JP2007219239A - Laser scanning type confocal microscope - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、試料表面の微小三次元計測が可能なレーザ走査型共焦点顕微鏡に関するものである。 The present invention relates to a laser scanning confocal microscope capable of micro three-dimensional measurement of a sample surface.
従来、試料表面の高さ情報を取得し、微小三次元計測を行なうものとしてレーザ走査型共焦点顕微鏡が知られている。このレーザ走査型共焦点顕微鏡は、光源からの光をスポット状にして試料面を2次元走査するとともに、試料面からの反射光のうち共焦点ピンホールを通過した光のみを光検出器により検出し、電気信号に変換して試料面の3次元情報を得るようにしている。 2. Description of the Related Art Conventionally, a laser scanning confocal microscope is known as a technique for acquiring height information of a sample surface and performing minute three-dimensional measurement. This laser scanning confocal microscope uses the light from the light source as a spot to scan the sample surface two-dimensionally, and only the light reflected from the sample surface that has passed through the confocal pinhole is detected by the photodetector. Then, it is converted into an electric signal to obtain three-dimensional information on the sample surface.
図5は、一般的なレーザ走査型共焦点顕微鏡の概略構成を示すもので、レーザ光源101から出射した光束は、ビームスプリッタ(PBS)102を透過した後、2次元走査手段103に入射する。2次元走査手段103は、光束を2次元的に走査して出力する。2次元的に走査された光束は、対物レンズ107へと導びかれる。2次元走査手段103は、対物レンズ107の瞳と共役な位置に配置されており、対物レンズ107の瞳へ入射した光束は収束光となって出射し、試料108の焦点面上を走査する。この時の光束は、λ/4板104により直線偏光から円偏光に変換される。
FIG. 5 shows a schematic configuration of a general laser scanning confocal microscope. A light beam emitted from a laser light source 101 passes through a beam splitter (PBS) 102 and then enters a two-
試料108の表面で反射した光は、再び対物レンズ107から、λ/4板104に導かれ、ここで直線偏光に変換された後、2次元走査手段103を介してビームスプリッタ102に導入され、このビームスプリッタ102で反射され結像レンズ109によってピンホール110上に集光する。ピンホール110上に集光した反射光は、ピンホール110により試料108の集光点以外からの光がカットされ、通過光だけが検出器111により検出され、コントローラ112に導かれ、モニタ115に表示される。
The light reflected from the surface of the
この場合、対物レンズ107は、不図示のZステージによって光軸方向(Z方向)に移動可能となっている。また、2次元走査手段103、及び前記不図示のZステージはコントローラ112によって制御される。
In this case, the
ここで、対物レンズ107による集光位置は、ピンホール110と光学的に共役な位置にある。このため、試料108面上に焦点が合っている試料108面からの光はピンホール110を通過し、焦点ずれがある試料108面からの光はピンホール110をほとんど通過せず、ピンホール110を通過した光だけが検出器111によって検出され、この検出光の強度に応じた信号がコントローラ112に導かれる。従って、このときの対物レンズ107と試料108の相対位置と検出器111の出力の関係は、次のようになる。すなわち、試料108が対物レンズ107の集光位置に有る場合には、検出器111の出カは最大となる。そして、この位置から対物レンズ107と試料108の相対位置が離れるに従い検出器111の出力は急激に低下する。
Here, the focusing position by the
これにより、2次元走査手段103によって試料108面上の集光点を2次元走査し、検出器111からの出力を2次元走査手段103による走査に同期して画像化すれば、試料108のある特定の高さのみが画像化され、試料108を光学的にスライスした画像(共焦点画像)が得られる。また、この状態から、対物レンズ107を光軸方向に移動させながら、各位置において、2次元走査手段103によって走査して共焦点画像を取得し、試料108面上の各点で検出器111の出力が最大になるZステージの位置を検出することにより試料108の高さ情報が得られる。
As a result, if the two-dimensional scanning means 103 two-dimensionally scans the focal point on the surface of the
ところで、このようにして取得される高さ情報の光学的分解能は、図6に示すように対物レンズ107と試料108の相対距離、つまり対物レンズ107の光軸方向の移動距離と検出器111の出力との関係において、ピーク波形の幅aが細くなるほど向上する。そして、このピーク波形は、対物レンズ107の開口数により大きく左右され、特に開口数の小さな低倍率の対物レンズで分解能が低下することが知られている。
By the way, as shown in FIG. 6, the optical resolution of the height information acquired in this way is the relative distance between the
これに対して、従来、例えば特許文献1に開示されるようにミラウ方式の二光束干渉対物レンズを用い、試料の表面と対物レンズの焦点との間の距離が1/4波長ずれる毎に得られるピーク信号のうち試料表面と焦点が一致するときの最大のピークを検出することにより分解能向上を計り、開口数の小さな低倍率の対物レンズでも高分解能の測定を可能としたものが提案されている。 On the other hand, conventionally, for example, as disclosed in Patent Document 1, a Mirau two-beam interference objective lens is used, and the distance between the surface of the sample and the focal point of the objective lens is obtained every time a quarter wavelength shifts. The resolution is improved by detecting the maximum peak when the focal point of the sample coincides with the focus of the sample signal, and a high-resolution measurement is possible even with a low-magnification objective lens with a small numerical aperture. Yes.
一方、微小三次元計測を行なうものとして、特許文献2に開示されるように積層構造体の試料から集光レンズ及びピンホールを通って検出器に入力される反射光から得られる共焦点信号と、参照鏡を経て集光レンズ及びピンホールを通って検出器に入力される参照光から得られる干渉信号に基づいて積層構造体の層厚などの計測を可能としたものが提案されている。
ところが、特許文献1のものは、試料に対する高さ方向の分解能の向上は実現しているが、二光束干渉対物レンズを用いているため、試料の観察画像上に常に干渉パターンや参照鏡からの反射光がバックグラウンドとして乗ってしまい良質の画像を得ることができない。つまり、このような特許文献1のものは、コントラストの良い高分解能の共焦点画像を得ることができるというレーザ共焦点顕微鏡の大きな特徴を損なうことになる。また、特許文献2のものは、二光束干渉対物レンズを用いることなく、集光レンズ及びピンホールを有する共焦点光学系から得られる共焦点信号と参照光から得られる干渉信号を組み合わせた構成を示しているが、試料上のあるポイントに対する測定のみを想定しており、2次元の走査に基づく試料面上の各点での高さ情報の測定まで考慮されていない。
However, although the thing of the patent document 1 implement | achieved the improvement of the resolution of the height direction with respect to a sample, since the two-beam interference objective lens is used, it is always from an interference pattern and a reference mirror on the observation image of a sample. The reflected light rides as a background and a high-quality image cannot be obtained. That is, such a thing of patent document 1 impairs the big characteristic of a laser confocal microscope that a high-resolution confocal image with good contrast can be obtained. Further, the one in
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、高さ測定の分解能の向上を図ることができるとともに、コントラストの良い共焦点画像を得ることができるレーザ走査型共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a laser scanning confocal microscope capable of improving the resolution of height measurement and obtaining a confocal image with good contrast. And
請求項1記載の発明は、レーザ光を発生する光源と、前記光源から発生したレーザ光を試料上に集光する対物レンズと、前記対物レンズの瞳位置と共役な位置に配置され前記レーザ光を前記試料面上で走査させる走査手段と、前記対物レンズと走査手段との間の光路に配置され前記レーザ光の光路を分割する光路分割手段及び該光路分割手段により分割された光路に配置され前記走査手段で走査されるレーザ光を反射する反射光学系を有する反射光学系ユニットと、前記反射光学系ユニット又は前記反射光学系を前記対物レンズと走査手段との間の光路に対し挿脱可能とした挿脱手段と、前記対物レンズの集光位置と共役な位置に配置され、前記試料面からの反射光又は前記反射光学系からの反射光と前記試料からの反射光の干渉による干渉パターンを通過させる微小開口と、前記微小開口を通過する光の強度を検出する光検出手段とを具備したことを特徴としている。 According to a first aspect of the present invention, there is provided a light source that generates laser light, an objective lens that condenses the laser light generated from the light source on a sample, and a laser beam that is disposed at a position conjugate with a pupil position of the objective lens. Is arranged on the optical path divided by the optical path dividing means for dividing the optical path of the laser beam, the optical path dividing means for dividing the optical path of the laser beam. A reflection optical system unit having a reflection optical system for reflecting laser light scanned by the scanning means, and the reflection optical system unit or the reflection optical system can be inserted into and removed from the optical path between the objective lens and the scanning means. Interference caused by interference between the reflected light from the sample surface or the reflected light from the reflective optical system and the reflected light from the sample. A very small aperture for passing a turn, is characterized by comprising a light-detecting means for detecting the intensity of light passing through the microscopic aperture.
請求項2記載の発明は、請求項1記載の発明において、前記反射光学系は、前記対物レンズの瞳位置と共役な位置に、瞳位置が配置された集光レンズと、該集光レンズの焦点位置に配置された反射手段を有することを特徴としている。 According to a second aspect of the present invention, in the first aspect of the invention, the reflective optical system includes a condenser lens in which a pupil position is arranged at a position conjugate with the pupil position of the objective lens, and the condenser lens. It has a reflection means arranged at the focal position.
請求項3記載の発明は、請求項1記載の発明において、前記反射光学系は、前記対物レンズの瞳位置と共役な位置に頂点位置が配置されるコーナーキューブを有することを特徴としている。 A third aspect of the invention is characterized in that, in the first aspect of the invention, the reflective optical system has a corner cube in which a vertex position is arranged at a position conjugate with a pupil position of the objective lens.
請求項4記載の発明は、請求項1乃至3のいずれかに記載の発明において、前記挿脱手段は、前記光路分割手段により分割された光路を遮断可能にした光路遮断手段を有することを特徴としている。 According to a fourth aspect of the present invention, in the invention according to any one of the first to third aspects, the insertion / removal unit includes an optical path blocking unit that can block the optical path divided by the optical path dividing unit. It is said.
請求項5記載の発明は、請求項2又は3記載の発明において、前記反射光学系ユニットは、前記光路分割手段に対する集光レンズと反射手段の相対位置関係又は前記光路分割手段に対するコーナーキューブの相対位置関係がそれぞれ一定に保持された状態で、前記挿脱手段により前記対物レンズと走査手段との間の光路に対し挿脱されることを特徴としている。 According to a fifth aspect of the present invention, in the invention according to the second or third aspect, the reflecting optical system unit is configured such that the relative position relationship between the condenser lens and the reflecting unit with respect to the optical path dividing unit or the relative of the corner cube with respect to the optical path dividing unit The optical system is characterized in that the optical path between the objective lens and the scanning unit is inserted and removed by the insertion / removal unit in a state where the positional relationship is kept constant.
請求項6記載の発明は、請求項1乃至5のいずれかに記載の発明において、さらに、任意の波長を有する照明光を出射する光源、該光源から出射された照明光を前記対物レンズの光軸上に導入する光導入手段、該光導入手段により導入された照明光が照射される試料からの反射光を検出して前記試料の非共焦点画像を取得する画像取得手段を有し、前記光導入手段と前記光路分割手段を一体に構成したことを特徴としている。 The invention according to claim 6 is the invention according to any one of claims 1 to 5, further comprising: a light source that emits illumination light having an arbitrary wavelength; and the illumination light emitted from the light source is emitted from the objective lens. A light introduction means for introducing on the axis, and an image acquisition means for obtaining a non-confocal image of the sample by detecting reflected light from the sample irradiated with the illumination light introduced by the light introduction means, The light introducing means and the optical path dividing means are formed integrally.
本発明によれば、高さ測定の分解能の向上を図ることができるとともに、コントラストの良い共焦点画像を得ることができるレーザ走査型共焦点顕微鏡を提供できる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, while improving the resolution of height measurement, the laser scanning confocal microscope which can obtain a confocal image with favorable contrast can be provided.
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
(第1の実施の形態)
図1は本発明の第1の実施の形態にかかるレーザ走査型共焦点顕微鏡の概略構成を示している。
(First embodiment)
FIG. 1 shows a schematic configuration of a laser scanning confocal microscope according to a first embodiment of the present invention.
図において、1は光源で、この光源1は、例えばレーザ光などの点光源からなっている。光源1からの光の光路上には、偏光ビームスプリッタ(以下、PBSと称する。)2が配置されている。このPBS2は、光源1の光(レーザ光)を透過し、後述する試料8及び参照鏡23からの反射光を反射する。
In the figure, 1 is a light source, and the light source 1 is a point light source such as a laser beam. A polarizing beam splitter (hereinafter referred to as PBS) 2 is disposed on the optical path of light from the light source 1. The
PBS2を透過する光源1の光の光路上には、走査手段としてのXY光偏向ユニット3が配置されている。このXY光偏向ユニット3は、直交する2方向に光を偏向するための不図示の2つのガルバノメータを有し、これらのガルバノメータにより後述する試料8面上及び参照鏡23面上の光を2次元走査するようになっている。また、このXY光偏向ユニット3は、後述する対物レンズ7の瞳と共役な位置に配置される。
On the optical path of the light of the light source 1 that passes through the
XY光偏向ユニット3から出射される光の光路上には、瞳投影レンズ5、λ/4板4及び第1のビームスプリッタ(以下、第1のBSと称する。)19が配置されている。λ/4板4は、XY光偏向ユニット3から出射される光を直線偏光から円偏光に変換する。第1のBS19は、光源1の光(レーザ光)を反射し、後述する照明光学系17からの光(白色光)を透過する。 On the optical path of the light emitted from the XY light deflection unit 3, a pupil projection lens 5, a λ / 4 plate 4, and a first beam splitter (hereinafter referred to as a first BS) 19 are arranged. The λ / 4 plate 4 converts the light emitted from the XY light deflection unit 3 from linearly polarized light to circularly polarized light. The first BS 19 reflects light (laser light) from the light source 1 and transmits light (white light) from an illumination optical system 17 described later.
第1のBS19を反射する光源1の光の光路上には、結像レンズ6、光路分割手段としての第2のビームスプリッタ(以下、第2のBSと称する。)16及び対物レンズ7が配置されている。結像レンズ6は、瞳投影レンズ5を透過した光(XY光偏向ユニット3により2次元的に走査された光)を対物レンズ7の瞳に入射する。第2のBS16は、光源1からの光(レーザ光)を透過するとともに、該レーザ光の光路を一部分割して反射し、また、後述する照明光学系17からの光(白色光)を反射する。対物レンズ7は、入射した光を収束し、この収束されたスポット光を上記XY光偏向ユニット3の動作によって試料8面上で光軸に垂直な面方向(X,Y方向)に2次元走査させる。また、対物レンズ7は光軸方向に移動可能なレボルバ部14に保持されており、このレボルバ部14の移動によって光軸方向(Z方向)に移動され、試料8との相対位置を連続的に可変可能にしている。レボルバ部14には、Zスケール141が設けられている。このZスケール141は、レボルバ部14の移動量、つまり対物レンズ7の光軸方向の移動量を測定可能にしている。この場合、レボルバ部14の移動は、コントローラ12により制御され、Zスケール141の測定値は、コントローラ12に取り込まれる。
On the optical path of the light of the light source 1 that reflects the first BS 19, an imaging lens 6, a second beam splitter (hereinafter referred to as a second BS) 16 as an optical path dividing means, and an objective lens 7 are arranged. Has been. The imaging lens 6 makes light that has passed through the pupil projection lens 5 (light that has been two-dimensionally scanned by the XY light deflection unit 3) incident on the pupil of the objective lens 7. The
試料8からの反射光は、第2のBS16、結像レンズ6、第1のBS19を介してλ/4板4に導かれ、円偏光から直線偏光に変換された後、瞳投影レンズ5、XY光偏向ユニット3を介してPBS2に戻る。
The reflected light from the sample 8 is guided to the λ / 4 plate 4 through the
PBS2に戻された反射光の反射光路上には、集光レンズ9、微小開口としてピンホール10を介して光検出手段として検出器11が配置されている。集光レンズ9は、PBS2に戻された反射光をスポット状に絞ってピンホール10に照射する。ピンホール10は、対物レンズ7の集光位置と光学的に共役な位置に配置され、試料8から反射される光のうち合焦の成分を通過させるが、非合焦の成分を透過できないようになっている。検出器11は、フォトマルチプライヤーなどからなるもので、ピンホール10を通過した光を検出し、この光の輝度を電気信号に変換して出力するものである。この場合、検出器11よって検出される光は、試料8に対して焦点が合ったところでは最大輝度となり、逆に試料8に対して焦点が外れたところでは、輝度が著しく小さいものとなる。
On the reflected light path of the reflected light returned to the
検出器11には、コントローラ12が接続されている。コントローラ12は、モニタ15が接続されている。コントローラ12には、検出器11で検出された光の輝度に応じた電気信号が入力され、この信号は、モニタ15に画像として表示される。 A controller 12 is connected to the detector 11. The controller 12 is connected to a monitor 15. An electrical signal corresponding to the luminance of the light detected by the detector 11 is input to the controller 12, and this signal is displayed on the monitor 15 as an image.
一方、17は照明光学系で、この照明光学系17には、白色照明用ファイバ18が接続され、この白色照明用ファイバ18を介して白色照明光が導入される。この場合、白色照明光の光源には、例えばハロゲンあるいは水銀等が用いられる。照明光学系17からの任意の波長を有する白色照明光の光路上には、前記第2のBS16が配置されている。この第2のBS16は、照明光学系17からの照明光を対物レンズ7の光軸上に導入する光導入手段をも構成し、導入された照明光を反射し、対物レンズ7により試料8に照射させる。
On the other hand, reference numeral 17 denotes an illumination optical system. A white illumination fiber 18 is connected to the illumination optical system 17, and white illumination light is introduced through the white illumination fiber 18. In this case, for example, halogen or mercury is used as the light source of the white illumination light. The
試料8からの反射光は、第2のBS16を透過し、さらに結像レンズ6、第1のBS19を透過する。第1のBS19を透過する反射光の光路上には、画像取得手段としてカメラレンズ20を介してCCDカメラ21が配置されている。CCDカメラ21は、カメラレンズ20により結像される試料8の観察像を撮像する。CCDカメラ21には、コントローラ12が接続されている。コントローラ12は、CCDカメラ21により撮像された観察像をモニタ15に表示する。
The reflected light from the sample 8 passes through the
第2のBS16で分割された分割光路上には、光路遮断手段としてのシャッタ24、集光レンズ22及び反射手段としての参照鏡23が配置されている。この場合、これら第2のBS16、集光レンズ22及び参照鏡23は、反射光学系ユニット25を構成している。シャッタ24は、通常のレーザ走査型共焦点顕微鏡機能と、該レーザ走査型共焦点顕微鏡に干渉パターン検出を組み合わせた機能を切換えるもので、第2のBS16で分割され集光レンズ22に入射する光路を遮断可能にしている。集光レンズ22の瞳位置は、対物レンズ7の瞳位置及びXY光偏向ユニット3と共役な位置に配置されている。また、参照鏡23は集光レンズ22の焦点位置、すなわち対物レンズ7の焦点位置と共役な位置に配置されている。この場合、前記第2のBS16で一部分割された前記光源1からの光(レーザ光)が集光レンズ22の瞳に入射し、参照鏡23に照射されると、集光レンズ22の瞳位置とXY光偏向ユニット3が共役な位置関係にあるので、参照鏡23からの反射光が、第2のBS16を反射して前記試料8の反射光と同様な光路を辿って検出器11により検出される。
On the divided optical path divided by the
次に、このように構成された実施の形態の作用を説明する。 Next, the operation of the embodiment configured as described above will be described.
まず、通常のレーザ走査型共焦点顕微鏡として用いる場合は、シャッタ24を閉じて集光レンズ22に入射する光路を遮断する。 First, when used as a normal laser scanning confocal microscope, the shutter 24 is closed to block the optical path incident on the condenser lens 22.
この状態で、光源1からの光(レーザ光)は、PBS2を通過しXY光偏向ユニット3に入射する。そして、XY光偏向ユニット3により2次元的に走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ5、λ/4板4を介して第1のBS19に入射し、ここで反射して結像レンズ6、第2のBS16を介して対物レンズ7の瞳に入射する。そして、対物レンズ7によって試料8上に集光し、スポット光となる。また、XY光偏向ユニット3による2次元走査によりスポット光は、試料8面上を2次元走査される。
In this state, light (laser light) from the light source 1 passes through the
また、試料8からの反射光は、第2のBS16、結像レンズ6、第1のBS19、λ/4板4、瞳投影レンズ5、XY光偏向ユニット3を介して上述した試料8に入射した時と全く同じ経路を逆に通ってPBS2まで戻る。この場合、XY光偏向ユニット3から出射される光はλ/4板4により直線偏光から円偏光に変換され、試料8からの反射光はλ/4板4を透過することで円偏光から直線偏光に変換される。つまり、光源1からの光と試料8からの反射光の関係は、90°回転した直線偏光となっている。これにより、試料8からの反射光は、PBS2で反射され集光レンズ9でスポット状に絞られピンホール10に入射する。このときの試料8からの反射光は、XY光偏向ユニット3を通過して戻ってきているので、軸外を走査してもピンホール10への入射位置は動かない。
Reflected light from the sample 8 is incident on the sample 8 described above via the
この状態で、ピンホール10は、対物レンズ7の焦点位置と共役な位置にあるので、試料8面上に焦点が合っている試料8面からの反射光はピンホール10を通過し、焦点ずれがある試料8面からの反射光はピンホール10を通過しない。これにより、ピンホール10を通過した光だけが検出器11によって検出され、この検出光の強度に応じた信号がコントローラ12に出力される。コントローラ12は、レーザ光がXY光偏向ユニット3により試料8上で走査されるタイミングで検出器11の出力信号を画像処理して試料8の共焦点画像を取得し、これをモニタ15に表示するとともに、不図示の画像メモリに保存する。 In this state, since the pinhole 10 is in a conjugate position with the focal position of the objective lens 7, the reflected light from the surface of the sample 8 focused on the surface of the sample 8 passes through the pinhole 10 and is out of focus. Reflected light from the surface of a certain sample 8 does not pass through the pinhole 10. As a result, only the light that has passed through the pinhole 10 is detected by the detector 11, and a signal corresponding to the intensity of the detected light is output to the controller 12. The controller 12 obtains a confocal image of the sample 8 by performing image processing on the output signal of the detector 11 at a timing when the laser beam is scanned on the sample 8 by the XY light deflection unit 3, and displays this on the monitor 15. At the same time, it is stored in an image memory (not shown).
その後、レボルバ部14により対物レンズ7を光軸方向に所定距離だけ移動して上述した動作を実行し、この時の対物レンズ7の位置に応じた試料8の共焦点画像を取得する。以下、同様にして所定の範囲内において対物レンズ7を光軸方向に所定距離ずつ移動させながら上述の共焦点画像取得を繰り返し実施する。 Thereafter, the revolver unit 14 moves the objective lens 7 by a predetermined distance in the optical axis direction to execute the above-described operation, and acquires a confocal image of the sample 8 according to the position of the objective lens 7 at this time. Similarly, the above-described confocal image acquisition is repeatedly performed while moving the objective lens 7 by a predetermined distance in the optical axis direction within a predetermined range.
そして、上述の繰り返し動作で不図示の画像メモリに保存された複数の共焦点画像から、各画素で最高輝度となる輝度とその時の高さ情報を抽出し、この高さ情報を含む3次元像を構築し、これをモニタ15に表示する。 Then, from the plurality of confocal images stored in the image memory (not shown) by the above-described repetitive operation, the luminance and the height information at that time are extracted from each pixel, and a three-dimensional image including the height information is extracted. Is displayed on the monitor 15.
次に、通常の光学顕微鏡として用いる場合、この時もシャッタ24を閉じて集光レンズ22に入射する光路を遮断する。 Next, when used as a normal optical microscope, the shutter 24 is also closed at this time to block the optical path incident on the condenser lens 22.
この状態で、白色照明用ファイバ18から導入された白色照明光は、照明光学系17を介して第2のBS16で反射し、対物レンズ7を介して試料8に照射される。また、試料8から反射される白色光は、対物レンズ7、第2のBS16、結像レンズ6、第1のBS19を通過し、カメラレンズ20によりCCDカメラ21の撮像面に結像され、顕微鏡画像として撮像される。CCDカメラ21で撮像された顕微鏡画像は、コントローラ12に送られる。コントローラ12は、顕微鏡画像をモニタ15に表示する。これにより、一般的な顕微鏡画像を取得することができる。
In this state, the white illumination light introduced from the white illumination fiber 18 is reflected by the
次に、レーザ走査型共焦点顕微鏡に干渉パターン検出を組み合わせる場合は、シャッタ24を開いて集光レンズ22に入射する光路を開放する。 Next, when combining interference pattern detection with a laser scanning confocal microscope, the shutter 24 is opened and the optical path incident on the condenser lens 22 is opened.
この状態で、光源1からレーザ光が発せられると、上述したと同様にしてXY光偏向ユニット3により2次元的に走査され、第2のBS16を透過して対物レンズ7によって試料8上に集光されるとともに、XY光偏向ユニット3による2次元走査により試料8面上を2次元走査され、また、試料8からの反射光は、上述した試料8に入射した時と全く同じ経路を逆に辿り、検出器11側に導かれる。
In this state, when laser light is emitted from the light source 1, it is scanned two-dimensionally by the XY light deflection unit 3 in the same manner as described above, passes through the
一方、光源1からのレーザ光の一部は、第2のBS16で反射し、集光レンズ22の瞳に入射し、参照鏡23に照射される。この場合、集光レンズ22の瞳位置は、対物レンズ7の瞳位置及びXY光偏向ユニット3と共役な位置に配置され、また、参照鏡23は集光レンズ22の焦点位置、すなわち対物レンズ7の焦点位置と共役な位置に配置されているので、参照鏡23上を走査される光の反射光は、第2のBS16を反射して前記試料8の反射光と同様な光路を辿って検出器11側に導かれる。
On the other hand, a part of the laser light from the light source 1 is reflected by the
この時、第2のBS16において、参照鏡23からの反射光と上述の試料8からの反射光が合流し、この合流した光は互いに干渉を起こす。そして、この状態の光が干渉パターンとなってピンホール10を通り検出器11により検出される。
At this time, in the
この干渉パターンは、上述したようにレボルバ部14により対物レンズ7を光軸方向に所定距離ずつ移動させながら画像取得を繰り返し実施すると、対物レンズ7と試料8の相対距離と検出光強度の関係は、図2(a)(b)に示すように表わすことができる。つまり、図2(a)は、ピンホール10手前での干渉パターンを示すもので、ここでは、干渉強度が略一定となっている。しかし、ピンホール10を通過することにより、対物レンズ7の焦点位置以外からの反射光が遮断されることで、図2(b)に示すように対物レンズ7の焦点位置付近で干渉強度(検出光強度)が最大となる干渉パターンが得られる。この干渉パターンは、図2(b)の点線bで示す特性部分が共焦点光学系の特性、つまり、対物レンズ7の開口数に依存する。これにより、図2(b)において、干渉パターンの干渉強度が最大となるピーク位置cを求めることにより、図5で述べた共焦点光学系のみを用いたときの光学的分解能よりもさらに高分解能な結果を得ることが可能となり、開口数の小さな低倍率の対物レンズでも、高分解能の高さ測定を行なうことができる。 As described above, when the image acquisition is repeated while the objective lens 7 is moved by a predetermined distance in the optical axis direction by the revolver unit 14 as described above, the relationship between the relative distance between the objective lens 7 and the sample 8 and the detected light intensity is as follows. 2 (a) and 2 (b). That is, FIG. 2A shows an interference pattern before 10 pinholes, and here, the interference intensity is substantially constant. However, since the reflected light from other than the focal position of the objective lens 7 is blocked by passing through the pinhole 10, the interference intensity (detection) is detected in the vicinity of the focal position of the objective lens 7 as shown in FIG. An interference pattern with a maximum (light intensity) is obtained. In this interference pattern, the characteristic portion indicated by the dotted line b in FIG. 2B depends on the characteristic of the confocal optical system, that is, the numerical aperture of the objective lens 7. Accordingly, in FIG. 2B, the peak position c at which the interference intensity of the interference pattern is maximized is obtained, so that the resolution is higher than that when using only the confocal optical system described in FIG. A high-resolution height measurement can be performed even with a low-magnification objective lens having a small numerical aperture.
この場合も、レボルバ部14により対物レンズ7を光軸方向に所定距離だけ移動して上述した動作を実行し、この時の対物レンズ7の位置に応じた干渉パターンを取得する。以下、同様にして所定の範囲内において対物レンズ7を光軸方向に所定距離ずつ移動させながら上述の干渉パターンの取得を繰り返し実施する。そして、上述の繰り返し動作で取得された複数の干渉パターンから、各画素で最高輝度となる輝度とその時の高さ情報を抽出し、この高さ情報を含む3次元像を構築し、これをモニタ15に表示する。 Also in this case, the revolver unit 14 moves the objective lens 7 by a predetermined distance in the optical axis direction to execute the above-described operation, and obtains an interference pattern corresponding to the position of the objective lens 7 at this time. Similarly, the above-described interference pattern acquisition is repeatedly performed while moving the objective lens 7 by a predetermined distance in the optical axis direction within a predetermined range. Then, from the plurality of interference patterns acquired by the above-described repetitive operation, the luminance with the highest luminance and the height information at that time are extracted from each pixel, and a three-dimensional image including the height information is constructed and monitored. 15 is displayed.
したがって、このようにすれば、光源1からの光(レーザ光)の光路を分割する第2のBS16の反射光路上に、シャッタ24、対物レンズ7の瞳位置及びXY光偏向ユニット3と共役な位置に瞳位置が配置される集光レンズ22及び集光レンズ22の焦点位置に配置される参照鏡23をそれぞれ配置し、シャッタ24を開いた状態で、参照鏡23上を走査される光の反射光を試料8の反射光と同様な光路を辿って検出器11側に導入し、このときそれぞれの反射光を互いに干渉させ、干渉パターンをピンホール10を介して検出器11で検出する。この場合、干渉パターンは、ピンホール10により対物レンズ7の焦点位置以外からの反射光が遮断され、対物レンズ7の焦点位置にて最大振幅となることから、この時得られる干渉パターンのピーク波形は、共焦点光学系におけるピーク波形に対し、半値幅の小さいものが得られるようになり、共焦点光学系のみを用いたときの光学的分解能よりもさらに高分解能な結果を得ることができ、開口数の小さな低倍率の対物レンズを用いた場合も高分解能の高さ測定を行なうことができる。
Therefore, in this way, the shutter 24, the pupil position of the objective lens 7, and the XY light deflection unit 3 are conjugate with the reflected light path of the
また、シャッタ24により光路の遮断が選択的に可能で、集光レンズ22側への光路を遮断することにより、対物レンズ7を介した光路のみを用いることができるので、試料8の画像上に干渉パターンや参照鏡23からの反射光がバックグラウンドとして乗ることがなく、レーザ走査型共焦点顕微鏡の特徴を維持したままのコントラストの良い共焦点画像を得ることができる。 Further, the optical path can be selectively blocked by the shutter 24, and only the optical path through the objective lens 7 can be used by blocking the optical path to the condenser lens 22 side. The interference pattern and the reflected light from the reference mirror 23 do not ride as the background, and a confocal image with good contrast can be obtained while maintaining the characteristics of the laser scanning confocal microscope.
さらに、XY光偏向ユニット3により試料8面上の光を2次元走査するとともに、参照鏡23面上の光も2次元走査するようになるので、これら2次元の走査による試料面上各点での高さ情報の測定を実現することができる。 Furthermore, since the light on the surface of the sample 8 is two-dimensionally scanned by the XY light deflection unit 3 and the light on the surface of the reference mirror 23 is also two-dimensionally scanned, at each point on the sample surface by these two-dimensional scanning. Measurement of height information can be realized.
なお、上述した第1の実施の形態では、第2のBS16は、照明光学系17からの光(白色光)が導入される白色照明導入部を兼ねるようにしているが、白色照明導入部は、第2のBS16と別に設けるようにしても良い。この場合、第2のBS16が白色照明導入部を兼ねることは、スペース的に有利であることは勿論である。また、第1の実施の形態では、第2のBS16の反射光路を遮断するシャッタ24を配置するようにしたが、光路を遮断する手段としては、第2のBS16を他の特性のものに切換えるなどによっても可能である。
In the first embodiment described above, the
(第2の実施の形態)
次に、本発明の第2の実施の形態を説明する。
(Second Embodiment)
Next, a second embodiment of the present invention will be described.
図3は、本発明の第2の実施の形態の概略構成を示すもので、図1と同一部分には、同符号を付してその説明を省略する。 FIG. 3 shows a schematic configuration of the second embodiment of the present invention. The same parts as those in FIG.
この場合、第1の実施の形態の集光レンズ22と参照鏡23に代えて、反射光学系ユニットとしてのコーナーキューブユニット31が用いられる。コーナーキューブユニット31は、図4に示すように鏡筒311内部の一方端部に第3のビームスプリッタ(以下、第3のBSと称する。)32が配置され、他方端部にコーナーキューブ33が配置されている。また、コーナーキューブユニット31は、不図示の挿脱手段によりレボルバ部14に挿脱可能で、第3のBS32が第2のBS16と対物レンズ7との間の光路に挿入可能になっている。第3のBS32は、前記光路に挿入された状態で前記光源1からの光(レーザ光)を透過するとともに、該光の一部を分割して反射し、この反射した光をコーナーキューブ33に入射する。コーナーキューブ33は、光を反射する平面板をそれぞれ90°の角度で組み合わせたもので、第3のBS32から入射する光を各平面板で1回ずつ反射させ、元来た第3のBS32に入射させるようになっている。この場合、コーナーキューブ33の各平面板により形成される頂点位置dは、対物レンズ7の瞳位置と共役な位置に配置されている。
In this case, instead of the condensing lens 22 and the reference mirror 23 of the first embodiment, a
このような構成において、レーザ走査型共焦点顕微鏡に干渉パターン検出機能を組み合わせる場合、コーナーキューブユニット31を光路上に挿入する。
In such a configuration, when combining an interference pattern detection function with a laser scanning confocal microscope, the
この状態で、光源1からレーザ光が発せられると、上述したと同様にしてXY光偏向ユニット3により2次元的に走査され、第2のBS16を透過して対物レンズ7によって試料8上に集光されるとともに、XY光偏向ユニット3による2次元走査により試料8面上を2次元走査され、また、試料8からの反射光は、上述した試料8に入射した時と全く同じ経路を逆に辿り、検出器11側に導かれる。
In this state, when laser light is emitted from the light source 1, it is scanned two-dimensionally by the XY light deflection unit 3 in the same manner as described above, passes through the
一方、光源1からのレーザ光の一部は、第3のBS32で反射し、コーナーキューブ33に入射する。この場合、コーナーキューブ33の頂点位置dは、対物レンズ7の瞳位置と共役な位置に配置されているので、コーナーキューブ33から第3のBS32に入射される反射光は、第3のBS32を反射して前記試料8の反射光と同様な光路を辿って検出器11側に導かれる。 On the other hand, a part of the laser light from the light source 1 is reflected by the third BS 32 and enters the corner cube 33. In this case, since the vertex position d of the corner cube 33 is arranged at a position conjugate with the pupil position of the objective lens 7, the reflected light incident on the third BS 32 from the corner cube 33 passes through the third BS 32. The light is reflected and follows the same optical path as the reflected light of the sample 8 and is guided to the detector 11 side.
この時、第3のBS32において、コーナーキューブ33からの反射光と上述の試料8からの反射光が合流し、この合流した光は互いに干渉を起こす。そして、この状態の光が検出器11まで導かれ干渉パターンの画像が検出される。 At this time, the reflected light from the corner cube 33 and the reflected light from the sample 8 are merged in the third BS 32, and the merged light causes interference. And the light of this state is guide | induced to the detector 11, and the image of an interference pattern is detected.
したがって、このようにしても第1の実施の形態と同様な効果を得ることができる。加えて、コーナーキューブ33の頂点を対物レンズ7の瞳と共役な位置とすることで第1の実施の形態の集光レンズ22と参照鏡23を組み合わせたものと同等の作用を得ることができ、コーナーキューブ33の位置調整をするのみで対物レンズ7の瞳位置と共役な位置の調整ができるので、かかる位置調整のための作業を簡単にできる。さらに、コーナーキューブ33と第3のBS32を組み合わせてコーナーキューブユニット31が構成され、かかるコーナーキューブユニット31は、レボルバ部14に着脱可能となっていて、第1の実施の形態のシャッタ24の機能を兼ね備えることができるので、その分構成が簡単で、価格的にも安価にできる。さらに、コーナーキューブユニット31を装着するレボルバ部14は対物レンズ7と一体で光軸方向(Z方向)に移動するため、対物レンズ7とコーナーキューブユニット31の相対位置関係は、レボルバ部14を光軸方向に移動しても変化することがないので、より正確な高さ計測をすることが可能となる。さらにレボルバ部14に倍率の異なる対物レンズ7を複数取り付ければ、干渉用の専用対物レンズを複数用意することなしに、倍率の異なる干渉パターン画像を検出できる。
Therefore, even if it does in this way, the effect similar to 1st Embodiment can be acquired. In addition, by setting the apex of the corner cube 33 to a position conjugate with the pupil of the objective lens 7, it is possible to obtain an operation equivalent to the combination of the condenser lens 22 and the reference mirror 23 of the first embodiment. Since the position conjugate with the pupil position of the objective lens 7 can be adjusted only by adjusting the position of the corner cube 33, the work for the position adjustment can be simplified. Further, the
なお、コーナーキューブユニット31に代えて、第1の実施の形態で述べた第2のBS16、集光レンズ22と参照鏡23をユニット化し、レボルバ部14に着脱可能とするようにもできる。
Instead of the
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。 In addition, this invention is not limited to the said embodiment, In the implementation stage, it can change variously in the range which does not change the summary.
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。 Furthermore, the above embodiments include inventions at various stages, and various inventions can be extracted by appropriately combining a plurality of disclosed constituent elements. For example, even if some constituent requirements are deleted from all the constituent requirements shown in the embodiment, the problem described in the column of the problem to be solved by the invention can be solved, and is described in the column of the effect of the invention. If the above effect is obtained, a configuration from which this configuration requirement is deleted can be extracted as an invention.
1…光源、2…PBS
3…XY光偏向ユニット、4…λ/4板
5…瞳投影レンズ、6…結像レンズ
7…対物レンズ、8…試料
9…集光レンズ、10…ピンホール
11…検出器、12…コントローラ
14…レボルバ部、141…Zスケール
15…モニタ、16…第2のBS
17…照明光学系、18…白色照明用ファイバ
19…第1のBS、20…カメラレンズ
21…CCDカメラ、22…集光レンズ
23…参照鏡、24…シャッタ、25…反射光学系ユニット
31…コーナーキューブユニット、311…鏡筒
32…第3のBS、33…コーナーキューブ
1 ... light source, 2 ... PBS
DESCRIPTION OF SYMBOLS 3 ... XY light deflection unit, 4 ... (lambda) / 4 board 5 ... Pupil projection lens, 6 ... Imaging lens 7 ... Objective lens, 8 ... Sample 9 ... Condensing lens, 10 ... Pinhole 11 ... Detector, 12 ... Controller 14 ... Revolver part 141 ... Z scale 15 ...
DESCRIPTION OF SYMBOLS 17 ... Illumination optical system, 18 ... White illumination fiber 19 ... 1st BS, 20 ... Camera lens 21 ... CCD camera, 22 ... Condensing lens 23 ... Reference mirror, 24 ... Shutter, 25 ... Reflective
Claims (6)
前記光源から発生したレーザ光を試料上に集光する対物レンズと、
前記対物レンズの瞳位置と共役な位置に配置され前記レーザ光を前記試料面上で走査させる走査手段と、
前記対物レンズと走査手段との間の光路に配置され前記レーザ光の光路を分割する光路分割手段及び該光路分割手段により分割された光路に配置され前記走査手段で走査されるレーザ光を反射する反射光学系を有する反射光学系ユニットと、
前記反射光学系ユニット又は前記反射光学系を前記対物レンズと走査手段との間の光路に対し挿脱可能とした挿脱手段と、
前記対物レンズの集光位置と共役な位置に配置され、前記試料面からの反射光又は前記反射光学系からの反射光と前記試料からの反射光の干渉による干渉パターンを通過させる微小開口と、
前記微小開口を通過する光の強度を検出する光検出手段と
を具備したことを特徴とするレーザ走査型共焦点顕微鏡。 A light source that generates laser light;
An objective lens for condensing the laser beam generated from the light source on the sample;
Scanning means arranged at a position conjugate with the pupil position of the objective lens and scanning the laser beam on the sample surface;
An optical path dividing unit arranged in an optical path between the objective lens and a scanning unit and dividing an optical path of the laser beam, and a laser beam arranged in an optical path divided by the optical path dividing unit and reflected by the scanning unit are reflected. A reflective optical unit having a reflective optical system;
Insertion / removal means capable of inserting / removing the reflection optical system unit or the reflection optical system with respect to the optical path between the objective lens and the scanning means;
A minute aperture that is disposed at a position conjugate with the focusing position of the objective lens, and that allows the reflected light from the sample surface or the reflected light from the reflective optical system to pass through an interference pattern due to interference of the reflected light from the sample;
A laser scanning confocal microscope, comprising: a light detection unit that detects an intensity of light passing through the minute aperture.
前記光導入手段と前記光路分割手段を一体に構成したことを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載のレーザ走査型共焦点顕微鏡。 Further, a light source that emits illumination light having an arbitrary wavelength, light introduction means that introduces illumination light emitted from the light source onto the optical axis of the objective lens, and illumination light introduced by the light introduction means are irradiated. Image acquisition means for detecting reflected light from the sample and acquiring a non-confocal image of the sample,
6. The laser scanning confocal microscope according to claim 1, wherein the light introducing unit and the optical path dividing unit are integrally configured.
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JP2006040663A JP2007219239A (en) | 2006-02-17 | 2006-02-17 | Laser scanning type confocal microscope |
Applications Claiming Priority (1)
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