JP2007212448A - 化学アレイの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】化学アレイの製造方法を提供する。
【解決手段】本発明の一態様には、基材表面のフィーチャー位置に固体活性化剤を設ける方法が包含される。本発明の態様にはまた、そのフィーチャー位置に固体活性化剤が存在する基材、当該基材から製造されたアレイ、当該アレイの使用方法、並びに当該アレイを含むキットも包含される。
【選択図】なし

Description

核酸及びポリペプチド等の化学結合剤のアレイは、バイオテクノロジー産業及びその関連分野において益々重要なツールになってきている。複数の化学結合剤が固体支持体の表面上にアレイ若しくはパターン状に配置されている、これらの化学（即ち、結合剤又はリガンド）アレイは、遺伝子発現分析、薬剤スクリーニング、核酸配列決定、変異分析、比較ゲノムハイブリダイゼーション、位置解析等をはじめとする種々の用途において利用される。

例えば、核酸アレイ及びポリペプチドアレイと同様に、アレイの化学結合剤が高分子剤である場合には、かかるアレイを製造する２つの主要な方法、即ち、ポリマーリガンドを段階的に基材表面で成長させるｉｎ ｓｉｔｕ合成による方法、並びにアレイの表面上に全リガンド、例えば予め合成された核酸／ポリペプチド、ｃＤＮＡフラグメント等、の付着による方法がある。

代表的なｉｎ ｓｉｔｕ合成法としては、ペプチドアレイの合成に関する特許文献１、並びにホスホラミダイト又は他の化学的性質を利用するポリヌクレオチド（特に、ＤＮＡ）の合成に関する特許文献２及びその中で引用されている文献に記載されているものが挙げられる。このようなｉｎ ｓｉｔｕ合成法は、（ａ）適切に活性化された基材表面（又は、既に付着している脱保護モノマー）と連結するように基材上の所定の位置に保護モノマーの液滴を付着させること、（ｂ）付着したモノマーを、後から付着される保護モノマーと反応することができるように脱保護すること、及び（ｃ）連結させるための他の保護モノマーを付着させること、という手順を繰り返すものである。完成したアレイの異なる領域が、完成したアレイに望まれるような、異なるバイオポリマー配列を有するように、種々のモノマーを、任意の１サイクルの間、基材上の種々の領域に付着させることができる。核酸アレイのｉｎ ｓｉｔｕ製造に関しては、一般に、ホスホラミダイトヌクレオチドモノマーが用いられる。既に付着したポリヌクレオチドモノマーのヒドロキシ基にホスホラミダイト基を連結するには、多くの用途において、まずはじめに、例えばテトラゾール等の弱酸を用いてそれを活性化させる。よって、酸化ステップ及び洗浄ステップ等の、１つ又は複数のさらなる中間ステップが、各繰り返しにおいて必要となり得る。
米国特許第５，４４９，７５４号 ＷＯ９８／４１５３１

化学アレイのｉｎ ｓｉｔｕ製造においては、例えば、多くの異なるターゲットを同じアレイ上でスクリーニングできるように、可能な限りフィーチャー密度の高いアレイを製造し得るのが望ましい。従って、製造時に、フィーチャーサイズの厳密な制御をもたらすプロトコルを採用するのが望ましい。

本発明の態様には、基材表面のフィーチャー位置に、固体活性化剤を配置する方法が含まれる。かかる方法においては、フィーチャー位置を有する基材表面を、活性化剤試薬の流体組成物と接触させる。次いで、フィーチャー位置においては固体活性化剤を生成するが、基材のフィーチャー間領域においては活性化剤を実質的に生成しないような方法で、流体組成物を表面から除去する。その後、特定の実施形態では、例えば、得られた官能化表面を、リガンド又はこれらのモノマー前駆体と接触させることにより、官能化表面上においてリガンドを生成する。本発明の態様にはまた、官能化基材から製造されたアレイ、当該アレイの使用方法、及び当該アレイを含むキットも含まれる。

定義
用語「ポリマー」とは、互いに共有結合した２つ以上のモノマー単位から成る任意の化合物を意味する。モノマー単位には、同じもの又は異なるものを用いることができ、それによって、ポリマーはホモポリマー又はヘテロポリマーとなり得る。代表的なポリマーとしては、ペプチド、多糖、核酸等が挙げられ、ポリマーは天然物でも合成物でもよい。

本書で用いるとき、用語「ペプチド」は、１つのアミノ酸のα−カルボキシ基と、もう１つの基のα−アミノ基とのアミド形成により生成された任意のポリマー化合物を指す。

本書で用いるとき、用語「オリゴペプチド」は、約１０〜２０の残基（即ち、アミノ酸モノマー単位）より小さいペプチドを指す。

本書で用いるとき、用語「ポリペプチド」は、約１０〜２０残基より大きいペプチドを指す。

本書で用いるとき、用語「タンパク質」は、約５０残基より大きい特定の配列のポリペプチドを指す。

本書で用いるとき、用語「核酸」は、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドから成るポリマー、又は、２つの天然核酸における場合と同様に配列特異的に天然核酸とハイブリダイズできる（例えば、ワトソン−クリック塩基対相互作用に関与し得る）合成化合物（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号及びその中で引用された文献に記載のＰＮＡ）を意味する。

本書で用いるとき、用語「リボ核酸」及び「ＤＮＡ」は、リボヌクレオチドから成るポリマーを意味する。

本書で用いるとき、用語「デオキシリボ核酸」及び「ＤＮＡ」は、デオキシリボヌクレオチドから成るポリマーを意味する。

本書で用いるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば、約１０〜約２００ヌクレオチド長（例えば、約５０〜約１７５ヌクレオチド長（例えば１５０ヌクレオチド長）をはじめとする、約２５〜約２００ヌクレオチド長）の一本鎖ヌクレオチドマルチマーを指す。

本書で用いるとき、用語「ポリヌクレオチド」は、一般に約１００ヌクレオチド長より大きな、ヌクレオチドモノマーから成る一本鎖ポリマー又は二本鎖ポリマーを指す。

本書で用いるとき、用語「官能化」は、基材表面に複数の官能基をもたらす、固体基材の修飾をいう。本書で用いるとき、用語「官能化された表面」は、表面に複数の官能基が存在するよう修飾された基材表面を意味する。

用語「アレイ」とは、用語「マイクロアレイ」を包含し、それは、ポリマー、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸等のリガンドに結合性を示す配列アレイ(ordered array)を指す。

用語「反応部位」、「反応性官能基」、又は「反応基」は、有機合成プロセスにおける開始点として用い得る、モノマー、ポリマー又は基材表面上にある成分を指す。これは、同じく基材表面上に存在し得る「不活性」親水基（例えば、ポリエチレングリコール、ポリアミド等と関連する親水性部位）とは異なる。

本書では、用語「オリゴマー」は、複数のモノマーを含む化学物質を指すために用いる。本書で用いるとき、用語「オリゴマー」と「ポリマー」は、必ずしもそうではないが、一般に、コンビナトリアル化学 (combinatorial chemistry）技術と共に本発明の官能化基材を用いて調製された、比較的小さい「ポリマー」であるため、相互に交換して用いる。オリゴマー及びポリマーの例としては、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、ポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、プリン塩基若しくはピリジン塩基のＣ-グリコシドである他のポリヌクレオチド、ポリペプチド（タンパク質）、多糖（デンプン又はポリシュガー(polysugars)）、並びに類似の化学構造の繰り返し単位を含む他の化学物質が挙げられる。本発明の実施においては、オリゴマーは、一般的に約２〜５０のモノマー、好ましくは約２〜２０のモノマー、より好ましくは約３〜１０のモノマーから構成されよう。

本書で用いるとき、用語「モノマー」とは、１つ又は複数の他のそのような物質と共有結合してポリマーを形成することのできる化学物質を示す。本願で特に対象となるものは、標準的な化学反応（例えば求核置換反応）により他の類似のモノマーとの結合に適する第１部位及び第２部位（例えば、５’位及び３’位）を有するヌクレオチド「モノマー」、並びに同種類の他のモノマーと特定のモノマーとを区別するような異なる要素（例えば、ヌクレオチド塩基等）を有するヌクレオチド「モノマー」である。当分野では、この種の核酸の合成には、完全な核酸を形成するための多段合成手順における基本要素として一般に用いられる、初期から基材の結合したモノマーが用いられる。

本書で用いるとき、用語「リガンド」は、対象とする化合物と共有結合、あるいは化学結合することのできる成分を指す。本法により製造される固体支持リガンドのアレイは、サンプル中の対象成分を結合させるために、スクリーニングプロセス又は分離プロセス等に用いることができる。本発明において、用語「リガンド」は、先に定義した「オリゴマー」であっても、そうでなくてもよい。しかしながら、本書で用いる用語「リガンド」はまた、「予め合成された」、即ち、市販されているものを、基材に結合させた化合物も意味し得る。

本書で用いるとき、用語「サンプル」は、一般に１つ又は複数の対象成分を含有しており、必ずしもそうではないが、液状の、物質若しくは物質の混合物をいう。

用語「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」は、既知のプリン塩基及びピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環塩基も含む成分も包含する意がある。このような修飾体としては、メチル化プリンやメチル化ピリミジン、アシル化プリンやアシル化ピリミジン、アルキル化リボース又は他の複素環が挙げられる。さらに、用語「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」は、従来のリボース糖及びデオキシリボース糖のみならず、他の糖も含む成分を包含する。修飾ヌクレオシド又は修飾ヌクレオチドはまた、糖成分上の修飾も含み、その場合、例えば、１つ又は複数のヒドロキシ基が、ハロゲン原子若しくは脂肪族基で置換されていたり、又はエーテル、アミン等として官能化されている。

本書で用いるとき、用語「アミノ酸」は、Ｌ型、Ｄ型、及び非キラル型の天然アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン）のみならず、変性アミノ酸、アミノ酸類似物、並びに従来のオリゴペプチド合成に組み込まれ得る他の化合物、例えば４−ニトロフェニルアラニン、イソグルタミン酸、イソグルタミン、ニコチノイル−リシン、イソニペコチン酸、テトラヒドロイソキノレイン酸(tetrahydroisoquinoleic acid)、アミノイソ酪酸、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、アラニン、４−アミノ酪酸等も包含する意がある。

バイオモノマー流体又はバイオポリマー流体は、それぞれバイオモノマー又はバイオポリマーを含む液体（一般に溶液）をいう。

「ホスホラミダイト」は、以下の構造式（Ｉ）：

式中、ＸはいずれもＯ又はＳのような結合原子であり、同じものとも異なるものともし得る。Ｙは、シアノエチルなどの保護基である。Ｚは、ハロゲン（特に、Ｃｌ又はＢｒ）又はモルホリノ若しくはＮ（低級アルキル）２などの第２級アミノ基であり、ここで前記アルキル基は同じものとも異なるものともし得、好ましくはＮ（ｉ−プロピル）２である。「低級アルキル」とは、炭素数１〜８のものを表す。ヌクレオシドホスホラミダイトは、式（Ｉ）のＸに遊離結合している糖環を有する、ヌクレオシド又はヌクレオシド類似体を有する。例えば、１つの具体的なヌクレオシドホスホラミダイトは、以下の式（ＩＩ）で表される。

式中、Ｂは、ヌクレオシド塩基であり、ＤＭＴはジメトキシトリチルである。ＤＭＴと結合しているＯ（代わりにＳで置換されていてもよい）は、ＤＭＴによって保護された第２の結合基として機能する。ＤＭＴ以外の保護基を使用することもでき、脱保護時のこれらの除去は、オリゴヌクレオチド合成において既知である。他のヌクレオシドホスホラミダイトも知られており、例えば、ホスホラミダイト基が、５員の糖環の異なる位置と結合しているものがある。ホスホラミダイト及びヌクレオシドホスホラミダイトは、特に米国特許第５，９０２，８７８号、同第５，７００，９１９号、同第４，４１５，７３２号、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／４１５３１及びそれらの中で引用されている文献（参照することで、これらの内容を本書に取り入れることとする）に記載されている。

「基」は、置換形態及び非置換形態の両方を含む。また当然のことながら、本願の全体にわたって、「上方」、「下方」等の語は、重力方向に関する装置の向きを表すために使用されるが、重力方向に関して、装置やその構成部品のいずれも、他の動作方向とし得ることは理解されよう。本書においてパルスジェットから吐出される「液滴」については、単にパルスジェットの単一パルス（イジェクタの１回の作動に対応する）で吐出された個々の少量の液体（通常、約１，０００ｐＬより少ない）を示しており、この個々の量に特定の形状は要求されない。「スポット」という場合、これは、文脈に応じて、吐出された液滴の乾燥により生じた、基材上の乾燥したスポット、又は吐出された液滴により生じた、未だ乾燥していない基材上の濡れたスポットを表し得る。

「流体」は、その従来の意味において本書で用いられ、それは気相又は液相のいずれかを意味する。

ある事物について単数形を用いるとき、このものが複数存在する可能性も包含する。

用語「保護基」は、反応条件において安定であり、反応基が化学反応に関与するのを阻害又は防止する化学成分を指す。保護基はまた、化合物が化学反応に関与することが可能となるように、化合物の溶解度等の物性を変化させ得る。保護基の例は、当分野で既知であり、例えば、Greeneらによる、Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Ed., New York: John Wiley & Sons, 1991にある。

「任意選択の」又は「任意選択的に」は、続いて記載される状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、それによって、この記載は、前記状況が起こる場合と起こらない場合を包含する。例えば、「任意選択的に置換された」というフレーズは、水素以外の置換基が存在してもしなくてもよいことを意味し、即ち、この記載は、水素以外の置換基が存在する構造と、水素以外の置換基が存在しない構造とを包含する。

相互に交換して用いられる「アレイ」又は「化学アレイ」は、それに関連する特定の化学成分（リガンド、例えばポリヌクレオチド配列又はオリゴヌクレオチド配列（核酸）、ポリペプチド（例えば、タンパク質）、炭水化物、脂質等のバイオポリマー）を有するアドレス指定可能な領域の、任意の一次元、二次元又は実質的に二次元（及び三次元）の配列を包含する。従って、アドレス指定可能なアレイは、関連する特定のバイオポリマー成分（例えば、種々のポリヌクレオチド配列）を有する個々の領域（即ち、「フィーチャー」）であって、基材上の所定の位置（かかる位置の各々が「アドレス」である）に配置された個々の領域から成る一次元、二次元若しくは三次元の配列を含む。これらの領域は、介在するスペースによって分離されていても、分離されていなくてもよい。最も広い意味では、多くの実施形態のアレイは、ポリマー結合剤から成るアレイであり、このポリマー結合剤は、ポリペプチド、タンパク質、核酸、多糖、及びそのようなバイオポリマー結合剤の合成模倣物のいずれかとし得る。対象とする実施形態の多くでは、アレイは、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、これらの合成模倣物等を含む、核酸のアレイである。アレイが核酸アレイである場合、核酸は、核酸鎖の任意の位置でアレイと共有結合し得るが、一般に、これらの１つの末端（例えば、３’末端又は５’末端）にて結合する。時には、アレイには、ポリペプチド、例えばタンパク質又はこれらの断片から成るアレイを用いることができる。

任意の所与の基材は、基材表面に配置された、１つ、２つ、４つ又はそれより多くのアレイを有し得る。用途に応じて、任意の又は全てのアレイを互いに同じものとしたり、異なるものとしたりすることができ、また、その各々は、複数のスポット、即ち、フィーチャーを有することができる。一般的なアレイは、１０より多いフィーチャー、１００より多いフィーチャー、１，０００より多いフィーチャー、１０，０００より多いフィーチャー、又は１００，０００よりも多いフィーチャーを、２０ｃｍ^２より小さい面積又は１０ｃｍ^２よりも小さい面積に含み得る。例えば、フィーチャーは、１０μｍ〜１．０ｃｍの範囲の幅（即ち、円形スポットの場合には直径）を有し得る。他の実施形態においては、各フィーチャーは、１．０μｍ〜１．０ｍｍ、一般に５．０μｍ〜５００μｍ、より一般的には１０μｍ〜２００μｍの範囲の幅を有し得る。円形以外のフィーチャーは、上記範囲の幅（直径）の円形フィーチャーのそれに相当する面積範囲を有し得る。少なくとも幾つか又は全てのフィーチャーは、異なる組成物から成る（例えば、各フィーチャー組成物の重複を排除すると、残るフィーチャーは、全フィーチャー数の少なくとも５％、１０％又は２０％の割合を占める）。一般に、いかなるポリヌクレオチド（又はフィーチャーを構成する他の種類のバイオポリマー成分若しくは化学成分）も有さないフィーチャー間領域が存在するであろう（必須ではないが）。このようなフィーチャー間領域は、一般に、アレイが、試薬の液滴付着を伴うプロセスにより形成される場合に存在するが、例えば、光誘導による合成製造プロセスを利用する場合には存在させなくてもよい。当然のことながら、存在する場合、フィーチャー間領域は、様々なサイズ及び立体配置をとり得る。各アレイは、１００ｃｍ^２未満、さらに５０ｃｍ^２、１０ｃｍ^２、又は１ｃｍ^２未満の面積を覆うことができる。多くの実施形態では、１つ又は複数のアレイを有する基材は、一般に（他の形も可能であるが）４ｍｍ超１ｍ未満、一般的には４ｍｍ超６００ｍｍ未満、より一般的には４００ｍｍ未満の長さと；４ｍｍ超１ｍ未満、一般的には５００ｍｍ未満、より一般的には４００ｍｍ未満の幅と；０．０１ｍｍ超５．０ｍｍ未満、通常０．１ｍｍ超２ｍｍ未満、より一般的には０．２ｍｍ超１ｍｍ未満の厚さとを有する直方体として形成されるであろう。蛍光を検出することにより読み取られるアレイに関しては、基材は、励起光を伴う照射下で低い蛍光を発する物質とし得る。さらにこの場合、集束レーザビームが領域にわたってあまりにもゆっくり進行する場合、基材は、入射する照射レーザー光の吸収と、それに伴う発熱とを低減させるために、比較的透明とし得る。例えば、このような照射光の全入射スペクトルにわたって、又は代替的に５３２ｎｍ若しくは６３３ｎｍにて測定する際、基材１０は、前面に入射した照射光のうち、少なくとも２０％又は５０％（又は、さらに少なくとも７０％、９０％、若しくは９５％）を透過し得る。

アレイは、ｉｎ ｓｉｔｕ製造の場合には前駆体ユニット（ヌクレオチド又はアミノ酸モノマーなど）を、又は予め得られたバイオポリマー（例えばポリヌクレオチド）のいずれかをパルスジェットから液滴付着させることにより製造することができる。このような方法は、米国特許第６，２４２，２６６号、米国特許第６，２３２，０７２号、米国特許第６，１８０，３５１号、米国特許第６，１７１，７９７号、米国特許第６，３２３，０４３号、１９９９年４月３０日付けの、Carenらによる米国特許出願第０９／３０２，８９８号、及びそれらの中で引用された文献をはじめとする、これまでに引用した文献にお詳細に記載されている。他の液滴付着法もまた、これまでに本書に記載したような製造のために、用いることができる。

例示的な化学アレイを図１〜図３に示しており、この実施形態で示されるアレイは、基材１１０の裏面１１１ｂ上に配置されたアレイ１１２を有する連続した平面基材１１０を含む。このようなアレイの間の隙間の有無に関わらず、１つよりも多いアレイ（これらはいずれも同じものであるか、又は異なるものである）が裏面１１１ｂ上に存在し得ることは理解されよう。即ち、任意の所与の基材は、基材の表面に配置された１つ、２つ、４つ又はそれより多くのアレイを有することができ、アレイの用途に応じて、幾つか又は全てのアレイが互いに同じものであっても、異なるものであってもよく、各々が、複数のスポット、即ち、フィーチャーを含み得る。１つ又は複数のアレイ１１２は、通常、裏面１１１ｂの一部のみを覆っており、スライド１１０の対向する側面１１３ｃ、１１３ｄ並びに前端１１３ａ及び後端１１３ｂに隣接する裏面１１１ｂの領域は、アレイ１１２によって覆われていない。スライド１１０の表面１１１ａは、アレイ１１２を有さない。試験サンプルであれ、参照サンプルであれ、これらの組み合わせであれ、又はポリヌクレオチド等のバイオポリマーの既知の混合物であれ、任意の種類のサンプルを試験するようにアレイ１１２を設計することができる。基材１１０は、上述のように任意の形状とし得る。

上述のように、アレイ１１２は、バイオポリマーから成る複数のスポット、即ち、フィーチャー１１６（例えば、ポリヌクレオチドの形態）を含む。上述のように、全てのフィーチャー１１６を異なるものとすることもできるし、幾つか又は全てを同じとすることもできる。フィーチャー間領域１１７は、様々なサイズ及び構成を有する領域とし得る。各フィーチャーは、所定のポリヌクレオチド等の所定のバイオポリマー（ポリヌクレオチドの混合物の可能性もある）を有する。裏面１１１ｂと第１のヌクレオチドとの間に、任意の既知の種類の連結分子（図示せず）が存在し得ることは理解されよう。

基材１１０は、表面１１１ａに、識別コード、例えば、基材上に印刷されたバーコード状のもの又は接着剤若しくは任意の適切な手段により接着された紙ラベル状のものを有することができる。識別コードは、アレイ１１２に関する情報を含み、このような情報には、アレイ１１２の識別、即ち、限定はしないが、アレイ（複数可）等に関するレイアウト情報が含まれる。基材は、多孔性であっても無孔性であってもよい。基材は平面であっても、平面でなくてもよい。

アレイが固体支持体の同一表面上に固定化された２つ以上のフィーチャーを有するような実施形態においては、アレイは、アドレス指定可能であるということができる。アレイ上の所定の位置（即ち、「アドレス」）にある領域（即ち、アレイの「フィーチャー」又は「スポット」）が特定のターゲット又は特定の種類のターゲットを検出するように（フィーチャーがターゲット以外のものを偶然検出することもあるが）、異なる成分（例えば、異なるポリヌクレオチド配列）から成る複数の領域をアレイが有する場合、このアレイは「アドレス指定可能」である。アレイフィーチャーは、一般に、介在するスペースにより分離されているが、必ずしもそうである必要はない。アレイに関しては、「ターゲット」は、基材の種々の領域に結合しているプローブ（「ターゲットプローブ」）により検出されるべき、移動相（典型的に流体）中の成分といえる。ここで、「ターゲット」や「プローブ」の一方は、他方により評価されることになるものを用いることができる（従って、いずれか一方は、もう一方と結合することによって評価されることになる検体、例えばポリヌクレオチドの未知の混合物であり得る）。

アレイ「アセンブリ」は、基材と、少なくとも１つの化学アレイ（例えば基材表面上にある）とを含んで成る。アレイアセンブリは、複数の突起を支持している土台を備えた素子の表面上に存在する１つ又は複数の化学アレイ（例えば、かかる素子の１つ又は複数の突起の表面上に存在する１つ又は複数の化学アレイ）を含む。アセンブリは、他の構造（基材部分を除去できるチャンバを有するハウジング等）を含むことができる。「アレイユニット」は、「アレイアセンブリ」と同じ意味で用いることができる。

ポリヌクレオチドに関していう「ハイブリダイズ」及び「結合」は、相互に交換して用いられる。

本書で用いるとき、用語「基材」は、マーカー分子又はプローブ（例えばアレイ）が接着され得る表面を指す。バイオチップのための最も一般的な基材はスライドガラスであるが、石英ガラス、シリコーン、プラスチック及び他の材料もまた好適である。

２つのものが互いに「関連」する場合、一方が他方と関係づけられるように、一方が他方に関係することが明らかであるような様式にてもたらされる。例えば、アレイ識別子は、アレイを支持しているアレイアセンブリ上（例えば、基材又はハウジング上）にあることで、又はアレイアセンブリを含むパッケージ若しくはキット内にあることによって、アレイに関連し得る。「安定に結合している」又は「安定に関連している」とは、物の位置をほぼ一定に保つことを意味し、これは、或る実施形態では、物の位置が既知であり、ほぼ一定に保たれることを意味する。

「ウェブ」とは、幅より長さの大きい、長く連続した一片の基材材料を意味する。例えば、ウェブの長さ対幅の比は、少なくとも５／１、１０／１、５０／１、１００／１、２００／１、若しくは５００／１、又はさらに少なくとも１０００／１であり得る。

基材又は基材ウェブに関していう「柔軟な」とは、基材が、半径１．２５ｃｍ未満のローラに沿って１８０°曲げることができることを意味する。基材は、不具合（例えば、割れ）又は塑性変形を起こすことなく、少なくとも１００回、いずれの方向にも曲げ伸ばしを繰り返すことができる。この曲げは、材料の弾性限界内でなければいけない。柔軟性の前述の試験は、２０℃の温度にて実施される。

「堅い」とは、柔軟ではなく、約２．５×７．５ｃｍのセグメントがその形状を維持し、不具合なしに任意の方向に沿って、６０°を超えて曲がることができない（多くの場合、４０°、２０°、１０°、又は５°以下）ように構成された材料、又は構造を指す。

本書で用いるとき、用語「と特異的にハイブリダイズする」、「特異的なハイブリダイゼーション」及び「と選択的にハイブリダイズする」は、ストリンジェントな条件下において、核酸分子が優先的に特定のヌクレオチド配列と結合すること、二本鎖となること、又はハイブリダイズすることを意味する。

本書で用いるとき、用語「ストリンジェントなアッセイ条件」とは、アッセイにおいて所望のレベルの特異性をもたらすのに十分に相補的である核酸（例えば、表面に結合した核酸と溶液相中の核酸）が結合対を生成するのには適合するが、所望の特異性をもたらすのには相補性が不十分である結合要素が結合対を形成するのにはさほど適合しないような条件を意味する。ストリンジェントなアッセイ条件は、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件の両方の和、即ち組み合わせ（合計）である。

核酸のハイブリダイゼーション（例えば、アレイの場合、サザンハイブリダイゼーション又はノーザンハイブリダイゼーション）についていう「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」とは、配列依存性であり、種々の実験パラメータ下において異なる。本発明の範囲において核酸を同定するのに用い得るストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳを含んで成るバッファー中で４２℃にて行うハイブリダイゼーション、又は５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳを含んで成るバッファー中で６５℃にて行うハイブリダイゼーションがあり、両者とも、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを用いて６５℃にて洗浄を行う。また、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としてはまた、４０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、及び１％ＳＤＳを含んで成るバッファー中で３７℃にてハイブリダイゼーションを行い、１×ＳＳＣを用いて４５℃にて洗浄を行うものも挙げられる。あるいはまた、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ_４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、６５℃にて、フィルターに結合させたＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃にて洗浄を行うことも採用し得る。さらに他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、６０℃以上にて、３×ＳＳＣ（４５０ｍＭの塩化ナトリウム／４５ｍＭのクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、又は４２℃にて、３０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５％サルコシンナトリウム、５０ｍＭ ＭＥＳを含んで成るｐＨ６．５の溶液中で、インキュベーションすることが挙げられる。同様のストリンジェントな条件をもたらすために、代わりの匹敵するハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件を利用し得ることは、当業者には容易に理解されよう。

ある実施形態では、核酸が、表面に結合させた核酸と特異的にハイブリダイズするかどうかを決める条件は、洗浄条件のストリンジェンシーである。核酸の同定に用いる洗浄条件としては、例えば、塩濃度約０．０２モル、ｐＨ７、温度少なくとも約５０℃、又は約５５℃〜約６０℃；又は、約０．１５Ｍ ＮａＣｌの塩濃度、７２℃、約１５分間；又は、約０．２×ＳＳＣの塩濃度、温度少なくとも約５０℃、又は約５５℃〜約６０℃、約１５〜約２０分間；又は、ハイブリダイゼーション複合体を、０．１％ＳＤＳを含む塩濃度約２×ＳＳＣの溶液を用いた、室温、１５分間の洗浄を２回行い、次いで０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣを用いた、６８℃、１５分間の洗浄を２回行う；又は、同等の条件、を挙げることができる。洗浄のためのストリンジェントな条件はまた、例えば、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、４２℃である。

ストリンジェントなアッセイ条件の具体的な例は、一価カチオン総濃度１．５Ｍの塩ベースのハイブリダイゼーションバッファー中での６５℃におけるハイブリダイゼーション（例えば、２０００年９月５日付けの、米国特許出願第０９／６５５，４８２号明細書に記載されており、参照することで、この開示内容を本明細書に取り入れることとする）と、それに次ぐ０．５×ＳＳＣ及び０．１×ＳＳＣによる室温での洗浄を繰り返すことである。

ストリンジェントなアッセイ条件は、少なくとも、上述の代表的な条件と同程度にストリンジェントであるハイブリダイゼーション条件であり、ここで、上記の特定の条件と比較して、所与の条件セットにおいて、望ましい特異性をもたらすのに十分な相補性が無い結合複合体が余計に形成されることが実質的に無い場合は、この所与の条件セットは、少なくとも同程度にストリンジェントであるとみなされる。ここで、“実質的に無い”とは、約５倍以上、典型的には、約３倍以上少ないことを意味する。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で公知であり、適宜使用し得る。

「接触」とは、一緒になることを意味する。従って、例えば、互いに触れさせることによって、２つのものが一緒になる場合、第１の物は第２の物と接触している。

「付着」とは、或る位置に或るものを配置すること（即ち、置くこと）、あるいはまた、或るものを或る位置に配置又は置くことを意味する。付着は、或るものを他のものと接触させることを含む。付着は、手動又は自動とし得、例えば、或る位置への或るものの「付着」は、自動ロボット装置によって実施し得る。本書において用いるとき、或る位置に「固体活性化剤を付着させる」とは、活性化剤を含む流体組成物を或る位置に付着させ、そして固体活性化剤が残存するように、組成物から流体を除去することを含む。

「離れた位置」とは、アレイ（又は言及されている物）が存在し且つハイブリダイゼーションが行われる位置以外の位置を意味する（ハイブリダイゼーション反応の場合）。例えば、リモート位置は、同じ都市の別の位置（例えば、オフィス、研究所等）、異なる都市の別の位置、異なる州の別の位置、異なる国の別の位置等であり得る。従って、或るものが他方とは「離れている」という場合、これは、２つのものが少なくとも異なる部屋又は異なる建物にあり、少なくとも１マイル、１０マイル、又は少なくとも１００マイル離れている場合があることを意味している。

情報を「通信する」とは、適切な通信チャネル（例えば、私設網又は公衆網）を介して、情報を信号（例えば、電気信号、光信号、無線信号等）として表すデータを送信することを意味する。

或るものを「送る」とは、それを物理的に輸送すること、又は（可能であるのなら）それ以外のいずれかによって、それを或る位置から他の位置へと移動させる任意の手段を指し、少なくともデータの場合、データを運ぶ媒体又はデータを通信する媒体を物理的に輸送することも含む。

アレイの「パッケージ」は、アレイと、アレイが付着している基材のみとし得るが、他の構造（チャンバを有するハウジング等）も含み得る。

「チャンバ」とは、閉じた空間を意味する（チャンバは、１つ又は複数のポートを介してアクセス可能であるが）。また、本願の全体にわたって、「最上部」、「上端」、及び「下端」等の語は、相対的な意味においてのみ用いられていることは理解されよう。

また、本願の全体にわたって、「カバー」、「土台」、「表面」、「裏面」、「最上部」等の語は、相対的な意味においてのみ用いられていることも理解されよう。基材及び／又はフローセルに関して用いる「上方」という語は、基材及び／又はフローセルが存在する環境、例えば部屋の水平面（例えばこのような部屋の地面又は床）に関しての意である。

詳細な説明
化学アレイの製造方法を提供する。本発明の態様には、基材表面のフィーチャー位置に活性化剤（例えば、官能基（例えばヒドロキシ基）と共有結合し得るようにホスホラミダイト基を活性化する試薬）を配置する方法が包含される。本発明の態様は、フィーチャー位置を有する基材表面を、活性化剤試薬の流体組成物と接触させることを包含する。次いで、基材のフィーチャー間領域には活性化剤を実質的にもたらさないが、フィーチャー位置には固体活性化剤をもたらすような方法で、組成物の流体成分を表面から除去する。次いで、或る特定の実施形態では、例えば、得られた官能化表面を、リガンド又はこれらのモノマー前駆体と接触させることにより、官能化表面上にリガンドを生成させる。また、本発明の態様には、表面上のフィーチャー位置に固体活性化剤を含む表面、官能化基材から製造されたアレイ、アレイの使用方法、及びアレイを含むキットが含まれる。

本発明についてさらに説明する前に、本発明は、以下に説明する本発明の特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。その特定の実施形態の変更形態を構成し得、それも添付の特許請求の範囲内である。また、用いる専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものであり、制限する意のないことも理解されたい。代わりに、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により規定することとする。

数値範囲が提示される場合、その範囲の上限と下限の間にある各値、別途本文に明確に指示のない限り、下限の１０分の１の単位までの各値、並びにその記載された範囲内の任意の他の値あるいはその間にある値が、本発明の範囲に包含される。これらの狭い範囲の上限及び下限は、この狭い範囲に独立して包含され得、また記載した範囲内における特に除外した限界を除いて、本発明内に包含される。記載する範囲に一方あるいは両方の限界が含まれる場合は、包含される限界の一方あるいは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。

本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は、他に記載が無ければ、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものに類似の或いは同等の任意の方法、装置及び物質を本発明の実施又は試験において用いることができるが、好ましい方法、装置及び物質について以下に説明する。

本明細書で引用する全ての刊行物及び特許は、それら刊行物がそれに関して引用された方法及び／又は物質を説明し、開示するために、あたかも各刊行物及び特許が詳細に個々に示されているかのように、参照することで本明細書に取り入れることとする。刊行物の引用は、出願日以前の本開示に関するものであり、本発明が、先行発明に基づいてそれら刊行物に先行する権利が本発明にないことを認めるものとして解釈すべきではない。さらに、提示した刊行日は、第三者的な機関によって確認する必要があり得、実際の刊行日と異なる場合がある。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途指示のない限り、複数形の意を包含することに留意されたい。また、特許請求の範囲は、任意選択の要素を排除するように作成し得ることに留意されたい。従って、特許請求の範囲の要素の記載、又は「否定的な」限定の使用に関する「単に」、「のみ」等のような排他的な語の使用の根拠としての役目を果たすことを意図している。

本開示を読むことによって当業者には明らかとなろうが、本書において記載、説明する個々の実施形態の各々は、本発明の範囲又は趣旨を逸脱することなく、他の幾つかの実施形態の特徴から容易に切り離したり、又は組み合わせたりすることのできる、個々の要素及び特徴を有する。記載する方法は、記載した順序にて、又は論理的に可能な他の順序にて実施することができる。

上記に要約したように、本発明は、化学アレイの製造方法を提供する。本発明の実施形態の特徴は、化学アレイ製造プロトコルの或る時点において（例えば、基材表面へのバイオポリマーリガンド又はこれらの前駆体の結合において）、活性化剤を用いることである。代表的な実施形態では、当該方法は、ｉｎ ｓｉｔｕ製造プロトコルを用いて基材上にバイオポリマーアレイを製造する方法であり、例えば、当該アレイは、パルスジェットヘッドを用いて製造される。代表的な実施形態では、本発明の方法を用い得るｉｎ ｓｉｔｕプロトコルは、ポリマー合成の方法である。かかる方法の実施形態には、活性化モノマーが末端官能基と共有結合し得るような条件下において、成長するポリマーリガンドの末端官能基に活性化モノマーを順次繰り返し接触させることが含まれる。その結果、所望のモノマー残基配列を有する表面結合リガンドが製造される。先に検討したように、ポリマーリガンドアレイの合成に用いるためのｉｎ ｓｉｔｕプロトコルは当分野で既知であり、特に米国特許第６，３０６，５９９号、及び同第６，３００，１３７号に記載されている。

本発明の態様には、フィーチャー位置内には効果的な付着をもたらすが、フィーチャー間領域には、たとえあったとしても実質的にほんのわずかの付着しかもたらさないプロトコルを用いて、基材のフィーチャー位置に活性化剤を配置することが包含される。換言すれば、当該プロトコルは、表面のフィーチャー位置に活性化剤を配置するために用いられるものであり、当該プロトコルは、表面上のフィーチャー間領域には、たとえあったとしてもほんのわずかの活性化剤しか付着しないようにするものである。本発明の一態様では、流体活性化剤組成物として活性化剤を設け、そこから流体を除去することで、フィーチャー位置に固体活性化剤を設ける。

一実施形態では、基材表面は、フィーチャー間領域により隔てられた、１つ又は複数のフィーチャー位置を有する。或る態様では、フィーチャー位置は、フィーチャー間領域とは異なる表面エネルギーを有する。代表的な実施形態では、フィーチャー位置は、流体活性化剤組成物の溶媒に対して濡れ性であるが、フィーチャー間領域は濡れ性ではない（例えば、フィーチャー位置は親液性であり、フィーチャー間領域は疎液性である）。

固体支持体表面は、複数のフィーチャー位置（即ち、２つ以上、例えば約１０以上、例えば約５０以上）を含むことができ、或る実施形態では、上記表面は、１００以上、１，０００以上、５，０００以上、１０，０００以上、２５，０００以上のフィーチャー位置を含む。かかる実施形態において、フィーチャー位置密度は変化させることができ、それは、少なくとも約１０／ｃｍ^２、少なくとも約５０／ｃｍ^２、少なくとも約１００／ｃｍ^２、例えば少なくとも４００／ｃｍ^２、１，０００／ｃｍ^２以上とし得る。フィーチャー位置のアレイは、緻密なパターンとし得、例えば、行及び列の配列パターン状の複数のスポットとし得る。

本発明で用いる初期の基材は、その表面上に複数の反応性親水性部位を有するか、又はその表面上に複数のそのような部位を有するように処理又は被覆し得る、任意の都合の良い材料から製造することができる。適切な材料としては、限定はしないが、ガラス、細孔制御ガラス(controlled pore glass)（「ＣＰＧ」）、石英、ケイ素又は二酸化ケイ素で被覆されたケイ素、セラミック、固相化学合成で一般に用いられる支持体（例えば架橋ポリマー材料（例えばジビニルベンゼンスチレン系ポリマー）、アガロース（例えばＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標））、デキストラン（例えばＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標））、非孔性基材及び多孔性基材、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド等）が挙げられる。支持体は、市販されており、それをそのまま使用するか、又はこれらを使用前に処理若しくは被覆することができる。基材表面は一般に平面であるが、平面性は要求されず、表面はアレイの形成に用いられるシラン化試薬との接触に好適な任意の幾何学形状とし得る。

或る実施形態では、表面に１つ又は複数のフィーチャー位置を有する固体支持体は、表面エネルギー修飾試薬で化学修飾（例えば、官能化）された表面を有する固体支持体である。従って、代表的な実施形態では、固体支持体（例えば、基材）の表面は、１つ又は複数の種類のシランを含むシラン誘導体化組成物等の表面エネルギー修飾試薬と接触させることによってまず官能化され、次いでこの官能化表面を修飾することで（例えば、これらのバイオポリマー若しくは前駆体残基のパルスジェット付着によって）、少なくとも１つのフィーチャー位置を有する表面が製造される。代表的な実施形態では、固体支持体の表面は、1つ又は複数のシラン化試薬のシラン誘導体化組成物と接触させることによって誘導体化される。対象とする特定の実施形態では、誘導体化組成物は、２つ以上の種類のシランを含むことができ、それらは互いに同じものでも異なるものでもよい。例えば、２つ以上のシランは、それらの脱離基置換基に関して異なっていてもよく、これらには、限定はしないが、ハロゲン、クロロ、アルコキシ、アリールオキシ、低級アルキル成分（例えばメチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、ｔ−ブチル等）が挙げられる。誘導体化組成物がシラン混合物から成る特定の実施形態では、第１のシランは、表面エネルギーを低下させる誘導体化剤である一方、第２のシランは所望の官能性をもたらす。

例えば、第２のシランは、対象とする付加的な分子種（例えば、ホスホラミダイトのようなバイオポリマー前駆体残基）と直に結合し得る官能基、又は基材表面に存在する他の化学種に実質的に影響を与えない条件下で官能基へと変化し得る変性可能基を含むことができる。当該官能基は、基材へのリガンドの結合を促進する基（限定はしないが、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ等）、又は当分野で既知の手順を用いて、ヒドロホウ素化及び酸化によって反応性のヒドロキシ基へと容易に変化し得るオレフィン成分（例えば末端ＣＨ＝ＣＨ_２基等）のような変性可能基とし得る。対象とする付加的な官能基としては、米国特許第６，６６０，３３８号、同第６，４４４，２６８号、同第６，３８７，６３１号、同第６，３１９，６７４号、同第６，２９１，１８３号、及び同第６，２５８，４５４号に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。固体支持体をシラン化する方法としては、同時係属の米国出願第１１／０５０，１３９号に記載のものが挙げられる。表面を誘導体化する一般的なプロセスのさらなる説明に関しては、米国特許第６，２５８，４５４号も参照されたい。

上述のように、フィーチャー間領域（複数可）によって隔てられた１つ又は複数のフィーチャー位置を有する所望の固体支持体を設けた後に、得られた基材を、化学リガンドが表面に固定化された固体支持体（例えばリガンドアレイ）を製造するのに用いることができる。本発明によるアレイの製造においては、活性化剤試薬は、基材表面のフィーチャー位置に配置される。先に検討したように、活性化剤試薬（例えば、固体状）が各フィーチャー位置を完全ではなくとも実質的に覆い且つフィーチャー位置以外の位置に存在する活性化剤がたとえあったとしてもほんのわずかとなるような方法にて、活性化剤試薬は、フィーチャー位置（複数可）に配置される。

一態様では、基材表面の全てではないが少なくとも一部を、活性化剤を含む流体組成物と接触させる。「活性化剤を含む流体組成物」とは、ホスホラミダイト合成プロトコル時の所望の残基（例えばホスホラミダイト）の活性化をもたらすのに十分な量にて活性化剤を含有している液体を意味する。具体的な活性化剤試薬は、製造する具体的なバイオポリマーに応じて変わる。例えば、ホスホラミダイトの場合、適切な活性化剤は既知であり、それらとしては、限定はしないが、テトラゾール、Ｓ−エチルテトラゾール、ジシアノイミダゾール（「ＤＣＩ」）又はベンズイミダゾリウムトリフレート(triflate)が挙げられる。同様に、ポリペプチド合成のためのアミノ酸の場合においては、適切な活性化剤は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）である。

対象とする活性化剤用の溶媒に関しては、低い沸点（例えば、約１１０℃以下の沸点、例えば約８０℃以下の沸点）を有する溶媒であって、用いる化学物質と適合する限り、任意の低沸点溶媒を使用することができる。ホスホラミダイトの場合、非プロトン性の低沸点溶媒（例えば、アセトニトリル、ジオキサン、トルエン、酢酸エチル、アセトン、テトラヒドロフラン）を用いることができる。或る実施形態では、流体組成物はさらに、或る量（以下に記載するように、例えば、蒸発時にフィーチャー表面上に活性化剤を保持させるのに十分な量）のより高い沸点を有する共溶媒をさらに含む。存在する場合、この共溶媒と溶媒の比は、約１：１００〜約１００：１の範囲（例えば、約１：１０〜約１０：１）とし得る。より沸点の高い溶媒とは、沸点が少なくとも約１１０℃である溶媒（例えば、低沸点溶媒よりも少なくとも約１０℃高い）を意味し、代表的な実施形態では、共溶媒の沸点は、約１１０℃〜３００℃の範囲（例えば、約１２０℃〜約２００℃）である。対象となる代表的な共溶媒としては、限定はしないが、炭酸プロピレン、炭酸ジエチル、炭酸ジメチル、アジポニトリル、エチレンスルホキシド、ＤＭＳＯ等が挙げられる。

フィーチャー位置の表面を活性化剤の流体組成物に接触させる際、一部のフィーチャー位置にのみ、又は表面上の全てのフィーチャー位置に流体組成物が接触するように接触させことができる。しかしながら、本発明の一態様では、表面上の少なくとも一部のフィーチャー間領域（複数可）も流体組成物と接触し、それによってまずはじめに流体組成物は表面のフィーチャー間領域の少なくとも一部と接触する。表面と流体組成物との接触は、パルスジェットから流体を吐出すること（例えば、複数の液滴を用いて、所望のマルチフィーチャー接触を得ることができる）、表面を浸水すること（当分野で既知のように、例えば、フローセルにおいて）などによる、都合の良いプロトコルを用いて実行することができる。代表的な実施形態では、表面と流体活性化剤組成物との接触は、約０．１μｓ〜約１０ｓに及ぶ間（例えば、約１μｓ〜約１ｓ）維持される。

一態様では、流体活性化剤組成物は、基材表面から除去される。この流体除去ステップの特徴は、複数のフィーチャー位置には固体活性化剤をもたらし且つ上記介在するフィーチャー間領域には活性化剤を実質的にもたらさないように、流体組成物が基材表面から除去されることである。活性化剤が実質的に存在しないとは、フィーチャー間領域に存在する活性化剤の量が、質量／面積に関して、フィーチャー位置に存在するそれの１０％未満（例えば、５％未満、１％未満、例えば０．５％未満、０．１％未満又はそれ以下）であることを意味する。従って、或る実施形態では、例えば図２に示すように、４つのフィーチャーによって囲まれたフィーチャー間領域が有する活性化剤の量は、質量／面積に関して、それを取り囲むフィーチャー位置内に存在するものの１０％未満（例えば、５％未満、１％未満、例えば０．５％未満、０．１％未満又はそれ以下）である。

或る特定の実施形態では、流体活性化剤組成物の除去には、溶媒蒸発の前に、バルク流体の除去が含まれる。或る実施形態では、バルク流体の除去は、表面のフィーチャーには流体組成物の液滴をもたらすが、表面のフィーチャー間領域にはあったとしてもわずかしかもたらさないような制御された所定の速度にて、流体表面から流体活性化剤組成物を排出することを包含する。或る実施形態では、流体組成物が表面から除去される速度は、約１ｍｍ／ｓ〜約３０ｃｍ／ｓの範囲（例えば、約１ｃｍ／ｓ〜約１０ｃｍ／ｓ）である。

一態様では、バルク流体の除去（例えば、上述のようなもの）によって、フィーチャー位置上部には流体活性化剤組成物の液滴を有するが、フィーチャー間領域には流体活性化剤組成物を有さないような基材表面の製造に帰着する（即ち、基材のフィーチャーに流体活性化剤組成物の液滴が存在する）。バルク流体の除去（例えば、上述のようなもの）後の、所与のフィーチャー位置にある所与の流体活性化剤組成物の流体の容積は、例えば、具体的流体組成物の特性並びにフィーチャーのサイズによって変化し得るが、或る実施形態では、約０．１ｐＬ〜約１００ｐＬの範囲（約０．５ｐＬ〜約２０ｐＬ等）とし得る。上述の方法によって製造された表面上の流体活性化剤組成物の液滴の代表的な画像を図６に示す。

先に検討したように、一態様では、流体活性化剤組成物は、低沸点溶媒を含む。従って、バルク流体の除去後、基材表面を溶媒が蒸発するのに十分な条件に維持することによって、表面のフィーチャー内に固体活性化剤組成物をもたらすことができる。表面を、プロセスのこの蒸発段階に維持する条件は変化させ得るが、代表的な実施形態では、約０℃〜約８０℃の温度範囲（約２５℃〜約４０℃等）とし得る。溶媒の蒸発速度を高めるために、適切な気体（例えば空気、窒素、ヘリウム、アルゴン）を表面上で循環（例えば加圧気体源に表面を暴露することによって）させることができる。

上記のプロトコルは、表面上の全てとはいかないまでも、少なくとも幾つかのフィーチャーに固体活性化剤試薬が存在するような表面の製造をもたらす。さらに、表面のフィーチャー間領域には、完全ではないにせよ、実質的に固体活性化剤がない。用いる具体的プロトコルによって、フィーチャーが完全ではないにせよ、実質的に固体活性化剤で覆われる一方、フィーチャー間領域には固体活性化剤が全くない。

得られた活性化剤含有表面は、アレイ製造（例えば、１つ又は複数のポリマーリガンドを官能化表面に接触させるようなポリマーリガンド付着によるもの、又は以下により詳細に記載するｉｎ−ｓｉｔｕポリマーリガンド合成によるもの）などの種々の用途において使用することができる。本発明の態様に従って製造された活性化剤含有表面の特徴は、これらが、ｉｎ ｓｉｔｕリガンドアレイ製造における基材として用いるのに特に適することである。

ｉｎ−ｓｉｔｕ合成方法には、ペプチドアレイ合成に関する米国特許第５，４４９，７５４号、並びにホスホラミダイト又は他の化学物質に使用されるポリヌクレオチド（特に、ＤＮＡ）の合成に関するＷＯ９８／４１５３１、並びにそれらの中で引用された文献に記載されるものが挙げられる。さらに、ｉｎ ｓｉｔｕ方法の詳細は、米国特許第６，２４２，２６６号、米国特許第６，２３２，０７２号、米国特許第６，１８０，３５１号、米国特許第６，１７１，７９７号、米国特許第６，３２３，０４３、及び米国特許出願第０９／３０２，８９８号（全て、先に参照したもの）に提示される。

先に検討したように、かかるｉｎ−ｓｉｔｕ合成法は、以下の手順の繰り返しである：（ａ）上記のように適切に活性化した基材表面又は既に付着した脱保護モノマーのうちのいずれかと結合させるべく、基材上の所定の位置に保護モノマーを付着させること；（ｂ）付着したモノマーが直後に付着した保護モノマーと反応し得るように、付着したモノマーを脱保護すること；及び（ｃ）結合させるための他の保護モノマーを付着させること。完成したアレイにおいて必要とされれば、或るサイクルの間に種々のモノマーを基材上の種々の領域に付着させることで、完成したアレイの異なる領域に異なるバイオポリマー配列を担持させることができる。各繰り返しにおいて、１つ又は複数のさらなる中間ステップ（酸化ステップ及び洗浄ステップ等）が必要とされ得る。

このような実施形態では、モノマーを含有する大量の流体（「流体モノマー」）を、固体活性化剤を含むフィーチャー位置（例えば、上述のようにして設けられる）に付着させる。一態様では、付着した流体モノマーは、一般に、既に表面上に付着した活性化剤と混合される。混合作用は、モノマーを含む液滴を、フィーチャー位置の乾燥した活性化剤と衝突させることにより、都合よく起こすことができる。

流体モノマーと接触すると、活性化剤は、流体モノマー中に存在するモノマーの第一の結合基（例えば、ｉｎ ｓｉｔｕ核酸製造に使用されるモノマーに存在するようなホスホラミダイト基）を活性化させ、それによって、活性化された基は、ヒドロキシ成分などの基材結合成分（例えば、それが最初の残基である場合にはシラン誘導体化表面上に、又は既に付着した残基上に、存在する）と結合し、その結果、付着された第２のモノマーが、直に又はポリマーリガンドの１つ若しくは複数の介在モノマー残基を介して、基材表面と共有結合するようになる。

所望のバイオポリマーが合成されるまで、活性化剤の付着及び流体モノマーの付着から成る上記ステップを、アレイ上の所望の各フィーチャー領域において繰り返すことができる。しかしながら、バイオポリマー合成の分野で既知のように、中間の酸化ステップ、脱保護ステップ、洗浄ステップ、及び他のステップを、サイクル間で実施し得ることを理解されたい。基材上に製造する所望のアレイ（複数可）にとって必要であれば、複数のサイクルにわたって、複数の領域に異なるモノマー若しくは同じモノマーを用いて、これらのサイクルを繰り返すことができる。

本発明の実施形態では、少なくとも２つの異なるポリマーが、基材表面の異なるフィーチャー領域に製造される。異なるとは、２つのポリマーが、モノマー単位の配列において互いに異なることを意味する。基材表面上に製造される異なるポリマーの数は、製造するアレイの所望の性質、例えばポリマー構造の所望の密度によって変化し得る。一態様では、アレイの表面上に製造される異なるポリマーの数は、少なくとも約５、例えば少なくとも約１０であり、少なくとも約１００を含み、この数は１，０００，０００以上もの高い数であってもよい。しかしながら、或る実施形態では、約５００，０００を越えず、或る他の実施形態では、約１００，０００を超えない。

本発明の一実施形態によるｉｎ ｓｉｔｕ製造プロトコルを、図４に示す。これらの図は一定の縮尺ではなく、幾つかの特徴部は、明確にするために誇張されている。適切な官能性成分（例えばヒドロキシ基）が、形成されることになる各フィーチャーの位置又は領域に少なくとも存在するものと考えることとする。例えば、官能性成分は、各フィーチャーの位置に付着し且つ脱保護されたヌクレオシドモノマー上に存在し、それによって、当該官能性成分は、他の活性化されたヌクレオシドモノマーと結合するのに利用可能となる。あるいはまた、官能性成分は、上述のように、基材１０に既に結合した（例えば、シラン誘導体化プロトコルにおいて）適切な基とし得る。

図４は、製造するアレイの或る領域のみを示している。溶媒を含む流体活性化剤組成物の液滴４０を、上述の本発明の一様態に従って、フィーチャー位置に与える。次いで、流体組成物の溶媒を蒸発させて、基材１０上のフィーチャー位置に固体活性化剤の層４２を形成することができる。本書に説明したような、典型的な液滴容積並びに用い得る溶媒を考えれば、この蒸発は、１秒未満で実施することができる（また、０．５秒未満又は０．２５秒未満でさえも完了し得る）。次いで、ヌクレオシドホスホラミダイトモノマーなどのバイオモノマー溶液の液滴４４を、フィーチャー位置に付着させる。或る実施形態では、この液滴４４は、図４に示すように、活性化剤層４２によって覆われる範囲よりも広い範囲又は狭い範囲を覆うことができる。層４２の固体活性化剤は、最初のバイオモノマーの結合基（詳細には、ヌクレオシドモノマーのホスホラミダイト基）を活性化し、それによって、活性化された基は、表面の官能性成分（例えば、基材１０に既に結合している官能基（ヒドロキシ基など）、又は事前のサイクルにおいて付着され、脱保護されたヌクレオシドモノマー上に存在する）と結合することができる。

所望のバイオポリマーが合成されるまで、図４に図示する上記ステップを、フィーチャー位置又は領域において繰り返すことができる。しかしながら、オリゴヌクレオチド等のバイオポリマー合成の分野において既知であるように、中間の酸化ステップ、脱保護ステップ、洗浄ステップ及び他のステップが、サイクル間で必要となり得ることを理解されたい。これらのサイクルは、基材１０上に所望のアレイ１２（複数可）を製造するのに必要であれば、複数のサイクルにわたって、複数の領域に異なるバイオモノマー又は同じバイオモノマーを用いて繰り返すことができる。

本発明の上記プロトコルによって、以下により詳細に説明するように、種々の用途において用い得る化学（例えばリガンド）アレイが製造される。

リガンドが予め製造された状態でアレイの表面上に付着されるか、又はこれらの前駆体の付着によってｉｎ ｓｉｔｕにて表面上で製造されるかに関わらず、両アプローチに共通するステップは、官能化された表面上に２つ以上のリガンドを製造することである。或る実施形態の特徴は、これら２つ以上の異なるリガンド若しくは前駆体が、基材表面の別個の領域又は区画上に（例えば、パルスジェット付着によって）付着されることである。

また、本発明の方法において用いるように構成されたパルスジェット流体付着装置も提供する。種々のアレイ製造用パルスジェット流体付着装置が当分野において知られており、米国特許第４，８７７，７４５号、同第５，３３８，６８８号、同第５，４４９，７５４号、同第５，４７４，７９６号、同第５，６５８，８０２号、同第５，７００，６３７号、同第５，９５８，３４２号、同第６，２８４，４６５号、及び同第６，３０６，５９９号に記載されるものが含まれる。多くの実施形態において、本発明のパルスジェット付着装置の特徴は、本発明の方法に従ってそれらにアレイ製造させるようなプログラミングを含むことである。

次に図５を参照すると、その上に基材１０を載せることのできる基材ステーション２０を備える、本発明の一態様によるシステムが示される。ピン１８又は同様の手段（図示せず）を基材ステーション２０上に設けることにより、基材ステーション２０上の或る位置に基材１０をほぼ位置決めすることができる。基材ステーション２０には、基材１０が多くの場合ガラスで作られるため、これらの上に過度の圧力を加えることなく基材１０を保持するために、適切な真空源（図示せず）に接続された吸入チャックを備えることができる。一態様では、浸水ステーション（フローセル）６８が設けられており、これは、図５に破線で図示するように、基材１０がステーション６８に配置される場合に、基材１０の表面全体をｉｎ ｓｉｔｕプロセスで使用される流体に暴露することができ、また全てのフィーチャーは、各サイクル（例えば、酸化剤、脱保護剤、及び洗浄バッファー）の間、及び上記のような表面と流体活性化剤組成物との接触の間、これに暴露されなければいけない。

一態様では、パルスジェットヘッドを重ねたパルスジェットヘッドアセンブリ２１０が、ヘッドリテーナ２０８により保持されている。或る態様では、パルスジェットヘッドは、流体活性化剤の容器に動作可能に接続されたパルスジェットを備える。配置システムは、プロセッサー１４０により制御される第１のトランスポーター６０と接続されたキャリッジ６２、及びプロセッサー１００により制御される第２のトランスポーター４５を含む。トランスポーター６０及びキャリッジ６２を用いて、吐出ヘッドアセンブリ２１０に面するステーション２０（その結果、配置された基材１０）を矢印６３の方向に動かすことによって、その１つの軸位置を達成すると共に、トランスポーター４５を用いることで、軸２０４の向きに、ヘッドリテーナ２０８（その結果、ヘッドアセンブリ２１０）の位置の調節を達成することができる。このように、トランスポーター４５を用いて、軸２０４の方向に基材１０上のラインに沿ってヘッドアセンブリ２１０を動かすことによってヘッドアセンブリ２１０はライン毎に移動することができると共に、トランスポーター６０によって軸６３の方向における基材１０のライン毎の動きが達成される。また、トランスポーター６０は、基材ホルダー２０を動かすことにより、浸水ステーション６８の真下に基材１０を配置することができる。また、ヘッドアセンブリ２１０は、もう１つの適切なトランスポーター（図示せず）によって、垂直方向２０２に動かすことも可能である。当然のことながら、他の配置を使用することもできる。また、適切な構成では、トランスポーター６０及びトランスポーター４５の両方又はこれらの一方を、基材に対するヘッドアセンブリ２１０の前述の動きを実施するために用いることができるは理解されよう。従って、本発明において、或る要素（ヘッドアセンブリ２１０等）を他の要素（ステーション２０又は基材１０の一方等）に関して「配置する」という場合、任意の要求される動きは、いずれかの要素又はこれら両方の組み合わせを動かすことによって達成することができることが理解されよう。ヘッドアセンブリ２１０、配置システム、及びプロセッサー１４０が共に、本発明による装置１００の付着システムとして作動する。エンコーダ３０は、ホルダー２０の正確な位置（その結果、ヘッドアセンブリの位置）のデータを提供する。直線位置のデータを提供する任意の好適なエンコーダ（光学エンコーダ等）を使用することができる。

ヘッドアセンブリの各パルスジェットヘッドは、１つ又は複数の液滴吐出オリフィス及びイジェクタの対応するセットに関連し、イジェクタはチャンバー内で、各オリフィスとは反対側に位置している。パルスジェットヘッドは、サーマルパルスジェットヘッド、圧電パルスジェットヘッド等をはじめとする、任意の適切なパルスジェットを用いることができ、これらの異種のパルスジェットヘッドは当業者に既知である。以下の付加的な記載は、主に、サーマルパルスジェットヘッド装置に関して提示するが、或る実施形態では、圧電装置を使用することができ、本発明の範囲内であり得る。

一態様では、各イジェクタは、プロセッサー５０の制御下で加熱要素として機能する電気抵抗の形態である（圧電素子を代用してもよいが）。関連するイジェクタを備える各オリフィスとチャンバ部分とは、対応するパルスジェットヘッドを画定する。イジェクタに対し電気パルスを１回印加すると、対応するオリフィスから液滴を吐出するであろう。ヘッドアセンブリ３０のヘッドの或る要素は、Hewlett-Packard CO.製の品番ＨＰ５１６４５Ａのような市販のサーマルインクジェットヘッド装置の部品を採用することができる。あるいはまた、単独のヘッドの代わりに複数のヘッドを用いることができ、独立した動きのために、プロセッサー１４０の制御下にあるトランスポーターがそれぞれ与えられる。この代替的な構成では、各ヘッドは、対応するモノマー又は活性化剤を吐出することができる。

パルスジェットの１回の作動イベントで排出される流体の量は、特にオリフィス直径、オリフィス長（オリフィスでのオリフィス部材の厚さ）、付着チャンバーのサイズ、及び加熱要素のサイズをはじめとする、１つ又は複数の多くのパラメータを変えることによって制御することができる。１回の作動イベントの間に排出される流体の量は、通常約０．１ｐＬ〜１，０００ｐＬ、一般的には約０．５ｐＬ〜約５００ｐＬ、及びより一般的には約１．０ｐＬ〜約２５０ｐＬの範囲である。流体がチャンバーから排出される一般的な速度は、約１ｍ／ｓより速く、通常約１０ｍ／ｓより速く、約２０ｍ／ｓ以上ほどの速さであってもよい。当然のことながら、イジェクタが作動する際に、オリフィスが受容表面に対して動いている場合は、材料の実際の付着部位は、作動時にオリフィスの見通し線上にある(in a line-of-sight relation to)位置ではないが、所与の距離及び速度に関して予測可能な位置であろう。

上述のように、図５に示すシステムのパルスジェットヘッドは、活性化剤吐出ヘッドを備えていないが、代わりに流体活性化剤組成物の供給源と動作可能に接続されていないヘッドを備える。モノマーを供給すべく構成されたパルスジェットヘッドが作動することによって、所望のように及び／又はプログラミングされた命令に従って、各フィーチャー位置に大量のモノマーを供給することができる。一旦、パルスジェットヘッドアセンブリが、基材の所望の長さ又は幅を移動すると、パルスジェットアセンブリは新たな列の開始位置へと進むことができる。或る特定の実施形態では、所与のヘッドのパルスジェットの数は、モノマーの供給に必要な数へと制限されており、それによって、パルスジェットから流体活性化剤組成物を付着させるプロトコルに用いられるヘッドと比べて少ない。或る特定の実施形態では、ヘッドの数はわずか４であっても、又は４（例えば、４つの標準的なホスホラミダイトの各々に関して１つ）の倍数、例えば８、１２、１６、２０、２４であってもよい。

当該装置は、さらに、ディスプレイ３１０及びオペレーター入力装置３１２を備えることができる。オペレーター入力装置は、例えば、キーボード、マウス、又は同様の入力装置とし得る。プロセッサー１４０は、メモリにアクセスし、パルスジェットヘッドアセンブリ２１０（特に本明細書中のイジェクタの作動）、配置システムの操作、パルスジェットヘッドにより付着される各パルスジェットの操作、及びディスプレイ３１０の操作を制御する。メモリ３２６には、磁気記憶装置、光学記憶装置、又は半導体記憶装置等のプロセッサ１４０がデータ３２４を保存及び取り出すことのできる任意の好適な装置を用い得る。プロセッサ１４０は、本発明で要求されるステップ全てを実行するために、必要なプログラミングコードを有するコンピュータ読み取り可能媒体から適切にプログラミングされる汎用デジタルマイクロプロセッサ、又は同等のステップが行われるであろう任意のハードウェア若しくはソフトウェアの組み合わせを含み得る。プログラミングは、プロセッサ１４０に対して離れた位置で提供することができ、また上記これらの装置のいずれかを用いてメモリ３２６若しくは他の何らかの携帯用コンピュータ読み取り可能媒体又は固定式コンピューター読み取り可能媒体等のコンピュータプログラム製品に前もって保存することができる。

また、本発明による装置を制御するプログラミングを提供する。例えば、プログラミングは、先に検討したように、活性流体で基材表面を浸水し、次いで、表面のフィーチャー位置に固体活性化剤を生成するように、表面から流体を除去するよう装置を制御することができる。プログラミングはさらに、ユーザからの入力の選択に従って、パルスジェットヘッド及びパルスジェットを制御し、アレイを形成することができる、例えば、ユーザにはグラフィカルインターフェースを介して、形成し得るアレイの型に関する複数の選択肢が提示され得る。入力装置を介してユーザーは、形成されるアレイの型を選択することができ、プログラミングが本発明に従って装置を制御し、ユーザーにより選択されたアレイを形成する。

本書記載の方法の態様に従って、装置の操作を説明することとする。一態様では、メモリ３２６は、ターゲットアレイに対するターゲット駆動パターンを提供する命令を有し、これは、例えば、基材１０上の各スポット又は各フィーチャーに対するターゲット位置及び寸法を含み得る。命令は、例えば、トランスポーター６０及びトランスポーター４５により実行され得る移動コマンド、並びにヘッド２１０及び基材１０の移動と連動してヘッド２１０に配置される各パルスジェットに対する発射コマンドをさらに含み得る。一態様では、このターゲット駆動パターンは、所望のターゲットアレイパターンに基づいており、適切なソース（入力装置３１２、携帯磁気媒体若しくは携帯光学媒体、若しくはリモートサーバからの、プロセッサ１４０と通信し得る任意のもの）から入力されるか、又は（これまでに言及した任意の適切なソースを用いて）入力ターゲットアレイパターン及びこれまでに既知の装置の操作パラメータに基づきプロセッサ５０により決定するかのいずれかとし得る。ターゲット駆動パターンをもたらすための命令を有するメモリは、装置のヘッドアセンブリ２１０及び配置システムに対して、フィーチャーが形成される各領域に活性化剤を付着させるための命令をさらに含み得る。パルスジェットには、４つの異なるモノマーを充填することができる。一態様では、浸水ステーション６８には、流体活性剤組成物をはじめとする、全ての必要な溶液が充填されている。以下の順序の操作は、別途指示のない限り、最初にオペレーターが起動した後は、プロセッサー１４０によって制御される。

一実施形態では、任意の所与の基材１０に関して、基材１０が、手動又は自動のいずれかで、基材ステーション２０上に載せられる。ターゲットアレイパターンを得るのに必要なターゲット駆動パターンは、装置の操作パラメータに基づいて、プロセッサ１４０により決定される（未提供の場合）。次いで、一態様では、装置は、以下のように操作される：（ａ）最初のサイクルでない場合、基材１０を浸水ステーション６８に配置し、形成するアレイの全領域に関して、浸水ステーション６８において、固体活性化剤並びに基材１０上に既に付着及び結合しているモノマーを脱保護する；（ｂ）ヘッドアセンブリ２１０から液滴を受容するよう基材１０を動かし、液滴（複数可）を付着させることで、各領域上に適切な第２のモノマーを吐出し、それによって最初の結合基を活性化剤で活性化し、既に脱保護化されたモノマーと結合させる；（ｃ）必要に応じて、基材全体にわたる酸化ステップ、保護ステップ及び洗浄ステップ、並びに付加的な固体活性化剤付着のために、基材１０を浸水ステーション６８に戻す；並びに（ｄ）所望のアレイが完成するまで、所望のアレイの全ての領域に関して上述のサイクルを繰り返す。

本発明の態様には、ホスホラミダイト液滴が表面の所望のフィーチャー位置に付着したか否かの検査のみが必要とされるような品質制御プロトコルが含まれる。従って、本方法を用いれば、２つ以上の液滴が適切に位置合わせされた状態で同じフィーチャー内に付着したか否かを判定する必要はない。本発明の実施形態において用いられる品質制御プロトコルでは、例えば上述のような付着後の乾燥した活性化剤のパターン化表面を最初に探すことができ、そこに存在する乾燥した活性化剤を有するフィーチャーは、活性化剤を欠くフィーチャー間領域とは異なって見えるはずである（例えば、グレースケールが異なる）。次いで、所与のフィーチャー位置にホスホラミダイト流体を付着させた後に、流体が所望の位置に実際に付着していることを確認するために検査することができる。そして、当該プロセスは、プロトコルの反復毎に繰り返すことができる。フィーチャー上に液滴として活性化剤も付着されるプロトコルと比較すると、２つの液滴が適切に付着しているか否かを検査及び決定する必要がない。従って、本発明の態様には、固体活性化剤がフィーチャー位置に存在するか否かを決定するために、例えば、上記のように活性化剤付着に続いて固体支持体の表面を検査すること、次いで表面のフィーチャー位置にわたってパルスジェットヘッドを配置し、パルスジェットヘッドを駆動すること、次いで、この駆動によりパルスジェットヘッドが表面のフィーチャー位置に液滴を正確に吐出したことを裏付けるためにフィーチャーを検査することを包含する方法が含まれる。

本発明は、ほとんど固体活性化剤を含まないフィーチャー間領域により隔てられた、固体活性化剤で占められたフィーチャーを有する基材を提供する。試薬との接触時に、所望の活性化作用をもたらすのに十分である限り、所与のフィーチャー内に含まれる固体活性化剤の量は変化させることができる。

本発明はまた、上記のような方法によって製造されるポリマー結合剤又はリガンドのアレイを提供する。アレイは、例えば、基材表面上の異なる既知の位置に固定化された（例えば、共有結合した）、モノマー配列の異なる、少なくとも２つの異なるモノマーを含む。或る特定の実施形態では、アレイの、異なるポリマー配列の各々は、通常、基材表面上に、ポリマーの複数のコピーから成る組成物として（例えば、基材表面上のスポットとして）存在する。アレイ上に存在する、異なるポリマー配列並びにスポットや類似の構造の数は変化させ得るが、通常少なくとも２であり、一般的には少なくとも５であり、より一般的には少なくとも１０であり、アレイの意図される用途に応じて、アレイ上の異なるスポットの数は、５０、１００、５００、１，０００、１０，０００、２５，０００又はそれより多くすることさえできる。アレイ表面上に存在する異なるポリマーのスポットは、或るパターンとして存在することができ、当該パターンは、スポットの組織化された行及び列の形態（例えば、基材表面にわたる格子状のスポット、基材表面にわたる一連の曲線、例えばスポットの一連の同心円又は半円等）であり得る。アレイ表面上に存在するスポットの密度は変化させることができ、少なくとも約１０スポット／ｃｍ^２（少なくとも約１００スポット／ｃｍ^２等）とすることができ、この密度は、１０^６スポット／ｃｍ^２より高くさえできるが、或る実施形態では、約１０^５スポット／ｃｍ^２を超えないであろう。

本発明のアレイの製造法に起因して、アレイ製品は、極めて均一な小さい直径のフィーチャーを有する高解像度アレイであり得る。高解像度とは、個々のフィーチャーの密度が高い密度を有することを意味する。高い密度とは、少なくとも約１００フィーチャー／ｃｍ^２（少なくとも約５００フィーチャー／ｃｍ^２等）であることを意味し、或る特定の実施形態では、この密度は、約５００〜約１０，０００フィーチャー／ｃｍ^２以上の範囲（約５００〜１０，０００フィーチャー／ｃｍ^２等）とし得る。或る実施形態では、フィーチャーは、約１，０００μｍを超えない直径（約１００μｍを超えないフィーチャー等）を有し、アレイ上の任意の２つのフィーチャーの直径の差の大きさがいずれも、直径の約２０％を超えない（例えば、直径の約５％を超えない）。この高解像度で均一な小さい直径のフィーチャーの特徴は、上記のようなｉｎ ｓｉｔｕ調製プロトコルを用いて達成することができる。

一態様では、本発明のアレイは、ポリマー結合剤又はリガンドから成るアレイである。このポリマー結合剤又はリガンドは、ペプチド、タンパク質、核酸、多糖、バイオポリマー結合剤等の合成模倣物のいずれかとし得る。対象となる代表的な実施形態では、アレイは、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、これらの合成模倣物等をはじめとする、核酸のアレイである。アレイが核酸アレイである場合、核酸は、核酸鎖に沿った任意の位置でアレイと共有結合し得るが、一般に、これらの末端（例えば３’末端又は５’末端）の一方にて結合する。他の実施形態では、アレイは、ポリペプチド（例えばタンパク質又はそれらのフラグメント）から成るアレイである。

上記のように製造した化学アレイは種々の用途において使用することができ、かかる用途には、所与のサンプル中の特定の検体の存在が定量的ではなくても少なくとも定性的に検出されるような検体検出用途、即ち、アレイＣＧＨアッセイ、位置分析アッセイ、核酸合成用途、遺伝子型同定等が含まれる。このようなアッセイを実行するプロトコルは、当業者に既知であり、本書において詳細に記載することはしない。一般的に、検体検出用途では、対象とする検体を含有していると考えられるサンプルを、アレイ上に存在する対応する結合対メンバーと検体とが結合するのに十分な条件下で、本方法によって製造したアレイと接触させる。従って、対象の検体がサンプル中に存在する場合、検体は、この相補的な結合メンバーの位置でアレイと結合し、複合体がアレイ表面上に形成される。次いで、アレイ表面上のこの結合複合体の存在を検出する（例えば、検体上に存在する同位体標識又は蛍光標識等の信号発生システムを用いて）。次いで、基材表面上の結合複合体を検出することにより、サンプル中の検体の有無が推定される。

対象となる特定の検体検出用途には、本発明の核酸アレイを用いたハイブリダイゼーションアッセイが含まれる。これらのアッセイでは、ターゲット核酸のサンプルを最初に調製するが、この場合、調製には、標識（例えば信号発生システム成分等）を用いたターゲット核酸の標識化が包含され得る。サンプルの調製に続いて、ハイブリダイゼーション条件下でサンプルをアレイと接触させ、これにより、アレイ表面に結合したプローブ配列と、それに相補的なターゲット核酸との間で複合体が形成される。次いで、ハイブリダイズされた複合体の存在を検出する。本発明のアレイを用いて実施し得る対象となる特定のハイブリダイゼーションアッセイとしては、遺伝子探索アッセイ、差次的遺伝子発現分析アッセイ、核酸配列決定アッセイ等が挙げられる。様々な用途におけるアレイの使用方法を記載した特許及び特許出願としては、第５，１４３，８５４号、同第５，２８８，６４４号、同第５，３２４，６３３号、同第５，４３２，０４９号、同第５，４７０，７１０号、同第５，４９２，８０６号、同第５，５０３，９８０号、同第５，５１０，２７０号、同第５，５２５，４６４号、同第５，５４７，８３９号、同第５，５８０，７３２号、同第５，６６１，０２８号、同第５，８００，９９２号が挙げられる。米国特許第６，６５６，７４０号、同第６，６１３，８９３号、同第６，５９９，６９３号、同第６，５８９，７３９号、同第６，５８７，５７９号、同第６，４２０，１８０号、同第６，３８７，６３６号、同第６，３０９，８７５号、同第６，２３２，０７２号、同第６，２２１，６５３号、及び同第６，１８０，３５１号もまた、関連する。或る実施形態では、本方法には、上記のような検出ステップ及び抽出ステップの少なくとも一方からのデータを、離れた位置に送信するステップが含まれる。

アレイが、ポリペプチド結合剤から成るアレイ（例えば、タンパク質アレイ）である場合、対象となる具体的用途は、米国特許第４，５９１，５７０号、同第５，１７１，６９５号、同第５，４３６，１７０号、同第５，４８６，４５２号、同第５，５３２，１２８号、及び同第６，１９７，５９９号、並びにＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９９／３９２１０、同ＷＯ００／０４８３２、同ＷＯ００／０４３８９、ＷＯ００／０４３９０、ＷＯ００／５４０４６、ＷＯ００／６３７０１、ＷＯ０１／１４４２５、及びＷＯ０１／４０８０３に記載のものをはじめとする、検体検出／プロテオミクス用途が含まれ、参照することで、これらの内容を本書に取り入れることとする。

従って、本発明の方法で製造したアレイを用いる場合、一般に、アレイは、サンプル（例えば、核酸若しくはタンパク質のような蛍光標識化された検体を含有するサンプル）に露出され、次いで、アレイは読み取られることになる。アレイの読み取りは、アレイ表面上の任意の結合複合体を検出すべく、アレイに光照射し、アレイの各フィーチャーで生じる蛍光の位置及び強度を読み取ることによって、達成することができる。例えば、Agilent Technologies（カリフォルニア州パロアルト）製のＡＧＩＬＥＮＴ ＭＩＣＲＯＡＲＲＡＹ ＳＣＡＮＮＥＲと同様のスキャナーをこの目的のために使用することができる。他の適切な装置及び方法は、米国特許第５，０９１，６５２号、同第５，２６０，５７８号、同第５，２９６，７００号、同第５，３２４，６３３号、同第５，５８５，６３９号、同第５，７６０，９５１号、同第５，７６３，８７０号、同第６，０８４，９９１号、同第６，２２２，６６４号、同第６，２８４，４６５号、同第６，３７１，３７０号、同第６，３２０，１９６号及び同第６，３５５，９３４号に記載される。しかしながら、アレイは、他の光学技術（例えば、化学発光標識の検出又はエレクトロルミネッセント標識の検出）、又は電気技術（各フィーチャーに、米国特許第６，２２１，５８３号等に開示された方法でフィーチャー位置でのハイブリダイゼーションを検出するための電極が設けられる）をはじめとする、他の読み取り方法を利用して、前述のものとは異なる任意の方法又は装置で読み取ることができる。読み取り結果は、未加工の結果（例えば、１つ又は複数のカラーチャネルにおける各フィーチャーに関する蛍光強度の読み取り値）、又は、既定の閾値に満たないフィーチャーに関しての読み取り値を排除し且つ／又はアレイからのパターンの読み取りに基づいて結論（特定のターゲット配列が、サンプル中に存在し得るか否か、又はサンプルを得た有機体が特定の条件を示すか否か等）を形成することによって得られたもののような加工済みの結果であり得る。読み取りの結果（加工済み又は未加工の）は、必要に応じてさらなる使用（さらなる処理等）のために、離れた位置に転送することができ（通信等によって）、そこで受け取ることができる。

或る実施形態では、上記方法には、上記のような検出ステップ及び抽出ステップの少なくとも一方からのデータを離れた位置へ送信するステップが含まれる。「離れた位置」とは、アレイが存在し且つハイブリダイゼーションが行われる位置以外の位置を意味する。例えば、離れた位置とは、同じ都市の別の位置（例えば、オフィス、研究所等）、異なる都市の別の位置、異なる州の別の位置、異なる国の別の位置等であり得る。したがって、或るものが、他のものから「離れている」という場合、それは、２つのものが、少なくとも異なる建物に存在すると共に、少なくとも１マイル、１０マイル、又は少なくとも１００マイル離れて存在し得ることを意味する。情報の「通信」とは、適切な通信チャネル（例えば、私設網又は公衆網）を介して、信号（例えば、電気信号、光信号、無線信号等）として情報を表すデータを送信することを意味する。ものを「転送する」とは、ものを物理的に輸送すること、又はそれ以外の方法で（可能である場合）、或る位置から他へと、ものを送る任意の手段を意味し、少なくともデータの場合においては、データを保有するか又はデータを通信する媒体を物理的に輸送することを含む。データは、さらなる評価及び／又は使用のために、離れた位置へ送信することができる。例えば、ファクシミリ、モデム、インターネット等の任意の都合の良い電気通信手段を、データを送信するために使用することができる。

従って、本発明の方法で製造したアレイを用いる場合、一般に、アレイは、サンプル（例えば、核酸若しくはタンパク質のような蛍光標識化された検体を含有するサンプル）に露出され、次いで、アレイは読み取られることになる。アレイの読み取りは、アレイ表面上の任意の結合複合体を検出すべく、アレイに光照射し、アレイの各フィーチャーで生じる蛍光の位置及び強度を読み取ることによって、達成することができる。例えば、Agilent Technologies（カリフォルニア州パロアルト）製のＡＧＩＬＥＮＴ ＭＩＣＲＯＡＲＲＡＹ ＳＣＡＮＮＥＲと同様のスキャナーをこの目的のために使用することができる。他の適切な装置及び方法は、米国特許第５，０９１，６５２号、同第５，２６０，５７８号、同第５，２９６，７００号、同第５，３２４，６３３号、同第５，５８５，６３９号、同第５，７６０，９５１号、同第５，７６３，８７０号、同第６，０８４，９９１号、同第６，２２２，６６４号、同第６，２８４，４６５号、同第６，３７１，３７０号、同第６，３２０，１９６号及び同第６，３５５，９３４号に記載される。しかしながら、アレイは、他の光学技術（例えば、化学発光標識の検出又はエレクトロルミネッセント標識の検出）、又は電気技術（各フィーチャーに、米国特許第６，２２１，５８３号等に開示された方法でフィーチャー位置でのハイブリダイゼーションを検出するための電極が設けられる）をはじめとする、他の読み取り方法を利用して、前述のものとは異なる任意の方法又は装置で読み取ることができる。読み取り結果は、未加工の結果（例えば、１つ又は複数のカラーチャネルにおける各フィーチャーに関する蛍光強度の読み取り値）、又は、既定の閾値に満たないフィーチャーに関しての読み取り値を排除し且つ／又はアレイからのパターンの読み取りに基づいて結論（特定のターゲット配列が、サンプル中に存在し得るか否か、又はサンプルを得た有機体が特定の条件を示すか否か等）を形成することによって得られたもののような加工済みの結果であり得る。読み取りの結果（加工済み又は未加工の）は、必要に応じてさらなる使用（さらなる処理等）のために、離れた位置に転送することができ（通信等によって）、そこで受け取ることができる。

検体検出アッセイに使用するためのキットも提供する。キットは、少なくとも、本発明のアレイを含む。キットは、サンプル調製試薬、バッファー、標識等の検体検出アッセイを実行するのに必要な、１つ又は複数の付加的な構成要素をさらに含むことができる。従って、キットは、バイアル又はボトル等の１つ又は複数の容器を含むこともでき、この場合、各容器は、アッセイ用の別個の成分並びに核酸ハイブリダイゼーションアッセイ等のアレイアッセイを実行するための試薬を含有している。上記キットはまた、検体を変性するための変性試薬、ハイブリダイゼーションバッファー等のバッファー、洗浄媒体、酵素基質、標識化ターゲット核酸サンプル等の標識化ターゲットサンプルを生成するための試薬、陰性コントロール及び陽性コントロール、並びにアレイに基づくアッセイを実行するためのアレイアッセイ装置の取扱説明書を含み得る。取扱説明書は、紙又はプラスチック等の下地に印刷することができる。従って、取扱説明書は、これらのキット又はこれらの構成要素の容器等のラベリングにおいて、添付文書としてキット内に存在し得る（即ち、パッケージング(packaging)又はサブパッケージング(sub-packaging)に関して）。他の実施形態では、取扱説明書は、適切なコンピューター読み取り可能記憶媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。

以下の実施例は、例示のために提示するものであり、限定の意はない。

ＤＮＡマイクロアレイは、標準的なＡｇｉｌｅｎｔ製造プロセスに従って製造された。Agilent Technologiesによって設計された自動化ツールを、以下のプロトコルに従って、シリル化された６．６２５×６インチのウェーハ上に標準的なホスホラミダイト化学物質を有するものと共に用いた。まずはじめに、用いた固体支持体は、平面の非孔性表面であった。第２に、結合ステップはインクジェット印刷技術を利用して空間的に制御されており、固体支持体上の適切な空間的位置に適切な量のホスホラミダイトが送出された。第３に、酸化反応及び脱トリチル化反応は、専用の(dedicated)フローセルで実施され、その機械的操作は以下に記載する。酸化溶液は、０．０２ＭのＩ_２のＴＨＦ／ピリジン／Ｈ_２０溶液であり、脱トリチル化溶液は、３％ＤＣＡのトルエン溶液だった。最後に、結合ステップ用の活性化剤は、後述するように送出した。

酸化反応及び脱トリチル化反応は、フローセルにおける浸水ステップにより実施した。フローセルは、マイクロアレイ基材を保持するガラス基材がリアクタチャンバの１つの壁を形成するように構築した。固定化したリアクタセルの周囲に埋め込んだシールを押し付けるように基材を持っていき、それによって、高いアスペクト比の封入チャンバを形成した。このアスペクト比は、平面のフローセルの幅Ｌと、側面の隙間の高さｈとの比として定義される。流体活性化剤試薬、洗浄溶媒及び気体を２つのポートを介して、フローセルに導入した。１つのポートは、セルの底面の角に位置しており、もう１つは、上端に位置していた。一連のソレノイドバルブによって、これら２つのポートへの試薬の流入及び流出を制御した。重力によって排出が促進されるようにフローセルの壁が垂直となるよう、フローセルを置いた。一般的な合成サイクルの間、フローセルが充填されるまで（充填時間）、最初に試薬を底部のポートからフローセルに導入した。次いで、酸化のための３０秒及び脱トリチル化のための６０秒間、試薬を混合することなく、フローセルに静置した。最後に、試薬を底部のポートから排出して（排出時間）、次いで、２フローセル量のアセトニトリル（ＡＣＮ）を用いて洗浄した。この量は、具体的なフローセルの形状に応じて、一般的に３０〜５０ｍＬであった。

結合反応用の活性化剤試薬の付着は、以下のように実施した。少なくとも１回の合成サイクルに関して、一般には１０サイクルに関して、ホスホラミダイト試薬の送出と同じインクシェットプロセスを用いて、活性化剤を空間的に送出した。これらの最初のサイクル後に、フローセルを使用して活性化剤を適切な位置に送出した。脱保護化サイクル（ＡＣＮ洗浄前の脱保護）の終了後、２５０ｍＭのテトラゾールのトルエン溶液をフローセルに導入し、１ｃｍ／ｓの速度で排出し、次いで、６０秒、Ｎ_２下で処理した。その後、インクジェット技術によってホスホラミダイトを送出するために、ウェーハを印刷モジュールへと転送した。溶媒として、トルエンの代わりに、９９：１のＡＣＮ：炭酸プロピレンを用いる場合、同様の結果が得られた。マイクロアレイ表面上で、不揮発性有機化合物をトルエン中に含有して成るモデル溶液を排出した効果を示す画像を、図６に示す。

理解が明瞭となるように図示及び例示するために、前述の発明をいくらか詳細に記載したが、本発明の教示に鑑みれば、添付の特許請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の変更及び修正を本発明に為し得ることは、当業者には容易に理解されよう。

従って、これまでの記載は、本発明の原理を単に説明するものに過ぎない。当然のことながら、当業者であれば、本明細書中に明記又は図示されていなくとも、本発明の原理を具体化し、この趣旨及び範囲内に包含される様々な構成の変更を案出できよう。さらに、本明細書中に記載される全ての例及び条件付けの用語は、本発明の原理及び本発明者によって当分野の進展のために与えられる概念を理解するのを助け、このような具体的に記載された例及び条件を制限することがないように構成されるように原則的に意図される。また、本明細書中の、本発明の原理、態様、及び実施形態並びにこれらの具体例を記載している全ての記述は、これらの構造的な等価物及び機能的な等価物の両方を包含するように意図される。さらに、このような等価物は、現時点で既知である等価物及び将来開発される等価物、即ち、構造に関わらず同じ機能を発現する、開発される任意の構成要素の両方を含むように意図される。従って、本発明の範囲は、本明細書中に図示及び記載される例示的な実施形態に限定されるものではなく、本明細書の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲において具体化されている。

本発明の態様による方法によって製造することができる、アレイを保持する基材を示す図 複数のスポット（即ち、フィーチャー）を示す図１の部分拡大図 図２記載の基材の部分拡大図 アレイの１つのフィーチャーを形成する際の、本発明の一態様による方法における各段階を示す拡大断面図 本発明の一実施形態によるｉｎ ｓｉｔｕアレイ製造装置の概略図 本発明の一態様によって製造される基材表面の図

Claims (18)

1. 固体支持体の表面上にあるフィーチャー位置に活性化剤試薬を提供する方法であって、
   （ａ）前記表面に前記活性化剤試薬を含む流体活性化剤組成物を接触させることであって、
   （ｉ）前記表面が、前記フィーチャー位置とは異なる濡れ性を有するフィーチャー間領域により隔てられた複数のフィーチャー位置を含み、
   （ｉｉ）前記接触させることが、前記流体活性化剤組成物が複数の前記フィーチャー位置及び任意の介在するフィーチャー間領域を覆うように実施される、接触させること、及び
   （ｂ）前記複数のフィーチャー位置には固体活性化剤がもたらされるが、前記介在するフィーチャー間領域には実質的に活性化剤がもたらされないように、前記表面上の前記流体活性化剤組成物から流体を除去すること
   を包含する、方法。
2. 前記接触させることが、全ての前記フィーチャー位置が前記流体活性化剤組成物で覆われるように実施される、請求項１に記載の方法。
3. 前記接触させることが、前記表面を前記流体活性化剤組成物で浸水させることを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記除去することが、前記流体活性化剤組成物を、前記表面から約１ｍｍ／ｓ〜約３０ｃｍ／ｓの範囲の速度で排出することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記排出後に前記基材表面上に残留する流体活性化剤組成物の液滴から溶媒を蒸発させることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記流体活性化剤組成物が、活性化剤試薬及び低沸点溶媒を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記低沸点溶媒が、アセトニトリルである、請求項６に記載の方法。
8. 前記流体活性化剤組成物が、少なくとも２つの異なる溶媒を含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記表面上のフィーチャー内にリガンドを生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記表面の２つの異なるフィーチャー内に少なくとも２つの異なるリガンドを生成することを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記生成することが、前記表面上に、予め製造されたリガンドを付着させることを含む、請求項９に記載の方法。
12. 前記生成することが、前記表面上に、リガンド前駆体を付着させることを含む、請求項９に記載の方法。
13. 前記リガンドが、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド−核酸、及び核酸から選択される、請求項９に記載の方法。
14. 前記ポリヌクレオチドが、デオキシリボ核酸である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記基材が、ガラスである、請求項１に記載の方法。
16. 固体活性化剤が前記フィーチャー位置内に存在するか否かを判定するために、請求項１記載の固体支持体の表面を検査すること、
    前記表面のフィーチャー位置にパルスジェットヘッドを配置し、前記パルスジェットを駆動させること、及び
    前記駆動によって前記パルスジェットヘッドが流体液滴を前記表面の前記フィーチャー位置上に正確に付着させたことを確認するために、前記フィーチャーを検査すること
    を包含する、方法。
17. 請求項１記載の方法に従って製造された表面を有する基材。
18. 請求項９記載の方法に従って製造された化学アレイ。