のうち一部または全部を導入された真核細胞が好ましい。パッケージング真核細胞にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の内一部のみが導入されている場合、残りの遺伝子を導入させることによって、レトロウイルスベクターの自己複製能を回復させ、すなわち組換えレトロウイルスを該パッケージング細胞に生産させる。該残りの遺伝子を導入する方法は、該遺伝子を該パッケージング細胞に導入できる限り特に限定されないが、該遺伝子をコードするプラスミドを、該パッケージング細胞に導入する方法が挙げられる。導入する方法としては特に限定されないが例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。好ましい実施態様では、ｇａｇおよびｐｏｌを構成的に発現するＧＰ２９３細胞に、ｅｎｖ遺伝子を含むプラスミドを導入させる。
2-2-1. Packaging cell The packaging cell for producing the recombinant retrovirus is not particularly limited as long as it is a eukaryotic cell. From the viewpoint of restoring the self-replication ability of the introduced retroviral vector, eukaryotic cells into which part or all of the gag, pol, and env genes have been introduced are preferred. When only a part of the gag, pol and env genes are introduced into the packaging eukaryotic cell, the self-replication ability of the retroviral vector is restored by introducing the remaining genes, that is, the recombinant retrovirus is The packaging cells are produced. The method for introducing the remaining gene is not particularly limited as long as the gene can be introduced into the packaging cell, and examples thereof include a method for introducing a plasmid encoding the gene into the packaging cell. The introduction method is not particularly limited, and examples thereof include a lipofection method, a calcium phosphate method, and an electroporation method. In a preferred embodiment, a plasmid containing the env gene is introduced into GP293 cells that constitutively express gag and pol.
２−２−２．ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ
鳥類の細胞にこの複製能欠失型組換えレトロウイルスを効率的に感染させるためには、外皮タンパク質（ｅｎｖ）を、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）とした、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプを用いることが、細胞表面の受容体に関わらず、広域宿主へウイルスの侵入が可能となる観点から望ましいがこれに限定されるものではない。上記のＶＳＶ−Ｇタンパク質を発現するＧＰ２９３細胞としては、ｇａｇ、ｐｏｌを構成的に発現するＧＰ２９３細胞に、ＶＳＶ−Ｇタンパク質の発現ベクターをコードするプラスミドをトランスフェクトしてもよいがこの方法に限られたものではない。
2-2-2. VSV-G pseudotype In order to efficiently infect avian cells with this replication-deficient recombinant retrovirus, the coat protein (env) is used as the coat protein of vesicular stomatitis virus (VSV). Although it is preferable to use the VSV-G pseudotype as (VSV-G) from the viewpoint of allowing the virus to enter a broad host regardless of the cell surface receptor, it is not limited thereto. As GP293 cells expressing the above VSV-G protein, a plasmid encoding a VSV-G protein expression vector may be transfected into GP293 cells that constitutively express gag and pol. It is not what was given.
２−２−３．外来遺伝子及びプロモーター
本発明において鳥類に導入される目的タンパク質をコードする遺伝子（外来遺伝子）は特に限定されないが、レトロウイルスに由来しない遺伝子であることが望ましい。レトロウイルスに由来しない遺伝子としては特に限定されず、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）などのマーカーとして用いられるタンパク質をコードする遺伝子又は、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、エリスロポエチン例えばｈＥＰＯ、抗体等の有用タンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。
2-2-3. Foreign gene and promoter The gene (foreign gene) encoding the target protein to be introduced into birds in the present invention is not particularly limited, but is preferably a gene not derived from a retrovirus. The gene not derived from the retrovirus is not particularly limited, and a gene encoding a protein used as a marker such as green fluorescent protein (GFP), human growth hormone (HGH), erythropoietin such as hEPO, antibody, etc. Examples include genes encoding useful proteins.
これらの遺伝子を発現させるプロモーターは鳥類で働くプロモーターであれば特に限定されない。好ましくは、プロモーターは、トランスジェニック鳥において目的タンパク質をコードする遺伝子と作動可能に連結されている。一般的によく用いられる観点からは、サイト・メガロ・ウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター、ミューリン・フォスフォグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなども用いられる。効率的な目的タンパク質の発現の観点からβ−アクチンプロモーター、オボアルブミンプロモーターが好ましい。 The promoter for expressing these genes is not particularly limited as long as it is a promoter that works in birds. Preferably, the promoter is operably linked to the gene encoding the protein of interest in the transgenic bird. From a commonly used viewpoint, a cytomegalovirus (CMV) promoter, a murine phosphoglycerokinase (PGK) promoter, and the like are also used. The β-actin promoter and the ovalbumin promoter are preferable from the viewpoint of efficient expression of the target protein.
２−２−４．ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子
ここにいうｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子は、レトロウイルスによって導入された外来遺伝子を細胞内でｍＲＮＡのポリアデニレーション化を促進またはｍＲＮＡの核外輸送の促進または翻訳活性化に寄与するＤＮＡ配列のことをいい、ｍＲＮＡを安定化しうる転写後調節因子として知られる既知配列としては、スプライシングシグナル（SS: splicing signal）、構成的RNA輸送因子（CTE: constitutive RNA transport element）、 B型肝炎などのヘパドナウイルスの転写後制御因子、ウッドチャック・肝炎ウイルス転写後制御因子（ＷＰＲＥ）などがある。このうち、配列の長さが扱いやすく、動物細胞での目的タンパク発現増強効果の高い観点からウッドチャック・肝炎ウイルス転写後制御因子（ＷＰＲＥ）配列が望ましいがこれに限定されるものではない。
2-2-4. Post-transcriptional regulators that can stabilize mRNA The post-transcriptional regulators that can stabilize mRNA described here promote the polyadenylation of mRNA in cells by introducing foreign genes introduced by retroviruses or the nuclear export of mRNA. A DNA sequence that contributes to activation or translational activation. Known sequences known as post-transcriptional regulators that can stabilize mRNA include splicing signal (SS) and constitutive RNA transport factor (CTE). RNA transport element), post-transcriptional regulators of hepadnaviruses such as hepatitis B, and woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulators (WPRE). Among these, the woodchuck and hepatitis virus post-transcriptional regulatory factor (WPRE) sequence is desirable from the viewpoint of easy handling of the sequence length and a high effect of enhancing the expression of the target protein in animal cells, but is not limited thereto.
２−２−５ レトロウイルスベクターの調製
上記の目的タンパク質をコードする遺伝子及びプロモーターは、プロウイルス由来のベクターコンストラクトの５‘末端（LTR）及び３’末端（LTR）の間に挿入される。
前記ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子であるＤＮＡ配列の位置は、パッケージング細胞において高ウイルスタイターが得られる限り特に限定されない。例えば、前記ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子としてWPREを用いる場合には、プロウイルス由来のベクターコンストラクトにおいて目的タンパク質をコードする遺伝子(以下目的遺伝子とも言う)のすぐ下流に挿入されるのが望ましいがこれに限定されるものではない。
2-2-5 Preparation of Retroviral Vector The gene and promoter encoding the above target protein are inserted between the 5 ′ end (LTR) and the 3 ′ end (LTR) of the provirus-derived vector construct.
The position of the DNA sequence that is a post-transcriptional regulator capable of stabilizing the mRNA is not particularly limited as long as a high virus titer is obtained in the packaging cell. For example, when using WPRE as a post-transcriptional regulator that can stabilize the mRNA, it is desirable that it be inserted immediately downstream of a gene encoding a target protein (hereinafter also referred to as a target gene) in a vector construct derived from provirus. However, it is not limited to this.
２−２−６．組換レトロウイルスの産生
前記調製したレトロウイルスベクターを、周知の方法、例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、又はエレクトロポレーション法などで前記パッケージング細胞、好適にはVSV-G蛋白質を発現する前記パッケージング細胞に導入する。産生された一過性の組換えレトロウイルスを回収する。好適には、組換えレトロウイルスを産生するパッケージング細胞の産生量を測定し、組換えレトロウイルス産生の高い細胞を選抜し増殖することにより、高力価で均一な組換えレトロウイルスを生産することができる。
2-2-6. Production of Recombinant Retrovirus Using the prepared retroviral vector, the packaging cell, preferably the VSV-G protein is expressed by a well-known method such as lipofection, calcium phosphate, or electroporation. Introduce into cells. The produced transient recombinant retrovirus is recovered. Preferably, the production amount of a packaging cell that produces a recombinant retrovirus is measured, and a high-titer and uniform recombinant retrovirus is produced by selecting and proliferating cells that have high production of the recombinant retrovirus. be able to.
ウイルスベクターコンストラクト中にｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子であるＤＮＡ配列を導入したことにより顕著にウイルスタイターが上がる。その確認はこのＤＮＡ配列を導入したレトロウイルスベクターを導入した細胞と導入していないレトロウイルスベクターを導入した細胞のウイルスタイターを比較することにより確認できる。ウイルスタイターの測定はｇａｇ、ｐｏｌを構成的に発現するＧＰ２９３細胞に、ＶＳＶ−Ｇタンパク質の発現ベクターとレトロウイルスベクターをコードするプラスミドを同時にトランスフェクトして組換えレトロウイルスを生産させ、ＮＩＨ３Ｔ３に感染させることで、感染した細胞数の割合により確認することができる。 The introduction of a DNA sequence that is a post-transcriptional regulator that can stabilize mRNA into a viral vector construct significantly increases the viral titer. The confirmation can be confirmed by comparing the virus titer of the cell into which the retroviral vector introduced with this DNA sequence is introduced and the cell into which the retroviral vector not introduced is introduced. Viral titer was measured by simultaneously transfecting GP293 cells that constitutively express gag and pol with a VSV-G protein expression vector and a plasmid encoding a retroviral vector to produce a recombinant retrovirus and infect NIH3T3. By making it, it can confirm by the ratio of the number of infected cells.
２−３．組換えレトロウイルスによる鳥類への感染及び、トランスジェニック鳥類の作製
パッケージング細胞等により生産されたレトロウイルスを鳥受精卵の初期胚に導入される方法としては、特に限定されないが、マイクロインジェクション法（Ｂｏｓｓｅｌａｍ、Ｒ．Ａら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３、５３３）、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。遺伝子導入効率の観点からマイクロインジェクション法が好ましい。
2-3. Infection of birds with recombinant retrovirus and production of transgenic birds The method of introducing a retrovirus produced by packaging cells into an early embryo of an avian fertilized egg is not particularly limited, but a microinjection method ( Bosselam, RA et al. (1989) Science 243, 533), lipofection method, electroporation method and the like. From the viewpoint of gene transfer efficiency, the microinjection method is preferred.
生産された組換えレトロウイルスを、孵卵開始後約２４時間以降約１２０時間以前に鳥初期胚に導入する。効率的に目的遺伝子を発現させる観点より、特に限定されない。例えばニワトリの場合では、好ましくは孵卵開始後約４０時間以降６０時間以前、より好ましくは孵卵開始後５０時間以降６０時間以前、およびもっとも好ましくは孵卵開始後約５５時間前後に導入する。ウズラの場合は、好ましくは孵卵開始後45時間から50時間、より好ましくは孵卵開始後48時間前後に導入する。複製欠失型レトロウイルスベクターに上記のプロモーター、目的タンパク質をコードする遺伝子、ｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子を組み込み、パッケージング細胞に導入して生産させた組換えレトロウイルスを鳥類の初期胚に導入させる場合、その導入位置は特に限定されず、例えば胚盤葉又は分化後の血管、心臓に導入することができる。遺伝子導入効率の観点から心臓に導入することが好ましい。また導入組換えレトロウイルス含有溶液量としては好適には2μｌ以上、１０μｌ以下が望ましい。また、外来遺伝子を持った子孫を得るためには、目的遺伝子が、生殖細胞の前駆細胞、又は始原生殖細胞にも導入されることが望ましい。孵化の方法として、該初期胚が発生しおよび成長し得る限り任意の公知の方法が挙げられる。例えば、本発明者らが開発した人工卵殻による方法（Ｋａｍｉｈｉｒａ，Ｍら（１９９８） Ｄｅｖｅｌｏｐ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．，４０，４４９）が挙げられるがこれに限定されない。 The produced recombinant retrovirus is introduced into the early bird embryo from about 24 hours to about 120 hours after the start of incubation. From the viewpoint of efficiently expressing the target gene, there is no particular limitation. For example, in the case of chickens, it is preferably introduced about 40 hours to 60 hours before the start of incubation, more preferably 50 hours to 60 hours before the start of incubation, and most preferably about 55 hours after the start of incubation. In the case of quail, it is preferably introduced 45 to 50 hours after the start of incubation, more preferably around 48 hours after the start of incubation. Recombinant deletion retrovirus vector incorporates the above promoter, gene encoding target protein, and post-transcriptional regulator that can stabilize mRNA and introduces the recombinant retrovirus produced in packaging cells to produce early avian embryos In the case of introduction into, the introduction position is not particularly limited, and can be introduced into, for example, blastoder, differentiated blood vessel, or heart. It is preferable to introduce into the heart from the viewpoint of gene transfer efficiency. The amount of the introduced recombinant retrovirus-containing solution is preferably 2 μl or more and 10 μl or less. In addition, in order to obtain offspring having a foreign gene, it is desirable that the target gene is also introduced into germ cell progenitor cells or primordial germ cells. As a method of hatching, any known method can be used as long as the early embryo can develop and grow. Examples thereof include, but are not limited to, an artificial eggshell method developed by the present inventors (Kamihira, M et al. (1998) Develop, Growth Differ., 40, 449).
孵化した鳥は、公知の獣医学的または畜産学的方法によって成長させる。
本発明の作製法で遺伝子を導入された鳥類は、その体細胞にモザイクキメラ状に遺伝子が導入されたものでありこの一世代目をＧ０トランスジェニックキメラ鳥類と呼ぶ。またその子孫である導入遺伝子をもった鳥類をＧ１，Ｇ２，Ｇ３〜トランスジェニック鳥類と称する。
Hatched birds are grown by known veterinary or animal husbandry methods.
Birds into which genes have been introduced by the production method of the present invention are those in which genes have been introduced into their somatic cells in a mosaic chimera form, and this first generation is called G0 transgenic chimeric birds. Birds having a transgene that is a descendant thereof are referred to as G1, G2, G3 transgenic birds.
なお、作製したパッケージング細胞及びＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の目的タンパク質の含有量を測定する方法としては特に限定されないがＥＬＩＳＡ等を用いることができる。例えば、目的タンパク質がＨＧＨの場合パッケージング細胞を培養した上清、作製したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の血清、また、その鳥類の産卵した卵白又は卵黄をＨＧＨを認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法及びウエスタンブロット法により測定することができる。また、ｈＥＰＯにおいても同様の方法を用いることにより測定できる。 In addition, although it does not specifically limit as a method of measuring content of the target protein of the produced packaging cell and G0 transgenic chimera bird, ELISA etc. can be used. For example, when the target protein is HGH, the supernatant obtained by culturing the packaging cell, the serum of the produced G0 transgenic chimeric bird, and the egg white or egg yolk produced by the bird using an ELISA method using an antibody that recognizes HGH and Western It can be measured by blotting. Moreover, it can measure by using the same method also in hEPO.
本発明で使用する鳥類としては、特に限定されるものではなく、例えばニワトリ、ウズラ、七面鳥、カモなどが挙げられる。なかでもニワトリやウズラは入手が容易で産卵種としても多産であり、長年の飼育経験により安全性が認められている点が好ましい。 The birds used in the present invention are not particularly limited, and examples thereof include chickens, quails, turkeys and ducks. Among these, chickens and quails are easy to obtain and are prolific as egg-laying species, and it is preferable that safety has been recognized by many years of breeding experience.
３．トランスジェニック鳥類の子孫の育種方法
Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を成鳥まで成長させ、非トランスジェニック鳥類（野生型鳥類）又はＧ０トランスジェニックキメラ鳥類と交配を行うことによりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類に導入した遺伝子を子孫Ｇ１トランスジェニック鳥類へ伝播することができる。遺伝子の伝播の成否は、得られたＧ１トランスジェニック鳥類の血液又は細胞などからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法などにより遺伝子導入を検定することができる。
3. Method for breeding offspring of transgenic birds A gene introduced into a G0 transgenic chimeric bird by growing a G0 transgenic chimeric bird to an adult bird and mating with a non-transgenic bird (wild type bird) or a G0 transgenic chimeric bird Can be transmitted to offspring G1 transgenic birds. The success or failure of gene transmission can be determined by extracting DNA from the blood or cells of the obtained G1 transgenic bird and testing gene transfer by PCR method or hybridization method.
作製したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びＧ１トランスジェニック鳥類での目的タンパク質をコードする遺伝子のコピー数は転写後調節に機能するＤＮＡ配列を導入した鳥類としていない鳥類とで組織又は血液から染色体を調製し、ハイブリダイゼーションなどの比較により確認できる。 The number of copies of the gene encoding the target protein in the prepared G0 transgenic chimeric bird and G1 transgenic bird is prepared from a tissue or blood with a non-avian bird introduced with a DNA sequence that functions in post-transcriptional regulation. This can be confirmed by comparison such as hybridization.
作製したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びＧ１トランスジェニック鳥類での目的タンパク質の発現量はｍＲＮＡを安定化し得る転写後調節因子を導入した鳥類としていない鳥類とで組織又は血液からｍＲＮＡをとり、ＲＴ−ＰＣＲ法又はノーザンブロット法などでの比較により調べることができる。 The expression level of the target protein in the prepared G0 transgenic chimera birds and G1 transgenic birds is the RT-PCR method in which mRNA is taken from tissues or blood with non-birds introduced with post-transcriptional regulators capable of stabilizing mRNA. Alternatively, it can be examined by comparison by Northern blotting or the like.
上記したように、得られたＧ１トランスジェニック鳥類の血液又は細胞などからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法などにより遺伝子導入を検定し、遺伝子が導入されている個体を完全体Ｇ１トランスジェニック鳥と呼ぶ。 As described above, DNA is extracted from the blood or cells of the obtained G1 transgenic birds, and gene introduction is tested by the PCR method or the hybridization method, and the individual into which the gene has been introduced is completely G1 transgenic. Call it a bird.
なお、上記交配には、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類として、例えば、オスの精子に導入遺伝子が存在することをＰＣＲ法等により確認することにより一次選抜したものを用いることもできる。 For the mating, as the G0 transgenic chimera bird, for example, a primary selection by confirming the presence of the transgene in male sperm by the PCR method or the like can be used.
こうして選抜した完全体Ｇ１トランスジェニック鳥を、他の鳥と交配する。他の鳥は、前記完全体Ｇ１トランスジェニック鳥と交配可能である限り、任意の鳥（同一種であっても異なる種であってもよい）を使用し得る。ホモ接合性完全体トランスジェニック鳥が得られる確率が高い観点から、他の完全体Ｇ１トランスジェニック鳥が好ましい。入手容易である観点から、他のＧ０トランスジェニックキメラ鳥が好ましく、野生型鳥がより好ましい。得られた完全体トランスジェニック鳥を他の鳥と交配し、その子孫を生産できる。
ここにいう交配は公知の畜産学的方法に従って実施できる。自然交配の他、人工交配等も用いることができる。
The complete G1 transgenic bird thus selected is crossed with other birds. As long as the other birds can be crossed with the complete G1 transgenic bird, any bird (which may be the same species or different species) may be used. From the viewpoint of a high probability of obtaining a homozygous complete transgenic bird, other complete G1 transgenic birds are preferable. From the viewpoint of easy availability, other G0 transgenic chimeric birds are preferable, and wild-type birds are more preferable. The resulting fully transgenic bird can be crossed with other birds to produce offspring.
The mating here can be carried out according to a known animal husbandry method. In addition to natural mating, artificial mating or the like can also be used.
得られた、その生殖細胞および全体細胞に目的タンパク質をコードする遺伝子が導入された鳥を、完全体トランスジェニック鳥という。この完全体トランスジェニック鳥は、体全体、例えば卵および血中に目的タンパク質を生産することが可能である。濃縮された目的タンパク質を回収できるという観点から、卵白中に目的タンパク質が生産されるのが好ましい。 The obtained bird in which the gene encoding the target protein is introduced into its germ cells and whole cells is called a complete transgenic bird. This complete transgenic bird can produce the protein of interest in the entire body, such as eggs and blood. From the viewpoint that the concentrated target protein can be recovered, the target protein is preferably produced in egg white.
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited by these Examples.
実施例１．ヒト成長ホルモンを発現させるレトロウイルスベクターコンストラクトｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）の作製
ヒト成長ホルモンｃＤＮＡは我々が以前作製したレトロウイルスベクターｐＬＧＯＧ（特許公開２００４−２３６６２６）から用いた。まずこのｐＬＧＯＧをＸｈｏＩ、ＭｌｕＩで切断し、切り出した０．７ｋｂをｐＥＴＢｌｕｅ−２（ノバジェン社製）のＳａｌＩ、ＭｌｕＩサイトに挿入しｐＥＴｈＧＨ（ｃＤＮＡ）を作製した。次にｐＥＴｈＧＨをＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで切り出した断片を、ｐＺｅｏＳＶ２（＋）（インビトロジェン社製）のＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩサイトに挿入しｐＺｅｏｈＧＨ（ｃＤＮＡ）を作製した。つづいてこのｐＺｅｏｈＧＨをＮｈｅＩ、ＸｈｏＩで切り出した断片をｐＣＥＰ４のＮｈｅＩ、ＸｈｏＩサイトに挿入しｐＣＥＰｈＧＨ（ｃＤＮＡ）を作製した。次にこのｐＣＥＰｈＧＨ（ｃＤＮＡ）をＨｉｎｄＩＩＩで切断しヒト成長ホルモンｃＤＮＡを含む０．７ｋｂをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＷＯ2004／016081号、特願２００２−２３６０８９）をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｓｃＦｖ−Ｆｃ領域を取り除いたものに挿入し、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）を作製した。
Example 1. Construction of retroviral vector construct pMSCVGΔAGH (−) expressing human growth hormone Human growth hormone cDNA was used from the retroviral vector pLGOG (patent publication 2004-236626) that we previously produced. First, this pLGOG was cleaved with XhoI and MluI, and the excised 0.7 kb was inserted into the SalI and MluI sites of pETBlue-2 (Novagen) to prepare pEThGH (cDNA). Next, a fragment obtained by excising pEThGH with XhoI and BamHI was inserted into the XhoI and BamHI sites of pZeoSV2 (+) (manufactured by Invitrogen) to prepare pZeoohGH (cDNA). Subsequently, the fragment obtained by excising this pZeohh with NheI and XhoI was inserted into the NheI and XhoI sites of pCEP4 to prepare pCEPhGH (cDNA). Next, this pCEPHGH (cDNA) was cleaved with HindIII, 0.7 kb containing human growth hormone cDNA was cleaved with pMSCV / GΔAscFv-Fc (WO2004 / 016081, Japanese Patent Application No. 2002-236089) with HindIII, and the scFv-Fc region was cleaved. It was inserted into the removed one to prepare pMSCVGΔAGH (−).
実施例２．ＷＰＲＥを挿入したヒト成長ホルモンを発現させるレトロウイルスベクターコンストラクトｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）Ｗの作製
ＷＰＲＥ領域を増幅するためにテンプレートとして、ｐＷＨＶ８（ＡＴＣＣ４５０９７）を用いて、化学合成オリゴヌクレオチドＷＰＲＥ（ｄｉｒｅｃｔ ＣｌａＩ）５‘−ｃｃａｔｃｇａｔａａｔｃａａｃｃｔｃｔｇｇａｔｔａｃａａａａｔｔｔｇｔｇａ−３’ （配列番号１；下線部はＣｌａＩサイト）とＷＰＲＥ（ｒｅｖｅｒｓ ＣｌａＩ）５‘−ｃｃａｔｃｇａｔｃａｇｇｃｇｇｇｇａｇｇｃｇ−３’ （配列番号２；下線部はＣｌａＩサイト）をプライマーとして用いてＫＯＤ＋にてＰＣＲ（９４℃２分の後９４℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃３０秒を３０サイクル）を行った。増幅した断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ−のＥｃｏＲＶサイトに挿入しｄａｍ−の大腸菌ＪＭ１１０（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に形質転換を行い、これからプラスミドを調製し、ｐＢｌｕｅＷＰＲＥ（ＥｃｏＲＶ）を作製した。最後にｐＢｌｕｅＷＰＲＥ（ＥｃｏＲＶ）をＣｌａＩで切断しＷＰＲＥを含む断片を切り出し、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）のＣｌａＩサイトに挿入して、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）Ｗを作製した。
Example 2 Construction of retroviral vector construct pMSCVGΔAGH (−) W expressing human growth hormone inserted with WPRE Using pWHV8 (ATCC45097) as a template to amplify the WPRE region, a chemically synthesized oligonucleotide WPRE (direct ClaI) 5 ′ -Cc atcgaat aatcaactctggattacaaaaatttgtga-3 '(SEQ ID NO: 1; underlined is ClaI site) and WPRE (revers ClaI) 5'-cc atccat caggcgggggaggcg-3' (SEQ ID NO: 2 is underlined and OD is used as primer OD; PCR was performed at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 30 seconds for 30 cycles. The amplified fragment was inserted into the EcoRV site of pBluescriptKS- and transformed into dam-E. Coli JM110 (manufactured by STRATAGENE). From this, a plasmid was prepared to prepare pBlueWPRE (EcoRV). Finally, pBlueWPRE (EcoRV) was cleaved with ClaI, and a fragment containing WPRE was excised and inserted into the ClaI site of pMSCVGΔAGH (−) to prepare pMSCVGΔAGH (−) W.
実施例３．
実施例１．で作製したベクターコンストラクトｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）及びｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）Ｗより組換えレトロウイルスを調製するため、トランスフェクションする前日にＧＰ２９３細胞（クロンテック社製）を２４ｗｅｌｌプレートに２×１０５細胞をまきＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）（シグマ社製）１０％ＦＣＳで培養した。培地を新鮮なＤＭＥＭ １０％ＦＣＳに交換し、ｐＶＳＶ−Ｇベクター（クロンテック社製）０．４μｇとｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）及びｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）Ｗ０．４μｇをリポフェクション法によりＧＰ２９３細胞に導入した。４８時間後ウイルス粒子を含む培養上清を回収し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）により細胞は夾雑物を除去した。得られた培養上清にポリブレン（シグマ社製）を８μｇ／ｍｌになるように加え組換えウイルス溶液とした。
Example 3
Example 1. In order to prepare a recombinant retrovirus from the vector constructs pMSCVGΔAGH (−) and pMSCVGΔAGH (−) W prepared in step 1, 2 × 10 5 cells were seeded on a 24-well plate on the day before transfection using DMEM (DMEM). Dulbecco's modified Eagle medium) (manufactured by Sigma) was cultured in 10% FCS. The medium was replaced with fresh DMEM 10% FCS, and 0.4 μg of pVSV-G vector (Clontech), pMSCVGΔAGH (−) and 0.4 μg of pMSCVGΔAGH (−) W were introduced into GP293 cells by the lipofection method. After 48 hours, the culture supernatant containing the virus particles was collected, and the cells removed contaminants by centrifugation (3000 rpm, 5 minutes). Polybrene (manufactured by Sigma) was added to the obtained culture supernatant at 8 μg / ml to obtain a recombinant virus solution.
実施例４．
ウイルス溶液のタイターは以下のように測定した。ウイルス溶液をかける前日にＮＩＨ３Ｔ３（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を２４ｗｅｌｌプレートに１．５×１０４細胞になるように植え培養した。２−２００倍希釈したウイルス溶液に培地交換した後４８時間後に蛍光顕微鏡によりＧＦＰを発現している細胞の割合を測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。
ウイルスタイター（ｃｆｕ／ｍｌ）＝細胞数×希釈率×発現割合
このようにしてタイターを測定した結果、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）とｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）ＷとではＷＰＲＥ配列を挿入したものの方が６倍高かった（図１）。
Example 4
The titer of the virus solution was measured as follows. The day before application of the virus solution, NIH3T3 (obtained from American Type Culture Collection) was planted and cultured on a 24-well plate at 1.5 × 10 4 cells. 48 hours after exchanging the medium with a virus solution diluted 2-200 times, the ratio of cells expressing GFP was measured with a fluorescence microscope, and the titer was determined by the following formula.
Virus titer (cfu / ml) = cell number × dilution rate × expression ratio As a result of measuring the titer in this manner, pMSCVGΔAGH (−) and pMSCVGΔAGH (−) W were 6 times higher in the case where the WPRE sequence was inserted. (FIG. 1).
実施例５．ヒト成長ホルモンを発現させるレトロウイルスベクターコンストラクトの動物細胞での発現
ヒト成長ホルモンを発現させるレトロウイルスベクターコンストラクトの動物細胞の発現をみるためにＣＨＯ−Ｋ１細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を用いた。まず、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフェクションする前日に２４ｗｅｌｌプレートに１．５×１０５細胞をまきＦ１２ １０％ＦＣＳ培地（ギブコ社製）にて培養した。次の日培地をＣＨＯ−Ｓ−ＳＭＦＩＩ ｌｏｗ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ギブコ社製）に交換し、ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）及びｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）Ｗ０．８μｇをリポフェクション法によりＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。６及び２４時間後同培地で培地交換を行い４８時間後に培養上清を回収した。
Embodiment 5 FIG. Expression of retroviral vector constructs expressing human growth hormone in animal cells CHO-K1 cells (obtained from American Type Culture Collection) for the expression of animal cells of retroviral vector constructs expressing human growth hormone Was used. First, 1.5 × 10 5 cells were seeded on a 24 well plate on the day before transfection of CHO-K1 cells and cultured in F12 10% FCS medium (Gibco). Next day, the medium was replaced with CHO-S-SMFII low protein serum-free Medium (manufactured by Gibco), and pMSCVGΔAGH (−) and pMSCVGΔAGH (−) W 0.8 μg were introduced into CHO-K1 cells by the lipofection method. After 6 and 24 hours, the medium was changed with the same medium, and after 48 hours, the culture supernatant was collected.
実施例６．ヒト成長ホルモン発現量の検定
回収した培養上清を１００倍及び１０００倍に希釈して測定に用いた。測定はｈＧＨ ＥＬＩＳＡキット（ロッシュ社製）を用いてマニュアルに従いＥＬＩＳＡ法にて測定した。その結果ｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）とｐＭＳＣＶＧΔＡＧＨ（−）ＷとではＷＰＲＥ配列を挿入したものの発現量が３．５倍高かった（図２）。
Example 6 Assay of human growth hormone expression level The collected culture supernatant was diluted 100 times and 1000 times and used for measurement. The measurement was performed by an ELISA method using a hGH ELISA kit (manufactured by Roche) according to the manual. As a result, in pMSCVGΔAGH (−) and pMSCVGΔAGH (−) W, the expression level of the WPRE sequence inserted was 3.5 times higher (FIG. 2).
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