JP2007209233A - Electro-stimulator generating morbid electric signal and/or bio-electric signal - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体細胞又は組織等のための電気刺激装置、及び上記電気刺激装置を用いたモデル細胞の作成方法に関する。より詳しくは、本発明は、研究所等において実験で用いられる生体細胞又は組織等に特定の電気刺激を与えることによって、変性疾患モデルを形成したり、又は細胞の機能や形態を修飾することができる電気刺激装置に関する。 The present invention relates to an electrical stimulation apparatus for living cells or tissues, and a method for creating a model cell using the electrical stimulation apparatus. More specifically, the present invention can form a degenerative disease model or modify the function or form of a cell by giving a specific electrical stimulus to a living cell or tissue used in an experiment in a laboratory or the like. The present invention relates to an electrical stimulation device that can be used.
てんかん性痴呆や低酸素脳症のように神経細胞の過剰興奮がその直接的原因とされる変性疾患の治療法開発においては、効果的なin vitro病態モデルの開発は重要である。同様に、不整脈患者の心筋内で起る長期的変化、特に生化学的諸成分の合成に関わる遺伝子の発現等を簡便に調べられるin vitro モデルの開発も重要である。 Development of an effective in vitro pathologic model is important in the development of therapeutic methods for degenerative diseases in which neuronal hyperexcitability is directly caused, such as epileptic dementia and hypoxic encephalopathy. Similarly, it is important to develop an in vitro model that can easily examine long-term changes that occur in the heart muscle of arrhythmia patients, especially the expression of genes involved in the synthesis of biochemical components.
従来、生体の培養細胞や組織に興奮性神経伝達物質を大量投与する試みや通常の電気刺激装置を用いた電気刺激が行われてきた。しかしながら、興奮性神経伝達物質の大量投与では、刺激を受ける受容体の種類が興奮性神経伝達物質受容体に限定されてしまい、生体内での過剰興奮時に起こり得る多様な情報伝達分子に対する細胞応答が興奮性神経伝達物質受容体応答に偏った様式で表現される可能性がある。 Conventionally, attempts have been made to administer a large amount of excitatory neurotransmitters to cultured cells or tissues of a living body, and electrical stimulation using a normal electrical stimulation device has been performed. However, in large doses of excitatory neurotransmitters, the types of receptors that are stimulated are limited to excitatory neurotransmitter receptors, and cellular responses to various signaling molecules that can occur during hyperexcitation in vivo May be expressed in a manner biased towards excitatory neurotransmitter receptor responses.
一方、電気刺激によって惹起された過剰興奮は、より生理的に近いと考えられるが、従来の電気刺激装置では、電極の装着や狭いインキュベーター内での刺激の実行には煩雑さが伴い、電気生理実験を専門としていない生化学者やゲノム科学者など、多くの研究者にとっては困難を伴うものであった。また、培養環境下で比較的長時間の電気刺激を必要とするその他の基礎研究及び応用研究の分野においては、より簡便でコンパクトな電気刺激機能の付いた培養装置は、研究遂行上の強力な武器となり得る。 On the other hand, the excessive excitement caused by electrical stimulation is considered to be more physiologically close. However, in conventional electrical stimulation devices, the mounting of electrodes and the execution of stimulation in a narrow incubator are complicated, and electrophysiology It was difficult for many researchers, including biochemists and genomic scientists who do not specialize in experiments. In other basic and applied research fields that require relatively long periods of electrical stimulation in a culture environment, a simpler and more compact culture device with electrical stimulation functions is a powerful tool for conducting research. Can be a weapon.
本発明は、簡便性とコンパクト性を備え、生体の病態時及び/又は正常時の電気現象を培養細胞に簡単に供給することができる電気刺激装置を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、生体細胞又は生体組織(以下、「生体細胞等」ともいう)の成長過程において、生体細胞等に電気刺激を与え、細胞や組織の機能及び形態を修飾し、変性疾患モデルを作製することができる電気刺激装置を提供することを解決すべき課題とした。 An object of the present invention is to provide an electrical stimulation device that has simplicity and compactness and can easily supply an electrical phenomenon during a disease state and / or normal state of a living body to cultured cells. Furthermore, the present invention provides a degenerative disease model by applying electrical stimulation to living cells and the like in the growth process of living cells or tissues (hereinafter also referred to as “living cells and the like”) to modify the functions and forms of the cells and tissues. Providing an electrical stimulation device that can be manufactured was an issue to be solved.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、パルス電気信号を組み合わせることにより作成した生体の病態時及び/又は正常時の電気現象を、電気刺激プロトコールとして、データベース化して、デジタルICに保存し、上記デジタルICからの情報に基づいて上記電気刺激プロトコールとして電気信号を培養培地内に出力することによって、in vitroの脱髄性疾患モデル並びに高頻度刺激応答性を長期にわたって保持した心筋組織を作成することに成功した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。 As a result of diligent investigations to solve the above problems, the present inventors have created a database of electrical phenomena in the pathological state and / or normal state of a living body created by combining pulse electrical signals as an electrical stimulation protocol, and digitally An in vitro demyelinating disease model and high frequency stimulation responsiveness were maintained for a long time by storing in an IC and outputting an electrical signal into the culture medium as the electrical stimulation protocol based on the information from the digital IC Succeeded in creating myocardial tissue. The present invention has been completed based on these findings.
即ち、本発明によれば、(1)パルス電気信号の組み合わせからなる生体の病態時及び/又は正常時の電気現象情報が、電気刺激プロトコールとしてデータベース化されて保存されているデジタルICを少なくとも含む電流発生手段であって、上記デジタルICからの電気現象情報に基づいて上記電気刺激プロトコールとしてパルス電気信号を培養培地内に出力するための電流発生手段と、(2)前記電流発生手段を固着するためのキャップと、(3)前記キャップから懸垂され、かつパルス電流を電気刺激として培養容器内の培地に出力するために前記電流発生手段に連結された1対の電極とを有する、病態電気信号及び/又は生体電気信号を発生する電気刺激装置が提供される。 That is, according to the present invention, (1) at least a digital IC in which electrical phenomenon information at the time of pathological condition and / or normal state of a living body composed of a combination of pulsed electrical signals is stored as a database as an electrical stimulation protocol is stored. Current generating means for outputting a pulse electric signal into the culture medium as the electrical stimulation protocol based on the electrical phenomenon information from the digital IC; and (2) fixing the current generating means. And (3) a pathological electrical signal that is suspended from the cap and connected to the current generating means for outputting a pulsed current to the medium in the culture vessel as an electrical stimulus. An electrical stimulation device that generates bioelectric signals and / or is provided.
好ましくは、デジタルICは、ロジックIC、メモリーIC及びマイクロプロセッサから構成される。
好ましくは、生体の病態時の電気現象は、不整脈、てんかん、又は異常筋電図の電気現象である。
Preferably, the digital IC includes a logic IC, a memory IC, and a microprocessor.
Preferably, the electrical phenomenon during the pathological condition of the living body is an electrical phenomenon of arrhythmia, epilepsy, or abnormal electromyogram.
好ましくは、電流発生手段は、デジタルIC、マイクロスイッチ及び電源から構成されている。
好ましくは、異なる電気現象情報は、異なる電気刺激プロトコールとしてデジタルICに保存されており、電流発生手段の複数個の出力端子を並列に接続することにより、複数の電気刺激パターンの組み合わせを培養培地内に出力することができる。
Preferably, the current generating means includes a digital IC, a micro switch, and a power source.
Preferably, different electrical phenomenon information is stored in the digital IC as different electrical stimulation protocols, and a plurality of output terminals of the current generating means are connected in parallel, thereby combining a plurality of electrical stimulation patterns in the culture medium. Can be output.
好ましくは、電流発生手段は、キャップに一体形成されている。
好ましくは、キャップは、培養皿の形態に対応した形態を有する。
好ましくは、キャップは、マルチウェルプレートのウェル配列に対応した構造を有する。
Preferably, the current generating means is integrally formed with the cap.
Preferably, the cap has a form corresponding to the form of the culture dish.
Preferably, the cap has a structure corresponding to the well arrangement of the multi-well plate.
好ましくは、キャップを培養容器の標本配置部に嵌着することにより、前記培養容器内の培地に装入された生体細胞又は生体組織に前記電極からパルス電流が電気刺激として与えられる。 Preferably, a pulse current is applied as an electrical stimulus from the electrode to a living cell or a living tissue inserted in a culture medium in the culture container by fitting a cap to a specimen arrangement portion of the culture container.
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の電気刺激装置を用いて、培養容器内に培養されている細胞に生体の病態時及び/又は正常時の電気現象を供給し、病態時及び/又は正常時のモデル細胞を作成することを含む、モデル細胞の作成方法が提供される。 According to another aspect of the present invention, the above-described electrical stimulation device of the present invention is used to supply the cells cultured in the culture vessel with an electrical phenomenon during normal and / or normal conditions of the living body, And / or a method for producing a model cell, comprising producing a model cell at normal time.
好ましくは、培養した有髄神経の髄鞘構築細胞を選択的に変性させることによって、in vitroの脱髄性疾患モデルを作成する。
好ましくは、培養した中枢神経細胞に、てんかん発作時の脳波やシナプス活動に類似したパターンの電気刺激を出力しながら培養することによって、てんかん焦点の神経組織モデル標本を作成する。
Preferably, an in vitro demyelinating disease model is created by selectively degenerating cultured myelinated myelinating cells.
Preferably, an epileptic focus neural tissue model specimen is created by culturing the cultured central nerve cells while outputting electrical stimulation having a pattern similar to the electroencephalogram and synaptic activity during the epileptic seizure.
好ましくは、培養した心筋細胞又は心筋組織に、不整脈のペーシング電気活動に類似したパターンの電気刺激を出力しながら培養することによって、不整脈発生時の病態心筋モデル標本を作成する。
好ましくは、培養した心筋細胞や心筋組織に、正常なペーシング電気活動に類似したパターンの電気刺激を出力しながら培養することによって、高頻度刺激応答性を長期にわたって保持した心筋組織を作成する。
Preferably, a cultured myocardial cell or myocardial tissue is cultured while outputting an electrical stimulus having a pattern similar to the pacing electrical activity of the arrhythmia, thereby creating a myocardial model specimen at the time of occurrence of the arrhythmia.
Preferably, culturing myocardial tissue or myocardial tissue while outputting electrical stimulation having a pattern similar to normal pacing electrical activity to produce myocardial tissue that maintains high-frequency stimulation responsiveness over a long period of time.
本発明の電気刺激装置は、培養容器の主要回路搭載部である容器キャップに、デジタルICを含む電流発生手段と1対の電極を有する構造からなる。このため、本発明の電気刺激装置によれば、装置の作製が容易であると共に、同キャップの培養容器からの着脱が簡便である。また、本発明の電気刺激装置はキャップを交換するだけで、簡単に培養容器内の生体細胞等に任意の強度、波形を有するパルス電流を設定して与えることができ、培養過程において生体細胞等の機能と形態を適宜調整することができる。即ち、本発明の電気刺激装置は、所望のパルス電流を培養容器内の培地に電気刺激として与える装置としては、構造が簡単で製作が容易で安価である。また本発明の電気刺激装置のキャップは、簡便に脱着が可能である。 The electrical stimulation apparatus of the present invention has a structure in which a container cap, which is a main circuit mounting portion of a culture container, has a current generating means including a digital IC and a pair of electrodes. For this reason, according to the electrical stimulation device of the present invention, the device can be easily manufactured and the cap can be easily detached from the culture vessel. In addition, the electrical stimulation device of the present invention can simply set and give a pulse current having an arbitrary intensity and waveform to a living cell in a culture vessel by simply exchanging the cap. The function and form can be adjusted as appropriate. That is, the electrical stimulation device of the present invention is simple in structure, easy to manufacture, and inexpensive as a device that applies a desired pulse current to the culture medium in the culture vessel as electrical stimulation. Moreover, the cap of the electrical stimulation apparatus of the present invention can be easily detached.
また、本発明の電気刺激装置を用いれば、病態電気信号及び/又は生体電気信号を発生することができ、これにより生体細胞等の機能と形態の修飾や変性疾患モデルを作製することが可能である。本発明の細胞用電気刺激装置は、生理学、薬理学、生化学の分野のみならず、再生医学やゲノム科学の分野において有用である。 In addition, by using the electrical stimulation device of the present invention, it is possible to generate a pathological electrical signal and / or a bioelectric signal, thereby making it possible to modify the function and form of biological cells and the like or to create a degenerative disease model. is there. The cell electrical stimulation device of the present invention is useful not only in the fields of physiology, pharmacology, and biochemistry, but also in the fields of regenerative medicine and genomic science.
以下に、本発明の電気刺激装置、及びこの電気刺激装置を用いたモデル細胞の作成方法について詳細に説明する。 Below, the electrical stimulation apparatus of this invention and the preparation method of the model cell using this electrical stimulation apparatus are demonstrated in detail.
本発明の電気刺激装置は、病態電気信号及び/又は生体電気信号を発生することができる装置であって、具体的には、(1)パルス電気信号の組み合わせからなる生体の病態時及び/又は正常時の電気現象情報が、電気刺激プロトコールとしてデータベース化されて保存されているデジタルICを少なくとも含む電流発生手段であって、上記デジタルICからの電気現象情報に基づいて上記電気刺激プロトコールとしてパルス電気信号を培養培地内に出力するための電流発生手段と、(2)前記電流発生手段を固着するためのキャップと、(3)前記キャップから懸垂され、かつパルス電流を電気刺激として培養容器内の培地に出力するために前記電流発生手段に連結された1対の電極とを有することを特徴とする。先ず、本発明の電気刺激装置10の構成について、図面を参酌しながら以下に説明する。 The electrical stimulation device of the present invention is a device capable of generating a pathological electrical signal and / or a bioelectric signal, and specifically, (1) during a pathological condition of a living body consisting of a combination of pulse electrical signals and / or Electricity generation means including at least a digital IC in which electrical phenomenon information at normal time is stored as a database as an electrical stimulation protocol, and pulse electrical power is generated as the electrical stimulation protocol based on the electrical phenomenon information from the digital IC. Current generating means for outputting a signal into the culture medium; (2) a cap for fixing the current generating means; and (3) suspended from the cap and using a pulsed current as an electrical stimulus in the culture vessel. And a pair of electrodes connected to the current generating means for outputting to the culture medium. First, the configuration of the electrical stimulation device 10 of the present invention will be described below with reference to the drawings.
図1は、本発明の電気刺激装置の好適な一実施例を示した概略図である。図1において、符号1は、デジタルICを含む電流発生手段を固着するためのキャップ(以下、単に「キャップ」という)、符号2は培養容器標本配置部をそれぞれ表す。図1(A)に示されるように、キャップ1上にはプリント基板3がキャップ1と一体的に装着されている。プリント基板3上には電気回路4が形成されている。 FIG. 1 is a schematic view showing a preferred embodiment of the electrical stimulation device of the present invention. In FIG. 1, reference numeral 1 denotes a cap for fixing a current generating means including a digital IC (hereinafter simply referred to as “cap”), and reference numeral 2 denotes a culture vessel specimen arrangement portion. As shown in FIG. 1A, a printed circuit board 3 is mounted on the cap 1 integrally with the cap 1. An electric circuit 4 is formed on the printed circuit board 3.
図1における電気回路4は、ロジックIC、メモリーICならびにマイクロプロセッサ等を含むデジタルIC5と、ボタン電池6、マイクロスイッチ7及び発光素子(LED)8で構成されている。電極9,9’は、陽極と陰極とからなり、キャップ1を貫通してキャップ1内に吊り下げられて配置されている。 The electric circuit 4 in FIG. 1 includes a digital IC 5 including a logic IC, a memory IC, a microprocessor, and the like, a button battery 6, a micro switch 7, and a light emitting element (LED) 8. The electrodes 9, 9 ′ are composed of an anode and a cathode, and are arranged suspended through the cap 1 and suspended in the cap 1.
図2は、市販の35mmペトリディッシュの形状に適合させて製作した本発明の電気刺激装置の例である。 FIG. 2 is an example of the electrical stimulation device of the present invention manufactured by adapting to the shape of a commercially available 35 mm Petri dish.
次に、本発明の電気刺激装置について具体的に説明する。 Next, the electrical stimulation apparatus of the present invention will be specifically described.
本発明の電気刺激装置10は、キャップ1上に電流発生手段を有する。電流発生手段は、キャップ1に固着でき、かつ電気刺激パルスを発生させ、電気刺激パルスの強度、サイクル等を調整できるものであれば特に制限はない。電流発生手段は、好ましくは、図1に示されるようボタン電池6、マイクロスイッチ7及びLED8を含む電気回路4である。 The electrical stimulation device 10 of the present invention has a current generating means on the cap 1. The current generating means is not particularly limited as long as it can adhere to the cap 1 and can generate an electrical stimulation pulse and adjust the intensity, cycle, etc. of the electrical stimulation pulse. The current generating means is preferably an electric circuit 4 including a button battery 6, a microswitch 7 and an LED 8 as shown in FIG.
電流発生手段から供給される電気刺激パルスの波形、強度、サイクル等については、電気刺激を与える生体細胞等の種類、培養目的(成長促進又は成長抑制、さらには変性疾患モデル作製や機能と形態の修飾)に応じて適宜調整することができる。例えば、電気刺激パルスの波形については、三角形、矩形、その他の各種関数波形(例えば、サイン波形、指数関数波形など)などを挙げることができ、中でも矩形であることが好ましい。また、電気刺激パルスの強度は、生体細胞等の成長促進と成長抑制(損傷)の二つの培養目的に応じて適宜調整することができる。例えば、生体細胞等の成長促進や機能と形態の修飾を目的として培養する場合、電気刺激パルスの強度は0.1〜100mV/mmであり、0.5〜50mV/mmであることが好ましく、1〜25mV/mmであることがさらに好ましい。一方、生体細胞等の成長抑制や変性を目的として培養する場合、電気刺激パルスの強度は5〜500mV/mmであり、75〜250mV/mmであることが好ましく、50〜150mV/mmであることがさらに好ましい。また、電気刺激パルスのサイクルについては、例えば、0.001〜1000Hzであり、0.005〜100Hzであることが好ましく、0.01〜50Hzであることがさらに好ましい。また、電気刺激パルスの通電時間は、例えば、0.1μ秒〜10秒であり、0.5μ秒〜1秒であることが好ましく、1μ秒〜0.1秒であることがさらに好ましい。 Regarding the waveform, intensity, cycle, etc. of the electrical stimulation pulse supplied from the current generating means, the type of biological cells to which electrical stimulation is applied, the purpose of culture (growth promotion or growth suppression, and further, the creation of degenerative disease model, function and form It can be adjusted as appropriate according to the modification. For example, regarding the waveform of the electrical stimulation pulse, a triangle, a rectangle, and other various function waveforms (for example, a sine waveform, an exponential function waveform, etc.) can be exemplified, and among them, a rectangle is preferable. In addition, the intensity of the electrical stimulation pulse can be appropriately adjusted according to the two culture purposes of growth promotion and growth inhibition (damage) of living cells and the like. For example, when culturing for the purpose of promoting growth of biological cells or the like and modifying the function and form, the intensity of the electrical stimulation pulse is 0.1 to 100 mV / mm, preferably 0.5 to 50 mV / mm, More preferably, it is 1-25 mV / mm. On the other hand, when culturing for the purpose of inhibiting growth or denaturation of living cells, etc., the intensity of the electrical stimulation pulse is 5 to 500 mV / mm, preferably 75 to 250 mV / mm, and 50 to 150 mV / mm. Is more preferable. The cycle of the electrical stimulation pulse is, for example, 0.001 to 1000 Hz, preferably 0.005 to 100 Hz, and more preferably 0.01 to 50 Hz. The energization time of the electrical stimulation pulse is, for example, 0.1 μsec to 10 seconds, preferably 0.5 μsec to 1 sec, and more preferably 1 μsec to 0.1 sec.
キャップ1は、嵌着する培養容器標本配置部2のサイズ及び形状に対応させてサイズ及び形状を自由に選択することができる。例えば、キャップ1は、市販の35mm、60mm、90mm、150mmのペトリデイッシュ、6穴〜384穴マルチウェルプレート、及び直径10〜30mmの組織培養チューブに対応した円形キャップや、各種スクエアデイッシュに対応した方形キャップを用いることができる。好ましくは、キャップ1は、マルチウェルプレートのウェル配列に対応したキャップである。 The cap 1 can be freely selected in size and shape in accordance with the size and shape of the culture vessel specimen placement portion 2 to be fitted. For example, the cap 1 can be a commercially available 35 mm, 60 mm, 90 mm, 150 mm Petri dish, a 6- to 384-well multiwell plate, a circular cap corresponding to a tissue culture tube having a diameter of 10 to 30 mm, and various square dishes. A corresponding square cap can be used. Preferably, the cap 1 is a cap corresponding to the well arrangement of the multi-well plate.
キャップ1の材質は、金属、ガラス、プラスチック等、種々の材料が使用可能であるが、培養物を観察しやすいよう透明性に優れ、取り扱いの際に破損しにくいプラスチック製であることが好ましく、特に高透明で剛性に優れたアクリル樹脂製であることが好ましい。 The material of the cap 1 can be various materials such as metal, glass, plastic, etc., but is preferably made of plastic that is excellent in transparency so that the culture can be easily observed and is not easily damaged during handling. In particular, it is preferably made of an acrylic resin that is highly transparent and excellent in rigidity.
キャップ1は、本発明の電気刺激装置10においてはプリント基板3と一体的に装着されていることが好ましい。プリント基板3は、耐熱性のあるプラスチック製又はガラス繊維等の繊維強化プラスチック製の基板上に電気回路4がプリントされている公知の材料を用いて作製することができる。プリント基板3の形状は特に限定されないが、電気回路4の形状に合わせたものであることが好ましい。 The cap 1 is preferably mounted integrally with the printed circuit board 3 in the electrical stimulation device 10 of the present invention. The printed circuit board 3 can be manufactured using a known material in which the electric circuit 4 is printed on a substrate made of heat-resistant plastic or fiber reinforced plastic such as glass fiber. The shape of the printed circuit board 3 is not particularly limited, but it is preferable to match the shape of the electric circuit 4.
電気回路4は、ロジックIC、メモリーICならびにマイクロプロセッサ等を含むデジタルIC5と電源6及びマイクロスイッチ7で構成され、さらに後述する発光素子8を有することが好ましい。電気回路4を形成する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、常法に従い、銅薄膜のエッチングによりプリント基板を形成する方法、プリント基板上に導電性塗料を塗布してプリント基板上にプリント印刷する方法、あるいは細い導線等を溶接する方法などを挙げることができる。中でもエッチングによる方法と基板上にプリント印刷する方法が回路をコンパクトにできる観点から好ましい。 The electric circuit 4 includes a digital IC 5 including a logic IC, a memory IC, a microprocessor, and the like, a power supply 6 and a microswitch 7, and preferably has a light emitting element 8 which will be described later. The method of forming the electric circuit 4 is not particularly limited. For example, according to a conventional method, a method of forming a printed circuit board by etching a copper thin film, a conductive paint is applied on the printed circuit board, and the printed circuit board is coated. And a method of printing and printing a thin wire or the like. Of these, the etching method and the method of printing on the substrate are preferable from the viewpoint of making the circuit compact.
電気回路4を構成するデジタルIC5は、汎用ロジックIC、およびメモリーICの一種のプログラマブルICやマイクロプロセッサのように、一連の作業指示が設定され又はプログラムの書き込みにより一連の作業指示を与え得る集積回路を用いることができる。本発明の電気刺激装置では、デジタルIC5は、パルス電流の大きさ、頻度、パターンを時間軸で変化させる役割を有する。 The digital IC 5 that constitutes the electric circuit 4 is an integrated circuit in which a series of work instructions are set or a series of work instructions can be given by writing a program, such as a general-purpose logic IC and a kind of programmable IC or microprocessor of a memory IC. Can be used. In the electrical stimulation device of the present invention, the digital IC 5 has a role of changing the magnitude, frequency, and pattern of the pulse current on the time axis.
ロジックICとしては、例えば、汎用ロジックIC、PLD(プログラマブル ロジック ディバイス)、CPLD(コンプレックス プログラム ロジック ディバイス)、FPGA(フィールド プログラマブル ゲート アレイ)、カスタムICや各種マイクロプロセッサ等の公知のものを挙げることができる。汎用ロジックICにはCMOS系のものとバイポーラ系のものとがあるが、CMOS系のものであることが好ましい。デジタルIC5は市場で容易に入手できる。デジタルIC5は、さらにコンデンサー等の周辺素子を有していてもよい。 Examples of the logic ICs include general-purpose logic ICs, PLDs (programmable logic devices), CPLDs (complex program logic devices), FPGAs (field programmable gate arrays), custom ICs and various microprocessors. . The general-purpose logic IC includes a CMOS type and a bipolar type, but is preferably a CMOS type. The digital IC 5 is easily available on the market. The digital IC 5 may further include peripheral elements such as a capacitor.
メモリーICとしては、マスクROM,PROM,EROM,EEPROMを含む各種ROM(read-only memory)とDRAM,SRAMを含むRAM(read-write memory)のランダムアクセスメモリ、またCCD(charge coupled devices)などのシーケンシャルアクセスメモリなどの公知のものを挙げることができる。 Memory ICs include various ROM (read-only memory) including mask ROM, PROM, EROM, and EEPROM, random access memory such as RAM (read-write memory) including DRAM and SRAM, and CCD (charge coupled devices). A publicly known one such as a sequential access memory can be listed.
本発明で用いるデジタルICには、パルス電気信号の組み合わせからなる生体の病態時及び/又は正常時の電気現象情報が、電気刺激プロトコールとして、データベース化されて保存されている。本発明では、パルス電気信号の組み合わせからなる生体の病態時及び/又は正常時の電気現象情報は、メモリーICに保管されていることが好ましい。 In the digital IC used in the present invention, electrical phenomenon information at the time of pathological condition and / or normal condition consisting of a combination of pulsed electrical signals is stored in a database as an electrical stimulation protocol. In the present invention, it is preferable that the electrical phenomenon information during the pathological condition and / or normal state of the living body, which is a combination of pulse electrical signals, is stored in the memory IC.
パルス電気信号の組み合わせからなる生体の病態時及び/又は正常時の電気現象情報としては、不整脈、てんかん、又は異常筋電図の電気現象などを挙げることができる。具体的には、実施例として、図4に示した異所性トリガー活動および振戦時筋電図のように病態として特徴的な出現パターンを示すものや、単に頻度として定義される頻拍(100〜250/分),粗動(250〜350/分),細動(350/分以上)などが挙げられる。 Examples of the electrical phenomenon information in the pathological state and / or normal state of a living body composed of a combination of pulsed electrical signals include arrhythmia, epilepsy, or electrical phenomenon of abnormal electromyogram. Specifically, as an example, an ectopic trigger activity and a tremor electromyogram shown in FIG. 4 that show a characteristic appearance pattern as a pathological condition, or a tachycardia (100 ~ 250 / min), coarse movement (250-350 / min), fibrillation (350 / min or more).
「生体の病態時及び/又は正常時の電気現象情報が、電気刺激プロトコールとして、データベース化されて保存されている」とは、下記の2つの作業のことを示す。
(1)病態時及び/又は正常時の電気信号が、一定した公知の特異的基本波形の出現頻度と出現パターンを持っている場合、その頻度とパターンを電流パルスの定形出力パターンとして、データベース化し保存する。
(2)病態時及び/又は正常時の電気信号が、公知の特異的基本波形ではなく、一定の範囲内で多様な形態をとる場合には、源生体電気信号を一度データレコーダに保存し、データの主要波形を、市販の電気刺激装置または電気刺激実験ソフトウェアのトリガー機能を用いて波高選別し、主要波形の出現頻度と出現パターンを決定し、(1)と同じくデータベース化し保存する。その際、主要波形の判別が容易なものは、人によるモニター観察によって判定するが、判別の難しいものは、源生体電気信号をフーリエ変換後の周波数解析を行い、パワースペクトラム上、最もパワーデンシティの大きなものを主要波形とする場合もある。また、源生体電気信号を構成する基本波形を全てとりあげ、個々の基本波形について、定形出力パターンとして、データベース化し、保存する場合や、基本波形の網羅的組み合わせとしてデータベース化し、保存する場合もある。
“The electrical phenomenon information at the time of a disease state and / or normal state is stored as a database as an electrical stimulation protocol” indicates the following two operations.
(1) When the electrical signal at the time of disease state and / or normal has the appearance frequency and appearance pattern of a constant known specific basic waveform, the frequency and pattern are made into a database as a standard output pattern of current pulses. save.
(2) When the electrical signal at the time of disease state and / or normal is not a known specific basic waveform but takes various forms within a certain range, the source bioelectric signal is once stored in the data recorder, The main waveform of the data is subjected to wave height selection using a trigger function of a commercially available electrical stimulation device or electrical stimulation experiment software, the appearance frequency and appearance pattern of the main waveform are determined, and the database is stored as in (1). In this case, the main waveform is easily discriminated by monitor observation by humans, but for those that are difficult to discriminate, the source bioelectric signal is subjected to frequency analysis after Fourier transform, and the power spectrum has the highest power density. In some cases, a large waveform is used as the main waveform. Further, all the basic waveforms constituting the source bioelectric signal may be picked up, and each basic waveform may be stored in a database as a standard output pattern, or may be stored in a database as an exhaustive combination of basic waveforms.
図4は、公知の病態電気信号の例と、それをもとに本発明の電気刺激装置により作られた病態電気信号の実例を示す。即ち、図4は、本発明の電気刺激装置を用いて作られた病態電気信号の例として、不整脈のペーシングリズムと関連した異所性トリガー活動およびパーキンソン症振戦やクローヌス振戦時の異常筋電図類似信号を示す。その他、期外収縮、頻拍、粗動、細動や、てんかん様電気信号等も、公知の原波形パターンをもとに再現できるが、パルス化した時の特徴は顕著でないので省略する。 FIG. 4 shows an example of a known pathological electrical signal and an example of a pathological electrical signal generated by the electrical stimulation device of the present invention based on the example. That is, FIG. 4 shows an example of pathological electrical signals generated using the electrical stimulation device of the present invention. Ectopic trigger activity related to pacing rhythm of arrhythmia and abnormal myoelectricity during Parkinsonism tremor and Cronus tremor The figure similar signal is shown. In addition, extrasystoles, tachycardia, coarse motion, fibrillation, epileptiform electrical signals, and the like can be reproduced based on a known original waveform pattern.
本発明の電気刺激装置では、ロジックIC、メモリーICならびにマイクロプロセッサ等を含むデジタルIC5により調整されたパルス電流を電気回路4に流すように設定されている。このパルス電流は、デジタルICにより実験の目的に応じて、電圧(強度)、発生の頻度(サイクル)、発生パターン(波形)等を一連のプロトコールとして変更可能であることが好ましい。このような変更可能な刺激のプロトコールを実現する方法としては、デジタルICへのプロトコールやプログラムの書き込みと消去があり、それらのプロトコールやプログラムをデータベース化することができる。 In the electrical stimulation device of the present invention, the pulse current adjusted by the digital IC 5 including a logic IC, a memory IC, a microprocessor, and the like is set to flow through the electrical circuit 4. It is preferable that the voltage (intensity), frequency of occurrence (cycle), generation pattern (waveform), and the like of this pulse current can be changed as a series of protocols according to the purpose of the experiment using a digital IC. As a method for realizing such a changeable stimulation protocol, there is writing and erasing of a protocol and a program in the digital IC, and the protocol and the program can be made into a database.
本発明の電気刺激装置における電源は、電池又は外部より電気を供給するための電気供給装置であることが好ましい。電源が電池である場合、電池はキャップ1上に装着する必要があるため、できるだけ小型であることが好ましく、ボタン型であることがさらに好ましい。電池に必要な性能としては、10V以下、好ましくは1.5〜6V程度の電位差の電圧を有していることが好ましい。また、平均10μAのパルス電流を2時間以上、好ましくは5時間以上、さらに好ましくは24時間以上、培地に流し得る容量を有していることが望ましい。 The power source in the electrical stimulation device of the present invention is preferably an electricity supply device for supplying electricity from a battery or the outside. When the power source is a battery, since the battery needs to be mounted on the cap 1, it is preferably as small as possible, and more preferably a button type. As the performance required for the battery, it is preferable that the battery has a potential difference voltage of 10 V or less, preferably about 1.5 to 6 V. Further, it is desirable to have a capacity capable of flowing an average 10 μA pulse current through the medium for 2 hours or more, preferably 5 hours or more, more preferably 24 hours or more.
本発明の電気刺激装置の好適な実施例では、電源はボタン電池6が使用されている(図1(A)参照)。ボタン電池6は、水銀電池又はリチウムのような使い捨て型の電池はもちろん、ニッケル−カドミニウム電池、電気二重層コンデンサー、リチウム蓄電池等の再充電可能な蓄電池であってもよい。 In the preferred embodiment of the electrical stimulation device of the present invention, the button battery 6 is used as the power source (see FIG. 1A). The button battery 6 may be a rechargeable storage battery such as a nickel-cadmium battery, an electric double layer capacitor, a lithium storage battery, as well as a disposable battery such as a mercury battery or lithium.
一方、本発明の電気刺激装置における電源が電気供給装置である場合、電気供給装置はACアダプター、AC/DCスイッチング電源、AC/DCコンバーター、各種電源トランス製品のような直流電源であってもよい。 On the other hand, when the power supply in the electrical stimulation apparatus of the present invention is an electrical supply apparatus, the electrical supply apparatus may be a direct current power supply such as an AC adapter, an AC / DC switching power supply, an AC / DC converter, and various power transformer products. .
本発明の電気刺激装置10におけるマイクロスイッチ7は、通常のスイッチと同様、刺激装置の回路におけるパルス電流をオン/オフ制御する装置である。マイクロスイッチ7は、人が操作することにより機械的に切り替わるスイッチであってもよいし、圧力により電流が自動的にオン/オフ制御可能な、例えば圧電素子を用いたスイッチであってもよい。マイクロスイッチ7は、操作が可能である限りできるだけ小型で軽量であることが望ましい。 The microswitch 7 in the electrical stimulation device 10 of the present invention is a device that controls on / off of the pulse current in the circuit of the stimulation device, like a normal switch. The micro switch 7 may be a switch that is mechanically switched by a human operation, or may be a switch using a piezoelectric element, for example, in which current can be automatically turned on / off by pressure. The microswitch 7 is desirably as small and light as possible as long as it can be operated.
本発明の電気刺激装置では、電気回路4が培養容器2内の培地11へ供給されるパルス電流の供給状況を監視するためのモニタリング装置をさらに有することができる。モニタリング装置として、例えば本発明の好適な実施例で示されるように発光素子(LED)8などが設けられていることが好ましい。 In the electrical stimulation device of the present invention, the electrical circuit 4 can further include a monitoring device for monitoring the supply status of the pulse current supplied to the culture medium 11 in the culture vessel 2. As the monitoring device, for example, a light emitting element (LED) 8 is preferably provided as shown in a preferred embodiment of the present invention.
本発明の電気刺激装置における電極9,9’は、パルス電流を培養容器内の培地に電気刺激として与えるための端子である。図1では、電極9,9’は、電気回路4の両端に連結され、キャップ1を貫通してキャップ1内に吊り下げされている。電極9,9’は、1対の陽極と陰極とで構成されている。電極9,9’の形状は、図1ではT字形状であるが、本発明の電気刺激装置における電極はこの形状に限定されるものではなく、その他の形状(例えば、格子あるいは同心円または半円の形状)であってもよい。さらに、電極9,9’の端子の長さは、培養容器2の深さ(高さ)に応じて適宜決定することができる。また、電極9,9’は互いに平行に吊り下げられてもよく、例えば、互いに向かい合ったときにハの字形又は逆ハの字形になるように吊り下げられていてもよい。さらに、電極9,9’は電気発生手段(電気回路4)の両端に連結されていれば、電気発生手段(電気回路4)に連結される位置はキャップ1及び培養容器2の形状に合わせて適宜決定することができる。電極9,9’の材料としては、例えば、銀、銀−塩化銀、白金、チタン、窒化チタン、カーボン、金、ガラス等を挙げることができる。 The electrodes 9, 9 'in the electrical stimulation device of the present invention are terminals for applying a pulse current to the culture medium in the culture vessel as electrical stimulation. In FIG. 1, the electrodes 9 and 9 ′ are connected to both ends of the electric circuit 4, pass through the cap 1, and are suspended in the cap 1. The electrodes 9, 9 'are composed of a pair of anode and cathode. The shape of the electrodes 9 and 9 'is a T shape in FIG. 1, but the electrodes in the electrical stimulation device of the present invention are not limited to this shape, and other shapes (for example, a lattice, concentric circles or semicircles). Shape). Furthermore, the lengths of the terminals of the electrodes 9 and 9 ′ can be appropriately determined according to the depth (height) of the culture vessel 2. Further, the electrodes 9, 9 'may be suspended in parallel with each other, for example, may be suspended so as to have a C shape or an inverted C shape when facing each other. Furthermore, if the electrodes 9 and 9 ′ are connected to both ends of the electricity generating means (electric circuit 4), the positions where the electrodes 9 and 9 ′ are connected to the electricity generating means (electric circuit 4) are matched to the shapes of the cap 1 and the culture vessel 2. It can be determined as appropriate. Examples of the material for the electrodes 9 and 9 'include silver, silver-silver chloride, platinum, titanium, titanium nitride, carbon, gold, and glass.
図1(B)に示されるように、本発明の電気刺激装置10におけるキャップを嵌合するための培養容器標本配置部2は、その中に培地11を充填できるようになっている。培地11は、通常は、Na、Mg、Ca等の金属イオンを含んだ生理食塩水に各種アミノ酸、例えばL-Arg, L-Cys, L-Gln, L-His及び各種ビタミン、例えば、葉酸、パントテン酸、ニコチンアミド、ピリドキサール、リボフラビン等を含んだ培地等を用いることができる。 As shown in FIG. 1 (B), the culture container specimen placement portion 2 for fitting the cap in the electrical stimulation device 10 of the present invention can be filled with the culture medium 11 therein. The medium 11 is usually prepared by adding various amino acids such as L-Arg, L-Cys, L-Gln, L-His and various vitamins such as folic acid in a physiological saline containing metal ions such as Na, Mg, and Ca. A medium containing pantothenic acid, nicotinamide, pyridoxal, riboflavin and the like can be used.
培地11には従来から組織の培養において提案されている各種サイトカイン類や増殖因子類、例えばインターロイキン類、ニューロトロピン類、血小板由来成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子を0.01ng/mlから100μg/mlの範囲の量で配合することが好ましい。また培地11は、固体培地及び液体培地のいずれであってもよい。 The medium 11 contains 0.01 ng / ml of various cytokines and growth factors conventionally proposed in tissue culture, such as interleukins, neurotropins, platelet-derived growth factor, epidermal growth factor, and fibroblast growth factor. To 100 μg / ml is preferable. The medium 11 may be a solid medium or a liquid medium.
本発明の電気刺激装置10を用いて生体細胞等の成長を促進又は抑制、さらに機能と形態の修飾や変性疾患モデル作製を実現するように培養する場合、培地11には、生体細胞又は生体組織12(以下「原組織等」という。)を培地表面又は培地中に装入する。この原組織等としては、公知の細胞又は組織として用いられている各種の原組織等を使用することが可能である。例えば、原組織等を構成する細胞(群)及びその幹細胞(群)、原組織等を培養すべき組織の一部、培養すべき組織に類似した組織、胚細胞、ES細胞等であってもよい。 In the case of culturing so as to promote or suppress the growth of living cells using the electrical stimulation device 10 of the present invention, and further realize the modification of function and form and the creation of a degenerative disease model, the medium 11 includes living cells or living tissues. 12 (hereinafter referred to as “original tissue or the like”) is placed on the surface of the medium or in the medium. As this original tissue, various kinds of original tissues used as known cells or tissues can be used. For example, cells (group) constituting the original tissue and the stem cells (group) thereof, a part of the tissue to be cultured, the tissue similar to the tissue to be cultured, embryonic cells, ES cells, etc. Good.
本発明の電気刺激装置により刺激が与えられる生体細胞等の「生体」とは、人間をはじめ、犬、ねこ、馬、豚、羊、マウス、ラット等の哺乳動物のほか、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、細菌、ウイルス等の微生物、植物をも包含する概念である。 The “living body” such as living cells to be stimulated by the electrical stimulation device of the present invention includes humans, mammals such as dogs, cats, horses, pigs, sheep, mice, rats, birds, reptiles, and amphibians. It is also a concept including microorganisms such as fish, bacteria and viruses, and plants.
また、本発明の電気刺激装置により刺激を与える「組織」には、生体のあらゆる組織、臓器、それらの一部が包含される。例えば、中枢神経、末梢神経、骨、軟骨、関節、リンパ管、血管、心臓(心筋、弁)、肺、肝臓、脾臓、すい臓、食道、胃、小腸、大腸、腎臓、膀胱、子宮、卵巣、精巣、横隔膜、筋肉、腱、皮膚、眼、鼻、気管、舌、唇、爪、毛髪等それらの1部をいう。本発明の電気装置で用いられる組織は、これらの臓器、組織の中でも生体内で興奮性の電気刺激が常在する組織、例えば心臓、骨格筋、平滑筋、末梢神経、脳等の中枢神経等の組織を主な対象とすることができる。 In addition, the “tissue” to which stimulation is applied by the electrical stimulation apparatus of the present invention includes all tissues and organs of the living body and parts thereof. For example, central nerve, peripheral nerve, bone, cartilage, joint, lymphatic vessel, blood vessel, heart (myocardium, valve), lung, liver, spleen, pancreas, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, kidney, bladder, uterus, ovary, The testis, diaphragm, muscles, tendons, skin, eyes, nose, trachea, tongue, lips, nails, hair, etc. The tissue used in the electrical apparatus of the present invention is a tissue in which excitatory electrical stimulation is resident in a living body among these organs or tissues, for example, a central nerve such as heart, skeletal muscle, smooth muscle, peripheral nerve, brain, etc. Can be the main target.
本発明の電気刺激装置における電気回路4のデジタルIC5、電源(6)、マイクロスイッチ、モニタリング装置(8)及び電極9,9’の回路配置は特に限定されるものではなく、キャップ1の形状、大きさ等に応じて適宜決定することができる。例えば、本発明の電気刺激装置では、図3(A)〜(C)に示されるような回路配置をとることが可能である。 The circuit arrangement of the digital IC 5 of the electric circuit 4, the power supply (6), the micro switch, the monitoring device (8) and the electrodes 9 and 9 ′ in the electric stimulation device of the present invention is not particularly limited, and the shape of the cap 1, It can be determined appropriately according to the size and the like. For example, in the electrical stimulation device of the present invention, it is possible to take a circuit arrangement as shown in FIGS.
図3(A)は、デジタルIC5がCMOS系のロジックIC(74HC)である場合の回路配置を示す。電源(6)から発生した電流はCMOS系ICにおいて、所望の波形のパルス電流に変換され、さらに周辺素子であるコンデンサーや抵抗により所望の電流強度、サイクル、通電時間に調整される。調整されたパルス電流は、発光素子(LED)8でモニタリングされながら電極へ供給される。 FIG. 3A shows a circuit arrangement when the digital IC 5 is a CMOS logic IC (74HC). The current generated from the power source (6) is converted into a pulse current having a desired waveform in the CMOS IC, and further adjusted to a desired current intensity, cycle, and energization time by a capacitor and a resistor as peripheral elements. The adjusted pulse current is supplied to the electrode while being monitored by the light emitting element (LED) 8.
図3(B)は、さらなる集積化により周辺素子がすべてデジタルIC5の中に盛り込まれている場合の回路配置を示す。図3(B)で示される回路配置では、周辺素子の占有スペースが省けるため、装置の小型化に寄与できるというメリットがある。 FIG. 3B shows a circuit arrangement in the case where all the peripheral elements are incorporated in the digital IC 5 by further integration. The circuit arrangement shown in FIG. 3B has an advantage that it can contribute to the downsizing of the device because the space occupied by the peripheral elements can be omitted.
また図3(B)は、周辺素子機能をすべて刺激信号とともにプログラマブル ロジックデバイスにプログラムとして書き込んで、出力するための回路配置も代表している。 FIG. 3B also shows a circuit arrangement for writing and outputting all peripheral element functions as a program in a programmable logic device together with stimulus signals.
図3(C)は、マイクロプロセッサに任意の刺激パターン形成のプログラムを書き込んで、出力するための回路配置の一例を示す。 FIG. 3C shows an example of a circuit arrangement for writing and outputting a program for forming an arbitrary stimulus pattern in the microprocessor.
本発明の電気刺激装置の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、通常の単一容器適用の電極と、刺激回路及びマルチウェルプレート適用の電極配列と、刺激回路とを半導体技術により一つのマイクロチップとして一体形成し、懸垂電極を追加して構築することができる。 The method of manufacturing the electrical stimulation device of the present invention is not particularly limited. For example, an ordinary single-container electrode, an electrode array for a stimulation circuit and a multiwell plate, and a stimulation circuit are integrated into a semiconductor technology. Thus, it can be integrally formed as one microchip and can be constructed by adding a suspended electrode.
以下に、本発明の好適な実施例を示す。なお、下の実施例に示される材料、使用量、割合、手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。 The preferred embodiments of the present invention are shown below. In addition, the material, usage-amount, ratio, procedure, etc. which are shown by the following example can be suitably changed unless it deviates from the meaning of this invention. Therefore, the scope of the present invention should not be construed as being limited by the specific examples shown below.
(実施例1)
温度37℃、湿度99%、CO2濃度5%の条件下で、本発明の図1及び図2に記載した電気刺激装置を用いて、知覚神経細胞とシュワン細胞の混合標本に成長抑制(細胞障害付与)を目的とした条件の電気刺激(150mV/mm, 持続時間5msec, 2Hz)を5時間印加し、さらに2日間培養した。結果を図5に示す。
Example 1
Using the electrical stimulation apparatus described in FIGS. 1 and 2 of the present invention under conditions of a temperature of 37 ° C., a humidity of 99%, and a CO 2 concentration of 5%, growth inhibition (cells) was performed on a mixed specimen of sensory nerve cells and Schwann cells. Electrical stimulation (150 mV / mm, duration 5 msec, 2 Hz) under the condition for the purpose of imparting damage was applied for 5 hours, and further cultured for 2 days. The results are shown in FIG.
図5に示されるように、電気刺激前の状態(図5の(A))と比べて、電気刺激後には神経突起を中心に遅発性のネクローシス(壊死)が見られた(図5の(B))。また電気刺激の強度を下げて(10mV/mm, 持続時間20μsec, 10Hz)3日間の刺激を行うと、髄鞘を形成していたシュワン細胞にのみ選択的にネクローシス(壊死)を起こさせることが可能で、神経突起を露出した状態すなわち脱髄現象を起こさせることに成功した(図5の(C))。 As shown in FIG. 5, compared with the state before electrical stimulation ((A) of FIG. 5), delayed necrosis (necrosis) centered on neurites was observed after electrical stimulation (FIG. 5). (B)). In addition, when stimulation is performed for 3 days with reduced electrical stimulation intensity (10 mV / mm, duration 20 μsec, 10 Hz), only Schwann cells that have formed myelin sheaths can selectively cause necrosis. It was possible and succeeded in causing the neurite to be exposed, that is, demyelination (FIG. 5C).
(実施例2)
《機能馴化細胞の観察》
以下における機能馴化心筋の電気刺激に対する応答性の変化と電気刺激による機能回復については、位相差顕微鏡に取り付けたデジタルムービーカメラを用いて1例ごとに35秒間の動画データを取得保存し、心拍数の測定と集計を行った。
(Example 2)
<Observation of functionally conditioned cells>
Regarding the functional acclimation of the functionalized myocardium in the following and the functional recovery by electrical stimulation, 35 seconds of moving image data is acquired and stored for each case using a digital movie camera attached to a phase contrast microscope, and the heart rate Measurement and aggregation were performed.
《心筋組織の摘出/活性化》
BALB/cマウス(3〜4 週令)より心臓を摘出し、カナマイシン(100mg/l)を含む無カルシウム・リン酸緩衝生理食塩水(PBS(-))にて2-3回洗浄後、3 mg/mlコラゲナーゼ (type1, Sigma) を含む同PBS(-) にて 37℃, 30min、ランゲンドルフ法による灌流処置を行った。
<< Extraction / Activation of Myocardial Tissue >>
Hearts were removed from BALB / c mice (3-4 weeks old) and washed 2-3 times with calcium-free phosphate buffered saline (PBS (-)) containing kanamycin (100 mg / l). The perfusion treatment was performed with the same PBS (-) containing mg / ml collagenase (type1, Sigma) at 37 ° C. for 30 min by the Langendorf method.
コラゲナーゼ処置した心臓切片を同PBS(-)にて2-3回洗浄後、先端径をバーナー炎で小さくした(200 〜400μm)パスツールピペットを用いて、ピペツテイングにより細胞を単離した。 そのようにして作った細胞懸濁液を遠心分離し、沈降した細胞塊を、カルシウムを含む通常のPBSに懸濁し、適量をプレインキュベーション済みの培養用 dishに2000〜3000/dishの細胞数で播いて温度37℃、湿度99%、CO2濃度5%の条件下で培養を開始した。培養開始24h 後、EAGLEs培地を交換し培養をつづけた。なお、プレインキュベーションは、10% ウシ胎児血清を含むEAGLEs 培地(日本水産)1.5 mlを、35mm カルチャー dish (FALCON, 3801) に入れ、0.5〜1時間行った。 The collagenase-treated heart sections were washed 2-3 times with the same PBS (−), and the cells were isolated by pipetting using a Pasteur pipette whose tip diameter was reduced with a burner flame (200 to 400 μm). The cell suspension thus prepared is centrifuged, the sedimented cell mass is suspended in normal PBS containing calcium, and an appropriate amount is placed in a pre-incubated culture dish at a cell number of 2000 to 3000 / dish. The culture was started under conditions of seeding temperature 37 ° C., humidity 99%, CO 2 concentration 5%. 24 hours after the start of the culture, the EAGLEs medium was changed and the culture was continued. The preincubation was carried out for 0.5 to 1 hour by placing 1.5 ml of EAGLEs medium (Nihon Suisan) containing 10% fetal bovine serum in a 35 mm culture dish (FALCON, 3801).
《機能馴化結果》
培養の時間経過とともに、活性化心筋の心拍数が、本来のマウスの心拍数(486〜738回/分、すなわち8.1〜12.3Hz)から低下し、さらに培養二週間目には電気刺激(強度3V, 持続3msec)に対する刺激応答性、すなわち培養した心筋細胞の追従可能な刺激頻度が2〜5Hzにまで低下した。
《Function acclimatization result》
As the culture progresses, the heart rate of the activated myocardium decreases from the original heart rate of the mouse (486-738 beats / minute, that is, 8.1-12. 3 Hz). , Sustained 3 msec), i.e., the frequency of stimulation of cultured cardiomyocytes can be reduced to 2-5 Hz.
《移植前機能馴化操作》
上記活性化二週間目の心筋細胞で構成された組織に対し、本発明の図1及び図2に記載の電気刺激装置を用いて、150mV/mmの電気刺激を応答性の強さに応じて1〜10Hzの頻度で3日間与えた。12例全ての刺激応答性が回復し、7Hzの上記電気刺激に追従可能であった(図6C及びD)。
<< Function habituation operation before transplantation >>
Using the electrical stimulation apparatus described in FIGS. 1 and 2 of the present invention, 150 mV / mm electrical stimulation is applied to the tissue composed of cardiomyocytes at the second week of activation according to the strength of response. It was given for 3 days at a frequency of 1-10 Hz. The stimulus responsiveness of all 12 cases recovered, and it was possible to follow the electrical stimulation of 7 Hz (FIGS. 6C and D).
また、比較例として、電気刺激を与えない以外は、上記と同様にして、二週間の心筋細胞の培養を行った。刺激応答性を検討した結果、培養14日目の心筋組織の電気刺激(強度3V, 持続3msec)に対する追従可能な頻度は、検討した全例(11例)において僅か2〜3Hzであり、7Hz以上の刺激に対する応答性の回復は全く見られなかった(図6D) As a comparative example, cardiomyocytes were cultured for 2 weeks in the same manner as above except that no electrical stimulation was given. As a result of examining the stimulus responsiveness, the frequency of follow-up to electrical stimulation (intensity 3 V, sustained 3 msec) of myocardial tissue on the 14th day of culture is only 2 to 3 Hz in all the examined cases (11 cases), 7 Hz or more There was no recovery of responsiveness to any stimulation (Fig. 6D).
1 キャップ
2 培養容器標本配置部
3 プリント基板
4 電気回路(電流発生手段)
5 デジタルIC
6 ボタン電池(電源)
7 マイクロスイッチ
8 発光素子(モニタリング装置)
9,9’ 電極
10 電気刺激装置
11 培地
12 生体細胞又は生体組織
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Cap 2 Culture container sample arrangement | positioning part 3 Printed circuit board 4 Electric circuit (electric current generation means)
5 Digital IC
6 Button battery (power)
7 Micro switch 8 Light-emitting element (monitoring device)
9, 9 'electrode 10 electrical stimulator 11 medium 12 biological cell or biological tissue
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