JP2007212438A - Cancer diagnostic agent and cancer diagnostic kit - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、癌の診断に利用することのできる癌診断剤、癌診断用キットおよび癌の重篤度の評価方法または予後診断方法に関する。より詳細には大腸癌、胃癌等の消化器癌の診断に利用することのできる診断剤および診断用キット、および上記癌の重篤度の評価方法および予後診断方法に関する。 The present invention relates to a cancer diagnostic agent, a cancer diagnostic kit, a method for evaluating the severity of cancer, or a prognosis diagnostic method that can be used for diagnosis of cancer. More specifically, the present invention relates to a diagnostic agent and a diagnostic kit that can be used for diagnosis of digestive organ cancers such as colorectal cancer and gastric cancer, and a method for evaluating the severity and prognosis of the cancer.
現在、様々な腫瘍マーカーが報告されており、大腸癌や胃癌のマーカーとしては癌胎児性抗原（ＣＥＡ）や糖鎖抗原（ＣＡ１９−９）といったマーカーが報告されている。 Currently, various tumor markers have been reported, and markers such as carcinoembryonic antigen (CEA) and sugar chain antigen (CA19-9) have been reported as markers for colon cancer and gastric cancer.
しかしながらこれらのマーカーを指標とした場合は、その偽陽性率が高いことなどが問題とされており、より臨床所見と相関の高いマーカーが望まれていた。 However, when these markers are used as an index, a high false positive rate is a problem, and a marker having a higher correlation with clinical findings is desired.
本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、その目的は、癌、特に大腸癌、胃癌等の消化器癌をより正確に診断するための新規マーカーを見出し、これを利用した癌診断剤および癌診断用キットや、癌の重篤度の評価方法および予後診断方法を提供することを課題とするものである。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and its purpose is to find a novel marker for more accurately diagnosing cancer, particularly digestive organ cancer such as colorectal cancer, gastric cancer, etc., and cancer diagnosis using the same It is an object of the present invention to provide an agent, a cancer diagnostic kit, a method for evaluating the severity of cancer, and a method for prognosis.
本発明者らは、上記課題を解決すべく、癌と関連を有するマーカーについて、鋭意検索を行った結果、癌間質などの組織再構築部位に特異的に発現するテネイシンＣの高分子スプライシングバリアントと、大腸癌および胃癌とが密接な関係があることを見出した。そしてこのテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量を、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識する抗体を利用した診断剤や診断用キットで測定することにより、これらの癌の診断等に使用できることを見出した。また、前記テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量が前記癌の重篤度や手術的根治度と相関があることも見出し、本発明を完成した。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted extensive searches for markers associated with cancer, and as a result, tenascin-C high molecular splicing variants that are specifically expressed in tissue remodeling sites such as cancer stroma. And colon cancer and gastric cancer were found to be closely related. The inventors have found that the amount of the tenascin-C polymer splicing variant can be used for diagnosis of these cancers by measuring with a diagnostic agent or diagnostic kit using an antibody that recognizes tenascin-C polymer splicing variant. Further, the present inventors have found that the amount of the tenascin-C polymer splicing variant is correlated with the severity of the cancer and the surgical curative degree, and completed the present invention.
すなわち本発明は、以下のとおりのものである。
（１）テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識する抗体を含有することを特徴とする癌診断剤。
（２）テネイシンＣ 高分子スプライシングバリアントを認識する抗体が、次の抗体（ａ）または（ｂ）である（１）に記載の癌診断剤。
（ａ）テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内
を認識する抗体
（ｂ）テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よ
りＮアミノ末端側を認識する抗体
（３）抗体（ａ）が、テネイシンＣ のフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位のＢＣＤドメインを認識する抗体である（２）に記載の癌診断剤。
（４）抗体（ｂ）が、テネイシンＣの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体である（２）に記載の癌診断剤。
（５）癌が消化器癌である、（１）〜（４）に記載の癌診断剤。
（６）消化器癌が大腸癌または胃癌である、（５）に記載の癌診断剤。
（７）テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する第一の抗体を含む第一の試薬と、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側を認識する第二の抗体を含む第二の試薬とを含有することを特徴とする癌診断用キット。
（８）第一の試薬が固相化された第一の抗体を含む試薬であり、第二の試薬が標識された第二の抗体を含む試薬である（７）に記載の癌診断用キット。
（９）癌が消化器癌である、（７）または（８）に記載の癌診断用キット。
（１０）消化器癌が大腸癌または胃癌である、（９）に記載の癌診断用キット。
（１１）患者の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量を測定することを特徴とする癌の重篤度の評価方法。
（１２）癌が消化器癌である、（１１）に記載の癌の重篤度の評価方法。
（１３）消化器癌が大腸癌または胃癌である、（１２）に記載の癌の重篤度の評価方法。
（１４）患者の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量を測定することを特徴とする癌の予後判定方法。
（１５）癌が消化器癌である、（１４）に記載の癌の予後判定方法。
（１６）消化器癌が大腸癌または胃癌である、（１５）に記載の癌の予後判定方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) A cancer diagnostic agent comprising an antibody that recognizes tenascin-C polymer splicing variant.
(2) Tenascin C The cancer diagnostic agent according to (1), wherein the antibody recognizing the polymer splicing variant is the following antibody (a) or (b).
(A) An antibody that recognizes the alternative splicing site of the fibronectin III-like domain of tenascin C (b) An antibody that recognizes the N-amino terminal side of the alternative splicing site of the fibronectin III-like domain of tenascin C (3) Antibody ( The cancer diagnostic agent according to (2), wherein a) is an antibody that recognizes a BCD domain of an alternative splicing site of tenascin-C fibronectin III-like domain.
(4) The cancer diagnostic agent according to (2), wherein the antibody (b) is an antibody that recognizes an epidermal growth factor-like domain of tenascin-C.
(5) The cancer diagnostic agent according to (1) to (4), wherein the cancer is digestive organ cancer.
(6) The cancer diagnostic agent according to (5), wherein the digestive organ cancer is colon cancer or gastric cancer.
(7) A first reagent containing a first antibody that recognizes within the alternative splicing site of tenascin-C fibronectin III-like domain, and N amino terminal side recognition from the alternative splicing site of tenascin-C fibronectin III-like domain And a second reagent containing the second antibody.
(8) The cancer diagnostic kit according to (7), wherein the first reagent is a reagent containing a solid-phased first antibody, and the second reagent is a reagent containing a labeled second antibody. .
(9) The cancer diagnostic kit according to (7) or (8), wherein the cancer is digestive organ cancer.
(10) The cancer diagnostic kit according to (9), wherein the digestive organ cancer is colon cancer or gastric cancer.
(11) A method for evaluating the severity of cancer, comprising measuring the amount of tenascin-C polymer splicing variant in a body fluid of a patient.
(12) The method for evaluating the severity of cancer according to (11), wherein the cancer is digestive organ cancer.
(13) The method for evaluating the severity of cancer according to (12), wherein the digestive organ cancer is colon cancer or gastric cancer.
(14) A method for determining a prognosis of cancer, comprising measuring the amount of tenascin-C polymer splicing variant in a body fluid of a patient.
(15) The cancer prognosis determination method according to (14), wherein the cancer is digestive organ cancer.
(16) The method for determining the prognosis of cancer according to (15), wherein the digestive organ cancer is colon cancer or gastric cancer.
本発明の診断剤や診断キットによれば、癌、特に消化器癌の重篤度や予後と関連のあるテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの発現量を測定することができる。 According to the diagnostic agent and diagnostic kit of the present invention, it is possible to measure the expression level of tenascin-C polymer splicing variant that is related to the severity and prognosis of cancer, particularly digestive organ cancer.
従って、本発明の診断剤や診断キットは、消化器癌等の癌の診断はもとより、その重篤度の判定や予後の評価に有利に利用することができる。 Therefore, the diagnostic agent and diagnostic kit of the present invention can be advantageously used not only for diagnosis of cancer such as digestive organ cancer but also for determination of the severity and evaluation of prognosis.
本発明の癌診断剤（以下、「本発明診断剤」という）は、癌の新規マーカーとしてテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを利用し、これを検出、測定するものである。 The cancer diagnostic agent of the present invention (hereinafter referred to as “the diagnostic agent of the present invention”) detects and measures tenascin-C polymer splicing variant as a novel marker for cancer.
上記診断剤において、検出、測定の対象となるテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントは、テネイシンＣ（Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ）中にあるフィブロネクチンIII様ドメインがスプライシングされた結果生じるバリアントである。このテネイシンＣは、細胞外マトリックス糖タンパク質の１種であり、分子量約２５万以上のポリペプチドがＮ末端付近で、３分子でコイル上に合わさり、更に、２つのジスルフィド結合によって６量体を形成しているものである。各ポリペプチド鎖にはＮ末端側から、ＴＡドメイン、上皮増殖因子様ドメイン、フィブロネクチンIII様ドメイン、フィブリノーゲン様ドメインが含まれている（Ｊｏｎｅｓ Ｆ.Ｓ.ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｄｙｖ Ｄｙｎ ２０８：２３５−２５９）。 In the diagnostic agent, the tenascin-C polymer splicing variant to be detected and measured is a variant resulting from splicing of the fibronectin III-like domain in tenascin-C. Tenascin-C is a type of extracellular matrix glycoprotein. A polypeptide with a molecular weight of about 250,000 or more is combined on the coil with three molecules near the N-terminus, and a hexamer is formed by two disulfide bonds. It is what you are doing. Each polypeptide chain includes, from the N-terminal side, a TA domain, an epidermal growth factor-like domain, a fibronectin III-like domain, and a fibrinogen-like domain (Jones FS et al., (2000) Dyv Dyn 208: 235-259).
このうち、フィブロネクチンIII様ドメインは、基本的な８個の配列（１−８）が反復しており、その５番目と６番目との間に、９個のスプライシングされる反復配列（Ａ１−Ａ４、Ｂ、ＡＤ２、ＡＤ１、Ｃ、Ｄ）が選択的スプライシング部位として存在する。テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントは、この反復配列が７個（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、Ｃ、Ｄ）挿入されるもの、７個がさまざまな組み合わせで挿入されるもの、または全く挿入されないものが大部分であろうとされている。このうち、癌などの病変組織では７個のドメインが入ったものが多く発現しており、後半の３つの反復（Ｂ、Ｃ、Ｄ）が癌間質に比較的特異的であると考えられる。他方、選択的スプライシング部位は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）で切断されやすい部位であることが知られており、この部位のエピトープを測定に使用することにより、分子構造の保たれたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントのみを測定することができると考えられる。 Among these, in the fibronectin III-like domain, 8 basic sequences (1-8) repeat, and 9 spliced repeat sequences (A1-A4) between the 5th and 6th thereof. , B, AD2, AD1, C, D) are present as alternative splicing sites. Tenascin-C polymer splicing variants have 7 repeats inserted (A1, A2, A3, A4, B, C, D), 7 inserted in various combinations, or none at all Most of the things are going to be. Of these, lesions such as cancer are often expressed with 7 domains, and the latter three repeats (B, C, D) are considered to be relatively specific to the cancer stroma. . On the other hand, it is known that the alternative splicing site is a site that is easily cleaved by matrix metalloprotease (MMP). By using the epitope at this site for measurement, the tenascin-C polymer having a molecular structure maintained. It is believed that only splicing variants can be measured.
本発明診断剤で用いる、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識する抗体（以下、「抗テネイシンバリアント抗体」という）は、上記の分子構造の保たれたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを測定することができるものである。この抗体は、上記のいずれかのテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等を抗原として使用し、抗体産生の常法に従って製造されるものであり、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを測定可能なものであれば、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良く、特に制限されない。 An antibody that recognizes tenascin-C polymer splicing variant (hereinafter referred to as “anti-tenascin-variant antibody”) used in the diagnostic agent of the present invention can measure the tenascin-C polymer splicing variant that maintains the above-described molecular structure. Is. This antibody is produced according to the conventional method of antibody production using any of the above tenascin C polymer splicing variants or peptide fragments obtained therefrom as an antigen, and can measure tenascin C polymer splicing variants. As long as it is a polyclonal antibody, it may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and is not particularly limited.
上記抗テネイシンバリアント抗体の製造において、抗原として用いられるテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等としては、例えば、テネイシンＣを産生している組織もしくは培養細胞から抽出したもの、前記培養細胞の培養液中のテネイシンＣを濃縮・精製したもの、あるいはこれらのテネイシンＣをプロテアーゼ等の酵素もしくは化学的に断片化したものが挙げられる。また、ヒトやマウスのテネイシンＣのアミノ酸配列や塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｘ５６１６０、Ｄ９０３４３）等から、認識させたい特定の部位をコードするｃＤＮＡに一致するポリヌクレオチドを作製し、これを常法によりベクターに組み込み、このベクターを用いて大腸菌等の宿主微生物もしくは培養細胞を形質転換し、この大腸菌等の宿主微生物・培養細胞を培養して産生させたリコンビナントタンパク質や上記配列から特定の部位のアミノ酸配列に一致したポリペプチドを合成した後ニッケルカラム等で精製したもの等も挙げられる。 In the production of the anti-tenascin variant antibody, tenascin-C polymer splicing variant used as an antigen or a peptide fragment obtained therefrom is, for example, one extracted from a tissue or cultured cell producing tenascin-C, the cultured cell And those obtained by concentrating and purifying tenascin-C in the above culture medium, or those obtained by chemically or enzymatically fragmenting these tenascin-C. In addition, from a human or mouse tenascin-C amino acid sequence or base sequence (Accession No .: X56160, D90343), etc., a polynucleotide corresponding to a cDNA encoding a specific site to be recognized is prepared, and this is prepared by a conventional method. Recombinant protein produced by transforming a host microorganism or cultured cell such as Escherichia coli using this vector and culturing the host microorganism or cultured cell such as Escherichia coli, or the amino acid sequence of a specific site from the above sequence And the like, which are synthesized by synthesizing a polypeptide corresponding to the above and purified by a nickel column or the like.
本発明で使用する抗テネイシンバリアント抗体は、例えば、次のようにして製造することができる。まず上記したテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等を抗原とし、常法により、ウサギ、マウス等の動物を免疫する。次いで、このように免疫した動物から脾細胞を取得し、この脾細胞とマウスミエローマ細胞とを融合し、限界希釈法により目的とするクローンをクローニングすることによりハイブリドーマ細胞を得ることができる。この抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、例えばポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で行うことができる。最後に、上記のようにして得られた融合細胞を培養することにより、抗テネイシンバリアント抗体を得ることができる。 The anti-tenascin variant antibody used in the present invention can be produced, for example, as follows. First, animals such as rabbits and mice are immunized by a conventional method using the above-mentioned tenascin-C polymer splicing variant or a peptide fragment obtained therefrom as an antigen. Subsequently, spleen cells are obtained from the animal thus immunized, the spleen cells and mouse myeloma cells are fused, and the desired clone is cloned by a limiting dilution method, whereby hybridoma cells can be obtained. Fusion of the antibody-producing cells and myeloma cells can be performed in a high concentration polymer solution such as polyethylene glycol. Finally, an anti-tenascin variant antibody can be obtained by culturing the fused cells obtained as described above.
なお、上記の動物の免疫において、ペプチドを抗原として用いる場合には、エピトープのはっきりとしたモノクローナル抗体を作製することが可能である。また、動物に免疫を行う際に、内在性のテネイシンＣの影響を除くために、テネイシンＣ遺伝子欠損マウスを使用することが好ましい。そのような遺伝子欠損マウスを用いることにより、種交差性の高いモノクローナル抗体を得ることが期待できる。更に、この際に融合細胞の選択は公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法を用いて行うことが好ましく、ミエローマ細胞としては、融合した細胞を選択する方法が確立されている、ＨＧＰＲＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎ−ｇｕａｎｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いることが好ましい。このＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞は、代謝系の欠損のためにアミノプテリン非存在下では生存できないが、融合したハイブリドーマ細胞では、脾細胞よりＨＧＰＲＴが供給されるために、ＨＡＴ培地中で生存することができ、その結果非融合細胞と容易に分離することができる。更に、限界希釈法によりＨＡＴ培地中で増殖するものの抗体を産生しないクローンを除くことにより、クローニングを確立することができる。 In the animal immunization described above, when a peptide is used as an antigen, it is possible to produce a monoclonal antibody with a well-defined epitope. In order to remove the influence of endogenous tenascin-C when immunizing animals, it is preferable to use tenascin-C gene-deficient mice. By using such a gene-deficient mouse, it can be expected to obtain a monoclonal antibody having a high species crossing property. Further, at this time, selection of the fused cells is preferably performed using a known HAT (hypoxanthine / aminopterin / thymidine) selection method, and a method for selecting fused cells has been established as a myeloma cell. It is preferable to use a strain lacking HGPRT (Hypoxanthin-guanine phosphoboyltransferase). The myeloma cells of this HGPRT-deficient strain cannot survive in the absence of aminopterin due to a lack of metabolic system, but the fused hybridoma cells must survive in HAT medium because HGPRT is supplied from splenocytes. As a result, it can be easily separated from non-fused cells. Furthermore, cloning can be established by removing clones that grow in HAT medium but do not produce antibodies by limiting dilution.
また、得られたハイブリドーマ細胞の産生する抗体が、目的とする適当な部位を認識しているかどうかは、前記のように作製されたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等とウエスタンブロット法等を用いることにより、確認することが可能である。もしくは、プロテアーゼを用い酵素的にテネイシンＣの断片を作製し、反応するポリペプチドのアミノ酸解析を行い、認識する部位を決定することなどを行うこともできる。 In addition, whether the antibody produced by the obtained hybridoma cells recognizes an appropriate site of interest is determined by Western blotting with tenascin-C polymer splicing variants prepared as described above or peptide fragments obtained therefrom. It can be confirmed by using a law or the like. Alternatively, a Tenascin-C fragment can be enzymatically produced using a protease, the amino acid analysis of the reacting polypeptide can be performed, and the recognition site can be determined.
具体的に本発明診断剤で用いる、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを測定することのできる抗体の好ましい例としては、次のような抗体を挙げることができる。
（ａ）テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内
を認識する抗体
（ｂ）テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よ
りＮアミノ末端側を認識する抗体
Specific examples of antibodies that can be used in the diagnostic agent of the present invention and that can measure tenascin-C polymer splicing variants include the following antibodies.
(A) An antibody that recognizes within the alternative splicing site of tenascin-C fibronectin III-like domain (b) An antibody that recognizes the N-amino terminal side of the alternative splicing site of tenascin-C fibronectin III-like domain
具体的に、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体（抗体（ａ））を作製する場合には、例えば、次のようにすればよい。すなわち、前記選択的スプライシング部位内のいずれかのドメイン、好ましくは選択的スプライシング部位内のＢＣＤドメインをコードするｃＤＮＡのポリヌクレオチドをＰＣＲ法により作製し、これをｐＱＥベクター等のベクターに組み込む。次いでこのベクターを大腸菌等の宿主微生物に導入し、この宿主微生物をＬＢ培地で培養してリコンビナントタンパク質を産生させる。次いで、このリコンビナントタンパク質を上記した方法により動物に免役し、この動物から得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞を融合させハイブリドーマ細胞を作製する。このハイブリドーマ細胞の産生する抗体の認識部位を、上記免疫に用いたリコンビナントタンパク質を用いてクローニングする。最後に、このハイブリドーマ細胞を常法により培養することによって抗体（ａ）が得られる。 Specifically, when preparing an antibody (antibody (a)) that recognizes the alternative splicing site of tenascin-C fibronectin III-like domain, for example, the following may be performed. That is, a polynucleotide of cDNA encoding any domain in the alternative splicing site, preferably a BCD domain in the alternative splicing site, is prepared by the PCR method and incorporated into a vector such as a pQE vector. Next, this vector is introduced into a host microorganism such as Escherichia coli, and this host microorganism is cultured in an LB medium to produce a recombinant protein. Next, this recombinant protein is immunized to the animal by the method described above, and a spleen cell obtained from this animal and mouse myeloma cell are fused to produce a hybridoma cell. The recognition site of the antibody produced by this hybridoma cell is cloned using the recombinant protein used for the immunization. Finally, the antibody (a) is obtained by culturing the hybridoma cells by a conventional method.
また、具体的に、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側を認識する抗体（抗体（ｂ））を作製する場合には、例えば、次のようにすればよい。すなわち、ヒト神経膠芽細胞腫培養細胞Ｕ−２５１ＭＧの培養液からゲルろ過カラムとイオン交換カラムを用いて精製されたヒトテネイシンＣを抗原として上記した方法により動物に免疫し、この動物から得られた脾細胞と、マウスミエローマ細胞を融合させハイブリドーマ細胞を作製する。次いで、このハイブリドーマ細胞のうち、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側、すなわち、ＴＡドメイン、上皮増殖因子様ドメイン等、好ましくは上皮増殖因子様ドメインを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、例えば前記ドメインのリコンビナントタンパク質やその断片等を用いてクローニングする。最後に、このハイブリドーマ細胞を培養することによって抗体（ｂ）が得られる。 Moreover, specifically, when preparing an antibody (antibody (b)) that recognizes the N amino terminal side from the alternative splicing site of the tenascin-C fibronectin III-like domain, for example, the following may be performed. That is, an animal was immunized by the above-described method using human tenascin C purified from a culture solution of cultured human glioblastoma cell U-251MG using a gel filtration column and an ion exchange column, and obtained from this animal. Spleen cells and mouse myeloma cells are fused to produce hybridoma cells. Next, among the hybridoma cells, an antibody that recognizes the N amino terminal side of the alternative splicing site of tenascin-C fibronectin III-like domain, that is, TA domain, epidermal growth factor-like domain, preferably epidermal growth factor-like domain. The hybridoma cells to be produced are cloned using, for example, a recombinant protein of the domain or a fragment thereof. Finally, the antibody (b) is obtained by culturing the hybridoma cells.
以上のようにして得られるテネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体（ａ）（クローン名：１９Ｃ４ＭＳ）とテネイシンＣの選択的スプライシング部位のＮ末端側を認識する抗体（クローン名：４Ｆ１０ＴＴ）を産生するハイブリドーマ細胞（Ｈｕｍａｎ Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９Ｃ４ＭＳおよびＨｕｍａｎ Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ４Ｆ１０ＴＴ）をそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−１９０６４およびＦＥＲＭ Ｐ−１９０６３として、平成１４年１０月１０日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託した。 An antibody (a) (clone name: 19C4MS) that recognizes the alternative splicing site of the fibronectin III-like domain of tenascin-C obtained as described above and an antibody that recognizes the N-terminal side of the alternative splicing site of tenascin-C ( Clone name: 4F10TT) (Human Tenascin-C Hybridoma 19C4MS and Human Tenascin-C Hybridoma 4F10TT) as FERM P-19064 and FERM P-19063, respectively. Deposited at the Research Center for Biological Biology (Postal Code: 305-8586, 1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba, Ibaraki, Japan).
上記の寄託したハイブリドーマ細胞１９Ｃ４ＭＳは、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位のＢＣＤドメインを認識する抗体を産生するものであり、ハイブリドーマ細胞４Ｆ１０ＴＴはテネイシンＣの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体を産生するものである。 The deposited hybridoma cell 19C4MS produces an antibody that recognizes the BCD domain of the alternative splicing site of tenascin-C fibronectin III-like domain, and hybridoma cell 4F10TT recognizes the epithelial growth factor-like domain of tenascin-C. An antibody is produced.
上記の様にして得られるハイブリドーマ細胞を公知の方法により培養して、精製することにより、本発明診断剤で用いられるモノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマ細胞の培養は、培地中で培養することにより行うことが好ましい。また、マウス腹腔内にハイブリドーマ細胞を注射し、腹水からモノクローナル抗体を採取することもできる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法、硫安塩析法等の常法により精製することができる。 A monoclonal antibody used in the diagnostic agent of the present invention can be obtained by culturing and purifying the hybridoma cells obtained as described above by a known method. The culture of the hybridoma cells is preferably performed by culturing in a medium. In addition, a hybridoma cell can be injected into a mouse abdominal cavity, and a monoclonal antibody can be collected from ascites. The monoclonal antibody thus obtained can be purified by conventional methods such as affinity chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration, and ammonium sulfate salting out.
また、これらの抗体は必要により標識することができる。この標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、３２Ｐ、１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などが挙げられる。 These antibodies can be labeled as necessary. Examples of this labeling substance include horseradish peroxidase (hereinafter referred to as “HRP”), enzymes such as alkaline phosphatase, fluorescent substances such as fluorescein isocyanate and rhodamine, radioactive substances such as 32 P and 125 I, and chemiluminescent substances. .
かくして得られる抗体（ａ）および抗体（ｂ）を含有する本発明診断剤は、下記の免疫学的測定方法に用いることができる。 The diagnostic agent of the present invention containing the antibody (a) and the antibody (b) thus obtained can be used in the following immunological measurement method.
以上説明した抗体を利用する具体的な免疫学的測定方法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ, Ｅ, Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ, ７０, ４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）を挙げることができる。そして、これらの方法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点からはＥＬＩＳＡ法が好ましい。 Specific immunological measurement methods using the antibodies described above include radioisotope immunoassay (RIA method), ELISA method (Engvall, E, Methods in Enzymol, 70, 419-439 (1980)), Various methods used in general immunochemical measurement methods such as fluorescent antibody method, plaque method, spot method, agglutination method, octalony ("Hybridoma method and monoclonal antibody", R & D Planning Co., Ltd., Page 30 to page 53, March 5, 1982). These methods can be appropriately selected from various viewpoints, but the ELISA method is preferable from the viewpoints of sensitivity and simplicity.
より具体的に、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの測定について、ＥＬＩＳＡ法の一つであるサンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである。すなわち、まず、本発明の抗体（ａ）を担体に固相化し（工程（Ａ））、次いで、抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする（工程（Ｂ））。更に、これに各種濃度のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを含む検体を加え、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント−抗体複合体を生成させた後（工程（Ｃ））、標識した抗体（ｂ）を加え、固相化抗原−抗体複合体と結合させ（工程（Ｄ））、最後に、標識量を測定することにより、予め作成した検量線から検体中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの量を決定することができる（工程（Ｅ））。 More specifically, the procedure for measuring tenascin-C polymer splicing variant is described as follows, taking the sandwich method as one of the ELISA methods as an example. That is, first, the antibody (a) of the present invention is immobilized on a carrier (step (A)), and then the surface of the carrier on which the antibody is not immobilized is blocked with, for example, a protein unrelated to the antigen (step). (B)). Furthermore, after adding specimens containing various concentrations of tenascin-C polymer splicing variant to produce tenascin-C polymer splicing variant-antibody complex (step (C)), the labeled antibody (b) was added, Determine the amount of the tenascin-C polymer splicing variant in the sample from the calibration curve prepared in advance by binding to the immobilized antigen-antibody complex (step (D)) and finally measuring the amount of label. (Step (E)).
まず、工程（Ａ）において、抗体を固相化するために用いられる担体としては、特別な制限はなく、免疫化学的測定法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。また、抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば１０ｍＭのＰＢＳを挙げることができる。緩衝液中の抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０.０１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０.１〜２０μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０〜１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩のインキュベーションが適している。 First, in the step (A), the carrier used for immobilizing the antibody is not particularly limited, and any carrier commonly used in immunochemical measurement methods can be used. For example, a 96-well microtiter plate made of polystyrene or an amino group-bonded microtiter plate can be used. In order to immobilize the antibody, for example, a buffer containing the antibody may be added to the carrier and incubated. A known buffer can be used, for example, 10 mM PBS. The concentration of the antibody in the buffer can be selected from a wide range, but is usually about 0.01 to 100 μg / ml, preferably 0.1 to 20 μg / ml. When a 96-well microtiter plate is used as a carrier, it is preferably about 300 to 100 μl / well and about 20 to 150 μl / well. Incubation conditions are not particularly limited, but overnight incubation at about 4 ° C. is usually suitable.
また、工程（Ｂ）のブロッキングは、抗体を固相化した担体において、後に添加する検体中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ：大日本製薬製（コードＮｏ.ＵＫ−２５Ｂ））等の市販のブロッキング剤を使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを適量加え、約４℃で、一晩のインキュベーションをした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。 In addition, the blocking in the step (B) is because there may be a portion where the tenascin-C polymer splicing variant in the specimen added later is adsorbed regardless of the antigen-antibody reaction in the carrier on which the antibody is immobilized. To prevent it. As the blocking agent, for example, BSA or skim milk solution can be used. Alternatively, a commercially available blocking agent such as Block Ace (Block-Ace: manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. (code No. UK-25B)) can also be used. Specifically, although not limited thereto, for example, an appropriate amount of Block Ace is added to the antigen-immobilized portion, incubated at about 4 ° C. overnight, and then washed with a buffer solution. Is called.
次いで工程（Ｃ）において、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを含む検体を固相化抗体と接触させ、固相化抗体でテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを捕捉し、固相化抗体−テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント複合体を生成させる。反応は限定されるわけではないが、３７℃程度で約１時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７.２）および０.０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０の組成のものが好ましい。
Next, in step (C), the specimen containing the tenascin-C polymer splicing variant is brought into contact with the immobilized antibody, the tenascin-C polymer splicing variant is captured with the immobilized antibody, and the immobilized antibody-tenascin-C polymer splicing is detected. Generate a variant complex. The reaction is not limited, but may be performed at about 37 ° C. for about 1 hour. After completion of the reaction, the carrier is preferably washed with a buffer solution to remove unreacted proteins and the like. As the buffer used for this reaction, a composition of 10 mM PBS (pH 7.2) and 0.05% (v / v)
更に工程（Ｄ）において、固相化抗体に捕捉されたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの別のエピトープを認識する、標識抗体を加え、固相化抗体−テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体を形成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、前記したものが使用される。この工程（Ｄ）において使用される標識抗体の量は、担体に結合した固相化抗体に対して約５０００〜１００００倍、好ましくは最終吸光度が１.０〜１.５となるように希釈した標識抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いることができ、反応は限定されるわけではないが、約４℃で約３０分間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好ましい。以上の反応により、担体に抗体−テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体を結合することができる。 Further, in step (D), a labeled antibody that recognizes another epitope of the tenascin-C polymer splicing variant captured by the immobilized antibody is added, and the immobilized antibody-tenascin-C polymer splicing variant-labeled antibody complex To form. After completion of this reaction, it is preferable to wash the carrier with a buffer solution to remove unreacted proteins and the like. As the buffer used for this reaction, those described above are used. The amount of the labeled antibody used in this step (D) is about 5000 to 10,000 times that of the immobilized antibody bound to the carrier, preferably diluted so that the final absorbance is 1.0 to 1.5. It is desirable to react the labeled antibody. A buffer solution can be used for dilution, and the reaction is not limited, but it is preferable to carry out the reaction at about 4 ° C. for about 30 minutes, and to wash with the buffer after the reaction. Through the above reaction, the antibody-tenascin C polymer splicing variant-labeled antibody complex can be bound to the carrier.
最後に工程（Ｅ）において、固相化抗体−テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの量を算出することができる。 Finally, in step (E), a chromogenic substrate solution that reacts with the labeled substance of the immobilized antibody-tenascin C polymer splicing variant-labeled antibody complex is added, and the absorbance is measured to determine the tenascin C polymer splicing from the calibration curve. The amount of variant can be calculated.
標識抗体の標識物としては、前記したものが利用できるが、標識物として酵素であるペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と３,３’,５,５’−テトラメチルベンジン（以下「ＴＭＢ」という）を含む発色基質溶液を使用することができる。発色反応は、限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約２０分間反応させた後、２Ｎの硫酸を加えて酵素反応を停止させことにより行うことができる。ＴＭＢを使用する場合、発色は４５０ｎｍの吸光度により測定する。一方、標識物として、酵素であるアルカリホスファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。なお、既知の濃度のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた検量線を用いて、検体中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの濃度を算出できる。 As the labeled product of the labeled antibody, those described above can be used. When peroxidase which is an enzyme is used as the labeled product, for example, hydrogen peroxide and 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzine ( Hereinafter, a chromogenic substrate solution containing “TMB”) can be used. The color development reaction is not limited, but can be performed by adding a color development substrate solution and reacting at about 25 ° C. for about 20 minutes, and then adding 2N sulfuric acid to stop the enzyme reaction. When TMB is used, color development is measured by absorbance at 450 nm. On the other hand, when alkaline phosphatase, which is an enzyme, is used as a label, there is a method in which color is developed using p-nitrophenyl phosphate as a substrate, 2N NaOH is added to stop the enzyme reaction, and the absorbance at 415 nm is measured. Is suitable. The concentration of tenascin-C polymer splicing variant in the sample can be calculated using a calibration curve prepared in advance based on the absorbance of the reaction solution to which tenascin-C polymer splicing variant of known concentration is added.
本発明診断剤を用いて上記のような測定を行うためには、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体（抗体（ａ））を含む第一の試薬と、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側を認識する抗体（抗体（ｂ））を含む第二の試薬とを含有させた癌診断用キット（以下、「本発明キット」という）を利用すればよい。 In order to perform the above-described measurement using the diagnostic agent of the present invention, a first reagent containing an antibody (antibody (a)) that recognizes the alternative splicing site of the fibronectin III-like domain of tenascin-C, tenascin A cancer diagnostic kit (hereinafter referred to as “the kit of the present invention”) containing a second reagent containing an antibody (antibody (b)) that recognizes the N amino terminal side of the alternative splicing site of the fibronectin III-like domain of C ).
より好ましい本発明キットの例としては、本発明の抗体（ａ）を担体上に固相化し、本発明の抗体（ｂ）を上記した標識物質で標識化したキットを利用することが好ましい。このような本発明キットとしては、上記のようにして作製したものの他に、例えば、株式会社免疫生物研究所から市販されているＨｕｍａｎ Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｖａｒｉａｎｔｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｌ）−ＩＢＬ（製品番号２７７５１）を利用することもできる。 As a more preferred example of the kit of the present invention, it is preferable to use a kit in which the antibody (a) of the present invention is immobilized on a carrier and the antibody (b) of the present invention is labeled with the above-mentioned labeling substance. As such a kit of the present invention, in addition to those prepared as described above, for example, Human Tenascin-C High Molecular Weight Assay Kit (L) -IBL (product) commercially available from Immunobiological Laboratories, Inc. The number 27751) can also be used.
上記のように作製された本発明キットは、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを定量できるものである。これを用いて血清、ＥＤＴＡ血漿等の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを定量すれば癌の診断、重篤度の評価、予後判定等を行うことができる。 The kit of the present invention produced as described above can quantify the tenascin-C polymer splicing variant. If this is used to quantify tenascin-C polymer splicing variants in body fluids such as serum and EDTA plasma, cancer diagnosis, severity assessment, prognosis determination, and the like can be performed.
本発明キットを用いて癌の診断を行うには、まず、被験者から採取した体液を試料とし、この中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを定量する。次に、被験者の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量と健常者の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の平均値と比べる。そして被験者の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量が高い場合には癌と診断することができる。また、前記診断のためにカットオフ値を設ける場合には、例えば、平均値＋２ｘ標準偏差をカットオフ値として、この値より被験者の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量が高い場合には癌、低い場合には健常と判断する。 In order to diagnose cancer using the kit of the present invention, first, a body fluid collected from a subject is used as a sample, and the tenascin-C polymer splicing variant therein is quantified. Next, the amount of tenascin-C polymer splicing variant in the subject's body fluid is compared with the average value of the tenascin-C polymer splicing variant in the healthy subject's body fluid. When the amount of tenascin-C polymer splicing variant in the body fluid of the subject is high, cancer can be diagnosed. Further, when a cutoff value is provided for the diagnosis, for example, an average value + 2 × standard deviation is set as a cutoff value, and if the amount of tenascin-C polymer splicing variant in the body fluid of the subject is higher than this value, cancer If it is low, it is judged to be healthy.
また、本発明キットを用いて癌の重篤度の評価を行うには、上記診断と同様にして定量されたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量が、平均値＋２ｘ標準偏差をカットオフ値とした場合、このカットオフ値を超え経時的な測定により増加していく場合重篤度が進行していると評価する。 In order to evaluate the severity of cancer using the kit of the present invention, the amount of tenascin-C polymer splicing variant quantified in the same manner as in the above diagnosis is an average value + 2 × standard deviation as a cutoff value If it exceeds this cut-off value and increases over time, the severity is evaluated as progressing.
更に、本発明キットを用いて癌の予後の判定を行うには、上記診断と同様にして定量されたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量が、平均値＋２ｘ標準偏差をカットオフ値とした場合、このカットオフ値より測定値が低下していれば予後が良好であると評価する。 Furthermore, in order to determine the prognosis of cancer using the kit of the present invention, the amount of tenascin-C polymer splicing variant quantified in the same manner as in the above diagnosis, when the average value + 2 × standard deviation is the cut-off value, If the measured value is lower than the cutoff value, the prognosis is evaluated as good.
上記した本発明キットを用いて診断、重篤度の評価、予後の判定される癌としては、 大腸癌、胃癌、盲腸癌等の消化器癌が挙げられる。これらの癌の中でも大腸癌および胃癌が好ましい。 Examples of cancers that can be diagnosed, evaluated for seriousness, and prognostic using the kit of the present invention include gastrointestinal cancers such as colorectal cancer, gastric cancer, and cecal cancer. Among these cancers, colon cancer and gastric cancer are preferable.
以下に実施例により本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実 施 例 １
テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を
認識する抗体の作製：
（１）免疫原の調製
テネイシンＣのアミノ酸配列や塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｘ５６１６０）から、フィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位のＢＣＤドメイン（以下、単に「ＢＣＤドメイン」という）をコードするｃＤＮＡであるポリヌクレオチド（配列番号１）を常法により作製し、これをｐＱＥ−３１ベクター（キアゲン製）に組換え、大腸菌のコンピテントセル（ＪＭ−１０９）に導入した。この大腸菌を培養し、イソプロピル−β−Ｄ（−）チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した後一晩培養し、ｐＱＥ−３１ベクターに組込んだｃＤＮＡのリコンビナントタンパク質（配列番号２）を産生させた。大腸菌の細胞膜を破壊することによりリコンビナントタンパク質を抽出した後、Ｈｉｓ ｔｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）で精製した。
Example 1
Generation of an antibody that recognizes the alternative splicing site of tenascin-C fibronectin III-like domain:
(1) Preparation of immunogen cDNA encoding an alternative splicing site of a fibronectin III-like domain (hereinafter simply referred to as “BCD domain”) from the amino acid sequence and base sequence (Accession No .: X56160) of tenascin-C A polynucleotide (SEQ ID NO: 1) was prepared by a conventional method, recombined into a pQE-31 vector (manufactured by Qiagen), and introduced into a competent cell of E. coli (JM-109). This Escherichia coli is cultured, and isopropyl-β-D (−) thiogalactopyranoside (IPTG) is added and cultured overnight to produce a recombinant protein (SEQ ID NO: 2) of cDNA incorporated into the pQE-31 vector. I let you. Recombinant protein was extracted by disrupting the cell membrane of E. coli, and then purified with a His trap column (Pharmacia).
（２）モノクローナル抗体の作製
テネイシンＣの遺伝子欠失マウスは三重大学医学部付属動物実験施設で継体飼育されている、ＢＡＬＢ／Ｃに戻し交配されたものを用いた。上記（１）で作製したＢＣＤ部分のリコンビナントタンパク質の１００μｇとコンプリートアジュバントとを等量混合してエマルジョンを作製し、これをマウスに２週間の間隔で２回免疫した。更に、細胞融合３日前にマウスの尾静脈内に１００μｇのリコンビナントタンパク質を注射した。免疫したマウスから脾臓を摘出し、これから脾細胞懸濁液を調整し、脾細胞とマウスミエローマ細胞（Ｓｐ２／０）を５：１で混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液中で細胞融合を行い、ハイブリドーマ細胞を得た。
(2) Production of Monoclonal Antibody Tenascin-C gene-deficient mice used were backcrossed to BALB / C, reared at the animal experiment facility attached to Mie University School of Medicine. Emulsions were prepared by mixing equal amounts of 100 μg of the recombinant protein of the BCD part prepared in (1) above and complete adjuvant, and mice were immunized twice at intervals of 2 weeks. Furthermore, 100 μg of recombinant protein was injected into the tail vein of mice 3 days before cell fusion. The spleen is removed from the immunized mouse, and the spleen cell suspension is prepared therefrom. The spleen cell and mouse myeloma cell (Sp2 / 0) are mixed at 5: 1, and cell fusion is performed in a polyethylene glycol (PEG) solution. Hybridoma cells were obtained.
その後、ハイブリドーマ細胞を含むＰＥＧ溶液からＰＥＧを除去し、残ったハイブリドーマ細胞をＢｒｉｃｌｏｎｅ（Ｂｉｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）５％と２０％ＦＣＳを添加したＩＭＤＭに再浮遊し、９６穴マイクロプレートに１×１０５個／穴の濃度でまきこみ、ＣＯ２濃度７％、３７℃で培養を行った。４日後、ＨＡＴ培地を添加し、７〜１０日後に精製ヒトテネイシンＣを抗原としてプレートに吸着させ、培養液を反応させ、更に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを反応させることにより、抗体産生を確認した。クローンはＨＴ培地を用いて更に選択培養し、限界希釈法によってクローニングを２回繰り返した。 Thereafter, PEG was removed from the PEG solution containing hybridoma cells, and the remaining hybridoma cells were resuspended in IMDM supplemented with 5% Brickone (manufactured by BioResearch) and 1 × 10 5 cells in a 96-well microplate. / Welling was carried out at the concentration of the hole, and the culture was carried out at 37 ° C. with a CO 2 concentration of 7%. 4 days later, HAT medium was added, 7 to 10 days later, purified human tenascin C was adsorbed to the plate as an antigen, the culture solution was reacted, and further diluted peroxidase-labeled anti-mouse IgG was reacted to confirm antibody production did. The clone was further selectively cultured using HT medium, and cloning was repeated twice by the limiting dilution method.
（３）抗体の精製
ハイブリドーマ細胞を無血清培地のＧＩＴ培地（和光純薬）で細胞の８０％が死滅するまで抗体を産生させた。遠心（１,０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）により細胞を取り除いた後、硫酸アンモニウム５０％飽和状態にして４℃で一晩静置し、沈殿を遠心（１,０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）して回収した。この沈殿を２倍に希釈したｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＭＡＰＳ ＩＩｋｉｔ製）に溶解させた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ製）にＩｇＧを吸着させた。その後、ＰＢＳ透析を一晩行って抗体を精製した。
(3) Antibody Purification Hybridoma cells were produced in serum-free GIT medium (Wako Pure Chemical Industries) until 80% of the cells were killed. After removing the cells by centrifugation (1,000 rpm, 15 min), the solution was saturated with
実 施 例 ２
テネイシンＣの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体の作製：
（１）免疫原の調製精製
ヒトテネイシンＣは、オークヒル（Ａｕｋｈｉｌ Ｉ. ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｍａｔｒｉｘ １０：９８−１１１）の方法に従い、ヒト神経膠細胞株Ｕ２５１の細胞株から５０％硫酸アンモニウム飽和による塩析とＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ５００カラム、モノＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いて精製した。
Example 2
Generation of antibodies that recognize the epithelial growth factor-like domain of tenascin-C:
(1) Preparation and purification of immunogen Human tenascin-C was obtained from a cell line of human glial cell line U251 by 50% ammonium sulfate saturation according to the method of Oak Hill (Aukhil I. et al. (1990) Matrix 10: 98-111). It refine | purified using salting-out and Sephacryl S500 column and mono Q column (made by Pharmacia Biotech).
（２）モノクローナル抗体の作製および精製
テネイシンＣの遺伝子欠失マウスは三重大学医学部付属動物実験施設で継体飼育されている、ＢＡＬＢ／Ｃに戻し交配されたものを用いた。上記（１）で精製した精製ヒトテネイシンＣをマウスに免疫し、実施例１と同様の方法で、ハイブリドーマ細胞を得た。実施例１と同様の方法で、クローンのスクリーニングを行い、陽性クローンを培養し、培養上清から得られる抗体を精製した。
(2) Production and Purification of Monoclonal Antibody Tenascin-C gene-deficient mice were used that had been reared to BALB / C and were reared in the animal experiment facility attached to Mie University School of Medicine. Mice were immunized with the purified human tenascin C purified in (1) above, and hybridoma cells were obtained in the same manner as in Example 1. Clones were screened by the same method as in Example 1, positive clones were cultured, and antibodies obtained from the culture supernatant were purified.
実 施 例 ３
ウエスタンブロット法による抗体の認識部位の解析：
実施例１および実施例２で作製した抗体の認識部位をウエスタンブロット法により解析した。
Example 3
Analysis of antibody recognition sites by Western blotting:
The recognition site of the antibody prepared in Example 1 and Example 2 was analyzed by Western blotting.
（１）テネイシンＣの上皮増殖因子様ドメインのリコンビナントタンパク質の作製
マウステネイシンＣ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｄ９０３４３）の上皮増殖因子様ドメインのｃＤＮＡ配列（配列番号３）から、上皮増殖因子様ドメインの両端にプライマーを設計し、マウステネイシンＣのｃＤＮＡからＰＣＲにより、遺伝子を増幅し、ｐＳｅｃベクターに同部の遺伝子を組み込んだ。これを用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を形質転換し、テネイシンＣの上皮増殖因子ドメインのリコンビナントタンパク質（配列番号４）を発現させた。培養上清に分泌されたリコンビナントタンパク質をＨｉｓ ｔｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）で精製した。
(1) Preparation of recombinant protein of epithelial growth factor-like domain of tenascin-C From the cDNA sequence (SEQ ID NO: 3) of epithelial growth factor-like domain of mouse tenascin-C (Accession No .: D90343), Primers were designed, the gene was amplified from mouse tenascin-C cDNA by PCR, and the same gene was incorporated into the pSec vector. Using this, CHO-K1 cells were transformed to express the recombinant protein of the epithelial growth factor domain of tenascin-C (SEQ ID NO: 4). Recombinant protein secreted into the culture supernatant was purified with a His trap column (Pharmacia).
（２）ウエスタンブロット法による抗体の認識部位の解析
ポリアクリルアミド ゲル エレクトロフォレイシス（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）ＭＵＬＴＩＧＥＬ２／１５（第一化学薬品製）上で、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法を用いて電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）を行った。電気泳動されたタンパク質は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）へ電気的に転写した。メンブレンは０.５％スキムミルク添加５０ｍＭ トリス−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）でブロッキングし、０.１％スキムミルク添加ＴＢＳで１,０００倍に希釈した実施例１および実施例２で作製したモノクローナル抗体と一晩反応させ、０.１％スキムミルク溶液で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ−ｃｈａｉｎ：Ｂｉｏｒａｄ製）で５００倍に希釈して２次抗体として反応させ、洗浄後ＤＡＢ／Ｈ２Ｏ２溶液で発色させた。
(2) Analysis of antibody recognition site by Western blotting Electrophoresis (SDS) on polyacrylamide gel electrophoresis MULTIGEL 2/15 (manufactured by Daiichi Kagaku) using the method of Laemmli -PAGE method). The electrophoresed proteins were electrically transferred to Immobilon Transfer Members (MILLIPORE). The membrane was blocked with 50 mM Tris-buffered saline (TBS) supplemented with 0.5% skim milk and diluted 1,000-fold with 0.1% skim milk-added TBS and the monoclonal antibodies prepared in Example 1 and Example 2. React overnight, wash with 0.1% skim milk solution, dilute 500 times with peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG (H + L-chain: Biorad), react as a secondary antibody, and after washing, DAB / H 2 O Color was developed with two solutions.
ウエスタンブロットの結果を図１に示す。実施例２で作製したモノクローナル抗体（クローン名：４Ｆ１０ＴＴ）は幅広いバンドを認識し、特に、選択的スプライシング部位の挿入がないテネイシンＣと考えられる２１０ｋＤａ付近（図１のＬ）および７つのフィブロネクチンIII様の反復が挿入されたバリアントであると考えられる３００ｋＤａ付近（図１のＨ）に濃いバンドが見られた。この結果より、実施例２で作製したモノクローナル抗体は、ヒトテネイシンＣを認識するとともに、上皮増殖因子様ドメインと反応し、同ドメインを認識することを確認した。 The result of Western blotting is shown in FIG. The monoclonal antibody prepared in Example 2 (clone name: 4F10TT) recognizes a wide band, particularly around 210 kDa (L in FIG. 1) considered to be tenascin C without insertion of an alternative splicing site and seven fibronectin III-like ones. A dark band was seen around 300 kDa (H in FIG. 1), which is considered to be a variant with inserted repeats. From this result, it was confirmed that the monoclonal antibody prepared in Example 2 recognizes human tenascin C and reacts with the epidermal growth factor-like domain to recognize the domain.
一方、実施例１で作製したモノクローナル抗体（クローン名：１９Ｃ４ＭＳ）は３００ｋＤａ付近に濃いバンドがあるものの、２１０ｋＤａ付近のバンドは見られなかった。従って、このモノクローナル抗体は低分子のバリアントを認識せず高分子量のバンドのみを認識すると推測されたため、実施例１で作製したＢＣＤドメインのリコンビナントタンパク質を用いて同様にウエスタンブロットを行った。その結果を図２に示す。図２において、ＢＣＤドメインのリコンビナントタンパク質を示す３７ｋＤａ付近に濃いバンドが認められた。従って、実施例１で作製したモノクローナル抗体はＢＣＤドメイン、すなわち、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内において正常ではスプライシングされる反復を含む、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識することを確認した。 On the other hand, the monoclonal antibody (clone name: 19C4MS) prepared in Example 1 had a dark band around 300 kDa, but no band around 210 kDa was observed. Therefore, since it was presumed that this monoclonal antibody did not recognize a low molecular variant but only a high molecular weight band, Western blotting was similarly performed using the recombinant protein of the BCD domain prepared in Example 1. The result is shown in FIG. In FIG. 2, a dark band was observed around 37 kDa indicating a recombinant protein of the BCD domain. Thus, the monoclonal antibody produced in Example 1 recognizes the Tenascin C macromolecular splicing variant, which contains repeats that are normally spliced within the alternative splicing site of the Tenascin C fibronectin III-like domain. confirmed.
従って、実施例１で作製したモノクローナル抗体（１９Ｃ４ＭＳ）と実施例２で作製したモノクローナル抗体（４Ｆ１０ＴＴ）とを組合わせることにより、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを測定することができると判断された。 Therefore, it was determined that the tenascin-C polymer splicing variant can be measured by combining the monoclonal antibody (19C4MS) prepared in Example 1 and the monoclonal antibody (4F10TT) prepared in Example 2.
実 施 例 ４
サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築：
サンドイッチＥＬＩＳＡ法の構築は以下のように作製した。実施例１で作製したテネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識するモノクローナル抗体（１９Ｃ４ＭＳ）の１０μｇ／ｍｌの濃度調整液を１０μｌずつ９６ｗｅｌｌＥＬＩＳＡ用プレートに加えた。４℃で一晩反応させた後、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ３溶液にてブロッキングを行い、この状態をサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。実施例２で作製したテネイシンＣの選択的スプライシング部位のＮ末端側を認識する第二のモノクローナル抗体（４Ｆ１０ＴＴ）とＨＲＰとの結合抗体を標識抗体とした。これらのサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートと標識抗体の組合せでサンドイッチＥＬＩＳＡ系を作製した。標準テネイシンＣは実施例２（１）で作製した精製ヒトテネイシンＣを用い、既知のタンパク質量から得られる吸光度とタンパク質濃度の標準曲線をあらかじめ求め、実際のサンプル測定で得られる吸光度よりそのタンパク質量を測定した。
Example 4
Construction of sandwich ELISA system:
The sandwich ELISA method was constructed as follows. Ten μl of a 10 μg / ml concentration-adjusting solution of a monoclonal antibody (19C4MS) that recognizes the alternative splicing site of tenascin-C fibronectin III-like domain prepared in Example 1 was added to a 96-well ELISA plate. After reacting overnight at 4 ° C., blocking was performed with a 10% BSA / PBS / NaN 3 solution, and this state was used as a sandwich ELISA plate. The second monoclonal antibody (4F10TT) that recognizes the N-terminal side of the alternative splicing site of tenascin-C prepared in Example 2 and the HRP-bound antibody were used as a labeled antibody. A sandwich ELISA system was prepared by combining these sandwich ELISA plates and labeled antibodies. Standard tenascin-C uses the purified human tenascin-C prepared in Example 2 (1), obtains a standard curve of absorbance and protein concentration obtained from a known protein amount in advance, and determines the protein amount from the absorbance obtained from actual sample measurement. Was measured.
実 施 例 ５
ＥＬＩＳＡ法による大腸癌患者体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリア
ント量の測定：
実施例４で作製したＥＬＩＳＡ系を用いて、インフォームドコンセントを得た上で、健常者３７例および大腸癌患者１４８例（原発例１２８例および再発例２０例）について、入院時および術後経時的にＥＤＴＡ血漿を採取し、このＥＤＴＡ血漿を１０倍希釈したものを測定対象サンプルとしてテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント濃度を測定した。血漿サンプル中のテネイシンＣ高分子量バリアント濃度はｎｇ／ｍｌ、また数値は平均±標準誤差で表した。測定の結果を表１に示す。
Example 5
Measurement of the amount of tenascin-C polymer splicing variant in the body fluid of colorectal cancer patients by ELISA:
After obtaining informed consent using the ELISA system prepared in Example 4, 37 healthy subjects and 148 patients with colorectal cancer (128 primary cases and 20 recurrent cases) were hospitalized and postoperatively timed. EDTA plasma was collected and the tenascin-C polymer splicing variant concentration was measured using a 10-fold diluted EDTA plasma as a measurement sample. The concentration of tenascin-C high molecular weight variant in the plasma sample was ng / ml, and the value was expressed as mean ± standard error. The measurement results are shown in Table 1.
測定の結果、大腸癌患者の原発例および再発例中のテネイシンＣ濃度の平均は、健常者が２３.６４３±７.４９６ｎｇ／ｍｌであったのに対し、原発例が５２.６０１±３２.４３３ｎｇ／ｍｌおよび再発例が４１.０６±２２.６１１ｎｇ／ｍｌという結果となり、健常者中の濃度よりも有意に高値を認めた（統計処理はｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った）。 As a result of the measurement, the average tenascin-C concentration in primary and recurrent cases of colorectal cancer patients was 23.643 ± 7.496 ng / ml in healthy subjects, while 52.601 ± 32. The result of 433 ng / ml and recurrence was 41.06 ± 22.611 ng / ml, which was significantly higher than the concentration in healthy subjects (statistical processing was performed using student's t-test).
また、前記大腸癌患者の血漿１４８例について従来の大腸癌マーカーであるＣＥＡ濃度およびＣＡ１９−９濃度を、それぞれ三菱化学ヤトロン社製のＣＥＡ測定キットおよび東ソー株式会社製のＣＡ１９−９測定キットを用いて測定した。そして、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９およびテネイシンＣ高分子量バリアントを大腸癌マーカーとした場合の陽性率について、平均値＋２ｘ標準偏差で導き出される値をカットオフ値として算出した。その数値を、テネイシンＣ高分子量バリアントの陽性率と比較した結果を表２に示す。 Further, CEA concentration and CA19-9 concentration, which are conventional colorectal cancer markers, were used for 148 cases of plasma of colorectal cancer patients, respectively, using a CEA measurement kit manufactured by Mitsubishi Chemical Yatron and a CA19-9 measurement kit manufactured by Tosoh Corporation. Measured. And about the positive rate at the time of using CEA, CA19-9, and tenascin C high molecular weight variant as a colon cancer marker, the value derived by the average value + 2x standard deviation was computed as a cutoff value. Table 2 shows the result of comparing the numerical value with the positive rate of tenascin-C high molecular weight variant.
その結果、ＣＥＡおよびＣＡ１９−９を大腸癌マーカーにした場合の大腸癌患者の陽性診断効率はそれぞれ４１.２％、２４.３％であるのに対し、テネイシンＣ高分子量バリアントを大腸癌マーカーにした場合の陽性診断効率は５８.１％と、従来のマーカーを大きく上回るものであった。 As a result, when CEA and CA19-9 were used as colorectal cancer markers, the positive diagnostic efficiencies of colorectal cancer patients were 41.2% and 24.3%, respectively, whereas tenascin-C high molecular weight variants were used as colorectal cancer markers. In this case, the positive diagnosis efficiency was 58.1%, much higher than the conventional marker.
また、テネイシンＣ高分子量バリアントを大腸癌マーカーとした場合の陽性サンプル、陰性サンプルそれぞれについての平均ＣＥＡ濃度および平均ＣＡ１９−９濃度を求め、両サンプル間の有意差を測定したところ有意差は見られなかった（統計処理はｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った）。その結果を表３に示す。 Further, when the average CEA concentration and the average CA19-9 concentration were determined for each of the positive sample and the negative sample when the tenascin-C high molecular weight variant was used as a colorectal cancer marker, and a significant difference between the two samples was measured, a significant difference was observed. None (statistical processing was performed using student's t-test). The results are shown in Table 3.
実 施 例 ６
ＥＬＩＳＡ法による胃癌患者体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアン
ト量の測定：
胃癌患者１０９例について入院時にＥＤＴＡ血漿を採取し、実施例５と同様にテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント濃度を測定した。その結果、胃癌患者サンプル中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの濃度は５９.７１４±５４.２９０ｎｇ／ｍｌ（平均±標準誤差）と、健常者中の濃度２３.６４３±７.４９６ｎｇ／ｍｌよりも有意に高値であった。
Example 6
Measurement of the amount of tenascin-C polymer splicing variant in body fluid of gastric cancer patients by ELISA method:
EDTA plasma was collected at the time of hospitalization for 109 gastric cancer patients, and tenascin-C polymer splicing variant concentration was measured in the same manner as in Example 5. As a result, the concentration of the tenascin-C polymer splicing variant in the gastric cancer patient sample was 59.714 ± 54.290 ng / ml (mean ± standard error), which was higher than the concentration in the healthy subject 23.643 ± 7.496 ng / ml. Significantly higher.
実 施 例 ７
大腸癌の進行度とテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の相関：
実施例５の大腸癌患者１４８例について、癌の悪性度を表すＴＮＭ分類に従って分類した母集団ごとにテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の平均値を算出した。その結果を表４に示す（注：ｐ値の算出は分散分析法（ＡＮＯＶＡ）により行った）。その結果、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量は癌の進行度に応じて有意に上昇することが明らかとなった。
Example 7
Correlation between the progression of colorectal cancer and the amount of tenascin-C polymer splicing variant:
For 148 colorectal cancer patients of Example 5, the average value of the tenascin-C polymer splicing variant amount was calculated for each population classified according to the TNM classification representing the malignancy of cancer. The results are shown in Table 4 (Note: p value was calculated by analysis of variance (ANOVA)). As a result, it was clarified that the amount of tenascin-C polymer splicing variant significantly increases depending on the degree of cancer progression.
実 施 例 ８
盲腸癌の手術的根治度とテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の相関：
盲腸癌患者（５７歳、男性、ステージ３ａ）について、術前の２００５年１月２９日にＥＤＴＡ血漿をサンプリングし、実施例５の方法に従い、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量、ＣＥＡ量およびＣＡ１９−９量を測定した。その後２００５年２月５日に回盲部を切除。術後の２００５年４月９日に再びＥＤＴＡ血漿を採取し、前記３種のマーカーについて濃度の測定を行った。
Example 8
Correlation between surgical cure of cecal cancer and the amount of tenascin-C polymer splicing variant:
For patients with cecal cancer (57 years old, male, stage 3a), EDTA plasma was sampled on January 29, 2005 preoperatively, and according to the method of Example 5, the amount of tenascin-C polymer splicing variant, the amount of CEA and the CA19- Nine quantities were measured. Thereafter, the ileocecum was excised on February 5, 2005. EDTA plasma was collected again on April 9, 2005 after the operation, and the concentrations of the three markers were measured.
その結果、ＣＥＡ濃度は３.４ｎｇ／ｍｌから２.５ｎｇ／ｍｌ、ＣＡ１９−９濃度は１１.５Ｕ／ｍｌから１７.１Ｕ／ｍｌへ推移したのに対し、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント濃度は１０１.１７３ｎｇ／ｍｌから５０.８４５ｎｇ／ｍｌへ推移した。しかしながらこの時点でテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント濃度については、平均値＋２ｘ標準偏差で導き出したカットオフ値（３８.６３７ｎｇ／ｍｌ）よりも上のレベルであった。そこで、当患者を再検したところ、肝臓に癌転移が認められたため、２００５年６月７日に当該箇所を切除する再手術を行った。そしてその後２００５年７月４日に再度前記３種のマーカーについて測定を行ったところ、ＣＥＡ濃度およびＣＡ１９−９濃度についてはそれぞれ、２.５ｎｇ／ｍｌ、１６Ｕ／ｍｌであったのに対し、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント濃度については２２.３８２ｎｇ／ｍｌとカットオフ値以下となった。この結果から、癌の手術的根治度とテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント濃度陰転化との間に相関関係があることが明らかとなった。 As a result, the CEA concentration was changed from 3.4 ng / ml to 2.5 ng / ml and the CA19-9 concentration was changed from 11.5 U / ml to 17.1 U / ml, whereas the tenascin-C polymer splicing variant concentration was 101. It changed from .173 ng / ml to 50.845 ng / ml. However, at this time point, the tenascin-C polymer splicing variant concentration was at a level above the cutoff value (38.637 ng / ml) derived from the mean value + 2 × standard deviation. Therefore, when this patient was reexamined, cancer metastasis was observed in the liver, and on June 7, 2005, reoperation was performed to remove the site. Then, on July 4, 2005, the above three types of markers were measured again. The CEA concentration and the CA19-9 concentration were 2.5 ng / ml and 16 U / ml, respectively. The C polymer splicing variant concentration was 22.382 ng / ml, which was below the cutoff value. From this result, it became clear that there is a correlation between the surgical curative degree of cancer and the negative conversion of tenascin-C polymer splicing variant concentration.
本発明の癌診断剤および癌診断キットは各種癌の診断、重篤度の評価および予後の判定を診断するものとして好適に利用できる。 The cancer diagnostic agent and cancer diagnostic kit of the present invention can be suitably used for diagnosing various cancers, evaluating the severity, and determining the prognosis.
Claims (16)
（ａ）テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内
を認識する抗体
（ｂ）テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よ
りＮアミノ末端側を認識する抗体 The cancer diagnostic agent according to claim 1, wherein the antibody that recognizes tenascin-C high molecular splicing variant is the following antibody (a) or (b).
(A) An antibody that recognizes within the alternative splicing site of tenascin-C fibronectin III-like domain (b) An antibody that recognizes the N-amino terminal side of the alternative splicing site of tenascin-C fibronectin III-like domain
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