JP2007129938A - Knockout mouse - Google Patents
Knockout mouse Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007129938A JP2007129938A JP2005325275A JP2005325275A JP2007129938A JP 2007129938 A JP2007129938 A JP 2007129938A JP 2005325275 A JP2005325275 A JP 2005325275A JP 2005325275 A JP2005325275 A JP 2005325275A JP 2007129938 A JP2007129938 A JP 2007129938A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mouse
- gene
- knockout
- embryonic stem
- knockout mouse
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims abstract description 73
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 24
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 29
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 13
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 14
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 abstract description 12
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 abstract description 8
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 abstract description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 7
- 206010034277 Pemphigoid Diseases 0.000 abstract description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 23
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 18
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 9
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 5
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000004510 Collagen Type VII Human genes 0.000 description 2
- 108010017377 Collagen Type VII Proteins 0.000 description 2
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 2
- 241000721454 Pemphigus Species 0.000 description 2
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 2
- 108010028309 kalinin Proteins 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000036560 skin regeneration Effects 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010014989 Epidermolysis bullosa Diseases 0.000 description 1
- 102000000426 Integrin alpha6 Human genes 0.000 description 1
- 108010041100 Integrin alpha6 Proteins 0.000 description 1
- 102000012334 Integrin beta4 Human genes 0.000 description 1
- 108010022238 Integrin beta4 Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000985214 Mus musculus 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 206010040840 Skin erosion Diseases 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000003699 antiulcer agent Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000003116 impacting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、ＢＰ１８０遺伝子の機能が欠損しており、表皮基底膜を構成するタンパク質の一つである１８０ｋＤ類天疱瘡抗原を欠損したマウスに関する。 The present invention relates to a mouse deficient in the BP180 gene function and lacking the 180 kD pemphigus antigen, which is one of the proteins constituting the epidermal basement membrane.
潰瘍治療の実験をするために、潰瘍が形成された動物モデルが用いられる。これまでの動物モデルは、皮膚に物理的な衝撃を与えて潰瘍を形成させて作製されていた。このように作製された動物モデルの潰瘍の深さや大きさは、個々の動物によって一定ではなく、そのモデルから得られる実験データの信頼性が十分ではなかった。 In order to conduct an experiment for treating ulcer, an animal model in which an ulcer is formed is used. Until now, animal models have been created by physically impacting the skin to form ulcers. The depth and size of ulcers in the animal model thus prepared are not constant for each animal, and the reliability of the experimental data obtained from the model has not been sufficient.
皮膚潰瘍とは、表皮の部分的欠損が皮下組織にまで達した状態である。したがって、表皮と真皮の間に存在する表皮基底膜を構成するタンパク質が欠損すると、潰瘍が形成されやすくなる。基底膜タンパク質の例には、ＶＩＩ型コラーゲン、ラミニン５、β４インテグリンなどのほか、１８０ｋＤ類天疱瘡抗原（ＸＶＩＩコラーゲン）が含まれる。これらのうち、ラミニン５、ＶＩＩ型コラーゲン、またはα６インテグリンを欠損したマウスが報告されている（非特許文献１〜４参照）。しかしながら、これらのマウスは、生後間もなく（２〜３日）に死亡するため、潰瘍治療の実験の動物モデルには適さない。 A skin ulcer is a condition in which a partial defect of the epidermis reaches the subcutaneous tissue. Therefore, if a protein constituting the epidermis basement membrane existing between the epidermis and the dermis is deficient, an ulcer is likely to be formed. Examples of basement membrane proteins include type VII collagen, laminin 5, β4 integrin, etc., as well as 180 kD pemphigoid antigen (XVII collagen). Among these, mice lacking laminin 5, type VII collagen, or α6 integrin have been reported (see Non-Patent Documents 1 to 4). However, these mice die soon after birth (2-3 days) and are not suitable for animal models of ulcer treatment experiments.
一方、１８０ｋＤ類天疱瘡抗原は、ＢＰ１８０遺伝子にコードされたタンパク質である。ＢＰ１８０遺伝子のｃＤＮＡのアクセッション番号はＮＭ ００７７３２であって、ゲノム情報は非特許文献５に記載されている。
表皮基底膜を構成するタンパク質を欠損したマウスは、基底膜のレベルで皮膚潰瘍を一定に発症することができ、潰瘍治療の実験動物モデルとして有用であると考えられる。そこで本発明は、基底膜タンパク質を欠損したマウスであって、潰瘍治療の実験の動物モデルとして十分な寿命を有するマウスを提供することを課題とする。 Mice deficient in the protein constituting the epidermis basement membrane can develop skin ulcers at the basement membrane level, and are considered useful as experimental animal models for ulcer treatment. Therefore, an object of the present invention is to provide a mouse deficient in a basement membrane protein and having a sufficient life span as an animal model for an experiment for treating ulcer.
本発明は、ＢＰ１８０遺伝子を不活性化させて、１８０ｋＤ類天疱瘡抗原（以下、「ＢＰ１８０タンパク質」とも称する）の発現を抑制すると、基底膜レベルで一定の皮膚潰瘍を容易に発症し、かつ長寿命であるマウスが得られることを見出して完成された。
すなわち本発明は以下の通りである。
［１］ＢＰ１８０遺伝子の機能が欠損したノックアウトマウス。
［２］ＢＰ１８０遺伝子の機能が欠損したノックアウトマウスの製造方法であって、ＢＰ１８０遺伝子が不活性化されたマウス胚幹細胞をマウス胚盤胞に導入して得られたキメラ胚を、メスマウスの子宮に着床させて得られるキメラマウス同士を交配させて、ヘテロ接合体のノックアウトマウス、またはホモ接合体のノックアウトマウスを得るステップを含む、ノックアウトマウスの製造方法。
In the present invention, when the expression of 180 kD pemphigus antigen (hereinafter also referred to as “BP180 protein”) is suppressed by inactivating the BP180 gene, certain skin ulcers easily develop at the basement membrane level, and It was completed by finding that a mouse having a long life could be obtained.
That is, the present invention is as follows.
[1] A knockout mouse deficient in the function of the BP180 gene.
[2] A method for producing a knockout mouse deficient in the function of the BP180 gene, wherein a chimeric embryo obtained by introducing a mouse embryonic stem cell in which the BP180 gene is inactivated into a mouse blastocyst is introduced into the uterus of a female mouse A method for producing a knockout mouse, comprising the step of mating chimeric mice obtained by implantation to obtain a heterozygous knockout mouse or a homozygous knockout mouse.
本発明のマウスは、皮膚潰瘍治療の実験のための動物モデルとして用いることができるので、皮膚潰瘍の治療剤の開発や、皮膚再生治療の開発に応用される。 Since the mouse of the present invention can be used as an animal model for experiments for treating skin ulcers, it is applied to the development of therapeutic agents for skin ulcers and the development of skin regeneration treatments.
１．本発明のマウス
本発明のマウスは、そのＢＰ１８０遺伝子の機能が欠損されていることを特徴とする。ＢＰ１８０遺伝子の機能が欠損されているとは、ＢＰ１８０遺伝子の少なくとも一部が欠失している；少なくとも一部が他の遺伝子と置換されている；任意の部位に外来シークエンスが挿入されている；または当該遺伝子のプロモーターが不活性化されている、ことを含む。
欠失または置換される、ＢＰ１８０遺伝子の少なくとも一部には、遺伝子のコード領域またはエキソンが含まれることが好ましく、特にエキソン２が含まれることが好ましい。また、置換している他の遺伝子は、選択マーカー遺伝子であることが好ましく、選択マーカー遺伝子の例には、ネオマイシン耐性遺伝子、単純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子、およびジフテリアトキシンＡ断片遺伝子などが含まれるが、好ましくはネオマイシン耐性遺伝子である。
1. The mouse of the present invention The mouse of the present invention is characterized in that the function of the BP180 gene is deficient. The function of the BP180 gene is deficient. At least a part of the BP180 gene is deleted; at least a part is replaced with another gene; a foreign sequence is inserted at any site; Or the promoter of the gene is inactivated.
It is preferable that at least a part of the BP180 gene to be deleted or replaced includes the coding region or exon of the gene, and particularly exon 2 is preferably included. Further, the other gene to be replaced is preferably a selectable marker gene, and examples of the selectable marker gene include a neomycin resistance gene, a simple virus thymidine kinase gene, and a diphtheria toxin A fragment gene. Preferably, it is a neomycin resistance gene.
本発明のマウスは、ＢＰ１８０遺伝子における対立遺伝子のいずれか一方の機能が欠損されているヘテロ接合体でも、対立遺伝子の両方の機能が欠損されているホモ接合体のノックアウトマウスであってもよいが、１８０ｋＤ類天疱瘡抗原を欠損しているマウスはホモ接合体のノックアウトマウスである。 The mouse of the present invention may be a heterozygote in which the function of any one of the alleles in the BP180 gene is deleted or a homozygous knockout mouse in which both functions of the allele are deleted. Mice deficient in the 180 kD pemphigoid antigen are homozygous knockout mice.
本発明のマウスは、そのＢＰ１８０遺伝子の機能が欠損されており、さらにホモ接合体である本発明のマウスはＢＰ１８０タンパク質を欠損している。ＢＰ１８０タンパク質は、皮膚基底膜を構成するタンパク質の一つであって、ＸＶＩＩコラーゲンまたは１８０ｋＤ類天疱瘡抗原と称されることもある。皮膚基底膜とは、表皮と真皮の間に存在し、表皮と真皮を結合させるほか、外界からの力学的ストレスから皮膚を守る働きなどを担っている。したがって、ＢＰ１８０タンパク質を発現できない本発明のマウスは、外界からの刺激によって、容易に皮膚潰瘍、またはびらんを発症する。組織学的に言えば、本発明のマウスは表皮と真皮の基底膜部に解離を生じさせやすい。
一方、本発明のマウスはＢＰ１８０タンパク質を発現しないが、通常は、その他の基底膜タンパク質を正常に発現する。
The mouse of the present invention is deficient in the function of the BP180 gene, and the mouse of the present invention which is a homozygote is deficient in the BP180 protein. BP180 protein is one of the proteins constituting the skin basement membrane, and is sometimes referred to as XVII collagen or 180 kD pemphigoid antigen. The skin basement membrane exists between the epidermis and the dermis, and not only binds the epidermis and dermis, but also protects the skin from mechanical stress from the outside. Therefore, the mouse of the present invention that cannot express BP180 protein easily develops skin ulcer or erosion due to external stimulation. Histologically speaking, the mouse of the present invention tends to cause dissociation in the basement membrane part of the epidermis and dermis.
On the other hand, the mouse of the present invention does not express BP180 protein but normally expresses other basement membrane proteins normally.
さらに、本発明のマウスは、実験動物モデルとして十分な寿命を有しうる。実験動物モデルとして十分な寿命とは、たとえば３〜４ヶ月以上である。
一方、本発明のマウスは陰部にびらんを発症しているため、通常は生殖能力を有さない。
Furthermore, the mouse of the present invention can have a sufficient life span as an experimental animal model. A sufficient life span as an experimental animal model is, for example, 3 to 4 months or longer.
On the other hand, since the mouse of the present invention develops erosion in the genital area, it usually does not have fertility.
本発明のマウスは種々の用途で用いられうるが、たとえば実験動物モデルとして用いられる。動物モデルとして用いるとは、抗潰瘍剤；皮膚の再生治療；表皮水疱症の遺伝子治療の効果を検討するために、これらのモデルを用いることを含む。 The mouse of the present invention can be used in various applications, for example, as an experimental animal model. Use as an animal model includes using these models to examine the effects of anti-ulcer agents; skin regeneration treatment; gene therapy for epidermolysis bullosa.
２．本発明のマウスの製造方法
本発明のマウスの製造方法は特に制限されないが、たとえばＢＰ１８０遺伝子が不活性化されたマウス胚幹細胞をマウス杯盤胞に導入して得られるキメラ胚を、メスマウスの子宮に着床させて得られるキメラマウスを得るステップを含む。より具体的には、たとえば以下のＡ）〜Ｇ）の工程で、本発明のマウスが得られる。
Ａ）ＢＰ１８０ゲノムＤＮＡのフラグメントをクローニングする工程；
Ｂ）得られたフラグメントの少なくとも一部を欠失させるか、または他の遺伝子と置換させて、ＢＰ１８０遺伝子を不活性化する改変フラグメントを得る工程；
Ｃ）得られた改変フラグメントをベクターに組み込み、ターゲッティングベクターを得る工程；
Ｄ）得られたターゲティングベクターをマウス胚幹細胞に導入して、ＢＰ１８０遺伝子が不活性化されたマウス胚幹細胞を得る工程；
Ｅ）得られたマウス胚幹細胞をマウス杯盤胞に導入して、キメラ胚を得る工程；および
Ｆ）得られたキメラ胚をメスマウスの子宮に着床させて、キメラマウスを発生させる工程。
2. Method for producing mouse of the present invention The method for producing the mouse of the present invention is not particularly limited. For example, a chimeric embryo obtained by introducing a mouse embryonic stem cell in which the BP180 gene is inactivated into a mouse goblet cyst is used as a uterus of a female mouse. A step of obtaining a chimeric mouse obtained by implantation in More specifically, for example, the mouse of the present invention is obtained by the following steps A) to G).
A) cloning a fragment of BP180 genomic DNA;
B) deleting at least a portion of the resulting fragment or replacing it with another gene to obtain a modified fragment that inactivates the BP180 gene;
C) a step of incorporating the obtained modified fragment into a vector to obtain a targeting vector;
D) introducing the obtained targeting vector into a mouse embryonic stem cell to obtain a mouse embryonic stem cell in which the BP180 gene is inactivated;
E) introducing the obtained mouse embryonic stem cells into a mouse goblet cyst to obtain a chimeric embryo; and F) implanting the obtained chimeric embryo into the uterus of a female mouse to generate a chimeric mouse.
さらに本発明のマウスの製造方法は、Ｇ）前記キメラマウス同士を交配させて、ヘテロ接合体のノックアウトマウス、またはホモ接合体のノックアウトマウスを得る工程を含みうる。以下、それぞれの工程について説明する。 Further, the method for producing a mouse of the present invention may comprise a step of G) crossing the chimeric mice to obtain a heterozygous knockout mouse or a homozygous knockout mouse. Hereinafter, each process will be described.
Ａ）ＢＰ１８０のゲノムＤＮＡフラグメントをクローニングする工程
ＢＰ１８０の、所望のゲノムＤＮＡフラグメントは、マウスゲノムライブラリーから、クローニング、さらに必要に応じてサブクローニングすることによって得られる。クローニングまたはサブクローニングされるフラグメントには、コード領域（好ましくは、ＡＴＧ開始コドンを有する第２エキソン）が含まれることが好ましい。
たとえば、１２９Ｓｖ／Ｅｖマウスライブラリーから１４．７ｋｂのフラグメントをクローニングして、さらに１１．５ｋｂのＮｈｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントをサブクローニングすれば、所望のフラグメントが得られる。
A) Step of Cloning BP180 Genomic DNA Fragment The desired genomic DNA fragment of BP180 is obtained from a mouse genomic library by cloning and optionally subcloning. The fragment to be cloned or subcloned preferably includes a coding region (preferably a second exon having an ATG start codon).
For example, cloning a 14.7 kb fragment from a 129Sv / Ev mouse library and then subcloning the 11.5 kb NheI-NotI fragment yields the desired fragment.
Ｂ）ＢＰ１８０遺伝子を不活性化する改変フラグメントを得る工程
工程Ａ）で得られたフラグメントの一部を欠失させるか、または他の遺伝子と置換させることで、ＢＰ１８０遺伝子を不活性化するフラグメント（以下、「改変フラグメント」ともいう）を得ることができる。欠失または置換される部分は、コード領域（好ましくはエキソン２）を含むことが好ましい。
B) Step of obtaining a modified fragment that inactivates the BP180 gene Fragment that inactivates the BP180 gene by deleting a part of the fragment obtained in step A) or replacing it with another gene ( Hereinafter also referred to as “modified fragment”). The portion to be deleted or replaced preferably includes the coding region (preferably exon 2).
置換する他の遺伝子を、選択マーカーすなわち薬剤耐性遺伝子（たとえば、ＰＧＫ−ｎｅｏ：ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター／ネオマイシン抵抗遺伝子カセット）とすれば、後述するマウス胚幹細胞の選択が容易になりうる。 If another gene to be replaced is a selectable marker, that is, a drug resistance gene (for example, PGK-neo: phosphoglycerate kinase promoter / neomycin resistance gene cassette), selection of mouse embryonic stem cells described later can be facilitated.
Ｃ）改変フラグメントを組み込まれたターゲッティングベクターを得る工程
改変フラグメントを、任意のベクターに導入してターゲッティングベクターを得る。ベクターの種類は特に制限されないが、改変フラグメントの上流領域と下流領域の相同配列を含むことが好ましい。ベクターの例には、プラスミドベクターｐＳＰ７２（プロメガ株式会社）を適宜改変したものが含まれる。これらのベクターに改変遺伝子断片を通常の手段で組み込むことにより、ターゲッティングベクターが得られる。なお、ターゲッティングベクターはマウス胚幹細胞に相同組み換えを起こすことができるものであれば、特に制限されない。
C) Step of obtaining a targeting vector incorporating the modified fragment The modified fragment is introduced into an arbitrary vector to obtain a targeting vector. The type of the vector is not particularly limited, but preferably includes homologous sequences in the upstream region and the downstream region of the modified fragment. Examples of the vector include those obtained by appropriately modifying plasmid vector pSP72 (Promega Corporation). By incorporating the modified gene fragment into these vectors by conventional means, a targeting vector can be obtained. The targeting vector is not particularly limited as long as it can cause homologous recombination in mouse embryonic stem cells.
Ｄ）ＢＰ１８０遺伝子が不活性化されたマウス胚幹細胞を得る工程
ＢＰ１８０遺伝子が不活性化されたマウス胚幹細胞は、前記ターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞に導入し；遺伝子断片が組み込まれた組み換えマウス胚幹細胞を選別する；ことにより得られる。
前記ターゲッティングベクターのマウス胚幹細胞への導入は、エレクトロポレーション法のほか任意の方法によって行われうる。ターゲッティングベクターは、導入前に線状化されることが好ましい。ベクターを導入するマウス胚幹細胞の種類は特に制限されないが、フラグメントをクローニングしたマウスと同系統のマウスであることが好ましい。
D) Step of obtaining a mouse embryonic stem cell in which the BP180 gene is inactivated The mouse embryonic stem cell in which the BP180 gene is inactivated is introduced into the mouse embryonic stem cell; a recombinant mouse embryonic stem cell in which the gene fragment is incorporated Is obtained.
Introduction of the targeting vector into mouse embryonic stem cells can be performed by any method other than electroporation. The targeting vector is preferably linearized before introduction. The type of mouse embryonic stem cell into which the vector is introduced is not particularly limited, but a mouse of the same strain as the mouse into which the fragment has been cloned is preferable.
さらに、ターゲッティングベクターを導入されたマウス胚幹細胞から、組み換えマウス胚幹細胞を選択する。たとえば前述の遺伝子断片が薬剤（たとえばネオマイシン）耐性遺伝子を含む場合は、ターゲッティングベクターを導入されたマウス胚幹細胞を、当該薬剤を含む培地で培養することで、組み換えマウス胚幹細胞を選択することができる。選択されたマウス胚幹細胞は、公知の遺伝子解析法により組み換え体であることを確認され得る。 Further, recombinant mouse embryonic stem cells are selected from mouse embryonic stem cells into which the targeting vector has been introduced. For example, when the aforementioned gene fragment contains a drug (eg, neomycin) resistance gene, recombinant mouse embryonic stem cells can be selected by culturing mouse embryonic stem cells introduced with a targeting vector in a medium containing the drug. . The selected mouse embryonic stem cell can be confirmed to be a recombinant by a known gene analysis method.
Ｅ）マウス胚幹細胞を、マウス杯盤胞に導入してキメラ胚を得る工程
得られた組み換えマウス胚幹細胞は、所望する種類のマウス初期胚に導入される。マウス初期胚への導入は、マイクロインジェクションなどの公知の方法で行うことができる。好ましいマウスの種類の例には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊが含まれる。
E) Step of introducing mouse embryonic stem cells into mouse goblet cysts to obtain chimeric embryos The obtained recombinant mouse embryonic stem cells are introduced into the desired type of mouse early embryo. Introduction into a mouse early embryo can be performed by a known method such as microinjection. An example of a preferred mouse type includes C57BL / 6J.
Ｆ）キメラ胚をメスマウスの子宮に着床させて、キメラマウス発生させる工程
マウス胚幹細胞を導入されたマウス初期胚を、仮親として用いるメスマウスの子宮内に着床させ、Ｆ１のキメラマウスを得ることができる。仮親として用いるメスマウスは、キメラ胚を得るために用いたマウスと同系統のマウスとすればよい。
F) by implantation chimeric embryo into the uterus of female mice, the early mouse embryos introducing step mouse embryonic stem cells to generate chimeric mice were implanted in the uterus of female mice used as foster mother to obtain a chimeric mouse F 1 be able to. The female mouse used as a temporary parent may be a mouse of the same strain as the mouse used to obtain the chimeric embryo.
Ｇ）Ｆ１のキメラマウス同士を交配させて、ヘテロ接合体マウスまたはホモ接合体マウスを得る工程
前記キメラマウス同士を交配させることにより、１）ヘテロ接合体のノックアウトマウス、または２）ホモ接合体のノックアウトマウスを得ることができる。得られたノックアウトマウスが、ヘテロ接合体か、またはホモ接合体であるかは、サザンブロット法などの公知の遺伝子解析法により行うことができる。
G) by mating the chimeric mice each other F 1, by mating the process the chimeric mice with each other to obtain heterozygous mice or homozygous mice, 1) knockout mice heterozygous or 2) homozygous, Knockout mice can be obtained. Whether the obtained knockout mouse is heterozygous or homozygous can be determined by a known gene analysis method such as Southern blotting.
以下、実施例を参照して本発明をさらに説明するが、これにより本発明の範囲は限定されない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is further demonstrated with reference to an Example, this does not limit the scope of the present invention.
［実施例１］ ノックアウトマウスの製造
マウス１２９Ｓｖ／Ｅｖゲノムライブラリー（Stratagene, La Jolla, CA）から、１４．７ｋｂマウスゲノムＤＮＡフラグメントをクローニングした。このフラグメントは、ＢＰ１８０ゲノムＤＮＡの５’ＵＴＲおよびｅｘｏｎ２を有する。さらに、１４．７ｋｂマウスゲノムＤＮＡフラグメントから、１１．５ｋｂのＮｈｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントをサブクローニングした。
Example 1 Production of Knockout Mice A 14.7 kb mouse genomic DNA fragment was cloned from a mouse 129Sv / Ev genomic library (Stratagene, La Jolla, Calif.). This fragment has the 5'UTR and exon2 of BP180 genomic DNA. In addition, a 11.5 kb NheI-NotI fragment was subcloned from the 14.7 kb mouse genomic DNA fragment.
エキソン２のＡＴＧ開始コドンの６ｂｐ上流部位から、エキソン２の１．２ｋｂ下流部位（イントロン２内部）までの領域を、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター／ネオマイシン抵抗遺伝子カセット（ＰＧＫ−ｎｅｏ）で置換した。置換された領域は、５’−ＴＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＧ−３’（配列番号２）で開始しており、５’−ＡＡＧＣＣＡＧＣＧＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＣＡＣＧＣＴ−３’（配列番号３）で終結している。
このストラテジーによって、ＡＴＧ開始コドンを含むｅｘｏｎ２のコード領域と、イントロン２の一部とが、ＰＧＫ−ｎｅｏで置換された改変フラグメントを得た。これにより、遺伝子転写がＰＧＫ−ｎｅｏでトラップされ、第２エキソンよりも下流のエキソン配列が発現されなかった。さらに改変フラグメントを、プラスミドベクターｐＳＰ７２（プロメガ株式会社）の改変物（図１を参照）に組み込んで、ターゲッティングベクターｐＴＶＣＯＬ１７を得た。ｐＳＰ７２の改変物の塩基配列を、後述の配列表に示した（配列番号１）。ターゲッティングベクターの前記ターゲッティングベクターは、"in Genious Targeting Laboratory, Inc." に委託して製造された。
The region from the 6 bp upstream site of the ATG start codon of exon 2 to the 1.2 kb downstream site (inside intron 2) of exon 2 was replaced with a phosphoglycerate kinase promoter / neomycin resistance gene cassette (PGK-neo). The substituted region begins with 5′-TATGGGATGGATGTGACCAAGAAAAAGCAAGCG-3 ′ (SEQ ID NO: 2) and ends with 5′-AAGCCAGCGGTTGGCACCCTCTCTGCGCCGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 3).
By this strategy, a modified fragment was obtained in which the coding region of exon2 including the ATG initiation codon and a part of intron 2 were replaced with PGK-neo. Thereby, gene transcription was trapped by PGK-neo, and exon sequences downstream from the second exon were not expressed. Furthermore, the modified fragment was incorporated into a modified product of plasmid vector pSP72 (Promega Corporation) (see FIG. 1) to obtain a targeting vector pTVCOL17. The base sequence of the modified pSP72 is shown in the sequence listing below (SEQ ID NO: 1). The targeting vector of the targeting vector was manufactured by consigning to “in Genious Targeting Laboratory, Inc.”.
得られたターゲッティングベクターをＮｏｔＩによって線状化して、１２９Ｓｖ／Ｅｖ胎生期幹細胞（WW1 cell line, NIH[National Institutes of Health]に登録されている）に、エレクトロポレーションによってトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、抗生物質Ｇ４１８を含む（５００ｍｇ／ｍｌ）、ＥＳ細胞用の１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地において３７℃で培養し、組み換えクローンを選択した。 The resulting targeting vector was linearized with NotI and transfected into 129Sv / Ev embryonic stem cells (registered with WW1 cell line, NIH [National Institutes of Health]) by electroporation. Transfected cells were cultured at 37 ° C. in 10% FCS-DMEM medium for ES cells containing antibiotic G418 (500 mg / ml) and recombinant clones were selected.
選択された２００の抵抗性コロニーを拡張させ、以下の条件でＰＣＲを行い、組み換えクローンを同定した。
まず、ターゲッティング構築物を得るために用いられる領域外のショートホモロジーアーム（short homology arm）の下流側（３’）へのプライマーＹＡ１（５’−ＣＡＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡＡＣＴＴＴＧＡ−３’）（配列番号４）と、Ｎｅｏカセットの５’末端へのプライマーＮ１（５’−ＴＴＧＴＧＴＡＧＣＧＣＣＡＡＧＴＧＣＣＡ−３’）（配列番号５）を得た。
プライマーＹＡ１とＮ１を用いて、０．７５ｍＭのＭｇＣｌ２存在下、「９４℃で１分間、６０℃で１分間、さらに７２℃で１分間」３５サイクルのＰＣＲ反応により、５６２ｂｐフラグメントを増幅させた。
The selected 200 resistant colonies were expanded and PCR was performed under the following conditions to identify recombinant clones.
First, primer YA1 (5′-CATACCAGGGCCACTACTTTGA-3 ′) (SEQ ID NO: 4) to the downstream side (3 ′) of the short homology arm outside the region used to obtain the targeting construct, and Neo cassette Primer N1 (5′-TTGTTGTAGGCCCAAGTGCCA-3 ′) (SEQ ID NO: 5) to the 5 ′ end of the DNA was obtained.
Using the primers YA1 and N1, a 562 bp fragment was amplified by 35 cycles of “94 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 1 minute” in the presence of 0.75 mM MgCl 2 . .
適切にターゲッティングされたマウス胚幹細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Jackson Laboratories; Bar Harbor, ME）から得られた胚盤胞にマイクロインジェクトして、キメラ胚を得た。得られたキメラ胚を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊメスマウスに着床して、キメラマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊメスと交雑されている）を発生させた。 Properly targeted mouse embryonic stem cells were microinjected into blastocysts obtained from C57BL / 6J mice (Jackson Laboratories; Bar Harbor, ME) to obtain chimeric embryos. The obtained chimeric embryos were implanted into C57BL / 6J female mice to generate chimeric mice (crossed with C57BL / 6J females).
Ｆ１のヘテロ接合体を、６週齢を超えるＣ５７ＢＬ／６Ｊと交雑させ、インタークロスさせてＢＰ１８０−／−マウス（ホモ接合体）とした。 F1 heterozygotes were crossed with C57BL / 6J over 6 weeks of age and intercrossed into BP180 − / − mice (homozygotes).
成体マウス、および新生仔マウスについて、３つのＰＣＲプライマー［ＹＡ１，Ｎ１，ＷＴ１（５’−ＣＣＴＴＡＴＡＴＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＣＣ−３’）（配列番号６）］を用いて、その遺伝子型を同定した。
ＹＡ１およびＮ１のプライマーペアを用いたＰＣＲでは５６２ｂｐ突然変異バンドが増幅され、一方、ＹＡ１およびＷＴ１のプライマーペアを用いたＰＣＲでは、野生型ゲノムＢＰ１８０ＤＮＡの４９６ｂｐフラグメントが増幅された。
The genotypes of adult mice and newborn mice were identified using three PCR primers [YA1, N1, WT1 (5′-CCTTATATCCCTTGAACTGCC-3 ′) (SEQ ID NO: 6)].
PCR with the YA1 and N1 primer pair amplified a 562 bp mutation band, while PCR with the YA1 and WT1 primer pair amplified a 496 bp fragment of wild-type genomic BP180 DNA.
［実施例２］ マウスの生存試験
ＢＰ１８０−／−マウスの生存曲線と、正常マウスの生存曲線を図３に示す。図３に示されたように、ＢＰ１８０−／−マウスの約２０％が５０日以上、約１０％が１００日以上生存したので、潰瘍治療の実験動物として十分に用いられうる。
[Example 2] Survival test of mice FIG. 3 shows the survival curve of BP180 − / − mice and the survival curve of normal mice. As shown in FIG. 3, about 20% of the BP180 − / − mice survived for 50 days or more, and about 10% survived for 100 days or more. Therefore, they can be sufficiently used as experimental animals for ulcer treatment.
本発明のマウスを動物モデルとして用いることで、新たな皮膚潰瘍治療剤の開発が行われうる。 By using the mouse of the present invention as an animal model, a new skin ulcer therapeutic agent can be developed.
Claims (6)
ＢＰ１８０遺伝子が不活性化されたマウス胚幹細胞をマウス胚盤胞に導入して得られたキメラ胚を、メスマウスの子宮に着床させて得られるキメラマウス同士を交配させて、ヘテロ接合体のノックアウトマウス、またはホモ接合体のノックアウトマウスを得るステップを含む、ノックアウトマウスの製造方法。
A method for producing a knockout mouse deficient in the function of the BP180 gene,
Knockout of heterozygote by crossing chimeric mice obtained by implanting a chimeric embryo obtained by introducing mouse embryonic stem cells inactivated BP180 gene into a mouse blastocyst to the uterus of a female mouse A method for producing a knockout mouse, comprising the step of obtaining a mouse or a homozygous knockout mouse.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005325275A JP2007129938A (en) | 2005-11-09 | 2005-11-09 | Knockout mouse |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005325275A JP2007129938A (en) | 2005-11-09 | 2005-11-09 | Knockout mouse |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007129938A true JP2007129938A (en) | 2007-05-31 |
Family
ID=38152122
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005325275A Pending JP2007129938A (en) | 2005-11-09 | 2005-11-09 | Knockout mouse |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2007129938A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009016855A1 (en) * | 2007-08-02 | 2009-02-05 | National University Corporation Kanazawa University | Method of preventing hair loss and method of preventing hair depigmentation |
| WO2018021527A1 (en) | 2016-07-28 | 2018-02-01 | 香港友池有限公司 | Type-17 collagen production promoter |
-
2005
- 2005-11-09 JP JP2005325275A patent/JP2007129938A/en active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009016855A1 (en) * | 2007-08-02 | 2009-02-05 | National University Corporation Kanazawa University | Method of preventing hair loss and method of preventing hair depigmentation |
| WO2018021527A1 (en) | 2016-07-28 | 2018-02-01 | 香港友池有限公司 | Type-17 collagen production promoter |
| KR20180083324A (en) | 2016-07-28 | 2018-07-20 | 토모이케 인더스트리얼 (에이치.케이.) 리미티드 | Type 17 collagen production accelerator |
| KR20190047743A (en) | 2016-07-28 | 2019-05-08 | 토모이케 인더스트리얼 (에이치.케이.) 리미티드 | Type-17 collagen production promoter |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9497944B2 (en) | Mouse for predicting a behavior of drugs in humans | |
| CN110269047A (en) | Humanization IL-4 and IL-4R α animal | |
| AU2002248977A1 (en) | Transgenic non-human animals for pharmacological and toxicological studies | |
| CN105950654B (en) | Humanized transgenic animal | |
| KR20210020018A (en) | Rodent model of progressive ossification fibrodysplasia | |
| JP2007129938A (en) | Knockout mouse | |
| CN116716345A (en) | Method for preparing humanized RHO and or RHO mutant mice and application thereof | |
| US20220217956A1 (en) | Rodent Model Of Increased Bone Mineral Density | |
| JPWO2008084566A1 (en) | Model mouse, manufacturing method thereof and use thereof | |
| WO2011126126A1 (en) | NON-HUMAN ANIMAL DEFICIENT IN Gm1 GENE PRODUCT AND METHOD OF UTILIZATION THEREOF | |
| CN117363660B (en) | Method for constructing SMA mouse model | |
| WO2002034041A1 (en) | Senescence marker protein 30-defective nonhuman animal, antibody and method of constructing the same | |
| JP4374438B2 (en) | lab8a gene-deficient mouse | |
| JP2009225697A (en) | Abca12 GENE FUNCTION-DEFICIENT MOUSE | |
| JP2007508814A (en) | Transgenic rodents that selectively express human B1 bradykinin receptor protein | |
| US7541511B2 (en) | Mouse exhibiting characteristics of Rothmund-Thomson syndrome and preparation method thereof | |
| JP2008061557A (en) | Mouse with neuron-specific expression of crerecombinase | |
| de Lange et al. | 13 Gene targeting in mice to study blood pressure regulation: role of the renin–angiotensin system | |
| US20130067605A1 (en) | hnRNP A1 KNOCKOUT ANIMAL MODEL AND USE THEREOF | |
| WO2007080710A1 (en) | Mouse deficient in vesicular gaba transporter gene | |
| JP2005013151A (en) | Mouse exhibiting characteristic of rothmund-thomson syndrome and method for preparing the same | |
| JP2004298180A (en) | Mouse with altered genome |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20081031 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110719 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20111115 |