JP2007097460A

JP2007097460A - 熱サイクル印加装置及び熱サイクル印加方法

Info

Publication number: JP2007097460A
Application number: JP2005290080A
Authority: JP
Inventors: Takashi Nakajima; 中島　　隆; Masaya Segawa; 昌也瀬川; Masanori Oka; 岡　　正則
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2005-10-03
Filing date: 2005-10-03
Publication date: 2007-04-19

Abstract

【課題】熱サイクル印加時に、サンプル間の温度差が少ない熱サイクル印加装置を提供する。
【解決手段】熱サイクル印加装置は、熱媒体を供給する熱媒体供給手段と、前記熱媒体供給手段から供給された熱媒体を入口側から出口側に流す空洞部分と、前記熱媒体の流れの方向に沿って複数のサンプルを前記空洞部分に保持するサンプル保持部とを有するチャンバと、前記熱媒体によって前記複数のサンプルに熱サイクルを印加する制御手段と、前記チャンバとは別体として並列に設けられ、前記チャンバの前記出口側の一部と前記入口側の一部とに接続され、前記出口側から前記熱媒体の一部を前記チャンバの入口側に還流させるバイパス経路とを備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、検定サンプルに熱サイクルを印加する方法および熱サイクル印加装置に関し、特に、流体流を利用してサンプルキャリア内の検定サンプルに熱サイクルを印加する方法および熱サイクル印加装置に関する。

近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と呼ばれる核酸増幅技術が普及し、広く医学・生物学の研究や臨床診断、環境検査等の分野で高感度な核酸分析が可能となった。このＰＣＲは、２種類のプライマーを用いて特定配列を増幅する手法である。ＰＣＲは、２本鎖ＤＮＡを第１の温度で開裂する変性工程（概ね９０〜９８℃）、開裂した１本鎖ＤＮＡに第２の温度でプライマーを結合させるアニーリング工程（概ね５０〜７０℃）、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の働きにより第３の温度でプライマーから１塩基ずつ相補鎖を合成する伸張工程（概ね６０〜７５℃）の３段階の工程を１サイクルとして進行し、１サイクル毎にプライマーに挟まれた特定の核酸領域が２倍に増幅する。そこで、第１〜第３の温度との間を遷移させる熱サイクルをｎ回繰り返すことによって２^ｎ倍のＤＮＡを複製することができる（例えば、非特許文献１参照。）。

核酸増幅のために核酸を含むサンプルに上記の熱サイクルを印加する方法としては、複数のサンプルを金属製ブロックに格納して金属製ブロックを加熱又は冷却することでサンプルに熱サイクルを印加するブロックサイクル法や、熱サイクルの各段階ごとに複数の固定温度浴間でサンプルを移動させる固定温度浴法がある。

しかし、上記従来技術によるシステムには両方とも多数の問題点がある。
まず、ブロックサイクル法は、効率が悪く、作動させるのにエネルギーと時間がかかり過ぎ、好ましくない。例えば、ブロック構成のサンプルを熱サイクルにかけるランプ（ramp）速度を増大させる手段として、唯一実用的なのは、熱交換器に対する壁面の露出ができるだけ大きくなるようなサンプル管を設計することである。このようなサンプル管を使用すればランプ時間が短縮されるが、システムの基本的な非効率性は改善されない。したがって、サンプル管またはバイアル（vial）を再構成しなくても、必要な熱サイクルやランプ時間を達成できる熱サイクルシステムを提供することが好ましい。

また、固定温度浴法では、熱サイクルを完了するにはサンプルを複数の温度浴間で移動させることが必要となるため、非効率である。また、サンプル位置による温度差を解消するには、サンプルの大きさを厳格に制限しなければならないことも多い。また、シリコンオイルはサンプルバイアルに付着し、作業環境の汚染という問題を引き起こす。さらに、バイアルを浴から取り出す前にバイアルからオイルを適切に除去しなければ、作業域が危険になることも有り得る。このような場合には、バイアルから適切にオイルを除去するには追加時間が必要となるため、システムはさらに非効率になる。

その他の従来技術では、ヒータブロック型あるいは熱浴型の熱サイクルシステムの問題点を解決する機器もある。たとえば、空気を熱媒体としたサーマルサイクラにおいて、円柱状の空洞内に、試料容器を円周上に配置し、円の中心部から熱風と冷風の空気を交互に噴射させ、加熱及び冷却を行う方法がある（例えば、特許文献１参照。）。この方法では、一定温度に保持するときは空気を微流量にして、同時に空洞内に設けられたファンで空気を攪拌する。しかし、試料容器境界の空気流速が遅く、熱交換効率が悪いため、昇温・冷却速度が小さい（４〜１０℃／ｓｅｃ）。そのため、熱サイクルを所定回数印加するために要する時間がかかり、核酸増幅のために要する所要時間が長くなる。

また、所定温度に維持された第一及び第二の流体流を混合して、サンプルチャンバに供給し、サンプルを熱サイクルにかける熱サイクル核酸検定装置がある（例えば、特許文献２参照。）。この装置では、排出された流体流を再循環させて用いている。ここでは、サンプルチャンバに供給する各流体流の混合比を可変させて目標温度を維持する。しかしこの場合には、風上側と風下側にあるサンプルの温度差が生じることが考えられる。

さらに、熱媒体として圧縮空気を用いる方法も考案されている（例えば、特許文献３参照。）。この方法では、熱媒体としたサーマルサイクラにおいて、筒状空洞内に試料容器を配置し、熱風と冷風の圧縮空気を空洞の片側から交互に噴射させ、加熱及び冷却を行い、一定温度に保持するときは空気を微流量にする。この方法では、試料容器境界の空気流速が非常に大きく、熱交換効率が高いため、昇温・冷却速度が大きくなり（１０〜４０℃／ｓｅｃ）、核酸増幅の所用時間が短い。しかし、熱サイクルにおいて、一定温度に保持する際に空気流量が少ない場合には、風上側と風下側にある試料間の温度差が大きくなり、制御温度に達しない場合には一つの熱サイクルが有効に機能しない場合があるので、試料間で有効な熱サイクル印加回数に差が生じて核酸増幅反応誤差が大きくなる。

Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、第１３５０頁−第１３５４頁、１９８５年特表２０００−５１１４３５号公報特表平９−５０８２２４号公報 WO２００４／０４２０８６

上記従来技術では、熱サイクルを所定回数だけ印加するために要する時間が長くなり、その結果、例えば、サンプルとして核酸を用い、所定の酵素によって核酸増幅を行う場合には、核酸増幅のための所要時間が長くなる。また、多数の試料に対して熱サイクルを印加する場合には、熱媒体に接触する試料間の温度差が大きいという問題がある。

本発明の目的は、熱サイクルにおいて、圧縮ガスを用いることによって高速で温度遷移させることができると共に、熱サイクル中の一定温度に保持する際に試料間の温度差を少なくすることができる熱サイクル印加装置を提供することである。

本発明に係る熱サイクル印加装置は、熱媒体を供給する熱媒体供給手段と、
前記熱媒体供給手段から供給された熱媒体を入口側から出口側に流す空洞部分と、前記熱媒体の流れの方向に沿って複数のサンプルを前記空洞部分に保持するサンプル保持部とを有するチャンバと、
前記熱媒体によって前記複数のサンプルに熱サイクルを印加する制御手段と、
前記チャンバとは別体として並列に設けられ、前記チャンバの前記出口側の一部と前記入口側の一部とに接続され、前記チャンバの前記出口側から前記熱媒体の一部を前記入口側に還流させるバイパス経路と
を備えたことを特徴とする。

また、前記制御手段は、前記チャンバの空洞部分を流れる熱媒体の温度及び流量を制御して、前記複数のサンプルに熱サイクルを印加することができる。

さらに、前記バイパス経路の中で前記熱媒体が逆流することを制限する逆止機構を有するポンプを備えていてもよい。

またさらに、前記サンプル保持部は、前記熱媒体の流れの方向に対して千鳥配置されていることが好ましい。

また、前記熱媒体は、気体であってもよい。

本発明に係る熱サイクル印加方法は、熱媒体を入口側から出口側に流す空洞部分と、前記熱媒体の流れの方向に沿って複数のサンプルを前記空洞部分に保持するサンプル保持部とを有するチャンバに前記熱媒体を供給して前記複数のサンプルに熱サイクルを印加する熱サイクル印加方法であって、
熱媒体を供給するステップと、
前記チャンバの入口側から出口側に前記熱媒体を流すステップと、
前記チャンバと別体として並列に設けられ、前記チャンバの出口側の一部から入口側の一部とを接続するバイパス経路を介して、前記チャンバの出口側から前記熱媒体の一部を前記入口側に還流させるステップと、
前記熱媒体によって前記複数のサンプルに熱サイクルを印加するステップと
を含むことを特徴とする。

また、前記熱サイクルを印加するステップでは、前記チャンバの空洞部分を流れる熱媒体の温度及び流量を制御して、前記複数のサンプルに熱サイクルを所定回数にわたって印加してもよい。

本発明に係る熱サイクル印加装置によれば、温度及び流量を制御した熱媒体を用いることによって高速で温度遷移させることができる。また、熱サイクルにおいて、一定温度に保持する場合に、バイパス経路によって、チャンバの出口側から熱媒体の一部を入口側に還流させることによって、サンプル間の温度差を小さくすることができる。

本発明の実施の形態に係る熱サイクル印加装置について添付図面を用いて説明する。なお、図面において実質的に同一の部材には同一の符号を付している。

実施の形態１
図１は、本発明の実施の形態１に係る熱サイクル印加装置２０の構成を示すブロック図である。この熱サイクル印加装置２０は、圧縮ガス源１、マニホールド２、電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、冷却コイル４、熱風ヒータ５、チャンバ６、バイパス経路１０を備える。この熱サイクル印加装置２０では、圧縮ガス源１より供給された圧縮ガスがマニホールド２内に設置された電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄに分配される。圧縮ガスは、マニホールド２内の電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄの後で、冷却ラインと加熱ラインに分割される。冷却ラインでは冷却コイル４を通過して冷却された後、冷風がチャンバ６に供給される。一方、加熱ラインでは熱風ヒータ５を通過して加熱された後、熱風がチャンバ６に供給される。電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄの制御により冷却ライン及び加熱ラインに供給される圧縮ガスの流量を制御して、制御された温度及び流量を有する冷風又は熱風がチャンバ６に供給される。チャンバ６内に供給された冷風又は熱風の圧縮ガスによって、チャンバ６内に保持されたサンプルに所定の熱サイクルが印加される。この熱サイクル印加装置２０では、チャンバ６の出口部から圧縮ガスの一部を回収し、再び入口部に還流させるバイパス経路１０を設けたことが大きな特徴である。本発明に係る熱サイクル印加装置では、チャンバ６の出口部から圧縮ガスの一部を回収し、再び入口部に還流させるバイパス経路１０を設けたことで、チャンバ６内の入口付近のサンプルと出口付近のサンプルとの間の温度差を低減させ、温度分布を均一にすることができる。

また、熱媒体の温度をサンプルの目標温度よりも高温又は低温に設定しておき、この熱媒体をチャンバ６内に大流量で導入して、サンプルを目標温度に近い温度まで急速に加熱又は冷却することができる。さらに、熱媒体をチャンバ内に微少流量で導入し、あるいは、熱媒体の供給を停止させて、チャンバ６内の熱媒体に接触するサンプルを一定の目標温度で保持することができる。本発明の熱サイクル印加装置では、特にこの微少流量又は停止状態の場合に、バイパス経路１０によりチャンバ６の出口部から圧縮ガスの一部を回収し、再び入口部に還流させることによって、チャンバ６内を攪拌できる。これによって上述のようにサンプル間の温度分布を均一にできる。

なお、本明細書中では、「チャンバ」もしくは「サンプルチャンバ」という用語は、サンプルを保持でき、所望の温度に変化させた圧縮ガスが送り込まれる部分を示す。また、「サンプル」という用語は、試験サンプル又は検定サンプルを指し、ここでは、検査対象から採取した試料と様々な試験試薬を混合したものである。また、サンプルチャンバには、１個から２０個までのサンプルを懸架できる。

以下に、この熱サイクル印加装置２０の各構成部材について説明する。

圧縮ガス源
圧縮ガス源１において、熱媒体として用いる圧縮ガスの圧力は０．０５ＭＰａ〜１．０ＭＰａの範囲内が好ましく、更に好ましくは０．２ＭＰａ〜０．５ＭＰａの範囲がさらに好ましい。圧縮ガスの成分は、特に限定はないが、空気、二酸化炭素、窒素、アルゴンなどでもよい。特に好ましくは、廃棄およびリサイクルに関する問題を解消することができる空気がよい。また、圧縮ガスを用いることによってサンプルを高速に温度遷移させることができるので、非常に高速に制御した時間間隔で温度変化させる必要があるサンプルでは、ランプ時間が重要な因子であるので、特に有用である。

マニホールド
圧縮ガスは、マニホールド部２で２種類の流路に分岐される。一方は、冷却ラインであって、熱交換コイル部に導かれ、冷却されてもよい。もしくは、空冷にて冷却されても良い。もう一方は、加熱ラインであって、熱風ヒータ５などにより加熱される。冷却ラインで冷却された圧縮ガスと、加熱ラインで加熱された圧縮ガスは、チャンバ６の入り口部で合流される。このマニホールド２から、冷却ラインからは、例えば、０℃〜３０℃の圧縮ガスと、加熱ラインからは、例えば、１５０℃〜２００℃の圧縮ガスがチャンバ６に入力され、所定の制御タイミングでチャンバ６内に送風される。マニホールド部２に設置された電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄを制御して、圧縮ガスを所望の温度及び流量に調整することができる。電磁弁の個数には特に限定はないが、冷却用、加熱用それぞれに２種類ずつ設置しても良い。なお、設置する電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄは、同一規格の電磁弁であってもよいが、異なる規格の電磁弁であっても良い。好ましくは、有効断面積が０．２ｍｍ^２〜０．６ｍｍ^２の電磁弁と有効断面積５ｍｍ^２〜２０ｍｍ^２の電磁弁を冷却用と加熱用にそれぞれ設置するのが好ましい。

チャンバ部
チャンバ６の構造は、断面積が３００ｍｍ^２以下の直方体形状が好ましく、更に好ましくは、断面積が１５０ｍｍ^２以下の直方体形状であればよい。チャンバ６は、耐熱性に優れた熱伝導度が小さい材料で構成することが好ましく、熱伝導度が０．３W／ｍＫ以下の材料で構成することが特に好ましい。マイクロヒュージ管を保持するための挿入部８は、３０本以下が好ましく、１５本以下が特に好ましい。マイクロヒュージ管の挿入部８は、圧縮ガスの流れる方向に沿って設けることが好ましい。さらに、挿入部８は、千鳥配置に設定するのがよい。ここで、千鳥配置とは、各サンプルを保持する挿入部８が圧縮ガスの流れる方向に沿って配置されると共に、圧縮ガスの流れる方向に対して挿入部８が１本毎にジグザグになるように設けられた配置をいう。また、各マイクロヒュージ管の挿入部８間の間隔は、圧縮ガスの流れる方向に沿った成分として３〜１０ｍｍの範囲であればよく、４〜６ｍｍの範囲内で等間隔配置するのが好ましい。

マイクロヒュージ管
マイクロヒュージ管は、チャンバ６内の一側面に設けられた挿入部８から空洞部に挿入されて保持される。このマイクロヒュージ管は、サンプル溶液部分が完全にチャンバ６内の圧縮ガスが流れる空洞部内に保持されるのが好ましい。更に、マイクロヒュージ管は、チャンバ内壁との距離が０．５ｍｍ以上離れている位置に設置できるよう設計されることがさらに好ましい。マイクロヒュージ管の詳細は、内部に空洞がある円筒形状が好ましく、外径φ１〜φ３ｍｍ、肉厚が０．２ｍｍ〜０．５ｍｍものが好ましい。マイクロヒュージ（microfuge）管は、３μＬから３０μＬの溶液を保持できるものがよい。なお、サンプルとして増幅する核酸が含まれる溶液を用いる場合には、その溶液部分がチャンバ６内の空洞部内に保持されることが好ましい。

バイパス経路
本発明の最も重要な特徴は、チャンバ６の出口部から圧縮ガスの一部を回収し、再び入口部に戻すバイパス経路１０を設けたことである。このバイパス経路１０によって、圧縮ガスを還流させることができるので、サンプル間の温度分布を軽減させることができる。バイパス経路１０は、チャンバ６の風下側に設けられたバイパス経路入口９ａと、風上側に設けられたバイパス経路出口９ｂとを接続して設けられている。このバイパス経路入口９ａと出口９ｂの内径は、φ２ｍｍ〜φ１０ｍｍが好ましく、φ３ｍｍ〜φ６ｍｍが特に好ましい。また、バイパス経路入口９ａと出口９ｂの間に、マイクロヒュージ管を保持するための全ての挿入部８が存在させることが好ましい。すなわち、バイパス経路１０を接続するためのバイパス経路入口９ａと出口９ｂとは、チャンバ６の一側面に設けられたマイクロヒュージ管を保持するための全ての挿入部８を挟んで設けることが好ましい。

圧縮ガス還流用ポンプ
チャンバ６の出口側から圧縮ガスの一部を入口側に還流させる方法は、チャンバ６の出口側の一部と入口側の一部とを接続するバイパス経路１０を介してポンプ１１を用いて強制的に還流させることによって実現できる。ここで使用されるポンプ１１は、特に限定はないが、逆方向に流量制限がかかる逆止弁などの機構を有することが好ましい。更に好ましくは、ポンプヘッド部が小容量のダイヤフラムポンプがよい。また、ポンプ流量は、１Ｌ／ｍｉｎ〜２０Ｌ／ｍｉｎのものが好ましく、更に好ましくは４Ｌ／ｍｉｎ〜１０Ｌ／ｍｉｎがよい。

チャンバ６内を流れる圧縮ガスの流量がポンプ１１の能力範囲内の微少流量又は場合には、チャンバ６内の風下側と風上側とを接続するバイパス経路１０内のポンプ１１の働きにより、循環風量が発生しチャンバ６内を撹拌することができる。一方、チャンバ６内の風量がポンプ１１の能力を越える大流量の場合には、ポンプ１１に設置されている逆止弁の働きによってポンプ１１で形成されたバイパス経路１０の流量がほぼ０になるので、チャンバ６の流量が低下することはない。つまり、温度を安定化するため微風量が要求される場合は、バイパス経路１０が機能して循環風量が発生しチャンバ６内を撹拌することができる。一方、急激な温度変化を要求されている場合は、逆止弁の働きでバイパス経路１０が実質的に機能しない状態となって大流量の圧縮ガスがチャンバ６内をそのまま流れてサンプルに急速に温度変化を生じさせることができる。

図３は、実施の形態１に係る熱サイクル印加方法のフローチャートである。
（ａ）熱媒体を供給する。図１では、圧縮ガス源１からマニホールド２に熱媒体である圧縮ガスを供給する。
（ｂ）チャンバ６の入口側７ａから出口側７ｂに熱媒体である圧縮ガスを流す（Ｓ０１）。
（ｃ）チャンバ６と別体として並列に設けられ、チャンバ６の出口側の一部９ａから入口側の一部９ｂとを接続するバイパス経路１０を介して、チャンバ６の出口側７ｂから熱媒体の一部を入口側７ａに還流させる（Ｓ０２）。なお、チャンバ６内を流す圧縮ガスが微少流量又は停止状態の場合にのみバイパス経路１０が機能する。
（ｄ）温度及び流量が制御された熱媒体によって、熱サイクルを複数のサンプルに印加する（Ｓ０３）。なお、熱サイクルとしては、例えば、第１温度から第２温度に遷移させ、第２温度で所定時間だけ保持し、その後、第２温度から第１温度に遷移させる熱サイクルとすることができる。熱サイクルの例としては、例えば、図４から図７に示す熱サイクルを印加できる。図５及び図７に示すように、熱サイクルは、さらに第３温度に遷移させ、第３温度で保持する工程を含んでもよい。
（ｅ）以上の熱サイクルを所定回数、およそ２０〜５０回程度繰り返してサンプルに印加する。
以上によって、サンプルに熱サイクルを所定回数にわたって有効に印加することができる。

本発明の実施例１では、実施の形態１に係る熱サイクル印加装置を核酸増幅装置として用いる場合の具体的な例について説明する。この核酸増幅装置は、図１とほぼ同様の構成を有する。各構成部材について以下に説明する。

ａ）圧縮ガス源１としては、約０．６ＭＰａの施設計装エアーから圧力レギュレータ（ＳＭＣ製ＡＲ４２５）により０．３ＭＰａに減圧した圧縮空気を入力した。
ｂ）マニホールド２は、図１に示す圧縮ガス回路を有し、且つ、電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄを４個固定できるようにジュラコンを材料にして加工製作した。電磁弁３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄには、ＣＫＤ社製の型番「ＧＦＡＢ４１−５−０−１２Ｃ−３」の電磁弁と、ＣＫＤ社製の型番「ＧＦＡＢ１１−Ｚ−１２Ｃ−３」の電磁弁とを、冷却ラインおよび加熱ラインについてそれぞれ１個ずつ使用し、マニホールド２に配置した。
ｃ）冷却コイル４には、内径φ５ｍｍの銅管を約５ｍ使用し、巻径約２００ｍｍのらせん状に巻いたものを使用した。その冷却コイル４を氷水中に浸漬して熱交換を行った。
ｄ）ヒータ５には、竹綱製作所製ＳＨ１Ａ（８００Ｗ／１００Ｖ）を使用し、熱風の温度を１８０℃に制御してチャンバ６に供給した。

ｅ）チャンバ６は、テフロン（登録商標）を材料にして加工製作した。その空洞部は高さ２０ｍｍ、幅６mm、長さ１００ｍｍの直方体形状とし、マイクロヒュージ管をチャンバ６の上部から挿入し、底面から約１ｍｍ離して風向に対して中央３６ｍｍ内に１０本を千鳥配置になるように設置できる構造とした。
ｆ）チャンバ６の空洞部の風下端から１０mmの位置に設けられた内径４mmのバイパス経路入口９ａと、風上端から１０mmの位置に設けられた内径４ｍｍのバイパス経路出口９ｂとを接続するバイパス経路１０を設けた。このバイパス経路１０内には、ポンプ１１を設けた。ポンプ１１は、榎本マイクロポンプ製ＭＶ−６００Ｇのダイヤフラム型空気ポンプを使用し、ガス流量は約６Ｌ／ｍｉｎであった。このバイパス経路１０によって、チャンバ６内を流れる圧縮空気が微少流量又は停止状態の際には、チャンバ６内の空気を撹拌することができる。

この実施例１では、図６に示すように、
ｉ）加熱して９０℃にする
ｉｉ）９０℃から６０℃に冷却する。
ｉｉｉ）６０℃で約５秒間保持する。
という熱サイクルを３０回繰り返して印加した。また、図４は、図６の部分拡大図である。このときの９０℃への昇温時の昇温速度、及び、９０℃から６０℃への冷却時の冷却速度を測定し、バイパス経路１０がない場合を比較例として測定した結果とを下記表１に示す。この表１によれば、バイパス経路１０を追加しても昇温速度及び冷却速度の低下はほとんどないことがわかる。これは、大流量の圧縮空気を流す場合にはバイパス経路１０のポンプ１１の逆止弁によって実質的にバイパス経路１０が機能せず、大流量の圧縮空気がそのままチャンバ６内を流れるためであると考えられる。

なお、ここでは図６に示すような熱サイクルを印加したが、熱サイクルとしては上記の場合に限られず、例えば、図７に示す熱サイクルを印加することができる。図７の熱サイクルでは、
ｉ）加熱して９０℃にする。
ｉｉ）９０℃から６０℃に遷移させる。
ｉｉｉ）６０℃で３秒間保持する。
ｉｖ）６０℃から７２℃に遷移させる。
ｖ）７２℃で３秒間保持する。
という熱サイクルを３０回にわたって印加する場合を示している。この熱サイクルでは、図６の熱サイクルと比較すると、第１の温度（９０℃）、第２の温度（６０℃）に加えて、第３の温度（７２℃）での工程を設けている。また、図５は、図７の部分拡大図である。このように、使用する酵素が働く温度に応じて熱サイクルを構成する温度を選択すればよい。また、この熱サイクルの回数は、サンプルに応じて適宜選択すればよい。例えば、核酸増幅がおよそ１０^９（＝２^３０倍）倍程度必要な場合には、３０サイクル程度行えばよい。

また、下記表２には、上記熱サイクルにおいて、６０℃で５秒間保持時の１０本のマイクロヒュージ管の温度分布を測定した結果を示す。バイパス経路１０がない比較例の場合は、制御温度である６０℃から２℃以上高い場所もあり、全体でも２℃以上の温度差が発生しているのに対して、本発明の実施例１のバイパス経路１０を有する場合は、すべての位置で制御温度である６０℃に対して±０．５℃以内に収まっており全体でも１℃以内の差であった。このことは、バイパス経路１０を設けたことによりチャンバ６内を還流させることによってサンプル間の温度差が減少し、均一な温度分布が得られたことを表している。

この核酸増幅装置によれば、温度及び流量を制御した圧縮空気を用いるので、従来に比べて非常に高速に温度遷移させることができると共に、バイパス経路を用いて圧縮空気を還流させてチャンバ内を攪拌できるので、熱サイクルにおいて、一定温度に保持する場合にもサンプル間の温度差を低減でき、均一な温度分布を得ることができる。そこで、核酸増幅を迅速に行うことができ、遺伝子判定、病原菌に対する薬剤選択などを迅速化できるので、産業界に大きく寄与することが期待される。

本発明に係る熱サイクル印加装置は、温度及び流量を制御した圧縮ガスを用いてサンプルを高速に温度遷移させることができ、バイパス経路を用いて圧縮ガスを還流させてチャンバ内を攪拌できるので、熱サイクルにおいて、一定温度に保持する場合にもサンプル間の温度差を低減でき、均一な温度分布を得ることができる。そこで、この熱サイクル印加装置は、サンプルに多数回の熱サイクルを印加する核酸増幅装置としても有用である。

本発明の実施の形態１に係る熱サイクル印加装置の構成を示す概略図である。図１のチャンバの拡大図である。本発明の実施の形態１に係る熱サイクル印加方法のフローチャートである。本発明の実施例１における熱サイクルの拡大図である。別例の熱サイクルの拡大図である。本発明の実施例１における熱サイクルの全体を示す図である。別例の熱サイクルの全体を示す図である。

符号の説明

１圧縮ガス源、２マニホールド、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ電磁弁、４冷却コイル、５ヒータ、６チャンバ、７ａチャンバ入口、７ｂチャンバ出口、８、８ａ、８ｂ、８ｃ、８ｄ、８ｅ、８ｆ、８ｇ、８ｈ、８ｉ、８ｊマイクロヒュージ管挿入部、９ａバイパス経路入口、９ｂバイパス経路出口、１０バイパス経路、１１ポンプ、２０熱サイクル印加装置

Claims

熱媒体を供給する熱媒体供給手段と、
前記熱媒体供給手段から供給された熱媒体を入口側から出口側に流す空洞部分と、前記熱媒体の流れの方向に沿って複数のサンプルを前記空洞部分に保持するサンプル保持部とを有するチャンバと、
前記熱媒体によって前記複数のサンプルに熱サイクルを印加する制御手段と、
前記チャンバとは別体として並列に設けられ、前記チャンバの前記出口側の一部と前記入口側の一部とに接続され、前記チャンバの前記出口側から前記熱媒体の一部を前記入口側に還流させるバイパス経路と
を備えたことを特徴とする熱サイクル印加装置。
前記制御手段は、前記チャンバの空洞部分を流れる熱媒体の温度及び流量を制御して、熱サイクルを前記複数のサンプルに印加することを特徴とする請求項１に記載の熱サイクル印加装置。
前記バイパス経路の中で前記熱媒体が逆流することを制限する逆止機構を有するポンプを備えたことを特徴とする請求項１に記載の熱サイクル印加装置。
前記サンプル保持部は、前記熱媒体の流れの方向に対して千鳥配置されていることを特徴とする請求項１に記載の熱サイクル印加装置。
前記熱媒体は、気体であることを特徴とする請求項１に記載の熱サイクル印加装置。
熱媒体を入口側から出口側に流す空洞部分と、前記熱媒体の流れの方向に沿って配置された複数のサンプルを前記空洞部分に保持するサンプル保持部とを有するチャンバに前記熱媒体を供給して前記複数のサンプルに熱サイクルを印加する熱サイクル印加方法であって、
熱媒体を供給するステップと、
前記チャンバの入口側から出口側に前記熱媒体を流すステップと、
前記チャンバと別体として並列に設けられ、前記チャンバの出口側の一部から入口側の一部とを接続するバイパス経路を介して、前記チャンバの出口側から前記熱媒体の一部を前記入口側に還流させるステップと、
前記熱媒体によって前記複数のサンプルに熱サイクルを印加するステップと
を含むことを特徴とする熱サイクル印加方法。
前記熱サイクルを印加するステップでは、前記チャンバの空洞部分を流れる熱媒体の温度及び流量を制御して、前記複数のサンプルに前記熱サイクルを所定回数にわたって印加することを特徴とする請求項６に記載の熱サイクル印加方法。