JP2007024822A - Discriminating method of male menopause or depression - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量に基づき、男性の更年期又はうつ病を鑑別する方法に関する。また、本発明は、血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量の新規測定方法に関する。 The present invention relates to a method for differentiating men's menopause or depression based on the amount of testosterone and cortisol present in blood or saliva. The present invention also relates to a novel method for measuring the amount of testosterone and cortisol present in blood or saliva.
男性更年期は、一般に、成熟期から老年期への移行期である４５〜５５歳を指す。その時期には、精力、気分・健康感、認知・記憶力等の精神的機能の低下、筋肉量・骨量の減少、体脂肪の増加等による身体的機能の低下及び性機能の低下が見られる。 Male menopause generally refers to the age of 45-55, a transition period from mature to old age. During that time, mental functions such as energy, mood / health, cognition / memory, decline in muscle mass / bone mass, decrease in physical function and decrease in sexual function due to increase in body fat, etc. .
一方、うつ病はストレスを誘因として発症することが臨床精神医学により明らかにされており、その初発年齢のピークは２０歳代及び５０歳代にある。 On the other hand, it has been clarified by clinical psychiatry that depression is triggered by stress, and the initial age peak is in the 20s and 50s.
近年、男性更年期としてＰＡＤＡＭ（partial androgen deficiency in aging male）が注目され、男性更年期障害の臨床診断及び治療はＰＡＤＡＭの観点から行われつつあるが、男性更年期外来を受診する患者の中にはうつ病の症例も相当の割合で混在しており、必ずしもテストステロン値の低下に基づくＰＡＤＡＭ患者ばかりではない。ＰＡＤＡＭとうつ病は主訴をほぼ同じくするため、実際にはうつ病である患者に対してＰＡＤＡＭに基づく治療（主としてアンドロゲン補充療法）が施されることがある。しかし、そのような場合は症状が改善されないばかりか、症状の悪化及び自殺等の事態を招くおそれがある。したがって、男性更年期外来を訪れた患者の診断及び治療は、患者の主訴を主とする問診のみに頼ることなく、内分泌状況などを総合的に検討した上で行わなければならない。 In recent years, PADAM (partial androgen deficiency in aging male) has attracted attention as men's menopause, and clinical diagnosis and treatment of men's menopause is being carried out from the perspective of PADAM. These cases are also mixed at a considerable rate, and are not always PADAM patients based on a decrease in testosterone levels. Since PADAM and depression have almost the same main complaints, PADAM-based treatment (mainly androgen replacement therapy) may be given to patients who are actually depressed. However, in such a case, not only the symptoms are not improved, but there is a risk of worsening the symptoms and suicide. Therefore, the diagnosis and treatment of patients who have visited men's menopause outpatients must be conducted after comprehensively examining the endocrine status, etc., without relying solely on the patient's main complaint.
男性更年期の診断は、現在は遊離テストステロン（Tsujimura,A. et al: J.Urology,170,2345 (2003)）及びバイオアベイラブルテストステロンを指標として行われているが、現在用いられている基準値は米国で作成されたものであり、日本人には値が高すぎてほとんどの人が基準値の下限（１５．２pg/mL）を下回ってしまうため、我が国独自の基準値の作成が求められている。また、生理活性を有するのはバイオアベイラブルテストステロンであることから、男性更年期の診断はバイオアベイラブルテストステロンを指標とするのが望ましい。しかし、その測定方法として、例えば、硫安法、ＩＳＳＡＭ法、ＣｏｎＡ法が提案されている（Medical Science Digest, Vol.31(3), 99-103(2005)参照）が、測定方法の国際的な統一はなされていない。このようなことから、バイオアベイラブルテストステロンに基づく我が国に適した男性更年期の診断方法の確立が求められている。 Male menopause is currently diagnosed using free testosterone (Tsujimura, A. et al: J. Urology, 170, 2345 (2003)) and bioavailable testosterone as indices. Since it was created in the United States and the value is too high for most Japanese people to fall below the lower limit of the standard value (15.2 pg / mL), it is required to create a standard value unique to Japan. Yes. In addition, since bioavailable testosterone has physiological activity, it is desirable to use bioavailable testosterone as an index for male menopause. However, for example, an ammonium sulfate method, an ISSAM method, and a ConA method have been proposed (see Medical Science Digest, Vol. 31 (3), 99-103 (2005)). There is no unification. For these reasons, there is a need to establish a male menopause diagnostic method suitable for Japan based on bioavailable testosterone.
一方、うつ病の診断は、ZungのSelf-rating Depression Scale（ＳＤＳ）、ZigmondによるHospital Anxiety and Depression Scale（ＨＡＤＳ）等のスクリーニングテスト、あるいは、臨床的な確定診断のためのＤＳＭ−４（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th. edition、米国精神医学会）等により行われている。これらはいずれも問診を中心としたものであるが、最近になって、血中コルチゾールの量に基づいてうつ病を診断する試みがなされている。これは、うつ病において視床下部−下垂体−副腎皮質系（ＨＡＰ系）の機能が亢進してグルココルチコイドの分泌が増大し、その結果として、血液、尿、脳脊髄液等におけるコルチゾールの濃度が上昇している所見が多く見られることに由来するものであり、例えば、ＨＡＰ系異常を検出する検査として、デキサメサゾンを負荷し、コルチゾールと副腎皮質刺激ホルモンの分泌抑制を見るデキサメサゾン抑制テスト（ＤＳＴ）やこれらを改良したＤＳＴ/ＣＲＨテストが提案されている（Heuser I, et al: J.Psychiatr．Res. 1994; 28,341）。しかしながら、どのような状態のコルチゾール、例えば、遊離しているものかバイオアベイラブルなものか、あるいは全量のコルチゾールがうつ病と関係しているのかが明らかではなく、特にバイオアベイラブルコルチゾールの定量法が確立していないこともあって、血中コルチゾールの量とうつ病の症状の程度との関係は未だ明らかにされていない。ただし、うつ病の発症誘因とされているストレスについては、スポーツ選手（Kivlighan KT,et al: Psychoneuroendocrinology, 2005 Jan; 30(1); 58-71: Maso F,et al; Br.J.Sports Med.2004 Jun; 38(3)260-263)、宇宙飛行士（Strollo F, et al: J.Gravit.Physiol.1997, July; 4(2)103-104)、消防士(Roy M, et al: Ann.Behav.Med.2003 Dec; 26(3)194-200)等の職業に起因するストレスを有する人を対象として、血中又は唾液中のテストステロン及びコルチゾールを測定し、その結果を考察した報告がいくつかなされている。また、デヒドロエピアンドロステロンとコルチゾールを測定しストレスを定量する方法も知られている（特開平１１−３８００４）。しかし、これらの文献には、男性の更年期又はうつ病については何ら記載されていない。 On the other hand, depression is diagnosed by screening tests such as Zung's Self-rating Depression Scale (SDS), Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS) by Zigmond, or DSM-4 (Diagnostic and Diagnosis) for clinical definitive diagnosis. Statistical Manual of Mental Disorders, 4th. Edition, American Psychiatric Association). Although these are all centered on an inquiry, recently, an attempt has been made to diagnose depression based on the amount of blood cortisol. In depression, the function of the hypothalamus-pituitary-adrenal cortex system (HAP system) is enhanced and glucocorticoid secretion is increased. As a result, the concentration of cortisol in blood, urine, cerebrospinal fluid, etc. Dexamethasone Suppression Test (DST) is a test for detecting abnormalities in the HAP system, such as loading dexamethasone and checking the inhibition of cortisol and corticotropin secretion. And DST / CRH tests improved on these have been proposed (Heuser I, et al: J. Psychiatr. Res. 1994; 28,341). However, it is not clear what state of cortisol, for example, free or bioavailable, or whether the total amount of cortisol is associated with depression, and in particular, a method for determining bioavailable cortisol has been established. As a result, the relationship between the amount of cortisol in the blood and the degree of symptoms of depression has not yet been clarified. However, for the stress that has been attributed to the onset of depression, athletes (Kivlighan KT, et al: Psychoneuroendocrinology, 2005 Jan; 30 (1); 58-71: Maso F, et al; Br. J. Sports Med .2004 Jun; 38 (3) 260-263), astronaut (Strollo F, et al: J. Gravit. Physiol. 1997, July; 4 (2) 103-104), firefighter (Roy M, et al : Ann.Behav.Med.2003 Dec; 26 (3) 194-200) etc., and the testosterone and cortisol in blood or saliva were measured and the results were examined. Several reports have been made. Also known is a method for measuring stress by measuring dehydroepiandrosterone and cortisol (Japanese Patent Laid-Open No. 11-38004). However, these documents do not describe any menopause or depression.
ところで、テストステロンが関係する疾患とコルチゾールが関係する疾患は全く領域が異なるために、それぞれのステロイドホルモンは単独で測定されている。また、その測定方法も免疫学的方法やラジオイムノアッセイが殆んどである。しかし、男性更年期外来を受診する患者が増加してきており、テストステロン及びコルチゾールの両者の値を同時に、しかも簡便に、さらにはバイオアベイラブルな状態にあるものを測定する方法の開発が求められている。
本発明の目的は、血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量に基づき、男性の更年期又はうつ病を鑑別する方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method for differentiating men's menopause or depression based on the amount of testosterone and cortisol present in blood or saliva.
また、本発明の別の目的は、血液又は唾液中のテストステロン及びコルチゾールの量をＬＣ／ＭＳを用いて同時に測定する方法を提供することである。 Another object of the present invention is to provide a method for simultaneously measuring the amount of testosterone and cortisol in blood or saliva using LC / MS.
本発明者らは、血液又は唾液中のテストステロンの量と男性の更年期症状との関係、及び血液又は唾液中のコルチゾールの量とうつ病の程度との関係について鋭意検討した。その結果、唾液中のテストステロン及びコルチゾールの量は血液中のバイオアベイラブルなそれらのホルモンの状態を反映していること、及びそれらのホルモンの量と男性の更年期又はうつ病の症状に一定の関係があることを見出し、男性の更年期又はうつ病を鑑別する方法を完成させた。また、血液又は唾液中のテストステロン及びコルチゾールの簡便な測定方法も併せて開発した。 The present inventors diligently investigated the relationship between the amount of testosterone in blood or saliva and menopausal symptoms, and the relationship between the amount of cortisol in blood or saliva and the degree of depression. As a result, the amount of testosterone and cortisol in saliva reflects the status of those bioavailable hormones in the blood, and there is a fixed relationship between the amount of these hormones and men's menopause or depression symptoms. He found something and completed a method to differentiate men's menopause or depression. We also developed a simple method for measuring testosterone and cortisol in blood or saliva.
すなわち、本発明は、血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量を測定し、両者の測定値を健常者及び男性の更年期又はうつ病患者の測定値と対比することを特徴とする、男性の更年期又はうつ病の鑑別法を提供するものである。 That is, the present invention measures the amount of testosterone and cortisol present in blood or saliva, and compares the measured values of both men and men with menopause or depressed patients, Provides a method for differentiating menopause or depression.
また、本発明は、血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量を測定し、両者の測定値を健常者及び男性の更年期又はうつ病患者の測定値と対比することを特徴とする、男性の更年期又はうつ病の鑑別用キットを提供するものである。 Further, the present invention is a male, characterized in that the amount of testosterone and cortisol present in blood or saliva is measured, and both measured values are compared with the measured values of healthy men and men's menopause or depressed patients A kit for distinguishing menopause or depression is provided.
さらに、本発明は、男性の更年期又はうつ病の鑑別のために、ＬＣ／ＭＳを用いて、それぞれの生成イオンを同時に検出することを特徴とする、血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量の測定方法を提供するものである。 Furthermore, the present invention relates to testosterone and cortisol present in blood or saliva, characterized in that each product ion is detected simultaneously using LC / MS for the discrimination of male menopause or depression. It provides a method for measuring quantity.
本発明は、具体的には、以下に記載の通りである。
（１）被検者から採取した血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチ
ゾールの量を測定し、得られた両者の測定値を健常者及び男性の更年期又はうつ
病患者の血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾール量の測定
値と対比することを特徴とする、男性の更年期又はうつ病の鑑別法。
（２）血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量の測定を、ＬＣ／ＭＳを用いて、それぞれの生成イオンを同時に検出することにより行う、上記（１）に記載の鑑別法。
（３）唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量を測定する、上記（１）又は（２）に記載の鑑別法。
（４）被検者の血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量を測定するための手段、及び得られた両者の測定値を健常者及び男性の更年期又はうつ病患者の血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾール量の測定値と対比する手段を含むことを特徴とする、男性の更年期又はうつ病の鑑別用キット。
（５）対比する手段が健常者及び男性の更年期又はうつ病患者の血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾール量の測定値の対比表である、上記（４）に記載の男性の更年期又はうつ病の鑑別用キット。
（６）男性の更年期又はうつ病の鑑別のために、ＬＣ／ＭＳを用いて、被検者から採取した血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールのそれぞれの生成イオンを同時に検出してテストステロン及びコルチゾールを定量することを特徴とする、血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量の測定方法。
（７）血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの水酸基をエステル化した後にＬＣ／ＭＳ測定を行う、上記（６）に記載の測定方法。
（８）さらに、血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールのカルボニル基をイミノ化した後にＬＣ／ＭＳ測定を行う、上記（７）に記載の測定方法。
（９）唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量を測定する、上記（６）〜（８）のいずれか１項に記載の測定方法。
The present invention is specifically as described below.
(1) Measure the amount of testosterone and cortisol present in blood or saliva collected from the subject, and present both measured values in the blood or saliva of healthy subjects and men's menopause or depressed patients A method for differentiating menopause or depression in men, characterized by contrasting with measured values of testosterone and cortisol levels.
(2) The discrimination method according to (1) above, wherein the amount of testosterone and cortisol present in blood or saliva is measured by simultaneously detecting each product ion using LC / MS.
(3) The differentiation method according to (1) or (2) above, wherein the amount of testosterone and cortisol present in saliva is measured.
(4) Means for measuring the amount of testosterone and cortisol present in the blood or saliva of the subject, and the measured values obtained in the blood or saliva of healthy men and men's menopause or depressed patients A kit for distinguishing menopause or depression in men, comprising means for contrasting the measured values of testosterone and cortisol present in
(5) The male menopause or depression according to (4) above, wherein the means for comparison is a comparison table of the measured values of testosterone and cortisol present in the blood or saliva of normal men and men's menopause or depressed patients Disease identification kit.
(6) For differentiation of male menopause or depression, LC / MS is used to simultaneously detect testosterone and cortisol produced ions in blood or saliva collected from a subject to simultaneously detect testosterone and A method for measuring the amount of testosterone and cortisol present in blood or saliva, characterized by quantifying cortisol.
(7) The measurement method according to (6), wherein LC / MS measurement is performed after esterifying hydroxyl groups of testosterone and cortisol present in blood or saliva.
(8) The measurement method according to (7), further comprising performing LC / MS measurement after iminating carbonyl groups of testosterone and cortisol present in blood or saliva.
(9) The measurement method according to any one of (6) to (8), wherein the amount of testosterone and cortisol present in saliva is measured.
本発明において使用することのできる生体由来試料は、血液及び唾液である。両者ともバイオアベイラブルなホルモンの状況を反映しているが、中でも、生体への負荷が少ない非侵襲的な方法で採取できるという点及び実質的にバイオアベイラブルなホルモンしか含まない点で、唾液が好適である。 Biological samples that can be used in the present invention are blood and saliva. Both reflect the status of bioavailable hormones, but saliva is preferred in that it can be collected in a non-invasive manner with less burden on the body and contains virtually only bioavailable hormones. It is.
血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量の測定は、例えば、免疫学的測定、ラジオイムノアッセイ、ＧＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ等を用いて、一般的な方法により行うことができる。この中で、微量測定が可能であること、テストステロンとコルチゾールの同時測定が可能であること及び測定者に放射線被爆等の危険がないことから、ＬＣ／ＭＳが最も適している。 The amount of testosterone and cortisol present in blood or saliva can be measured by a general method using, for example, immunological measurement, radioimmunoassay, GC / MS, LC / MS, or the like. Among these, LC / MS is most suitable because it can measure a trace amount, can simultaneously measure testosterone and cortisol, and has no danger of radiation exposure to the measurer.
本発明の「鑑別用キット」には、被検者からの血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量の測定値と健常者及び男性の更年期又はうつ病患者の血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量の測定値とを対比して男性の更年期又はうつ病を鑑別するために必要な手段が含まれ、例えば、被検者からの血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量の測定手段として、血液又は唾液の採取用具、カラムカートリッジ等、及び、被検者からの血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量の測定値と健常者及び男性の更年期又はうつ病患者の血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量の測定値とを対比する手段として、健常者及び男性の更年期又はうつ病患者のそれぞれの測定値の対比表が挙げられる。中でも、上記対比表は、医師の判断によらなくとも男性の更年期又はうつ病であるかどうかを鑑別することが可能となるものであり、特に有用である。 In the “differentiation kit” of the present invention, the measurement value of the amount of testosterone and cortisol present in the blood or saliva from the subject and the blood or saliva of healthy persons and male menopause or depressed patients are present. Includes the means necessary to distinguish men's menopause or depression relative to measurements of testosterone and cortisol levels, such as the amount of testosterone and cortisol present in blood or saliva from a subject As a means of measurement, blood or saliva collection tools, column cartridges, etc., and measured values of testosterone and cortisol present in blood or saliva from the subject, and healthy men and men's menopause or depressed patients As a means of contrasting measurements of the amount of testosterone and cortisol present in blood or saliva, One comparison table of the respective measurements of the disease the patient and the like. Above all, the above comparison table is particularly useful because it can distinguish whether men have menopause or depression without judgment of a doctor.
本発明の測定方法において、「ＬＣ／ＭＳ」は、一般的なＬＣ／ＭＳを使用することができる。また、その測定においては、例えば、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ、ＬＣ−ＡＰＣＩ／ＭＳ−ＭＳ等を用いることができる。 In the measurement method of the present invention, general LC / MS can be used as “LC / MS”. Moreover, in the measurement, LC / MS-MS, LC-ESI / MS, LC-APCI / MS-MS etc. can be used, for example.
また、本発明の測定方法においては、生体由来試料中に存在するテストステロン及びコルチゾールの水酸基をエステル化し、さらに必要に応じてカルボニル基をイミノ化した後に、ＬＣ／ＭＳ測定を行うことも可能である。それらの誘導体化を行う場合は、エステル化については、例えば、アセチル化、ベンゾイル化、トリフルオロベンゾイル化等を挙げることができ、また、イミノ化については、ヒドロキシルイミノ化、メチルオキシルイミノ化等を挙げることができる。 In the measurement method of the present invention, it is also possible to perform LC / MS measurement after esterifying the hydroxyl groups of testosterone and cortisol present in a sample derived from a living body and further iminating the carbonyl group as necessary. . In the case of performing derivatization thereof, examples of esterification include acetylation, benzoylation, trifluorobenzoylation, and the like, and examples of imination include hydroxylimination, methyloxy limination and the like. Can be mentioned.
本発明について、以下に具体的に説明する。
試料の調製
試料の調製方法については、後記実施例において詳述するが、被検者から採取した血液又は唾液を遠心分離や簡易カラムクロマトグラフィーにより分離精製する一般的調製方法を適宜選択して用いることができる。この試料調製方法により、特に血液中のバイオアベイラブルなホルモンを分離でき、これを以後の測定工程に供する。また、血液として、血清を使用することもできる。なお、唾液については、特に調製することなく、採取したものをそのまま測定に供することもできる。
The present invention will be specifically described below.
Sample preparation The sample preparation method will be described in detail in the examples below, but a general preparation method for separating and purifying blood or saliva collected from a subject by centrifugation or simple column chromatography is appropriately selected and used. be able to. By this sample preparation method, particularly a bioavailable hormone in blood can be separated and used for the subsequent measurement process. Serum can also be used as blood. In addition, about saliva, what was extract | collected can also be used for a measurement as it is, without preparing especially.
ＬＣ−ＭＳを使用する場合には、血清のＳＨＢＧ結合を除いた画分又は採取した唾液を極性溶媒（例えば、酢酸エチル、ブタノール等）を用いて抽出することにより、アルブミンに結合したテストステロン及びコルチゾールを遊離のテストステロン及びコルチゾールに変換して測定する。
血液試料あるいは唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量の測定
When LC-MS is used, testosterone and cortisol bound to albumin are extracted by extracting the fraction from which serum has no SHBG binding or the collected saliva with a polar solvent (eg, ethyl acetate, butanol, etc.). Is converted to free testosterone and cortisol and measured.
Measurement of the amount of testosterone and cortisol present in blood samples or saliva
上記で調製した血液試料あるいは採取した唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量を、免疫学的測定用キット、例えば、エンザプレート テストステロン、エンザプレート コルチゾール、Testosterone saliva LIA キット、Cortisol saliva LIA キット等；ラジオイムノアッセイキット、例えば、ＤＰＣトータルテストステロンキット、ＤＰＣコルチゾールキット等；ＧＣ／ＭＳ；又はＬＣ／ＭＳ等を用いて測定する。 The amount of testosterone and cortisol present in the blood sample prepared above or in the collected saliva is determined using an immunological measurement kit such as Enzaplate testosterone, Enzaplate cortisol, Testosterone saliva LIA kit, Cortisol saliva LIA kit, etc .; radio Measurement is performed using an immunoassay kit such as DPC total testosterone kit, DPC cortisol kit, etc .; GC / MS; or LC / MS.
測定においてＬＣ／ＭＳを用いると、血液試料あるいは唾液中に含まれるテストステロン及びコルチゾールを同時に測定することができるので、特に好ましい。例えば、テストステロンは７９、８１、９７、１０９、１２１及び１２３に特徴的な生成イオンを示し、特に９７及び１０９が代表的な生成イオンであり、また、コルチゾールは９７、１２１、１２３、１４７、３０９及び３２７に特徴的な生成イオンを示し、特に１２１及び３２７が代表的な生成イオンである。したがって、これらの特徴的な生成イオンに着目し、内部標準物質と対比することにより、それぞれのステロイドホルモンの量を同時に算出することができる。 When LC / MS is used in the measurement, testosterone and cortisol contained in a blood sample or saliva can be measured at the same time, which is particularly preferable. For example, testosterone exhibits product ions characteristic of 79, 81, 97, 109, 121, and 123, particularly 97 and 109 are typical product ions, and cortisol is 97, 121, 123, 147, 309. And 327 are characteristic product ions. In particular, 121 and 327 are representative product ions. Therefore, by paying attention to these characteristic product ions and comparing with the internal standard substance, the amount of each steroid hormone can be calculated simultaneously.
また、血液試料あるいは唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの水酸基をエステル化し、さらに必要に応じてカルボニル基をイミノ化した後に、ＬＳ／ＭＳにより測定する場合は、検出する生成イオンは次のようになる。例えば、両者の水酸基をアセチル化した後にＬＣ／ＭＳ測定したときは、テストステロンについては９７及び１０９が特徴的な生成イオンであり、また、コルチゾールについては１２１、２４１、３０９及び３２７が特徴的な生成イオンである。
血液試料あるいは唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量と、健常者及び男性の更年期又はうつ病患者の測定値との対比
In addition, when measuring by LS / MS after esterifying the hydroxyl groups of testosterone and cortisol present in a blood sample or saliva and further iminating the carbonyl group as necessary, the generated ions to be detected are as follows: Become. For example, when LC / MS is measured after acetylating both hydroxyl groups, 97 and 109 are characteristic product ions for testosterone, and 121, 241, 309 and 327 are characteristic products for cortisol. Ion.
Contrast the amount of testosterone and cortisol present in blood samples or saliva with measurements from healthy and male menopausal or depressed patients
上記で得られた被検者からの血液又は唾液中のテストステロン及びコルチゾールの測定値（午前９時の測定値）を、例えば、下記表Ａに示す健常者及び男性の更年期又はうつ病患者の血液又は唾液中のテストステロン及びコルチゾールの測定値（午前９時の測定値）と対比し、鑑別を行う。「午前９時」とするのは、血液又は唾液中のテストステロン及びコルチゾールの測定値は日内変動があるので、特定の時間の測定値を対比する必要があるからである。表Ａは、５０歳前後の午前９時の測定値であるが、テストステロンの量は年齢にも依存するので、鑑別にあたっては年齢に応じて総合的に判断する。なお、コルチゾールの量は、年齢にはほとんど依存しないので、年齢に関わらず、表Ａの測定値が対比に使用できる。
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するものであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
The measured values of testosterone and cortisol in blood or saliva obtained from the subject as described above (measured values at 9:00 am) are, for example, the blood of healthy subjects and men's menopause or depressed patients shown in Table A below. Or it compares with the measured value (measured value of 9:00 am) of the testosterone and cortisol in saliva, and performs a discrimination. The reason for “9:00 am” is that the measured values of testosterone and cortisol in blood or saliva have diurnal variations, and the measured values at a specific time must be compared. Table A shows measured values at 9:00 am before and after the age of 50. Since the amount of testosterone depends on the age, the judgment is comprehensively made according to the age. In addition, since the quantity of cortisol is hardly dependent on age, the measured value of Table A can be used for comparison irrespective of age.
The following examples illustrate the invention in more detail, but the invention is not limited thereto.
実施例１：ＬＣ／ＭＳ−ＭＳによるテストステロン及びコルチゾールの量の測定（検量線の作成）
ＬＣ／ＭＳ−ＭＳは、液体クロマトグラフィー装置（アジレントテクノロジー、Agilent 1100）に接続したマススペクトロメータＡＰＩ-４０００を用い、ＥＳＩ法で測定した。ＬＣ及びＭＳの測定条件を、下記表Ｂに示す。
Example 1: Measurement of the amount of testosterone and cortisol by LC / MS-MS (preparation of calibration curve)
LC / MS-MS was measured by the ESI method using a mass spectrometer API-4000 connected to a liquid chromatography apparatus (Agilent Technology, Agilent 1100). The measurement conditions for LC and MS are shown in Table B below.
テストステロンのＭＳ測定を行うと、ｍ／ｚ２８９．３に前駆イオンが検出された。この前駆イオンについて更にＭＳ測定を行うと、ｍ／ｚ９７．３に強い強度を示すスペクトルが得られた（図１及び図２）。 When MS measurement of testosterone was performed, a precursor ion was detected at m / z 289.3. When MS measurement was further performed on this precursor ion, a spectrum having a strong intensity at m / z 97.3 was obtained (FIGS. 1 and 2).
そこでｍ／ｚ２８９．３を前駆イオンとして、また、ｍ／ｚ９７．３を生成イオンとしてＬＣ／ＭＳクロマトグラム測定したところ、テストステロン１pgを検出することができた（検出限界）。なお、内部標準物質には重水素で標識したテストステロン（１６，１６，１７-ｄ３テストステロン）を用いた（図３）。この条件で得られた検量線を図４に示す。検量線は、試験管に１，５，１０，２５，１００，５００，１０００pgのテストステロンをそれぞれ採り、これに内部標準物質を１ng添加し、精製水１mlに溶解したものから作成した。テストステロン５〜１０００pg／１０μLの濃度範囲において、相関係数１．００００と良好な直線を示した。 Thus, when LC / MS chromatogram measurement was performed using m / z 289.3 as a precursor ion and m / z 97.3 as a product ion, 1 pg of testosterone could be detected (detection limit). As the internal standard substance, testosterone labeled with deuterium (16, 16, 17-d 3 testosterone) was used (FIG. 3). A calibration curve obtained under these conditions is shown in FIG. Calibration curves were prepared from 1,5, 10, 25, 100, 500, and 1000 pg of testosterone in test tubes, 1 ng of internal standard substance added thereto, and dissolved in 1 ml of purified water. In the concentration range of testosterone of 5 to 1000 pg / 10 μL, the correlation coefficient was 1.0000 and a good straight line was shown.
コルチゾールについてもテストステロンと同様にＬＣ／ＭＳ測定を行った。すなわち、コルチゾールのＭＳ測定において、前駆イオンｍ／ｚ３６３．３が検出され、これについて更にＭＳ測定を行い、生成イオンｍ／ｚ３２７．１を得た（図５及び図６）。この条件でＬＣ／ＭＳクロマトグラム測定したところ、コルチゾール５pgを検出することができた（検出限界）。内部標準物質には重水素で標識したコルチゾール（９，１１，１２，１２−ｄ４コルチゾール）を用いた（図７）。この条件で得られた検量線を図８に示す。検量線は、試験管に２０，５０，１００，５００，１０００、５０００、１００００pgのコルチゾールをそれぞれ採り、これに内部標準物質を１ng添加し、精製水１mlに溶解したものから作成した。コルチゾール２０〜１００００pg／１０μLの濃度範囲において、相関係数０．９９７３と良好な直線を示した。
Cortisol was also subjected to LC / MS measurement in the same manner as testosterone. That is, in MS measurement of cortisol, precursor ion m / z 363.3 was detected, and further MS measurement was performed on this to obtain product ion m / z 327.1 (FIGS. 5 and 6). When LC / MS chromatogram measurement was performed under these conditions, 5 pg of cortisol could be detected (detection limit). Cortisol labeled with deuterium (9, 11, 12, 12-d 4 cortisol) was used as an internal standard (FIG. 7). A calibration curve obtained under these conditions is shown in FIG. A calibration curve was prepared by taking 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, and 10,000 pg of cortisol in a test tube, adding 1 ng of an internal standard substance thereto, and dissolving it in 1 ml of purified water. In the concentration range of
実施例２：ヒト唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量の測定
（１−１）試料の調製
健常男性から得た唾液１mLに２Ｈ３−テストステロン１ng、２Ｈ４−コルチゾール１ng及び酢酸エチル５mLを加えて１０分間振り混ぜ、遠心分離（４℃、３０００回転、５分間）した。これを凍結し有機層を分離した。有機層を遠心式エバポレータで乾固した後、残渣を０．０５％ギ酸/アセトニトリル混液（３：２）１００μLに溶解し、試料とした。
（１−２）ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ法による測定
上記（１−１）で得た試料のうちの１０μLをＬＣ／ＭＳ測定に使用した。測定は、実施例１と同様に行った。テストステロン及びコルチゾールのＬＣ／ＭＳクロマトグラムにおける生成イオンｍ／ｚ９７．３及び３２７．１のピーク面積をそれぞれ測定し、それらと内部標準物質とのピーク面積比を算出し、テストステロン及びコルチゾール濃度を求めた。その結果を下記表Ｃに示す。
Example 2: Measurement of the amount of testosterone and cortisol present in human saliva (1-1) Preparation of
(1-2) Measurement by LC / MS-
上記の通り、本発明の測定方法により、唾液中のテストステロン及びコルチゾール（バイオアベイラブルなもの）をそれぞれ５〜１０００pg及び２０〜１００００pg/mLの範囲で定量できる。また、それぞれの測定限界は、テストステロンは１０pg、コルチゾールは５pgである。 As described above, testosterone and cortisol (bioavailable) in saliva can be quantified in the range of 5-1000 pg and 20-10000 pg / mL, respectively, by the measurement method of the present invention. The measurement limits are 10 pg for testosterone and 5 pg for cortisol.
実施例３：
受診者１〜５について、午前９時頃に唾液中のテストステロン及びコルチゾールを測定し、更年期又はうつ病への罹患の有無について、前期表Ａに基づいて鑑別を行った。その結果を、下記表Ｄに示す。また、下記表Ｄには、それぞれの受診者に対する問診によるＡＭＳ評価（男性の老化症状に対する質問票）及びＨＡＤスコアも併せて記載した。
Example 3:
About test subjects 1-5, the testosterone and cortisol in saliva were measured at about 9:00 am, and the presence or absence of the menopause or the depression was distinguished based on the first term table A. The results are shown in Table D below. In Table D below, the AMS evaluation (questionnaire for aging symptoms in men) and the HAD score are also shown together with the interviews for each examinee.
上記表Ｄには、問診によるＡＭＳ評価が中程度以上であったとしても、更年期ではなくむしろうつ病を疑うべき者がみられる。これらの例に対して、唾液中のテストステロン及びコルチゾールの測定値に基づく鑑別がより適切であることがわかる。
In Table D above, some individuals should be suspected of depression rather than menopause, even if the AMS assessment by interview is moderate or higher. For these examples, it can be seen that discrimination based on measured values of testosterone and cortisol in saliva is more appropriate.
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