JP2007215427A - Method for producing lactic acid - Google Patents
Method for producing lactic acid Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007215427A JP2007215427A JP2006037210A JP2006037210A JP2007215427A JP 2007215427 A JP2007215427 A JP 2007215427A JP 2006037210 A JP2006037210 A JP 2006037210A JP 2006037210 A JP2006037210 A JP 2006037210A JP 2007215427 A JP2007215427 A JP 2007215427A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lactic acid
- culture
- medium
- acid bacteria
- culturing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
Description
本発明は、乳酸の製造方法に関するものである。特に、本発明は、乳酸菌を用いて高い発酵効率で乳酸を製造する方法に関するものである。 The present invention relates to a method for producing lactic acid. In particular, the present invention relates to a method for producing lactic acid with high fermentation efficiency using lactic acid bacteria.
現在、乳酸は食品添加物として清酒、清涼飲料、漬物、醤油、製パンまたはビールなどの製造に使用され、また、工業用として皮革、繊維、プラスチック、医薬品または農薬などの製造に使用されている。また、最近では乳酸の誘導体または合成中間体である乳酸エチルまたは乳酸ブチルなどのエステル類は安全性の高い溶剤、洗浄剤としての用途が広がっている。さらに、乳酸のポリマーであるポリ乳酸は、生分解性ポリマーとしての用途が拡大するものとして期待されている。 Currently, lactic acid is used as a food additive in the production of sake, soft drinks, pickles, soy sauce, bread making or beer, and for industrial use in the production of leather, fibers, plastics, pharmaceuticals, agricultural chemicals, etc. . Recently, esters such as ethyl lactate or butyl lactate, which are derivatives or synthetic intermediates of lactic acid, are widely used as highly safe solvents and cleaning agents. Furthermore, polylactic acid, which is a polymer of lactic acid, is expected to expand its use as a biodegradable polymer.
今日得られる乳酸としては、石油化学製品から化学合成によって製造される乳酸と発酵により製造される乳酸とがある。このうち、石油化学製品から化学合成によって製造される乳酸は、一般に乳酸エステルの形で精製されるため高純度であるが、ラセミ体であり、光学活性を有しない。一方、発酵により製造される乳酸は、Ｌ体またはＤ体の光学活性体およびラセミ体が存在し、発酵に使用する微生物の種類により自由に必要とする光学活性体を調製できる。このように、光学活性を持つ乳酸は、特に医薬や農薬分野において強く求められているものの、現在のところ発酵法でしか生産することができないのが現状である。 Lactic acid obtained today includes lactic acid produced by chemical synthesis from petrochemical products and lactic acid produced by fermentation. Among these, lactic acid produced from petrochemical products by chemical synthesis is generally highly purified because it is purified in the form of lactic acid ester, but is racemic and has no optical activity. On the other hand, lactic acid produced by fermentation includes L-form or D-form optically active substance and racemic body, and an optically active substance that is freely required can be prepared depending on the type of microorganism used for fermentation. As described above, although lactic acid having optical activity is strongly demanded particularly in the fields of medicine and agricultural chemicals, it can be produced only by fermentation at present.
このため、現在、発酵により光学活性を持つ乳酸を製造する様々な方法が報告されている。一般的に、乳酸を発酵により生産する場合には、乳酸菌をカルシウム塩やナトリウム塩などのアルカリを用いて中和しながら培養して、乳酸塩の形態で培養液中に蓄積させる方法が使用されている。しかしながら、このような方法では、乳酸は、塩の形態で存在しているため、乳酸を酸の形態で得るためにはさらにアルカリを除去する工程を必要とするため、製造工程数が多くなり、これに伴うコストの上昇が避けられないという現状がある。また、上記方法において、塩基を添加せずに（即ち、ｐＨを調節せずに）培養を行なうことも考えられるが、ｐＨの低下に伴い、菌体の成長が著しく低下し、乳酸の収率が低くなり、当該方法もやはり実用的とはいいがたいという問題がある。 For this reason, various methods for producing lactic acid having optical activity by fermentation have been reported. Generally, when lactic acid is produced by fermentation, a method is used in which lactic acid bacteria are cultured while neutralizing with an alkali such as calcium salt or sodium salt, and accumulated in the culture solution in the form of lactate. ing. However, in such a method, since lactic acid exists in the form of a salt, in order to obtain lactic acid in the form of an acid, a step for removing alkali is further required, and therefore the number of production steps increases. The current situation is that an increase in costs associated with this is inevitable. In addition, in the above method, culturing without adding a base (that is, without adjusting the pH) is also conceivable, but as the pH is lowered, the growth of bacterial cells is significantly reduced, and the yield of lactic acid is increased. However, there is a problem that this method is also not practical.
または、遺伝子操作を用いて乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を大腸菌に導入し、この大腸菌を培養することによって、乳酸を高レベルで製造する方法が報告されている（例えば、特許文献１）。しかしながら、この方法においても、大腸菌は、乳酸の生成による培養液のｐＨの低下により、成長が阻害されるため、細胞の培養を、通常、４〜８、より好ましくは６〜７（請求項９，１０参照）といった比較的高いｐＨに保ちながら行なうが、このような方法では、上記したのと同様、乳酸が塩の形態で製造されるため、乳酸の形態に戻すためにはアルカリを除去する工程を必要とするため、コストの上昇が避けられないという問題が依然として残ってしまう。上記点に加えて、遺伝子組み換えなどを用いて菌を改良する方法は、一般的に手間や時間がかかるという問題もある。 Alternatively, a method for producing lactic acid at a high level by introducing a gene encoding lactate dehydrogenase into Escherichia coli using genetic manipulation and culturing the Escherichia coli has been reported (for example, Patent Document 1). However, even in this method, since the growth of E. coli is inhibited by lowering the pH of the culture solution due to the production of lactic acid, cell culture is usually performed in 4 to 8, more preferably 6 to 7 (claim 9). In this method, lactic acid is produced in the form of a salt, as described above, so that the alkali is removed in order to return to the lactic acid form. Since a process is required, the problem that an increase in cost cannot be avoided still remains. In addition to the above points, methods for improving bacteria using genetic recombination generally have a problem that it takes time and effort.
上記方法に加えて、乳酸の生産量を向上させるために乳酸菌の培養条件を最適化する方法もまた考えられる。しかしながら、乳酸の生産に一般的に使用される乳酸菌は栄養要求性が高いため、培養条件は大きく限定されてしまい、培養条件を自由に変更することは困難であるという問題がある。 In addition to the above method, a method of optimizing the culture conditions of lactic acid bacteria to improve the production amount of lactic acid is also conceivable. However, since lactic acid bacteria generally used for the production of lactic acid are highly auxotrophic, the culture conditions are greatly limited, and there is a problem that it is difficult to freely change the culture conditions.
上述したように、高純度の光学活性を有する乳酸を容易に製造する方法の開発が医薬、農薬分野において強く求められている現状を鑑みると、より高い発酵効率で乳酸菌を培養できる方法の確立が依然として要求されている。
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、高い収率で乳酸を製造できる方法を提供することを目的とする。 This invention is made | formed in view of the said situation, and aims at providing the method which can manufacture lactic acid with a high yield.
本発明の他の目的は、短時間でかつ高い収率で乳酸を製造できる方法を提供することである。 Another object of the present invention is to provide a method capable of producing lactic acid in a short time and with a high yield.
本発明者らは、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、乳酸菌を培養する際に、培養開始してからある一定の期間は培地のｐＨの調節を行なわずに乳酸菌をある程度成長させた後、培地のｐＨを中性付近になるように調節しながら培養をさらに続けることによって、従来より短期間でかつ高い発酵効率で乳酸を生産できることを知得し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive research to solve the above problems, the present inventors have found that when cultivating lactic acid bacteria, the lactic acid bacteria can be added to some extent without adjusting the pH of the medium for a certain period after the start of the culture. After growing, by further culturing while adjusting the pH of the medium to be near neutral, it is learned that lactic acid can be produced in a shorter period of time and with higher fermentation efficiency, and the present invention is completed. It came to.
すなわち、上記諸目的は、乳酸菌の培養による乳酸の製造方法において、前記乳酸菌の培養開始後、１２〜３６時間は、培地のｐＨの調節を行なわずに乳酸菌を培養する第一の培養段階；および該第一の培養段階後、培地のｐＨを４．５〜７．５に調節しながら培養する第二の培養段階を有する、乳酸の製造方法によって達成される。 That is, the above-mentioned objects are as follows. In the method for producing lactic acid by culturing lactic acid bacteria, a first culturing stage in which lactic acid bacteria are cultured without adjusting the pH of the medium for 12 to 36 hours after the start of culturing the lactic acid bacteria; After the first culturing step, this is achieved by a method for producing lactic acid, which has a second culturing step of culturing while adjusting the pH of the medium to 4.5 to 7.5.
本発明の方法によれば、簡単な方法で、乳酸を短期間で、効率よくかつ安価に生産できる。 According to the method of the present invention, lactic acid can be produced efficiently and inexpensively in a short period of time by a simple method.
以下、本発明の実施の形態を説明する。 Embodiments of the present invention will be described below.
本発明は、乳酸菌の培養による乳酸の製造方法において、前記乳酸菌の培養開始後、１２〜３６時間は、培地のｐＨの調節を行なわずに乳酸菌を培養する第一の培養段階；および該第一の培養段階後、培地のｐＨを４．５〜７．５に調節しながら培養する第二の培養段階を有する、乳酸の製造方法に関するものである。本発明の方法は、乳酸菌を培養して乳酸を生産するにあたって、（１）乳酸菌が乳酸を十分量生産するのに十分なくらい成長するまでの期間、即ち、１２〜３６時間は、特にｐＨの調節を行なわずに、乳酸菌を培養し（「第一の培養」）；（２）所定期間、上記（１）の第一の培養を行なった後は、培地のｐＨが４．５〜７．５になるように調節しながら、十分量の乳酸が得られるまで（好ましくは２４〜１２０時間）、乳酸菌を培養する（「第二の培養」）という、２段階で培養を行なうことを特徴とするものである。このような方法によると、乳酸を、塩の形態ではなく乳酸の形態で、従来に比して高生産量で得ることができる。 The present invention relates to a method for producing lactic acid by culturing lactic acid bacteria, wherein a first culturing step of culturing lactic acid bacteria without adjusting the pH of the medium for 12 to 36 hours after the start of cultivation of the lactic acid bacteria; It is related with the manufacturing method of lactic acid which has the 2nd culture | cultivation stage which culture | cultivates, adjusting the pH of a culture medium to 4.5-7.5 after the culture | cultivation stage. In the method of the present invention, in producing lactic acid by culturing lactic acid bacteria, (1) a period until the lactic acid bacteria grow sufficiently to produce a sufficient amount of lactic acid, that is, 12 to 36 hours is particularly pH. Lactic acid bacteria are cultured without adjustment ("first culture"); (2) After the first culture of (1) is performed for a predetermined period, the pH of the medium is 4.5-7. And culturing lactic acid bacteria in two stages until a sufficient amount of lactic acid is obtained (preferably 24 to 120 hours) ("second culture"). To do. According to such a method, it is possible to obtain lactic acid in a lactic acid form, not a salt form, in a higher production amount than in the past.
本発明では、乳酸菌の培養開始後、１２〜３６時間は、培地のｐＨの調節を行なわずに培養することが主な特徴の一である。一般的に、乳酸菌により乳酸を生産させる場合には、乳酸の生成により培地のｐＨが低下して酸性になり、また、乳酸そのものの存在が菌の生育を抑制あるいは阻害するため、乳酸の生産もまた低下あるいは停止してしまう。このため、培養期間中は培地のｐＨをアンモニアや水酸化ナトリウム等の塩基を用いて中性付近になるように調節しながら乳酸菌を培養するが、多くの乳酸菌はこれらのｐＨ調節剤に対して耐性を持たない。これに対して、本発明の方法によるように、培養初期の所定時間は培地のｐＨを調節しなくとも、この期間は乳酸の生産ではなくむしろ乳酸菌の増殖を促進し、ある程度乳酸菌が増殖して十分量の菌体量が得られ、その後、培地にアルカリを添加して乳酸の生産に適したｐＨ（ほぼ中性）になるように培地のｐＨを調節することによって今度は乳酸の生産を促し、所望のｐＨ範囲になるように培地のｐＨを調節しながら乳酸菌を培養することによって、第一の培養期間中に得られた十分量の乳酸菌体に乳酸を生産させることが判明したものである。したがって、本発明の方法によれば、従来に比して効率よく乳酸が生産できる。 In the present invention, one of the main features is that the culture is performed without adjusting the pH of the medium for 12 to 36 hours after the start of the cultivation of lactic acid bacteria. In general, when lactic acid is produced by lactic acid bacteria, the pH of the medium decreases due to the production of lactic acid and becomes acidic, and the presence of lactic acid itself suppresses or inhibits the growth of the bacteria, so that production of lactic acid is also difficult. It will also drop or stop. For this reason, during the culture period, lactic acid bacteria are cultured while adjusting the pH of the medium to be near neutral using a base such as ammonia or sodium hydroxide, but many lactic acid bacteria are resistant to these pH regulators. Not resistant. On the other hand, as in the method of the present invention, even if the pH of the medium is not adjusted for a predetermined time in the initial stage of the culture, this period promotes the growth of lactic acid bacteria rather than the production of lactic acid. Encourage the production of lactic acid by adjusting the pH of the medium so that a sufficient amount of cells is obtained, and then adding alkali to the medium to a pH suitable for lactic acid production (approximately neutral). It has been found that by culturing lactic acid bacteria while adjusting the pH of the medium so as to be in a desired pH range, lactic acid can be produced in a sufficient amount of lactic acid bacteria obtained during the first culture period. . Therefore, according to the method of the present invention, lactic acid can be produced more efficiently than in the past.
本発明において、使用される乳酸菌は、乳酸を生産できる微生物であれば特に制限されず、得られる乳酸の所望の形態（ＤあるいはＬ−体）によって適宜選択される。例えば、所望の形態がＤ−体である場合には、使用できる乳酸菌は、Ｄ−乳酸を生産できる微生物であれば特に制限されないが、例えば、ラクトバチラス属(Lactobacillus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ロイコノストック属(Leuconostoc)、及びスポロラクトバチラス属(Sporolactobacillus)に属する微生物などが好ましく使用できる。これらのうち、Ｄ−乳酸の生産能を考慮すると、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus bifidus、Lactobacillus bifidus Pennsylvanicus、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus casei、Lactobacillus caucasicus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus lactia、Lactobacillus leichmannii、Lactobacillus thermophilus、及びLactobacillus trichodes等の、ラクトバチラス属(Lactobacillus)に属する微生物がより好ましく、特にラクトバチラス・デブルキイー(Lactobacillus delbrueckii)、最も好ましくはラクトバチラス・デブルキイー ＩＦＯ３２０２株(Lactobacillus delbrueckii IFO3202)が使用できる。また、所望の形態がＬ−体である場合には、使用できる乳酸菌は、Ｌ−乳酸を生産できる微生物であれば特に制限されないが、例えば、ラクトバチラス属(Lactobacillus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ロイコノストック属(Leuconostoc)、及びスポロラクトバチラス属(Sporolactobacillus)に属する微生物などが好ましく使用できる。これらのうち、Ｌ−乳酸の生産能を考慮すると、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus casei等の、ラクトバチラス属(Lactobacillus)に属する微生物がより好ましく、特にラクトバチラス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、最も好ましくはラクトバチラス・ラムノサス ＩＦＯ３８６３(Lactobacillus rhamnosus IFO3863)が使用できる。 In the present invention, the lactic acid bacterium used is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of producing lactic acid, and is appropriately selected depending on the desired form (D or L-form) of the lactic acid obtained. For example, when the desired form is D-form, lactic acid bacteria that can be used are not particularly limited as long as they are microorganisms capable of producing D-lactic acid. For example, Lactobacillus, Lactococcus, Microorganisms belonging to the genus Leuconostoc and the genus Sporolactobacillus can be preferably used. Among these, taking into account the ability to produce D-lactic acid, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus bifidus Pennsylvanicus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delactor, Lactobacillus Microorganisms belonging to the genus Lactobacillus such as Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus thermophilus, and Lactobacillus trichodes, more preferably Lactobacillus delbrueckii, most preferably Lactobacillus debrukie IFO3202 strain bru320 . In addition, when the desired form is L-form, lactic acid bacteria that can be used are not particularly limited as long as they are microorganisms that can produce L-lactic acid. For example, Lactobacillus, Lactococcus, Microorganisms belonging to the genus Leuconostoc and the genus Sporolactobacillus can be preferably used. Among these, in consideration of the ability to produce L-lactic acid, microorganisms belonging to the genus Lactobacillus such as Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei are more preferable, particularly Lactobacillus rhamnosus, and most preferably Lactobacillus rhamnosus. -Rhamnosus IFO3863 (Lactobacillus rhamnosus IFO3863) can be used.
また、本発明で使用される乳酸菌は、上記したような野生株に加えて、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理などの、当該分野において既知の変異処理によって得られる変異株、細胞融合や遺伝子組換技術などの遺伝学的手法により誘導される組換株などを使用してもよい。なお、上記変異処理や遺伝学的手法は、当該分野において既知の方法と同様の方法が使用できる。また、上記遺伝子組換株の宿主としては、所望の遺伝子を形質転換してタンパク質を発現できるものであれば特に制限されず、親株と同じ属種であってもあるいは属種の異なるものを宿主として使用してもよいが、上述したような乳酸菌と同じ属種のものを宿主として使用することが好ましい。 The lactic acid bacteria used in the present invention are known mutations known in the art such as UV irradiation, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) treatment in addition to the wild strains as described above. Mutant strains obtained by treatment, recombinant strains induced by genetic techniques such as cell fusion and gene recombination techniques, and the like may be used. In addition, the said mutation process and a genetic method can use the method similar to the method known in the said field | area. In addition, the host of the above-mentioned genetically modified strain is not particularly limited as long as it can transform a desired gene and express a protein. However, it is preferable to use the same genus species as the lactic acid bacteria described above as the host.
本発明の乳酸菌の培養をするにあたって、寒天培地等の固体培地に斜面培養したものを直接培養用の培地に植菌して、本発明の方法による培養を行なってもよいが、乳酸菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを、本発明の方法にかかる培養（場合によっては、種培養と区別するために「本培養」とも記載する）に使用することが好ましい。このような方法によると、乳酸菌の成長をより向上できるからである。なお、本明細書において、「乳酸菌の培養開始時」とは、第一の培養を開始する時を意味し、より具体的には、固体培地に斜面培養したものを直接培養用の培地に植菌する時点、及び種培養液を本培養用の培地に接種する時点をいう。 When cultivating the lactic acid bacteria of the present invention, the slant culture on a solid medium such as an agar medium may be inoculated directly into the culture medium and cultured by the method of the present invention. It is preferable to use what has been cultured in a medium (seed culture) for culturing according to the method of the present invention (in some cases, also referred to as “main culture” in order to distinguish it from seed culture). This is because such a method can further improve the growth of lactic acid bacteria. In the present specification, “at the start of cultivation of lactic acid bacteria” means the time at which the first culture is started. More specifically, a slant culture on a solid medium is directly planted on the culture medium. It refers to the time when the fungus is inoculated and the time when the seed culture solution is inoculated into the medium for main culture.
なお、本発明の方法において、種培養に使用される培地の組成と、本培養に使用される培地の組成は、同一であってもあるいは異なるものであってもよく、使用される乳酸菌の種類に応じて適宜選択され、一般的に乳酸菌を接種／培養するために市販されている培地が使用できる。例えば、本発明において特に好ましく使用されるラクトバチラス・デブルキイー ＩＦＯ３２０２株(Lactobacillus delbrueckii IFO3202)やラクトバチラス・ラムノサス ＩＦＯ３８６３(Lactobacillus rhamnosus IFO3863)を用いる場合には、一般乳酸菌接種用培地「ニッスイ」などが種培養用の培地として好ましく使用され、その培地組成は下記実施例の表１に示される。なお、上記種培養に使用される培地は、乳酸菌の本培養に使用するのに十分な量の菌体量が得られれば上記に制限されるものではなく、他の乳酸菌を培養するに適することが知られている組成の培地、上記組成を変えたもの、上記組成における成分を変えたものなど、様々な組成が使用できる。 In the method of the present invention, the composition of the medium used for seed culture and the composition of the medium used for main culture may be the same or different, and the type of lactic acid bacteria used Depending on the medium, a commercially available medium can generally be used for inoculating / culturing lactic acid bacteria. For example, when Lactobacillus debrukey IFO3202 strain (Lactobacillus delbrueckii IFO3202) or Lactobacillus rhamnosus IFO3863 (Lactobacillus rhamnosus IFO3863), which is particularly preferably used in the present invention, is used, the medium for inoculation of general lactic acid bacteria “Nissui” and the like is used for seed culture. It is preferably used as a medium, and the composition of the medium is shown in Table 1 of Examples below. The medium used for the seed culture is not limited to the above as long as a sufficient amount of cells can be used for the main culture of lactic acid bacteria, and is suitable for culturing other lactic acid bacteria. Various compositions such as a medium having a known composition, a medium having the above-mentioned composition changed, and a medium having the above-mentioned composition changed can be used.
以下、本発明の方法による本培養に好ましく使用される培地について説明する。 Hereinafter, the medium preferably used for the main culture by the method of the present invention will be described.
本発明による乳酸菌の培養において使用できる炭素源としては、上記菌株が良好に生育し、乳酸を順調に産生できうるものであれば特に制限されず、公知の炭素源が使用できる。例えば、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、セルロース、デンプンまたはその組成画分、焙焼デキストリン、加工デンプン、デンプン誘導体、物理処理デンプン及びα−デンプン等の炭水化物；グリセリン、マンイトル、キシリトール、リビトール等のポリアルコールなどの発酵性糖質などが使用できる。または、具体例としては、上記発酵性糖質を含むデンプン糖化液、トウモロコシやコメの加水分解物、糖蜜、農業廃棄物の加水分解液、可溶性デンプン、アミロース、アミロペクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキストリン、プルラン、トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、甘藷デンプン及びデキストリン等の炭水化物を使用してもよい。これらの炭素源のうち、乳酸菌の産生及び乳酸の生産性の観点から、グルコース、フルクトース及びグリセロールが好ましく使用され、特にグルコースが好ましい。これらの炭素源は、単独あるいは２種以上の混合物の形態で使用できる。 The carbon source that can be used in the culture of the lactic acid bacteria according to the present invention is not particularly limited as long as the strain can grow well and can produce lactic acid smoothly, and a known carbon source can be used. For example, carbohydrates such as galactose, lactose, glucose, fructose, glycerol, sucrose, sucrose, cellulose, starch or fractions thereof, roasted dextrin, modified starch, starch derivatives, physically processed starch and α-starch; glycerin, manitol Fermentable carbohydrates such as polyalcohols such as xylitol and ribitol can be used. Or, as specific examples, starch saccharified solution containing the above fermentable sugar, corn or rice hydrolyzate, molasses, agricultural waste hydrolyzed solution, soluble starch, amylose, amylopectin, maltooligosaccharide, cyclodextrin, pullulan Carbohydrates such as corn starch, potato starch, sweet potato starch and dextrin may be used. Among these carbon sources, glucose, fructose, and glycerol are preferably used, and glucose is particularly preferable from the viewpoint of lactic acid bacteria production and lactic acid productivity. These carbon sources can be used alone or in the form of a mixture of two or more.
上記炭素源の培地における使用濃度は、特に制限されず従来と同様の濃度で使用できるが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高い濃度であることが好ましい。通常、炭素源の濃度は、培地中、好ましくは５〜３０（ｗ／ｖ）％、より好ましくは１０〜２０（ｗ／ｖ）％である。 The concentration of the carbon source used in the medium is not particularly limited and can be used at a concentration similar to the conventional one. However, it is preferably as high as possible within a range not inhibiting the production of organic acid. Usually, the concentration of the carbon source is preferably 5 to 30 (w / v)%, more preferably 10 to 20 (w / v)% in the medium.
また、本発明による乳酸菌の培養において使用できる窒素源としては、上記菌株が良好に生育し、乳酸を順調に産生できるものであれば特に制限されず、公知の窒素源が使用できる。例えば、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、大豆粉末、カゼイン、ミルクカゼイン、カゼイン分解物、カザミノ酸等の無機窒素化合物、麦芽根、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、各種アミノ酸及びコーンスティープリカー等の有機窒素化合物などが使用できる。なお、上記窒素源は、単独あるいは２種以上の混合物の形態で使用できる。これらのうち、麦芽根を、上記他の窒素源と組合わせて使用することが好ましく、より好ましくは、麦芽根を、酵母エキス、ペプトン、ポリペプトン、麦芽エキス、コーンスティープリカー、乾燥酵母、大豆加水分解物、及び肉エキスからなる群より選択される少なくとも１種の他の窒素源を組合わせて使用し、最も好ましくは、麦芽根を、酵母エキス、ペプトン、乾燥酵母、及び大豆加水分解物からなる群より選択される少なくとも１種の他の窒素源を組合わせて使用する。麦芽根は、栄養要求性の高い乳酸菌が資化できる有用な窒素源であり、以下に詳述するように大麦を製麦して麦芽を製造する際に副生物であり、非常に安価であるという利点がある。このため、窒素源の一部を麦芽根で置換することによって、乳酸菌による窒素源の利用効率は維持したまま、従来、窒素源としてしばしば使用されていた高価な酵母エキスやペプトンの使用量を減らすことができ、ゆえに、製造される乳酸のコストを有意に軽減することができる。また、麦芽根を上記したように他の窒素源と組合わせて使用すると、麦芽根単独で使用する場合に比して、乳酸菌の成長が促進して、乳酸の生産量が向上できることも判明した。さらに、麦芽根は、上記他の窒素源とは異なり、水に不溶性であるため、乳酸を回収する際に、培養終了後、培地を濾過などすることによって菌体などと共に容易に除去でき、所望の乳酸の精製が簡便であるという利点もある。 Further, the nitrogen source that can be used in the culture of lactic acid bacteria according to the present invention is not particularly limited as long as the above-mentioned strain grows well and can produce lactic acid smoothly, and a known nitrogen source can be used. For example, ammonium salts such as ammonia, ammonium nitrate, ammonium sulfate and ammonium chloride, nitrates such as sodium nitrate, urea, soybean hydrolysate, soybean powder, casein, milk casein, casein decomposed product, inorganic nitrogen compounds such as casamino acid, malt root Organic nitrogen compounds such as meat extract, peptone, polypeptone, yeast extract, various amino acids and corn steep liquor can be used. The nitrogen source can be used alone or in the form of a mixture of two or more. Of these, malt root is preferably used in combination with the above other nitrogen sources, and more preferably, malt root is used as yeast extract, peptone, polypeptone, malt extract, corn steep liquor, dry yeast, soy hydrolysate. A combination of at least one other nitrogen source selected from the group consisting of a degradation product and a meat extract, most preferably malt root from yeast extract, peptone, dry yeast, and soy hydrolyzate A combination of at least one other nitrogen source selected from the group is used. Malt root is a useful nitrogen source that can be assimilated by highly auxotrophic lactic acid bacteria, and is a by-product when producing malt from malting barley as detailed below, and is very inexpensive. There is an advantage. For this reason, by substituting a part of the nitrogen source with malt root, the amount of expensive yeast extract and peptone, which has been often used as a nitrogen source in the past, is reduced while maintaining the use efficiency of the nitrogen source by lactic acid bacteria. Therefore, the cost of the lactic acid produced can be significantly reduced. It was also found that when malt root is used in combination with other nitrogen sources as described above, the growth of lactic acid bacteria is promoted and the amount of lactic acid produced can be improved compared to the case where malt root is used alone. . Furthermore, unlike other nitrogen sources, malt root is insoluble in water. Therefore, when lactic acid is recovered, it can be easily removed together with the cells by filtering the medium after completion of the culture. There is also an advantage that the purification of lactic acid is simple.
本発明において、「麦芽根」は、麦芽が発芽した直後の幼根である。麦芽根の製造方法は、公知であり、本発明においても同様の方法が適用でき、原料である、大麦の製麦副生物である穀皮、穂軸等を含む麦芽根は、大麦を製麦して麦芽を製造する際に副生物として生ずるものであれば何れも使用することができる。この副生物は製麦時に生じた麦芽根の他、大麦の外皮である穀皮、大麦の穂軸、護頴、芒等の不要物を含んでいてもよい。この際、麦芽根は、上記したようなそのままの形態で使用されても、麦芽根を粉砕して使用しても、麦芽根を乾燥した後、粉砕して使用しても、熱水などによって麦芽根から所望の窒素成分を抽出した液体の形態で使用しても、いずれの形態でもよいが、麦芽根を粉砕する、または麦芽根を乾燥した後、粉砕することによって、粉末の形態で使用することが好ましい。このような形態であれば、乳酸菌による窒素源の利用効率を上げることができるからである。 In the present invention, “malt root” is a juvenile root immediately after germination of malt. The manufacturing method of malt root is well-known, and the same method can be applied also in the present invention, and the malt root containing bark, cob, etc., which is a raw material by-product of barley, which is a raw material, As long as they are produced as by-products when producing malt, any of them can be used. This by-product may contain undesired products such as husks of barley, barley cobs, gills, and straws, in addition to malt roots produced during malting. At this time, the malt root may be used in the form as described above, or may be used by pulverizing the malt root, or after drying the malt root and using it after pulverization, by hot water or the like. It can be used in the form of a liquid obtained by extracting a desired nitrogen component from malt root, or any form can be used. It is preferable to do. This is because the use efficiency of the nitrogen source by lactic acid bacteria can be increased in such a form.
上記窒素源の培地における使用濃度は、特に制限されず従来と同様の濃度で使用できるが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高い濃度であることが好ましい。通常、窒素源の濃度は、培地中、好ましくは０．０１〜５（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．１〜３（ｗ／ｖ）％である。また、麦芽根を他の窒素源と組合わせて使用する場合の、麦芽根と他の窒素源との混合比は、特に制限されないが、麦芽根と他の窒素源との混合質量比が、１〜５：０．１〜１、より好ましくは１〜３：０．５〜１となるように、麦芽根と他の窒素源とを混合することが好ましい。 The concentration of the nitrogen source used in the medium is not particularly limited, and can be used at the same concentration as before. However, it is preferably as high as possible within a range not inhibiting the production of organic acid. Usually, the concentration of the nitrogen source is preferably 0.01 to 5 (w / v)%, more preferably 0.1 to 3 (w / v)% in the medium. In addition, when the malt root is used in combination with another nitrogen source, the mixing ratio of the malt root and the other nitrogen source is not particularly limited, but the mixing mass ratio of the malt root and the other nitrogen source is It is preferable to mix a malt root and another nitrogen source so that it may become 1-5: 0.1-1 and more preferably 1-3: 0.5-1.
本発明による培養に使用できる無機塩としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩及び酢酸塩等から選ばれた１種または２種以上を使用することができる。この際、無機塩の培地における使用濃度は、特に制限されず従来と同様の濃度で使用できるが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高い濃度であることが好ましい。通常、無機源の濃度は、培地中、好ましくは０〜０．５（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０〜０．２（ｗ／ｖ）％である。 Examples of the inorganic salt that can be used for the culture according to the present invention include one or two selected from phosphates such as magnesium, manganese, calcium, sodium, potassium, copper, iron and zinc, hydrochloride, sulfate and acetate. More than seeds can be used. In this case, the use concentration of the inorganic salt in the medium is not particularly limited and can be used at the same concentration as before, but it is preferably as high as possible within a range not inhibiting the production of the organic acid. Usually, the concentration of the inorganic source is preferably 0 to 0.5 (w / v)%, more preferably 0 to 0.2 (w / v)% in the medium.
乳酸菌の生育を促進する目的で、上記培地に、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育促進因子をさらに添加してもよい。なお、上記生育促進因子は、上記に限定されるものではなく、当該分野において使用される他の生育促進因子もまた同様に使用でき、また、添加する場合の生育促進因子の培地への添加量もまた、特に制限されるものではなく、当該分野において通常使用される量と同様の量が使用できるが、好ましくは、生育促進因子の培地中の濃度が、０．１（ｗ／ｖ）％以下、より好ましくは０．０００１〜０．０１（ｗ／ｖ）％となるような量である。なお、上記生育促進因子は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。 For the purpose of promoting the growth of lactic acid bacteria, growth promoting factors such as vitamins such as biotin, pantothenic acid, inositol and nicotinic acid, nucleotides and amino acids may be further added to the medium. The growth promoting factor is not limited to the above, and other growth promoting factors used in the field can be used in the same manner, and the amount of growth promoting factor added to the medium when added. Also, the amount is not particularly limited, and an amount similar to the amount usually used in the art can be used, but preferably the concentration of the growth promoting factor in the medium is 0.1 (w / v)%. Hereinafter, the amount is more preferably 0.0001 to 0.01 (w / v)%. In addition, the said growth promotion factor may be used independently or may be used with the form of 2 or more types of mixtures.
また、培養時の発泡を抑えるために、消泡剤を培地に添加してもよい。この際、消泡剤は、公知の消泡剤が同様にして使用でき、市販の消泡剤を使用してもよい。また、消泡剤を使用する場合の培地への添加量もまた、特に制限されず、当該分野において使用される通常の量が同様にして使用でき、適宜選択される。なお、上記消泡剤は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。 Further, an antifoaming agent may be added to the medium in order to suppress foaming during culture. At this time, as the antifoaming agent, a known antifoaming agent can be used in the same manner, and a commercially available antifoaming agent may be used. Moreover, the addition amount to the culture medium in the case of using an antifoaming agent is also not particularly limited, and usual amounts used in this field can be used in the same manner and are appropriately selected. In addition, the said antifoamer may be used independently or may be used with the form of 2 or more types of mixtures.
上記したようにして調製された培地のｐＨ（第一の培養開始前）は、特に制限されず使用する乳酸菌の種類などによって適宜選択できる。一般的に、上述したように、第一の培養期間中は、培地のｐＨの調節を行なわずに乳酸菌を培養するため、菌体の増殖に従って培地のｐＨが下がる傾向にある。この点を考慮すると、本発明では、培養前の培地のｐＨを、６〜８、より好ましくは６．５〜７．５に調節することが好ましい。 The pH of the medium prepared as described above (before the start of the first culture) is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the type of lactic acid bacteria to be used. In general, as described above, during the first culture period, lactic acid bacteria are cultured without adjusting the pH of the medium. Therefore, the pH of the medium tends to decrease as the cells grow. Considering this point, in the present invention, it is preferable to adjust the pH of the medium before the culture to 6 to 8, more preferably 6.5 to 7.5.
また、本発明の方法による第一の培養において、培地のｐＨの調節を行なわない時間は、乳酸菌の培養開始時から１２〜３６時間である。このような範囲であれば、乳酸菌の生育が十分達成でき、ゆえに、このように十分な菌体量が存在する状態で第二の培養を行なうと、培地中に乳酸が効率よくかつ短期間で生産できる。なお、上記「乳酸菌の生育が十分達成でき」とは、次の第二の培養段階で乳酸を生産するのに十分な量の乳酸菌が得られる」ことを意味し、より具体的には、６６０ｎｍでの濁度（ＯＤ６６０）が、好ましくは３．０以上、より好ましくは７．０以上となるまで、乳酸菌を生育させる。この際、培地のｐＨの調節を行なわない時間が乳酸菌を培養開始してから１２時間より短い場合には、乳酸菌の生育が十分でなく、第二の培養期間中に生産される乳酸量が十分でない可能性がある。逆に、３６時間を超えても、乳酸菌の生育は定常状態となり、培地のｐＨが下がりすぎて、乳酸菌の生育に悪影響を及ぼす可能性がある。好ましくは、培地のｐＨの調節を行なわない時間は、乳酸菌の培養開始時から、１２〜３６時間であり、より好ましくは１５〜３０時間、最も好ましくは１８〜２４時間である。 In the first culture according to the method of the present invention, the time during which the pH of the medium is not adjusted is 12 to 36 hours from the start of the culture of lactic acid bacteria. Within such a range, the growth of lactic acid bacteria can be sufficiently achieved. Therefore, when the second culture is carried out in such a state where a sufficient amount of cells exist, lactic acid is efficiently contained in the medium in a short period of time. Can be produced. The phrase “sufficient growth of lactic acid bacteria” means that a sufficient amount of lactic acid bacteria to produce lactic acid is obtained in the next second culture stage, and more specifically, 660 nm. Lactic acid bacteria are grown until the turbidity (OD 660 ) is preferably 3.0 or more, more preferably 7.0 or more. At this time, if the time during which the pH of the medium is not adjusted is shorter than 12 hours after the start of cultivation of lactic acid bacteria, the growth of lactic acid bacteria is not sufficient and the amount of lactic acid produced during the second culture period is sufficient. It may not be. On the other hand, even if it exceeds 36 hours, the growth of lactic acid bacteria becomes a steady state, and the pH of the medium is too low, which may adversely affect the growth of lactic acid bacteria. Preferably, the time during which the pH of the medium is not adjusted is 12 to 36 hours, more preferably 15 to 30 hours, and most preferably 18 to 24 hours from the start of cultivation of lactic acid bacteria.
また、本発明の方法による第二の培養では、上記第一の培養でｐＨの下がった培地のｐＨを４．５〜７．５という特定の範囲に調節しながら、乳酸菌を培養する。この際、培地のｐＨを上記範囲に調節するのは、第一の培養期間中は培地のｐＨの低下に伴い、乳酸の生産は抑えられていたが、第二の培養では培地のｐＨを上記範囲にまで上げることによって、乳酸の生産に適した環境を作ることができるからである。このため、本発明の方法によると、第一の培養でまず乳酸菌を十分量増殖させた後、第二の培養において乳酸の生産に最適な条件に乳酸菌をおくことによって、この十分量の乳酸菌による乳酸の生産が可能になったものである。この際、培地のｐＨを４未満になるように調節しつつ培養を行なうと、培地のｐＨが低すぎて、乳酸の生産が抑制・阻害されてしまい、その結果、乳酸の収量が十分高レベルに達成できず、逆に、培地のｐＨを８を超えて調節しつつ培養を行なうと、乳酸の生産には適するが、得られる乳酸が塩の形態となり、乳酸の形態に戻す操作がさらに必要になり、また場合によっては、乳酸菌の生育に悪影響を及ぼす可能性がある。また、本発明による第二の培養期間中の上記乳酸菌を培養する時間は、上述したように、第一の培養で得られた十分量の乳酸菌を用いて十分量の乳酸が生産できる時間であれば特に制限されないが、好ましくは２４〜１２０時間である。このように第二の培養における乳酸菌の培養を上記ｐＨの培地中で上記好ましい時間範囲内で行なう場合には、十分量の乳酸の生産が達成できる。乳酸菌の培養時間が２４時間未満であると、乳酸菌による乳酸の生産が十分でないうちに培養が終了してしまうため十分量の乳酸が得られないおそれがある。逆に、１２０時間を超えても、乳酸の生産は定常状態となって時間の延長に見合う乳酸の生産が達成されず、むしろ乳酸の多量の生産に伴い、乳酸菌の生育が逆に抑制／阻害されるという問題がある。本発明では、第二の培養期間中の培地のｐＨは、４．５〜７．５、より好ましくは５．５〜６．５に調節しておくことが好ましい。また、第二の培養における乳酸菌の培養時間は、培養温度及びｐＨや菌体濃度等の培養条件および培養方法によって異なるが、より好ましくは３６〜９６時間、最も好ましくは４８〜７２時間である。 In the second culture according to the method of the present invention, lactic acid bacteria are cultured while adjusting the pH of the medium whose pH has been lowered in the first culture to a specific range of 4.5 to 7.5. At this time, the pH of the medium was adjusted to the above range because the production of lactic acid was suppressed during the first culture period due to the decrease in the pH of the medium. This is because an environment suitable for the production of lactic acid can be created by raising the range. Therefore, according to the method of the present invention, after a sufficient amount of lactic acid bacteria are first grown in the first culture, the lactic acid bacteria are placed under optimal conditions for the production of lactic acid in the second culture. Production of lactic acid is now possible. In this case, if the culture is carried out while adjusting the pH of the medium to be less than 4, the pH of the medium is too low and the production of lactic acid is suppressed / inhibited, resulting in a sufficiently high yield of lactic acid. In contrast, if the culture is carried out while adjusting the pH of the medium to more than 8, it is suitable for the production of lactic acid, but the resulting lactic acid is in the form of a salt, which requires further operation to return to the lactic acid form. In some cases, it may adversely affect the growth of lactic acid bacteria. Further, as described above, the time for culturing the lactic acid bacteria during the second culture period according to the present invention may be a time during which a sufficient amount of lactic acid can be produced using the sufficient amount of lactic acid bacteria obtained in the first culture. Although not particularly limited, it is preferably 24 to 120 hours. Thus, when the culture of lactic acid bacteria in the second culture is carried out in the above-mentioned preferable time range in a medium having the above pH, a sufficient amount of lactic acid can be produced. If the culture time of the lactic acid bacteria is less than 24 hours, the culture is completed before the production of lactic acid by the lactic acid bacteria is not sufficient, so that a sufficient amount of lactic acid may not be obtained. On the other hand, even if it exceeds 120 hours, the production of lactic acid is in a steady state and the production of lactic acid commensurate with the extension of time is not achieved, but rather the growth of lactic acid bacteria is suppressed / inhibited with the production of a large amount of lactic acid. There is a problem of being. In the present invention, the pH of the medium during the second culture period is preferably adjusted to 4.5 to 7.5, more preferably 5.5 to 6.5. The culture time of lactic acid bacteria in the second culture varies depending on the culture conditions such as the culture temperature, pH, and cell concentration, and the culture method, but is more preferably 36 to 96 hours, and most preferably 48 to 72 hours.
上記第二の培養期間において、培地のｐＨを上記範囲に調節するために使用されるｐＨ調節剤は、培地のｐＨを適宜上昇させかつ菌体の成長を阻害しないものであれば特に制限されないが、例えば、アンモニア水、アンモニアガス、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ金属の水酸化物、炭酸ナトリウムや炭酸カリウム等のアルカリ金属の炭酸塩、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸バリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム等のアルカリ土類金属の炭酸塩、炭酸水素バリウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸水素カルシウム等のアルカリ土類金属の炭酸水素塩、尿素などが使用される。これらのうち、アンモニア水、及びアンモニアガスが好ましく使用され、特にアンモニア水及びアンモニアガスが好ましく使用される。なお、上記ｐＨ調節剤は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。また、ｐＨ調節剤の培地への添加量は、培地のｐＨが上記範囲になるように適宜決定される。 In the second culture period, the pH adjuster used for adjusting the pH of the medium to the above range is not particularly limited as long as it appropriately raises the pH of the medium and does not inhibit the growth of bacterial cells. For example, ammonia water, ammonia gas, alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, alkali metal carbonates such as sodium carbonate and potassium carbonate, barium hydroxide, magnesium hydroxide, calcium hydroxide, etc. Alkaline earth metal hydroxides, alkaline earth metal carbonates such as barium carbonate, magnesium carbonate, calcium carbonate, alkaline earth metal hydrogen carbonates such as barium bicarbonate, magnesium bicarbonate, calcium bicarbonate, Urea or the like is used. Of these, ammonia water and ammonia gas are preferably used, and ammonia water and ammonia gas are particularly preferably used. In addition, the said pH adjuster may be used independently or may be used with the form of 2 or more types of mixtures. Further, the amount of the pH regulator added to the medium is appropriately determined so that the pH of the medium falls within the above range.
本発明において、乳酸菌の培養は、嫌気的条件下で行われ、その際の培養条件は、培地の組成や培養法によって適宜選択され、本菌株が増殖し、所望の乳酸が効率よく産生できる条件であれば特に制限されない。具体的には、培養温度は、乳酸菌が速やかに生育できる条件であれば特に制限されないが、通常は、２０〜４０℃、より好ましくは３０〜４０℃、特に好ましくは３７℃の温度で培養される。なお、本発明において、培養温度は、第一の培養期間及び第二の培養期間は実質的に同一の温度に維持されても、あるいは菌体増殖期である第一の培養期間及び乳酸産生時期である第二の培養期間とで温度を変えてもよい。後者の場合には、例えば、第一の培養中の培養温度は、２５〜４０℃であり、第二の培養中の培養温度は、３０〜４５℃であることが好ましい。 In the present invention, lactic acid bacteria are cultured under anaerobic conditions, and the culture conditions at that time are appropriately selected according to the composition of the medium and the culture method, and the strains can grow and produce the desired lactic acid efficiently. If it is, it will not be restrict | limited in particular. Specifically, the culture temperature is not particularly limited as long as lactic acid bacteria can grow rapidly. Usually, the culture temperature is 20 to 40 ° C, more preferably 30 to 40 ° C, and particularly preferably 37 ° C. The In the present invention, the culture temperature is maintained at substantially the same temperature during the first culture period and the second culture period, or the first culture period and the lactic acid production period, which are the cell growth period. The temperature may be changed depending on the second culture period. In the latter case, for example, the culture temperature during the first culture is preferably 25 to 40 ° C., and the culture temperature during the second culture is preferably 30 to 45 ° C.
上記したように、第一及び第二の培養を経た後、乳酸菌によって生成した乳酸は、培養液中に蓄積されるので、培養液から乳酸を分離・精製することによって、所望の乳酸が回収できる。この際、乳酸の培地からの回収方法は、特に制限されず、公知の方法が単独であるいは適宜組合わせて同様にして適用できる。具体的には、培地を、遠心分離や濾過等によって不溶な物質（菌体、添加される場合には麦芽根などを含む）を除去した後、イオン交換樹脂などで脱塩し、その溶液から、結晶化やカラムクロマトグラフィー等の常法に従って所望の乳酸を分離・精製することができる。 As described above, since the lactic acid produced by the lactic acid bacteria after the first and second cultures is accumulated in the culture solution, the desired lactic acid can be recovered by separating and purifying the lactic acid from the culture solution. . In this case, the method for recovering lactic acid from the medium is not particularly limited, and known methods can be applied in the same manner, alone or in appropriate combination. Specifically, after removing insoluble substances (including microbial cells and malt root when added) by centrifugation, filtration, etc., the medium is desalted with an ion exchange resin or the like, and then removed from the solution. The desired lactic acid can be separated and purified according to a conventional method such as crystallization or column chromatography.
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。 The effects of the present invention will be described using the following examples and comparative examples. However, the technical scope of the present invention is not limited only to the following examples.
実施例１
オートクレーブにより滅菌した一般乳酸菌接種用培地「ニッスイ」（培地組成は、下記表１参照）１００ｍｌに、Lactobacillus delbrueckii(IFO3202)を一白金耳植菌する。これを３７℃、２４時間静置培養を行ない、種培養液を調製した。
Example 1
One platinum ear of Lactobacillus delbrueckii (IFO3202) is inoculated into 100 ml of a medium for inoculation of general lactic acid bacteria "Nissui" (see Table 1 below for the medium composition) sterilized by autoclaving. This was subjected to stationary culture at 37 ° C. for 24 hours to prepare a seed culture solution.
次に、下記表２に示す発酵培地Ａ ２Ｌ（培地のｐＨ：７）を５Ｌ容の通気攪拌型バイオアリアクターに入れてオートクレーブ滅菌した後、これに上記種培養液を１００ｍＬ接種し、３７℃にて窒素ガスを通気しながら攪拌培養を行なった。この際、培養開始後、２４時間目までは特にｐＨの制御は行わずに培養を行ない（第一の培養）、２４時間後からアンモニア水を添加することにより、ｐＨを６で制御して培養を行なった（第二の培養）。その結果、培養開始から１４４時間後に培地中には、８７．５ｇ／ＬのＤ−乳酸が蓄積していた。 Next, 2 L of fermentation medium A shown in Table 2 (medium pH: 7) was placed in a 5 L aeration and stirring bioreactor and sterilized by autoclave. Culturing was performed while aeration of nitrogen gas. At this time, after the start of culture, the culture is performed without controlling the pH until the 24th hour (first culture), and after 24 hours, the aqueous solution is added with aqueous ammonia to control the pH at 6. (Second culture). As a result, 87.5 g / L of D-lactic acid was accumulated in the medium after 144 hours from the start of the culture.
また、上記実験中の、培養時間に対する、グルコースの消費量、Ｄ−乳酸の生産量、及び菌の発育を示す６６０ｎｍでの濁度（図中、ＯＤ（６６０ｎｍ））の経時的な変化を、図１に示す。 In addition, the change in the turbidity at 660 nm (OD in the figure (OD (660 nm)) indicating the consumption of glucose, the production amount of D-lactic acid, and the growth of the fungus with respect to the culture time during the above experiment over time, As shown in FIG.
なお、本実施例において、Ｄ−乳酸の生成量は、下記条件によるＨＰＬＣによる分析によって測定した。 In this example, the amount of D-lactic acid produced was measured by HPLC analysis under the following conditions.
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：東ソー製 ＴＳＫｇｅｌ ＯＡＰａｋ−Ａ
（内径：７．８ｍｍ、カラム長：３０．０ｃｍ）
溶媒： ０．７５ｍＭ 硫酸水溶液
流速： １ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＲＩ（屈折率測定）
カラム温度：４０℃
また、本実施例において、生産した乳酸の形態（Ｄ体またはＬ体）は、下記条件に従って光学純度を測定することによって、確認した。
<HPLC analysis conditions>
Column: Tosoh TSKgel OAPak-A
(Inner diameter: 7.8 mm, column length: 30.0 cm)
Solvent: 0.75 mM sulfuric acid aqueous solution Flow rate: 1 ml / min
Detector: RI (refractive index measurement)
Column temperature: 40 ° C
In this example, the form of lactic acid produced (D-form or L-form) was confirmed by measuring optical purity according to the following conditions.
＜光学純度測定条件＞
カラム：住化分析センター製 Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ ＯＡ−５０００
（内径：４．６ｍｍ、カラム長：１５．０ｃｍ）
溶媒： １ｍＭ 硫酸銅水溶液
流速： １ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ（紫外線吸収、波長：２５４ｎｍ）
カラム温度：４０℃
<Optical purity measurement conditions>
Column: Sumikar OA-5000 manufactured by Sumika Chemical Analysis Center
(Inner diameter: 4.6 mm, column length: 15.0 cm)
Solvent: 1 mM aqueous copper sulfate flow rate: 1 ml / min
Detector: UV (UV absorption, wavelength: 254 nm)
Column temperature: 40 ° C
実施例２
実施例１において、発酵培地Ａの代わりに、表３の組成の発酵培地Ｂ（培地のｐＨ：７）を使用した以外は、実施例１同様の方法で乳酸菌の培養を行ない、Ｄ−乳酸を生産させた。その結果、培養開始から９６時間後に培地中には、１０６．９ｇ／ＬのＤ−乳酸が蓄積していた。
Example 2
In Example 1, instead of fermentation medium A, lactic acid bacteria were cultured in the same manner as in Example 1 except that fermentation medium B (medium pH: 7) having the composition shown in Table 3 was used. Produced. As a result, 106.9 g / L of D-lactic acid was accumulated in the medium 96 hours after the start of the culture.
また、上記実験中の、培養時間に対する、グルコースの消費量、Ｄ−乳酸の生産量、及び菌の発育を示す６６０ｎｍでの濁度（図中、ＯＤ（６６０ｎｍ））の経時的な変化を、図２に示す。 In addition, the change in the turbidity at 660 nm (OD in the figure (OD (660 nm)) indicating the consumption of glucose, the production amount of D-lactic acid, and the growth of the fungus with respect to the culture time during the above experiment over time, As shown in FIG.
比較例１
実施例１において、培養開始時に培地のｐＨを６に調整し、その後はｐＨの制御を全く行わずに乳酸菌の培養を行なった以外は、実施例１に記載の方法と同様の方法で培養を行ない、Ｄ−乳酸を生産させた。その結果、１４４時間後における培地中のＤ−乳酸蓄積量は、２１ｇ／Ｌであった。
Comparative Example 1
In Example 1, except that the pH of the medium was adjusted to 6 at the start of the culture, and thereafter the lactic acid bacteria were cultured without any pH control, the culture was performed in the same manner as described in Example 1. D-lactic acid was produced. As a result, the amount of D-lactic acid accumulated in the medium after 144 hours was 21 g / L.
また、上記実験中の、培養時間に対する、グルコースの消費量、Ｄ−乳酸の生産量、及び菌の発育を示す６６０ｎｍでの濁度（図中、ＯＤ（６６０ｎｍ））の経時的な変化を、図３に示す。 In addition, the change in the turbidity at 660 nm (OD in the figure (OD (660 nm)) indicating the consumption of glucose, the production amount of D-lactic acid, and the growth of the fungus with respect to the culture time during the above experiment over time, As shown in FIG.
比較例２
実施例１において、培養開始直後からアンモニアを添加することにより培地のｐＨを６に制御しながら乳酸菌の培養を行なった以外は、実施例１に記載の方法と同様の方法で培養を行ない、Ｄ−乳酸を生産させた。その結果、１４４時間後における培地中のＤ−乳酸蓄積量は、５３．４ｇ／Ｌであった。
Comparative Example 2
In Example 1, except that the lactic acid bacteria were cultured while controlling the pH of the medium to 6 by adding ammonia immediately after the start of the culture, the culture was performed in the same manner as described in Example 1, and D -Lactic acid was produced. As a result, the amount of D-lactic acid accumulated in the medium after 144 hours was 53.4 g / L.
また、上記実験中の、培養時間に対する、グルコースの消費量、Ｄ−乳酸の生産量、及び菌の発育を示す６６０ｎｍでの濁度（図中、ＯＤ（６６０ｎｍ））の経時的な変化を、図４に示す。 In addition, the change in the turbidity at 660 nm (OD in the figure (OD (660 nm)) indicating the consumption of glucose, the production amount of D-lactic acid, and the growth of the fungus with respect to the culture time during the above experiment over time, As shown in FIG.
上記実施例１，２及び比較例１，２の結果を比較すると、本発明の方法によると、Ｄ−乳酸が有意により高い収率で得られることが分かった。また、実施例１及び２の結果を比較することによって、培地の窒素源の一部に麦芽根を使用することによって、同じ窒素源量で、より短時間でかつより効率よくＤ−乳酸が生産できることが示される。 When the results of Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 2 were compared, it was found that D-lactic acid was obtained in a significantly higher yield according to the method of the present invention. In addition, by comparing the results of Examples 1 and 2, by using malt root as a part of the nitrogen source of the medium, D-lactic acid can be produced in a shorter time and more efficiently with the same nitrogen source amount. It is shown that it can.
実施例３
オートクレーブにより滅菌した一般乳酸菌接種用培地「ニッスイ」（培地組成は、上記表１参照）１００ｍｌに、Lactobacillus rhamnosus IFO3863を一白金耳植菌する。これを３７℃、２４時間静置培養を行ない、種培養液を調製した。
Example 3
One platinum ear of Lactobacillus rhamnosus IFO3863 is inoculated into 100 ml of a medium for inoculation of general lactic acid bacteria "Nissui" (see Table 1 above for the medium composition) sterilized by autoclaving. This was subjected to stationary culture at 37 ° C. for 24 hours to prepare a seed culture solution.
次に、上記実施例１で使用したのと同様の発酵培地Ａ ２Ｌ（培地のｐＨ：７）を５Ｌ容の通気攪拌型バイオアリアクターに入れてオートクレーブ滅菌した後、これに上記種培養液を１００ｍＬ接種し、３７℃にて窒素ガスを通気しながら攪拌培養を行なった。この際、培養開始後、２４時間目までは特にｐＨの制御は行わずに培養を行ない（第一の培養）、２４時間後からアンモニア水を添加することにより、ｐＨを６で制御して培養を行なった（第二の培養）。その結果、培養開始から１４４時間後に培地中には、７２ｇ／ＬのＬ−乳酸が蓄積していた。 Next, fermentation medium A 2 L (medium pH: 7) similar to that used in Example 1 above was placed in a 5 L aerated and stirred bioreactor and sterilized by autoclave. 100 mL of the inoculum was inoculated, and agitation culture was performed at 37 ° C. with aeration of nitrogen gas. At this time, after the start of culture, the culture is performed without controlling the pH until the 24th hour (first culture), and after 24 hours, the aqueous solution is added with aqueous ammonia to control the pH at 6. (Second culture). As a result, 72 g / L of L-lactic acid was accumulated in the medium after 144 hours from the start of the culture.
また、上記実験中の、培養時間に対する、グルコースの消費量、Ｌ−乳酸の生産量、及び菌の発育を示す６６０ｎｍでの濁度（図中、ＯＤ（６６０ｎｍ））の経時的な変化を、図５に示す。 In addition, during the above experiment, glucose consumption, L-lactic acid production, and turbidity at 660 nm (in the figure, OD (660 nm)) indicating the growth of bacteria with respect to the culture time, As shown in FIG.
比較例３
実施例３において、培養開始直後からアンモニアを添加することにより培地のｐＨを６に制御しながら乳酸菌の培養を行なった以外は、実施例３に記載の方法と同様の方法で培養を行ない、Ｌ−乳酸を生産させた。その結果、１４４時間後における培地中のＬ−乳酸蓄積量は、２６ｇ／Ｌであった。
Comparative Example 3
In Example 3, culturing was carried out in the same manner as described in Example 3 except that lactic acid bacteria were cultured while controlling the pH of the medium to 6 by adding ammonia immediately after the start of culture. -Lactic acid was produced. As a result, the amount of L-lactic acid accumulated in the medium after 144 hours was 26 g / L.
また、上記実験中の、培養時間に対する、グルコースの消費量、Ｌ−乳酸の生産量、及び菌の発育を示す６６０ｎｍでの濁度（図中、ＯＤ（６６０ｎｍ））の経時的な変化を、図６に示す。 In addition, during the above experiment, glucose consumption, L-lactic acid production, and turbidity at 660 nm (in the figure, OD (660 nm)) indicating the growth of bacteria with respect to the culture time, As shown in FIG.
比較例４
実施例３において、培養開始時に培地のｐＨを６に調整し、その後はｐＨの制御を全く行わずに乳酸菌の培養を行なった以外は、実施例３に記載の方法と同様の方法で培養を行ない、Ｌ−乳酸を生産させた。その結果、１４４時間後における培地中のＬ−乳酸蓄積量は、１３ｇ／Ｌであった。
Comparative Example 4
In Example 3, the culture was carried out in the same manner as described in Example 3, except that the pH of the medium was adjusted to 6 at the start of the culture, and thereafter the lactic acid bacteria were cultured without any pH control. And L-lactic acid was produced. As a result, the amount of L-lactic acid accumulated in the medium after 144 hours was 13 g / L.
また、上記実験中の、培養時間に対する、グルコースの消費量、Ｌ−乳酸の生産量、及び菌の発育を示す６６０ｎｍでの濁度（図中、ＯＤ（６６０ｎｍ））の経時的な変化を、図７に示す。 In addition, during the above experiment, glucose consumption, L-lactic acid production, and turbidity at 660 nm (in the figure, OD (660 nm)) indicating the growth of bacteria with respect to the culture time, As shown in FIG.
上記実施例３及び比較例３，４の結果を比較すると、本発明の方法によると、Ｌ−乳酸が有意により高い収率で得られることが分かった。 Comparing the results of Example 3 and Comparative Examples 3 and 4, it was found that according to the method of the present invention, L-lactic acid was obtained in a significantly higher yield.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006037210A JP2007215427A (en) | 2006-02-14 | 2006-02-14 | Method for producing lactic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006037210A JP2007215427A (en) | 2006-02-14 | 2006-02-14 | Method for producing lactic acid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007215427A true JP2007215427A (en) | 2007-08-30 |
Family
ID=38493343
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006037210A Pending JP2007215427A (en) | 2006-02-14 | 2006-02-14 | Method for producing lactic acid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2007215427A (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010055874A1 (en) * | 2008-11-13 | 2010-05-20 | 株式会社ロイヤル・バイオ・プラ | Method for producing polylactic acid, apparatus for producing polylactic acid, method for producing biodegradable plastic and apparatus for producing biodegradable plastic |
| WO2010113351A1 (en) * | 2009-03-31 | 2010-10-07 | 株式会社ロイヤル・バイオ・プラ | Process for production of polylactic acid, apparatus for production of polylactic acid, process for production of biodegradable plastic, and apparatus for production of biodegradable plastic |
| WO2010143323A1 (en) * | 2009-06-08 | 2010-12-16 | 国立大学法人 九州大学 | Novel d-lactic acid-producing strains and method for producing d-lactic acid |
| JP2013535224A (en) * | 2010-08-19 | 2013-09-12 | コンパニア レフィナドラ ダ アマゾニア | System and method for correcting acidity of fermentation medium for organic acid production at constant volume |
| JP2015080429A (en) * | 2013-10-22 | 2015-04-27 | 王子ホールディングス株式会社 | Method for producing d-lactic acid |
| WO2015068645A1 (en) * | 2013-11-05 | 2015-05-14 | 関西化学機械製作株式会社 | Method for producing lactic acid |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61293388A (en) * | 1985-06-21 | 1986-12-24 | Daicel Chem Ind Ltd | Production of d-lactic acid |
| JPH06178692A (en) * | 1992-12-11 | 1994-06-28 | Baiotsukusu:Kk | Calcium agent and its production |
| JPH06253871A (en) * | 1993-03-02 | 1994-09-13 | Musashino Kagaku Kenkyusho:Kk | Production of lactic acid |
| JPH06311886A (en) * | 1993-03-02 | 1994-11-08 | Musashino Kagaku Kenkyusho:Kk | Production of lactic acid and lactic ester |
| JPH09266793A (en) * | 1996-03-29 | 1997-10-14 | Mizusawa Ind Chem Ltd | Production of organic acid |
| JPH11137286A (en) * | 1997-11-11 | 1999-05-25 | Musashino Chemical Laboratory Ltd | Fermentation of lactic acid |
| JPH11285397A (en) * | 1998-04-01 | 1999-10-19 | Kankyo Technos Kk | Production of lactic acid using organic waste as feedstock |
| JP2001506504A (en) * | 1996-12-23 | 2001-05-22 | ラクタスキャン・アンパルトセルスカブ | Fermentative production and isolation of lactic acid |
| JP2002051793A (en) * | 2000-08-09 | 2002-02-19 | Yoshito Shirai | Method for producing lactic acid from food garbage |
| WO2006001034A2 (en) * | 2004-05-20 | 2006-01-05 | Reliance Life Sciences Pvt Ltd | Production of polylactic acid (pla) from renewable feedstocks |
-
2006
- 2006-02-14 JP JP2006037210A patent/JP2007215427A/en active Pending
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61293388A (en) * | 1985-06-21 | 1986-12-24 | Daicel Chem Ind Ltd | Production of d-lactic acid |
| JPH06178692A (en) * | 1992-12-11 | 1994-06-28 | Baiotsukusu:Kk | Calcium agent and its production |
| JPH06253871A (en) * | 1993-03-02 | 1994-09-13 | Musashino Kagaku Kenkyusho:Kk | Production of lactic acid |
| JPH06311886A (en) * | 1993-03-02 | 1994-11-08 | Musashino Kagaku Kenkyusho:Kk | Production of lactic acid and lactic ester |
| JPH09266793A (en) * | 1996-03-29 | 1997-10-14 | Mizusawa Ind Chem Ltd | Production of organic acid |
| JP2001506504A (en) * | 1996-12-23 | 2001-05-22 | ラクタスキャン・アンパルトセルスカブ | Fermentative production and isolation of lactic acid |
| JPH11137286A (en) * | 1997-11-11 | 1999-05-25 | Musashino Chemical Laboratory Ltd | Fermentation of lactic acid |
| JPH11285397A (en) * | 1998-04-01 | 1999-10-19 | Kankyo Technos Kk | Production of lactic acid using organic waste as feedstock |
| JP2002051793A (en) * | 2000-08-09 | 2002-02-19 | Yoshito Shirai | Method for producing lactic acid from food garbage |
| WO2006001034A2 (en) * | 2004-05-20 | 2006-01-05 | Reliance Life Sciences Pvt Ltd | Production of polylactic acid (pla) from renewable feedstocks |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6011043718; 日本生物工学会大会講演要旨集 Ｖｏｌ．２００６ｔｈ, 200608, ｐ．２２５， ＃３Ｌ０９-５ * |
| JPN6012022103; 八杉龍一他 編: '乳酸菌' 岩波生物学辞典 第４版第３刷, 1997, ｐ．１０４４, 株式会社岩波書店 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010055874A1 (en) * | 2008-11-13 | 2010-05-20 | 株式会社ロイヤル・バイオ・プラ | Method for producing polylactic acid, apparatus for producing polylactic acid, method for producing biodegradable plastic and apparatus for producing biodegradable plastic |
| WO2010113351A1 (en) * | 2009-03-31 | 2010-10-07 | 株式会社ロイヤル・バイオ・プラ | Process for production of polylactic acid, apparatus for production of polylactic acid, process for production of biodegradable plastic, and apparatus for production of biodegradable plastic |
| WO2010143323A1 (en) * | 2009-06-08 | 2010-12-16 | 国立大学法人 九州大学 | Novel d-lactic acid-producing strains and method for producing d-lactic acid |
| JP2013535224A (en) * | 2010-08-19 | 2013-09-12 | コンパニア レフィナドラ ダ アマゾニア | System and method for correcting acidity of fermentation medium for organic acid production at constant volume |
| JP2015080429A (en) * | 2013-10-22 | 2015-04-27 | 王子ホールディングス株式会社 | Method for producing d-lactic acid |
| WO2015068645A1 (en) * | 2013-11-05 | 2015-05-14 | 関西化学機械製作株式会社 | Method for producing lactic acid |
| JPWO2015068645A1 (en) * | 2013-11-05 | 2017-03-09 | 関西化学機械製作株式会社 | Method for producing lactic acid |
| JP2019146596A (en) * | 2013-11-05 | 2019-09-05 | 関西化学機械製作株式会社 | Method for producing lactic acid |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11198890B2 (en) | Preparation of (R)-3-hydroxybutyric acid or its salts by one-step fermentation | |
| KR101686900B1 (en) | Novel Pichia kudriavzevii NG7 and use thereof | |
| JP2007215427A (en) | Method for producing lactic acid | |
| CN105593361A (en) | Modified microorganism for improved production of alanine | |
| WO2010001862A1 (en) | Process for producing organic acid | |
| JP4024044B2 (en) | Method for producing highly concentrated polyglutamic acid with additional supply of sugars | |
| Ramachandran et al. | Gluconic acid | |
| CN101544992A (en) | Method for preparing high optical purity D-lactic acid by fermentation | |
| WO2009048202A1 (en) | Method for preparing succinic acid using glycerol as carbon source | |
| JP4132253B2 (en) | Ammonia-resistant L (+)-lactic acid-producing bacterium and L (+)-lactic acid production method | |
| US5686277A (en) | Fermentation process for preparing xylitol using mutant cells | |
| KR20190070986A (en) | Fermentation method for producing D-lactic acid or its salt | |
| JP4742610B2 (en) | Process for producing fumaric acid | |
| Medina | Fermentation technology | |
| JP4870442B2 (en) | Method for producing lactic acid | |
| JP4742475B2 (en) | Method for producing D-lactic acid | |
| JP7158107B2 (en) | Method for producing organic compounds | |
| KR101576183B1 (en) | Method of producing erythritol using by-products, Moniliella pollinis mutant with high productivity of erythritol and the use thereof | |
| US9096874B2 (en) | Method for producing lactic acid under pressure that exceeds normal atmospheric pressure | |
| JP2005102625A (en) | Method for producing d-lactic acid | |
| Papagianni | Microbial bioprocesses | |
| Zhang et al. | L (+)-lactic acid production using sugarcane molasses and waste potato starch: An alternative approach | |
| JPS5945895A (en) | Preparation of l-aspartic acid by fermentation method | |
| KR0169061B1 (en) | A process for preparing xylitol by controlling fermenting condition | |
| JP2004097136A (en) | Method for producing lactic acid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090108 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110823 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111019 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20111021 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120508 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120702 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130108 |