JP2007217347A - Intraocular pathologic neovascularization inhibitor, medicine for preventing and/or treating intraocular neovascularization disease, and method for screening the same - Google Patents
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Abstract
Description
Ｌｎｋノックアウトマウスに網膜虚血モデルを適用して得られたモデルマウスより得られた知見に基づき、眼内血管新生性疾患の予防・治療に有用な薬剤を得ることに関する。 The present invention relates to obtaining a drug useful for prevention and treatment of intraocular neovascular diseases based on knowledge obtained from a model mouse obtained by applying a retinal ischemia model to a Lnk knockout mouse.
虚血性増殖性網膜症は、糖尿病や網膜静脈閉塞症等の合併症や未熟児網膜症等として知られている。虚血性増殖性網膜症とは、網膜の一部に血液が流れていない虚血部分に非常に脆く出血しやすい増殖性毛細血管（新生血管）が形成され、これが刺激となって形成される薄層の増殖膜が網膜剥離を、また脆弱な新生血管が網膜内で破れて硝子体出血を引き起こし、放置しておくと失明に至る疾患である。現状では、このような網膜における血管新生を抑制する治療として、網膜光凝固術、網膜冷凍凝固術が行われているが、薬物療法は確立していない。 Ischemic proliferative retinopathy is known as complications such as diabetes and retinal vein occlusion and retinopathy of prematurity. Ischemic proliferative retinopathy is a thin blood vessel that is formed by the formation of proliferative capillaries (neovascular vessels) that are very brittle and easy to bleed in the ischemic area where blood does not flow in part of the retina. The proliferative membrane of the layer causes retinal detachment, and fragile new blood vessels break in the retina, causing vitreous hemorrhage. At present, retinal photocoagulation and retinal cryocoagulation are performed as treatments for suppressing angiogenesis in the retina, but no drug therapy has been established.
一方、Ｌｎｋは、アダプター蛋白として、造血幹細胞の産生制御において重要な役割を持つことが知られている。また、J. Exp. Med. 2002 Jan 21;195:151-160には、Ｌｎｋノックアウトマウスと野生マウスについて作製された下肢虚血モデルマウス及び骨折モデルマウスがにおいて、Ｌｎｋノックアウトマウスに有意な血流改善が認められたこと、Ｌｎｋが血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の制御に関与することなどが報告されている。 On the other hand, Lnk is known as an adapter protein that has an important role in controlling the production of hematopoietic stem cells. In J. Exp. Med. 2002 Jan 21; 195: 151-160, there is a significant blood flow in the Lnk knockout mouse in the lower limb ischemia model mouse and the fracture model mouse prepared for the Lnk knockout mouse and the wild mouse. It has been reported that improvement has been observed and that Lnk is involved in the control of vascular endothelial progenitor cells (EPC).
Ｌｎｋに制御を受ける血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に関しては、成体の循環血液中に存在し、重症虚血部位の血管形成に関与することが、本発明者より報告されている（例えば、Science. 1997 Feb 14;275(5302):964-7）。以来多くのin vivo/ in vitroの実験を通じてその治療応用の有用性を示唆する知見が集積され、現在、重症の冠動脈疾患（虚血性心疾患）や慢性重症下肢虚血疾患（閉塞性動脈硬化症、バージャー病）患者の血管再生療法として臨床試験が始まっている（例えば、Nat Med. 1999 Apr;5(4):434-8）。 The present inventors have reported that vascular endothelial progenitor cells (EPC) that are controlled by Lnk are present in adult circulating blood and are involved in angiogenesis in severe ischemic sites (for example, Science. 1997 Feb 14; 275 (5302): 964-7). Since then, many in vivo / in vitro experiments have accumulated knowledge that suggests the usefulness of its therapeutic application. At present, severe coronary artery disease (ischemic heart disease) and chronic severe lower limb ischemia disease (occlusive arteriosclerosis) , Buerger's disease) clinical trials have started as a revascularization therapy for patients (for example, Nat Med. 1999 Apr; 5 (4): 434-8).
本発明の目的は、眼内血管新生を効果的に阻害する作用を有する眼内病的血管新生阻害剤及び眼内血管新生性疾患の予防及び／又は治療薬、並びにＬｎｋ欠損網膜虚血モデルを用いて予防・治療薬を効率よくスクリーニングする方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide an intraocular pathogenic angiogenesis inhibitor having an action of effectively inhibiting intraocular neovascularization, a preventive and / or therapeutic agent for intraocular neovascular diseases, and an Lnk-deficient retinal ischemia model. The object is to provide a method for efficiently screening for preventive / therapeutic drugs.
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスを作製し、虚血部位における病的な血管新生が抑制され、正常な血管の再生が促進されるという知見を得たことに基づき、Ｌｎｋ遺伝子の機能を阻害することにより眼内血管新生を効果的に抑制できること、Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルにおける網膜虚血部位の血管再生を指標として種々の眼内血管新生性疾患の予防や治療に利用できる薬剤を効率よくスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have produced a Lnk-deficient retinal ischemia model mouse, which suppresses pathological angiogenesis at the ischemic site and promotes normal blood vessel regeneration. Based on the above findings, it is possible to effectively suppress intraocular neovascularization by inhibiting the function of the Lnk gene, and various intraocular markers using vascular regeneration at the retinal ischemia site in the Lnk-deficient retinal ischemia model as an index. The present invention has been completed by finding that a drug that can be used for the prevention and treatment of angiogenic diseases can be efficiently screened.
すなわち、本発明は、Ｌｎｋ遺伝子の発現又は機能を阻害する物質を有効成分として含有する眼内病的血管新生阻害剤を提供する。眼内病的血管新生阻害剤は、Ｌｎｋ遺伝子の発現を阻害する物質を有効成分として含有していることが好ましい。 That is, the present invention provides an intraocular pathological angiogenesis inhibitor containing a substance that inhibits the expression or function of the Lnk gene as an active ingredient. The intraocular pathological angiogenesis inhibitor preferably contains a substance that inhibits the expression of the Lnk gene as an active ingredient.
また、本発明は、Ｌｎｋ遺伝子の発現又は機能を阻害する物質を有効成分として含有する眼内血管新生性疾患の予防及び／又は治療薬を提供する。前記眼内血管新生性疾患には、虚血性増殖性網膜症、黄斑浮腫、加齢性黄斑変性症、血管新生緑内障、角膜血管新生、及び脈絡膜血管新生が含まれる。 In addition, the present invention provides a preventive and / or therapeutic agent for intraocular neovascular diseases containing a substance that inhibits the expression or function of the Lnk gene as an active ingredient. The intraocular neovascular diseases include ischemic proliferative retinopathy, macular edema, age-related macular degeneration, neovascular glaucoma, corneal neovascularization, and choroidal neovascularization.
本発明は、また、染色体上のＬｎｋ遺伝子の機能が欠損している網膜虚血モデル非ヒト動物に被験物質を投与し、該非ヒト動物の網膜虚血領域における血管再生の程度を評価することを特徴とする眼内血管新生性疾患の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法を提供する。この際、網膜虚血モデル非ヒト動物の網膜虚血部位近傍の病的血管新生の程度を評価してもよい。 The present invention also comprises administering a test substance to a retinal ischemia model non-human animal deficient in the function of the Lnk gene on the chromosome and evaluating the degree of vascular regeneration in the retinal ischemia region of the non-human animal. Provided is a screening method for a preventive and / or therapeutic agent for a characteristic intraocular neovascular disease. At this time, the degree of pathological angiogenesis in the vicinity of the retinal ischemia site of the retinal ischemia model non-human animal may be evaluated.
さらに、本発明は、染色体上のＬｎｋ遺伝子の機能が欠損している網膜虚血モデル非ヒト動物に被験物質を投与し、該非ヒト動物の骨髄に含まれる未分化細胞群における血管内皮前駆細胞分画の増減を評価することを特徴とする眼内血管新生性疾患の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法を提供する。前記非ヒト動物はマウスであってもよい。 Furthermore, the present invention provides a test substance administered to a retinal ischemia model non-human animal deficient in the function of the Lnk gene on the chromosome, and a vascular endothelial progenitor cell component in an undifferentiated cell group contained in the bone marrow of the non-human animal. There is provided a screening method for a preventive and / or therapeutic agent for an intraocular neovascular disease characterized by evaluating the increase / decrease in stroke. The non-human animal may be a mouse.
本願明細書中、「血管新生」とは、血管を形成するプロセスであって、既存の血管から新しい血管を形成することを意味している。血管を形成するプロセスである点で類似する「脈管形成」は、胚形成期の初期の段階に見られる最初の血管形成の過程をいい、既存の血管からではなく中胚葉系の血管芽細胞の分化によって発生される点で両者は異なる。 In the present specification, “angiogenesis” is a process of forming a blood vessel and means forming a new blood vessel from an existing blood vessel. Angiogenesis, which is similar in that it is a process that forms blood vessels, refers to the first angiogenesis process found in the early stages of embryogenesis, and is not from existing blood vessels but mesodermal hemangioblasts They differ in that they are generated by differentiation.
本発明によれば、Ｌｎｋ遺伝子の機能阻害により眼内血管新生を効果的に抑制することを指標として眼内病的血管新生阻害剤を容易に得ることができる。また、血管新生の阻害効果に基づけば眼内血管新生性疾患の予防及び／又は治療に利用可能な薬剤を得ることができる。さらに、Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルを用いることにより、網膜虚血部位に表される症状を指標として、眼内血管新生性疾患に対する予防・治療効果に優れた薬剤を効率よくスクリーニングすることができる。 According to the present invention, an intraocular pathogenesis angiogenesis inhibitor can be easily obtained using as an index the effective suppression of intraocular neovascularization by inhibiting the function of the Lnk gene. Moreover, based on the angiogenesis inhibitory effect, a drug that can be used for the prevention and / or treatment of intraocular angiogenic diseases can be obtained. Furthermore, by using the Lnk-deficient retinal ischemia model, it is possible to efficiently screen a drug having an excellent preventive / therapeutic effect on an intraocular neovascular disease using the symptom expressed in the retinal ischemic site as an index.
本発明の眼内病的血管新生阻害剤は、眼内における病的血管新生を阻害することにより、正常な血管再生を促す効果を奏する薬剤を意味しており、Ｌｎｋ遺伝子の発現又は機能を阻害する物質を有効成分として含有している。有効成分として、好ましくはＬｎｋ遺伝子の発現を阻害する物質が用いられる。 The intraocular pathological angiogenesis inhibitor of the present invention means a drug having an effect of promoting normal blood vessel regeneration by inhibiting pathological angiogenesis in the eye, and inhibits the expression or function of the Lnk gene. The substance to be contained is contained as an active ingredient. As an active ingredient, a substance that inhibits the expression of the Lnk gene is preferably used.
Ｌｎｋは、ＳＨ２ドメイン及びＰＨドメインをもつアダプター蛋白質である。Ｌｎｋ遺伝子の塩基配列及びＬｎｋのアミノ酸配列は公知であり、例えばマウスＬｎｋ ｃＤＮＡの塩基配列としては、GenBank Accession No. U89992で表される配列等が挙げられる。本発明者らは、染色体上のＬｎｋ遺伝子の機能を欠損させたＬｎｋノックアウトマウスを作製し、同マウスに網膜虚血モデルを適用して得られたモデルマウスを解析したところ、Ｌｎｋ蛋白質が眼内血管新生に関与することを見出した。Ｌｎｋ遺伝子には、ヒト、チンパンジー、ラット、ニワトリ、ショウジョウバエ等のホモログの存在が知られており、これらの塩基配列はGenBankに公開されている。従って、本発明の眼内病的血管新生阻害剤は、マウスのみならず、上記の動物及びその他の動物における眼内血管新生の阻害が要請される疾患に適用することも可能である。 Lnk is an adapter protein having an SH2 domain and a PH domain. The nucleotide sequence of the Lnk gene and the amino acid sequence of Lnk are known. For example, the nucleotide sequence of mouse Lnk cDNA includes the sequence represented by GenBank Accession No. U89992. The inventors of the present invention produced a Lnk knockout mouse in which the function of the Lnk gene on the chromosome was deleted, and analyzed a model mouse obtained by applying a retinal ischemia model to the mouse. It was found to be involved in angiogenesis. The Lnk gene is known to have homologues such as human, chimpanzee, rat, chicken, and Drosophila, and their base sequences are disclosed in GenBank. Therefore, the intraocular pathogenesis angiogenesis inhibitor of the present invention can be applied not only to mice but also to diseases that require inhibition of intraocular neovascularization in the above-mentioned animals and other animals.
眼内血管新生性疾患には、例えば、虚血性増殖性網膜症、黄斑浮腫、加齢性黄斑変性症、血管新生緑内障、角膜血管新生及び脈絡膜血管新生等が含まれる。虚血性増殖性網膜症の具体例としては、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症などの合併症等が挙げられる。本発明によれば、特に虚血性増殖性網膜症における虚血の優れた改善効果を得ることができ、例えば、糖尿病網膜症等の防止、治療に有効な眼内病的血管新生阻害剤を提供できる。 Examples of intraocular neovascular diseases include ischemic proliferative retinopathy, macular edema, age-related macular degeneration, neovascular glaucoma, corneal neovascularization, and choroidal neovascularization. Specific examples of ischemic proliferative retinopathy include complications such as diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, and retinal vein occlusion. According to the present invention, it is possible to obtain an excellent improvement effect of ischemia particularly in ischemic proliferative retinopathy, for example, to provide an intraocular pathological angiogenesis inhibitor effective for the prevention and treatment of diabetic retinopathy, etc. it can.
本発明の眼内病的血管新生阻害剤は、Ｌｎｋ遺伝子の発現又は機能を阻害する物質を有効成分として含有している。ここで、「発現」とは、蛋白質が産生されることを意味しており、「発現を阻害する物質」は、遺伝子の転写、転写後調節、蛋白質への翻訳、翻訳後修飾（チロシンリン酸化）、蛋白質フォールディング等の何れの段階で作用するものであってもよい。また、「機能を阻害する物質」は、蛋白質における蛋白質間相互作用部位（ＳＨ２ドメイン等）や活性部位（リン酸化チロシン等）等の機能部位に作用してシグナル伝達を低減又は抑制する物質；Ｌｎｋ又はＬｎｋと相互作用する蛋白質のドミナントネガティブ変異体等であってもよい。ここで、「ドミナントネガティブ変異体」とは、蛋白質に対する変異の導入（機能領域の欠失等）によりその生理活性が低減したものをいう。これらの変異体は野生型と競合して間接的にその機能を阻害することができる。 The intraocular pathogenesis angiogenesis inhibitor of the present invention contains a substance that inhibits the expression or function of the Lnk gene as an active ingredient. Here, “expression” means that a protein is produced, and “substances that inhibit expression” include gene transcription, post-transcriptional regulation, translation into protein, and post-translational modification (tyrosine phosphorylation). ), Which may act at any stage such as protein folding. In addition, a “substance that inhibits a function” is a substance that acts on a functional site such as a protein-protein interaction site (such as SH2 domain) or an active site (such as phosphorylated tyrosine) in a protein to reduce or suppress signal transduction; Alternatively, it may be a dominant negative mutant of a protein that interacts with Lnk. Here, the “dominant negative mutant” refers to a substance whose physiological activity has been reduced by introducing a mutation into a protein (deletion of a functional region, etc.). These mutants can compete with the wild type and indirectly inhibit its function.
Ｌｎｋの発現を阻害する物質としては、例えば、転写抑制因子、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、蛋白質合成阻害剤、蛋白質分解酵素、蛋白質変性剤、スプライシングやｍＲＮＡの細胞質移行を阻害しうる因子、ｍＲＮＡ分解酵素、ｍＲＮＡに結合して不活化する因子等が挙げられるが、他の遺伝子や蛋白質への副作用を最小限にするため、標的分子に特異的に作用しうる物質が好ましい。このようなＬｎｋの発現を特定的に阻害する物質としては、例えば、Ｌｎｋ若しくはその均等物にｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、アプタマー、デコイ核酸等の機能性核酸；抗体等の機能性蛋白質が好ましく用いられる。これらの機能性核酸及び蛋白質は、投与後に投与対象内で産生される形態であってもよく、必要に応じて発現ベクター、細胞等を用いて公知の方法で調製することができる。なかでも、標的分子の特異性を容易に付与でき、取扱性に優れる点で、機能性核酸が好ましく、特にｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸等が好ましく用いられる。機能性核酸を用いる場合には、標的分子と相補的又は同一である領域の長さが、例えば１５〜３０個、好ましくは１８〜２５個、より好ましくは２０〜２３個程度のヌクレオチドである。 Examples of substances that inhibit Lnk expression include transcriptional repressors, RNA polymerase inhibitors, protein synthesis inhibitors, proteolytic enzymes, protein denaturing agents, factors that can inhibit splicing and cytoplasmic translocation of mRNA, mRNA degrading enzymes, Examples include a factor that binds to mRNA and inactivates it, but a substance that can specifically act on a target molecule is preferable in order to minimize side effects on other genes and proteins. Examples of the substance that specifically inhibits the expression of Lnk include functional nucleic acids such as siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, antisense nucleic acid, aptamer, decoy nucleic acid, etc. in Lnk or its equivalent; Sex proteins are preferably used. These functional nucleic acids and proteins may be in a form produced in the administration subject after administration, and can be prepared by a known method using an expression vector, a cell, or the like, if necessary. Among these, functional nucleic acids are preferable, and siRNA, antisense nucleic acids, and the like are preferably used in that the specificity of the target molecule can be easily imparted and the handleability is excellent. When a functional nucleic acid is used, the length of the region complementary or identical to the target molecule is, for example, about 15 to 30, preferably 18 to 25, more preferably about 20 to 23 nucleotides.
Ｌｎｋの機能を阻害する物質としては、上記と同様の観点から、Ｌｎｋ蛋白質に特異的に（特定部位に）結合する因子が好ましく用いられ、例えば、アプタマー、デコイ核酸等の機能性核酸；抗体、Ｌｎｋドミナントネガティブ変異体、Ｌｎｋ蛋白と相互作用する蛋白質のドミナントネガティブ変異体等の機能性蛋白質が挙げられる。本発明においては、Ｌｎｋ遺伝子の機能を阻害する物質を有効成分とする眼内病的血管新生阻害剤が好ましく用いられる。 As a substance that inhibits the function of Lnk, from the same viewpoint as described above, a factor that specifically binds to Lnk protein (specific site) is preferably used. For example, a functional nucleic acid such as an aptamer or decoy nucleic acid; an antibody, Examples include functional proteins such as Lnk dominant negative mutants and dominant negative mutants of proteins that interact with Lnk protein. In the present invention, an intraocular pathological angiogenesis inhibitor containing a substance that inhibits the function of the Lnk gene as an active ingredient is preferably used.
Ｌｎｋ遺伝子の発現又は機能を阻害する物質を有効成分として含有する眼内病的血管新生阻害剤は、例えば、適宜なビヒクルに溶解又は懸濁して、経口又は非経口投与される。非経口投与には、例えば、静脈、動脈、筋肉、腹腔、気道等を経路とする全身投与、又は虚血部位又はその近傍への局所投与を利用できるが、これらに限定されない。好ましくは非経口投与、より好ましくは網膜虚血部位又はその近傍へ局所投与される。 The intraocular pathogenesis angiogenesis inhibitor containing a substance that inhibits the expression or function of the Lnk gene as an active ingredient is, for example, orally or parenterally dissolved or suspended in an appropriate vehicle. For parenteral administration, for example, systemic administration via the vein, artery, muscle, abdominal cavity, airway, etc., or local administration at or near the ischemic site can be used, but is not limited thereto. Preferably, it is administered parenterally, more preferably locally administered at or near the retinal ischemic site.
眼内病的血管新生阻害剤は、Ｌｎｋ遺伝子の発現又は機能を阻害する物質を虚血部位又はその近傍の細胞に安定に到達させ、細胞膜を透過し、リソソーム／エンドソームからの薬剤の遊離を促進しうるドラッグデリバリーシステムの設計がされていることが好ましい。ヌクレアーゼ耐性、細胞内移行、リソソーム／エンドソームからの薬剤の遊離の改善方法としては、例えば、アンチセンス核酸等のオリゴ核酸分子の場合、リン酸結合や糖部分に修飾を施したり、リン酸骨格の代わりにモルフィン骨格を有するオリゴ核酸、ＰＮＡ等を用いる方法等の化学修飾を施す方法等の公知の方法を適用できる。 Intraocular angiogenesis inhibitors allow substances that inhibit Lnk gene expression or function to stably reach cells at or near ischemic sites, permeate the cell membrane, and promote the release of drugs from lysosomes / endosomes It is preferable that a possible drug delivery system is designed. Examples of methods for improving nuclease resistance, intracellular translocation, and drug release from lysosomes / endosomes include, for example, in the case of oligonucleic acid molecules such as antisense nucleic acids, modification of the phosphate bond or sugar moiety, Instead, a known method such as a method of chemically modifying such as a method using oligonucleic acid having a morphine skeleton, PNA or the like can be applied.
眼内病的血管新生阻害剤の剤形としては、液剤、固形剤の何れであってもよく、例えば、水、生理食塩水等の希釈液又は分散媒に有効量の阻害剤を溶解、分散、乳化させた液剤；有効量の阻害剤を固体や顆粒として含むカプセル剤、サッシェ剤、錠剤等の固形剤などが挙げられる。 The dosage form of the intraocular pathological angiogenesis inhibitor may be either a liquid or a solid agent. For example, an effective amount of the inhibitor is dissolved and dispersed in a diluent or dispersion medium such as water or physiological saline. And emulsified liquids; capsules containing an effective amount of an inhibitor as solids or granules, sachets, solids such as tablets, and the like.
眼内病的血管新生阻害剤は、また、有効成分となるＬｎｋ遺伝子の発現又は機能を阻害する物質がそのまま添加されていてもよく、有効成分がリポソームや徐放性材料等に封入された封入体や担体に担持された担持体などであってもよい。リポソーム等に封入することにより、有効成分をヌクレアーゼやプロテアーゼによる分解から保護し、リポソーム膜が細胞表面と結合してエンドサイトーシスにより細胞内に到達しやすくなる点で有利である。コラーゲン等の徐放性材料に封入することにより、有効成分の長期持続性が得られる。 Intraocular angiogenesis inhibitors may also contain substances that inhibit the expression or function of the Lnk gene as an active ingredient, and the active ingredient is encapsulated in liposomes or sustained-release materials. It may be a carrier or a carrier carried on a carrier. Encapsulating in liposomes and the like is advantageous in that the active ingredient is protected from degradation by nucleases and proteases, and the liposome membrane binds to the cell surface and easily reaches inside the cell by endocytosis. By encapsulating in a sustained release material such as collagen, long-term persistence of the active ingredient can be obtained.
眼内病的血管新生阻害剤には、上記以外に、医薬上許容される公知の添加剤を添加することができる。 In addition to the above, known pharmaceutically acceptable additives can be added to the intraocular pathological angiogenesis inhibitor.
眼内病的血管新生阻害剤の投与量は、同阻害剤の種類、投与方法、症状、投与対象の種類、大きさ、薬物特性等に応じて異なるが、通常、成人１日当たり有効成分量として例えば０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは０．０００５〜５ｍｇ／ｋｇ程度であり、１回又は複数回に分けて投与することができる。 The dosage of the intraocular pathological angiogenesis inhibitor varies depending on the type of inhibitor, administration method, symptom, type of administration subject, size, drug characteristics, etc. For example, it is about 0.0001 to 10 mg / kg, preferably about 0.0005 to 5 mg / kg, and can be administered once or divided into a plurality of times.
本発明のスクリーニング方法は、染色体上のＬｎｋ遺伝子の機能が欠損している網膜虚血モデル非ヒト動物に被験物質を投与し、該非ヒト動物の網膜虚血領域における血管再生の程度を評価することにより眼内血管新生性疾患の予防及び／又は治療薬をスクリーニングする方法である（以下、「スクリーニング方法１」と称する場合がある）。 The screening method of the present invention comprises administering a test substance to a retinal ischemia model non-human animal deficient in the function of the Lnk gene on the chromosome, and evaluating the degree of vascular regeneration in the retinal ischemia region of the non-human animal. Is a method for screening a preventive and / or therapeutic agent for an intraocular neovascular disease (hereinafter sometimes referred to as “screening method 1”).
染色体上のＬｎｋ遺伝子の機能が欠損している網膜虚血モデル非ヒト動物は、Ｌｎｋ遺伝子の機能が欠損している非ヒト動物を用いて網膜虚血モデルを作製することにより得ることができる。非ヒト動物としては、ヒト以外の動物であれば特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、サル、チンパンジー、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）、特にマウスを用いることができる。例えば、Ｌｎｋノックアウトマウスは、Ｌｎｋ遺伝子の一部又は全部が欠失、置換若しくは他の塩基配列を付加されたことによりＬｎｋの機能が低下又は抑制されているマウスを意味している。Ｌｎｋノックアウトマウスは、一般に特定の遺伝子ノックアウトマウスを作製する方法として公知乃至慣用の方法で作製することができ、例えば、Immunity vol.13, 599-609, 2000に記載の方法に従って作製できる。 A retinal ischemia model non-human animal deficient in the function of the Lnk gene on the chromosome can be obtained by preparing a retinal ischemia model using a non-human animal deficient in the function of the Lnk gene. The non-human animal is not particularly limited as long as it is a non-human animal, but is preferably a mammal (rodent such as mouse, rat, rabbit, guinea pig, monkey, chimpanzee, pig, cow, horse, sheep, dog, Cats), in particular mice. For example, a Lnk knockout mouse means a mouse in which the function of Lnk is reduced or suppressed due to deletion, substitution, or addition of another base sequence of part or all of the Lnk gene. The Lnk knockout mouse can be generally produced by a known or commonly used method for producing a specific gene knockout mouse. For example, it can be produced according to the method described in Immunity vol.13, 599-609, 2000.
網膜虚血モデル非ヒト動物（以下、「モデル動物」と称する場合がある）の作製方法は、マウスを用いた方法が広く知られており、マウス以外の非ヒト動物においても概ね同様の方法を適用可能である。例えば、網膜虚血モデルマウスは、生後７日目から１２日までの５日間、７５容量％酸素濃度雰囲気下で飼育した後、飼育環境を通常酸素雰囲気（約２０容量％酸素濃度）へ戻し、所定期間（例えば５日間程度）飼育する方法により作製することができる。すなわち、Ｌｎｋノックアウトマウスを生後７日目から上記方法により飼育することにより、生後約１７日経過後、染色体上のＬｎｋ遺伝子の機能が欠損している網膜虚血モデルマウス（以下、「Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウス」と称する場合がある）を得ることができる。 As a method for producing a retinal ischemia model non-human animal (hereinafter sometimes referred to as “model animal”), a method using a mouse is widely known, and a similar method is generally used for a non-human animal other than a mouse. Applicable. For example, a retinal ischemia model mouse was raised in a 75 vol% oxygen concentration atmosphere for 5 days from the 7th day to the 12th day after birth, and then returned to a normal oxygen atmosphere (about 20 vol% oxygen concentration). It can produce by the method of raising for a predetermined period (for example, about 5 days). That is, Lnk knockout mice are bred from the 7th day after birth by the above-described method, so that about 17 days after birth, the function of the Lnk gene on the chromosome is deficient (hereinafter referred to as “Lnk-deficient retina imaginary”). May be referred to as “blood model mouse”).
本発明のスクリーニング方法に供される被検物質は、公知又は新規化合物の何れであってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物等の合成又は天然由来の有機化合物を用いることができる。 The test substance used in the screening method of the present invention may be any known or novel compound, for example, synthetic or naturally derived nucleic acid, carbohydrate, lipid, protein, peptide, organic low molecular weight compound, etc. Organic compounds can be used.
被検物質をモデル動物の投与方法は、特に限定されず、経口及び非経口投与の何れであってもよい。非経口投与には、例えば、静脈、動脈、筋肉、腹腔、気道等を経路とする全身投与、又は虚血部位又はその近傍への局所投与を利用できるが、これらに限定されない。好ましくは非経口投与、より好ましくは網膜虚血部位又はその近傍へ局所投与される。被検物質の投与量は、被検物質の種類、投与方法、モデル動物の種類、大きさ等に応じて適宜設定できる。 The method of administering the test substance to the model animal is not particularly limited, and any of oral and parenteral administration may be used. For parenteral administration, for example, systemic administration via the vein, artery, muscle, abdominal cavity, airway, etc., or local administration at or near the ischemic site can be used, but is not limited thereto. Preferably, it is administered parenterally, more preferably locally administered at or near the retinal ischemic site. The dose of the test substance can be appropriately set according to the type of test substance, the administration method, the type, size, etc. of the model animal.
評価は、モデル動物の網膜虚血部位における血管再生の程度に基づいて行われる。「網膜虚血部位」とは、網膜における毛細血管の脱落領域であって、眼球から公知の処理を施して回収しうる網膜組織により肉眼で容易に判断することができる。「網膜虚血部位における血管再生の程度」は、例えば、網膜における毛細血管の脱落領域の面積変化で評価することができる。本発明のスクリーニング方法１によれば、Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスの網膜毛細血管の脱落領域の面積が、野生型網膜虚血モデルマウスに対して、例えば９０％以下（例えば０〜９０％）、好ましくは８０％以下、より好ましくは５０％以下であり、３０％以下であってもよい。このように、Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスは、野生型網膜虚血モデルマウスと比較して、網膜毛細血管の脱落領域を著しく減少することができる。このような知見から、本発明者らは、Ｌｎｋの機能を阻害することにより網膜における血管再生が促進されること、同作用は眼内血管新生性疾患の予防・治療に有効に利用できることを見出し、本発明に至ったものである。 The evaluation is performed based on the degree of blood vessel regeneration in the retinal ischemic region of the model animal. A “retinal ischemic site” is a region where capillaries have fallen in the retina, and can be easily determined with the naked eye based on retinal tissue that can be recovered by performing a known process from the eyeball. The “degree of vascular regeneration at the retinal ischemic site” can be evaluated by, for example, the change in the area of the capillaries in the retina. According to the screening method 1 of the present invention, the area of the retinal capillary dropout region of the Lnk-deficient retinal ischemia model mouse is, for example, 90% or less (eg, 0 to 90%) with respect to the wild-type retinal ischemia model mouse. , Preferably 80% or less, more preferably 50% or less, and may be 30% or less. Thus, the Lnk-deficient retinal ischemia model mouse can remarkably reduce the retinal capillary dropout region as compared with the wild-type retinal ischemia model mouse. From these findings, the present inventors have found that inhibition of Lnk function promotes vascular regeneration in the retina, and that this action can be effectively used for the prevention and treatment of intraocular neovascular diseases. This has led to the present invention.
本発明のスクリーニング方法１においては、「網膜虚血部位における血管再生の程度」は、「網膜虚血部位近傍の病的血管新生の程度」に基づいて評価されてもよい。「網膜虚血部位近傍の病的血管新生の程度」は、例えば、視神経を中心に周辺部方向に眼球矢状断切片を作製し（例えば図１中の１２）、内境界膜より硝子体側に存在している細胞を「病的血管新生」により生成されたものと判断し、病的新生血管の細胞核数を評価することができる。 In the screening method 1 of the present invention, “the degree of vascular regeneration in the retinal ischemic site” may be evaluated based on “the degree of pathological angiogenesis in the vicinity of the retinal ischemic site”. “The degree of pathological angiogenesis in the vicinity of the retinal ischemic site” refers to, for example, producing a sagittal slice of the eyeball in the peripheral direction centering on the optic nerve (for example, 12 in FIG. 1), The existing cells can be determined to have been generated by “pathological neovascularization”, and the number of cell nuclei of the pathological neovascularization can be evaluated.
本発明のスクリーニング方法１によれば、Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスにおいて病的血管新生が観察された単位面積当たりの細胞核数は、野生型モデルマウスにおける同細胞核数の９０％以下（例えば０〜９０％）、好ましくは８０％以下、より好ましくは５０％以下であり、３０％以下であってもよい。このように、Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスは、野生型網膜虚血モデルマウスと比較して、病的血管新生を高度に抑制することができる。このような知見に基づき、Ｌｎｋの機能を阻害することにより網膜近傍の病的血管新生が抑制されることを見出した。本発明の方法によれば、この現象を指標とすることにより、眼内血管新生性疾患の予防・治療に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。 According to the screening method 1 of the present invention, the number of cell nuclei per unit area in which pathological angiogenesis was observed in Lnk-deficient retinal ischemia model mice was 90% or less of the number of cell nuclei in wild-type model mice (for example, 0 to 0). 90%), preferably 80% or less, more preferably 50% or less, and may be 30% or less. Thus, Lnk-deficient retinal ischemia model mice can highly suppress pathological angiogenesis compared to wild-type retinal ischemia model mice. Based on such findings, it was found that pathological angiogenesis near the retina is suppressed by inhibiting the function of Lnk. According to the method of the present invention, by using this phenomenon as an index, it is possible to screen a drug effective for the prevention / treatment of an intraocular neovascular disease.
本発明のスクリーニング方法の他の方法としては、染色体上のＬｎｋ遺伝子の機能が欠損している網膜虚血モデル非ヒト動物に被験物質を投与し、該非ヒト動物の骨髄血における血管内皮前駆細胞分画の増減を評価することにより眼内血管新生性疾患の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法が挙げられる（以下、「スクリーニング方法２」と称する場合がある）。Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデル非ヒト動物、被検物質及びその投与条件等は上記と同様である。 As another method of the screening method of the present invention, a test substance is administered to a retinal ischemia model non-human animal deficient in the function of the Lnk gene on the chromosome, and the vascular endothelial progenitor cell component in bone marrow blood of the non-human animal is obtained. A screening method for a preventive and / or therapeutic agent for intraocular neovascular diseases can be mentioned by evaluating the increase / decrease of the stroke (hereinafter, referred to as “screening method 2” in some cases). The Lnk-deficient retinal ischemia model non-human animal, the test substance and the administration conditions thereof are the same as described above.
本発明のスクリーニング方法２は、Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデル非ヒト動物の骨髄に含まれる未分化細胞群における血管内皮前駆細胞分画の増減を評価することを主な特徴としている。「骨髄に含まれる未分化細胞群」とは、骨髄血中の造血幹細胞を含む未分化細胞（lineage陰性細胞）分画を意味しており、例えばマウス骨髄血においては、B220陰性、CD3陰性、Gr-1陰性、Mac-1陰性、TER-199陰性、BD陰性を示す細胞（lineage陰性細胞）が未分化細胞群に相当する。このような未分化細胞群は、ＭＡＣＳ法等の公知の方法で分離可能である。「血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）分画」とは、血管内皮前駆細胞のマーカー蛋白の発現を指標に選別され、例えばマウスのＥＰＣ分画については、c-Kit陽性／Sca-1陽性分画に相当する。 The screening method 2 of the present invention is characterized mainly by evaluating the increase or decrease in the fraction of vascular endothelial progenitor cells in the undifferentiated cell group contained in the bone marrow of a non-human animal of an Lnk-deficient retinal ischemia model. “Undifferentiated cell group contained in bone marrow” means a fraction of undifferentiated cells (lineage negative cells) containing hematopoietic stem cells in bone marrow blood. For example, in mouse bone marrow blood, B220 negative, CD3 negative, Cells showing Gr-1 negative, Mac-1 negative, TER-199 negative and BD negative (lineage negative cells) correspond to the undifferentiated cell group. Such an undifferentiated cell group can be separated by a known method such as the MACS method. “Endothelial progenitor cell (EPC) fraction” is selected based on the expression of marker protein of vascular endothelial progenitor cells as an index. For example, for the EPC fraction of mouse, c-Kit positive / Sca-1 positive fraction Equivalent to.
本発明のスクリーニング方法２によれば、Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスにおける上記ＥＰＣ分画を、野生型網膜虚血モデルマウスに対して例えば１．２倍以上（１．２〜２０倍程度）、好ましくは１．５倍以上（１．５〜１５倍低℃）、特に２倍以上増加させることが可能である。 According to the screening method 2 of the present invention, the EPC fraction in the Lnk-deficient retinal ischemia model mouse is, for example, 1.2 times or more (about 1.2 to 20 times) that of the wild-type retinal ischemia model mouse, Preferably, it can be increased by 1.5 times or more (1.5 to 15 times lower ° C), particularly by 2 times or more.
本発明のスクリーニング方法（１，２）によれば、眼内血管新生性疾患の予防及び／又は治療薬を効率よく得ることができる。こうして得られる眼内血管新生性疾患の予防及び／又は治療薬は、網膜虚血モデル非ヒト動物に投与した場合に、(i)眼内虚血部位における血管再生の促進、(ii)病的血管新生の抑制、(iii)骨髄に含まれる未分化細胞群における血管内皮前駆細胞分画の増加から選択される少なくとも一つの作用により、眼内血管新生性疾患に対する優れた予防及び／又は治療効果を発揮できる。 According to the screening method (1, 2) of the present invention, a prophylactic and / or therapeutic drug for intraocular neovascular diseases can be obtained efficiently. The thus obtained preventive and / or therapeutic agents for intraocular angiogenic diseases are (i) promotion of vascular regeneration at the site of intraocular ischemia, (ii) pathological Superior prophylactic and / or therapeutic effect on intraocular angiogenic disease by at least one action selected from suppression of angiogenesis, (iii) increase in vascular endothelial progenitor cell fraction in undifferentiated cells group contained in bone marrow Can be demonstrated.
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
参考例１（Ｌｎｋノックアウトマウスの作成）
Takaki et al, Nov;13(5):599-609;2000に記載の方法に従って、Ｌｎｋノックアウトマウスを作製した。具体的には以下の方法を用いた。
Ｌｎｋ遺伝子（J Immunol.Li et al, May 15;164(10):5199-206; 2000;及びImmunity, Takaki et al, Nov;13(5):599-609;2000）をクローニングし、ＯＲＦ部分をマーカー遺伝子（ネオマイシン[neo]、ガンシクロビル[gan c]耐性遺伝子など）で置換し遺伝子を破壊した。次に、破壊されたＬｎｋ遺伝子を有するＥＳ細胞を胚盤胞に注入してキメラ胚を作製した。その後、キメラ胚を仮親の子宮に移植し、キメラマウスを産ませた。最後に、キメラマウス同士を交配させ、Ｌｎｋ遺伝子を機能欠損したマウス（Ｌｎｋ欠損マウス）を作成した。
Reference example 1 (creation of a Lnk knockout mouse)
Lnk knockout mice were prepared according to the method described in Takaki et al, Nov; 13 (5): 599-609; 2000. Specifically, the following method was used.
The Lnk gene (J Immunol. Li et al, May 15; 164 (10): 5199-206; 2000; and Immunity, Takaki et al, Nov; 13 (5): 599-609; 2000) was cloned and the ORF portion Was replaced with a marker gene (neomycin [neo], ganciclovir [gan c] resistance gene, etc.) and the gene was destroyed. Next, ES cells having the disrupted Lnk gene were injected into blastocysts to produce chimeric embryos. Thereafter, the chimeric embryo was transplanted into the uterus of the foster parent to give birth to a chimeric mouse. Finally, chimera mice were mated with each other to create mice lacking the function of the Lnk gene (Lnk-deficient mice).
参考例２（網膜虚血モデルマウスの作製）
既に未熟児網膜症として確立されている方法に基づき網膜虚血モデルマウスを作成した。詳細には、生後7日目のC57BL/6Jマウス（野生型マウス）、Ｌｎｋノックアウトマウスを、母親と共に75%酸素濃度下で5日間飼育することにより眼球中心部の網膜毛細血管を脱落させた後、生後12日目の時点で通常酸素濃度下へ戻し、さらに5日間飼育することにより、網膜血管新生が誘発された(c)野生型網膜虚血モデルマウス、及び(d)Ｌｎｋ欠損マウス網膜虚血モデルを作成した。
Reference Example 2 (Preparation of retinal ischemia model mouse)
A retinal ischemia model mouse was created based on a method already established as retinopathy of prematurity. Specifically, after C57BL / 6J mice (wild-type mice) and Lnk knockout mice on the 7th day after birth were bred together with their mothers for 5 days under 75% oxygen concentration, the retinal capillaries in the center of the eyeball were removed. At the time of the 12th day after birth, the retinal neovascularization was induced by returning to normal oxygen concentration and rearing for another 5 days. (C) Wild type retinal ischemia model mice and (d) Lnk deficient mice A blood model was created.
実施例１（網膜虚血部位における血管再生）
(a)通常飼育した野生型マウス、参考例１で得た(b)通常飼育したＬｎｋ欠損マウス、参考例２で得た(c)野生型網膜虚血モデルマウス、及び(d)Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスについて、各眼球を摘出後、4%PFAで約30分間固定、その後強膜、網膜色素上皮、水晶体、角膜を除き、網膜のwhole mountを作成した。whole mountは、ブロッキングの後、１次抗体に、PECAM-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule)、２次抗体にCy3を用いて免疫染色を行った。網膜毛細血管領域は、画像処理ソフトで処理したデジタル画像を用いて、生後７日目（P7）、１２日目（P12）、１７日目（P17）について評価した。
Example 1 (Revascularization in retinal ischemia)
(a) Normal-bred wild-type mouse, obtained in Reference Example 1 (b) Normal-bred Lnk-deficient mouse, (c) Wild-type retinal ischemia model mouse obtained in Reference Example 2, and (d) Lnk-deficient retina For each ischemic model mouse, each eyeball was removed and fixed with 4% PFA for about 30 minutes, and then the sclera, retinal pigment epithelium, lens and cornea were removed, and a retina whole mount was prepared. The whole mount was subjected to immunostaining after blocking using PECAM-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule) as the primary antibody and Cy3 as the secondary antibody. The retinal capillary region was evaluated on the 7th day (P7), 12th day (P12), and 17th day (P17) using digital images processed by image processing software.
各マウスにおける各網膜毛細血管の脱落面積を比較したところ、通常飼育したマウスについては、図２に示されるように、(a)野生型マウスと(b)Ｌｎｋ欠損マウスはP7, P12, P17の何れも有意な差は認められなかった。一方、(c)野生型マウスと(d)Ｌｎｋ欠損マウスについては、グラフ（i）に示されるように、P12では網膜毛細血管の脱落面積に大きな差は認められないが、グラフ（ii）に示されるように、P17では(c)野生型マウスの網膜毛細血管の脱落面積は４．５ｍｍ2程度であったのに対し、(d)Ｌｎｋ欠損マウスは１ｍｍ2程度であって、網膜毛細血管の脱落面積が明らかに減少していた（P<0.01）。以上の結果より、野生型網膜虚血モデルマウスと比較して、Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスは、網膜毛細血管の再構築が亢進されていた。 As shown in FIG. 2, when comparing the dropout area of each retinal capillary in each mouse, as shown in FIG. 2, (a) wild-type mice and (b) Lnk-deficient mice were P7, P12, and P17. In all cases, no significant difference was observed. On the other hand, (c) wild type mice and (d) Lnk-deficient mice, as shown in graph (i), P12 shows no significant difference in the area of retinal capillaries, but graph (ii) As shown, in P17 (c) the dropout area of retinal capillaries of wild type mice was about 4.5 mm 2 , whereas (d) Lnk-deficient mice were about 1 mm 2 , and retinal capillaries The drop-out area of was clearly reduced (P <0.01). From the above results, remodeling of retinal capillaries was enhanced in Lnk-deficient retinal ischemia model mice compared to wild-type retinal ischemia model mice.
実施例２（網膜虚血部位における病的血管新生）
(a)通常飼育した野生型マウス、参考例１で得た(b)通常飼育したＬｎｋ欠損マウス、参考例２で得た(c)野生型網膜虚血モデルマウス、及び(d)Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスの各眼球を摘出し、4%PFAで固定した後パラフィンで包埋し、評価用切片として、3μm厚の眼球矢状断切片を、それぞれ視神経を中心に周辺部方向へ約140μm分作成した。得られた網膜組織切片はヘマトキシリンとエオジンを用いて染色し、内境界膜（図３のＸ）より硝子体側に存在している細胞核数を測定することにより、(a),(b),(c),(d)のマウスの病的網膜血管新生を比較した。これらの結果を図３に示す。
Example 2 (Pathologic angiogenesis in retinal ischemia)
(a) Normal-bred wild-type mouse, obtained in Reference Example 1 (b) Normal-bred Lnk-deficient mouse, (c) Wild-type retinal ischemia model mouse obtained in Reference Example 2, and (d) Lnk-deficient retina Each eyeball of an ischemic model mouse was removed, fixed with 4% PFA, then embedded in paraffin, and a 3 μm thick ocular sagittal section as an evaluation section, about 140 μm in the peripheral direction centered on the optic nerve, respectively Created a minute. The obtained retinal tissue section was stained with hematoxylin and eosin, and by measuring the number of cell nuclei existing on the vitreous side from the inner limiting membrane (X in FIG. 3), (a), (b), ( c) The pathological retinal neovascularization of mice in (d) was compared. These results are shown in FIG.
図３は、図１における１２の枠に対応する組織切片を、ｓが画面下、ｔが画面上となるように配置した図に対応し、白矢印は病的網膜新生血管を示している。病的網膜新生血管が認められた細胞核数を比較したところ、生後１７日目における通常飼育した(a)野生型マウスと(b)Ｌｎｋ欠損マウスは共に病的網膜毛細血管は出現しなかった。グラフに示されるように、(c)野生型網膜虚血モデルマウスにおいて病的血管新生が観察された細胞核数は６０程度であったのに対し、(d)Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスは１５程度であって、病的網膜新生血管は明らかに減少していた（P<0.01）。以上の結果より、Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスは病的網膜新生血管が減少していた。 FIG. 3 corresponds to a diagram in which tissue sections corresponding to 12 frames in FIG. 1 are arranged so that s is at the bottom of the screen and t is at the top of the screen, and white arrows indicate pathological retinal neovascularization. When the number of cell nuclei in which pathological retinal neovascularization was observed was compared, pathological retinal capillaries did not appear in both (a) wild-type mice and (b) Lnk-deficient mice normally reared on the 17th day after birth. As shown in the graph, (c) the number of cell nuclei in which pathological angiogenesis was observed in wild type retinal ischemia model mice was about 60, whereas (d) Lnk-deficient retinal ischemia model mice had 15 The pathological retinal neovascularization was clearly reduced (P <0.01). From the above results, pathological retinal neovascularization was reduced in Lnk-deficient retinal ischemia model mice.
実施例３（骨髄血未分化細胞群における血管内皮前駆細胞分画）
(a)通常飼育した野生型マウス、参考例１で得た(b)通常飼育したＬｎｋ欠損マウス、(c)参考例２で得た野生型網膜虚血モデルマウス、及び(d)参考例２で得たＬｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスの各骨髄組織から骨髄細胞を分離した後、biotin化 Cocktail抗体の６０倍希釈液(x60, 10 ul of cocktail Abs in 1x108, bio-B220, bio-CD3, bio-Gr-1, bio-Mac-1, bio-TER-119, BD)10ulを4℃、20分間反応させ、streptoavidin beads (x10, 15u/150ul of 2x106 cells, Miltenyi Biotec. )を用いて同条件下で反応を行い、次いで、MACS法(Miltenyi Biotec.)によって未分化細胞(lineage陰性細胞)を分離した。得られた未分化細胞分画について、更にc-kit (x200, PE-c-kit Abs, BD)と Sca-1(x200,FITC-Sca1,BD) の抗体を20分間反応させた後、 ＦＡＣＳ (BD)法によって、Linage陰性/c-Kit陽性/Sca-1陽性分画をＥＰＣ分画として比較した。図４は、未分化細胞におけるc-Kit/Sca-1をマーカーに用いたＦＡＣＳ解析図を示しており、それぞれ（ａ）通常飼育した野生型マウス、（ｂ）通常飼育したＬｎｋ欠損マウス、（ｃ）野生型網膜虚血モデルマウス、（ｄ）Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスの解析図を示す。
Example 3 (vascular endothelial progenitor cell fraction in bone marrow blood undifferentiated cells)
(a) a wild-type mouse normally bred, obtained in Reference Example 1 (b) a normally bred Lnk-deficient mouse, (c) a wild-type retinal ischemia model mouse obtained in Reference Example 2, and (d) Reference Example 2 The bone marrow cells were isolated from each bone marrow tissue of the Lnk-deficient retinal ischemia model mouse obtained in the above, and then a 60-fold dilution of biotinylated Cocktail antibody (x60, 10 ul of cocktail Abs in 1x10 8 , bio-B220, bio-CD3 , bio-Gr-1, bio-Mac-1, bio-TER-119, BD) 10ul was reacted at 4 ° C for 20 minutes, and using streptoavidin beads (x10, 15u / 150ul of 2x10 6 cells, Miltenyi Biotec.) Then, the reaction was performed under the same conditions, and then undifferentiated cells (lineage negative cells) were separated by MACS method (Miltenyi Biotec.). The obtained undifferentiated cell fraction was further reacted with an antibody of c-kit (x200, PE-c-kit Abs, BD) and Sca-1 (x200, FITC-Sca1, BD) for 20 minutes, and then FACS By the (BD) method, the Linage negative / c-Kit positive / Sca-1 positive fractions were compared as EPC fractions. FIG. 4 shows FACS analysis diagrams using c-Kit / Sca-1 as a marker in undifferentiated cells. (A) Wild-type mice reared normally, (b) Lnk-deficient mice normally reared, The analysis figure of c) wild type retinal ischemia model mouse and (d) Lnk deficient retinal ischemia model mouse is shown.
図４に示されるように、(a)通常飼育した野生型マウスと(b)通常飼育したＬｎｋ欠損マウスの各骨髄血中のＥＰＣ分画を比較したところ、(b)Ｌｎｋ欠損マウスにＥＰＣ分画の増加を認めた。また、(c)野生型網膜虚血モデルマウスと(d)Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスについては、(c)野生型網膜虚血モデルマウスと比較して、(d)Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスのＥＰＣ分画は顕著に増加していた。以上の結果より、Ｌｎｋノックアウトマウスでは血管内皮前駆細胞分画が増加していた。 As shown in FIG. 4, the EPC fractions in each bone marrow blood of (a) a normally bred wild-type mouse and (b) a normally bred Lnk-deficient mouse were compared. An increase in painting was observed. In addition, (c) wild-type retinal ischemia model mice and (d) Lnk-deficient retinal ischemia model mice are compared with (d) Lnk-deficient retinal ischemia model mice. The EPC fraction of mice was significantly increased. From the above results, vascular endothelial progenitor cell fraction was increased in Lnk knockout mice.
実施例４
参考例２で得た(c)野生型網膜虚血モデルマウス、及び(d)Ｌｎｋ欠損マウス網膜虚血モデルについて、それぞれ生後１２日目に、被検物質を生理的食塩水に溶解して調製した15mg/0.5mlの注射液を、眼球壁の外側（強膜上）後方に注射し、５日経過後、各マウスの眼球を摘出し、実施例１に記載の方法に従って網膜毛細血管の脱落面積を測定する。その結果、(c)野生型網膜虚血モデルマウスに比べ、(d)Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスの網膜毛細血管の脱落面積が明らかに減少する被検物質は、眼内血管新生性疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。
Example 4
The (c) wild type retinal ischemia model mouse and (d) Lnk-deficient mouse retinal ischemia model obtained in Reference Example 2 were prepared by dissolving the test substance in physiological saline on the 12th day after birth. 15 mg / 0.5 ml of the injection solution was injected into the outside of the eyeball wall (on the sclera), and after 5 days, the eyeballs of each mouse were removed and the retinal capillaries were removed according to the method described in Example 1. Measure. As a result, compared to (c) wild-type retinal ischemia model mice, (d) test substances in which the dropout area of retinal capillaries of Lnk-deficient retinal ischemia model mice was clearly reduced were intraocular angiogenic diseases. It is useful as a preventive and / or therapeutic agent.
実施例５
参考例２で得た(c)野生型網膜虚血モデルマウス、及び(d)Ｌｎｋ欠損マウス網膜虚血モデルについて、それぞれ生後１２日目に、被検物質を生理的食塩水に溶解して調製した15mg/0.5mlの注射液を硝子体内注射し、５日経過後、各マウスの眼球を摘出し、実施例２に記載の方法に従って病的網膜血管新生を評価する。その結果、(c)野生型網膜虚血モデルマウスに比べ、(d)Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスの病的網膜新生血管が明らかに減少する被検物質は、眼内血管新生性疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。
Example 5
The (c) wild type retinal ischemia model mouse and (d) Lnk-deficient mouse retinal ischemia model obtained in Reference Example 2 were prepared by dissolving the test substance in physiological saline on the 12th day after birth. The 15 mg / 0.5 ml injection solution was injected intravitreally, and after 5 days, the eyeballs of each mouse were removed, and pathological retinal neovascularization was evaluated according to the method described in Example 2. As a result, compared to (c) wild type retinal ischemia model mice, (d) a test substance in which pathological retinal neovascularization of Lnk-deficient retinal ischemia model mice is clearly reduced is prevention of intraocular neovascular diseases. And / or useful as a therapeutic agent.
実施例６
参考例２で得た(c)野生型網膜虚血モデルマウス、及び(d)Ｌｎｋ欠損マウス網膜虚血モデルについて、それぞれ生後１２日目に、被検物質を生理的食塩水に溶解して調製した15mg/0.5mlの注射液を硝子体内注射し、５日経過後、各マウスの眼球を摘出し、実施例３に記載の方法に従って病的網膜血管新生を評価する。その結果、(c)野生型網膜虚血モデルマウスに比べ、(d)Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスの病的網膜新生血管が明らかに減少する被検物質は、眼内血管新生性疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。
Example 6
The (c) wild type retinal ischemia model mouse and (d) Lnk-deficient mouse retinal ischemia model obtained in Reference Example 2 were prepared by dissolving the test substance in physiological saline on the 12th day after birth. The 15 mg / 0.5 ml injection solution was injected intravitreally, and after 5 days, the eyeball of each mouse was removed and pathological retinal neovascularization was evaluated according to the method described in Example 3. As a result, compared to (c) wild type retinal ischemia model mice, (d) a test substance in which pathological retinal neovascularization of Lnk-deficient retinal ischemia model mice is clearly reduced is prevention of intraocular neovascular diseases. And / or useful as a therapeutic agent.
実施例７
参考例２で得た(c)野生型網膜虚血モデルマウス、及び(d)Ｌｎｋ欠損マウス網膜虚血モデルについて、それぞれ生後１２日目に、被検物質を生理的食塩水に溶解して調製した15mg/0.5mlの注射液を硝子体内注射し、５日経過後、各マウスの骨髄組織から骨髄細胞を分離し、実施例４に記載の方法に従ってＥＰＣ分画の差を評価する。その結果、(c)野生型網膜虚血モデルマウスと比較して、(d)Ｌｎｋ欠損網膜虚血モデルマウスのＥＰＣ分画は顕著に増加している被検物質は、眼内血管新生性疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。
Example 7
The (c) wild type retinal ischemia model mouse and (d) Lnk-deficient mouse retinal ischemia model obtained in Reference Example 2 were prepared by dissolving the test substance in physiological saline on the 12th day after birth. The 15 mg / 0.5 ml injection solution was injected intravitreally, and after 5 days, bone marrow cells were separated from the bone marrow tissue of each mouse, and the difference in EPC fraction was evaluated according to the method described in Example 4. As a result, (c) the EPC fraction of the Lnk-deficient retinal ischemia model mouse was significantly increased compared to the wild-type retinal ischemia model mouse. It is useful as a preventive and / or therapeutic agent.
実施例８
ＬｎｋのｍＲＮＡの部分配列に相補的な二本鎖オリゴＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を合成し、生理的食塩水に溶解して調製した15mg/0.5mlの注射液を調製した。参考例２で得た(c)野生型網膜虚血モデルマウスの生後１２日目に、前記注射液又は生理的食塩水を眼球壁の外側（強膜上）後方に注射し、５日経過後、各マウスの眼球を摘出し、実施例１に記載の方法に従って網膜毛細血管の脱落面積を測定する。その結果、生理的食塩水が投与されたマウスに比べ、ｓｉＲＮＡを投与されたマウスの網膜毛細血管の脱落面積が明らかに減少することから、眼内病的血管新生阻害剤として、また眼内血管新生性疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。
Example 8
A 15 mg / 0.5 ml injection solution prepared by synthesizing a double-stranded oligo RNA (siRNA) complementary to a partial sequence of Lnk mRNA and dissolving it in physiological saline was prepared. On the 12th day after birth of the (c) wild type retinal ischemia model mouse obtained in Reference Example 2, the injection solution or physiological saline was injected to the back of the eyeball wall (on the sclera), and after 5 days, The eyeball of each mouse is removed and the area of the retinal capillary dropout is measured according to the method described in Example 1. As a result, the dropout area of the retinal capillaries of the mice administered with siRNA is clearly reduced as compared with mice administered with physiological saline. It is useful as a preventive and / or therapeutic agent for neoplastic diseases.
１ 強膜
２ 脈絡膜
３ 視神経
４ 視神経乳頭
５ 黄斑
６ 中心窩
７ 網膜
８ 虹彩
９ 角膜
１０ 硝子体
１１ 水晶体
１２ 実施例２に用いた評価用切片採取部位
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Sclera 2 Choroid 3 Optic nerve 4 Optic disc 5 Macula 6 Fovea 7 Retina 8 Iris 9 Cornea 10 Vitreous body 11 Lens 12 Evaluation part collection part used for Example 2
Claims (9)
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|---|---|---|---|
| JP2006040035A JP2007217347A (en) | 2006-02-16 | 2006-02-16 | Intraocular pathologic neovascularization inhibitor, medicine for preventing and/or treating intraocular neovascularization disease, and method for screening the same |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2007217347A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104107429A (en) * | 2014-08-01 | 2014-10-22 | 武汉大学 | Function and application of SH2B adapter protein 3(SH2B3) for treating cardiac hypertrophy |
| WO2021201170A1 (en) * | 2020-03-31 | 2021-10-07 | スカイファーマ株式会社 | Method for screening for, method for producing, and method for designing drug active ingredients |
| CN114917230A (en) * | 2022-03-09 | 2022-08-19 | 山东第一医科大学附属眼科研究所(山东省眼科研究所、山东第一医科大学附属青岛眼科医院) | Application of CB-839 in preparation of medicine for inhibiting cornea angiogenesis |
-
2006
- 2006-02-16 JP JP2006040035A patent/JP2007217347A/en not_active Withdrawn
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