JP2007068402A - Immune response regulatory protein - Google Patents
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Abstract
Description
この出願の発明は、免疫応答を調節する新規なヒト免疫応答調節遺伝子とヒト免疫応答調節蛋白質に関するものである。 The invention of this application relates to a novel human immune response regulatory gene and a human immune response regulatory protein that regulate the immune response.
免疫システムは、生体防御に必須の役割を担っている。免疫システムの活性化は、細胞間、細胞内あるいは細胞外に分泌される多彩な微量蛋白物質によって調節されている。免疫細胞は、これらの分子を介して恒常性を保ちながら生体防御に働いている。一方、免疫システムの破綻は、重篤な感染症を引き起こすばかりでなく、自己免疫疾患、アレルギー、免疫不全や癌などさまざまな疾患を引き起こす。したがって、免疫を調節する微量蛋白物質の解明は、免疫システムが関与した様々な病態を正確に把握し有効な治療方針を立てるうえで重要であり、それらを医薬として使用すればさまざまな免疫異常疾患の克服が可能になると考えられている。 The immune system plays an essential role in biological defense. The activation of the immune system is regulated by various trace protein substances secreted between cells, inside or outside the cells. Immune cells work to protect the body through these molecules while maintaining homeostasis. On the other hand, the failure of the immune system not only causes serious infections, but also causes various diseases such as autoimmune diseases, allergies, immune deficiencies, and cancer. Therefore, elucidation of trace protein substances that regulate immunity is important for accurately grasping various pathological conditions involved in the immune system and making effective treatment policies. It is thought that this can be overcome.
免疫応答の調節に関与する蛋白質としては、例えば、インターロイキン(IL)1〜29、リピドA、ホスホリパーゼA2、エンド毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンBおよび他の毒素、I型インターフェロン、II型インターフェロン、腫瘍壊死因子、トランスフォーミング増殖因子-β(「TGF−β」)、リンホ毒素、遊走阻止因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(CSF)、単球マクロファージCSF、顆粒球CSF、血管上皮増殖因子、アンギオテンシン、トランスフォーミング増殖因子、熱ショックタンパク質、血液型の糖鎖部分、Rh因子、線維芽細胞増殖因子、ケモカイン等が知られているが、これらの既知の微量蛋白質のみではさまざまな免疫異常疾患の病態が説明できないことからさらに多数の未知免疫応答調節物質が存在することが予想されている。 Examples of proteins involved in the regulation of immune response include interleukin (IL) 1-29, lipid A, phospholipase A2, endotoxin, staphylococcal enterotoxin B and other toxins, type I interferon, type II interferon, tumor necrosis Factor, transforming growth factor-β (“TGF-β”), lymphotoxin, migration inhibitory factor, granulocyte macrophage colony stimulating factor (CSF), monocyte macrophage CSF, granulocyte CSF, vascular epidermal growth factor, angiotensin, trans Forming growth factors, heat shock proteins, blood sugar groups, Rh factors, fibroblast growth factors, chemokines, etc. are known, but these known trace proteins alone explain the pathology of various immune abnormalities It is predicted that there will be more unknown immune response modulators. It is conceived.
また一方で、これらの免疫応答調節物質の有効な使用方法も大きく進展しており、例えば金属コロイド等と結合させた標識化送達系と、これを用いた免疫応答調節方法およびモノクローナル抗体の産生方法等が提案されている(特許文献1)。
免疫応答を促進あるいは制御する微量蛋白質はそれ自身が発癌およびアレルギー、自己免疫疾患、慢性感染症などの免疫異常に関連した様々な疾患を予防あるいは是正する医薬品となりうるのみならず、病態を正確に把握するための診断マーカーとしても有用であり、また抗体医薬品や低分子医薬品を開発するためのターゲット蛋白質としての可能性を秘めている。また、免疫賦活作用を持ったものはワクチン添加物としても有用である。従って、できるだけ多くの免疫関連蛋白質を得ることが望まれている。この出願の発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ヒトの新規な免疫応答調節蛋白質とその遺伝子、抗体ならびにそれらを利用した発明を提供することを課題としている。 A trace protein that promotes or regulates the immune response can not only be a drug that prevents or corrects various diseases related to immune abnormalities such as carcinogenesis and allergies, autoimmune diseases, chronic infections, etc. It is also useful as a diagnostic marker for grasping, and has the potential as a target protein for developing antibody drugs and small molecule drugs. Those having an immunostimulatory effect are also useful as vaccine additives. Therefore, it is desired to obtain as many immune-related proteins as possible. The invention of this application has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a novel human immune response-regulating protein, its gene, antibody, and an invention using them.
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の発明を提供する。 This application provides the following invention to solve the above-mentioned problems.
すなわち、第1の発明は、ヒトの単離遺伝子であって、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2における1若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基に置換した配列を有する免疫応答調節蛋白質をコードする免疫応答調節遺伝子である。 That is, the first invention is an isolated human gene, wherein the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or one or more amino acid residues in SEQ ID NO: 2 is deleted, added or substituted with another amino acid residue An immune response regulatory gene encoding an immune response regulatory protein having the sequence described above.
この第1発明の免疫応答調節遺伝子の一態様は、転写産物mRNAから合成されるcDNAが配列番号1の塩基配列を有する遺伝子である。 One embodiment of the immune response regulatory gene of the first invention is a gene in which the cDNA synthesized from the transcript mRNA has the base sequence of SEQ ID NO: 1.
第2の発明は、前記第1発明の免疫応答調節遺伝子のゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチドである。 The second invention is a polynucleotide purified from the genomic DNA, mRNA, cDNA or their complementary sequence of the immune response regulatory gene of the first invention.
第3の発明は、前記第1発明の免疫応答調節遺伝子または第2発明の精製ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。 The third invention is an oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with the immune response regulatory gene of the first invention or the purified polynucleotide of the second invention.
第4の発明は、前記第1発明の免疫応答調節遺伝子または第2発明の精製ポリヌクレオチドをPCR増幅するプライマーセットである。 The fourth invention is a primer set for PCR amplification of the immune response regulatory gene of the first invention or the purified polynucleotide of the second invention.
第5の発明は、前記第2発明の精製ポリヌクレオチドあるいは前記第3発明のオリゴヌクレオチドを保有する組換えベクターである。 The fifth invention is a recombinant vector carrying the purified polynucleotide of the second invention or the oligonucleotide of the third invention.
第6の発明は、前記第5発明の組換えベクターによる形質転換細胞である。 The sixth invention is a transformed cell by the recombinant vector of the fifth invention.
第7の発明は、ヒトの精製蛋白質であって、配列番号2のアミノ酸配列または配列番号2における1若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基に置換した配列を有する免疫応答調節蛋白質である。 The seventh invention is a purified human protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a sequence in which one or more amino acid residues in SEQ ID NO: 2 are deleted, added or substituted with other amino acid residues It is an immune response regulatory protein.
この第7発明の免疫応答調節蛋白質の一態様は、前記第1発明の免疫応答調節遺伝子または前記第2発明のポリヌクレオチドの発現産物である蛋白質である。 One aspect of the immune response regulating protein of the seventh invention is a protein that is an expression product of the immune response regulating gene of the first invention or the polynucleotide of the second invention.
第8の発明は、前記第7発明の免疫応答調節蛋白質の一部分からなる精製または合成されたペプチドである。 The eighth invention is a purified or synthesized peptide comprising a part of the immune response regulating protein of the seventh invention.
この第8発明のペプチドの一態様は、配列番号2における第1-164アミノ酸残基の連続8以上のアミノ酸配列からなるペプチドである。 One embodiment of the peptide of the eighth invention is a peptide consisting of 8 or more consecutive amino acid sequences of amino acid residues 1-164 in SEQ ID NO: 2.
第9の発明は、前記第7発明の免疫応答調節蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。また第10の発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞である。 A ninth invention is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody that specifically recognizes the immune response-regulating protein of the seventh invention. The tenth invention is a hybridoma cell that produces the monoclonal antibody.
第11の発明は、免疫応答調節を目的とした医薬組成物であって、
(a) 前記第2発明のポリヌクレオチド;
(b) 前記第5発明の組換えベクター;
(c) 前記第7発明の免疫応答調節蛋白質;
(d) 前記第8発明のペプチド;および
(e) 前記第9発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、
からなる群より選択される1以上を含むことを特徴とする医薬組成物である。この医薬組成物には例えば、抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫応答調節剤、抗感染症剤、抗癌剤、免疫賦活剤、ワクチン製剤が包含される。
The eleventh invention is a pharmaceutical composition for the purpose of regulating immune response,
(a) the polynucleotide of the second invention;
(b) the recombinant vector of the fifth invention;
(c) the immune response-regulating protein of the seventh invention;
(d) the peptide of the eighth invention; and
(e) the monoclonal or polyclonal antibody of the ninth invention,
A pharmaceutical composition comprising at least one selected from the group consisting of: This pharmaceutical composition includes, for example, anti-inflammatory agents, anti-allergic agents, immune response modifiers, anti-infective agents, anti-cancer agents, immunostimulants, and vaccine preparations.
第12の発明は、前記第1発明の免疫応答調節遺伝子の発現レベルを測定する方法であって、被験者から単離した生体試料における前記遺伝子の発現産物量を測定することを特徴とする遺伝子発現レベル測定方法である。この第12発明の方法においては、遺伝子発現産物がmRNAであること、または第7発明の免疫応答調節蛋白質であることを具体的な態様としている。 A twelfth aspect of the invention is a method for measuring the expression level of the immune response regulatory gene of the first aspect of the invention, wherein the expression level of the gene in a biological sample isolated from a subject is measured. This is a level measurement method. In the method of the twelfth invention, a specific embodiment is that the gene expression product is mRNA or the immune response regulating protein of the seventh invention.
第13の発明は、前記第7発明の免疫応答調蛋白質が過剰に機能発現している細胞または動物である。 A thirteenth invention is a cell or animal in which the immune response protein of the seventh invention is overexpressed.
第14の発明は、任意の蛋白質に対する抗体を動物体内で作成する方法であって、前記第13発明の動物に抗原物質を投与する工程と、この動物から抗体を単離する工程を含むことを特徴とする方法である。 A fourteenth invention is a method for producing an antibody against an arbitrary protein in an animal body, comprising the steps of administering an antigenic substance to the animal of the thirteenth invention and isolating the antibody from the animal. It is a characteristic method.
なお、この発明において、「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ-N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル(ATP、GTP、CTP、UTP;またはdATP、dGTP、dCTP、dTTP)が100個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは2-99個連結した分子を言う。「蛋白質」および「ペプチド」とは、アミド結合(ペプチド結合)または非天然の残基連結によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。 In the present invention, “polynucleotide” means a nucleoside phosphate ester (ATP, GTP, CTP, UTP; or dATP, dGTP, dCTP, dTTP) in which purine or pyrimidine is β-N-glycoside-linked to a sugar. A molecule in which 100 or more molecules are bound is referred to, and an “oligonucleotide” is a molecule in which 2-99 molecules are linked. “Protein” and “peptide” mean a molecule composed of a plurality of amino acid residues joined together by amide bonds (peptide bonds) or non-natural residue linkages.
またこの発明において、「1若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基への置換」とは、この発明の免疫応答調節蛋白質の機能が実質的に変化しない範囲において、全アミノ酸配列における30%以下、好ましくは20%以下、さらに好ましくは10%以下のアミノ酸残基が付加、欠失または置換していることを意味する。 In the present invention, “one or a plurality of amino acid residues are deleted, added or substituted with other amino acid residues” means that the function of the immune response regulatory protein of the present invention is not substantially changed. It means that 30% or less, preferably 20% or less, more preferably 10% or less of amino acid residues in the total amino acid sequence are added, deleted or substituted.
この出願の各発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の医薬組成物の調製はRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。さらに、この発明における用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。 Other terms and concepts in each invention of this application are defined in detail in the description of the embodiments and examples of the invention. Various techniques used for carrying out the present invention can be easily and surely implemented by those skilled in the art based on known documents and the like, except for a technique that clearly indicates the source. For example, the preparation of the pharmaceutical composition of the present invention is described in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed.A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, and genetic engineering and molecular biological techniques are described in Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1995, etc. Furthermore, the terms in the present invention are basically based on the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, or based on the meanings of terms conventionally used in the field.
この発明の免疫応答調節遺伝子は、免疫応答調節蛋白質(以下「UKC1」と記載することがある)をコードするヒト遺伝子であり、具体的には配列番号2のアミノ酸配列を有する免疫応答調節蛋白質をコードするヒト遺伝子である。そしてUKC1遺伝子はそのcDNAが配列番号1の塩基配列を有している。 The immune response regulatory gene of the present invention is a human gene encoding an immune response regulatory protein (hereinafter sometimes referred to as “UKC1”), specifically, an immune response regulatory protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It is a human gene that encodes. The UKC1 gene has the cDNA sequence of SEQ ID NO: 1.
UKC1遺伝子はこの発明によって提供されるオリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムライブラリーを用いてスクリーニングすることによって単離することができる。プローブは、例えばこの発明によって提供される精製ポリヌクレオチド(例えばcDNA)の一部配列(15bp以上)またはその相補配列を利用する事ができる。プローブによるスクリーニングは、ゲノムDNAとプローブとの特異的なハイブリダイゼーションを可能とするストリンジェントな条件下で行うことができる。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒(ホルムアルデヒド等)の濃度、温度条件等によって規定される。例えば、米国特許No.,6,100,037等に開示されている条件を採用することができる。またプローブの標識は、ラジオアイソトープ(RI)法または非RI法によって行うことができるが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素(例えば、Cy DyeTMシリーズのCy3、Cy5等)、ローダミン6G試薬、N-アセトキシ-N2-アセチルアミノフルオレン(AAF)、AAIF(AAFのヨウ素誘導体)などを使用することができる。 The UKC1 gene can be isolated by screening with a human genomic library using the oligonucleotide probe provided by this invention. As the probe, for example, a partial sequence (15 bp or more) of a purified polynucleotide (for example, cDNA) provided by the present invention or a complementary sequence thereof can be used. Screening with a probe can be performed under stringent conditions that allow specific hybridization between genomic DNA and the probe. Stringent conditions are defined by the salt concentration, organic solvent (formaldehyde, etc.) concentration, temperature conditions, etc. in the hybridization and washing steps. For example, the conditions disclosed in US Pat. No. 6,100,037 and the like can be employed. The labeling of the probe can be performed by a radioisotope (RI) method or a non-RI method, but it is preferable to use a non-RI method. Examples of the non-RI method include a fluorescence labeling method, a biotin labeling method, a chemiluminescence method, and the like, but it is preferable to use a fluorescence labeling method. As the fluorescent substance, those capable of binding to the base moiety of the oligonucleotide can be appropriately selected and used. However, cyanine dyes (eg, Cy Dye TM series Cy3, Cy5 etc.), rhodamine 6G reagent, N-acetoxy- N 2 -acetylaminofluorene (AAF), AAIF (iodine derivative of AAF) and the like can be used.
UKC1遺伝子はまた、適当なプライマーセットを用い、ヒトゲノムDNAあるいは本遺伝子を発現している細胞から調整したcDNAを鋳型としてPCR(Polymerase Chain Reaction)法によって増幅することもできる。プライマーセットはこの発明によって提供される精製ポリヌクレオチド(cDNA)から選択した一部配列(15bp以上)の2以上の組み合わせによって作成することができる。また、cDNAの5'側の1プライマーを用いた5' RACE法によって遺伝子の上流を、cDNAの3'側の1プライマーを用いた3' RACE法によって遺伝子の下流部分をPCR増幅することもできる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することもできる。プライマーのサイズ(塩基数)は、鋳型DNAとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、15-40塩基、望ましくは15-30塩基である。ただし、LA(long and accurate) PCRを行う場合には、少なくても30塩基が効率的である。センス鎖(5'末端側)とアンチセンス鎖(3'末端側)からなる1組あるいは一対(2本)のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けるようにする。さらに、鋳型DNAとの安定な結合を確保するためGC含量を約50%にし、プライマー内においてGC-richあるいはAT-richが偏在しないようにする。アニーリング温度はTm(melting temperature)に依存するので、特異性の高いPCR産物をえるため、Tm値が55-65℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、PCRにおけるプライマー使用の最終濃度が約0.1から約1μMになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウエア、例えばOligoTM [National Bioscience Inc.(米国)製]、GENETYX(ソフトウエア開発(株)(日本)製)等を用いることもできる。 The UKC1 gene can also be amplified by PCR (Polymerase Chain Reaction) using a suitable primer set and human genomic DNA or cDNA prepared from cells expressing this gene as a template. The primer set can be prepared by combining two or more partial sequences (15 bp or more) selected from the purified polynucleotide (cDNA) provided by the present invention. It is also possible to amplify the upstream of the gene by 5 ′ RACE method using one primer on the 5 ′ side of cDNA and the downstream part of the gene by 3 ′ RACE method using one primer on the 3 ′ side of cDNA. . In addition, the following can also be pointed out as points to keep in mind when designing primers. The size (number of bases) of the primer is 15-40 bases, preferably 15-30 bases in consideration of satisfying specific annealing with the template DNA. However, when LA (long and accurate) PCR is performed, at least 30 bases are efficient. The complementary sequence between both primers should be avoided so that one or a pair (two) of the primer consisting of the sense strand (5 ′ end side) and the antisense strand (3 ′ end side) does not anneal to each other. Further, in order to ensure stable binding to the template DNA, the GC content is set to about 50% so that GC-rich or AT-rich is not unevenly distributed in the primer. Since the annealing temperature depends on Tm (melting temperature), in order to obtain a highly specific PCR product, primers having Tm values of 55 to 65 ° C. that are close to each other are selected. In addition, it is necessary to pay attention to adjusting the final concentration of primers used in PCR to be about 0.1 to about 1 μM. Also, commercially available software for primer design such as Oligo ™ [manufactured by National Bioscience Inc. (USA)], GENETYX (manufactured by Software Development Co., Ltd. (Japan)) and the like can be used.
このようにして得られた全長ゲノム遺伝子は、例えば、PCR法、NASBN (Nucleic acid sequence based amplification )法、TMA(Transcription−mediated amplification)法およびSDA(Strand Displacement Amplification)法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することもできる。 The full-length genomic gene thus obtained is, for example, a gene amplification that is usually performed, such as PCR, NASBN (Nucleic acid sequence based amplification), TMA (Transcription-mediated amplification), and SDA (Strand Displacement Amplification). It can also be amplified by the method.
そして、このUKC1ゲノム遺伝子はこの遺伝子が転写するmRNA、mRNAから合成したcDNAから精製ポリヌクレオチド(DNA断片やRNA断片)を調整することができる。例えば、cDNAはヒト細胞から抽出したポリ(A)+RNAを鋳型として合成することもできる。ヒト細胞としては、UKC1を発現していれば生体より摘出したものでも培養細胞でも良い。cDNAは、公知の方法(Mol.Cell.Biol.2, 167-170,1982; J.Gene 25,263-269,1983; Gene, 150, 243-250, 1994)を用いて合成することができる。あるいは、この発明によって提供される情報をもとにデザインしたプライマーセットを用いて、ヒト細胞から単離したmRNAを鋳型とするRT-PCR法を用いて、目的cDNAを合成することもできる。または、DNAオリゴ合成機によって部分配列を合成し、それを酵素的手法およびサブクローニングの手法を使ってつなぎ合わせる事によっても目的cDNAを合成することもできる。このようにして調整されるcDNAは、具体的には配列番号1の塩基配列を有している。これらのポリヌクレオチドは、UKC1蛋白質の遺伝子工学的な製造に使用することができる。また、これらのポリヌクレオチドは、生体にUKC1蛋白質を過剰発現させるための遺伝子材料(導入遺伝子)としても使用することができる。なお、UKC1蛋白質を遺伝子工学的に作成するため、あるいは導入遺伝子として使用する場合には、配列番号1の全長でなくてもよく、例えば少なくともそれぞれの蛋白質コード領域(CDS)を構成するポリヌクレオチド配列でよい。また目的の抗原に対する動物の抗原認識を向上させるために遺伝子導入する場合には、例えば、配列番号1の塩基配列のうちの連続60以上の塩基を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを使用することもできる。このようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、例えばcDNAを適当な制限酵素で切断して作成することもでき、あるいは文献(例えばCarruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams(1983)J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov(1997)Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel(1995)Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers(1994)Biochemistry 33:7886-7896; Narang(1979)Meth. Enzymol. 68:90; Brown(1979)Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage(1981)Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号)に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することができる。 The UKC1 genomic gene can be used to prepare a purified polynucleotide (DNA fragment or RNA fragment) from mRNA transcribed by this gene or cDNA synthesized from mRNA. For example, cDNA can be synthesized using poly (A) + RNA extracted from human cells as a template. The human cell may be either one isolated from a living body or a cultured cell as long as UKC1 is expressed. cDNA can be synthesized using a known method (Mol. Cell. Biol. 2, 167-170, 1982; J. Gene 25, 263-269, 1983; Gene, 150, 243-250, 1994). Alternatively, the target cDNA can also be synthesized by RT-PCR method using mRNA isolated from human cells as a template, using a primer set designed based on the information provided by the present invention. Alternatively, the target cDNA can also be synthesized by synthesizing partial sequences with a DNA oligo synthesizer and connecting them using an enzymatic method and a subcloning method. Specifically, the cDNA thus prepared has the base sequence of SEQ ID NO: 1. These polynucleotides can be used for genetic engineering production of UKC1 protein. These polynucleotides can also be used as genetic material (transgene) for overexpressing the UKC1 protein in the living body. When the UKC1 protein is to be genetically engineered or used as a transgene, it may not be the full length of SEQ ID NO: 1, for example, a polynucleotide sequence constituting at least each protein coding region (CDS) It's okay. In addition, when a gene is introduced in order to improve animal antigen recognition for a target antigen, for example, an oligonucleotide or a polynucleotide containing 60 or more consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 1 can be used. . Such oligonucleotides or polynucleotides can be prepared, for example, by cleaving cDNA with an appropriate restriction enzyme, or in the literature (for example, Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418; Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105: 661; Belousov (1997) Nucleic Acid Res. 25: 3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19: 373-380; Blommers (1994) ) Biochemistry 33: 7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22: 1859; US Pat. No. 4,458,066) Can be synthesized in vitro by well-known chemical synthesis techniques such as those described in.
この発明の組換えベクターはクローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートとしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宣のものを使用する。例えば、cDNAまたはそのORF領域をインサートとしてUKC1蛋白質を生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することもできる。またUKC1遺伝子のゲノムDNAをインサートとする場合には、BAC(Bacterial Artificial Chromosome)ベクターやコスミドベクター等を使用することもできる。 The recombinant vector of the present invention is a cloning vector or an expression vector, and an appropriate one is used according to the type of polynucleotide as an insert, the purpose of use, and the like. For example, when producing UKC1 protein using cDNA or its ORF region as an insert, expression vectors for in vitro transcription, prokaryotic cells such as E. coli and Bacillus subtilis, yeast, insect cells, and eukaryotic cells such as mammalian cells are used. Expression vectors suitable for each can also be used. Moreover, when using genomic DNA of UKC1 gene as an insert, a BAC (Bacterial Artificial Chromosome) vector, a cosmid vector, or the like can also be used.
この発明の形質転換細胞は、例えば、UKC1蛋白質を大量製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポゾーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調整することができる。 For example, when the UKC1 protein is produced in large quantities, the transformed cells of the present invention can use prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis and eukaryotic cells such as yeast, insect cells and mammalian cells. . These transformed cells can be prepared by introducing a recombinant vector into cells by a known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method.
この発明のUKC1蛋白質は、ヒトの臓器、細胞株から特異的な抗体等を用いて単離する方法、配列番号2のアミノ酸配列に基づいて化学合成によってペプチドを調整する方法、あるいはこの発明によって提供される精製ポリヌクレオチド(cDNAまたはその翻訳領域)を用いて組換えDNA技術で生産する方法などにより取得できるが、組換えDNA技術で取得する方法が好ましく用いられる。例えば前記のポリヌクレオチドを有するベクターからインビトロ転写によってRNAを調整し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロで蛋白質を発現できる。またポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞で、ポリヌクレオチドがコードしている蛋白質を大量に発現させる事ができる。 The UKC1 protein of the present invention is provided by a method of isolating a human organ or cell line using a specific antibody or the like, a method of preparing a peptide by chemical synthesis based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or the present invention The purified polynucleotide (cDNA or its translation region) can be used for production by a recombinant DNA technique, but a method for obtaining by a recombinant DNA technique is preferably used. For example, a protein can be expressed in vitro by preparing RNA from a vector having the above-mentioned polynucleotide by in vitro transcription and performing in vitro translation using this as a template. If the polynucleotide is recombined into an appropriate expression vector by a known method, the protein encoded by the polynucleotide in prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and eukaryotic cells such as yeast, insect cells and mammalian cells. Can be expressed in large quantities.
UKC1蛋白質をインビトロでDNAを発現させて生産させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、RNAポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作成し、このベクターを、プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、UKC1蛋白質をインビトロで生産することができる。RNAポリメラーゼプロモーターとしては、T3,T7,SP6などが例示できる。これらのRNAポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、pKA1,pCDM8,pT3/T718、pT7/319、pBluescriptIIなどが例示できる。 When UKC1 protein is produced by expressing DNA in vitro, a recombinant vector is prepared by inserting the above-described polynucleotide into a vector having an RNA polymerase promoter, and this vector is converted into an RNA polymerase corresponding to the promoter. UKC1 protein can be produced in vitro by adding it to an in vitro translation system such as a rabbit reticulocyte lysate or wheat germ extract. Examples of the RNA polymerase promoter include T3, T7, SP6 and the like. Examples of vectors containing these RNA polymerase promoters include pKA1, pCDM8, pT3 / T718, pT7 / 319, and pBluescriptII.
UKC1蛋白質を大腸菌などの微生物でDNAを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクローニング部位、ターミネーター配列等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、このポリヌクレオチドがコードしている蛋白質を微生物内で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させれば、任意の領域を含む蛋白質断片を得ることもできる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによってもこのポリヌクレオチドがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、pBluescriptII、pET発現システム、pGEX発現システムなどが例示できる。 When the UKC1 protein is produced by expressing DNA in a microorganism such as Escherichia coli, the polynucleotide is added to an expression vector having an origin, promoter, ribosome binding site, DNA cloning site, terminator sequence, etc. that can replicate in the microorganism. If a recombinant expression vector is prepared and a host cell is transformed with this expression vector and then the obtained transformant is cultured, the protein encoded by the polynucleotide can be mass-produced in a microorganism. it can. At this time, if a start codon and a stop codon are added before and after an arbitrary translation region and expressed, a protein fragment containing the arbitrary region can be obtained. Alternatively, it can be expressed as a fusion protein with another protein. It is also possible to obtain only the protein portion encoded by this polynucleotide by cleaving this fusion protein with an appropriate protease. Examples of the expression vector for E. coli include pUC system, pBluescriptII, pET expression system, pGEX expression system and the like.
UKC1蛋白質を、真核細胞でDNAを発現させて生産させる場合には、前記ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプラインシング領域、ポリ(A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば、UKC1蛋白質を真核細胞内で生産することができる。発現ベクターとしては、pKA1, pCDM8, pSVK3, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBVベクター、pRS, pYE82 などが例示できる。また、pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1などを発現ベクターとして用いれば、Hisタグ、FLAGタグ、GFPなど各種タグを付加した融合蛋白質として発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞COS-7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、UKC1蛋白質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポゾーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。 When the UKC1 protein is produced by expressing DNA in eukaryotic cells, the polynucleotide is inserted into an expression vector for eukaryotic cells having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site, etc. UKC1 protein can be produced in eukaryotic cells by creating a replacement vector and introducing it into eukaryotic cells. Examples of expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pYE82 and the like. Moreover, if pIND / V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, etc. are used as an expression vector, it can be expressed as a fusion protein to which various tags such as His tag, FLAG tag, and GFP are added. . As eukaryotic cells, mammalian cultured cells such as monkey kidney cell COS-7, Chinese hamster ovary cell CHO, budding yeast, fission yeast, silkworm cell, Xenopus egg cell, etc. are generally used, but can express UKC1 protein. Any eukaryotic cell can be used. In order to introduce the expression vector into eukaryotic cells, a known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method can be used.
UKC1蛋白質を原核細胞や真核細胞で発現させた後、培養物から目的蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS−PAGE,等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー(タグ配列を利用した方法およびUKC1に特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を用いる方法も含む)、などが挙げられる。 In order to isolate and purify the target protein from the culture after expressing the UKC1 protein in prokaryotic cells or eukaryotic cells, known separation operations can be combined. For example, treatment with denaturing agents and surfactants such as urea, ultrasonic treatment, enzyme digestion, salting out and solvent precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing, Ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography (including methods using tag sequences and methods using polyclonal antibodies and monoclonal antibodies specific to UKC1), and the like.
なお、以上の方法によって得られる組換えUKC1蛋白質には、他の任意の蛋白質との融合蛋白質も含まれる。例えば、グルタチオン‐S-トランスフェラーゼ(GST)や緑色蛍光蛋白質(GFP)との融合蛋白質などが例示できる。さらに、前記発明の蛋白質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。従って、修飾された蛋白質も前記発明の蛋白質の範囲に含まれる。このような翻訳後の修飾としては、N末端メチオニンの脱離、N末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミストレイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。 The recombinant UKC1 protein obtained by the above method includes a fusion protein with any other protein. Examples thereof include a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) and green fluorescent protein (GFP). Furthermore, the protein of the invention may be subjected to various modifications in the cell after being translated. Therefore, modified proteins are also included in the scope of the protein of the invention. Examples of such post-translational modifications include elimination of N-terminal methionine, N-terminal acetylation, glycosylation, limited degradation by intracellular protease, mistrailization, isoprenylation, phosphorylation and the like.
この発明のペプチドは、UKC1蛋白質の一部分からなるペプチド断片である。すなわち、配列番号2における連続8アミノ酸配列、9〜30アミノ酸配列、31〜60アミノ酸配列、61〜110アミノ酸配列、111〜160アミノ酸配列のペプチドである。さらに具体的には、配列番号2における第1-164アミノ酸残基の連続8以上のアミノ酸配列からなるペプチドである。すなわち、後記実施例で示したように、UKC1蛋白質は免疫細胞活性化作用を有している。従って、UKC1の部分ペプチドは、例えば抗原を融合させることによって、動物に抗原認識を向上させる原料と用いることができると共に、過剰投与等により動物に免疫寛容を生じさせるために使用することもできる。 The peptide of the present invention is a peptide fragment consisting of a part of UKC1 protein. That is, it is a peptide having a continuous 8-amino acid sequence, 9-30 amino acid sequence, 31-60 amino acid sequence, 61-110 amino acid sequence, 111-160 amino acid sequence in SEQ ID NO: 2. More specifically, it is a peptide consisting of 8 or more consecutive amino acid sequences of the 1-164 amino acid residues in SEQ ID NO: 2. That is, as shown in Examples below, UKC1 protein has an immune cell activating effect. Therefore, the UKC1 partial peptide can be used as a raw material for improving antigen recognition in animals by, for example, fusing antigens, and can also be used for causing immune tolerance in animals by overdose or the like.
これらのペプチドは、前記のUKC1蛋白質を任意の蛋白分解酵素で切断することによって調整することができる。また、配列番号2のアミノ酸配列に基づき、公知のペプチド合成法(Merrifield, R.B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W.C. and White, P.D., Oxford University Press, 2000)によって作成することもできる。また、これらのペプチドは天然のアミド結合以外の残基連結からなるものであってもよい。天然のアミド結合以外の残基連結は、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、2官能マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、またはN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)等の化学結合またはカップリング手段を例示することができる。また、ペプチド結合の代替となり得る連結基は、例えばケトメチレン(例えば、-C(=O)-CH2-に対する-C(=O)-NH-)、アミノメチレン(CH2-NH)、エチレン、オレフィン(CH=CH)、エーテル(CH2-O)、チオエーテル(CH2-S)、テトラゾール(CN4-)、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルを含む(例えば、Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications," Marcell Dekker, NYを参照)。 These peptides can be prepared by cleaving the UKC1 protein with an arbitrary proteolytic enzyme. Further, based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a known peptide synthesis method (Merrifield, RBJ Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, WC and White, PD, Oxford University Press, 2000). Moreover, these peptides may consist of residue linkages other than natural amide bonds. Residue linkages other than natural amide bonds may be chemistry such as glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide ester, bifunctional maleimide, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), or N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC). A coupling or coupling means can be illustrated. Linking groups that can substitute for peptide bonds include, for example, ketomethylene (eg, —C (═O) —NH— for —C (═O) —CH 2 —), aminomethylene (CH 2 —NH), ethylene, olefin (CH = CH), ether (CH2-O), thioether (CH 2 -S), tetrazole (CN 4 -), thiazole, retro amide, including thioamide, or ester (e.g., Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications," Marcell Dekker, NY).
この発明の抗体は動物由来のUKC1に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。具体的には、精製UKC1蛋白質やその部分ペプチドを抗原として調整される抗体である。この発明の抗体には、UKC1蛋白質のエピトープに結合することができる全体分子、およびFab, F(ab')2, Fv断片等が全て含まれる。 The antibody of this invention is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody specific for animal-derived UKC1. Specifically, it is an antibody prepared using a purified UKC1 protein or a partial peptide thereof as an antigen. The antibody of the present invention includes all molecules capable of binding to the epitope of UKC1 protein, Fab, F (ab ′) 2 , Fv fragments, and the like.
例えばポリクローナル抗体の場合には、前記のUKC1蛋白質またはペプチドを抗原として動物を免役した後、血清から得ることができる。動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ニワトリなどが用いられる。また、ヒトへの治療を目的としてヒト型抗体を得たい場合はヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する組換え動物も用いられる。免疫抗原ペプチドによる動物の免疫は公知の方法(例えば、村松繁、他編、実験生物学講座 14 、免疫生物学、丸善株式会社、昭和60年、日本生化学会編、続生化学実験講座5、免疫生化学研究法、東京化学同人、1986年、日本生化学会編、新生化学実験講座12、分子免疫学III、抗原・抗体・補体、東京化学同人、1992年などに記載された方法)に準じて行うことができる。例えば、一般的方法としては、抗原ペプチドを哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより免疫を行うことができる。また、抗原ペプチドをアジバントと共に投与してもよい。アジュバントとしては、例えばフロイント完全(または不完全)アジュバント、リビ(Ribi)アジュバント、百日咳ワクチン、BCG、リピッドA、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。
For example, a polyclonal antibody can be obtained from serum after immunizing an animal using the UKC1 protein or peptide as an antigen. As the animal, mouse, rat, hamster, rabbit, goat, sheep, cow, horse, pig, dog, cat, monkey, chicken and the like are used. In addition, when it is desired to obtain human-type antibodies for the purpose of human therapy, recombinant animals carrying human immunoglobulin genes are also used. Immunization of animals with immunizing antigen peptides is a known method (for example, Shigeru Muramatsu, et al., Laboratory Biology Course 14, Immunobiology, Maruzen Co., Ltd., 1985, Japan Biochemical Society, Secondary
ポリクローナル抗体を含む抗血清は、免疫された動物を所定の期間飼育した後、その動物から採血した血液から調製することができる。 The antiserum containing the polyclonal antibody can be prepared from blood collected from an immunized animal after breeding for a predetermined period.
また、モノクローナル抗体は公知のモノクローナル抗体作製法(「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年; "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996; Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987 など)に従い作製することができる。 Monoclonal antibodies are known monoclonal antibody production methods ("monoclonal antibodies", Nagamune Kamei, Terada Hiroko, Yodogawa Shoten, 1990; "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996; Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, etc.).
またこの発明の抗体には、各種の標識(酵素、放射性同位体、蛍光色素、ビオチン等の低分子、毒素等)を結合したものも含まれる。 The antibodies of the present invention include those bound with various labels (enzymes, radioisotopes, fluorescent dyes, low molecules such as biotin, toxins, etc.).
これらの抗体は、例えば、血液、尿、組織片等の臨床検体や培養細胞中のUKC1蛋白質を検出し病態を把握する診断的目的に用いられる。その場合は目的に合わせてウエスタンブロッティング、免疫沈降法、免疫組織化学的方法、フローサイトメトリー、RIA、ELISA法などが使用できる。また、これらの抗体は、後述の実施例に示すように、天然型UKC1あるいはリコンビナントUKC1を含む資料からUKC1を精製する際に有用である。また特異的抗体は実験動物等に投与することにより内在性UKC1を中和し免疫応答を調節する目的にも使用することができる。また、動物由来モノクローナル抗体をヒト化したもの、あるいはヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する動物より作成したヒト型モノクローナル抗体はヒトへ投与して疾患の診断や治療、予防の目的で使用される。 These antibodies are used for diagnostic purposes, for example, to detect the UKC1 protein in clinical specimens such as blood, urine, tissue fragments, etc. and in cultured cells to ascertain the pathological condition. In that case, Western blotting, immunoprecipitation method, immunohistochemical method, flow cytometry, RIA, ELISA method and the like can be used according to the purpose. Moreover, these antibodies are useful for purifying UKC1 from materials containing natural UKC1 or recombinant UKC1, as shown in the Examples below. The specific antibody can also be used for the purpose of neutralizing endogenous UKC1 and regulating immune response by administering it to experimental animals or the like. In addition, humanized monoclonal antibodies produced from animals or human monoclonal antibodies prepared from animals carrying human immunoglobulin genes are administered to humans and used for the purpose of diagnosis, treatment and prevention of diseases.
第11発明は、前記のポリヌクレオチド、組換えベクター、免疫応答調節蛋白質、ペプチドおよび抗体からなる群より選択される1以上の成分を含むことを特徴とする、免疫応答調節を目的とした医薬組成物である。前記の各成分は、公知の方法・手段によって、生体あるいは細胞内に導入可能な形態として製剤化される。薬剤形態としては、ポリペプチド発現ベクターを、例えば生体認識分子を提示した中空ナノ粒子、または公知のウイルスベクター(レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等)に組み込むようにすればよい。このような薬剤を遺伝子治療の手法により生体内に導入することによって、生体細胞内で免疫応答調節蛋白質を発現させることができる。また、免疫応答調節蛋白質またはペプチドを生体内に導入可能な形態とするためには、例えば、この蛋白質やペプチドの構造や機能を変更することなく、かつ薬理学的に許容される担体溶液に蛋白質またはペプチドを混合して製剤化することができる。生体の組織あるいは細胞を一旦体外に取り出し、インビトロでこれらのUKC1蛋白質あるいはペプチドで処理し所望の形質を誘導した後に生体に戻す方法もある。また、生体より取り出した組織あるいは細胞にUKC1遺伝子発現ベクターを導入した後に生体に戻すことも治療のひとつの形態として可能である。そのような場合は、例えばマイクロインジェクション法により細胞内に導入することができる。あるいは脂質による細胞内導入法(BioPORTER(Gene Therapy Systems社、米国)、Chariot(Active Motif社、米国)等)を採用することもできる。このようにして製剤化された医薬組成物は例えば、抗炎症剤、抗アレルギー剤、免疫応答調節剤、抗感染症剤、抗癌剤、免疫賦活剤、ワクチン製剤等である。 The eleventh invention comprises one or more components selected from the group consisting of the aforementioned polynucleotides, recombinant vectors, immune response regulating proteins, peptides and antibodies, and a pharmaceutical composition for the purpose of immune response regulation It is a thing. Each of the above components is formulated as a form that can be introduced into a living body or cells by known methods and means. As a drug form, the polypeptide expression vector may be incorporated into, for example, a hollow nanoparticle displaying a biorecognition molecule or a known virus vector (retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, etc.). By introducing such a drug into a living body by a gene therapy technique, an immune response regulatory protein can be expressed in a living cell. In order to make the immune response regulatory protein or peptide into a form that can be introduced into the living body, for example, the protein or peptide in a pharmacologically acceptable carrier solution without changing the structure or function of the protein or peptide. Alternatively, it can be formulated by mixing peptides. There is also a method in which a living tissue or cell is once taken out of the body, treated with these UKC1 proteins or peptides in vitro to induce a desired character, and then returned to the living body. In addition, it is possible as one form of treatment to introduce a UKC1 gene expression vector into tissues or cells taken out from a living body and then return it to the living body. In such a case, it can be introduced into cells by, for example, a microinjection method. Alternatively, intracellular introduction methods using lipids (BioPORTER (Gene Therapy Systems, USA), Chariot (Active Motif, USA), etc.) can also be employed. The pharmaceutical composition thus formulated is, for example, an anti-inflammatory agent, an antiallergic agent, an immune response modifier, an anti-infective agent, an anticancer agent, an immunostimulant, a vaccine formulation or the like.
第12の発明は、前記第1発明の免疫応答調節遺伝子の発現レベルを測定する方法であって、被験者から単離した生体試料における前記遺伝子の発現産物量を測定することを特徴とする遺伝子発現レベル測定方法である。 A twelfth aspect of the invention is a method for measuring the expression level of the immune response regulatory gene of the first aspect of the invention, wherein the expression level of the gene in a biological sample isolated from a subject is measured. This is a level measurement method.
発現産物としてmRNAを対象とする場合には、例えば、定量的なプローブハイブリダイゼーションやマイクロアレイを用いて行うことができる。標識DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法としては、具体的には、例えばAllele-specific Oligonucleotide Probe法、Oligonucleotide Ligation Assay法、Invader法等の公知の方法を採用することができる。また、マイクロアレイでの測定は、例えば以下のとおりに行うことができる。すなわち、被験者の生体試料(例えば血液等)から単離したmRNAを鋳型として、cDNAを合成し、PCR増幅する。その際に、標識dNTPを取り込ませて標識cDNAとする。この標識cDNAをマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキャプチャープローブ(オリゴヌクレオチド)にハイブリダイズしたcDNAを定量的に検出する。ハイブリダイゼーションは、96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注して標識cDNA水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、1〜100nl程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜70℃の温度範囲で、6〜20時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識cDNAを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。 When mRNA is used as an expression product, for example, quantitative probe hybridization or microarray can be used. Specifically, as a hybridization method using a labeled DNA probe, for example, a known method such as the Allele-specific Oligonucleotide Probe method, Oligonucleotide Ligation Assay method, Invader method or the like can be employed. Moreover, the measurement in a microarray can be performed as follows, for example. That is, cDNA is synthesized and amplified by PCR using mRNA isolated from a biological sample (eg, blood) of a subject as a template. At that time, labeled dNTP is incorporated into labeled cDNA. The labeled cDNA is brought into contact with the macroarray, and the cDNA hybridized with the capture probe (oligonucleotide) of the microarray is quantitatively detected. Hybridization can be performed by dispensing a 96- or 384-well plastic plate and spotting a labeled cDNA aqueous solution on the microarray. The amount of spotting can be about 1 to 100 nl. Hybridization is preferably performed in the temperature range of room temperature to 70 ° C. for 6 to 20 hours. After completion of hybridization, washing is performed using a mixed solution of a surfactant and a buffer to remove unreacted labeled cDNA. As the surfactant, sodium dodecyl sulfate (SDS) is preferably used. As the buffer solution, a citrate buffer solution, a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, a Tris buffer solution, a Good buffer solution, or the like can be used, and a citrate buffer solution is preferably used.
あるいはまた、被験者から単離したmRNAを鋳型とし、前記第4発明のプライマーセットを用いた定量的RT-PCRによってもmRNA量を測定することができる。 Alternatively, the amount of mRNA can also be measured by quantitative RT-PCR using mRNA isolated from a subject as a template and the primer set of the fourth invention.
さらに、発現産物としてこの発明の免疫応答調節蛋白質を対象とする場合には、第9発明の抗体を用いる方法が好ましい。特に標識化抗体を用いることによって、簡便かつ高精度の検出が可能となる。標識は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のEIAに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−6−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、125Iや3H等の通常のRIAで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート(FITC)やテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。また、フローサイトメーターを用いて測定することもできる。さらに、1次抗体と標識化2次抗体を用いたサンドイッチ法(標識として酵素を用いた場合には「ELISA法」)も好ましく用いることができる。 Furthermore, when targeting the immune response regulatory protein of this invention as an expression product, the method using the antibody of the ninth invention is preferred. In particular, by using a labeled antibody, simple and highly accurate detection becomes possible. The label can be an enzyme, a radioisotope or a fluorescent dye. The enzyme is not particularly limited as long as it satisfies the conditions such as a large turnover number, stability even when bound to an antibody, and specific coloring of a substrate, and is used for normal EIA. Enzymes such as peroxidase, β-galactosidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, acetylcholinesterase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, malate dehydrogenase and the like can also be used. Moreover, an enzyme inhibitor, a coenzyme, etc. can also be used. These enzymes and antibodies can be bound by a known method using a crosslinking agent such as a maleimide compound. As the substrate, a known substance can be used according to the type of enzyme used. For example, when peroxidase is used as an enzyme, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine can be used, and when alkaline phosphatase is used as an enzyme, paranitrophenol or the like can be used. As the radioisotope, those used in usual RIA such as 125 I and 3 H can be used. As the fluorescent dye, those used in usual fluorescent antibody methods such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) can be used. When using an enzyme, add a substrate that decomposes due to enzymatic action and develops color, optically measures the amount of degradation of the substrate, obtains the enzyme activity, converts this to the amount of bound antibody, and compares it with the standard value. From this, the antibody amount is calculated. When using a radioactive isotope, the radiation dose emitted by the radioactive isotope is measured with a scintillation counter or the like. In addition, when a fluorescent dye is used, the amount of fluorescence may be measured by a measuring device combined with a fluorescence microscope. Moreover, it can also measure using a flow cytometer. Furthermore, a sandwich method using a primary antibody and a labeled secondary antibody (“ELISA method” when an enzyme is used as a label) can be preferably used.
次に、UKC1蛋白質が過剰に機能発現している第13発明の細胞または動物について説明する。この動物または細胞は、例えば、動物にUKC1蛋白質溶液を注射する方法;特許文献1に記載されているような金属コロイドとUKC1蛋白質を結合させて動物に投与する方法;レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療の方法に準じて動物に活性型UKC1遺伝子(すなわち、高発現プロモーター等を連結した精製ポリヌクレオチド)を導入する方法;リン酸カルシウム法、リポソームや赤血球ゴーストを使用する方法、エレクトロポーレーション法、ガラスピペットを用いた微量注入法等によって細胞にUKC1遺伝子を導入する方法等によって作成することができる。
Next, the cell or animal of the thirteenth invention in which the UKC1 protein is excessively expressed will be described. This animal or cell is prepared by, for example, a method of injecting a UKC1 protein solution into an animal; a method of administering a metal colloid and UKC1 protein as described in
さらに、これらの動物や細胞は、公知のトランスジェニック動物作成法(例えば、Proc. Natl. Acad. Scl. USA 77;7380-7384, 1980)に従って作成することができる。すなわち、活性型UKC1遺伝子を非ヒト動物(好ましくはマウスまたはラット)の分化全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中にUKC1遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって目的とするトランスジェニック動物を作成することができる。分化全能性細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニック動物個体の産出高率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、外来遺伝子DNAの物理的注入(マイクロインジェクション)法が最適である。遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部(尾部先端等)からDNAを抽出し、サザンブロット解析やPCRアッセイにより導入した外来遺伝子の存在を確認することによって、2倍体染色体の一方に外来遺伝子が導入された初代のヘテロ接合体動物が得られ、このヘテロ接合体同士を交配することによってホモ接合体動物が獲られる。この発明のトランスジェニック動物には、初代ヘテロ接合体動物、ヘテロ接合体同士を交配して得られるホモ接合体動物、それらの子孫動物、またはそれらの胎児が含まれる。 Furthermore, these animals and cells can be produced according to a known transgenic animal production method (for example, Proc. Natl. Acad. Scl. USA 77; 7380-7384, 1980). That is, an active UKC1 gene is introduced into a totipotent cell of a non-human animal (preferably mouse or rat), this cell is generated into an individual, and an individual in which the UKC1 gene is integrated into the somatic cell genome is selected. By doing so, a target transgenic animal can be prepared. As a method for gene transfer into totipotent cells, the physical injection (microinjection) of foreign gene DNA is optimal when considering the high yield of transgenic animals and the efficiency of transgene transfer to the next generation. . The fertilized egg into which the gene has been injected is then transplanted into the oviduct of the foster parent, and after raising and born animals to foster parents, DNA is extracted from a part of the body (such as the tip of the tail) and then Southern By confirming the presence of the foreign gene introduced by blot analysis or PCR assay, a primary heterozygous animal having the foreign gene introduced into one of the diploid chromosomes is obtained, and the heterozygotes are mated. Homozygous animals are obtained. The transgenic animals of the present invention include primary heterozygous animals, homozygous animals obtained by mating heterozygotes, their progeny animals, or their fetuses.
第14の発明は、任意の蛋白質に対する抗体を動物体内で作成する方法であって、前記第13発明の動物に抗原を投与する工程と、この動物から抗体を単離する工程を含むことを特徴とする方法である。具体的には、第13発明の動物作成と同一の手段(例えば、動物にUKC1蛋白質を投与する方法や、遺伝子治療の方法に準じて動物にUKC1遺伝子を導入する方法等)で動物体内でのUKC1蛋白質の活性を上昇させると共に、任意の抗原物質を動物に投与する。UKC1蛋白質の投与や高発現によって動物の免疫応答が活性化されるため、効率よく抗体を作成することが可能となる。またこの第14発明における別の態様は、活性型UKC1遺伝子を体細胞に有するトランスジェニック動物を用いて抗体を作成する方法である。この動物は導入UKC1遺伝子の高発現によってUKC1蛋白質を過剰に発現し、高い免疫応答能を有するため、効率良く抗体を産生する。なお、抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、前記第9発明の抗体と同一の手続で作成することができる。 A fourteenth invention is a method for producing an antibody against an arbitrary protein in an animal body, comprising the steps of administering an antigen to the animal of the thirteenth invention and isolating the antibody from the animal. It is a method. Specifically, the same means as the animal preparation of the thirteenth invention (for example, a method of administering UKC1 protein to an animal, a method of introducing a UKC1 gene into an animal according to a gene therapy method, etc.) In addition to increasing the activity of the UKC1 protein, any antigenic substance is administered to the animal. Since the immune response of animals is activated by the administration and high expression of UKC1 protein, it is possible to efficiently produce antibodies. Another embodiment of the fourteenth invention is a method for producing an antibody using a transgenic animal having an activated UKC1 gene in somatic cells. Since this animal overexpresses the UKC1 protein due to high expression of the introduced UKC1 gene and has a high immune response ability, it efficiently produces antibodies. The antibody is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be prepared by the same procedure as the antibody of the ninth invention.
次に実施例を示しこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、DNAの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、文献("Molecular Cloning, Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記載のない場合には、Invitrogen社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。 EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. The basic procedures and enzyme reactions related to DNA recombination were in accordance with the literature ("Molecular Cloning, Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Unless otherwise specified, restriction enzymes and various modifying enzymes were used from Invitrogen. The buffer composition of each enzyme reaction and the reaction conditions were in accordance with the attached instructions.
ヒトTh1およびTh2細胞は既報[Nagata et al.. J Immunol: 1999; 162(3):1278-8630] に従い健常人末梢血リンパ球より作成した。UKC1遺伝子発現検出用のプローブは、22 merのセンスプライマー(CAGCCCAGCCATCCGGGCATAT:配列番号3)および22 merのアンチセンスプライマー(CCGAGGGCTCCCCCAGGGAG:配列番号4)を用い、ヒトTh2細胞のpoly(A)+RNAを鋳型としてRT-PCR法により増幅して得た。得られたPCR産物(590 bp)をランダムプライミング法を用いた市販の32P標識用キット(宝酒造製)を用いて標識し、これを放射性プローブとして、ノーザンブロティング法にて種々のヒト組織や細胞株におけるUKC1 mRNAの発現を調べた。種々のヒト組織由来mRNAを含む市販のマルチティシューブロットメンブレン(Clonetech社製)を用いて調べたところいずれの組織においても明瞭なmRNAの発現は確認されなかった。次にTh1およびTh2細胞におけるUKC1 mRNAの発現を調べた。Th1およびTh2細胞をPMA (20 ng/ml)とionomycin (1 μg/ml)の存在下および非存在下に37℃で6時間培養後、細胞からtotal RNAを抽出し、ノーザンブロッティング法でUKC1 mRNAの発現を解析したところ、刺激したTh2細胞に約1.1 kbのUKC1 mRNAが顕著に発現しており、非刺激Th1、Th2細胞および刺激したTh1細胞には殆ど発現していなかった(図1)。このようにUKC1遺伝子の発現はヒト組織中で極めて限定されており、1例としては刺激を受けたTh2細胞で選択的に発現されることが分かった。 Human Th1 and Th2 cells were prepared from peripheral blood lymphocytes of healthy individuals according to a previous report [Nagata et al .. J Immunol: 1999; 162 (3): 1278-8630]. The probe for detecting UKC1 gene expression uses a 22-mer sense primer (CAGCCCAGCCATCCGGGCATAT: SEQ ID NO: 3) and a 22-mer antisense primer (CCGAGGGCTCCCCCAGGGAG: SEQ ID NO: 4), using human Th2 cell poly (A) + RNA as a template As a result of amplification by RT-PCR. The obtained PCR product (590 bp) is labeled with a commercially available 32P labeling kit (Takara Shuzo) using a random priming method, and this is used as a radioactive probe to detect various human tissues and cells by Northern blotting. The expression of UKC1 mRNA in the strain was examined. When a commercially available multi-tissue blot membrane (manufactured by Clonetech) containing various human tissue-derived mRNAs was examined, no clear mRNA expression was confirmed in any tissue. Next, the expression of UKC1 mRNA in Th1 and Th2 cells was examined. Th1 and Th2 cells were cultured for 6 hours at 37 ° C in the presence and absence of PMA (20 ng / ml) and ionomycin (1 μg / ml), then total RNA was extracted from the cells, and UKC1 mRNA was extracted by Northern blotting. As a result, about 1.1 kb of UKC1 mRNA was remarkably expressed in the stimulated Th2 cells, and hardly expressed in the unstimulated Th1, Th2 cells and the stimulated Th1 cells (FIG. 1). Thus, the expression of UKC1 gene was extremely limited in human tissues, and as an example, it was found that it was selectively expressed in stimulated Th2 cells.
所望のcDNAの全長をクローニングするために、UKC1 mRNAの発現が高い細胞からλファージcDNAライブラリーを調製した。すなわち、PMA (20 ng/ml)とionomycin (1 μg/ml)の存在下37℃で6時間培養後のヒトTh2細胞よりtotal RNAを抽出し、オリゴ(dT)ビーズ(Promega社製)を用いて、poly(A)+RNAを精製した。次に、市販のcDNAクローニングキット(Invitrogen社製)を用いて、2本鎖cDNAを合成し、その両端にEcoRI(NotI)アダプターを付加した後に、ZAP Express(Stratagene社製)のEcoRIサイトにクローニングした。これに引続き、市販のキット(Stratagene社製)を用いて、インビトロで上記λファージにおけるパッケージングを完了した。このパッケージング産物を大腸菌XL1-Bleu MRF'(Stratagene社製)に感染させ、約1.7×105個の組換えλファージを得た。次に、上記実施例1で作成した590 bpのPCR産物をランダムプライミング法を用いた市販の32P標識用キット(宝酒造製)を用いて標識し、これを放射性プローブとして、プラークハイブリダイゼーション法によりλファージライブラリーのスクリーニングを行い複数のcDNAクローンを得た。最も長いcDNAクローンはpoly (A)部分を除いて全長913bpからなり、492bpのオープンリーディングフレーム(ORF)、37 bpの5'非翻訳領域および384 bpの3'非翻訳領域からなる構造を有していた(配列番号1)。ORFは164アミノ酸残基からなる蛋白質をコードおり、分泌蛋白質の特徴的なシグナル配列が存在していた(配列番号2)。 To clone the full length of the desired cDNA, a λ phage cDNA library was prepared from cells with high UKC1 mRNA expression. Specifically, total RNA was extracted from human Th2 cells after 6 hours of culture at 37 ° C. in the presence of PMA (20 ng / ml) and ionomycin (1 μg / ml), and oligo (dT) beads (Promega) were used. Then, poly (A) + RNA was purified. Next, using a commercially available cDNA cloning kit (Invitrogen), double-stranded cDNA was synthesized, EcoRI (NotI) adapters were added to both ends, and then cloned into the EcoRI site of ZAP Express (Stratagene). did. Following this, packaging in the λ phage was completed in vitro using a commercially available kit (Stratagene). This packaging product was infected with Escherichia coli XL1-Bleu MRF ′ (Stratagene) to obtain about 1.7 × 10 5 recombinant λ phages. Next, the 590 bp PCR product prepared in Example 1 above was labeled using a commercially available 32P labeling kit (manufactured by Takara Shuzo) using the random priming method, and this was used as a radioactive probe to obtain λ by plaque hybridization. A phage library was screened to obtain a plurality of cDNA clones. The longest cDNA clone consists of 913 bp in length, excluding the poly (A) part, and has a structure consisting of a 492 bp open reading frame (ORF), a 37 bp 5 'untranslated region and a 384 bp 3' untranslated region. (SEQ ID NO: 1). ORF encoded a protein consisting of 164 amino acid residues, and a characteristic signal sequence of the secreted protein was present (SEQ ID NO: 2).
上記実施例2でクローニングしたUKC1 cDNAクローンの全長(アダプター配列を含む)をpcDNA3.1(-) (Invitrogen社製)のBamHI/HindIIIサイトにサブクローニングし哺乳類細胞用の発現ベクターを作成した(以下pcD-UKC1と呼ぶ)。また一方で、上記実施例2でクローニングしたUKC1 cDNAクローンの翻訳領域をpQE30ベクター(キアゲン)にサブクローニングし、HisタグのC末にUKC1蛋白質の全長が融合した融合蛋白質を発現する大腸菌用の発現ベクターを作成した(以下pQE-H-ss-UKC1と呼ぶ)。さらには、上記実施例2でクローニングしたUKC1 cDNAクローンの翻訳領域のうちシグナルペプチド配列を除いた分泌蛋白質部分に相当する領域だけを含み、サブクローニング用の制限酵素サイトを付加したフラグメントをPCRにより増幅した.PCRプライマーはNdeIサイトを付加した30 merのセンスプライマー(AAACATATGTCCCACACGTTGCCCGTCCGT:
配列番号5)とXhoIサイトを付加した30 merのアンチセンスプライマー(TTTCTCGAGAGTGGTGGCCTGTTGGGCTCC:配列番号6)を用いた。
The full length (including adapter sequence) of the UKC1 cDNA clone cloned in Example 2 above was subcloned into the BamHI / HindIII site of pcDNA3.1 (-) (manufactured by Invitrogen) to prepare an expression vector for mammalian cells (hereinafter pcD). -Call it UKC1). On the other hand, an expression vector for Escherichia coli expressing the fusion protein in which the translation region of the UKC1 cDNA clone cloned in Example 2 above is subcloned into the pQE30 vector (Qiagen) and the full length of the UKC1 protein is fused to the C terminus of the His tag. (Hereinafter referred to as pQE-H-ss-UKC1). Furthermore, a fragment containing only the region corresponding to the secreted protein portion excluding the signal peptide sequence in the translation region of the UKC1 cDNA clone cloned in Example 2 above, and added with a restriction enzyme site for subcloning was amplified by PCR. . The PCR primer is a 30-mer sense primer with an NdeI site (AAACATATGTCCCACACGTTGCCCGTCCGT:
SEQ ID NO: 5) and a 30-mer antisense primer (TTTCTCGAGAGTGGTGGCCTGTTGGGCTCC: SEQ ID NO: 6) to which an XhoI site was added were used.
PCR産物をKODポリメラーゼ(東洋紡社製)により平滑化し、pZero-2.0のEcoRV部位に挿入し、宿主大腸菌DH-5αFT(Invitorgen社製)に形質転換を行った。得られたクローンの塩基配列を決定し、PCR反応中に増幅エラーが生ぜず、目的の構造を有するクローンを選択した。このプラスミドからNdeIからXhoIのフラグメントをpET30-A(Novagen社製)のNdeIからXhoIの間に挿入し宿主大腸菌DH-5αFT(Invitorgen社製)に形質転換を行った。塩基配列を確認し、cDNAのORFのHisタグが融合した蛋白質として発現されるクローンを選択した。このクローンをLB培地で37℃で16時間培養し、発現プラスミドDNA(pET-UKC-H)を精製した。 The PCR product was smoothed with KOD polymerase (Toyobo Co., Ltd.), inserted into the EcoRV site of pZero-2.0, and transformed into host E. coli DH-5αFT (Invitorgen). The base sequence of the obtained clone was determined, and a clone having an objective structure without an amplification error during the PCR reaction was selected. From this plasmid, an NdeI to XhoI fragment was inserted between NdeI and XhoI of pET30-A (Novagen) and transformed into host E. coli DH-5αFT (Invitorgen). The base sequence was confirmed, and a clone expressed as a protein fused with the His tag of the ORF of the cDNA was selected. This clone was cultured in LB medium at 37 ° C. for 16 hours to purify the expression plasmid DNA (pET-UKC-H).
プラスミドPQE-H-ss-UKCとpET-UKC-Hはそれぞれ宿主大腸菌JM-109(東洋紡社製)とBL21-Codon Plus (Stratagene社製)に形質転換を行った。次にIPTGにより蛋白質の誘導を行い、宿主にUKC1蛋白質の発現を誘導した。大腸菌を遠心により回収後、8M尿素を含むPBS緩衝液に懸濁し、凍結融解処理を行った後、超音波で破砕した。破砕液を遠心操作により上清を分離し、ニッケルNTA-レジン(Qiagen社製)により精製した。尿素を含む精製液をゲル濾過により分離し、UKC1蛋白質を含む画分を集めた後、PBSに対して透析し、遠心操作により不溶物を除去した。得られたリコンビナント蛋白質はそれぞれHis-ss-UKC1およびUKC1-Hisと称し以下の実験に用いた(図2)。 Plasmids PQE-H-ss-UKC and pET-UKC-H were transformed into host E. coli JM-109 (Toyobo) and BL21-Codon Plus (Stratagene), respectively. Next, protein was induced by IPTG to induce expression of UKC1 protein in the host. E. coli was recovered by centrifugation, suspended in a PBS buffer containing 8M urea, freeze-thawed, and then disrupted by ultrasonic waves. The supernatant was separated from the crushed liquid by centrifugation and purified with nickel NTA-resin (Qiagen). The purified solution containing urea was separated by gel filtration, and fractions containing UKC1 protein were collected, dialyzed against PBS, and insoluble matters were removed by centrifugation. The obtained recombinant proteins were referred to as His-ss-UKC1 and UKC1-His, respectively, and used in the following experiments (FIG. 2).
また、バキュロウイルスで分泌型のUKC1蛋白質を作らせることもできる。まずバキュロウイルス発現プラスミドpAC-GP67-B(Invitrogen社製)を鋳型として、センスプライマー(AATCCATgggAATgCTACTAgTAAATCAgT:配列番号7)とUKC1の配列を含むアンチセンスプライマー(CAACGTGTGGGACGCCGCAAAGGCAGAATG:配列番号8)を用いてPCRを行い、バキュロウイルスのシグナル配列を増幅した。プラスミドDNA(pcD-UKC1)を鋳型として、バキュロウイルスの一部シグナル配列を含み配列番号8の相補鎖であり、かつUKC1のシグナル配列の切断点の下流の配列を含むプライマー(TTTGCGGCGTCCCACACGTTGCCCGTCCGT:配列番号9)とアンチセンスプライマー(TTTGAATTCTTAAGTGGTGGCCTGTTGGG:配列番号10)を用いてPCRを行い、UKC1の部分cDNAを増幅した。このcDNAと前述のバキュロウイルスのシグナル配列のDNAの混合物を鋳型として、センスプライマー(配列番号7)とアンチセンスプライマー(配列番号10)を用いてPCRを行い、バキュロウイルスのシグナル配列とUKC1のシグナル配列の切断点の下流の配列が融合したDNA(配列番号11)を増幅し、KODポリメラーゼ(東洋紡社製)により平滑化し、pZero-2.0のEcoRV部位に挿入し、宿主大腸菌DH-5αFT(Invitorgen社製)に形質転換を行った。目的の構造を持つクローンを選択し、プラスミドを精製した。このプラスミドをSpeIとEcoRIで切断し、得られたフラグメントをバキュロウイルス発現プラスミドpAC-GP67-BのSpeIとEcoRIの間に挿入し、宿主大腸菌DH-5αFT(Invitorgen社製)に形質転換を行った。目的の構造を持つクローンを選択し、プラスミドを精製した。得られたプラスミドをPharmingen社のプロトコルに従い、UKC1蛋白質を発現する組換えバキュロウイルスを作成し、UKC蛋白質を無蛋白質培地の中に放出させると共に、昆虫細胞を回収した。上清と細胞からSDSにより蛋白質を溶解させ、ウエスタンブロットをおこない、UKC蛋白質が発現し、放出されていることを確認すると共に、糖鎖修飾がされていることを電気泳動的に確認した。 It is also possible to produce a secreted UKC1 protein with baculovirus. First, using baculovirus expression plasmid pAC-GP67-B (manufactured by Invitrogen) as a template, PCR was performed using a sense primer (AATCCATgggAATgCTACTAgTAAATCAgT: SEQ ID NO: 7) and an antisense primer (CAACGTGTGGGACGCCGCAAAGGCAGAATG: SEQ ID NO: 8) containing the UKC1 sequence. The baculovirus signal sequence was amplified. Using a plasmid DNA (pcD-UKC1) as a template, a primer (TTTGCGGCGTCCCACACGTTGCCCGTCCGT: SEQ ID NO: 9) which contains a partial signal sequence of baculovirus and a complementary strand of SEQ ID NO: 8 and downstream of the cleavage point of the UKC1 signal sequence ) And an antisense primer (TTTGAATTCTTAAGTGGTGGCCTGTTGGG: SEQ ID NO: 10) was used to amplify a partial cDNA of UKC1. Using this cDNA and the above DNA mixture of baculovirus signal sequence as a template, PCR was performed using the sense primer (SEQ ID NO: 7) and antisense primer (SEQ ID NO: 10), and the baculovirus signal sequence and UKC1 signal DNA (SEQ ID NO: 11) fused with the sequence downstream of the sequence breakpoint is amplified, smoothed with KOD polymerase (Toyobo), inserted into the EcoRV site of pZero-2.0, and host E. coli DH-5αFT (Invitorgen) Made). A clone having the desired structure was selected and the plasmid was purified. This plasmid was digested with SpeI and EcoRI, and the resulting fragment was inserted between SpeI and EcoRI of baculovirus expression plasmid pAC-GP67-B, and transformed into host E. coli DH-5αFT (Invitorgen). . A clone having the desired structure was selected and the plasmid was purified. A recombinant baculovirus expressing the UKC1 protein was prepared from the obtained plasmid according to the Pharmingen protocol, and the UKC protein was released into a protein-free medium and insect cells were collected. Proteins were dissolved from the supernatant and cells by SDS, and Western blotting was performed to confirm that UKC protein was expressed and released, and that the sugar chain was modified electrophoretically.
実施例3で得られた大腸菌由来のリコンビナントUKC1蛋白質His-ss-UKC1をフロイント完全アジュバントとともにBALB/cマウスの腹腔に免疫した。二回目以降は同一蛋白質をフロイント不完全アジュバントとともにほぼ2週間のインターバルをおいて数回追加免疫を行った。最終免疫から2週間後に採血し、ポリクローナル抗体を精製すると共に、脾臓細胞からモノクローナル抗体の作成を行った。モノクローナル抗体はCOS-7細胞に発現させたUKC1蛋白質に対する反応性をもとにスクリーニングした。すなわち、pcD-UKC1およびコントロールのpcDNA3.1(-)プラスミドを遺伝子導入して24時間培養後のCOS-7細胞をトリプシン・EDTA処理でいったん回収し、スライドグラス上にてさらに6時間培養後、ホルマリン固定、NP-40処理を施したものをそれぞれ抗原陽性および抗原陰性スライドとし、FITC標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体(Biosource International社製)を用いた蛍光抗体間接法にてUKC1特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した。1回の細胞融合で24種のUKC1特異的モノクローナル抗体を得た。このうちウエスタンブロッティングに使えなおかつ互いにエピトープが異なる2種のモノクローナル抗体(CX-2およびCX-10、いずれもマウスIgG1抗体)を選択した。 The recombinant UKC1 protein His-ss-UKC1 derived from Escherichia coli obtained in Example 3 was immunized to the peritoneal cavity of BALB / c mice together with Freund's complete adjuvant. From the second time on, the same protein was boosted several times with an incomplete Freund's adjuvant at intervals of about 2 weeks. Two weeks after the final immunization, blood was collected and the polyclonal antibody was purified, and a monoclonal antibody was prepared from the spleen cells. Monoclonal antibodies were screened based on reactivity to UKC1 protein expressed in COS-7 cells. That is, COS-7 cells after 24 hours of transfection with pcD-UKC1 and control pcDNA3.1 (-) plasmid were collected by trypsin / EDTA treatment, and further cultured on a slide glass for 6 hours. Formalin fixation and NP-40 treatment were used as antigen positive and antigen negative slides, respectively, and a UKC1-specific monoclonal antibody by FITC-labeled goat anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by Biosource International) with an indirect fluorescent antibody method Were selected. Twenty-four UKC1-specific monoclonal antibodies were obtained by one cell fusion. Of these, two monoclonal antibodies (CX-2 and CX-10, both of which are mouse IgG1 antibodies) that can be used for Western blotting and have different epitopes were selected.
UKC1蛋白質は実施例4で述べたように特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に検出できる他、分子の性状の解析や定性の目的ではウエスタンブロッティングなどでも検出できる。例えば図3にはウエスタンブロッティングの結果を示す。ここでは、まずpcD-UKC1およびコントロールプラスミドpcDNA3.1(-)を導入したCOS-7の培養上清および、PMA (20 ng/ml)とionomycin (1 μg/ml)の存在下、非存在下で6時間培養したヒトTh2細胞の培養上清を抗UKC1モノクローナル抗体CX-2で免疫沈降した。次にそれぞれの免疫沈降物を2等分し、一方はそのまま、もう一方はEndoF処理をして全ての糖鎖をはずした後にSDS-PAGEに供し、ビオチン標識CX-2抗体をプローブとしてウェスタンブロット解析を行った結果を示している。図3に示す結果より、アミノ酸配列から予想されたようにUKC1が分泌蛋白質であり、糖鎖が付加されており、糖鎖をはずした場合の分子量は約16Kダルトンであることが確認された。またpcD-UKC1に由来するUKC1蛋白質がTh2細胞に由来する天然型のUKC1と同様の分子構造を有することが確認された。さらに、図1に示すような遺伝子発現解析の結果から予想されたようにUKC1は刺激に応答して産生分泌されることが蛋白質のレベルで確認された。 The UKC1 protein can be detected immunohistochemically using a specific antibody as described in Example 4, and can also be detected by Western blotting for molecular property analysis or qualitative purposes. For example, FIG. 3 shows the results of Western blotting. Here, the culture supernatant of COS-7 introduced with pcD-UKC1 and control plasmid pcDNA3.1 (-), and in the presence or absence of PMA (20 ng / ml) and ionomycin (1 μg / ml) The culture supernatant of human Th2 cells cultured for 6 hours was immunoprecipitated with anti-UKC1 monoclonal antibody CX-2. Next, each immunoprecipitate is divided into two equal parts, one is left as it is, the other is treated with EndoF to remove all sugar chains, and then subjected to SDS-PAGE. Western blotting using biotin-labeled CX-2 antibody as a probe The result of the analysis is shown. From the results shown in FIG. 3, it was confirmed that UKC1 is a secreted protein, a sugar chain was added, and the molecular weight when the sugar chain was removed was about 16 K Dalton, as predicted from the amino acid sequence. It was also confirmed that the UKC1 protein derived from pcD-UKC1 has a molecular structure similar to that of natural UKC1 derived from Th2 cells. Furthermore, as predicted from the results of gene expression analysis as shown in FIG. 1, it was confirmed at the protein level that UKC1 was produced and secreted in response to stimulation.
UKC1蛋白質は既存の免疫学的定量法例えばELISA法などを用いて簡便に定量することができる。UKC1を定量するに当たってはできるだけ天然型に近いUKC1標準品を調整する必要がある。この目的で、pcD-UKC1を遺伝子導入したCOS-7細胞の培養上清を、CX-2抗体を結合したAffi-Gel 10(バイオラド社製)のカラムにアプライし、PBSおよび2MのNaClを含むPBSでよく洗浄した後にpH2.5のグリシン塩酸バッファーで溶出したところ高純度のUKC1標準品を得ることができた(図4)。この標準品中の主要蛋白質がUKC1であることはEndoFで糖鎖をはずすと約16Kダルトンの単一分子量のバンドになること(図4)およびウエスタンブロッティングでモノクローナル抗体に特異的に反応することで確認された。次にCX-10抗体を固相化抗体、ビオチン化したCX-2抗体を検出抗体とするサンドウィッチELISAを構築した。上記UKC1標準品を用いた標準曲線を図5に示す。また実際にヒトTh1細胞およびTh2細胞の刺激、非刺激培養上清を測定した結果を図6に示す。 UKC1 protein can be easily quantified using existing immunological methods such as ELISA. When quantifying UKC1, it is necessary to adjust UKC1 standard products that are as close to natural as possible. For this purpose, the culture supernatant of COS-7 cells into which pcD-UKC1 has been introduced is applied to a column of Affi-Gel 10 (Biorad) coupled with CX-2 antibody, and contains PBS and 2M NaCl. After thoroughly washing with PBS and eluting with pH 2.5 glycine hydrochloride buffer, a highly pure UKC1 standard product was obtained (FIG. 4). The main protein in this standard is UKC1, because when EndoF removes the sugar chain, it becomes a single molecular weight band of about 16K Dalton (Fig. 4) and reacts specifically with monoclonal antibodies by Western blotting. confirmed. Next, a sandwich ELISA was constructed using CX-10 antibody as a solid phase antibody and biotinylated CX-2 antibody as a detection antibody. A standard curve using the above UKC1 standard is shown in FIG. FIG. 6 shows the results of actual measurement of stimulated and non-stimulated culture supernatants of human Th1 cells and Th2 cells.
健常成人末梢血より単核細胞(以下PBMCと略す)を分離し、His-ss-UKC1および対照の大腸菌由来のHisタグ付きリコンビナント蛋白質[ここでは造血器型プロスタグランディンD2合成酵素(hPGDS)を用いた]の存在下に23時間培養し、培養上清中のサイトカインをHuman Cytokine LINCOplex kit(Linco Research社製)で測定した。UKC1を添加するとIL-6、IL-10、IL-13、IFN-γの産生が誘導されることからUKC1は免疫細胞とりわけ単球系の細胞を強力に活性化することが確認された(表1の上段)。次に、低濃度のPHA刺激下に同様の実験を行った。その結果UKC1はTh1関連のサイトカインであるIL-12やIFN-γの産生を有意に促進し、一方でTh2関連サイトカインであるIL-4、IL-5、IL-13の産生を抑制した(表1の下段)。この結果はUKC1はアレルギー性の免疫応答に抑制的に作用することを示している。このことを確認するために、PBMCのスギ花粉アレルゲン、PPD(典型的なTh1関連抗原、結核菌成分)および低濃度のPHAに対する増殖応答を3H-thymidine (1mCi)の取り込みで測定する系に、COS-7由来のUKC1(1mg/ml)を添加して影響を調べた。その結果UKC1はPPDやPHAに対する増殖応答には影響せず、スギ花粉アレルゲンに対する増殖応答だけを選択的に抑制した(図7)。 Mononuclear cells (hereinafter abbreviated as PBMC) are isolated from healthy adult peripheral blood, and His-ss-UKC1 and a control His-tagged recombinant protein derived from Escherichia coli (here, hematopoietic prostaglandin D2 synthase (hPGDS)) Used] was measured for 23 hours, and the cytokine in the culture supernatant was measured with a Human Cytokine LINCOplex kit (manufactured by Linco Research). When UKC1 was added, production of IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-γ was induced, confirming that UKC1 strongly activates immune cells, particularly monocyte cells (Table). 1 top). Next, the same experiment was performed under a low concentration of PHA stimulation. As a result, UKC1 significantly promoted the production of IL-12 and IFN-γ, which are Th1-related cytokines, while suppressing the production of IL-4, IL-5, and IL-13, which are Th2-related cytokines (Table). 1 bottom). This result indicates that UKC1 acts suppressively on allergic immune responses. To confirm this, a system that measures the proliferative response to PBMC cedar pollen allergen, PPD (typical Th1-related antigen, Mycobacterium tuberculosis) and low concentrations of PHA by measuring 3 H-thymidine (1 mCi) uptake. The effect was examined by adding UKC1 (1 mg / ml) derived from COS-7. As a result, UKC1 did not affect the proliferation response to PPD or PHA, but selectively suppressed the proliferation response to cedar pollen allergen (FIG. 7).
リポポリサッカライド(LPS)非応答性マウスC3H/HeJの脾臓細胞から、B220に対するmagnetic beads 付着抗体(BD社製)を用いてB細胞を分離した。96ウェルプレートに6x105個のB細胞をUKC1蛋白の存在、非存在下で40時間培養した。培養24〜40時間に3H-thymidine (1mCi)をパルスし、その取り込みを液体シンチレーションカウンター(BD社製)で測定した。それぞれのUKC蛋白は、大腸菌で発現させ、モノクローナル抗体(CX-2)アフィニティーカラムを用いて精製した。この結果は図8に示したとおり、His-ss-UKC1蛋白およびUKC-His蛋白は、C3H/HeJマウスB細胞に対し増殖活性を示した。なお、コントロールのHis-hPGDS蛋白では増殖活性は認められなかった。このように、UKC1はB細胞に作用して増殖活性を示す蛋白であることが確認された。 B cells were isolated from spleen cells of lipopolysaccharide (LPS) non-responsive mouse C3H / HeJ using a magnetic bead-attached antibody against B220 (BD). 6 × 10 5 B cells were cultured in a 96-well plate for 40 hours in the presence or absence of UKC1 protein. 3 H-thymidine (1 mCi) was pulsed for 24 to 40 hours in culture, and the uptake was measured with a liquid scintillation counter (BD). Each UKC protein was expressed in E. coli and purified using a monoclonal antibody (CX-2) affinity column. As a result, as shown in FIG. 8, His-ss-UKC1 protein and UKC-His protein showed proliferation activity against C3H / HeJ mouse B cells. The control His-hPGDS protein showed no growth activity. Thus, it was confirmed that UKC1 is a protein that acts on B cells and exhibits proliferative activity.
スギ花粉アレルゲンCry j 1 に特異的に増殖するマウスTh2細胞株2x104個、マイトマイシン処理した抗原提示細胞6x105個、および抗原としてCry j 1 (2.5 mg/ml) にUKC1蛋白の存在、非存在下で64時間培養した。培養48〜64時間に3H-thymidine (1mCi)をパルスし、その取り込みを液体シンチレーションカウンター(BD社製)で測定した。それぞれのUKC蛋白は、大腸菌で発現させ、モノクローナル抗体(CX?2)アフィニティーカラムを用いて精製した。この結果はこの図9に示したとおり、UKC1はスギ花粉アレルゲンCry j 1 特異的Th2細胞のCry j 1 に対する増殖反応を抑制することができる蛋白であることが確認された。このようにUKC1蛋白は、Th2細胞の抗原特異的増殖反応を抑制する活性をもつ蛋白である。
Presence or absence of UKC1 protein in 2 × 10 4 mouse Th2 cell lines that specifically propagate to the cedar pollen
以上に詳しく説明したとおり、この発明によってヒトを含む動物に免疫を活性化させる免疫応答調節蛋白質とその遺伝子および特異的抗体が提供される。また、この発明のポリヌクレオチドを利用することによって、前記蛋白質を大量に製造することができる。この遺伝子、蛋白質あるいは抗体は癌、アレルギー、自己免疫疾患、種々の炎症性疾患を含む免疫関連疾患の予防、治療に効果を発揮することが期待される。ワクチンの効果増強物質としても有用である。また遺伝子あるいは抗体は上記免疫関連疾患の病態の把握や治療効果の評価に有用である。また、本発明の免疫応答調節蛋白質とその特異的なレセプターの相互作用に対するアンタゴニスト、アゴニストのスクリーニング系を提供する。そのようなアンタゴニスト、アゴニストも上記免疫関連疾患の予防、治療薬として有望である。一方、蛋白質および融合蛋白質を、実験動物を免疫する際に用いる事により、効率良く免疫を行うことができ、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体において、簡便に多種な抗体を得ることができる。実験動物において免疫を効率良く行える事は、自己免疫疾患等の免疫異常のモデルマウス作成が効率良く行える。 As explained in detail above, the present invention provides an immune response regulatory protein that activates immunity in animals including humans, its gene, and a specific antibody. In addition, the protein can be produced in large quantities by using the polynucleotide of the present invention. This gene, protein or antibody is expected to be effective in the prevention and treatment of immune-related diseases including cancer, allergies, autoimmune diseases, and various inflammatory diseases. It is also useful as a vaccine effect-enhancing substance. In addition, the gene or antibody is useful for understanding the pathology of the immune-related disease and evaluating the therapeutic effect. Also provided are screening systems for antagonists and agonists for the interaction between the immune response-regulating protein of the present invention and its specific receptor. Such antagonists and agonists are also promising as preventive and therapeutic agents for the above immune-related diseases. On the other hand, by using proteins and fusion proteins when immunizing experimental animals, immunization can be efficiently carried out, and various antibodies can be easily obtained as polyclonal and monoclonal antibodies. Efficient immunization in experimental animals can efficiently create model mice for immune abnormalities such as autoimmune diseases.
UKC1蛋白によるB細胞増殖刺激活性は、培養24〜40時間に3H-thymidineをパルスして
B細胞の増殖反応をDNA合成能として評価した。
The proliferative response of B cells was evaluated as the ability to synthesize DNA.
Claims (19)
(a) 請求項3のポリヌクレオチド;
(b) 請求項6の組換えベクター;
(c) 請求項8または9の免疫応答調節蛋白質;
(d) 請求項10または11のペプチド;および
(e) 請求項12のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、
からなる群より選択される1以上を含むことを特徴とする医薬組成物。 A pharmaceutical composition for the purpose of regulating immune response,
(a) the polynucleotide of claim 3;
(b) the recombinant vector of claim 6;
(c) the immune response regulatory protein of claim 8 or 9;
(d) the peptide of claim 10 or 11; and
(e) the monoclonal or polyclonal antibody of claim 12,
A pharmaceutical composition comprising one or more selected from the group consisting of:
A method for producing an antibody against an arbitrary protein in an animal body, the method comprising the steps of administering an antigenic substance to the animal of claim 18 and isolating the antibody from the animal.
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