JP2007089402A - イネ萎縮ウイルスの感染に必須なイネ遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【課題】 イネ萎縮ウイルス抵抗性および／またはいもち病菌抵抗性のイネの作出方法を確立し、イネ萎縮ウイルスに対する抵抗性および／またはいもち病菌抵抗性を有する品種を得ること。
【解決手段】 本発明により、ＲＩＭ１配列が提供され、イネ萎縮病およびいもち病の処置または予防において有用な標的およびそれによるスクリーニング法、ならびにその方法によって同定される医薬を用いて、イネ萎縮病およびいもち病に関連する病害を処置することができるようになった。
【選択図】なし
【解決手段】 本発明により、ＲＩＭ１配列が提供され、イネ萎縮病およびいもち病の処置または予防において有用な標的およびそれによるスクリーニング法、ならびにその方法によって同定される医薬を用いて、イネ萎縮病およびいもち病に関連する病害を処置することができるようになった。
【選択図】なし
Description
本発明は、イネ萎縮ウイルス抵抗性イネの作出方法に関する。より具体的には、イネ萎縮ウイルスの複製に必要なウイルスの宿主である、イネの核酸分子であるイネＲＩＭ１核酸分子を用いた、イネ萎縮ウイルス抵抗性イネの作出方法に関する。
イネ萎縮ウイルスがヨコバイによって伝播され、虫体内で増殖することが、１９３０年代に証明された（非特許文献１＝Ｆｕｋｉｓｈｉ，Ｔ：Ｊ，Ｆａｃ．Ｈｏｋｋａｉｄｏ Ｉｍｐ． Ｕｎｉｖ． ４５， ８３−１５４ （１９４０））。様々なウイルスについて生物学的に多様な伝搬形式が明らかになってきている。昆虫を媒介者とする植物ウイルスは、その伝搬様式によって、４つに大別されている（非特許文献２＝上田一郎および玉田哲男「植物ウイルスと媒介生物の相互関係」 細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ 分子レベルからみた植物の耐病性−植物と病原菌の相互作用に迫る− １５６〜１６５ １９９７年）。
イネ萎縮病の防除は、媒介昆虫であるツマグロヨコバイ等のヨコバイ類を薬剤処理することによって実施してきた。一旦、イネ萎縮病が発生すると、数年間その発生が終焉しない。そのため、薬剤処理によるイネ萎縮病の防除を実施しようとすると、大量の薬剤を使用しなければならず、環境汚染を起こす結果となる。
イネ萎縮ウイルスの防除の代替的な手段としては、抵抗性品種の利用が最も有効な方法のひとつとして考えられるが、イネ萎縮病の病原であるイネ萎縮ウイルスに対する抵抗性品種は未だ報告されていない。
Ｆｕｋｉｓｈｉ，Ｔ：Ｊ，Ｆａｃ．Ｈｏｋｋａｉｄｏ Ｉｍｐ． Ｕｎｉｖ． ４５， ８３−１５４ （１９４０） 上田一郎および玉田哲男「植物ウイルスと媒介生物の相互関係」 細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ 分子レベルからみた植物の耐病性−植物と病原菌の相互作用に迫る− １５６〜１６５ １９９７年
Ｆｕｋｉｓｈｉ，Ｔ：Ｊ，Ｆａｃ．Ｈｏｋｋａｉｄｏ Ｉｍｐ． Ｕｎｉｖ． ４５， ８３−１５４ （１９４０） 上田一郎および玉田哲男「植物ウイルスと媒介生物の相互関係」 細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ 分子レベルからみた植物の耐病性−植物と病原菌の相互作用に迫る− １５６〜１６５ １９９７年
したがって、イネ萎縮ウイルス抵抗性イネの作出方法を確立し、イネ萎縮病ウイルスに対する抵抗性を有する品種を得ることが望まれる。
そこで、本発明者らは、イネ品種日本晴の内在性レトロトランスポゾンＴｏｓ１７による遺伝子破壊系統（ミュータントパネル）を用いて、イネ萎縮ウイルスの感染・増殖に関与する遺伝子を単離し、イネのウイルス病抵抗性育種素材の作出法を開発した。
上述のイネ遺伝子破壊系統の一つはイネ萎縮ウイルスに対する感受性に変化が生じ、本ウイルるスに対し、抵抗性を示した。この抵抗性を示した個体において、Ｔｏｓ１７の挿入により破壊された遺伝子の配列を解析した。さらに、この遺伝子を用いて、上記遺伝子破壊系統の形質転換を行ったところ、イネ萎縮ウイルスに対する感染性が野生型日本晴と同等に復帰した。このことにより、得られた遺伝子がイネ萎縮ウイルスの増殖に関与する遺伝子であると結論された。上述の遺伝子構造を解析したところ、２種のｍＲＮＡの存在が確認された８、図４および図５）。本発明者らは、上述の遺伝子をＲｉｃｅ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ １（ＲＩＭ１）と命名した。また、この遺伝子の破壊系統では、いもち病に対しても抵抗性を獲得していることが示された。
したがって、本願発明の方法に従うと、本遺伝子の機能を改変することによってイネ萎縮ウイルスといもち病に対する抵抗性を付与し得る。
つまり、ＲＩＭ１遺伝子の発現制御により、イネ萎縮ウイルスに対する抵抗性を付与することが可能であり、農業分野で利用され得る。
上述のＲＩＭ１遺伝子を破壊した系統は葉先が捻れ、植物体の生長も抑制される場合がある。この問題が、組織、器官特異的なＲＩＭ１遺伝子の発現量の低下によるのであれば、ＲＮＡｉ、コサプレション、アンチセンスサプレションなどにより、ＲＩＭ１遺伝子の発現を適度に抑制させ、それらＲＩＭ１遺伝子抑制株の中からＲＤＶ抵抗性系統を選出することによって、所望するイネ萎縮病ウイルスに対して耐性である品種を作出し得る。また、ＲＤＶ抵抗性と生育、形態形成に関与するＲＩＭ１の作用点が異なるのであれば、ドミナントネガティブアレルを検索することによって、所望するイネ萎縮病ウイルスに対して耐性である品種が得られ得る。
したがって、本発明は、以下を提供する。
（項目１）
（ａ）配列番号１または配列番号３に示す塩基配列；
（ｂ）該（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（ｃ）該（ａ）の塩基配列において、１または複数の置換、付加または欠失を有し、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（ｄ）該（ａ）の塩基配列に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（ｅ）該（ａ）の塩基配列からなる核酸分子の種相同体、スプライス変異体または対立遺伝子変異体をコードし、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列、および
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される塩基配列のフラグメント
からなる群より選択される配列を含む、核酸分子。
（項目２） 前記生物学的機能は、植物におけるイネ萎縮ウイルスの増殖への関与および前記核酸分子の破壊によりイネ萎縮ウイルスに対する抵抗性が付与されることからなる群より選択される、項目１に記載の核酸分子。
（項目３） 前記抵抗性は、前記核酸分子における塩基配列の少なくとも一部が破壊されることもしくは発現が抑制されること、または該核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現が抑制されることによって、付与される、項目２に記載の核酸分子。
（項目４） 前記生物学的機能は、植物におけるいもち病菌の増殖への関与および前記核酸分子の破壊によりいもち病菌に対する抵抗性が付与されることからなる群より選択される、項目１に記載の核酸分子。
（項目５） 前記抵抗性は、前記核酸分子における塩基配列の少なくとも一部が破壊されることもしくは発現が抑制されること、または該核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現が抑制されることによって、付与される、項目４に記載の核酸分子。
（項目６） 前記生物学的機能は、イネ萎縮病に対する耐性を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目７） 前記生物学的機能は、いもち病に対する耐性を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目８） イネ萎縮ウイルスに対する抵抗性およびいもち病菌に対する抵抗性からなる群より選択される少なくとも１つの抵抗性を付与することができる因子であって、該因子は、項目１に記載の核酸分子の機能を阻害する機能を有する、因子。
（項目９） 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目８に記載の因子。
（項目１０） 前記因子は、項目１に記載される核酸分子と相互作用するか、または項目１に記載される核酸分子によってコードされるポリペプチドと相互作用することを特徴とする、項目８に記載の因子。
（項目１１） 前記因子は、項目１に記載される核酸分子のアンチセンス核酸分子またはＲＮＡｉ分子であるか、あるいは項目１に記載される核酸分子によってコードされるポリペプチドに対する抗体であることを特徴とする、項目８に記載の因子。
（項目１２） 前記因子を特異的部位に送達させる手段をさらに含む、項目８に記載の因子。
（項目１３） 前記手段は、前記特異的部位に特異的に前記核酸分子を発現させるものである、項目１２に記載の因子。
（項目１４） 前記手段は、プロモーターである、項目１３に記載の因子。
（項目１５） 項目１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
（項目１６） 項目１に記載の核酸分子の機能を阻害する阻害核酸分子を含む、ベクター。
（項目１７） 前記阻害核酸分子は、ドミナントネガティブ実験における条件下において、項目１に記載の核酸分子または該核酸分子の発現を調節する配列とハイブリダイズすることを特徴とする、項目１６に記載のベクター。
（項目１８） 前記阻害核酸分子は、リプレッションドメインをコードする領域を含む、項目１６に記載のベクター。
（項目１９） 前記阻害核酸分子の発現を特異的部位においてのみ起こさせるためのプロモーターをさらに含む、項目１６に記載のベクター。
（項目２０） 項目１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物細胞。
（項目２１） 項目１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物組織。
（項目２２） 項目１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物器官。
（項目２３） 項目１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物体。
（項目２４） 項目１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物種子。
（項目２５） イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を有する植物を作出する方法であって、
（Ａ）目的とする植物において、項目１に記載の核酸分子またはそれに対応する核酸分子の発現を抑制させる工程
を包含する、方法。
（項目２６） さらに、（Ｂ）イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を有する植物を選択する工程を包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２７） 前記発現が抑制された植物を再生させる工程をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２８） 前記抑制は、ジーンサイレンシング技術またはドミナントネガティブ法によって達成される、項目２５に記載の方法。
（項目２９） 前記ジーンサイレンシング技術は、ＲＮＡｉ、コサプレッション、リボザイム、キメラオリゴ、アンチセンスサプレッションおよびそれらの組合せからなる群より選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０） 前記植物は、イネ科植物である、項目２５に記載の方法。
（項目３１） 前記植物は、イネ属植物である、項目２５に記載の方法。
（項目３２） 前記植物は、イネである、項目２５に記載の方法。
（項目３３） 前記植物は、ジャポニカ種のイネである、項目２５に記載の方法。
（項目３４） イネ萎縮病に対して耐性を有する植物を作出する方法であって、
（Ａ）目的とする植物において、項目１に記載の核酸分子またはそれに対応する核酸分子の発現を抑制させる工程
を包含する、方法。
（項目３５） いもち病菌に対して抵抗性を有する植物を作出する方法であって、
（Ａ）目的とする植物において、項目１に記載の核酸分子またはそれに対応する核酸分子の発現を抑制させる工程
を包含する、方法。
（項目３６） さらに、（Ｂ）イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を有する植物を選択する工程を包含する、項目３５に記載の方法。
（項目３７） 前記発現が抑制された植物を再生させる工程をさらに包含する、項目３５に記載の方法。
（項目３８） 前記抑制は、ジーンサイレンシング技術またはドミナントネガティブ法によって達成される、項目３５に記載の方法。
（項目３９） 前記ジーンサイレンシング技術は、ＲＮＡｉ、コサプレッション、リボザイム、キメラオリゴ、アンチセンスサプレッションおよびそれらの組合せからなる群より選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４０） 前記植物は、イネ科植物である、項目３５に記載の方法。
（項目４１） 前記植物は、イネ属植物である、項目３５に記載の方法。
（項目４２） 前記植物は、イネである、項目３５に記載の方法。
（項目４３） 前記植物は、ジャポニカ種のイネである、項目３５に記載の方法。
（項目４４） いもち病に対して耐性を有する植物を作出する方法であって、
（Ａ）目的とする植物において、項目１に記載の核酸分子またはそれに対応する核酸分子の発現を抑制させる工程
を包含する、方法。
（項目４５） 項目２５、３４、３５または４４のいずれか１項に記載の方法によって作出された、植物。
（項目４６） イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を付与させる因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は：
Ａ）因子の候補を提供する工程；
Ｂ）該候補と項目１に記載の核酸分子とを相互作用させて、該核酸分子の機能が抑制されるかどうかを検出する工程；
Ｃ）該機能の抑制を提供する候補をイネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子であると判定する工程、
を包含する、方法。
（項目４７） イネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は：
Ａ）因子の候補を提供する工程；
Ｂ）該候補と項目１に記載の核酸分子とを相互作用させて、該核酸分子の機能が抑制されるかどうかを検出する工程；
Ｃ）該機能の抑制を提供する候補をイネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子であると判定する工程、
を包含する、方法。
（項目４８） いもち病菌に対して抵抗性を付与させる因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は：
Ａ）因子の候補を提供する工程；
Ｂ）該候補と項目１に記載の核酸分子とを相互作用させて、該核酸分子の機能が抑制されるかどうかを検出する工程；
Ｃ）該機能の抑制を提供する候補をイネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子であると判定する工程、
を包含する、方法。
（項目４９） いもち病に対して耐性を付与させる因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は：
Ａ）因子の候補を提供する工程；
Ｂ）該候補と項目１に記載の核酸分子とを相互作用させて、該核酸分子の機能が抑制されるかどうかを検出する工程；
Ｃ）該機能の抑制を提供する候補をイネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子であると判定する工程、
を包含する、方法。
（項目５０） 項目４６から４９のいずれか１項に記載の方法によって同定された因子。
（項目５１） 項目１に記載の核酸分子がコードするポリペプチド。
（項目５２） 項目１に記載の核酸分子の、イネ萎縮病ウイルスに対する抵抗性を付与するための使用。
（項目５３） 項目１に記載の核酸分子の、イネ萎縮病に対する耐性を付与するための使用。
（項目５４） 項目１に記載の核酸分子の、いもち病菌に対する抵抗性を付与するための使用。
（項目５５） 項目１に記載の核酸分子の、いもち病に対する耐性を付与するための使用。
（項目５６） 項目１に記載の核酸分子と相互作用する因子の、イネ萎縮病ウイルスに対する抵抗性を付与するための使用。
（項目５７） 項目１に記載の核酸分子と相互作用する因子の、イネ萎縮病に対する耐性を付与するための使用。
（項目５８） 項目１に記載の核酸分子と相互作用する因子の、いもち病菌に対する抵抗性を付与するための使用。
（項目５９） 項目１に記載の核酸分子と相互作用する因子の、いもち病に対する耐性を付与するための使用。
（項目１）
（ａ）配列番号１または配列番号３に示す塩基配列；
（ｂ）該（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（ｃ）該（ａ）の塩基配列において、１または複数の置換、付加または欠失を有し、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（ｄ）該（ａ）の塩基配列に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（ｅ）該（ａ）の塩基配列からなる核酸分子の種相同体、スプライス変異体または対立遺伝子変異体をコードし、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列、および
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される塩基配列のフラグメント
からなる群より選択される配列を含む、核酸分子。
（項目２） 前記生物学的機能は、植物におけるイネ萎縮ウイルスの増殖への関与および前記核酸分子の破壊によりイネ萎縮ウイルスに対する抵抗性が付与されることからなる群より選択される、項目１に記載の核酸分子。
（項目３） 前記抵抗性は、前記核酸分子における塩基配列の少なくとも一部が破壊されることもしくは発現が抑制されること、または該核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現が抑制されることによって、付与される、項目２に記載の核酸分子。
（項目４） 前記生物学的機能は、植物におけるいもち病菌の増殖への関与および前記核酸分子の破壊によりいもち病菌に対する抵抗性が付与されることからなる群より選択される、項目１に記載の核酸分子。
（項目５） 前記抵抗性は、前記核酸分子における塩基配列の少なくとも一部が破壊されることもしくは発現が抑制されること、または該核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現が抑制されることによって、付与される、項目４に記載の核酸分子。
（項目６） 前記生物学的機能は、イネ萎縮病に対する耐性を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目７） 前記生物学的機能は、いもち病に対する耐性を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目８） イネ萎縮ウイルスに対する抵抗性およびいもち病菌に対する抵抗性からなる群より選択される少なくとも１つの抵抗性を付与することができる因子であって、該因子は、項目１に記載の核酸分子の機能を阻害する機能を有する、因子。
（項目９） 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目８に記載の因子。
（項目１０） 前記因子は、項目１に記載される核酸分子と相互作用するか、または項目１に記載される核酸分子によってコードされるポリペプチドと相互作用することを特徴とする、項目８に記載の因子。
（項目１１） 前記因子は、項目１に記載される核酸分子のアンチセンス核酸分子またはＲＮＡｉ分子であるか、あるいは項目１に記載される核酸分子によってコードされるポリペプチドに対する抗体であることを特徴とする、項目８に記載の因子。
（項目１２） 前記因子を特異的部位に送達させる手段をさらに含む、項目８に記載の因子。
（項目１３） 前記手段は、前記特異的部位に特異的に前記核酸分子を発現させるものである、項目１２に記載の因子。
（項目１４） 前記手段は、プロモーターである、項目１３に記載の因子。
（項目１５） 項目１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
（項目１６） 項目１に記載の核酸分子の機能を阻害する阻害核酸分子を含む、ベクター。
（項目１７） 前記阻害核酸分子は、ドミナントネガティブ実験における条件下において、項目１に記載の核酸分子または該核酸分子の発現を調節する配列とハイブリダイズすることを特徴とする、項目１６に記載のベクター。
（項目１８） 前記阻害核酸分子は、リプレッションドメインをコードする領域を含む、項目１６に記載のベクター。
（項目１９） 前記阻害核酸分子の発現を特異的部位においてのみ起こさせるためのプロモーターをさらに含む、項目１６に記載のベクター。
（項目２０） 項目１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物細胞。
（項目２１） 項目１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物組織。
（項目２２） 項目１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物器官。
（項目２３） 項目１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物体。
（項目２４） 項目１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物種子。
（項目２５） イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を有する植物を作出する方法であって、
（Ａ）目的とする植物において、項目１に記載の核酸分子またはそれに対応する核酸分子の発現を抑制させる工程
を包含する、方法。
（項目２６） さらに、（Ｂ）イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を有する植物を選択する工程を包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２７） 前記発現が抑制された植物を再生させる工程をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２８） 前記抑制は、ジーンサイレンシング技術またはドミナントネガティブ法によって達成される、項目２５に記載の方法。
（項目２９） 前記ジーンサイレンシング技術は、ＲＮＡｉ、コサプレッション、リボザイム、キメラオリゴ、アンチセンスサプレッションおよびそれらの組合せからなる群より選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０） 前記植物は、イネ科植物である、項目２５に記載の方法。
（項目３１） 前記植物は、イネ属植物である、項目２５に記載の方法。
（項目３２） 前記植物は、イネである、項目２５に記載の方法。
（項目３３） 前記植物は、ジャポニカ種のイネである、項目２５に記載の方法。
（項目３４） イネ萎縮病に対して耐性を有する植物を作出する方法であって、
（Ａ）目的とする植物において、項目１に記載の核酸分子またはそれに対応する核酸分子の発現を抑制させる工程
を包含する、方法。
（項目３５） いもち病菌に対して抵抗性を有する植物を作出する方法であって、
（Ａ）目的とする植物において、項目１に記載の核酸分子またはそれに対応する核酸分子の発現を抑制させる工程
を包含する、方法。
（項目３６） さらに、（Ｂ）イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を有する植物を選択する工程を包含する、項目３５に記載の方法。
（項目３７） 前記発現が抑制された植物を再生させる工程をさらに包含する、項目３５に記載の方法。
（項目３８） 前記抑制は、ジーンサイレンシング技術またはドミナントネガティブ法によって達成される、項目３５に記載の方法。
（項目３９） 前記ジーンサイレンシング技術は、ＲＮＡｉ、コサプレッション、リボザイム、キメラオリゴ、アンチセンスサプレッションおよびそれらの組合せからなる群より選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４０） 前記植物は、イネ科植物である、項目３５に記載の方法。
（項目４１） 前記植物は、イネ属植物である、項目３５に記載の方法。
（項目４２） 前記植物は、イネである、項目３５に記載の方法。
（項目４３） 前記植物は、ジャポニカ種のイネである、項目３５に記載の方法。
（項目４４） いもち病に対して耐性を有する植物を作出する方法であって、
（Ａ）目的とする植物において、項目１に記載の核酸分子またはそれに対応する核酸分子の発現を抑制させる工程
を包含する、方法。
（項目４５） 項目２５、３４、３５または４４のいずれか１項に記載の方法によって作出された、植物。
（項目４６） イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を付与させる因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は：
Ａ）因子の候補を提供する工程；
Ｂ）該候補と項目１に記載の核酸分子とを相互作用させて、該核酸分子の機能が抑制されるかどうかを検出する工程；
Ｃ）該機能の抑制を提供する候補をイネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子であると判定する工程、
を包含する、方法。
（項目４７） イネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は：
Ａ）因子の候補を提供する工程；
Ｂ）該候補と項目１に記載の核酸分子とを相互作用させて、該核酸分子の機能が抑制されるかどうかを検出する工程；
Ｃ）該機能の抑制を提供する候補をイネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子であると判定する工程、
を包含する、方法。
（項目４８） いもち病菌に対して抵抗性を付与させる因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は：
Ａ）因子の候補を提供する工程；
Ｂ）該候補と項目１に記載の核酸分子とを相互作用させて、該核酸分子の機能が抑制されるかどうかを検出する工程；
Ｃ）該機能の抑制を提供する候補をイネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子であると判定する工程、
を包含する、方法。
（項目４９） いもち病に対して耐性を付与させる因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は：
Ａ）因子の候補を提供する工程；
Ｂ）該候補と項目１に記載の核酸分子とを相互作用させて、該核酸分子の機能が抑制されるかどうかを検出する工程；
Ｃ）該機能の抑制を提供する候補をイネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子であると判定する工程、
を包含する、方法。
（項目５０） 項目４６から４９のいずれか１項に記載の方法によって同定された因子。
（項目５１） 項目１に記載の核酸分子がコードするポリペプチド。
（項目５２） 項目１に記載の核酸分子の、イネ萎縮病ウイルスに対する抵抗性を付与するための使用。
（項目５３） 項目１に記載の核酸分子の、イネ萎縮病に対する耐性を付与するための使用。
（項目５４） 項目１に記載の核酸分子の、いもち病菌に対する抵抗性を付与するための使用。
（項目５５） 項目１に記載の核酸分子の、いもち病に対する耐性を付与するための使用。
（項目５６） 項目１に記載の核酸分子と相互作用する因子の、イネ萎縮病ウイルスに対する抵抗性を付与するための使用。
（項目５７） 項目１に記載の核酸分子と相互作用する因子の、イネ萎縮病に対する耐性を付与するための使用。
（項目５８） 項目１に記載の核酸分子と相互作用する因子の、いもち病菌に対する抵抗性を付与するための使用。
（項目５９） 項目１に記載の核酸分子と相互作用する因子の、いもち病に対する耐性を付与するための使用。
本発明は、イネ萎縮病およびいもち病の処置または予防において有用な標的およびそれによるスクリーニング法、ならびにその方法によって同定される生体分子を用いて、イネ萎縮病およびいもち病に関連する病害を処置することができるという効果を奏する。
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「イネ萎縮病」とは、植物ウイルス病の一種であって、その原因となるイネ萎縮ウイルス（ＲＤＶ）は昆虫によって伝播される（例えば、体内にＲＤＶを保毒した、ツマグロヨコバイ、クロスジツマグロヨコバイまたはイナズマヨコバイなどが、イネの汁液を吸うために口吻をイネに刺すときに、このイネ萎縮ウイルスがイネに感染する）。この植物ウイルス病にかかったイネは、斑紋を生じ、背丈が伸びなくなる。
本明細書において「ウイルス」とは、核酸とタンパク質を主要な構成要素とする微小構造体をいう。ウイルスは、ゲノムの種類および構造、ウイルスを含む膜（「エンベロープ」）の有無、感染宿主などに基づいて分類される。その分類方法としては、例えば、国際ウイルス分類委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｒ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ（ＩＣＴＶ））による分類法が挙げられる。ウイルス粒子は、ビリオンとも呼ばれ、その大きさは、約２０〜約３００ｎｍである。
本明細書において「構造タンパク質」とは、ウイルス粒子を構成するタンパク質をいい、他方、ウイルスゲノムにコードされるが、粒子を構成しないタンパク質を「非構造タンパク質」という。
本明細書中において「病原体」、「生物学的病原」、または「病原菌」とは、植物に病害を引き起こす原因であって、伝染性のものをいう。この病原体としては、例えば、糸状菌（カビ・菌類）、細菌、ウイルス、ウイロイド、ファイトプラズマ、リケッチア様微生物、線虫、原虫などが挙げられる。
本明細書において「イネ萎縮ウイルス（Ｒｉｃｅ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ（ＲＤＶ））」とは、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）ファイトレオウイルス属（Ｐｈｙｔｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）のウイルスである。イネ萎縮ウイルスは、イネ萎縮病の原因となる。このイネ萎縮病は、昆虫によって伝搬される。イネ萎縮ウイルスは、１２本のゲノムセグメント（Ｓ１〜Ｓ１２）を有する。Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５、Ｓ７およびＳ８が、粒子を構成する構造タンパク質である、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ７およびＰ８をコードしていることが知られている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎ．：Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６：８９−９５）。上記イネ萎縮病を媒介するウイルスであり、体内にＲＤＶを保毒した、ツマグロヨコバイ、クロスジツマグロヨコバイまたはイナズマヨコバイなどが、イネの汁液を吸うために口吻をイネに刺すときに、このイネ萎縮ウイルスがイネに感染する。この植物ウイルス病にかかったイネは、斑紋を生じ、背丈が伸びなくなる。
本明細書において「レオウイルス」とは、ウイルスの一科であって、代表的には、そのウイルス粒子は直径７０ｎｍ程度の正二十面体状である。このレオウイルスのゲノムは、１０〜１２分節の二本鎖ＲＮＡであることが知られている。各ＲＮＡ分節からおおむね１種類のタンパク質がコードされる。キャプシド内部にＲＮＡポリメラーゼを含み感染直後のウイルスｍＲＮＡ合成に関与する。レオウイルス科のウイルスは、動物、昆虫、植物、の幅広い宿主に分布しているウイルスである。レオウイルスに属するウイルスとしては、例えば、オルトレオウイルス属（Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓ．１〜３型，レオウイルスなど）、オルビウイルス属（Ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ．１型ブルータングウイルスなど）、ロタウイルス属（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ．乳児胃腸炎ウイルス、仔ウシ下痢症ウイルスほか多種動物のロタウイルス）、ファイトレオウイルス属（Ｐｈｙｔｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）などが挙げられる。
本明細書において「イネ萎縮ウイルスの増殖への関与」は、イネ萎縮ウイルスの植物内での増殖に直接または間接的に関与することを含み、例えば、ウイルスの細胞内への侵入、細胞内での生存、維持、増幅、分泌等を含むことが理解される。
本明細書において「いもち病」とは、温帯地帯におけるイネの最大病害であって、病原体の寄生などによって起こる植物の病気である。その病原体は、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ属菌であり、この病原体は、古くは完全時代（有性生殖期）が見つからずに不完全菌類として扱われたが、最近完全時代が見つかり、子嚢菌の１種であることが明らかにされた。このようないもち病としては、例えば、イネいもち病、トウモロコシいもち病、シコクビエいもち病などが挙げられる。イネいもち病の病原菌は、Ｐ．ｏｒｙｚａｅ ｃａｖａｒａで、自然条件下では分生子だけを形成し，長い間完全時代が不明であったが，人工培地上で本菌の完全時代が発見され、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ（Ｈｅｂｅｒｔ）Ｂａｒｒとされている。イネいもち病はイネの最も重要な病気の１つであって、夏期の低温、曇天、多雨などの異常気象の際に大発生することが知られている。この病気の発生時期は、イネの生育の全期間に及ぶ。イネいもち病は、その発病する部位に応じて、苗いもち、葉いもち、節いもち、穂首いもち、穂いもちなどに分類される。特に、いもち病が穂に発生すると、イネの収量、品質とも著しく低下する。
本明細書において「いもち病菌」とは、いもち病を媒介する菌をいう。Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ属菌であり、子嚢菌の１種である。イネいもち病の病原菌は、Ｐ．ｏｒｙｚａｅ ｃａｖａｒａを含む。
本明細書において、ウイルス（例えば、イネ萎縮ウイルス）または菌（例えば、いもち病菌）に対する「抵抗性」または「耐性」とは、ウイルスまたは菌が侵入しようとする宿主生体（本明細書では、植物）が、ウイルスまたは菌の侵入に対して抵抗力を持つことをいう。本明細書では、抵抗力とは、宿主生体の通常の生存・増殖が維持される程度の性質のほか、その宿主生体の生存が維持されている限り、抵抗力を有するとみなす。
本明細書において、病害（例えば、イネ萎縮病またはいもち病）に対する「耐性」または「抵抗性」とは、その病害に対して宿主生体（本明細書では、植物）が抵抗力を持つことをいう。従って、ウイルスまたは菌の侵入を許したとしても、そのようなウイルスまたは菌との共存が図られる限り、病害に対する耐性はあるといえる。
本明細書では、特に言及するときは、抵抗性は、ウイルスまたは菌に対する性質をいい、耐性は病害に対する性質をいうが、交換可能に使用され得ることが理解される。
本明細書において、「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。このような植物には、任意の有用植物、特に作物植物、蔬菜植物、および花卉植物が含まれる。好ましい植物としては、例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガムなどのイネ科に属する単子葉植物が挙げられる。好ましい植物のほかの例としては、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、サツマイモ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ニンジン、キュウリ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、ジャガイモおよびリンゴが挙げられる。本発明にとって最も好ましい植物としては、イネである。好ましい植物は作物に限られず、花、樹木、芝生、雑草なども含まれる。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物組織の例としては、維管束組織（篩部組織、木部組織などを含む）、頂端分裂組織、葉肉組織、厚角組織、柔組織などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
本明細書において生物の「器官」とは、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。例えば、茎、根、葉、花、種子などを挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、器官の一部であり得る。器官内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有していてもよい。
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。
本明細書では「核酸分子」もまた、核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。したがって、本明細書では、たとえば、本発明の遺伝子には、そのスプライス変異体もまた包含され得る。
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、遺伝子というときは、通常、本発明の遺伝子の構造遺伝子ならびにそのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含する。本発明では、構造遺伝子のほか、転写および／または翻訳などの調節配列もまた、神経再生、神経疾患の診断、治療、予防、予後などに有用であることが理解される。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
本明細書において「アミノ酸誘導体」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのようなアミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。本明細書では、アミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、アミノ酸と同じ生物学的機能を提供し得る限り代替として使用され得ることが理解される。
本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。ヌクレオチドの配列は、本明細書において「ヌクレオチド配列」または「塩基配列」という。
本明細書において「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書では、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドと同じ生物学的機能を提供し得る限り、ヌクレオチドの代替として使用され得ることが理解される。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
本明細書において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、ＲＩＭ１）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、イネの遺伝子に対応する遺伝子は、他の植物（コムギ、トウモロコシ、オオムギ、ソルガムなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある植物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその植物（例えば、イネ、ソルガム）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
本明細書中で使用される「異種」とは、異なる配列または対応しない配列、あるいは異なる種由来の配列である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をいう。例えば、イネのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、ヒトのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種であり、そしてヒトの核酸配列またはアミノ酸配列は、ヒトアルブミンのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種である。
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、例えば、植物におけるイネ萎縮ウイルスの増殖への関与、イネ萎縮ウイルスに対する抵抗性または感受性への関与、イネ萎縮病に対する耐性、植物におけるいもち病菌の増殖への関与、いもち病菌に対する抵抗性または感受性への関与、いもち病に対する耐性、これらの具体的な機能について直接的または間接的に関連する機能（例えば、ウイルスタンパク質との結合など）などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
したがって、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
本明細書中で使用される用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「改変する（ｍｏｄｉｆｙ）」は、特定の活性、因子またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少あるいは維持を意味する。
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。本明細書において「因子」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などであって、代表的には分子量約１０，０００以下のもの（例えば、約１，０００以下のもの）をさすがそれらに限定されない。）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「Ｔｏｓ１７」とは、本明細書中で使用される場合、レトロトランスポゾンの一種を表す。イネのレトロトランスポゾンＴｏｓ１７が培養によって活性化され転移をする性質を利用して、イネの多数の遺伝子破壊系統が作出されている。「トランスポゾン」は、動物、酵母、細菌および植物のゲノムに遍在することが知られる変異誘発遺伝子である。トランスポゾンは、その転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）機構により２つのクラスに分類されている。クラスＩＩに属するトランスポゾンは、複製することなくＤＮＡの形態で転移する。クラスＩＩに属するトランスポゾンとして、トウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）のＡｃ／Ｄｓ、Ｓｐｍ／ｄＳｐｍおよびＭｕ要素（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ、１９８９、Ｃｅｌｌ５６、１８１−１９１；Ｆｅｄｏｒｏｆｆら、１９８３、Ｃｅｌｌ３５、２３５−２４２；Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２、４７８３−４７８７）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍｍａｊｕｓ）のＴａｍ要素（Ｂｏｎａｓら、１９８４、ＥＭＢＯＪ、３、１０１５−１０１９）が知られている。クラスＩＩに属するトランスポゾンは、トランスポゾン・タッギングを利用する遺伝子単離に広く利用されている。この技術は、トランスポゾンがゲノム上で転移して、ある遺伝子 中に挿入されると遺伝子の生理学的および形態学的変異が起こり、遺伝子が制御する表現型が変化することを利用する。この変化を検出することにより影響を受けた遺伝子を単離する（Ｂａｎｃｒｏｆｔら、１９９３、Ｔｈｅ ＰｌａｎｔＣｅｌｌ、５、６３１−６３８；Ｃｏｌａｓａｎｔｉら、１９９８、Ｃｅｌｌ、９３、５９３−６０３；Ｇｒａｙら、１９９７、Ｃｅｌｌ、８９、２５−３１；Ｋｅｄｄｉｅら、１９９８、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１０、８７７−８８７；Ｗｈｉｔｈａｍら、１９９４、Ｃｅｌｌ、７８、１１０１−１１１５）。
クラスＩに属するトランスポゾンは、レトロトランスポゾンとも呼ばれ、ＲＮＡ中間体を介して複製し、転移する。しかクラスＩトランスポゾンは、最初、ショウジョウバエおよび酵母で同定され、そして特徴付けられたが、最近の研究により植物ゲノム中に遍在し、そのかなりの部分を占めていることが明らかにされている（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、１９９６、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４、３４７−３５３；Ｖｏｙｔａｓ、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、７３７−７３８）。レトロトランスポゾンの大部分は、非移動性の組み込みユニットであるようである。最近の研究は、これらのいくつかが、創傷、病原体の攻撃および細胞培養などのストレス条件下で活性化されることを示している（Ｇｒａｎｄｂａｓｔｉｅｎ、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ、３、１８１−１８７；Ｗｅｓｓｌｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６、９５９−９６１；Ｗｅｓｓｌｅｒら、１９９５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．５、８１４−８２１。例えば、タバコではＴｎｔ１ＡおよびＴｔｏ１（Ｐｏｕｔｅａｕら、１９９４、ＰｌａｎｔＪ．、５、５３５−５４２；Ｔａｋｅｄａら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３６、３６５−３７６）、およびイネではＴｏｓ１７（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７７８３−７７８８）について、ストレス条件下における活性化が報告されている。
イネのレトロトランスポゾンＴｏｓ１７は、最も良く研究されている植物中のクラスＩ要素である。Ｔｏｓ１７は、Ｔｙ１−ｃｏｐｉａ群レトロ要素の間の逆転写酵素ドメインの保存アミノ酸配列を基に作成された縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によりクローン化された（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９２、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２３３、２０９−２１６）。Ｔｏｓ１７は、４．３ｋｂの長さの、２つの同じ１３８ｂｐのＬＴＲ（長鎖末端反復）および開始メチオニンｔＲＮＡの３’末端に相補的なＰＢＳ（プライマー結合部位）を持つ（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、上述）。Ｔｏｓ１７の転写は、組織培養により強く活性化され、そして培養時間とともにＴｏｓ１７のコピー数が増加する。ゲノム研究のモデルジャポニカ品種である日本晴では、Ｔｏｓ１７の当初のコピー数は２であるが、組織培養後、再生した植物では、５〜３０コピーに増加している（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、上述）。酵母およびショウジョウバエで特徴付けられたクラスＩトランスポゾンとは異なり、Ｔｏｓ１７は、染色体中をランダムな様式で転移し、そして安定な変異を引き起こし、そしてそれ故、イネにおける遺伝子 の機能解析の強力なツールを提供する（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ、１９９７、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５，２３１−２４０；１９９９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆＲｉｃｅ（Ｋ．Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、４３−５８）。
本明細書において「ミュータントパネル」とは、変異の集合体を意味し、より具体的には、イネの内在性レトロトランスポゾンＴｏｓ１７を転移させて作製したイネ品種「日本晴」遺伝子破壊系統を総称する。イネにおいては、イネレトロトランスポゾンＴｏｓ１７が、培養により活性化され、遺伝子内に転移する（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７７８３−７７８８（１９９６））ことから、イネの大量遺伝子破壊の手段として利用されている。
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。
本明細書において「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、配列番号２のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントであって、イネ萎縮ウイルスの増殖に関与する生物学的な活性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合分子も使用することができる。
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、細胞、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、細胞、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
本明細書において「純化（された）」および「クローニング（された）」とは、互換可能に用いられる。「純化（された）」および「クローニング（された）」とは、ある物質または核酸の状態についていい、その核酸の存在頻度を高い状態にすることであって、好ましくは、その物質または核酸が、他の種類の物質または核酸が実質的に伴わない状態をいう。本明細書において「純化」および「クローニング」に関する文脈において使用される場合、他の種類の物質または核酸が「実質的に伴わない状態」とは、それら他の種類の物質または核酸が全く存在しない状態か、または存在するとしても、目的の物質または核酸に対して、何ら影響を与えない状態をいう。従って、より好ましい状態では、純化された核酸または核酸組成物は、ある特定の核酸のみを含む。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、形質転換、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、互換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」は互換可能に使用される。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」としては、ウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をいい、導入された遺伝子の機能（例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および／またはそのタンパク質の活性など）を指標として検出され得る。
本明細書で使用される場合、「不活性化」とは、ゲノムを不活性化したウイルスをいう。この不活性化ウイルスは、複製欠損である。好ましくは、この不活性化は、ＵＶ処理またはアルキル化剤による処理によって、なされる。
本明細書で使用される場合、「外来遺伝子」とは、ウイルスエンベロープベクター内に含まれるウイルス以外の起源の核酸などをいう。本発明の１つの局面において、この外来遺伝子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列（例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど）と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。本発明のさらなる局面において、外来遺伝子は、オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸である。
遺伝子導入ベクター内に含まれる外来遺伝子は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子であるが、導入される核酸分子は、核酸アナログ分子を含んでもよい。遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、単一の遺伝子分子種であっても、複数の異なる遺伝子分子種であってもよい。
本明細書で使用される場合、「遺伝子ライブラリー」とは、天然より単離された核酸配列または合成の核酸配列を含む、核酸ライブラリーである。天然より単離された核酸配列の供給源としては、真核生物細胞、原核生物細胞、またはウイルス由来の、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。天然より単離された配列に、任意の配列（例えば、シグナル、タグなど）を付加したライブラリーもまた、本発明の遺伝子ライブラリーに含まれる。１つの実施態様において、遺伝子ライブラリーは、その中に含まれる核酸配列の、転写および／または翻訳をもたらすプロモーターなどの配列を含む。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。このような遺伝子または遺伝子産物（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）の発現の増加または減少は、本発明の治療形態、予後形態または予防形態において有用であり得る。
本明細書において「特異的部位に送達」させるとは、目的物質を、ある特定の部位に対して、他の部位よりも多く送達させることをいう。そのような手段としては、例えば、核酸分子における特異的プロモーターの使用、薬物送達システム（ＤＤＳ）（例えば、リポソーム、シクロデキストリン、抗体など）の使用、特異的リガンドの使用などを挙げることができるが、それらに限定されない。
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、動物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。
本明細書において「アンチセンス（活性）」とは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制または低減することができる活性をいう。アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列を有する分子を本明細書において「アンチセンス分子」、「アンチセンス核酸分子」または「アンチセンス核酸」と称し、これらは互換的に使用される。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、もっとも好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有するものもまた含まれる。本明細書中で開示される核酸配列（例えば、配列番号１または３）が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋ塩基対形成の法則またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成の法則に従い設計され得る。アンチセンス核酸分子は、シグナル伝達因子のｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学合成または酵素的連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはその分子の生物学的安定性を増加させるかもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二本鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々の改変ヌクレオチドを用いて（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）化学合成され得る。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例として、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「ドミナントネガティブ」とは、発現すると変異型の表現型（特に、もとの遺伝子の抑制型）になることになることをいう。例えば、転写因子の代わりに、抑制因子に機能変換した転写因子を用いると、機能重複する転写因子に優先して標的遺伝子の発現を抑制し、ドミナントネガティブ型の表現型をもたらす。ドミナントネガティブ技術においてリプレッションドメイン（例えば、アミノ酸配列LDLELRLGFA）を用いることによって、目的とする核酸分子の転写を抑制することができる。
本明細書中で使用される場合、「ジーンサイレンシング」とは、遺伝子発現の抑制現象を意味する。「ジーンサイレンシング」と呼ばれる現象としては、ゲノムインプリンティング、Ｘ染色体の不活性化、ＰＥＶ（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ）、トウモロコシのパラミューテションなどが挙げられる。植物におけるトランスジーン（導入遺伝子）の不活性化の一つとして、相同性依存型ジーンサイレンシング（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ＨＤＧＳ）があり、そのＨＤＧＳ様の現象は、植物内在性遺伝子、植物以外のトランスジェニックにおいても見られており、生物のなんらかの遺伝子制御機構であると考えられ、植物が動物に先んじて研究が進んでいる数少ない現象である（森野和子および島本功「植物の相同性依存型ジーンサイレンシング」細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ５ 「植物のゲノムサイエンス 遺伝子・染色体から生体機能解明する」第４章 １６１〜１６９頁 １９９６年）。
本明細書中で使用される場合、「相同性依存型ジーンサイレンシング」または「ＨＤＧＳ」は、複数の遺伝子が、その塩基配列の相同性またはその配列の類似性に依存して起こる遺伝子発現の抑制現象をいう。特に、特定の導入された遺伝子（導入遺伝子）を過剰発現させると、その導入遺伝子とともに本来ゲノムに存在していた（すなわち、内在的な）同一または相同な遺伝子が抑制される現象をいう。「ＨＤＧＳ」としては、例えば、「ＰＴＧＳ」および「ＴＧＳ」が挙げられる。
本明細書中で称される場合、「転写抑制型ジーンサイレンシング」または「ＴＧＳ」は、転写自体が抑制される遺伝子発現の抑制現象をいう。
本明細書中で使用される場合、「翻訳後型ジーンサイレンシング」または「ＰＴＧＳ」は、転写後に起こる遺伝子発現の抑制現象をいう。ＲＮＡｉもＰＴＧＳの一種である。
本明細書中において使用される場合、「コサプレッション」、「コーサプレッション」および「共抑制」は、同意義語として使用され得る。「コサプレッション」とは、導入遺伝子を含む植物において、その導入遺伝子と相同な配列を有する内在性の遺伝子（その植物において、その植物のゲノム上の存在していた、その導入遺伝子と同一であるかまたは相同である遺伝子）の両方の発現が抑制される現象をいう。この現象は、ペニュアの花の色素合成にかかる遺伝子の発現機構を研究している過程に発見された（Ｎａｐｏｌｉ，Ｃ．，Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｃ．＆Ｊｐｒｇｅｎｓｅｎ，Ｒ．：Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，２９１−２９９（１９９０）；ならびにｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ，Ｒ ｅｔ ａｌ：Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，２９１−２９９（１９９０））。その後、植物のみでなくアカパンカビ、ショウジョウバエ、線虫、哺乳動物細胞などにおいてもそれらの同様の現象が発見されている。このような「コサプレッション」を、育種目的に利用した例は、ＳＣＩＥＮＣＥ Ｖｏｌ． ３０９ ２９ Ｊｕｌｙ ２００５ ｐ． ７４１−７４５などに記載されている。
本明細書において「ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）」とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）によって配列特異的にｍＲＮＡが分解されることによって、タンパク質への翻訳が阻害され、遺伝子発現が抑制される現象をいう。遺伝子発現抑制手法としての植物におけるＲＮＡｉについての総説は、例えば、三木ら、「植物におけるＲＮＡｉの分子機構とその応用」（実験医学 Ｖｏｌ．２２ Ｎｏ．４（３月号）２００４）（本明細書中で、参考として援用される）などが挙げられる。ＲＮＡｉの利点の一つとして、弱いものから強いものまで様々なレベルの発現抑制が個々の遺伝子によって取得され得ること挙げられる。現在、ＲＮＡｉは、簡便かつ有効な遺伝子発現抑制法として利用されている。好ましい実施形態において、「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
理論に束縛されないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものをＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
また、理論に束縛されることを希望しないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。
本発明においてｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態を採っていてもよい。
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明の処置方法および組成物において有用である。
本明細書において、配列番号２または４のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１または３の核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。配列番号２または４のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ ＥＤＴＡ；４２℃の温度で ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ ＮａＣｌ；６０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ； ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ；３０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）；０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１または３に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドなどには、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
本明細書中で使用される場合、「類似性」とは、２以上の配列における、互いに対する同一性の程度をいう。配列間の類似性の測定は、配列間のアライメントを構成し、それらの配列間の同一性の割合、ならびにより複雑な計測に基づくスコアを用いことによって、定量化される。「類似性」は、あらゆる配列間において定義可能である（例えば、２以上の塩基配列間において、「類似性」が定義され、その同一性の程度は、容易に決定される）。本明細書中で使用される場合、「アライメント（する）」または「並置（する）」は、２以上の配列群を比較し、配列中で同じ並び方をしている文字列や配列パターンを発見する手続きをいい、また、その比較した結果をいう。本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。
配列における同一性または類似性の測定は、当該分野で公知の配列解析ソフトウエアを利用することで容易に決定され得る。配列における類似性検索を行う方法としては、例えば、ＢＬＡＳＴ（たとえば、（Ａｌｔｓｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５、３３８９−３４０２、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ら（１９８８）、ＰＮＡＳ ８５：２４４４−２４４８）、スミス−ウォーターマンアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ． ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ｍ． Ｓ． （１９８１））、ニードルマン−ブンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ Ｃ．Ｄ （１９７０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４４３−４５３）、さらに、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（８）：２４４４−２４４８、 Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２）が挙げられるが、何らこれに限定されるものではない。
類似性検索における、上述のような配列解析ソフトウエアを実行する際のパラメータ設定は、それらの使用目的に応じて、当業者により容易に選択され得る。「類似性」は、上述のような方法による測定方法のほか、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ、第２章 「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
「相同性」は、２以上の配列の比較において、それらの配列が進化的に祖先を共有することを示す。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなうか、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなう場合、その類似性測定過程のアライメントにおける最も単純な解釈として、同一な（もしくは等価である）文字列（塩基、アミノ酸残基など）で並置されている文字列が、これらの領域が祖先配列のまま変化しなかったものであることを示し、同一でない（もしくは、等価でない）文字列が、突然変異が一方の配列で起こったものであるとの考察が可能である。アライメントにおけるギャップ（インデル）は、配列の一方で、挿入または欠失が起こったものであると考えられる。つまり、それらの配列の同一性または類似性は高いことは、それらの配列における相同性を強く示唆することが理解される。
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本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
（遺伝子、タンパク質分子、核酸分子などの改変）
あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
当該分野において、親水性指数もまた、改変設計において考慮され得る。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、短縮化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、ホスホリル化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
本発明のポリペプチドがポリマーに結合している、化学修飾されたポリペプチド組成物は、本発明の範囲に包含される。このポリマーは、水溶性であり得、水溶性環境（例えば、生理学的環境）でこのタンパク質の沈澱を防止し得る。適切な水性ポリマーは、例えば、以下からなる群より選択され得る：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール。この選択されたポリマーは、通常は改変され、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有し、その結果、重合度は制御され得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、そして、このポリマーは分枝状でも分枝状でなくてもよく、そしてこのようなポリマーの混合物はまた、使用され得る。この化学修飾された本発明のポリマーは、治療用途に決定付けられる場合、薬学的に受容可能なポリマーが使用するために選択される。
このポリマーがアシル化反応によって改変される場合、このポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。あるいは、このポリマーが還元アルキル化によって改変される場合、このポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。好ましい反応性アルデヒドは、ポリエチレングリコール、プロピオンアルデヒド（このプロピオンアルデヒドは、水溶性である）または、そのモノＣ１〜Ｃ１０の、アルコキシ誘導体もしくはアリールオキシ誘導体である（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号（これは、本明細書中で全体が参考として援用される）を参照のこと）。
本発明のポリペプチドのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、例えば、以下の参考文献に記載されるような、当該分野で公知の、任意のペグ化反応によって実施され得る：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３，４−１０（１９９２）；ＥＰ ０ １５４ ３１６ ；およびＥＰ ０ ４０１ ３８４（これらの各々は、本明細書中で、全体が参考として援用される）。好ましくは、このペグ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。本発明のポリペプチドのペグ化のための好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書中で使用される場合、「ポリエチレングリコール」は、ＰＥＧの任意の形態の包含することを意味し、ここで、このＰＥＧは、他のタンパク質（例えば、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールまたはモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アリールオキシポリエチレングリコール）を誘導体するために使用される。
ポリペプチドの化学誘導体化は、生物学的に活性な物質を活性化したポリマー分子と反応させるのに使用される適切な条件下で、実施され得る。ペグ化した本発明のポリペプチドを調製するための方法は、一般に以下の工程を包含する：（ａ）ポリペプチドが１以上のＰＥＧ基に結合するような条件下で、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの、反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とこのポリペプチドを反応させる工程および（ｂ）この反応生成物を得る工程。公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはアシル化反応を選択することは当業者に容易である。
ペグ化された本発明のポリペプチドは、一般に、本明細書中に記載のポリペプチドを投与することによって、緩和または調節され得る状態を処置するために使用され得るが、しかし、本明細書中で開示された、化学誘導体化された本発明のポリペプチド分子は、それらの非誘導体分子と比較して、さらなる活性、増大された生物活性もしくは減少した生物活性、または他の特徴（例えば、増大された半減期または減少した半減期）を有し得る。本発明のポリペプチド、それらのフラグメント、改変体および誘導体は、単独で、併用して、または他の薬学的組成物を組み合わせて使用され得る。これらのサイトカイン、増殖因子、抗原、抗炎症剤および／または化学療法剤は、徴候を処置するのに適切である。
同様に、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。
本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
（遺伝子工学）
本発明において用いられる配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
本発明において用いられる配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。
従って、本明細書において「発現ベクター」または「発現プラスミド」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
本発明において用いられ得る原核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。原核生物細胞は、遺伝子の増幅、改変などに用いることができる。
本明細書において用いられ得る植物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐＢＥ７１３３−ＧＵＳ−Ｈｙｇｒｏ（ｐＥ７ΩＩＧＵＳ−Ｈｙｇｒｏ）、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃを挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、そして遺伝子 の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターの例としては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、植物の部位におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、植物の発達段階に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。部位特異的調節エレメントを使用して核酸を発現することによって、組換え植物発現ベクターでは、特定の細胞型において核酸の発現を優先的に指向し得る。部位特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。
「部位特異的発現プロモーター」とは、器官（例えば、根、茎、葉、果実、種子ならびにそれらの組合せなど）、組織（例えば、表皮、篩部、柔組織、木部、維管束、ならびにそれらの組合せなど）、発達段階（例えば、発芽期、生長期、開花期、登期ならびにそれらの組み合わせなど）などにおいて、特異的なプロモーターである。原理的には、個体において特異的に発現している遺伝子を単離し、そのプロモーター、発現制御シス領域を単離することによって得られる。
本明細書において、プロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の成長／増殖のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、ノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「応答性」であるとは、少なくとも１つの因子が生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を因子に対して「誘導性」といい、発現量が減少する性質を因子に対して「減少性」という。「減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。因子に対して誘導性のプロモーターを本発明の部位特異的組換え誘導因子をコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された哺乳動物細胞または哺乳動物（特定の組織などを含む）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での部位特異的組換え配列の部位特異的組換えを行うことができる。
本発明のポリヌクレオチドは、そのままでまたは改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切な植物発現ベクターに連結され、公知の遺伝子 組換え技術により、植物細胞に導入され得る。導入された遺伝子 は、植物細胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、植物細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、植物細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）に含まれるＤＮＡを含む。
「植物発現ベクター」は、本発明の遺伝子の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメントが宿主植物の細胞中で作動可能に連結されている核酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、それに関するポリヌクレオチドと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。植物発現ベクターは、好適には、植物遺伝子、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる植物発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
本明細書において「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発現するプロモーターを意味する。再生植物のすべての組織において、本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させる植物プロモーターフラグメントを採用し得る。構成的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，１９８５，Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＲｅｐ．４，３５５）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙ，１９８２，Ｃｅｌｌ３０，７６３）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｏｄｅｌｌ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１３，８１０）、イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ，１９９１，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ３，１１５５）、トウモロコシユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ １９９３，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３，５６７）、ＲＥＸφプロモ−タ−（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）などを用いることができる。
あるいは、植物プロモーターは、特定組織において本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させ得るか、またはそうでなければ、より特異的な環境または発達の制御下にあり得る。このようなプロモーターは、本明細書では、「誘導可能な」プロモーターと称する。誘導可能なプロモーターとしては、例えば、光、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。この様なプロモーターとしては、例えば、光照射によって発現するリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子 のプロモーター（Ｆｌｕｈｒ，１９８６，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，２３５８）、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子 のプロモーター（Ａｇｕａｎ，１９９３，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０，１）、高温によって誘導されるイネのｈｓｐ７２、ｈｓｐ８０遺伝子 のプロモーター（Ｖａｎ Ｂｒｅｕｓｅｇｅｍ，１９９４，Ｐｌａｎｔａ １９３，５７）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子 のプロモーター（Ｎｕｎｄｙ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１４０６）、紫外線の照射によって誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子 のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔ，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８，６５１）などが挙げられる。また、ｒａｂ１６遺伝子 のプロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
本明細書において「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定されない。これらの薬剤耐性遺伝子は、本発明においてスクリーニング技術などにおいて用いられる。
上記のような植物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子 組換え技術を用いて作製され得る。植物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＢＩ系のベクターまたはｐＵＣ系のベクターが好適に用いられるが、これらに限定されない。
ＤＮＡ導入のための植物材料としては、導入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラスト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なものを選択することができる。「植物細胞」とは、任意の植物細胞であり得る。「植物細胞」の例としては、葉および根などの植物器官の細胞、カルスならびに懸濁培養細胞が挙げられる。植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましくは培養細胞である。
また一般に、植物培養細胞へＤＮＡを導入する場合、材料としてプロトプラストが用いられ、エレクトロポーレーション法、ポリエチレングリコール法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われるのに対して、植物組織へＤＮＡを導入する場合、材料としては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条原基など、好ましくは葉、茎、カルスが用いられ、ウイルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法、またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われる。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、植物発現ベクターで（例えば、エレクトロポレーションによって）アグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをリーフディスク法などの周知の方法により植物組織に導入する方法である。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
植物発現ベクターを導入された細胞は、例えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生され得る。
本発明のポリヌクレオチドが導入された植物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地などに培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再生（再分化）の方法は植物細胞の種類により異なる。様々な文献にイネ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ ＣｕｌｔｕｒｅＬｅｔｔ．２，７４）、トウモロコシ（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，６０３）、ジャガイモ（Ｖｉｓｓｅｒ，１９８９，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８，５９４）、タバコ（Ｎａｇａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ ９９，１２）など各種の植物に対しての再分化の方法が記載されている。
再生した植物体においては、当業者に周知の手法を用いて、導入された本発明の遺伝子の発現を確認し得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析を用いて行い得る。具体的には、植物の葉から全ＲＮＡを抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメンブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子の一部分と相補的な標識したＲＮＡプローブをハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子のｍＲＮＡを検出し得る。
本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転換され得る植物は、遺伝子導入の可能ないずれの植物をも包含する。
大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
本明細書において「複製起点」とは、ＤＮＡ複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照）。
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。例えば、エンハンサーとして、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が用いられるが、これらに限定されない。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
本発明において「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１つの植物発現ベクターあたり複数個用いられ得る。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１が例示される。
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法などが挙げられる。
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００２ Ｄｅｃ；３２ Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
（抵抗性の評価）
本発明の方法によって作出された遺伝子組換え植物が、病原体に対する抵抗性を有しているか否かは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ＩｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｏｆＰｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎに記載されている試験方法により容易に確認し得る。例えば、イネいもち病の場合は、特定のイネ品種にその品種に親和性のイネいもち病菌のレースを接種した場合の病斑形成や病斑面積率の程度を、原品種と組換え体とを比較することによって検定することが可能であるが、これに限定されることはない。例えば、イネいもち病の抵抗性検定については、今回の実験で使用した噴霧接種法の他に、イネの葉に接種用パンチで穴を開け、その上にいもち病菌胞子のペーストをのせて感染させるパンチ接種法、針の先にいもち病菌胞子ペーストを付けて葉を突き刺す針接種法が挙げられる。これらの接種法では、病斑は葉の傷口から広がるように発病するので、病斑の伸展長を測定することによって、抵抗性強度の検定を行い得る（例えば、Ｋ．Ｏｈａｔａら、ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＩｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ＩｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｏｆＰｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第３７−４１頁、ＪａｐａｎＰｌａｎｔ ＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９５）を参照のこと）。
本発明の方法によって作出された遺伝子組換え植物が、病原体に対する抵抗性を有しているか否かは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ＩｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｏｆＰｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，Ｊａｐａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎに記載されている試験方法により容易に確認し得る。例えば、イネいもち病の場合は、特定のイネ品種にその品種に親和性のイネいもち病菌のレースを接種した場合の病斑形成や病斑面積率の程度を、原品種と組換え体とを比較することによって検定することが可能であるが、これに限定されることはない。例えば、イネいもち病の抵抗性検定については、今回の実験で使用した噴霧接種法の他に、イネの葉に接種用パンチで穴を開け、その上にいもち病菌胞子のペーストをのせて感染させるパンチ接種法、針の先にいもち病菌胞子ペーストを付けて葉を突き刺す針接種法が挙げられる。これらの接種法では、病斑は葉の傷口から広がるように発病するので、病斑の伸展長を測定することによって、抵抗性強度の検定を行い得る（例えば、Ｋ．Ｏｈａｔａら、ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＩｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ＩｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｏｆＰｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第３７−４１頁、ＪａｐａｎＰｌａｎｔ ＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９９５）を参照のこと）。
本明細書において「発現量」とは、対象となる細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
本明細書において「上流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端に向かう位置を示す。
本明細書において「下流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの３’末端に向かう位置を示す。
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ ＆ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
（本明細書において用いられる一般的技術）
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、糖鎖科学、マイクロフルイディクス、微細加工、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、糖鎖科学、マイクロフルイディクス、微細加工、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、糖鎖科学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）； Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，ＮＹ，１０１５８（２０００）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２３０、２４２、２４７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９４；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
１つの局面において、本発明は、（ａ）配列番号１または配列番号３に示す塩基配列；（ｂ）該（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列；（ｃ）該（ａ）の塩基配列において、１または複数の置換、付加または欠失を有し、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列；（ｄ）該（ａ）の塩基配列に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列；（ｅ）該（ａ）の塩基配列からなる核酸分子の種相同体、スプライス変異体または対立遺伝子変異体をコードし、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列、および（ｆ）（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される塩基配列のフラグメントまたは変異体からなる群より選択される配列を含む、核酸分子、ならびにこれがコードするポリペプチドを提供する。本明細書においてＲｉｃｅ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ １（ＲＩＭ１）と呼ぶ。この核酸分子は、予想外に、植物におけるイネ萎縮ウイルスの増殖への関与、核酸分子の破壊によりイネ萎縮ウイルスに対する抵抗性が付与されること、植物におけるいもち病菌の増殖への関与、核酸分子の破壊によりいもち病菌に対する抵抗性が付与されること、イネ萎縮病に対する耐性または感受性、いもち病に対する耐性または感受性に関与していることを見出した。
１つの実施形態において、上記（ｃ）における置換、付加および欠失の数は限定されていてもよく、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下であることが好ましい。別の実施形態において、上記（ｃ）における置換、付加および欠失の数は限定されていてもよく、例えば、５０以上、４０以上、３０以上、２０以上、１５以上、１０以上、９以上、８以上、７以上、６以上、５以上、４以上、３以上、２以上、１以上であることが好ましい。置換、付加および欠失は、生物学的活性（好ましくは、本発明における抵抗性または耐性に関与する活性）を付与する限り、任意の数であり得る。
好ましい実施形態において、上記（ｄ）の塩基配列に対する相同性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、少なくとも約９９％であり得るが、全く同一のものは排除され得る。
本発明のポリペプチドは、通常、少なくとも３の連続するアミノ酸配列を有する。本発明のポリペプチドが有するアミノ酸長は、目的とする用途に適合する限り、どれだけ短くてもよいが、好ましくは、より長い配列が使用され得る。従って、好ましくは、少なくとも４アミノ酸長、より好ましくは少なくとも５アミノ酸長、少なくとも６アミノ酸長、少なくとも７アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長であってもよい。さらに好ましくは少なくとも１５アミノ酸長であり得、なお好ましくは少なくとも２０アミノ酸長であり得る。これらのアミノ酸長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明のポリペプチドは、ある因子と相互作用することができる限り、その上限の長さは、配列番号２または４に示す配列の全長と同一であってもよく、それを超える長さであってもよい。
好ましい実施形態において、本発明の核酸分子またはそのフラグメントおよび改変体は、少なくとも８の連続するヌクレオチド長であり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、９、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、マーカー、プライマー、プローブ、所定の因子と相互作用し得ること）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号１に示す配列の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約８のヌクレオチド長であり得、好ましくは約１０ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約１５ヌクレオチド長であり得、好ましくは約１７ヌクレオチド長であり得る。
本発明では、核酸分子における塩基配列の少なくとも一部が破壊されることもしくは発現が抑制されることもしくは発現が抑制されること、または核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現が抑制されることによって、付与され得るが、それに限定されず、所望の結果が達成される限り、どのような改変が加えられても良いことを当業者は理解する。
１つの局面において、本発明は、イネ萎縮ウイルスに対する抵抗性およびいもち病菌に対する抵抗性からなる群より選択される少なくとも１つの抵抗性を付与することができる因子を提供する。このような因子は、本発明の核酸分子の機能を阻害する機能を有する。本明細書において、「核酸分子の機能を阻害する」とは、その核酸分子が生体内で果たしている役割を何らかの形で阻害することをいい、例えば、ＤＮＡのＲＮＡへの転写の抑制ＤＮＡの複製の阻害、ＤＮＡの破壊または置換、ＤＮＡがコードするタンパク質またはポリペプチドの機能の抑制または低減、ＤＮＡがコードするｍＲＮＡからタンパク質またはポリペプチドへの転写の抑制または低減などを挙げることができるがそれらに限定されない。そのような因子としては、どのようなものでも用いることができるが、例えば、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子等を挙げることができる。
１つの実施形態では、本発明の因子は、本発明の核酸分子と相互作用し得るか、または請求項１に記載される核酸分子によってコードされるポリペプチドを相互作用し得る。
別の実施形態では、本発明の因子は、本発明の核酸分子のアンチセンス核酸分子またはＲＮＡｉ分子であり得るか、あるいは本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドに対する抗体であり得る。
別の実施形態では、本発明の因子、本発明の因子を特異的部位に送達させる手段をさらに含んでいてもよい。そのような送達手段は、特異的部位への送達を実現するものであれば、どのようなものでもよく、例えば、特異的部位に特異的に目的とする核酸分子を発現させるもの、例えば、プロモーターなどであり得る。
別の局面において、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。あるいは、本発明は、本発明の核酸分子の機能を阻害する阻害核酸分子を含むベクターを提供する。本発明において使用されるベクターは、所望の目的（発現、送達、挿入、導入など）を達成する限り、どのようなベクターを用いても良いことが理解される。
好ましい実施形態では、阻害核酸分子の発現を特異的部位においてのみ起こさせるためのプロモーターをさらに含む。
別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子を含む植物細胞、植物組織、植物器官、植物体および植物種子を提供する。ここで、含まれるべき本発明の核酸分子は、好ましくは、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子であり得る。さらに好ましくは、この核酸分子は、植物におけるイネ萎縮ウイルスの増殖への関与、核酸分子の破壊によりイネ萎縮ウイルスに対する抵抗性が付与されること、植物におけるいもち病菌の増殖への関与、核酸分子の破壊によりいもち病菌に対する抵抗性が付与されること、イネ萎縮病に対する耐性または感受性、いもち病に対する耐性または感受性に関与していることに関し、好ましくは、その核酸分子の破壊によりイネ萎縮ウイルスおよび／またはいもち病菌に対する抵抗性が付与されるか、イネ萎縮病および／またはいもち病に対する耐性が付与されることが好ましい。
このような植物としては、どのようなものでも良いが、好ましくは、イネ萎縮ウイルスおよび／またはいもち病菌に罹患する植物であり、さらに好ましくは、イネ科植物（コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ソルガムなど）、さらにより好ましくはイネ属植物、さらにより好ましくは、イネ（例えば、ジャポニカ種またはインディカ種）であり得る。
（抵抗性・耐性植物の作出）
別の局面において、本発明は、イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性、イネ萎縮病に対して耐性、いもち病菌に対して抵抗性および／またはいもち病に対して耐性を有する植物（好ましくは、イネ萎縮病ウイルスに対する抵抗性（またはイネ萎縮病に対する耐性）といもち病菌に対して抵抗性（いもち病に対して耐性）とを両方有する植物）を作出する方法、ならびにこの方法によって作出された植物（例えば、植物細胞、植物組織、植物器官、植物体、植物種子など）を提供する。ここで、この方法は、（Ａ）目的とする植物において、本発明のＲＩＭ１核酸分子またはそれに対応する核酸分子の発現を抑制させる工程を包含する。発現の抑制は、ＤＮＡまたはＲＮＡ複製のレベルであっても、ＲＮＡ転写レベルであってもタンパク質翻訳レベルであっても、翻訳後のレベルであってもよい。この方法は、さらに、（Ｂ）イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を有する植物を選択する工程を包含し得る。選択は、抵抗性を有する植物を選択することができる限り、どのような方法を用いてもよく、細胞レベルでもよく、植物体レベルでもよい。このような植物としては、どのようなものでも良いが、好ましくは、イネ萎縮ウイルスおよび／またはいもち病菌に罹患する植物であり、さらに好ましくは、イネ科植物（コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ソルガムなど）、さらにより好ましくはイネ属植物、さらにより好ましくは、イネ（例えば、ジャポニカ種またはインディカ種）であり得る。
別の局面において、本発明は、イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性、イネ萎縮病に対して耐性、いもち病菌に対して抵抗性および／またはいもち病に対して耐性を有する植物（好ましくは、イネ萎縮病ウイルスに対する抵抗性（またはイネ萎縮病に対する耐性）といもち病菌に対して抵抗性（いもち病に対して耐性）とを両方有する植物）を作出する方法、ならびにこの方法によって作出された植物（例えば、植物細胞、植物組織、植物器官、植物体、植物種子など）を提供する。ここで、この方法は、（Ａ）目的とする植物において、本発明のＲＩＭ１核酸分子またはそれに対応する核酸分子の発現を抑制させる工程を包含する。発現の抑制は、ＤＮＡまたはＲＮＡ複製のレベルであっても、ＲＮＡ転写レベルであってもタンパク質翻訳レベルであっても、翻訳後のレベルであってもよい。この方法は、さらに、（Ｂ）イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を有する植物を選択する工程を包含し得る。選択は、抵抗性を有する植物を選択することができる限り、どのような方法を用いてもよく、細胞レベルでもよく、植物体レベルでもよい。このような植物としては、どのようなものでも良いが、好ましくは、イネ萎縮ウイルスおよび／またはいもち病菌に罹患する植物であり、さらに好ましくは、イネ科植物（コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ソルガムなど）、さらにより好ましくはイネ属植物、さらにより好ましくは、イネ（例えば、ジャポニカ種またはインディカ種）であり得る。
好ましくは、本発明のＲＩＭ１核酸分子の発現が抑制された植物を再生させる工程をさらに包含し得る。この抑制は、ジーンサイレンシング技術（例えば、ＲＮＡｉ、コサプレッション、リボザイム、キメラオリゴ、アンチセンスサプレッションおよびそれらの組合せ）またはドミナントネガティブ法によって達成され得る。
（スクリーニング方法）
本発明は、イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を付与させる因子、イネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子、いもち病菌に対して抵抗性を付与させる因子およびいもち病菌に対して抵抗性を付与させる因子からなる群より選択される少なくとも１つの因子をスクリーニングするための方法ならびにこの方法によって提供されまたは同定された因子（例えば、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子等）を提供する。本発明のスクリーニング方法は、Ａ）因子の候補を提供する工程；Ｂ）該候補と本発明のＲＩＭ１核酸分子とを相互作用させて、該核酸分子の機能が抑制されるかどうかを検出する工程；Ｃ）該機能の抑制を提供する候補をイネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子であると判定する工程、を包含する。このようなスクリーニングは、目的とする核酸分子またはポリペプチドに対して特異的に相互作用する因子ならびにその改変体およびフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの分子とそれらに相互作用する分子との相互作用に、試験因子が有意に影響を与える（減少、増強、消失など）かどうかを判定することによって同定することができる。このような試験因子の判定方法は、当該分野において周知であり、任意の統計学的手法を用いて結果を算出することができる。このようなスクリーニングまたは同定の方法は、当該分野において周知であり、例えば、そのようなスクリーニングまたは同定は、マイクロタイタープレート、ＤＮＡまたはプロテインなどの生体分子アレイまたはチップを用いて行うことができる。スクリーニングの試験因子を含む対象としては、例えば、遺伝子のライブラリー、コンビナトリアルライブラリーで合成した化合物ライブラリーなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本発明は、イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を付与させる因子、イネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子、いもち病菌に対して抵抗性を付与させる因子およびいもち病菌に対して抵抗性を付与させる因子からなる群より選択される少なくとも１つの因子をスクリーニングするための方法ならびにこの方法によって提供されまたは同定された因子（例えば、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子等）を提供する。本発明のスクリーニング方法は、Ａ）因子の候補を提供する工程；Ｂ）該候補と本発明のＲＩＭ１核酸分子とを相互作用させて、該核酸分子の機能が抑制されるかどうかを検出する工程；Ｃ）該機能の抑制を提供する候補をイネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子であると判定する工程、を包含する。このようなスクリーニングは、目的とする核酸分子またはポリペプチドに対して特異的に相互作用する因子ならびにその改変体およびフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの分子とそれらに相互作用する分子との相互作用に、試験因子が有意に影響を与える（減少、増強、消失など）かどうかを判定することによって同定することができる。このような試験因子の判定方法は、当該分野において周知であり、任意の統計学的手法を用いて結果を算出することができる。このようなスクリーニングまたは同定の方法は、当該分野において周知であり、例えば、そのようなスクリーニングまたは同定は、マイクロタイタープレート、ＤＮＡまたはプロテインなどの生体分子アレイまたはチップを用いて行うことができる。スクリーニングの試験因子を含む対象としては、例えば、遺伝子のライブラリー、コンビナトリアルライブラリーで合成した化合物ライブラリーなどが挙げられるがそれらに限定されない。
したがって、本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
本発明は、他の実施形態において、本発明の化合物に対する調節活性についての有効性のスクリーニングの道具として、コンピュータによる定量的構造活性相関（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ＝ＱＳＡＲ）モデル化技術を使用して得られる化合物を包含する。ここで、コンピューター技術は、いくつかのコンピュータによって作成した基質鋳型、ファーマコフォア、ならびに本発明の活性部位の相同モデルの作製などを包含する。一般に、インビトロで得られたデータから、ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基をモデル化するは、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭ ファーマコフォア法（Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：４７７〜４８９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８８：２１〜２９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９０：４２９〜４３８，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９１：４２４〜４３３，１９９９）および比較分子電界分析（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｉｅｌｄ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＣｏＭＦＡ）（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ＆ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，２４：１〜６，１９９６）などを使用して示されている。本発明において、コンピュータモデリングは、分子モデル化ソフトウェア（例えば、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭバージョン４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）など）を使用して行われ得る。
本発明は、他の実施形態において、本発明の化合物に対する調節活性についての有効性のスクリーニングの道具として、コンピュータによる定量的構造活性相関（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ＝ＱＳＡＲ）モデル化技術を使用して得られる化合物を包含する。ここで、コンピューター技術は、いくつかのコンピュータによって作成した基質鋳型、ファーマコフォア、ならびに本発明の活性部位の相同モデルの作製などを包含する。一般に、インビトロで得られたデータから、ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基をモデル化するは、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭ ファーマコフォア法（Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：４７７〜４８９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８８：２１〜２９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９０：４２９〜４３８，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９１：４２４〜４３３，１９９９）および比較分子電界分析（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｉｅｌｄ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＣｏＭＦＡ）（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ＆ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，２４：１〜６，１９９６）などを使用して示されている。本発明において、コンピュータモデリングは、分子モデル化ソフトウェア（例えば、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭバージョン４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）など）を使用して行われ得る。
活性部位に対する化合物のフィッティングは、当該分野で公知の種々のコンピュータモデリング技術のいずれかを使用してで行うことができる。視覚による検査および活性部位に対する化合物のマニュアルによる操作は、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，１９９２）、ＳＹＢＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，１９９２）、ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６：７６５〜７８４，１９８４）、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，４：１８７〜２１７，１９８３）などのようなプログラムを使用して行うことができる。これに加え、ＣＨＡＲＭＭ、ＡＭＢＥＲなどのような標準的な力の場を使用してエネルギーの最小化を行うこともできる。他のさらに特殊化されたコンピュータモデリングは、ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８：８４９〜８５７，１９８５）、ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：２９〜３４，１９９１）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ ａｎｄ Ｏｌｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：１９５〜２０２，１９９０）、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１：２６９〜２８８，（１９８２））などを含む。さらなる構造の化合物は、空白の活性部位、既知の低分子化合物における活性部位などに、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６：６１〜７８，１９９２）、ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ ａｎｄ Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７：８９８５，１９９１）、ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などのようなコンピュータープログラムを使用して新規に構築することもできる。このようなモデリングは、当該分野において周知慣用されており、当業者は、本明細書の開示に従って、適宜本発明の範囲に入る化合物を設計することができる。
別の局面において、本発明は、本発明の上記同定またはモデリング方法によって同定される因子を提供する。
（使用）
別の局面において、本発明は、本発明の核酸分子またはその核酸分子と相互作用する因子の、イネ萎縮病ウイルスに対する抵抗性、イネ萎縮病に対する耐性、いもち病菌に対する抵抗性および／またはいもち病に対する耐性を付与するための使用を提供する。ここで使用される核酸分子および因子は、本明細書において上記される任意の核酸分子であり得ることが理解される。
別の局面において、本発明は、本発明の核酸分子またはその核酸分子と相互作用する因子の、イネ萎縮病ウイルスに対する抵抗性、イネ萎縮病に対する耐性、いもち病菌に対する抵抗性および／またはいもち病に対する耐性を付与するための使用を提供する。ここで使用される核酸分子および因子は、本明細書において上記される任意の核酸分子であり得ることが理解される。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、和光純薬（大阪、日本）、インビトロジェン株式会社（東京、日本）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（ＮＪ，ＵＳＡ）、タカラバイオ株式会社（大津、日本）、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Madison, USA）などから市販されるものを用いた。
（実施例１：培養によるＴｏｓ１７の活性化および得られた変異体の特徴付け）
ジヤポニカ種の品種「日本晴」の完熟種子を出発材料に用い、先に記載のように（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７７８３−７７８８）（前述）、カルス開始培養および細胞懸濁培養を行った。遺伝子破壊を行うために使用したＴｏｓ１７を活性化するための培養条件は、大槻（１９９０）の方法（イネ・プロトプラスト培養系、農林水産技術情報協会）の方法に従った。
ジヤポニカ種の品種「日本晴」の完熟種子を出発材料に用い、先に記載のように（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７７８３−７７８８）（前述）、カルス開始培養および細胞懸濁培養を行った。遺伝子破壊を行うために使用したＴｏｓ１７を活性化するための培養条件は、大槻（１９９０）の方法（イネ・プロトプラスト培養系、農林水産技術情報協会）の方法に従った。
要約すれば、イネの完熟種子を２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を添加したＭＳ培地（大槻（１９９０）、前述）で培養し（２５℃、５ケ月間）、カルス誘導を行った。得られたカルスを、２，４−Ｄを添加したＮ６液体培地（大槻（１９９０）、前述）で５ケ月間培養したのち、再分化培地（大槻（１９９０）、前述）に移し再分化イネ（第１世代（Ｒ１）植物）を得た。
得られたＲ１イネの各々を１株とし、それぞれの株から全てのＲ１種子を回収した。イネへのＲＤＶの接種は、約８０％がＲＤＶを保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ１株当たり５頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約１日間イネを吸汁させて行った。図１は、イネ萎縮ウイルス接種後２ヶ月目の比較である。図１においては、左側に野生型株（左に健全株、右にＲＤＶ接種株を示す）、図１においては、右にｒｉｍ１変異系統株（左に健全株、右にＲＤＶ接種株を示す）を示している。図１より、ｒｉｍ１変異系統は、ＲＤＶに対して抵抗性を有しており、イネ萎縮病に対して耐性が付与されたことを示す。
図２には、ＲＤＶ接種後の外殻タンパク質蓄積量の相対強度を示す。白抜きがｒｉｍ１変異株であり、黒は野生型を示す。このように接種後約２週間から野生型では、ウイルスに由来するタンパク質の蓄積が見られるのに対して、ｒｉｍ１変異株では、５０日後でもほとんど見出されなかった。従って、ウイルスのタンパク質生成に対して抑制効果が働いていることが理解される。
（実施例２：Ｔｏｓ１７の隣接配列の単離）
実施例１で見られたような表現型を支配する遺伝子を突き止めるために、ゲノムＤＮＡ中に転移されたＴｏｓ１７の隣接配列を単離した。
実施例１で見られたような表現型を支配する遺伝子を突き止めるために、ゲノムＤＮＡ中に転移されたＴｏｓ１７の隣接配列を単離した。
実施例１で得られたＲ２イネ（独立に、１６個体）からＣＴＡＢ法（ＭｕｒｒａｙおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９８０、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．８、４３２１−４３２５）によりＤＮＡを調製した。Tos17標的部位配列の増幅は、Miyaoら、1998、PlantBiotechnology 15、 253-256、総DNAを用いるTAILPCR により実施した。
要約すれば、まず、Ｔｏｓ１７挿入変異株（ＲＤＶ抵抗性株）、およびＴｏｓ１７挿入の認められない株（ＲＤＶ感受性株）を１株ずつ選抜し、総ＤＮＡを抽出した。これらの総ＤＮＡ約３０ｎｇ を鋳型に用いてＴＡＩＬ ＰＣＲをおこなった。Ｔｏｓ１７特異的プライマーとしては、Ｔｏｓ１７−ｔａｉｌ２：ＡＧＴＣＧＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＧ（配列番号６）、Ｔｏｓ１７−ｔａｉｌ３：ＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号７）、Ｔｏｓ１７−ｔａｉｌ４；ＡＴＣＣＡＣＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＧ（配列番号８）を用い、ランダムプライマーとしては、ＡＤ１： ＮＧＴＣＧＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）ＧＡＮＡ（Ａ／Ｔ）ＧＡＡ（配列番号９）、ＡＤ２：ＧＴＮＣＧＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）ＣＡＮＡ（Ａ／Ｔ）ＧＴＴ（配列番号１０）、ＡＤ３：（Ａ／Ｔ）ＧＴＧＮＡＧ（Ａ／Ｔ）ＡＮＣＡＮＡＧＡ（配列番号１１）を用いた。Ｔｏｓ１７挿入変異株（ＲＤＶ抵抗性株）を鋳型に用いた場合にのみ増幅したＤＮＡをｐＣＲ４ベクター（インビトロジェン）にクローン化し、塩基配列を決定した。シークエンサーはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた。この配列を基にして設計したプライマーＯｈｍｕｒａ０７＿ｃｈｅｃｋ＋３７３： ＡＣＡＧＣＡＣＴＣＧＣＴＴＣＧＴＡＧＡＡＴ（配列番号１２）とＴｏｓ１７ ｔａｉｌ６： ＣＴＡＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＣＡＡＧＴＴＡＧＴＴＡＡＧＡ（配列番号１３），を用いて増幅したＤＮＡをプローブに用いたサザン解析より、ＲＤＶ抵抗性株とＲＤＶ感受性株におけるＴｏｓ挿入の有無を確認した。さらにＲＩＭ ＳＳＬＰ ＦＰ１： ＧＧＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＣＧＴＡＡＡＴＴＴＴＧＧ（配列番号１４）、ＲＩＭ ＳＳＬＰ ＲＰ１： ＣＧＴＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＡＧＴＡＡＣ（配列番号１５）を用いたＰＣＲを行うことにより、ＲＤＶ抵抗性株とＲＤＶ感受性株におけるＴｏｓ挿入の有無を確認した。図３はＲＩＭ１遺伝子を含むゲノム配列を示し、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に登録されているＢＡＣクローンＯＪ１２６３Ｈ１１上の８８１４７−９３６２０の塩基を示した。
これをエキソン・イントロン構造を解析した結果を図４に示す。図４は、RIM1遺伝子のエキソン−イントロン構造を示す。ボックスはエキソンを、ラインはイントロンを示す。RIM1は２種のmRNAをコードしており、上が、RIM1-Lであり、下がRIM1-Sである。これらのエキソンのゲノム上での位置は、ＲＩＭ１−Ｌでは、５’末端側のエキソンから、第８９３５３位〜第８９５０９位；第９１０００位〜第９１２７７位；第９１４６３位〜第９１８１９位；第９１９２３位〜第９２３３６位；第９２４３８位〜第９２５１９位；第９２６４６位〜第９３３１０位である。他方、ＲＩＭ１−Ｓでは、５’末端側のエキソンから、第８９３５３位〜第８９５０９位；第９１０００位〜第９１２７７位；第９１４６３位〜第９１８１９位；第９１９２３位〜第９２３３６位；第９２４３８位〜第９２５１９位；第９２６３９位〜第９２６７９である。ＲＩＭ１は２種のｍＲＮＡ（ＲＩＭ１−ＬおよびＲＩＭ１−Ｓ）をコードしていることが明らかになった。ＲＩＭ１−Ｌを配列番号１として、ＲＩＭ１−Ｓを配列番号３として示す（図５）。これらのポリペプチドの配列は、配列番号２および４に記載のポリペプチドである。
（実施例３：変異体の原因遺伝子の構造解析）
土壌で１４日間生育させた野生型イネ（日本晴）の幼苗から以下のようにＲＮＡを調製した。まず、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて幼苗から総ＲＮＡを調製した。総ＲＮＡ １μｇを用いてＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）のマニュアルに従い、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成し、プライマーＲＩＭ１−Ｂａｍ ＦＰ：ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＧＴＧＡＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＡ ＲＩＭ１−Ｘｂａ ＲＰ：ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＣＧＣＡＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＧＴＧを用いてＰＣＲを行い、増幅したＲＩＭ１ ｃＤＮＡをｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）にクローン化した。５’末端および３’末端はＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン）のマニュアルに従って決定した。塩基配列の決定はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた。配列決定分析にはＧｅｎｅｔｙｘ Ｍａｃ ｖｅｒ１２（ゼネティックス）を用いた。その結果ＲＩＭ１−Ｌは３４８７ｂｐの長さからなり、６５０アミノ酸からなる１９５３ｂｐのＯＲＦが同定された。ＲＩＭ１−Ｓは３４９４ｂｐの長さからなり、４４２アミノ酸からなる１３２６ｂｐのＯＲＦが同定された。
土壌で１４日間生育させた野生型イネ（日本晴）の幼苗から以下のようにＲＮＡを調製した。まず、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて幼苗から総ＲＮＡを調製した。総ＲＮＡ １μｇを用いてＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）のマニュアルに従い、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成し、プライマーＲＩＭ１−Ｂａｍ ＦＰ：ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＧＴＧＡＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＡ ＲＩＭ１−Ｘｂａ ＲＰ：ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＣＧＣＡＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＧＴＧを用いてＰＣＲを行い、増幅したＲＩＭ１ ｃＤＮＡをｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）にクローン化した。５’末端および３’末端はＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン）のマニュアルに従って決定した。塩基配列の決定はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた。配列決定分析にはＧｅｎｅｔｙｘ Ｍａｃ ｖｅｒ１２（ゼネティックス）を用いた。その結果ＲＩＭ１−Ｌは３４８７ｂｐの長さからなり、６５０アミノ酸からなる１９５３ｂｐのＯＲＦが同定された。ＲＩＭ１−Ｓは３４９４ｂｐの長さからなり、４４２アミノ酸からなる１３２６ｂｐのＯＲＦが同定された。
（実施例４：いもち病に対する耐性）
次に、上記実施例において作出したｒｉｍ１変異系統について、いもち病に対する耐性を調べた。その方法は以下の通りである。つまり、15×104個/mlのいもち病菌胞子を0.01％Tween20溶液に懸濁し、検体であるイネの葉に噴霧した。これを２４時間、湿度100％の条件で保持した後、25℃に保持したインキュベータにイネを保持する。その８日後にいもち病斑形成を調べた。
次に、上記実施例において作出したｒｉｍ１変異系統について、いもち病に対する耐性を調べた。その方法は以下の通りである。つまり、15×104個/mlのいもち病菌胞子を0.01％Tween20溶液に懸濁し、検体であるイネの葉に噴霧した。これを２４時間、湿度100％の条件で保持した後、25℃に保持したインキュベータにイネを保持する。その８日後にいもち病斑形成を調べた。
その結果を図６に示す。図６の上パネルには、日本晴（標準株）とｒｉｍ１変異体とを比較した結果を示す。明らかなように、日本晴は、いもち病に罹病したのに対して、ｒｉｍ１変異体は、いもち病に対して耐性が付与されていることが明らかになった。
図６下パネルには、いもち病の発病指数（感染後８日目）および胞子／１００ｍｇ新鮮葉（感染後８日目）のデータを示す。示されるように、日本晴については、いもち病菌に起因する発病指数が高く、より多くの菌胞子の増殖が見られたのに対して、ｒｍ１変異体では、いずれも低く抑えられていた。
従って、本発明によって、いもち病菌に対する抵抗性およびいもち病に対する耐性が付与されることが理解される。
（実施例５：転写レベルでのスクリーニング）
次に、本発明の因子をスクリーニングする方法として、イネの細胞株または初代培養脂肪細胞を用いて、候補薬物ライブラリーの（種々の濃度での）存在下または非存在下で、これらの細胞を培養する。
次に、本発明の因子をスクリーニングする方法として、イネの細胞株または初代培養脂肪細胞を用いて、候補薬物ライブラリーの（種々の濃度での）存在下または非存在下で、これらの細胞を培養する。
ｒｉｍ１遺伝子のｍＲＮＡの発現は、上記実施例に記載される技術に準じて測定する。
これにより、ｍＲＮＡレベルで、発現量を活性化させる化合物を測定することができる。
（実施例６：翻訳レベルでのスクリーニング）
次に、本発明の因子をスクリーニングする方法として、イネの細胞株または初代培養脂肪細胞を用いて、候補薬物ライブラリーの（種々の濃度での）存在下または非存在下で、これらの細胞を培養する。
次に、本発明の因子をスクリーニングする方法として、イネの細胞株または初代培養脂肪細胞を用いて、候補薬物ライブラリーの（種々の濃度での）存在下または非存在下で、これらの細胞を培養する。
ｒｉｍ１遺伝子のタンパク質の発現は、上記実施例に記載される技術に準じて測定する。
これにより、タンパク質の発現レベルで、発現量を活性化させる化合物を測定することができる。
（実施例７：ＲＮＡｉ技術によりＲＩＭ１遺伝子の発現を抑制した、形質転換イネの作出）
ＲＩＭ１遺伝子を破壊した系統において葉先が捻れ、植物体の生長の抑制が著しいものについては、ＲＩＭ１遺伝子の発現を適度に抑制させ、それらのＲＩＭ１遺伝子抑制株の中からＲＤＶ抵抗性系統を選出することで、ＲＤＶ抵抗性植物体を得る。
ＲＩＭ１遺伝子を破壊した系統において葉先が捻れ、植物体の生長の抑制が著しいものについては、ＲＩＭ１遺伝子の発現を適度に抑制させ、それらのＲＩＭ１遺伝子抑制株の中からＲＤＶ抵抗性系統を選出することで、ＲＤＶ抵抗性植物体を得る。
植物におけるＲＮＡｉのプロトコルについては、「実験医学別冊 注目のバイオ実験シリーズ８ 改訂 ＲＮＡｉ実験プロトコール より効果的な遺伝子の発現抑制を行うための最新テクニック」（羊土社；２００４年１０月１日）の「生物種別ＲＮＡｉ実験プロトコール ２ 植物」などに記載される。このようなプロトコールにしたがって、形質転換植物を作製し得る。
（１）ＲＩＭ１遺伝子に特異的な領域（ＲＮＡｉを引き起こす因子）を、特異的なプライマーセットを用いて増幅する；
（２）制限酵素またはＧａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）システムなどを用いて、形質転換用のＲＮＡｉバイナリーベクターを作製する；
（３）ＲＮＡｉを引き起こす因子を（２）のベクターにクローニングする；
（４）上記ベクターをエレクトロポレーション法などによってアグロバクテリウムへ導入する；
（５）アグロバクテリウムにベクターが導入されていることを、ＰＣＲなどにより確認する；
（６）形質転換イネの作出は、カルス化したイネにアグロバクテリウムを感染させ、その後、再分化させ形質転換イネを作製することによって行われ得る（アグロバクテリウム法による形質転換イネの作出は、Ｓａｎｄｅｒ，Ｍら：ＥＭＢＯ Ｊ．，２１：５８２４〜５８３２，２００２、ならびにＡｌｄｅｒ Ｍ．Ｎら：ＲＮＡ，９ ２５−３２，２００３などの詳説があり、これらを参考に作出し得る）。
（１）ＲＩＭ１遺伝子に特異的な領域（ＲＮＡｉを引き起こす因子）を、特異的なプライマーセットを用いて増幅する；
（２）制限酵素またはＧａｔｅｗａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）システムなどを用いて、形質転換用のＲＮＡｉバイナリーベクターを作製する；
（３）ＲＮＡｉを引き起こす因子を（２）のベクターにクローニングする；
（４）上記ベクターをエレクトロポレーション法などによってアグロバクテリウムへ導入する；
（５）アグロバクテリウムにベクターが導入されていることを、ＰＣＲなどにより確認する；
（６）形質転換イネの作出は、カルス化したイネにアグロバクテリウムを感染させ、その後、再分化させ形質転換イネを作製することによって行われ得る（アグロバクテリウム法による形質転換イネの作出は、Ｓａｎｄｅｒ，Ｍら：ＥＭＢＯ Ｊ．，２１：５８２４〜５８３２，２００２、ならびにＡｌｄｅｒ Ｍ．Ｎら：ＲＮＡ，９ ２５−３２，２００３などの詳説があり、これらを参考に作出し得る）。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本発明は、イネ萎縮病およびいもち病の処置または予防において有用な標的およびそれによるスクリーニング法、ならびにその方法によって同定される医薬を用いて、イネ萎縮病およびいもち病に関連する病害を処置することができるという有用性を有する。
配列番号１：RIM1-LcDNA（3469 bp）の核酸配列
配列番号２：配列番号１に記載の核酸配列配列によってコードされるタンパク質
配列番号３：RIM1-ScDNA（3476 bp）の核酸配列
配列番号４：配列番号１に記載の核酸配列配列によってコードされるタンパク質
配列番号５：イネ第３染色体上のBAC OJ1263H11 (gene bank accession: AC118980)の88147-93620の塩基配列（ゲノム配列）
配列番号６：Ｔｏｓ１７特異的プライマーである、Ｔｏｓ１７−ｔａｉｌ２の核酸配列：ＡＧＴＣＧＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＧ
配列番号７：Ｔｏｓ１７特異的プライマーである、Ｔｏｓ１７−ｔａｉｌ３の核酸配列：ＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣ
配列番号８：Ｔｏｓ１７特異的プライマーである、Ｔｏｓ１７−ｔａｉｌ４の核酸配列；ＡＴＣＣＡＣＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＧ
配列番号９：ランダムプライマーである、ＡＤ１の核酸配列： ＮＧＴＣＧＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）ＧＡＮＡ（Ａ／Ｔ）ＧＡＡ
配列番号１０：ランダムプライマーである、ＡＤ２の核酸配列：ＧＴＮＣＧＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）ＣＡＮＡ（Ａ／Ｔ）ＧＴＴ
配列番号１１：ランダムプライマーである、ＡＤ３の核酸配列：（Ａ／Ｔ）ＧＴＧＮＡＧ（Ａ／Ｔ）ＡＮＣＡＮＡＧＡ
配列番号１２：プライマーＯｈｍｕｒａ０７＿ｃｈｅｃｋ＋３７３の核酸配列： ＡＣＡＧＣＡＣＴＣＧＣＴＴＣＧＴＡＧＡＡＴ
配列番号１３：プライマーＴｏｓ１７ ｔａｉｌ６の核酸配列： ＣＴＡＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＣＡＡＧＴＴＡＧＴＴＡＡＧＡ
配列番号１４：ＲＩＭ ＳＳＬＰ ＦＰ１の核酸配列： ＧＧＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＣＧＴＡＡＡＴＴＴＴＧＧ
配列番号１５：ＲＩＭ ＳＳＬＰ ＲＰ１の核酸配列： ＣＧＴＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＡＧＴＡＡＣ
配列番号２：配列番号１に記載の核酸配列配列によってコードされるタンパク質
配列番号３：RIM1-ScDNA（3476 bp）の核酸配列
配列番号４：配列番号１に記載の核酸配列配列によってコードされるタンパク質
配列番号５：イネ第３染色体上のBAC OJ1263H11 (gene bank accession: AC118980)の88147-93620の塩基配列（ゲノム配列）
配列番号６：Ｔｏｓ１７特異的プライマーである、Ｔｏｓ１７−ｔａｉｌ２の核酸配列：ＡＧＴＣＧＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＧ
配列番号７：Ｔｏｓ１７特異的プライマーである、Ｔｏｓ１７−ｔａｉｌ３の核酸配列：ＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣ
配列番号８：Ｔｏｓ１７特異的プライマーである、Ｔｏｓ１７−ｔａｉｌ４の核酸配列；ＡＴＣＣＡＣＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＧ
配列番号９：ランダムプライマーである、ＡＤ１の核酸配列： ＮＧＴＣＧＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）ＧＡＮＡ（Ａ／Ｔ）ＧＡＡ
配列番号１０：ランダムプライマーである、ＡＤ２の核酸配列：ＧＴＮＣＧＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）ＣＡＮＡ（Ａ／Ｔ）ＧＴＴ
配列番号１１：ランダムプライマーである、ＡＤ３の核酸配列：（Ａ／Ｔ）ＧＴＧＮＡＧ（Ａ／Ｔ）ＡＮＣＡＮＡＧＡ
配列番号１２：プライマーＯｈｍｕｒａ０７＿ｃｈｅｃｋ＋３７３の核酸配列： ＡＣＡＧＣＡＣＴＣＧＣＴＴＣＧＴＡＧＡＡＴ
配列番号１３：プライマーＴｏｓ１７ ｔａｉｌ６の核酸配列： ＣＴＡＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＣＡＡＧＴＴＡＧＴＴＡＡＧＡ
配列番号１４：ＲＩＭ ＳＳＬＰ ＦＰ１の核酸配列： ＧＧＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＣＧＴＡＡＡＴＴＴＴＧＧ
配列番号１５：ＲＩＭ ＳＳＬＰ ＲＰ１の核酸配列： ＣＧＴＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＡＧＴＡＡＣ
Claims (59)
- （ａ）配列番号１または配列番号３に示す塩基配列；
（ｂ）該（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（ｃ）該（ａ）の塩基配列において、１または複数の置換、付加または欠失を有し、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（ｄ）該（ａ）の塩基配列に対して少なくとも７０％の配列相同性を有し、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（ｅ）該（ａ）の塩基配列からなる核酸分子の種相同体、スプライス変異体または対立遺伝子変異体をコードし、生物学的機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列、および
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される塩基配列のフラグメント
からなる群より選択される配列を含む、核酸分子。 - 前記生物学的機能は、植物におけるイネ萎縮ウイルスの増殖への関与および前記核酸分子の破壊によりイネ萎縮ウイルスに対する抵抗性が付与されることからなる群より選択される、請求項１に記載の核酸分子。
- 前記抵抗性は、前記核酸分子における塩基配列の少なくとも一部が破壊されることもしくは発現が抑制されること、または該核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現が抑制されることによって、付与される、請求項２に記載の核酸分子。
- 前記生物学的機能は、植物におけるいもち病菌の増殖への関与および前記核酸分子の破壊によりいもち病菌に対する抵抗性が付与されることからなる群より選択される、請求項１に記載の核酸分子。
- 前記抵抗性は、前記核酸分子における塩基配列の少なくとも一部が破壊されることもしくは発現が抑制されること、または該核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現が抑制されることによって、付与される、請求項４に記載の核酸分子。
- 前記生物学的機能は、イネ萎縮病に対する耐性を含む、請求項１に記載の核酸分子。
- 前記生物学的機能は、いもち病に対する耐性を含む、請求項１に記載の核酸分子。
- イネ萎縮ウイルスに対する抵抗性およびいもち病菌に対する抵抗性からなる群より選択される少なくとも１つの抵抗性を付与することができる因子であって、該因子は、請求項１に記載の核酸分子の機能を阻害する機能を有する、因子。
- 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項８に記載の因子。
- 前記因子は、請求項１に記載される核酸分子と相互作用するか、または請求項１に記載される核酸分子によってコードされるポリペプチドと相互作用することを特徴とする、請求項８に記載の因子。
- 前記因子は、請求項１に記載される核酸分子のアンチセンス核酸分子またはＲＮＡｉ分子であるか、あるいは請求項１に記載される核酸分子によってコードされるポリペプチドに対する抗体であることを特徴とする、請求項８に記載の因子。
- 前記因子を特異的部位に送達させる手段をさらに含む、請求項８に記載の因子。
- 前記手段は、前記特異的部位に特異的に前記核酸分子を発現させるものである、請求項１２に記載の因子。
- 前記手段は、プロモーターである、請求項１３に記載の因子。
- 請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項１に記載の核酸分子の機能を阻害する阻害核酸分子を含む、ベクター。
- 前記阻害核酸分子は、ドミナントネガティブ実験における条件下において、請求項１に記載の核酸分子または該核酸分子の発現を調節する配列とハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１６に記載のベクター。
- 前記阻害核酸分子は、リプレッションドメインをコードする領域を含む、請求項１６に記載のベクター。
- 前記阻害核酸分子の発現を特異的部位においてのみ起こさせるためのプロモーターをさらに含む、請求項１６に記載のベクター。
- 請求項１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物細胞。
- 請求項１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物組織。
- 請求項１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物器官。
- 請求項１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物体。
- 請求項１に記載の核酸分子であって、配列番号１または３に示す配列とは同一ではない核酸分子を含む、植物種子。
- イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を有する植物を作出する方法であって、
（Ａ）目的とする植物において、請求項１に記載の核酸分子またはそれに対応する核酸分子の発現を抑制させる工程
を包含する、方法。 - さらに、（Ｂ）イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を有する植物を選択する工程を包含する、請求項２５に記載の方法。
- 前記発現が抑制された植物を再生させる工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
- 前記抑制は、ジーンサイレンシング技術またはドミナントネガティブ法によって達成される、請求項２５に記載の方法。
- 前記ジーンサイレンシング技術は、ＲＮＡｉ、コサプレッション、リボザイム、キメラオリゴ、アンチセンスサプレッションおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
- 前記植物は、イネ科植物である、請求項２５に記載の方法。
- 前記植物は、イネ属植物である、請求項２５に記載の方法。
- 前記植物は、イネである、請求項２５に記載の方法。
- 前記植物は、ジャポニカ種のイネである、請求項２５に記載の方法。
- イネ萎縮病に対して耐性を有する植物を作出する方法であって、
（Ａ）目的とする植物において、請求項１に記載の核酸分子またはそれに対応する核酸分子の発現を抑制させる工程
を包含する、方法。 - いもち病菌に対して抵抗性を有する植物を作出する方法であって、
（Ａ）目的とする植物において、請求項１に記載の核酸分子またはそれに対応する核酸分子の発現を抑制させる工程
を包含する、方法。 - さらに、（Ｂ）イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を有する植物を選択する工程を包含する、請求項３５に記載の方法。
- 前記発現が抑制された植物を再生させる工程をさらに包含する、請求項３５に記載の方法。
- 前記抑制は、ジーンサイレンシング技術またはドミナントネガティブ法によって達成される、請求項３５に記載の方法。
- 前記ジーンサイレンシング技術は、ＲＮＡｉ、コサプレッション、リボザイム、キメラオリゴ、アンチセンスサプレッションおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
- 前記植物は、イネ科植物である、請求項３５に記載の方法。
- 前記植物は、イネ属植物である、請求項３５に記載の方法。
- 前記植物は、イネである、請求項３５に記載の方法。
- 前記植物は、ジャポニカ種のイネである、請求項３５に記載の方法。
- いもち病に対して耐性を有する植物を作出する方法であって、
（Ａ）目的とする植物において、請求項１に記載の核酸分子またはそれに対応する核酸分子の発現を抑制させる工程
を包含する、方法。 - 請求項２５、３４、３５または４４のいずれか１項に記載の方法によって作出された、植物。
- イネ萎縮病ウイルスに対して抵抗性を付与させる因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は：
Ａ）因子の候補を提供する工程；
Ｂ）該候補と請求項１に記載の核酸分子とを相互作用させて、該核酸分子の機能が抑制されるかどうかを検出する工程；
Ｃ）該機能の抑制を提供する候補をイネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子であると判定する工程、
を包含する、方法。 - イネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は：
Ａ）因子の候補を提供する工程；
Ｂ）該候補と請求項１に記載の核酸分子とを相互作用させて、該核酸分子の機能が抑制されるかどうかを検出する工程；
Ｃ）該機能の抑制を提供する候補をイネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子であると判定する工程、
を包含する、方法。 - いもち病菌に対して抵抗性を付与させる因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は：
Ａ）因子の候補を提供する工程；
Ｂ）該候補と請求項１に記載の核酸分子とを相互作用させて、該核酸分子の機能が抑制されるかどうかを検出する工程；
Ｃ）該機能の抑制を提供する候補をイネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子であると判定する工程、
を包含する、方法。 - いもち病に対して耐性を付与させる因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は：
Ａ）因子の候補を提供する工程；
Ｂ）該候補と請求項１に記載の核酸分子とを相互作用させて、該核酸分子の機能が抑制されるかどうかを検出する工程；
Ｃ）該機能の抑制を提供する候補をイネ萎縮病に対して耐性を付与させる因子であると判定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項４６から４９のいずれか１項に記載の方法によって同定された因子。
- 請求項１に記載の核酸分子がコードするポリペプチド。
- 請求項１に記載の核酸分子の、イネ萎縮病ウイルスに対する抵抗性を付与するための使用。
- 請求項１に記載の核酸分子の、イネ萎縮病に対する耐性を付与するための使用。
- 請求項１に記載の核酸分子の、いもち病菌に対する抵抗性を付与するための使用。
- 請求項１に記載の核酸分子の、いもち病に対する耐性を付与するための使用。
- 請求項１に記載の核酸分子と相互作用する因子の、イネ萎縮病ウイルスに対する抵抗性を付与するための使用。
- 請求項１に記載の核酸分子と相互作用する因子の、イネ萎縮病に対する耐性を付与するための使用。
- 請求項１に記載の核酸分子と相互作用する因子の、いもち病菌に対する抵抗性を付与するための使用。
- 請求項１に記載の核酸分子と相互作用する因子の、いもち病に対する耐性を付与するための使用。
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| JP2005278950A JP2007089402A (ja) | 2005-09-26 | 2005-09-26 | イネ萎縮ウイルスの感染に必須なイネ遺伝子 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010079335A3 (en) * | 2009-01-09 | 2010-10-21 | Rothamsted Research Ltd. | Method for improving biomass yield |
| CN112390866A (zh) * | 2019-08-14 | 2021-02-23 | 北京大学 | OsARF12基因在提高水稻对水稻矮缩病毒抗性中的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005047516A2 (en) * | 2003-11-13 | 2005-05-26 | Mendel Biotechnology, Inc. | Plant transcriptional regulators |
-
2005
- 2005-09-26 JP JP2005278950A patent/JP2007089402A/ja active Pending
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2005047516A2 (en) * | 2003-11-13 | 2005-05-26 | Mendel Biotechnology, Inc. | Plant transcriptional regulators |
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| CN112390866A (zh) * | 2019-08-14 | 2021-02-23 | 北京大学 | OsARF12基因在提高水稻对水稻矮缩病毒抗性中的应用 |
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