JP2007075090A - 旋回培養装置 - Google Patents

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Abstract

【課題】旋回培養装置に荷重や加圧の力学的刺激を加える。培地交換も自動的に行い培養細胞の汎用性を有する培養装置、培養方法を提供する。
【解決手段】培養部の培地槽とポンプ部の培地タンクを連動するように構成し、培地槽回転駆動モーターで培地槽と培養タンクを回転させ、ポンプ部の外部回転加圧装置を回転駆動モーターで回転させ、チューブポンプや加圧用チューブポンプに圧力をかけ、培地槽内の加圧、培地交換を行う、培地槽の回転とポンプ部の回転は独立しており、加圧や培地量は可変であり、加圧用チューブポンプ、培地交換用チューブポンプは脱着交換可能な旋回培養装置。
【選択図】図5

Description

技術の分野
本発明は、力学的刺激負荷が可能な旋回培養装置及び細胞培養方法に関する。
従来の薬物療法や外科的手術で治癒不可能な病変組織に対して、自家細胞を体外で培養した細胞組織を、生体に移植することにより機能再建を目指す新しい治療方法として世界中で研究開発が行われている。
生体内の組織・細胞は種々の因子による生化学的な刺激だけでなく、動的な力学刺激を繰り返すことで、分化・増殖・代謝など、細胞の生化学的そして生理学的な機能を発揮している。これまで世界中で力学刺激を利用し、細胞の分化・増殖を目的とした細胞培養システムの開発を検討、実施がなされてきた。
まず、力学刺激としては試験管を旋回させる装置やフラスコ内の懸濁培地を回転攪拌させる方法。フラスコを旋回させる方法等から、シート状培養担体に細胞を播種したシートを伸縮させる伸縮培養装置やシート状培養担体を振動させる振動培養装置から、細胞を播種した3次元培養担体に静水圧荷重培養装置や回転(旋回)培養装置が開発された。
特に回転(旋回)培養装置としては、NASAの開発した回転(RWV)バイオリアクタが有名で、この回転(旋回)培養装置を使って世界中で多くの研究者によって成果発表が行われている。
なかでもマサチューセッツ工科大学のフリードらの仕事が有名で、彼女らはウシの関節軟骨細胞をポリグリコール酸(PGA)でできた足場材料(scaffold)に播種し、回転(RWV)バイオリアクタに移した後、スペースシャトルでミール宇宙ステーションに運び4ヶ月間培養した。その後、地上に帰還させ、地上で回転(RWV)バイオリアクタを用いて培養した軟骨との比較から、できあがった組織の形状は地上での培養軟骨はもとの形を反映していたが、ミールではほぼ球形であったり、重量はミールより地上の方が大きかったり、機械的性質は地上で得られたものの方が関節軟骨に近かった。
これらの結果から、必ずしも微小重力環境が3次元組織構築に有利であるわけでなく、適度な力学刺激が必要であると発表している。
また国内の独立行政法人物質・材料研究機構も軟骨培養やマウスの肝臓から単離した細胞集団から胆管や血管を持った組織の再現に成功したと発表している。
東京大学の牛田多加志、立石哲也らの研究グループもウシ軟骨細胞を用いて生体外で再生軟骨を再構築することを目的とした実験を行っている。結論として、軟骨細胞を用いて細胞ディスクシートを作製し、静置培養と旋回培養をおこない、静置培養と旋回培養とを比較した結果、旋回培養によって力学的な特性に優れた再生軟骨が作製できることが明らかになった。
NASAは宇宙旅行中に幹細胞から組織を培養、移植するプロジェクトをキングストン大学のコリン・マガッキン博士とP・ニコラス・フォラズ博士と共同で100万ドルのプロジェクトに着手した。
テキサス大学のデュークらは、軟骨の3次元組織培養や顎骨の発生過程の研究などを精力的に行っている。回転(RWV)バイオリアクタを用いてマウスの3次元培養を行い。確認検査後、回転(RWV)バイオリアクタを用いて軟骨組織を3次元構築することが可能であることを示している。またデュークらは軟骨組織から骨組織にだんだん移行していく様子を回転(RWV)バイオリアクタを用いて確認している。
NASAはこの回転(RWV)培養装置を羊水に包まれフワフワとした環境は母体内の胎児の環境に類似しているとし、回転(PWV)培養装置をES細胞培養装置としての研究成果を期待している。
このように回転(RWV)バイオリアクタの3次元培養方法、組織工学での利用だけでなく、生物の発生や進化を考える上でも、とても重要な技術に発展する可能性を秘めていると世界中の研究者達はさらなる培養実験装置、進化の研究用培養装置として研究開発を行っている。
特開2003−265164号公報 特開2003−289851号公報 特開2004−350557号公報
NASA開発の回転(RWV)バイオリアクタを使用した多くの研究者達は、研究成果と、さらなる研究に回転(RWV)バイオリアクタに力学的負荷の刺激を加えた培養装置の研究開発あるいは開発の要望がある。さらにNASAの回転(RWV)バイオリアクタを羊水に包まれた胎児の環境としているが、炭酸ガスインキュベター内で保温(37℃)し、回転させる培養装置では、鶏の孵卵培養装置に類似しており、母体が胎児に与える環境の再現とは言えない。
発明が解決するための手段
本発明は、培地槽内に細胞を懸濁した培地を、旋回させながら、チューブポンプで荷重あるいは、血管細胞を播種したパイプ形状培養担体内部に培地タンクから培地あるいは血液を拍動流で流し、血官の3次元培養装置とする。また培地タンク内に分圧された気体(空気)を注入し、チューブポンプで気管上皮細胞を播種したパイプ形状培養担体内部にチューブポンプで拍動流で通過させ呼吸気管系組織の培養をおこなう旋回培養装置。
さらに、培地槽(培養容器)を旋回させ、培養細胞の沈降方向を変え、培地内をフワフワと浮いた状態に、チューブポンプに外部加圧回転部を回転させ、培養細胞に加圧をかける。NASAは2020年に火星に有人飛行をさせる計画をしており、宇宙の微小重力環境での荷重装置の開発を望んでいる。
また、さきに出願した回転荷重加圧培養装置(特願2005−61516)とセットにすると、母体の胎児に与える物理的刺激に加え、培地の交換等、更に多様な刺激や長期培養が行える。
発明の効果
本発明は、培養装置にポンプ部分が組み込まれており、他の静水圧培養装置と比較して小型で構造も簡単であり、さらに、チューブポンプを変えることで加圧、培地交換、拍動流培養装置としても実験可能な装置であり、極めてシンプルな構造の培養装置であるにも係わらず、多くの培養方法の実験装置として利用可能である。
培養装置の部品は簡単に分解可能でオートクレーブで滅菌や洗浄、消毒が隅々まで行える。また培養培地、細胞に接触した部品は安全性のためすべて破棄できるように開発した。将来、再生医療用培養装置として厚生労働省の細胞製造装置としての認可を収得できる可能性が高い。
以下で本発明の旋回培養装置の形態を説明する。図1に示すように、基本構造として、培養部とポンプ部で構成、培養部とポンプ部は連結、連動する。ポンプ部には培地タンク(4)と培地槽(1)とを固定連結された円形固定装置(12)と、円形固定装置(12)外径にはチューブポンプ(13)を取り付け、円形固定装置(12)内側には培地タンク(4)を固定装着し、培地タンク(4)から培地槽(1)に連結配管を行い、回転加圧駆動モーター(3)で外部回転加圧装置(2)を回転させ、培地タンク(4)内の培地をチューブポンプ(13)を加圧し、培地タンク(4)内の培地を培地槽(1)に循環させ培地槽(1)を固定静止した静止培養に培地を循環させる、また静止培養において培地槽は円形、箱形等状況に応じて形状を可変とする。
さらに図2に示す加圧装置を図3の培地交換装置と付け替え、加圧用チューブポンプ(8)を円形固定装置(12)に固定をし、加圧チューブ(7)を培地槽(1)内に装着をする。加圧用チューブポンプ(8)と加圧チューブ(7)の内部に液体(気体を含む)を注入密封を行い、回転加圧駆動モーター(3)を回転させ、外部回転加圧装置(2)で加圧用チューブポンプ(8)を加圧し、培地槽(1)内の加圧チューブ(7)を介して、培地槽(1)内の細胞を播種した培養担体に圧力をかけ力学的刺激を繰り返し発生させる。
図5は培地槽(1)を旋回させ、細胞の沈下方向を変え、培地内を浮遊させ3次元培養を行う方法に、加圧循環培養法を付加した培養装置で、培地槽回転駆動モーター(11)を培地槽に固定し、培地槽を旋回させる。培地槽に加圧をかけない状態にするには外部回転加圧装置(2)の回転加圧駆動モーター(3)と培地槽回転駆動モーター(11)と同一方向で同じ回転数にすると、外部回転加圧装置(2)と円形固定装置(12)とが同一回転になり、培地槽内の培地に加圧等の影響が発生しない。また加圧、培地交換等は、培地槽回転駆動モーター(11)と回転加圧駆動モーター(3)の回転数をかえる事で、無加圧から目的加圧数を可変可能である。重力を利用した荷重、加圧装置は、宇宙船内の微小重力環境では利用できず、本発明の旋回培養装置はポンプ荷重であるためNASAの有人飛行時の培養装置としての可能性も十分秘めた装置と思われる。
以下に実施例を揚げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
(実施例1)以下、実施例2〜5で用いたユニット、実施例について説明する。
図1は培養部を静止した状態で培養槽に加圧や培地交換を行う静止培養方法の実施例である。培地槽(1)を固定した状態で、円形固定装置(12)を培地槽(1)に固定する。円形固定装置(12)内側に培地タンク(4)装着し、円形固定装置(12)外側にチューブポンプ(13)装着する。培地交換時は、円形固定装置(12)外径に固定されたチューブポンプ(13)に外部回転加圧装置(2)を回転加圧駆動モーター(3)を回転させ、外部回転加圧装置(2)でチューブポンプ(13)に加圧し、培地タンク(4)内の培地を培地注入パイプ(6)から培地槽(1)内に培地を注入し、培地排出パイプ(5)で培地槽(1)から培地タンク(4)に排出し、培地を培地タンク(4)から培地槽(1)に培地を循環させる。
培地槽(1)に注入培地量の決定には、チューブポンプ(13)のパイプ径を変える事で内容量の変更が行えるが、同一径のチューブポンプ(13)でも回転加圧駆動モーター(3)の回転角度を調整することでも行える。このように培地交換量を0から可変可能にした旋回培養装置。
加圧培養装置の実施例としては、図2の液体、あるいは気体を密封した加圧用チューブポンプ(8)を円形固定装置(12)外側に固定装着し、加圧チューブ(7)を培地槽(1)内に固定装着する。外部回転加圧装置(2)を回転駆動モーター(3)で回転させ、外部回転加圧装置(2)で加圧用チューブポンプ(8)に圧力をかけ、培地槽(1)内に固定装着された加圧チューブ(7)に密封された液体あるいは気体を送り、培地槽(1)内の培地を介して培養細胞、培養組織に圧力をかける加圧培養装置。
細胞を播種したパイプ形状培養担体(10)の培養方法を図1と、図4を用いて実施例を述べる。培地槽(1)内に培地注入パイプ(6)と培地排出パイプ(5)の間に細胞を播種したパイプ形状培養担体(10)を装着し、チューブポンプ(13)に外部回転加圧装置(2)を回転加圧駆動モーター(3)で回転させ、培地タンク(4)内の血管用培地、あるいは呼吸気体等をパイプ形状培養担体(10)内を流す。
血管細胞を播種したパイプ形状培養担体(10)の培養方法は、培地タンク(4)内に血管培養用培地あるいは血液等を入れ、回転加圧駆動モーター(3)で外部回転加圧装置(2)を回転させ、チューブポンプ(13)に圧力をかけ、培地タンク(4)内の血管培養用培地あるいは血液をパイプ形状培養担体(10)内に流す。血管培養は流れを拍動流にする必要があり、この装置は拍動流を流す方法、培地流量も可変可能で、例えば、回転加圧駆動モーター(3)を45度回転させ停止、45度回転させ停止を繰り返す事で、流れを拍動流にさせることが可能である。
呼吸器系の気管支の場合は、気管上皮細胞等を播種したパイプ形状培養担体(10)内を培養タンク(4)内に気体(空気等)を入れ、回転加圧駆動モーター(3)で外部回転加圧装置(2)を回転させ、チューブポンプ(13)に圧力をかけ、培地タンク(4)内の気体(空気等)をパイプ形状培養担体(10)内に流し、生体の呼吸器官の環境に類似した環境を再現した培養装置。
図5の実施例については、上記実施例に培地槽を旋回させる旋回培養方法の実施例である。培養部の培地槽(1)を回転(旋回)させるために、培地槽回転駆動モーター(11)で培地槽(1)を連動旋回させる。旋回培養によりスフェロイドと呼ばれる細胞凝集体を作る実験装置に培地交換、加圧培養等を実施できる培養装置であり、旋回培養で加圧、培地交換を停止した培養方法を行う場合は、培地槽回転駆動モーター(11)で培地槽(1)を旋回させると培地タンク(4)と円形固定装置(12)も旋回し、円形固定装置(12)から外部回転加圧装置(2)に加重をかけてしまうので、培地槽回転駆動モーター(11)と回転加圧駆動モーター(3)とを、同じ方向に同じ回転数で回転させ、加圧を作動させないようにする。また加圧、培地交換の場合は、培地槽回転駆動モーター(11)と回転加圧駆動モーター(3)の回転数を変える事で加圧、培地交換等、培養方法や目的により可変可能な培養装置。
本発明は、患者本人の細胞を採取し、体外培養を行って患者の損傷部に移植する再生医療の分野で、この事業規模は世界中で50兆ともいわれ、世界中で培養方法、培養装置の研究開発が行われている。しかし培養方法の進歩に対して、医療用培養装置の開発は遅れぎみで、製品化のためにGMP(医療用具製造工程規則)の基準をクリアするためにも、装置は全て分解可能な装置として開発を行った。
また製造プラントの作製、製造ライン化を行うにあたり、感染症等の安全性のために一献体、一装置とするのが望ましい。そのためにも小型の培養装置が望まれている。
そうした要望のもとに開発した培養装置で、多種の細胞培養にも対応でき、実験用培養装置としての用途に応えられる。
静止培養装置の実施方法を示した説明図である。(実施例1) 培地槽を加圧する加圧用チューブポンプと加圧チューブの設置図、矢印は外部回転加圧装置の回転方向。 培地循環用チューブポンプと配管図、矢印は外部回転加圧装置の回転方向。 培地循環用チューブポンプと配管途中にパイプ形状培養担体を装着した設置図。矢印は外部回転加圧装置の回転方向。 旋回培養に加圧、培地交換装置の実施方法を示した説明図である。(実施例2)
符号の説明
1 培地槽
2 外部回転加圧装置
3 回転加圧駆動モーター
4 培地タンク
5 培地排出パイプ
6 培地注入パイプ
7 加圧チューブ
8 加圧用チューブポンプ
9 培地注入口
10 パイプ形状培養担体
11 培地槽回転駆動モーター
12 円形固定装置
13 チューブポンプ
14 伸縮シート

Claims (8)

  1. 炭酸ガスインキュベーター内の滅菌、温度、湿度、酸素、二酸化炭素、窒素等分圧を制御した環境内に、細胞、組織を培養する培養部の培地槽と連結固定された、培地タンクと培地タンクを固定する円形固定装置、円形固定装置外径にはチューブポンプを固定し、回転加圧駆動モーターに連結、連動する外部回転加圧装置を回転加圧駆動モーターで外部回転加圧装置を回転させる事でチューブポンプを加圧し、培地タンク内の培地を培養部の培養槽内に培地を送り、培地槽内の培地交換、培地循環を行う旋回培養装置。
  2. 加圧用チューブポンプと配管で連結された加圧チューブの内部に、液体あるいは気体を注入密封をし、加圧用ポンプチューブは円形固定装置外径に固定し、配管で連結された加圧チューブは培地槽内に挿入固定し、外部回転加圧装置を回転加圧駆動モーターで回転させ、加圧用チューブポンプに圧力をかけ加圧用チューブポンプ内の液体あるいは気体を加圧チューブに送り込み、培地槽内に圧力をかけ培地を介して、培養細胞、培養組織に力学的荷重をかける旋回培養装置。
  3. 請求項1に記載された培地循環経路の培地槽内の培地注入口と培地排出口に培養細胞を播種したパイプ形状培養担体を固定装着し、パイプ形状培養担体内部に培地タンク内の培地、あるいは血液(気体を含む)を循環させ、パイプ形状の血管、気管支等の組織培養に外部回転加圧装置を回転させ培養タンク内の液体(血液、気体を含む)を拍動流をパイプ形状培養担体内に流し、細胞を播種したパイプ形状培養担体の3次元培養をおこなう旋回培養装置。
  4. 培地槽回転駆動モーターを培養部の培地槽にも連結装着し、培地槽を回転させ、培地槽内部の細胞懸濁培地を回転させ細胞沈下方向を変え、培養細胞をフワフワ浮いた状態にし、必要に応じて外部回転加圧装置を回転加圧駆動モーターで駆動させる。双方の回転駆動モーターの回転数を変える事で、無荷重から複数回荷重まで自由に可変可能とした、請求項1、請求項2、請求項3に記載された旋回培養装置。
  5. 円形固定装置に連結固定された、培養タンク内の培地交換が可能で、培養タンクと加圧用チューブポンプやチューブポンプ、加圧チューブ等は円形固定装置から脱着可能な請求項1、請求項2、請求項3、請求項4記載の旋回培養装置。
  6. 請求項2に記載された培地槽内の加圧チューブと培養細胞、組織の懸濁培地の間に収縮フイルムで仕切、懸濁培地にフイルムを介して圧力をかけ、培養細胞、培養組織に損傷を与えないようにした請求項2、請求項4記載の旋回培養装置。
  7. 請求項2記載された培地槽の一部を伸縮シート(ガス透過膜を含む)で構成し、加圧チューブを加圧用チューブポンプからの圧力で膨らませると、伸縮シート(ガス透過膜を含む)が膨らみ、培地槽内の培地に歪みと力学刺激を発生させる請求項2、請求項4、請求項6に記載の旋回培養装置。
  8. 円形固定装置外径に培地注入用チューブポンプと加圧用チューブポンプを並列に固定し、培地交換、培地加圧が同時に行えるようにした、請求項1、請求項2、請求項3、請求項4、請求項5、請求項6、請求項7に記載の旋回培養装置と培養方法と製造された培養物。
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