JP2007020426A - Method for judging onset of pulmonary alveolar microlithiasis - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、肺胞微石症の発症可能性を判定する方法と、該方法において使用するプローブ若しくはプライマーとしてのポリヌクレオチド、及び抗体作成のための抗原として使用するポリペプチドに関する。 The present invention relates to a method for determining the possibility of developing alveolar microlithiasis, a polynucleotide as a probe or primer used in the method, and a polypeptide used as an antigen for preparing an antibody.
肺胞微石症は、肺胞内に層状、年輪状のリン酸カルシウムよりなる無数の微結石が形成される原因不明の稀な疾患である(非特許文献1)。本疾患は小児から成人に至るまで見られるが発症における性差はなく、その症状は年齢により異なる。通常、小児期から若年期の症例では胸部X線像に顕著なびまん性肺陰影が見られるにもかかわらず、概して自覚症状に乏しい。そのため、この年齢の多くの症例は、健康診断や家族検診等で偶然の機会により発見されることが多い。これに対して40歳以上の症例では運動時の呼吸困難、咳等自覚症状を訴える。本疾患の長期予後は発見時の年齢により異なるものの、必ずしも良好ではない。特に40歳以上の中高年期では症状の進行に伴い咳、呼吸困難等の呼吸器症状を生じ、呼吸不全に陥って死亡する例も多い。本疾患罹患患者の平均死亡年齢は50歳代であり、40歳以上の発見では半数が5年以内に死亡している。 Alveolar microlithiasis is a rare disease whose cause is unknown due to the formation of countless microliths made of layered and annual ring-shaped calcium phosphate in the alveoli (Non-patent Document 1). Although this disease can be seen from children to adults, there is no gender difference in onset, and symptoms vary with age. Usually, childhood to juvenile cases are generally poor in subjective symptoms, despite significant diffuse lung shadows on chest x-rays. For this reason, many cases of this age are often found by chance during health examinations and family examinations. In contrast, cases over 40 years of age complain of subjective symptoms such as dyspnea and cough during exercise. Although the long-term prognosis of this disease varies depending on the age at the time of discovery, it is not necessarily good. In particular, in middle-aged and older people over 40 years old, there are many cases in which respiratory symptoms such as cough and dyspnea occur with the progression of symptoms, resulting in respiratory failure and death. The average mortality of patients with this disease is in their 50s, and half of those who died within 5 years are found to be over 40 years old.
本疾患は同胞発生の頻度が高いことや兄弟間のような水平伝播の傾向が見られることから常染色体劣性遺伝による遺伝性肺疾患と考えられている(非特許文献2)。しかし、その原因遺伝子は同定されていない。稀な疾患ではあるが、単一民族からなる島国のように同胞性の高い国や、宗教的背景から近親婚率の高い国では潜在的な発症頻度は必ずしも低いとは言えず、無視できる疾患ではない。特に日本は本疾患の症例が世界的にも非常に多いことが知られている(非特許文献3)。 This disease is considered to be an inherited lung disease due to autosomal recessive inheritance because of the high frequency of siblings and the tendency of horizontal transmission among siblings (Non-patent Document 2). However, the causative gene has not been identified. Although it is a rare disease, its potential incidence is not necessarily low in countries with high siblings, such as island nations consisting of a single ethnic group, or countries with a high relative marriage rate, and can be ignored. is not. Particularly in Japan, it is known that there are very many cases of this disease worldwide (Non-patent Document 3).
このような背景から、本疾患の原因究明や治療方法の開発が望まれているが、現在のところ酸素療法等の対処療法や肺移植以外には有効な治療方法は知られていない。また、本疾患は発見時が高齢なほど、あるいは加齢が進むほど症状が悪化する傾向にある。しかし、小児期から若年期が無症状であることや経過が極めて緩慢なこと等から、偶然的な機会がなければ早期発見は難しい。実際、自覚症状による発見時には既に症状が進行している例が多い。自覚症状のない時期に肺胞微石症を発症する可能性を迅速、かつ容易に判定できれば、医師による早期診断や近い将来開発されると予想される本疾患の治療方法による早期治療を受けることも可能と考えられる。
本発明の課題は、肺胞微石症の自覚症状前の被験者に対して肺胞微石症の発症可能性を判定する方法を提供することである。本発明の他の課題は、臨床症状で肺胞微石症の疑いがあると診断された被験者に対して、その原因を確定することである。本発明の更なる課題は、被験者に対して迅速、かつ容易に肺胞微石症の発症が可能な発症判定に使用するプローブ若しくはプライマーとしてのポリヌクレオチド、及び抗体作成のための抗原として使用するポリペプチドを提供することである。 The subject of this invention is providing the method of determining the onset possibility of alveolar microlithiasis with respect to the test subject before the subjective symptom of alveolar microlithiasis. Another object of the present invention is to determine the cause of a subject diagnosed as suspected to have alveolar microlithiasis due to clinical symptoms. A further object of the present invention is to use a polynucleotide as a probe or primer used for the onset determination capable of developing alveolar microlithiasis quickly and easily for a subject, and an antigen for producing an antibody. It is to provide a polypeptide.
上記課題を解決するためには、まず肺胞微石症の原因遺伝子を同定する必要があった。そこで、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、肺胞微石症の原因遺伝子がヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質をコードするヒトSLC34A2遺伝子であることを発見した。本発明は、係る肺胞微石症原因遺伝子の発見に基づいて完成された以下の肺胞微石症の発症可能性を判定する方法、それに使用するポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。該方法において使用するプローブ若しくはプライマーとしてのポリヌクレオチド、及び抗体作成のための抗原として使用するポリペプチドに関する。すなわち、以下の発明を提供する。 In order to solve the above problems, it was first necessary to identify the gene responsible for alveolar microlithiasis. Thus, as a result of intensive studies, the present inventors have discovered that the causative gene of alveolar microlithiasis is a human SLC34A2 gene encoding a human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein. The present invention provides the following method for determining the possibility of the onset of alveolar microlithiasis completed based on the discovery of such alveolar microlithiasis-causing gene, and the polynucleotide and polypeptide used therefor. The present invention relates to a polynucleotide used as a probe or primer used in the method and a polypeptide used as an antigen for preparing an antibody. That is, the following invention is provided.
(1)本発明は、ヒト由来の核酸を抽出する核酸抽出工程と、前記抽出された核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列が、配列番号1で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変を有するかを検出する遺伝子改変検出工程とからなる肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (1) The present invention relates to a nucleic acid extraction step for extracting a human-derived nucleic acid, and a base sequence of a human SLC34A2 gene that can be contained in the extracted nucleic acid from a wild-type base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Provided is a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, which comprises determining the possibility of developing alveolar microlithiasis, comprising a genetic alteration detection step for detecting whether or not a known alteration derived from the alteration is present.
(2)本発明は、ヒト由来の核酸を抽出する核酸抽出工程と、前記抽出された核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列が、配列番号1で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する遺伝子改変検出工程と、前記抽出された核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型が、野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する遺伝型判定工程とからなる肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (2) The present invention relates to a nucleic acid extraction step for extracting a human-derived nucleic acid, and the base sequence of the human SLC34A2 gene that can be contained in the extracted nucleic acid is modified from the wild-type base sequence represented by SEQ ID NO: 1. A genetic modification detection step for detecting whether or not a genotype of the human SLC34A2 gene that can be contained in the extracted nucleic acid is a wild type homozygote, a modified homozygote, a wildtype and a modified heterologous, or a modified heterologous The present invention provides a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, which comprises a genotype determination step of determining which one of
(3)本発明は、前記核酸抽出工程において抽出する核酸がゲノムDNA、トータルRNA、mRNA、又はそれらに基づく核酸である肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (3) The present invention provides a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, wherein the nucleic acid extracted in the nucleic acid extraction step is genomic DNA, total RNA, mRNA, or a nucleic acid based thereon.
(4)本発明は、前記トータルRNA、又はmRNAが肺組織、喀痰、又は胸水から抽出されるものである肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (4) The present invention provides a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, wherein the total RNA or mRNA is extracted from lung tissue, sputum, or pleural effusion.
(5)本発明は、前記遺伝子改変検出工程における検出すべき改変の様態が塩基の欠失、置換、又は付加である肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (5) The present invention provides a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, wherein the modification to be detected in the genetic modification detection step is a base deletion, substitution, or addition.
(6)本発明は、前記遺伝子改変検出工程における検出すべき既知の改変が配列番号1で表される第13290位のTから第13304位Gまでの塩基配列が配列番号3で表される塩基配列で置換された改変である肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (6) In the present invention, the known modification to be detected in the genetic modification detection step is a base represented by SEQ ID NO: 3 from the 13290th position T to the 13304th position G represented by SEQ ID NO: 1. Provided is a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, which is a modification substituted with a sequence.
(7)本発明は、前記遺伝子改変検出工程における検出すべき既知の改変が配列番号1で表される塩基配列において第8イントロンのスプライシングドナー部位のGがAに置換された改変に基づくものである肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (7) The present invention is based on a modification in which the G of the splicing donor site of the eighth intron is replaced with A in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the known genetic modification detection step. A method for determining the onset of alveolar microlithiasis is provided.
(8)本発明は、前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法が配列番号1で表される野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列からの改変に由来する既知の改変の塩基配列の全部、又は連続する少なくとも14塩基以上からなる一部を有するポリヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションにより検出する方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (8) In the present invention, the detection method of the modification in the genetic modification detection step is the entire or continuous base sequence of known modifications derived from the modification from the base sequence of the wild-type human SLC34A2 gene represented by SEQ ID NO: 1. A method for determining the onset of alveolar microlithiasis, which is a method of detecting by hybridization using a polynucleotide having a part consisting of at least 14 bases as a probe.
(9)本発明は、前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法が配列番号1で表される野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列からの改変に由来する既知の改変の塩基配列が存在し得る領域の全部又は一部の塩基配列の決定により検出する方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (9) The present invention provides a region in which a known modification base sequence derived from a modification from the base sequence of the wild-type human SLC34A2 gene represented by SEQ ID NO: 1 is present in the modification detection method in the genetic modification detection step A method for determining the onset of alveolar microlithiasis, which is a method of detecting by determining all or a part of the nucleotide sequence.
(10)本発明は、前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法が配列番号1で表される野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列の全部又は連続する少なくとも14塩基以上からなる一部を有するポリヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションにより検出する方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (10) The present invention relates to a polynucleotide comprising a whole of the base sequence of the wild type human SLC34A2 gene represented by SEQ. Provided is a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, which is a method of detecting by hybridization using as a probe.
(11)本発明は、前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法が前記核酸抽出工程で抽出された核酸においてヒトSLC34A2遺伝子が存在し得る領域の全部、又は一部の塩基配列を決定し、当該塩基配列と配列番号1で表される野生型遺伝子の塩基配列との比較により検出する方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (11) In the present invention, the modification detection method in the genetic modification detection step determines all or a part of the base sequence of the region where the human SLC34A2 gene may be present in the nucleic acid extracted in the nucleic acid extraction step, Provided is a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, which is a method of detecting by comparing the base sequence with the base sequence of the wild-type gene represented by SEQ ID NO: 1.
(12)本発明は、前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法が核酸増幅法によって目的とする核酸増幅産物が増加したかによって検出する方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (12) The present invention provides a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, which is a method for detecting whether a target nucleic acid amplification product is increased by the nucleic acid amplification method in the method for detecting a modification in the genetic modification detection step.
(13)本発明は、前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法が核酸増幅法によって増幅される野生型の核酸増幅産物と、改変型の核酸増幅産物の塩基数の比較によって検出するする方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (13) The present invention provides a method for detecting a modification in the genetic modification detection step by detecting the number of bases of a wild-type nucleic acid amplification product amplified by a nucleic acid amplification method and a modified nucleic acid amplification product. A method for determining the onset of alveolar microlithiasis is provided.
(14)本発明は、前記遺伝子改変検出工程における改変の検出がRFLPを利用した制限酵素のよる野生型と改変型での切断パターンよって行われる肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (14) The present invention provides a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, wherein the detection of the modification in the genetic modification detection step is performed based on a cleavage pattern of a wild type and a modified type using a restriction enzyme utilizing RFLP.
(15)本発明は、ヒト由来のタンパク質を抽出するタンパク質抽出工程と、前記抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号2で表される野生型のアミノ酸配列からの既知のアミノ酸改変を有するかを検出するアミノ酸改変検出工程と、からなる肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (15) In the present invention, the protein extraction step of extracting a human-derived protein and the amino acid sequence of the human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein that can be contained in the extracted protein are represented by SEQ ID NO: 2. And a method for determining the onset of alveolar microlithiasis that determines the possibility of developing alveolar microlithiasis, comprising the step of detecting whether or not there is a known amino acid modification from a wild-type amino acid sequence.
(16)本発明は、ヒト由来のタンパク質を抽出するタンパク質抽出工程と、前記抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号2で表される野生型のアミノ酸配列からアミノ酸改変されたかを検出するアミノ酸改変検出工程と、前記抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質をコードするヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型が野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する第二遺伝型判定工程とからなる肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (16) In the present invention, the protein extraction step of extracting a human-derived protein and the amino acid sequence of the human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein that can be contained in the extracted protein are represented by SEQ ID NO: 2. An amino acid modification detecting step for detecting whether the amino acid has been modified from the wild-type amino acid sequence, and a genotype of a human SLC34A2 gene encoding a human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein that can be contained in the extracted protein. Provided is a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, comprising a second genotype determination step for determining whether a wild-type homozygote, a modified homozygote, a wild-type and a modified heterotype, or a modified heterotype .
(17)本発明は、前記タンパク質抽出工程におけるタンパク質が肺組織から抽出する肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (17) The present invention provides an alveolar microlithiasis onset determination method in which the protein in the protein extraction step is extracted from lung tissue.
(18)本発明は、前記アミノ酸改変検出工程における検出すべきアミノ酸改変の様態がアミノ酸の欠失、置換、又は付加である肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (18) The present invention provides a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, wherein the mode of amino acid modification to be detected in the amino acid modification detection step is amino acid deletion, substitution, or addition.
(19)本発明は、前記アミノ酸改変検出工程における検出すべきアミノ酸改変が配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸改変である肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (19) The present invention provides a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, wherein the amino acid modification to be detected in the amino acid modification detection step is an amino acid modification having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
(20)本発明は、前記アミノ酸改変検出工程における検出すべきアミノ酸改変が配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸改変である肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (20) The present invention provides a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, wherein the amino acid modification to be detected in the amino acid modification detection step is an amino acid modification having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(21)本発明は、前記アミノ酸改変検出工程におけるアミノ酸改変の検出方法が既知のアミノ酸改変型ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列において、該アミノ酸配列のアミノ酸改変された全部又は連続する少なくとも5アミノ酸以上の一部を有するポリペプチドを抗原とした抗体を用いる抗原抗体反応法により検出する方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (21) The present invention relates to an amino acid sequence of an amino acid-modified human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein whose amino acid modification detection method in the amino acid modification detection step is known, Provided is a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, which is a method of detecting by an antigen-antibody reaction method using an antibody whose antigen is a polypeptide having at least 5 consecutive amino acids.
(22)本発明は、前記アミノ酸改変検出工程におけるアミノ酸改変の検出方法が配列番号2で表される野生型ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列の全部又は連続する少なくとも5アミノ酸以上の一部を有するポリヌクレオチドを抗原とした抗体を用いる抗原抗体反応法により検出する方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (22) The present invention provides at least 5 amino acids in the amino acid sequence of the wild-type human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein represented by SEQ ID NO: 2 as the method for detecting amino acid modifications in the amino acid modification detection step. The present invention provides a method for determining the onset of alveolar microlithiasis, which is a method of detecting by an antigen-antibody reaction method using an antibody whose antigen is a polynucleotide having a part of the above.
(23)本発明は、配列番号1で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列において、改変された領域の塩基配列の全部又は連続する少なくとも14塩基以上を一部として有する塩基配列からなり、かつ前記(8)に記載の肺胞微石症発症判定方法で使用するプローブとして用いられるポリヌクレオチドを提供する。 (23) In the base sequence of a known modified human SLC34A2 gene derived from modification from the wild-type base sequence represented by SEQ ID NO: 1, the present invention provides at least all or a continuous base sequence of the modified region. Provided is a polynucleotide comprising a base sequence having a part of 14 bases or more and used as a probe for use in the method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to (8) above.
(24)本発明は、前記改変された領域の塩基配列が配列番号3で表される塩基配列であるポリヌクレオチドを提供する。 (24) The present invention provides a polynucleotide in which the base sequence of the modified region is the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(25)本発明は、前記改変された領域の塩基配列が配列番号4で表される塩基配列であるポリヌクレオチドを提供する。 (25) The present invention provides a polynucleotide in which the base sequence of the modified region is the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(26)本発明は、配列番号1で表される野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列において全部、又は連続する少なくとも14塩基以上を一部として有する塩基配列からなり、かつ前記(10)に記載の肺胞微石症発症判定方法で使用するプローブとして用いられるポリヌクレオチドを提供する。 (26) The present invention consists of the base sequence of the wild-type human SLC34A2 gene represented by SEQ ID NO: 1 all or a base sequence having at least 14 consecutive bases as a part, and is described in (10) above Provided is a polynucleotide used as a probe for use in a method for determining the onset of alveolar microlithiasis.
(27)本発明は、配列番号1で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列において、改変された領域の塩基配列が18塩基以上の場合、当該改変された領域の塩基配列の連続する18から60塩基を一部として有し、かつ前記(9)、若しくは(12)に記載の肺胞微石症発症判定方法で使用するプライマーとして用いられるポリヌクレオチドを提供する。 (27) In the base sequence of a known modified human SLC34A2 gene derived from modification from the wild-type base sequence represented by SEQ ID NO: 1, the present invention is a case where the base sequence of the modified region is 18 bases or more , Having a part of 18 to 60 bases in the base sequence of the modified region as a part, and used as a primer used in the method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to (9) or (12) above Provided polynucleotides.
(28)本発明は、前記改変された領域の塩基配列が配列番号3で表される塩基配列であるポリヌクレオチドを提供する。 (28) The present invention provides a polynucleotide in which the base sequence of the modified region is the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(29)本発明は、前記改変された領域の塩基配列が配列番号4で表される塩基配列であるポリヌクレオチドを提供する。 (29) The present invention provides a polynucleotide in which the base sequence of the modified region is the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
(30)本発明は、配列番号1で表される野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列において連続する18から60塩基を一部として有し、かつ前記(11)、若しくは(13)に記載の肺胞微石症発症判定方法で使用するプライマーとして用いられるポリヌクレオチドを提供する。 (30) The present invention includes a part of a continuous 18 to 60 bases in the base sequence of the wild-type human SLC34A2 gene represented by SEQ ID NO: 1, and the lung according to (11) or (13) Provided is a polynucleotide used as a primer for use in a method for determining the development of cyst microlithiasis.
(31)本発明は、前記(23)から(30)のいずれか一以上のポリヌクレオチドを用いて肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定用キットを提供する。 (31) The present invention provides an alveolar microlithiasis onset determination kit for determining the possibility of onset of alveolar microlithiasis using any one or more of the polynucleotides (23) to (30). .
(32)本発明は、配列番号2で表される野生型のアミノ酸配列からの既知のアミノ酸改変型ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸改変された領域のアミノ酸配列の全部又は連続する少なくとも5アミノ酸以上を一部として有するアミノ酸配列からなり、かつ前記(15)に記載の肺胞微石症発症判定方法においてアミノ酸改変を検出する抗体を作成するための抗原としてのポリペプチドを提供する。 (32) The present invention relates to an amino acid sequence of a region in which amino acid modification is performed in the amino acid sequence of a known amino acid-modified human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein from the wild-type amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 As an antigen for preparing an antibody that comprises an amino acid sequence having at least 5 consecutive amino acids as a part thereof and that detects an amino acid modification in the method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to (15) above A polypeptide is provided.
(33)本発明は、前記アミノ酸改変された領域のアミノ酸配列が配列番号5で表されるアミノ酸配列であるポリペプチドを提供する。 (33) The present invention provides a polypeptide, wherein the amino acid sequence of the amino acid-modified region is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
(34)本発明は、前記アミノ酸改変された領域のアミノ酸配列が配列番号6で表されるアミノ酸配列であるポリペプチドを提供する。 (34) The present invention provides a polypeptide, wherein the amino acid sequence of the amino acid-modified region is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(35)本発明は、配列番号2で表される野生型ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列の全部又は連続する少なくとも5アミノ酸以上を一部として有するアミノ酸配列からなり、かつ前記(16)に記載の肺胞微石症発症判定方法の改変を検出する抗体を作成するための抗原としてのポリペプチドを提供する。 (35) The present invention consists of an amino acid sequence having, as a part, at least 5 or more consecutive amino acids of the entire amino acid sequence of the wild-type human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein represented by SEQ ID NO: 2; Provided is a polypeptide as an antigen for preparing an antibody for detecting a modification of the method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to (16) above.
(36)本発明は、ヒト由来の核酸を抽出する核酸抽出工程と、前記抽出された核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子の発現制御領域の塩基配列が、配列番号7で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する発現制御領域改変検出工程と、からなる肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定方法を提供する。 (36) The present invention relates to a nucleic acid extraction step for extracting a human-derived nucleic acid, and a wild-type nucleic acid represented by SEQ ID NO: 7 in which the base sequence of the expression control region of the human SLC34A2 gene that can be contained in the extracted nucleic acid An expression control region modification detection step for detecting whether the base sequence has been modified, and an alveolar microlithiasis onset determination method for determining the possibility of onset of alveolar microlithiasis.
本発明の「発症判定方法」によれば、ヒトSLC34A2遺伝子が肺胞微石症の発症原因となる既知の改変を有するかを迅速、かつ容易に検出することができる。肺胞微石症の自覚症状発症前の被験者であれば、当該検出により今後肺胞微石症を自覚症状として発症する可能性を判定することができる。判定結果が「発症する可能性がある。」というものであれば、当該被験者のヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型を確認し、医師による早期診断、早期治療を受診することが可能となる。また臨床症状から既に肺胞微石症と診断されている被験者であれば、この検出により当該被験者のヒトSLC34A2遺伝子が既知の改変を有するかを判定できる。既知の改変を有していれば、当該被験者は遺伝子レベルでも肺胞微石症である可能性があると判定できる。 According to the “onset determination method” of the present invention, it is possible to quickly and easily detect whether the human SLC34A2 gene has a known modification that causes onset of alveolar microlithiasis. If the subject is a subject before the onset of subjective symptoms of alveolar microlithiasis, the possibility of developing alveolar microlithiasis as a subjective symptom in the future can be determined by the detection. If the determination result is “possible to develop”, it is possible to confirm the genotype of the human SLC34A2 gene of the subject and receive early diagnosis and early treatment by a doctor. Moreover, if it is a test subject who has already been diagnosed with alveolar microlithiasis from clinical symptoms, it can be determined by this detection whether the human SLC34A2 gene of the test subject has a known modification. If the subject has a known modification, it can be determined that the subject may have alveolar microlithiasis even at the genetic level.
本発明の「発症判定方法」によれば、肺胞微石症の自覚症状前に被験者のヒトSLC34A2遺伝子に関する遺伝型を迅速、かつ容易に判定することが出来る。当該判定結果により当該疾患の将来的な発症可能性を判定することができる。また、当該方法は、被験者が胎児であっても実施が可能である。さらに、当該方法で被験者の当該疾患の発症可能性が高いと判定された場合も、医師による早期診断、早期治療を受診することが可能となる。 According to the “onset determination method” of the present invention, the genotype related to the human SLC34A2 gene of a subject can be determined quickly and easily before the subjective symptoms of alveolar microlithiasis. The possibility of future onset of the disease can be determined from the determination result. In addition, this method can be performed even if the subject is a fetus. Furthermore, even when it is determined by the method that the subject is highly likely to develop the disease, it is possible to receive early diagnosis and early treatment by a doctor.
本発明の「発症判定方法」によれば、臨床症状から肺胞微石症の疑いのある疾患を発症している被験者に対して実施することで、ヒトSLC34A2遺伝子の改変を検出することにより当該被験者が肺胞微石症であると確定することができる。また、当該遺伝子の改変によることが判明すれば、それに応じた適切な治療を施すことが可能となる。 According to the “onset determination method” of the present invention, the present invention is carried out on a subject who has developed a disease suspected of having alveolar microlithiasis from clinical symptoms, thereby detecting the modification of the human SLC34A2 gene. It can be determined that the subject has alveolar microlithiasis. Moreover, if it turns out that it is due to the modification of the gene, it becomes possible to perform appropriate treatment accordingly.
本発明の「発症判定方法」によれば、夫婦のヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型を明らかにすることで、当該夫婦間に生まれる子供の肺胞微石症の発症可能性を予測できる。さらに、その結果に応じて妊娠判明後、早期に胎児の発症可能性を判定することで、胎児における肺胞微石症の早期診断、早期治療が可能となる。 According to the “onset determination method” of the present invention, by revealing the genotype of a couple's human SLC34A2 gene, the possibility of developing alveolar microlithiasis in a child born between the couple can be predicted. Furthermore, early diagnosis and early treatment of alveolar microlithiasis in the fetus can be performed by determining the possibility of fetal development at an early stage after the pregnancy is determined according to the result.
本発明の「発症判定方法に用いるポリペプチドを含むキット等」によれば、ヒトSLC34A2遺伝子の改変による肺胞微石症の発症の可能性を迅速かつ簡便に判定することができる。 According to the “kit containing a polypeptide used in the onset determination method” of the present invention, the possibility of the onset of alveolar microlithiasis due to the modification of the human SLC34A2 gene can be determined quickly and easily.
本発明の前記判定方法、又は前記キット等によれば、一定の操作技術を習得した者であれば医師のような専門知識や熟練性を要すること無くヒトSLC34A2遺伝子の改変による肺胞微石症の発症可能性を判定することができる。また、当該方法のうちいくつかは、特段の専用機器等を必要とせず、ほとんどの研究施設等に常備されている機器等で実施できる。また、当該方法のうち特別な専用機器を必要とするものに関しては、専門業者に容易に解析を委託することができる。 According to the determination method or the kit of the present invention, alveolar microlithiasis caused by alteration of the human SLC34A2 gene without requiring specialized knowledge or skill as a doctor if a person who has acquired a certain operation technique is acquired. The possibility of onset can be determined. In addition, some of the methods do not require special dedicated equipment, and can be carried out with equipment that is always available in most research facilities. In addition, regarding the method that requires a special dedicated device, analysis can be easily entrusted to a specialist.
以下に、各発明を実施するための最良の実施形態を説明する。なお、本発明はこれらの実施の形態に何ら限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる様態で実施しうる。 The best mode for carrying out each invention will be described below. The present invention is not limited to these embodiments, and can be implemented in various ways without departing from the scope of the invention.
本発明において、核酸、塩基、塩基配列、遺伝子、遺伝型、野生型、ホモ、へテロ、ゲノムDNA、cDNA、トータルRNA、mRNA、イントロン、スプライシングドナー部位、ハイブリダイゼーション、プローブ、プライマー、タンパク質、アミノ酸、アミノ酸配列、コードの用語の定義は、現在、分子生物学、遺伝学、遺伝子工学等の分野で当業者が広く一般的に使用している意味と同じであることから、本明細書ではこれらの定義の説明を省略する。 In the present invention, nucleic acid, base, base sequence, gene, genotype, wild type, homo, hetero, genomic DNA, cDNA, total RNA, mRNA, intron, splicing donor site, hybridization, probe, primer, protein, amino acid The definitions of the terms of amino acid sequences and codes are the same as the meanings widely used by those skilled in the art in the fields of molecular biology, genetics, genetic engineering, etc. Explanation of the definition of is omitted.
実施形態1は、請求項1、3から9、12、23から30等に関するものである。
実施形態2は、請求項2から14、23から30等に関するものである。実施形態3は、請求項15、17から21、32から35等に関するものである。実施形態4は、請求項16から22、32から35等に関するものである。実施形態5は、請求項31等に関するものである。実施形態6は、請求項36等に関するものである。
The first embodiment relates to claims 1, 3 to 9, 12, 23 to 30, and the like.
The second embodiment relates to claims 2 to 14, 23 to 30, and the like. The third embodiment relates to claims 15, 17 to 21, 32 to 35, and the like. The fourth embodiment relates to claims 16 to 22, 32 to 35, and the like. The fifth embodiment relates to claim 31 and the like. The sixth embodiment relates to claim 36 and the like.
本実施形態の説明に入る前に、肺胞微石症の原因遺伝子の発見に関して説明しておく。本疾患は単純劣性遺伝子疾患であることが過去の研究結果から示唆されている(非特許文献3)。劣性疾患遺伝子を同定する方法としては、従来技術としてホモ接合体マッピング(Homozygosity mapping)法が知られている(非特許文献4)。しかし、家系解析を主体とするこの方法では、肺胞微石症のような稀少遺伝子疾患の原因遺伝子を同定することは困難であった。そこで、本発明者らはホモ接合体マッピング法の概念を拡張して新たにホモ接合体指紋法(Homozygosity fingerprinting法)を開発した。ホモ接合体指紋法の原理等に関しては、本発明者らが発明した特許出願中の「ホモ接合指紋法による同祖領域判定方法、同祖領域判定装置、及び遺伝子スクリーニング方法(特許文献1)」を参照されたい。 Prior to the description of the present embodiment, the discovery of a causative gene for alveolar microlithiasis will be described. Past research results suggest that this disease is a simple recessive genetic disease (Non-patent Document 3). As a method for identifying a recessive disease gene, a homozygosity mapping method is known as a conventional technique (Non-patent Document 4). However, it has been difficult to identify the causative genes of rare genetic diseases such as alveolar microlithiasis by this method, which is based on pedigree analysis. Therefore, the present inventors have expanded the concept of the homozygote mapping method and newly developed a homozygous fingerprint method. Regarding the principle of the homozygous fingerprint method, etc., a patent application invented by the present inventors “Homozygous region determination method, homoeologous region determination device, and gene screening method by homozygous fingerprint method (Patent Document 1)” Please refer to.
前記ホモ接合体指紋法により3人の肺胞微石症患者から得られた試料を用いてその原因遺伝子のスクリーニングを行った結果、本疾患の原因遺伝子は11.5Mb(Mb=100万塩基)の候補領域に存在することが判明した。当該候補領域には35個の遺伝子が含まれており、このうち25個は既知遺伝子、若しくはその機能が予測された遺伝子であった。本疾患と関連性が高いと考えられるカルシウムやリン酸の代謝に直接関与する遺伝子は、前記候補領域中ではヒトSLC34A2遺伝子のみであった。ヒトSLC34A2(Unigene Hs.479372)遺伝子は、ソリュート・キャリアー・ファミリー34(SLC34)メンバーの一つであり、ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質をコードしている。このタンパク質は主に細胞膜上でナトリウム依存的方法によりリン酸イオンの輸送に機能している膜タンパク質である(非特許文献5)。そこで、当該遺伝子を肺胞微石症の原因遺伝子の候補として着目して、前記肺胞微石症患者3人、及び健常人10人の当該遺伝子のゲノム塩基配列をそれぞれ決定した。その結果、健常人ではいずれも野生型の塩基配列と同じであったが、肺胞微石症患者では3人全員が当該遺伝子にホモ接合で改変を有していた。肺胞微石症患者から検出された改変の種類は、図1、及び図2に示す二種類であった。また、当該二種類の遺伝子の改変に基づくアミノ酸改変型タンパク質は、いずれもヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体としての活性を有さないことが判明した。以上の結果から、ヒトSLC34A2遺伝子が肺胞微石症の原因遺伝子であり、ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体の機能の失活が肺胞微石症の発症原因と関連することが明らかとなった(非特許文献8)。以下、本発明者らが発見した二種類の改変について詳細に説明する。 As a result of screening the causative gene using samples obtained from 3 alveolar microlithiasis patients by the homozygous fingerprint method, the causative gene of this disease was 11.5 Mb (Mb = 1 million bases) It was found to exist in the candidate area. The candidate region contains 35 genes, 25 of which were known genes or genes whose functions were predicted. The only gene directly involved in the metabolism of calcium and phosphate considered to be highly related to this disease was the human SLC34A2 gene in the candidate region. The human SLC34A2 (Unigene Hs. 479372) gene is one of the members of the Solute Carrier Family 34 (SLC34) and encodes a human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein. This protein is a membrane protein that functions to transport phosphate ions mainly on the cell membrane by a sodium-dependent method (Non-patent Document 5). Therefore, focusing on the gene as a candidate gene for the cause of alveolar microlithiasis, the genomic base sequences of the gene of the 3 patients with alveolar microlithiasis and 10 healthy individuals were determined. As a result, all of the healthy individuals had the same wild-type nucleotide sequence, but all three patients with alveolar microlithiasis had homozygous modifications to the gene. The types of alterations detected from alveolar microlithiasis patients were the two types shown in FIG. 1 and FIG. In addition, it was found that neither of the amino acid-modified proteins based on the modification of the two genes has activity as a human type IIb sodium-phosphate cotransporter. From the above results, it is clear that the human SLC34A2 gene is a causative gene for alveolar microlithiasis, and that the inactivation of the function of the human type IIb sodium-phosphate cotransporter is associated with the onset of alveolar microlithiasis. (Non-Patent Document 8). Hereinafter, two types of modifications discovered by the present inventors will be described in detail.
第一の改変は図1のAに示すような置換による改変であった。具体的には野生型の塩基配列(0101)において配列番号1の第13290位のTから第13304位のGまでの15塩基に相当する配列が、改変型(0102)では配列番号3で表される19塩基からなる配列(0103)に置き換わっていた。当該改変によりアミノ酸のフレームシフトが生じるため、野生型CDSの途中に停止コドンが現れる。その結果、配列番号2の第286位のイソロイシン以降が配列番号5で表される28アミノ酸に置換され、図1のBに示すように313アミノ酸からなるアミノ酸改変型ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質(0105)が生じる。当該改変型タンパク質は、野生型タンパク質(0104)のアミノ酸配列から予想される8つの膜貫通ドメイン(TM:transmembrane domain)のうちC末側に存在する5つを欠失している。本明細書では、以下、当該塩基配列の改変を改変A、改変Aにより生じるアミノ酸配列をアミノ酸改変Aとする。 The first modification was a modification by substitution as shown in FIG. Specifically, in the wild-type base sequence (0101), a sequence corresponding to 15 bases from T at position 13290 to G at position 13304 in SEQ ID NO: 1 is represented by SEQ ID NO: 3 in the modified type (0102). The 19-base sequence (0103) was replaced. Since this modification causes an amino acid frameshift, a stop codon appears in the middle of wild-type CDS. As a result, the amino acid after isoleucine at position 286 of SEQ ID NO: 2 was substituted with 28 amino acids represented by SEQ ID NO: 5, and as shown in FIG. Transporter protein (0105) is produced. The modified protein lacks five transmembrane domains (TM) present on the C-terminal side among eight transmembrane domains (TM) predicted from the amino acid sequence of the wild-type protein (0104). In the present specification, hereinafter, the modification of the base sequence is referred to as modification A, and the amino acid sequence generated by the modification A is referred to as amino acid modification A.
第二の改変も図2のAに示すような置換による改変であった。具体的には野生型の塩基配列(0201)において第8イントロンのスプライシングドナー部位(二重下線部)として表されるGTが、改変型(0202)ではATに置き換わる点突然変異を生じていた。この改変により、当該遺伝子の転写後、第8イントロンがmRNAスプライシングによって除去されなくなることから、図2のBに示すように、成熟mRNAは改変を有した第8イントロンが残された塩基配列(0203)となる。すなわち、これは配列番号1内で説明する当該遺伝子の野生型CDS(Cording sequence:アミノ酸コード配列)において、第14304位のTと第15670位のG間に配列番号4で表される塩基配列が挿入された状態と同様の配列となる。当該改変によりアミノ酸のフレームシフトが生じるため、配列番号4の塩基配列内に停止コドンが現れる。その結果、配列番号2の第350位のシステイン以降が配列番号6で表される10アミノ酸に置換され、図2のCで示すように359アミノ酸からなるアミノ酸改変型ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質が生じる。当該改変型タンパク質(0205)は野生型タンパク質(0204)のアミノ酸配列から予想される8つの膜貫通ドメインのうちC末側に存在する5つを欠失している。本明細書では、当該塩基配列の改変を改変B、改変Bにより生じるアミノ酸配列をアミノ酸改変Bとする。 The second modification was also a modification by substitution as shown in FIG. Specifically, in the wild type base sequence (0201), GT represented as the splicing donor site (double underlined portion) of the 8th intron had a point mutation that replaced AT in the modified type (0202). As a result of this modification, the 8th intron is not removed by mRNA splicing after transcription of the gene. As shown in FIG. 2B, the mature mRNA has a nucleotide sequence (0203) in which the modified 8th intron is left. ) That is, in the wild-type CDS (Cording sequence: amino acid coding sequence) of the gene described in SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 is present between T at position 14304 and G at position 15670. The arrangement is similar to the inserted state. Since this modification causes an amino acid frame shift, a stop codon appears in the base sequence of SEQ ID NO: 4. As a result, the cysteine after position 350 of SEQ ID NO: 2 was substituted with 10 amino acids represented by SEQ ID NO: 6, and an amino acid-modified human type IIb sodium-phosphate codon consisting of 359 amino acids as shown in FIG. Transporter proteins are produced. The modified protein (0205) lacks 5 of the 8 transmembrane domains predicted from the amino acid sequence of the wild-type protein (0204), present on the C-terminal side. In this specification, the modification of the base sequence is referred to as modification B, and the amino acid sequence generated by modification B is referred to as amino acid modification B.
ここで、配列番号1は、野生型ヒトSLC34A2遺伝子のゲノム上の全塩基配列(5'非翻訳領域、及び3'非翻訳領域を含む。)とそのコード領域に対応するアミノ酸配列を表している。前記エクソン及びイントロンの番号等の位置情報は配列表内に説明している。配列番号2は、野生型のヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質の全アミノ酸配列を表している。配列番号3は、前記改変Aにおいて置き換わる19塩基からなる配列を表している。配列番号4は、前記改変Bにおいてスプライシングドナー部位に点突然変異を有する第8イントロンの塩基配列を表している。配列番号5は、前記アミノ酸改変Aでアミノ酸改変をしたアミノ酸配列を表している。配列番号6は、前記アミノ酸改変Bでアミノ酸改変をしたアミノ酸配列を表している。 Here, SEQ ID NO: 1 represents the entire nucleotide sequence (including 5 ′ untranslated region and 3 ′ untranslated region) on the genome of the wild type human SLC34A2 gene and the amino acid sequence corresponding to the coding region. . Position information such as exon and intron numbers is described in the sequence listing. SEQ ID NO: 2 represents the entire amino acid sequence of wild-type human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein. SEQ ID NO: 3 represents a sequence consisting of 19 bases that replaces the modification A. SEQ ID NO: 4 represents the base sequence of the eighth intron having a point mutation at the splicing donor site in the modified B. SEQ ID NO: 5 represents an amino acid sequence obtained by amino acid modification with the amino acid modification A. SEQ ID NO: 6 represents an amino acid sequence obtained by amino acid modification with the amino acid modification B.
以下の実施形態は、上記の発見に基づいて発明されたものである。 The following embodiments have been invented based on the above findings.
<<実施形態1>> << Embodiment 1 >>
<実施形態1:概要> 実施形態1は、ヒト由来の核酸を抽出し、抽出した核酸に含まれ得る肺胞微石症の原因遺伝子ヒであるトSLC34A2遺伝子が既知の改変を有するかを検出することで肺胞微石症の発症可能性を判定する方法を基本とするものである。 <Embodiment 1: Overview> Embodiment 1 extracts a human-derived nucleic acid and detects whether the to SLC34A2 gene, which is a causative gene for alveolar microlithiasis, that can be contained in the extracted nucleic acid has a known modification This is based on a method for determining the possibility of developing alveolar microlithiasis.
<実施形態1:処理の流れ> 図3に実施形態1の処理の流れを例示する。まず、「核酸抽出工程」(S0301)で試料から適当な方法によってヒト由来の核酸を抽出する。次に、「遺伝子改変検出工程」(S0302)で前記核酸抽出工程で得られたヒト由来の核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列が、配列番号1で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変を有するかを検出する。以上の工程により得られた結果から肺胞微石症の発症可能性を判定するものである。以下、各工程について詳細に説明する。 <Embodiment 1: Process Flow> FIG. 3 illustrates a process flow of the first embodiment. First, in the “nucleic acid extraction step” (S0301), human-derived nucleic acid is extracted from a sample by an appropriate method. Next, the base sequence of the human SLC34A2 gene that can be contained in the human-derived nucleic acid obtained in the nucleic acid extraction step in the “gene modification detection step” (S0302) is determined based on the wild-type base sequence represented by SEQ ID NO: 1. It is detected whether it has a known modification derived from the modification. The onset possibility of alveolar microlithiasis is determined from the results obtained by the above steps. Hereinafter, each step will be described in detail.
「核酸抽出工程」(S0301)は、試料からヒト由来の核酸を抽出する工程である。試料は通常人体から得られるものであるが、ヒト以外の生物種で、かつヒト由来の核酸を含む形質転換体から得られるものであってもよい。試料はヒト一個体由来のものを使用する。ただし、本発明の方法を用いて二人以上の複数単位でヒトSLC34A2遺伝子の改変の有無を調べる場合にはこの限りではない。試料が人体から得られるものの場合、当該試料は採取した個体の核酸を抽出できればその種類や状態は問わない。例えば、血液、粘膜、皮膚、毛髪、爪のような人体を構成する組織の一部や、唾液、精液、膿、大便等のような人体より分泌、排泄されたものや、胎児を判定の対象とする場合には絨毛、又は羊水が該当する。また、試料の状態は採取直後一定期間培養されたもの(生きている細胞に限る)を用いてもよいし、採取後冷凍保存されたもの、若しくはホルマリン固定後にパラフィン包理切片標本として保存されたもの等を用いてもよい。核酸抽出工程で抽出される核酸の種類は、目的とするヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列情報を含み得るゲノムDNA、トータルRNA、mRNA、又はそれらに基づく核酸であることが好ましい。 The “nucleic acid extraction step” (S0301) is a step of extracting human-derived nucleic acid from a sample. The sample is usually obtained from the human body, but may be obtained from a transformant containing a human-derived nucleic acid and a human-derived nucleic acid. Use a sample derived from a single individual. However, this is not the case when the presence or absence of alteration of the human SLC34A2 gene is examined using two or more units using the method of the present invention. In the case where the sample is obtained from the human body, the type and state of the sample are not limited as long as the nucleic acid of the collected individual can be extracted. For example, a part of the tissue that constitutes the human body such as blood, mucous membrane, skin, hair, and nails, or that is secreted or excreted from the human body such as saliva, semen, pus, stool, etc. In this case, villus or amniotic fluid is applicable. The sample may be cultured for a certain period of time immediately after collection (limited to living cells), frozen after collection, or stored as a paraffin-embedded specimen after formalin fixation. You may use things. The type of nucleic acid extracted in the nucleic acid extraction step is preferably genomic DNA, total RNA, mRNA, or a nucleic acid based on them that can contain the nucleotide sequence information of the target human SLC34A2 gene.
「それらに基づく核酸」とは、ヒト由来のゲノムDNA、トータルRNA、又はmRNAに基づいて加工された核酸を意味する。例えば、mRNAの逆転写反応によって得られるcDNAや、ゲノムDNA、cDNA、若しくはESTの全部又は一部をプラスミドやウイルス等のベクター内に組み込んだクローンDNA等である。 “Nucleic acid based on them” means a nucleic acid processed based on human-derived genomic DNA, total RNA, or mRNA. For example, cDNA obtained by reverse transcription reaction of mRNA, genomic DNA, cDNA, or cloned DNA obtained by incorporating all or part of EST into a vector such as a plasmid or virus.
「それらに基づく核酸」とは、ヒト由来のゲノムDNA、トータルRNA、又はmRNAに基づいて加工された核酸を意味する。例えば、mRNAの逆転写反応によって得られるcDNAや、ゲノムDNA、cDNA、若しくはESTの全部又は一部をプラスミドやウイルス等のベクター内に組み込んだクローンDNA等が該当する。 “Nucleic acid based on them” means a nucleic acid processed based on human-derived genomic DNA, total RNA, or mRNA. For example, cDNA obtained by reverse transcription reaction of mRNA, clone DNA in which all or part of genomic DNA, cDNA, or EST is incorporated into a vector such as a plasmid or virus is applicable.
核酸抽出工程でトータルRNA、又はmRNAを抽出する場合には、試料は被験者の肺組織、喀痰、又は胸水であることが好ましい。これは、肺胞微石症の原因遺伝子であるヒトSLC34A2遺伝子が肺で最も多く発現していることに基づく(非特許文献6)。 When total RNA or mRNA is extracted in the nucleic acid extraction step, the sample is preferably lung tissue, sputum or pleural effusion of the subject. This is based on the fact that the human SLC34A2 gene, which is a causative gene for alveolar microlithiasis, is most frequently expressed in the lung (Non-patent Document 6).
細胞から核酸を抽出する方法は、目的とする核酸を試料から抽出できる方法であれば特に限定しない。しかし、通常は図4に示すように(A)細胞を破砕するステップ(S0401)、(B)タンパク質を除去するステップ(S0402)、(C)目的以外の核酸を除去するステップ(S0403)を経る方法が一般的である。以下、細胞から核酸を抽出する方法の一例として、この方法の各ステップについて説明する。 The method for extracting nucleic acid from cells is not particularly limited as long as the target nucleic acid can be extracted from a sample. However, usually, as shown in FIG. 4, (A) a step of disrupting cells (S0401), (B) a step of removing proteins (S0402), and (C) a step of removing non-target nucleic acids (S0403). The method is common. Hereinafter, each step of this method will be described as an example of a method for extracting nucleic acid from cells.
(A)細胞を破砕するステップ(S0401)は、採取した細胞の膜構造を破壊して細胞質等の細胞内容物を流出させるステップである。細胞の膜構造の破壊は、例えば界面活性剤による細胞膜脂質構造の化学的破壊、又はプロテイナーゼK等のタンパク質分解酵素と界面活性剤との併用による酵素化学的破壊によって達成することができる。 (A) The step of disrupting cells (S0401) is a step of destroying the membrane structure of the collected cells and causing cell contents such as cytoplasm to flow out. The destruction of the cell membrane structure can be achieved, for example, by chemical destruction of the cell membrane lipid structure by a surfactant, or by enzymatic chemical destruction by the combined use of a protease and a surfactant such as proteinase K.
(B)タンパク質を除去するステップ(S0402)は、細胞内容物が溶解した細胞溶解液中に含まれるタンパク質を変性処理して除去するステップである。タンパク質の変性処理方法は、例えば、フェノール処理によって達成することができる。 (B) The step of removing protein (S0402) is a step of denaturing and removing the protein contained in the cell lysate in which the cell contents are dissolved. The protein denaturation treatment method can be achieved by, for example, phenol treatment.
(C)目的以外の核酸を除去するステップ(S0403)は、前記タンパク質を除去するステップで得られたサンプル中に含まれる核酸から目的以外の核酸を除去し、目的の核酸を精製するステップである。ここで除去する核酸は、DNA、又はRNAのいずれか一方である。目的以外の核酸を除去する方法は、RNA分解酵素、又はDNA分解酵素のような一方の核酸のみを特異的に分解する核酸分解酵素を用いた酵素処理等によって達成することができる。 (C) The step of removing non-target nucleic acid (S0403) is a step of removing the non-target nucleic acid from the nucleic acid contained in the sample obtained in the step of removing the protein and purifying the target nucleic acid. . The nucleic acid to be removed here is either DNA or RNA. The method of removing nucleic acids other than the target can be achieved by an enzyme treatment using a nucleolytic enzyme that specifically degrades only one of the nucleic acids, such as an RNA degrading enzyme or a DNA degrading enzyme.
試料から核酸を抽出する場合には、前記方法以外にも市販のキットを使用すると便利である。キットを使用する際は試料の種類に適したタイプのキットを使用する。また、キットを使用する際の手順は当該キットに添付されているプロトコル等に従えばよい。 When extracting nucleic acid from a sample, it is convenient to use a commercially available kit in addition to the above method. When using a kit, use a kit of the type appropriate for the type of sample. The procedure for using the kit may be in accordance with the protocol attached to the kit.
ところで、核酸抽出工程で抽出された核酸の量が、以降の工程で必要とされる量に足りない場合がしばしばある。このような場合には以降の工程を行う前に必要に応じて核酸を増幅しておくとよい。増幅する方法は、目的とする核酸の領域が増幅できれば特に限定はされない。例えば、遺伝子クローニング法であってもよいが、核酸増幅法が迅速、かつ簡易な点から便利である。核酸増幅法とは、増幅用プライマーを用いて特定の核酸の領域を酵素反応により増幅する方法である。例えば、PCR法、ICAN法、LAMP法、又はNASBA法が該当する。このうちPCR法は、医学、分子生物学の分野において現在世界中で最も広く浸透している方法であり、様々な応用技術も知られていることから便利である。 By the way, the amount of nucleic acid extracted in the nucleic acid extraction step is often insufficient for the amount required in the subsequent steps. In such a case, it is preferable to amplify the nucleic acid as necessary before performing the subsequent steps. The amplification method is not particularly limited as long as the target nucleic acid region can be amplified. For example, a gene cloning method may be used, but a nucleic acid amplification method is convenient because it is quick and simple. The nucleic acid amplification method is a method of amplifying a specific nucleic acid region by an enzymatic reaction using an amplification primer. For example, the PCR method, ICAN method, LAMP method, or NASBA method is applicable. Among these methods, the PCR method is the most widely used method in the fields of medicine and molecular biology all over the world, and is convenient because various application techniques are known.
「遺伝子改変検出工程」(S0302)は、前記核酸抽出工程で抽出された核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子(以下、改変検出遺伝子とする)の塩基配列が、配列番号1で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変を有するかを検出する工程である。 The “gene modification detection step” (S0302) is a wild type wherein the nucleotide sequence of the human SLC34A2 gene (hereinafter referred to as a modification detection gene) that can be contained in the nucleic acid extracted in the nucleic acid extraction step is represented by SEQ ID NO: 1. It is the process of detecting whether it has a known modification derived from the modification from the base sequence of.
本実施形態において「改変」とは、改変検出遺伝子の塩基配列が野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列と一致しない状態を意味する。野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列とは、配列番号1で表されるゲノム上の塩基配列に基づくものである。「ゲノム上の塩基配列に基づく」とは、配列番号1で表されるゲノム上の塩基配列が転写されて、スプライシングされた成熟mRNAの野生型塩基配列、及びヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体のアミノ酸をコードする野生型CDSも含むことを意味する。また、本実施形態の改変は、特にホモ接合により肺胞微石症を発症する実質的な改変を意味する。即ち、ホモ接合により野生型ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体としての機能を有しないタンパク質のみが産生される場合、又は当該共輸送体として機能をする上で必要なだけの野生型のタンパク質量が産生されない場合等が該当する。 In the present embodiment, “modified” means a state in which the base sequence of the modified detection gene does not match the base sequence of the wild-type human SLC34A2 gene. The base sequence of the wild type human SLC34A2 gene is based on the base sequence on the genome represented by SEQ ID NO: 1. “Based on the base sequence on the genome” means that the base sequence on the genome represented by SEQ ID NO: 1 is transcribed and spliced into the wild-type base sequence of mature mRNA, and human IIb type sodium-phosphate co-transport It is also meant to include wild-type CDS that encodes body amino acids. In addition, the modification of the present embodiment means a substantial modification that causes alveolar microlithiasis particularly by homozygosity. That is, when only a protein having no function as a wild-type human type IIb sodium-phosphate cotransporter is produced by homozygote, or only a wild-type protein necessary for functioning as the cotransporter This is the case when the amount is not produced.
本実施形態において検出すべき改変の様態には、例えば、塩基の欠失、置換、又は付加がある。「欠失」とは、改変検出遺伝子の塩基配列を野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列と比較した時に、野生型遺伝子の塩基配列から一以上の塩基が失われている改変を言う。また、本実施形態において「置換」とは、改変検出遺伝子の塩基配列を野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列と比較した時に、野生型遺伝子の塩基配列から全部でない一以上の連続した塩基が他の異なる塩基と置き換えられた改変を言う。例えば、点突然変異、逆位、又は欠失を伴う重複、挿入、若しくは転座が該当する。さらに、本実施形態において「付加」とは、改変検出遺伝子の塩基配列をその野生型遺伝子の塩基配列と比較した時に、野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列では見られない位置に一以上の連続した塩基が新たに付加されている改変を言う。例えば、欠失を伴わない挿入、重複、又は転座が該当する。 Examples of the modification to be detected in the present embodiment include base deletion, substitution, or addition. “Deletion” refers to a modification in which one or more bases are lost from the base sequence of the wild-type gene when the base sequence of the modified detection gene is compared with the base sequence of the wild-type human SLC34A2 gene. In the present embodiment, “substitution” means that when the base sequence of the modified detection gene is compared with the base sequence of the wild-type human SLC34A2 gene, one or more consecutive bases other than all of the base sequence of the wild-type gene A modification that is replaced with a different base. For example, duplications, insertions, or translocations with point mutations, inversions, or deletions. Furthermore, in this embodiment, “addition” means that one or more consecutive positions are not found in the base sequence of the wild-type human SLC34A2 gene when the base sequence of the modified detection gene is compared with the base sequence of the wild-type gene. A modification in which a base is newly added. For example, an insertion, duplication, or translocation without deletion is applicable.
本実施形態において「既知の改変」とは、肺胞微石症の患者より得られるヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列上に生じた改変であって、かつ日本国内又は外国において頒布された刊行物に記載された改変、あるいは電気通信回線を通じて公知となった肺胞微石症を発症し得る改変を意味する。当該既知の改変の具体的な例としては前述の改変A、又はBが該当する。 In this embodiment, the “known modification” is a modification that occurs on the base sequence of the human SLC34A2 gene obtained from a patient with alveolar microlithiasis and is described in a publication distributed in Japan or abroad. Or an alteration that can cause alveolar microlithiasis that has become publicly known through a telecommunication line. The above-mentioned modification A or B corresponds to a specific example of the known modification.
本実施形態において「検出すべき既知の改変」は、配列番号1で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変のものを含む。「改変に由来するもの」とは、ゲノム塩基配列上の改変部位だけでなく、その改変に起因して発生する改変の全領域を言う。例えば、改変Bで検出すべき既知の改変は、検出の対象となる核酸がmRNAの場合には図2のBに示す第8イントロンのスプライシングドナー部位の1塩基だけでなく、成熟mRNAに残されている当該改変された塩基を有する第8イントロンの全領域が該当する。 In the present embodiment, the “known modification to be detected” includes a known modification derived from a modification from the wild-type base sequence represented by SEQ ID NO: 1. The term “derived from modification” refers not only to the modification site on the genome base sequence, but also to the entire region of modification that occurs due to the modification. For example, when the nucleic acid to be detected is mRNA, the known modification to be detected by modification B is left not only in the base of the splicing donor site of the eighth intron shown in FIG. 2B but also in the mature mRNA. This corresponds to the entire region of the 8th intron having the modified base.
当該工程で既知の改変を検出する方法は、例えば、(1)プローブを用いたハイブリダイゼーションによる検出方法であってもよいし、(2)塩基配列の決定による検出方法であってもよいし、(3)核酸増幅法を利用した増幅産物の比較による検出方法であってもよいし、又は(4)多型マーカーを用いた方法であってもよい。これら4つの検出方法に関して、以下で説明する。 The method for detecting a known modification in this step may be, for example, (1) a detection method by hybridization using a probe, or (2) a detection method by determination of a base sequence, (3) A detection method based on comparison of amplification products using a nucleic acid amplification method may be used, or (4) a method using a polymorphic marker may be used. These four detection methods will be described below.
(1)プローブを用いたハイブリダイゼーションによる検出方法について説明する。当該方法は、既知の改変の塩基配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして、ハイブリダイゼーションにより既知の改変の有無を検出する方法である。例えば、ゲル・ブロッティング法を用いる方法であってもよいし、核酸が固定された基板を用いる方法であってもよい。ゲル・ブロッティング法を用いる方法の具体例としてはサザンブロット・ハイブリダイゼーション法、ノザンブロット・ハイブリダイゼーション法等が該当する。核酸が固定された基板を用いる方法の具体例としてはマイクロアレイ、又はDNAチップを用いた解析方法等が該当する。 (1) A detection method by hybridization using a probe will be described. This method is a method for detecting the presence or absence of a known modification by hybridization using a polynucleotide having a base sequence of a known modification as a probe. For example, a method using a gel blotting method or a method using a substrate on which a nucleic acid is immobilized may be used. Specific examples of the method using the gel blotting method include Southern blot hybridization method and Northern blot hybridization method. Specific examples of the method using a substrate on which a nucleic acid is immobilized include an analysis method using a microarray or a DNA chip.
本発明で用いる「ポリヌクレオチド」は、通常の定義の範囲内だけではなく、数塩基〜20塩基で構成されるオリゴヌクレオチドも含むものとする。また、当該ポリヌクレオチドの構成は、DNA、RNA、LNA等やそれらの組み合わせから構成されていてもよい。 The “polynucleotide” used in the present invention includes not only a normal definition but also an oligonucleotide composed of several bases to 20 bases. Moreover, the structure of the said polynucleotide may be comprised from DNA, RNA, LNA etc. and those combinations.
プローブとして用いられるポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1で表される野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列からの改変に由来する塩基配列の全部、又は連続する少なくとも14塩基以上を一部として有する配列である。例えば、改変Aの場合には配列番号3で表される19塩基配列の全部か、又は当該19塩基のうち連続する14塩基以上の18塩基以下の配列を有していればよい。また、改変Bの場合には配列番号4で表される塩基配列の全部か、又は当該塩基配列のうち連続する14塩基以上の1364塩基以下の配列を有していればよい。当該プローブとして用いられるポリヌクレオチドの塩基配列は、検出の対象となる核酸がDNAである場合にはセンス鎖側、アンチセンス鎖側を問わないが、検出する核酸がRNAである場合には、アンチセンス鎖側の配列を使用する。 The base sequence of the polynucleotide used as the probe is the entire base sequence derived from modification from the base sequence of the wild-type human SLC34A2 gene represented by SEQ ID NO: 1, or a sequence having at least 14 consecutive bases as a part It is. For example, in the case of modification A, it is sufficient if it has the entire 19 base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a sequence of 14 bases or more and 18 bases or less of the 19 bases. Further, in the case of modification B, it is sufficient if it has the entire base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a sequence of 1464 or more and 1364 bases or less in the base sequence. The base sequence of the polynucleotide used as the probe may be the sense strand side or the antisense strand side when the nucleic acid to be detected is DNA, but when the nucleic acid to be detected is RNA, the nucleotide sequence is The sequence on the sense strand side is used.
プローブとして用いられるポリヌクレオチドは修飾されていてもよい。例えば、放射性核種、発色性物質、若しくは蛍光物質等による標識や、消光物質、化学基、若しくは糖鎖の付加等が該当する。一のプローブは、同種、又は異なる種類の修飾を複数受けていても構わない。修飾箇所は問わない。例えば、5'末端部であってもよいし、それ以外であってもよい。また、当該ポリヌクレオチドの末端若しくは内部には制限酵素部位、又はタグ配列等の修飾的な配列が含まれていてもよい。 The polynucleotide used as the probe may be modified. For example, labeling with a radionuclide, a chromogenic substance, or a fluorescent substance, addition of a quenching substance, a chemical group, or a sugar chain is applicable. One probe may be subjected to a plurality of modifications of the same type or different types. The modification part does not matter. For example, it may be the 5 ′ end portion or any other portion. Further, the end or the inside of the polynucleotide may contain a restriction enzyme site or a modified sequence such as a tag sequence.
プローブとして用いられるポリヌクレオチドは、支持体に固定されていてもよい。支持体は核酸が直接結合できる素材、又は核酸が結合する素材でコーティングされた素材であれば、形状、サイズは問わない。例えばシリカで構成された微粒子であってもよいし、ガラスで構成された基板であってもよいし、有機高分子ポリマー鎖で構成された繊維であってもよい。ポリヌクレオチドの固定方法は、例えば前記素材上でポリヌクレオチドを直接合成する方法(特許文献2)や、予め調製されたポリヌクレオチドを後から素材に担持させる方法(特許文献3)等が利用できる。 The polynucleotide used as a probe may be fixed to a support. The support is not particularly limited in shape and size as long as it is a material to which nucleic acid can be directly bound or a material coated with a material to which nucleic acid is bound. For example, it may be a fine particle composed of silica, a substrate composed of glass, or a fiber composed of an organic polymer chain. As a method for immobilizing a polynucleotide, for example, a method of directly synthesizing a polynucleotide on the material (Patent Document 2), a method of supporting a previously prepared polynucleotide on the material later (Patent Document 3), or the like can be used.
当該方法により、ハイブリダイゼーションの結果がポジティブであった場合には、試料に含まれるヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列は、既知の改変に基づく塩基配列を有していると判定される。 When the hybridization result is positive by this method, the base sequence of the human SLC34A2 gene contained in the sample is determined to have a base sequence based on a known modification.
(2)塩基配列の決定による検出方法について説明する。当該方法は、前記核酸抽出工程で抽出された核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子において既知の改変に由来する塩基配列が存在し得る領域の全部又は一部の塩基配列を決定することにより改変の有無を検出する方法である。塩基配列の決定方法に関しては特に限定しない。現在世界で最も広く使用されている核酸増幅法に基づく方法とダイデオキシ法を組み合わせた方法が便利である。各社からこの原理に基づいた専用の試薬や自動塩基配列読取機(シーケンサー)等が市販されており、迅速性、簡便性の点からも非常に便利である。 (2) A detection method based on determination of a base sequence will be described. In this method, the human SLC34A2 gene that can be contained in the nucleic acid extracted in the nucleic acid extraction step determines the presence or absence of the modification by determining the whole or part of the region where the base sequence derived from a known modification can exist. It is a method of detecting. The method for determining the base sequence is not particularly limited. A method combining the method based on the nucleic acid amplification method currently most widely used in the world and the dideoxy method is convenient. Dedicated reagents and automatic base sequence readers (sequencers) based on this principle are commercially available from various companies, which is very convenient in terms of speed and simplicity.
当該検出方法では、鋳型となる核酸、プライマーとしてのポリヌクレオチド、及び合成DNA鎖の原料となるdNTP(dATP、dGTP、dTTP、dCTP)等の核酸が必要である。 The detection method requires a nucleic acid as a template, a polynucleotide as a primer, and a nucleic acid such as dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) as a raw material for a synthetic DNA strand.
鋳型となる核酸は前記核酸抽出工程で得られたゲノムDNA、若しくはcDNAを使用することが好ましい。当該鋳型となる核酸がRNAの場合には、一旦逆転写反応によってcDNAに変換したものを用いる。鋳型となる核酸は必要に応じて増幅してもよい。ダイデオキシ法を用いた配列決定法の場合には、dNTPと共にddNTP(ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP)を加えておく。ddNTPは、放射性核種、蛍光物質等で修飾されていてもよい。 It is preferable to use the genomic DNA or cDNA obtained in the nucleic acid extraction step as the template nucleic acid. When the nucleic acid used as the template is RNA, one that has been converted into cDNA by reverse transcription is used. The template nucleic acid may be amplified as necessary. In the case of a sequencing method using the dideoxy method, ddNTP (ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP) is added together with dNTP. The ddNTP may be modified with a radionuclide, a fluorescent substance, or the like.
プライマーとしてのポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1で表される野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列からの改変に由来する塩基配列の全部、又は一部の塩基配列を決定でき、かつ当該改変に対応する野生型遺伝子の塩基配列が検出できない領域であればいずれの塩基配列であってもよい。例えば、改変Aの場合、プライマーとして用いられるポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号3で表される19塩基配列の全部とすることができる。 The nucleotide sequence of the polynucleotide as a primer can determine all or part of the nucleotide sequence derived from the modification from the nucleotide sequence of the wild-type human SLC34A2 gene represented by SEQ ID NO: 1, and Any base sequence may be used as long as the base sequence of the corresponding wild type gene cannot be detected. For example, in the case of modification A, the base sequence of the polynucleotide used as a primer can be the entire 19 base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
プライマーとしてのポリヌクレオチドの塩基配列の向きは、鋳型となる核酸のセンス鎖側、アンチセンス鎖側、又は両鎖を問わない。結果の正確性を期する点においては両鎖にデザインし、両方の鎖の塩基配列を決定することが好ましい。 The orientation of the base sequence of the polynucleotide as a primer may be the sense strand side, the antisense strand side, or both strands of the nucleic acid serving as the template. In view of the accuracy of the results, it is preferable to design both strands and determine the base sequences of both strands.
プライマーとしてのポリヌクレオチドの塩基の長さは、18から100塩基の範囲内であればよいが、そのうち18から80塩基はヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列の全部、又は連続する一部であることが好ましい。 The length of the base of the polynucleotide as a primer may be in the range of 18 to 100 bases, but 18 to 80 bases thereof are preferably all or part of the base sequence of the human SLC34A2 gene. .
プライマーとして用いられるポリヌクレオチドは修飾されていてもよい。例えば、放射性核種、発色性物質、若しくは蛍光物質等による標識や、消光物質、化学基、若しくは糖鎖の付加等が該当する。一のプライマーは、同種、又は異なる種類の修飾を複数受けていても構わない。修飾箇所は問わない。例えば、5'末端部であってもよいし、それ以外であってもよい。 The polynucleotide used as a primer may be modified. For example, labeling with a radionuclide, a chromogenic substance, or a fluorescent substance, addition of a quenching substance, a chemical group, or a sugar chain is applicable. One primer may be subjected to a plurality of modifications of the same type or different types. The modification part does not ask | require. For example, it may be the 5 ′ end portion or any other portion.
当該方法によって決定された塩基配列中に改変が検出された場合には、試料に含まれるヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列は、既知の改変に基づく塩基配列を有していると判定される。 When a modification is detected in the base sequence determined by the method, it is determined that the base sequence of the human SLC34A2 gene contained in the sample has a base sequence based on a known modification.
(3)核酸増幅法を利用した増幅産物による検出方法について説明する。当該方法は、改変型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列を有する核酸増幅産物の増幅の有無として検出する方法である。当該方法は、増幅用プライマーをデザインする際に目的とする改変型ヒトSLC34A2遺伝子のみが増幅されるような塩基配列を選択する。例えば、一組の増幅用プライマーのうち、一方の増幅用プライマーの塩基配列の全てが改変型遺伝子特異的な塩基配列になるようにデザインすれば、当該一組の増幅用プライマーは当該改変型が存在する場合のみ増幅産物が得られる。また、本発明者らが開発したPNA−LNA−PCR clamp法(特許文献4、非特許文献7)を使用すれば改変型遺伝子の改変箇所を特異的に検出することができるので便利である。 (3) A detection method using an amplification product using a nucleic acid amplification method will be described. This method is a method for detecting the presence or absence of amplification of a nucleic acid amplification product having the base sequence of the modified human SLC34A2 gene. In this method, a base sequence is selected such that only the target modified human SLC34A2 gene is amplified when designing primers for amplification. For example, if one of the amplification primers is designed so that all of the base sequences of one of the amplification primers have a modified gene-specific base sequence, the pair of amplification primers has the modified type. An amplification product is obtained only if present. Further, if the PNA-LNA-PCR clamp method developed by the present inventors (Patent Document 4, Non-Patent Document 7) is used, it is convenient because the modified site of the modified gene can be specifically detected.
当該方法により、ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列を有する核酸増幅産物が増幅された場合には、試料に含まれるヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列は、既知の改変に基づく塩基配列を有していると判定される。 When a nucleic acid amplification product having the base sequence of human SLC34A2 gene is amplified by this method, it is determined that the base sequence of human SLC34A2 gene contained in the sample has a base sequence based on a known modification. The
(4)最後に、多型マーカーを用いた方法について説明する。当該方法は、改変型のヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列上に特異的に存在し得るDNAの多型マーカーを利用して、当該多型マーカーの有無から改変を検出する方法である。 (4) Finally, a method using a polymorphic marker will be described. This method is a method for detecting a modification from the presence or absence of the polymorphic marker using a polymorphic marker of DNA that can specifically exist on the base sequence of the modified human SLC34A2 gene.
「多型」とはDNA上の塩基の違いを言い、ある塩基の変化が人口中1%以上の頻度で存在しているものと定義されているが、本発明においては、野生型と改変型との塩基配列の間で塩基の違いのあるものをすべて多型とする。例えば、SNP(Single Nucleitide Polymorphism)、マイクロサテライト、VNTR(Variable Nucleotide Tandem Repeat)、又はRFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)等が該当する。 “Polymorphism” refers to a difference in bases on DNA, and it is defined that a change of a certain base is present at a frequency of 1% or more in the population. In the present invention, a wild type and a modified type are defined. All polymorphisms that differ in nucleotide sequence between and For example, SNP (Single Nucleide Polymorphism), microsatellite, VNTR (Variable Nucleotide Tandem Repeat), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), and the like are applicable.
多型マーカーとは、特定の多型をマーカー(標識)として用いたものである。多型マーカーを用いた方法は、予め改変の検出に用いる改変型ヒトSLC34A2遺伝子に特異的な多型マーカーを選定しておく必要がある。選定した多型マーカーがSNP、マイクロサテライト、VNTRである場合には、検出する対象が改変に由来する塩基配列か、若しくは改変型遺伝子に特異的な多型マーカーの違いかであって検出方法は前記(1)のハイブリダイゼーションによる検出方法、又は前記(2)の塩基配列の決定による検出方法と同様の方法でよい。したがって、当該多型マーカーを用いた検出方法は、前記二つの方法のいずれかで検出された改変検出遺伝子の改変を確認するための方法として併用されてもよい。 The polymorphic marker is a marker using a specific polymorphism as a marker (label). In the method using a polymorphic marker, it is necessary to select a polymorphic marker specific for the modified human SLC34A2 gene used for detection of the modification in advance. When the selected polymorphic marker is SNP, microsatellite, or VNTR, whether the target to be detected is a base sequence derived from modification or a polymorphic marker specific to the modified gene, and the detection method is The same method as the detection method by hybridization of (1) or the detection method by determination of the base sequence of (2) may be used. Therefore, the detection method using the polymorphic marker may be used in combination as a method for confirming the modification of the modified detection gene detected by either of the two methods.
RFLPを用いた検出方法は、改変型ヒトSLC34A2遺伝子に特異的な制限酵素部位が多型マーカーとして存在する場合に使用できる方法である。当該制限酵素部位を含む塩基領域を前記(3)の核酸増幅法に準じた方法によって増幅する。得られた増幅産物を当該制限酵素で切断処理し、切断の有無によって改変の有無を検出できる。 The detection method using RFLP is a method that can be used when a restriction enzyme site specific to the modified human SLC34A2 gene is present as a polymorphic marker. The base region containing the restriction enzyme site is amplified by a method according to the nucleic acid amplification method (3). The obtained amplification product is cleaved with the restriction enzyme, and the presence or absence of modification can be detected by the presence or absence of cleavage.
当該方法により、改変型遺伝子に特異的な多型マーカーが検出された場合には、試料に含まれるヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列は、既知の改変に基づく塩基配列を有していると判定される。 When a polymorphic marker specific to the modified gene is detected by this method, the base sequence of the human SLC34A2 gene contained in the sample is determined to have a base sequence based on a known modification. .
当該遺伝子改変検出工程は、業者に委託して行ってもよい。特に前記マイクロアレイ、又はDNAチップを用いた解析方法は、本発明用の基板作成のための技術、労力、コストを考慮するとマイクロアレイやDNAチップの受託解析サービスを行っている専門業者を利用する方が便利である。また、塩基配列受託サービスを行っている業者も多数存在するのでこちらも利用できる。 The genetic modification detection step may be performed by a contractor. In particular, the analysis method using the microarray or the DNA chip should use a specialized contractor that provides a contract analysis service for the microarray or the DNA chip in consideration of the technology, labor, and cost for producing the substrate for the present invention. Convenient. In addition, there are many companies that offer nucleotide sequence trust services, so you can also use them.
本実施形態では、既知の複数の改変型について検証することが望ましい。最も望ましくは既知の全ての改変型について検出することである。例えば、改変Aのみを検出するのではなく、改変Aと改変Bを検出することである。 In the present embodiment, it is desirable to verify a plurality of known modified types. Most preferably, all known variants are detected. For example, instead of detecting only the modification A, the modification A and the modification B are detected.
本発明において「肺胞微石症の発症」とは、肺胞微石症の自覚症状である咳、呼吸困難等の呼吸器症状、あるいは呼吸不全等の症状が現れることを意味する。したがって、肺胞内の微石形成やその蓄積等が生じていても無自覚で進行する症状については、本発明では肺胞微石症の発症として考慮しない。 In the present invention, “onset of alveolar microlithiasis” means that symptoms such as coughing, respiratory symptoms such as dyspnea, or respiratory failure appear as subjective symptoms of alveolar microlithiasis. Therefore, the present invention does not consider symptoms that progress unconsciously even if microlith formation or accumulation in the alveoli occurs, as the onset of alveolar microlithiasis.
<実施形態1の効果> 本実施形態によれば、被験者のヒトSLC34A2遺伝子に肺胞微石症を発症し得る既知の改変が存在するかを容易に判定できる。当該遺伝子に既知の改変が検出された場合には、当該被験者は肺胞微石症が未発症であっても「今後少なくとも50%の確率で発症する可能性を有する。」と判定できる。また、被験者の臨床症状から肺胞微石症であると診断された場合、ヒトSLC34A2遺伝子の既知の改変を確認することで当該疾患であることを遺伝子レベルで確定できる。 <Effect of Embodiment 1> According to the present embodiment, it is possible to easily determine whether there is a known modification that can cause alveolar microlithiasis in the human SLC34A2 gene of the subject. If a known modification is detected in the gene, the subject can be determined as “has a possibility of developing with a probability of at least 50% in the future” even if alveolar microlithiasis has not yet occurred. Moreover, when it is diagnosed as alveolar microlithiasis from the clinical symptom of the subject, it can be confirmed at the gene level that the disease is concerned by confirming a known modification of the human SLC34A2 gene.
<<実施形態2>> << Embodiment 2 >>
<実施形態2:概要> 実施形態2はヒト由来の核酸を抽出し、抽出した核酸に含まれ得る肺胞微石症の原因遺伝子SLC34A2の塩基配列が、配列番号1で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出することで、抽出された核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型が、野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する方法を基本とするものである。 <Embodiment 2: Overview> In Embodiment 2, a human-derived nucleic acid is extracted, and the base sequence of the alveolar microlithiasis causal gene SLC34A2 that can be contained in the extracted nucleic acid is a wild-type represented by SEQ ID NO: 1. By detecting whether the nucleotide sequence has been modified, the genotype of the human SLC34A2 gene that can be contained in the extracted nucleic acid is wild-type homo, modified homo, wild-type and modified hetero, or modified hetero It is based on the method of determining which one is.
<実施形態2:処理の流れ> 図5に実施形態2の処理の流れを例示する。まず、「核酸抽出工程」(S0501)で試料から適当な方法によってヒト由来の核酸を抽出する。次に、「遺伝子改変検出工程」(S0502)で前記核酸抽出工程にて得られた改変検出遺伝子に関して、その塩基配列が配列番号1で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する。最後に、「遺伝型判定工程」(S0503)で、前記遺伝子改変検出工程にて得られた結果から試料を提供した被験者のヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型を判定する。 <Second Embodiment: Process Flow> FIG. 5 illustrates a process flow of the second embodiment. First, in the “nucleic acid extraction step” (S0501), human-derived nucleic acid is extracted from a sample by an appropriate method. Next, in the “gene modification detection step” (S0502), it is detected whether the nucleotide sequence of the modification detection gene obtained in the nucleic acid extraction step has been modified from the wild-type nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. . Finally, in the “genotype determination step” (S0503), the genotype of the human SLC34A2 gene of the subject who provided the sample is determined from the result obtained in the genetic modification detection step.
本実施形態のうち「核酸抽出工程」(S0501)は実施形態1の「核酸抽出工程」(S0301)と同様であることからその説明は省略する。また、「遺伝子改変検出工程」(S0502)も実施形態1の「遺伝子改変検出工程」(S0501)を基本としていることから、ここでは本実施形態に特徴的な点についてのみ説明をする。さらに、「遺伝型判定工程」(S0503)は本実施形態に特徴的な工程であることから、以下で詳細に説明する。 In the present embodiment, the “nucleic acid extraction step” (S0501) is the same as the “nucleic acid extraction step” (S0301) of the first embodiment, and thus the description thereof is omitted. Since the “gene modification detection step” (S0502) is also based on the “gene modification detection step” (S0501) of the first embodiment, only the characteristic points of this embodiment will be described here. Furthermore, since the “genotype determination step” (S0503) is a step characteristic of the present embodiment, it will be described in detail below.
本実施形態の「遺伝子改変検出工程」(S0502)で特徴的な点は、実施形態1が改変検出遺伝子の塩基配列が既知の改変を有するかを検出することであったのに対して、本実施形態は改変検出遺伝子の塩基配列が配列番号1で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する点である。即ち、既知の改変を有するかを検出するだけでなく、改変を有しないことも検出する点にある。 The characteristic point of the “gene modification detection step” (S0502) of the present embodiment is that the first embodiment detects whether the base sequence of the modification detection gene has a known modification, whereas this The embodiment is to detect whether the base sequence of the modified detection gene is modified from the wild-type base sequence represented by SEQ ID NO: 1. That is, not only is it detected whether there is a known modification, but it is also detected that there is no modification.
本実施形態における「改変」、改変の様態、「既知の改変」、「改変に由来するもの」、そして「ポリヌクレオチド」等の定義については実施形態1と同様である。 The definitions of “modification”, modification mode, “known modification”, “derived from modification”, “polynucleotide” and the like in the present embodiment are the same as those in the first embodiment.
当該工程で既知の改変を検出する方法も、実施形態1の遺伝子改変検出工程を基本とする。即ち、(1)プローブを用いたハイブリダイゼーションによる検出方法であってもよいし、(2)塩基配列の決定による検出方法であってもよいし、(3)核酸増幅法を利用した増幅産物の比較による検出方法であってもよいし、又は(4)多型マーカーを用いた方法であってもよい。以下、各方法において本実施形態に特徴的な点について説明する。その他の点に関しては、実施形態1と同様であるのでその説明は省略する。 The method for detecting a known modification in this step is also based on the genetic modification detection step of the first embodiment. That is, (1) a detection method by hybridization using a probe may be used, (2) a detection method by determination of a base sequence may be used, or (3) an amplification product using a nucleic acid amplification method may be used. It may be a detection method by comparison, or (4) a method using a polymorphic marker. Hereinafter, the characteristic points of this embodiment in each method will be described. Since the other points are the same as those of the first embodiment, the description thereof is omitted.
(1)プローブを用いたハイブリダイゼーションによる検出方法で本実施形態に特徴的な点はプローブとして改変型検出用ポリヌクレオチドと野生型検出用ポリヌクレオチドの2種を使用する点にある。「改変型検出用ポリヌクレオチド」は実施形態1と同様に配列番号1で表される野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列からの改変に由来する塩基配列の全部、又は連続する少なくとも14塩基以上を一部とした塩基配列を有する。「野生型検出用ポリヌクレオチド」は、配列番号1で表される野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列の全部、又は連続する少なくとも14塩基以上を一部とした塩基配列を有し、かつ改変型検出用ポリヌクレオチドの存在位置に対応する野生型の塩基配列を検出可能なポリヌクレオチドである。例えば、改変Aの場合、「改変型検出用ポリヌクレオチド」の塩基配列は、配列番号3で表される19塩基配列の全部か、当該19塩基のうち連続する14塩基以上18塩基以下を有していればよい。これに対して「野生型検出用ポリヌクレオチド」の塩基配列は、配列番号3で表される19塩基配列に置換される前の15塩基(配列番号1の第13290位のTから第13304位のGまでに相当)のうち全部、又は14塩基を有していればよい。また、改変Bの場合、「改変型検出用ポリヌクレオチド」の塩基配列は、配列番号4で表される塩基配列の全部か、又は当該塩基配列のうち連続する14塩基以上の1364塩基以下の配列を有していればよい。これに対して「野生型検出用ポリヌクレオチド」の塩基配列は、第8、及び第9エクソンにおけるスプライシング連結後の配列で当該連結部位を含み、かつ連続する14塩基以上有していればよい。 (1) In the detection method by hybridization using a probe, a characteristic point of this embodiment is that two types of a detection polynucleotide and a wild-type detection polynucleotide are used as probes. As in the first embodiment, the “modified polynucleotide for detection” refers to all of the base sequence derived from the modification from the base sequence of the wild-type human SLC34A2 gene represented by SEQ ID NO: 1, or at least 14 consecutive bases. Part of the base sequence. “Wild-type detection polynucleotide” has the entire base sequence of the wild-type human SLC34A2 gene represented by SEQ ID NO: 1, or a base sequence comprising at least 14 consecutive bases, and modified detection It is a polynucleotide capable of detecting a wild-type base sequence corresponding to the position of the polynucleotide for use. For example, in the case of modification A, the base sequence of the “modified detection polynucleotide” has the entire 19 base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the continuous 14 bases to 18 bases of the 19 bases. It only has to be. On the other hand, the base sequence of the “wild type detection polynucleotide” is 15 bases (from 13290th position T to 13304th position of SEQ ID NO: 1) before being replaced with the 19 base sequence represented by SEQ ID NO: 3. (Equivalent to G)) or 14 bases. In the case of modification B, the base sequence of the “modified detection polynucleotide” is the entire base sequence represented by SEQ ID NO: 4, or a sequence of 14 bases or more and 1364 bases or less continuous among the base sequences. As long as it has. On the other hand, the base sequence of the “wild type detection polynucleotide” may be the sequence after splicing ligation in the 8th and 9th exons, including the ligation site and having 14 or more consecutive bases.
改変型検出用ポリヌクレオチドと野生型検出用ポリヌクレオチドはそれぞれ一つずつ選択していれば、一度の検出で2種以上使用してもよい。例えば、一の改変型検出用のポリヌクレオチドに対して、一以上の野生型検出用のポリヌクレオチド使用してもよい。 As long as one modified detection polynucleotide and one wild type detection polynucleotide are selected, two or more kinds may be used in one detection. For example, one or more wild-type detection polynucleotides may be used for one modified detection polynucleotide.
当該検出方法によって改変を有しない場合も検出可能となる。したがって、前記実施形態1では改変型を有するとしか検出できなかった野生型と改変型のヘテロの場合であっても当該改変型に関しては正確にその遺伝型を検出できる。 Even when there is no modification by the detection method, it can be detected. Therefore, even in the case of the heterozygous wild type and modified type that could only be detected as having the modified type in the first embodiment, the genotype can be accurately detected for the modified type.
(2)塩基配列の決定による検出方法で本実施形態に特徴的な点は、前記核酸抽出工程で抽出された核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子の望ましくは全塩基配列、少なくとも既知の改変に由来する塩基配列が存在し得る領域の全部又は一部の塩基配列を決定することにより当該ヒトSLC34A2遺伝子が野生型のみか、改変型のみか、あるいは野生型と改変型の双方を有するかを決定する点にある。 (2) The detection method based on the determination of the base sequence is characterized by this embodiment in that the human SLC34A2 gene that can be included in the nucleic acid extracted in the nucleic acid extraction step is desirably the entire base sequence, at least derived from known modifications By determining all or a part of the base sequence of the region where the base sequence to be present can be determined, whether the human SLC34A2 gene has only the wild type, only the modified type, or both the wild type and the modified type In the point.
プライマーとしてのポリヌクレオチドの塩基配列は、ヒトSLC34A2遺伝子の全塩基配列を決定する場合、鋳型がゲノムDNA由来であれば配列番号1、mRNA由来(例えばcDNA)であれば配列番号1で説明する野生型ヒトSLC34A2遺伝子のCDSの任意の領域を選択してよい。一度の検出で使用するプライマーの種類数は、ヒトSLC34A2遺伝子の全塩基配列を決定できるようにデザインされていれば1種以上であってもよい。 When determining the entire nucleotide sequence of the human SLC34A2 gene, the nucleotide sequence of the polynucleotide as the primer is SEQ ID NO: 1 if the template is derived from genomic DNA, and SEQ ID NO: 1 if the template is derived from mRNA (eg, cDNA). Any region of the CDS of the type human SLC34A2 gene may be selected. The number of types of primers used in one detection may be one or more as long as it is designed so that the entire base sequence of the human SLC34A2 gene can be determined.
プライマーとしてのポリヌクレオチドの塩基配列は、既知の改変に由来する塩基配列の存在し得る領域の塩基配列を決定する場合、その領域が野生型のみを有するか、改変型のみを有するか、あるいは野生型と改変型の双方を有するかを検出できればいずれの領域の塩基配列であってもよい。例えば、改変Aの場合、プライマーとして用いられるポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号3で表される19配列の全部が検出できるように配列番号1の改変箇所である第856位から上流(5'側)約100塩基の位置の塩基配列をプライマーとしてデザインすればよい。これにより、既知の改変に由来する塩基配列が存在し得る領域が野生型のみであれば、野生型の塩基配列のバンドのみが、また改変Aのみであれば改変Aのみの塩基配列のバンドのみが検出される。さらに改変Aがヘテロの場合には第856位以降は野生型と改変Aの2種のバンドが検出される。 When determining the base sequence of a region where a base sequence derived from a known modification can be present, the base sequence of the polynucleotide as a primer has only a wild type, a modified type, or a wild type. The base sequence of any region may be used as long as it is possible to detect whether both types and modified types are present. For example, in the case of modification A, the base sequence of the polynucleotide used as a primer is upstream (5 ′) from position 856, which is the modification position of SEQ ID NO: 1, so that all 19 sequences represented by SEQ ID NO: 3 can be detected. Side) What is necessary is just to design the base sequence of the position of about 100 bases as a primer. Thus, if the region where a base sequence derived from a known modification can exist is only wild-type, only the band of the wild-type base sequence, and if only the modification A, only the band of the base sequence of modification A only Is detected. Further, when the modified A is heterozygous, two types of bands of wild type and modified A are detected after the 856th position.
本実施形態において望ましくは改変検出遺伝子における既知の全改変型の有無を検出することであり、最も望ましくは既知の全改変型の有無を検出するとともに、全塩基配列を決定して他の改変がないことを確認することである。 In this embodiment, it is desirable to detect the presence / absence of all known modified types in the modified detection gene, and most desirably, the presence / absence of all known modified types is detected, and the entire base sequence is determined to determine other modified types. It is to confirm that there is no.
(3)核酸増幅法を利用した核酸増幅産物で本実施形態に特徴的な点は、(3−1)核酸増幅産物の有無を検出する場合には、野生型、及び改変型のそれぞれについて検出する点と、(3−2)核酸増幅産物の塩基数の違いとして野生型、及び改変型を検出する点である。 (3) Nucleic acid amplification products using the nucleic acid amplification method are characteristic in this embodiment. (3-1) When detecting the presence or absence of nucleic acid amplification products, each of wild type and modified type is detected. And (3-2) the point of detecting the wild type and the modified type as the difference in the number of bases of the nucleic acid amplification product.
(3−1)核酸増幅産物の増幅の有無として検出する方法は、ヒトSLC34A2遺伝子の一の改変に関して、改変を有する核酸増幅産物のみが増幅されるか、当該改変に対応する野生型の塩基配列を有する核酸増幅産物のみが増幅されるか、あるいはその両方が増幅されるかを検出するものである。増幅用プライマーの塩基配列は、改変を含む領域、若しくはそれに対応する野生型の領域いずれか一方のみが増幅されるように領域を選択する。増幅プライマーは、改変型検出用、及び野生型検出用として、それぞれ少なくとも1組ずつ選択する。望ましくは既知の全改変に対して、野生型検出用、及び改変型検出用の各組を少なくとも一つずつ選択することである。他は実施形態1の方法に準ずる。当該方法により、一の改変に関して改変を有する核酸増幅産物のみが増幅された場合は当該改変に関して改変型ホモとして、また当該改変に対応する野生型の塩基配列を有する核酸増幅産物のみが増幅された場合には当該改変に関して野生型ホモとして、そして両方が増幅された場合には当該改変に関して野生型と改変型のヘテロとして検出することができる。 (3-1) A method for detecting the presence or absence of amplification of a nucleic acid amplification product is a method for detecting only one modification of a human SLC34A2 gene, wherein only a nucleic acid amplification product having a modification is amplified or a wild-type base sequence corresponding to the modification It is detected whether only the nucleic acid amplification product having the above is amplified or both are amplified. The base sequence of the amplification primer is selected so that only one of the region containing the modification or the wild-type region corresponding thereto is amplified. At least one set of amplification primers is selected for each of the modified type detection and the wild type detection. Desirably, at least one set each for wild-type detection and modified-type detection is selected for all known modifications. Others are in accordance with the method of the first embodiment. When only a nucleic acid amplification product having a modification with respect to one modification is amplified by this method, only a nucleic acid amplification product having a modified nucleotide sequence corresponding to the modification is amplified. In some cases, it can be detected as a wild-type homozygote for the modification, and when both are amplified, the modification can be detected as a wild-type and modified heterozygote.
(3−2)核酸増幅産物の塩基数の違いとして検出する方法は、一の改変に関して野生型と改変型との間で塩基数の違いが生じている場合にのみ使用できる方法である。塩基数の違いが生じている場合とは、例えば欠失、付加、又は塩基数の違いを伴う置換が該当する。このような場合には、塩基数の違いが生じている塩基配列上の領域を挟み込むようにして少なくとも一組の増幅用プライマーをデザインして、遺伝子増幅法を行う。検出は、核酸増幅産物の塩基数の違いをゲル電気泳動等で確認してもよいし、核酸増幅産物を蛍光物質で染色してその蛍光強度をリアルタイムPCR等で測定してもよい。当該一組の増幅用プライマー間の距離は、予想される核酸増幅産物の塩基数が少なくとも50塩基以上あることが好ましい。当該方法により、一の改変に関して改変を有する場合の塩基数に相当する核酸増幅産物のみが増幅された場合は当該改変に関して改変型ホモとして、また当該改変に対応する野生型の塩基配列を有する場合の塩基数に相当する核酸増幅産物のみが増幅された場合には当該改変に関して野生型ホモとして、そして両方が増幅された場合には当該改変に関して野生型と改変型のヘテロとして検出することができる。 (3-2) The method of detecting the difference in the number of bases of the nucleic acid amplification product is a method that can be used only when a difference in the number of bases occurs between the wild type and the modified type with respect to one modification. The case where the difference in the number of bases occurs corresponds to, for example, deletion, addition, or substitution with a difference in the number of bases. In such a case, the gene amplification method is performed by designing at least one set of amplification primers so as to sandwich a region on the base sequence where the difference in the number of bases occurs. For detection, the difference in the number of bases of the nucleic acid amplification product may be confirmed by gel electrophoresis or the like, or the nucleic acid amplification product may be stained with a fluorescent substance and the fluorescence intensity measured by real-time PCR or the like. The distance between the pair of amplification primers is preferably such that the expected number of bases of the nucleic acid amplification product is at least 50 bases. When only the nucleic acid amplification product corresponding to the number of bases in the case of having one modification is amplified by the method, the modified homozygote with respect to the modification, and having a wild-type base sequence corresponding to the modification When only a nucleic acid amplification product corresponding to the number of bases is amplified, it can be detected as a wild-type homozygote for the modification, and when both are amplified, it can be detected as a heterozygous of the wild-type and the modified type. .
(4)最後に、多型マーカーを用いた方法で本実施形態に特徴的な点は、野生型と改変型のヒトSLC34A2遺伝子間で異なるDNAの多型マーカーを利用して当該多型マーカーの有無から野生型、及び改変型を検出する点である。 (4) Finally, the characteristic feature of this embodiment in the method using a polymorphic marker is that the polymorphic marker of the polymorphic marker is different from the wild type and the modified human SLC34A2 gene using a DNA polymorphic marker. The point is to detect the wild type and the modified type from the presence or absence.
当該多型マーカーを用いた方法は、ヒトSLC34A2遺伝子における多型マーカーを検出前に予め特定しておく必要がある。この時特定される多型マーカーは、野生型と改変型の間で異なる分布パターン、又は異なる塩基配列を示す必要がある。当該多型マーカーのうちSNP、マイクロサテライト、VNTRの検出は、検出対象が異なるだけで、本実施形態の前記(1)のハイブリダイゼーションによる検出方法、又は前記(2)の塩基配列の決定による検出方法と同様の方法で達成され得る。したがって、当該多型マーカーを用いた検出方法は、前記二つの方法のいずれかで検出された改変検出遺伝子の結果を確認する方法として併用されてもよい。 In the method using the polymorphic marker, the polymorphic marker in the human SLC34A2 gene needs to be specified in advance before detection. The polymorphic marker specified at this time needs to show a different distribution pattern or a different base sequence between the wild type and the modified type. Among the polymorphic markers, SNP, microsatellite, and VNTR are detected only by different detection targets. The detection method by the hybridization (1) of the present embodiment or the detection by determination of the base sequence (2) It can be achieved in a manner similar to the method. Therefore, the detection method using the polymorphic marker may be used in combination as a method for confirming the result of the modified detection gene detected by either of the two methods.
RFLPを用いた検出方法は、ヒトSLC34A2遺伝子において野生型と改変型の間で異なる制限酵素部位が存在する場合、あるいはいずれか一方にのみ制限酵素部位が存在する場合に使用できる方法である。当該制限酵素部位を含む塩基領域を前記(3)の核酸増幅法に準じた方法によって増幅する。得られた核酸増幅産物を当該制限酵素で切断処理し、切断の有無によって改変の有無を検出できる。 The detection method using RFLP is a method that can be used when there are restriction enzyme sites different between the wild type and the modified type in the human SLC34A2 gene, or when restriction enzyme sites are present only in one of them. The base region containing the restriction enzyme site is amplified by a method according to the nucleic acid amplification method (3). The obtained nucleic acid amplification product is cleaved with the restriction enzyme, and the presence or absence of modification can be detected by the presence or absence of cleavage.
当該方法により一の改変に関して、改変型遺伝子に特異的な多型マーカーのみが検出された場合には当該改変に関して改変型ホモとして、また野生型遺伝子に特異的な多型マーカーのみが検出された場合には当該改変に関して野生型ホモとして、そして両方の多型マーカーが検出された場合には当該改変に関して野生型と改変型のヘテロとして検出することができる。 When only a polymorphic marker specific to the modified gene was detected for one modification by the method, only the polymorphic marker specific to the wild type gene was detected as a modified homozygote for the modification. In some cases, it can be detected as a wild type homozygote for the modification, and when both polymorphic markers are detected, it can be detected as a heterozygous wild type and modified type for the modification.
本実施形態における遺伝子改変検出工程も、業者に委託して行ってもよい。 The genetic modification detection step in this embodiment may also be performed by a contractor.
「遺伝型判定工程」(S0503)は、改変検出遺伝子の遺伝型が、野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する工程である。当該判定工程は前記遺伝子改変検出工程において確認した各既知の改変の検出結果に基づいて行われる。 The “genotype determination step” (S0503) is a step of determining whether the genotype of the modified detection gene is a wild type homozygote, a modified homozygote, a wild type or a modified heterogene, or a modified heterogeneous. It is. The determination step is performed based on the detection result of each known alteration confirmed in the genetic alteration detection step.
図6は当該判定工程における遺伝型の判定の概念を示した図である。a、b、cはヒトSLC34A2遺伝子の既知の改変を、数字は各既知の改変の検出結果の組み合わせ(ケース)を表している。 FIG. 6 is a diagram showing the concept of genotype determination in the determination step. a, b, and c represent known modifications of the human SLC34A2 gene, and the numbers represent combinations (cases) of detection results of the respective known modifications.
「野生型ホモ」と判定されるのは、改変検出遺伝子の全塩基配列を決定して改変が全く検出されなかった場合、又は確認した範囲の改変が全て野生型のみ検出された場合である。図6のケース1から3が該当する。確認した改変の結果からのみ判定し、未確認の改変は判定に加えない。例えば、2では改変cに関して未確認であるが、仮に実際はcが改変を有しており、野生型と改変型のヘテロ、若しくは改変型ホモであったとしても、未確認である限りは判定の考慮には入れない。 The case where “wild type homology” is determined is when the entire nucleotide sequence of the modified detection gene is determined and no modification is detected at all, or when all the modifications in the confirmed range are detected only in the wild type. Cases 1 to 3 in FIG. Judgment is made only from the result of the confirmed modification, and unconfirmed modification is not added to the determination. For example, in 2 it is unconfirmed with respect to modified c, but if c actually has modification, even if it is a wild type and modified heterozygous or modified homozygous, as long as it is unconfirmed I can't enter.
「野生型と改変型のヘテロ」と判定されるのは、改変検出遺伝子において確認した改変のうち一の改変で野生型と改変型の両方が検出された場合であり、他の改変は未確認か全て野生型が検出された場合である。図6のケース4から6が該当する。当該判定も確認した改変の結果からのみ判定し、未確認の改変については判定に加えない。 “Hetero of wild type and modified type” is determined when both wild type and modified type are detected in one of the modifications confirmed in the modified detection gene, and other modifications are unconfirmed. This is the case when all wild types are detected. Cases 4 to 6 in FIG. This determination is also determined only from the confirmed modification result, and unconfirmed modification is not added to the determination.
「改変型ヘテロ」と判定されるのは、改変検出遺伝子において確認した改変のうち二以上の改変で野生型と改変型の両方が検出された場合であり、他の改変は未確認か野生型が検出された場合である場合である。図6のケース7から9が該当する。当該判定も確認した改変の結果からのみ判定し、未確認の改変については判定に加えない。 “Modified heterogeneity” is determined when both wild type and modified type are detected in two or more of the modifications confirmed in the modified detection gene, and other modifications are unconfirmed or wild type This is the case when it is detected. Cases 7 to 9 in FIG. This determination is also determined only from the confirmed modification result, and unconfirmed modification is not added to the determination.
「改変型ホモ」と判定されるのは、改変検出遺伝子において確認した改変のうち少なくとも一以上の改変で改変型のみが検出された場合である。即ち、他の改変が「野生型のみ」、「野生型と改変型の両方」、又は「二以上の改変で野生型と改変型の両方」のいずれであっても「改変型のみ」が一つでも検出されれば必ず「改変型ホモ」と判定される。図6のケース10から19が該当する。 “Modified homo” is determined when only the modified type is detected by at least one of the modifications confirmed in the modified detection gene. That is, if only one of the other modifications is “wild type only”, “both wild type and modified type”, or “both wild type and modified type with two or more modifications”, only “modified type” is If any one is detected, it is always determined as “modified homo”. Cases 10 to 19 in FIG.
上記のように当該工程で判定される遺伝型は、前記遺伝子改変検出工程で確認した改変に対して総合判定されるものである。遺伝型の正確さは、前記遺伝子改変検出工程で確認した改変に対してのみ適用される。したがって、検出された改変の一つ以上が「改変型ホモ」である場合と、改変検出遺伝子の全塩基配列を決定する場合を除けば、必ずしも改変検出遺伝子全体に対して遺伝子型が判定されるのではない。 The genotype determined in this step as described above is comprehensively determined for the alterations confirmed in the genetic alteration detection step. The accuracy of the genotype is applied only to the alteration confirmed in the genetic alteration detection step. Therefore, the genotype is not necessarily determined for the entire modified detection gene, except when one or more of the detected modifications are “modified homozygous” and when the entire nucleotide sequence of the modified detection gene is determined. Not.
例えば、前記遺伝子改変検出工程で図6のケース1のように改変aについてのみ確認を行い、野生型のみが検出された場合、当該遺伝型判定工程では野生型ホモと判定される。しかし、これは改変aに対してのみ改変検出遺伝子が野生型ホモであると判定されたのであり、改変検出遺伝子全体が野生型ホモと判定されたわけではない。とは言うものの、改変aに対してのみの遺伝子型判定であっても、従来皆無であった肺胞微石症の発症判定が、当該工程によって少なくとも一つの既知の改変について野生型ホモであると判定できることの意義は大きい。同様に、図6のケース5のように改変aとbの二つの既知の改変について確認を行い、改変aは野生型と改変型の両方が検出され、改変bが野生型のみ検出されたという結果であれば、野生型と改変型のヘテロと判定される。この判定も改変aと改変bに対する結果から総合判定されたのであって、遺伝子全体が野生型ホモと判定されたわけではない。しかし、確認する既知の改変数が1つのときよりも複数になればなるほど、判定の正確さが高まり、誤判定のリスク度が減少することから、判定の意義はより大きくなる。 For example, if only the modification a is confirmed in the genetic modification detection step as shown in case 1 of FIG. 6 and only the wild type is detected, it is determined to be a wild type homology in the genotype determination step. However, this is because only the modified a was determined that the modified detection gene was a wild type homology, and the entire modified detection gene was not determined to be a wild type homology. Nonetheless, even if genotyping only for modification a, the determination of the occurrence of alveolar microlithiasis, which has never been heretofore, is wild-type for at least one known modification by the process The significance of being able to be judged is great. Similarly, as in case 5 of FIG. 6, two known modifications, modification a and b, were confirmed, and both modification a and wild type were detected, and modification b was detected only in the wild type. If it is a result, it will be judged as the heterozygous of a wild type and a modified type. This determination is also comprehensively determined from the results for modification a and modification b, and the entire gene is not determined to be wild-type homozygote. However, as the number of known modifications to be confirmed becomes more than one, the accuracy of determination increases and the risk of erroneous determination decreases, so the significance of determination increases.
本実施形態で判定されたヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型から、被験者の肺胞微石症を発する可能性を以下で説明する。 The possibility of developing alveolar microlithiasis in the subject from the genotype of the human SLC34A2 gene determined in this embodiment will be described below.
遺伝型が改変型ホモの場合には、当該被験者は肺胞微石症が未発症であっても今後発症する可能性が極めて高いと判定できる。 If the genotype is a modified homozygote, it can be determined that the subject is very likely to develop even if alveolar microlithiasis has not yet occurred.
遺伝型が野生型ホモの場合には、当該被験者は確認した改変に関しては肺胞微石症を発症する可能性はないと判定できる。ただし、確認外の改変に関してはその限りではない。改変検出遺伝子に関して肺胞微石症の発症可能性を完全に除去するためには、改変検出遺伝子の全塩基配列を決定する等の方法により当該遺伝子の全領域を確認し、肺胞微石症の原因となる実質的な改変を有さないことを確認する必要がある。しかしながら、この方法は時間や、コストを要する上に、非効率的である。肺胞微石症は稀な疾患であることから、現在全世界に存在する肺胞微石症の発症原因となるヒトSLC34A2遺伝子の実質的な改変数は非常に限定されると予想できる。したがって、当該方法による遺伝型の判定は、例えヒトSLC34A2遺伝子全体ではなく部分的な改変であったとしても、実質的な既知の改変のみをピンポイントで検出することから、その判定精度は低くはない。さらに、全塩基配列を決定する場合と比較し、改変検出の効率性、迅速性、コスト面においては優れている。 If the genotype is wild-type homozygous, the subject can determine that there is no possibility of developing alveolar microlithiasis for the confirmed modification. However, this does not apply to modifications not confirmed. In order to completely eliminate the possibility of developing alveolar microlithiasis with respect to the modified detection gene, the entire region of the gene is confirmed by a method such as determining the entire base sequence of the modified detection gene, and alveolar microlithiasis It is necessary to confirm that there is no substantial modification that causes However, this method is time consuming and costly and is inefficient. Since alveolar microlithiasis is a rare disease, it can be expected that the number of substantial alterations in the human SLC34A2 gene that causes the occurrence of alveolar microlithiasis currently present worldwide is very limited. Therefore, the genotype determination by this method is not limited to the entire human SLC34A2 gene, even if it is a partial modification, since only a substantially known modification is detected pinpointed, the determination accuracy is low. Absent. Furthermore, compared with the case of determining the entire base sequence, it is excellent in the efficiency, speed and cost of modification detection.
遺伝型が野生型と改変型のヘテロの場合には、当該被験者は確認した改変に関しては肺胞微石症を発症する可能性はないと判定できる。ただし、確認外の改変に関してはその限りではない。 When the genotype is heterozygous between the wild type and the modified type, the subject can determine that there is no possibility of developing alveolar microlithiasis for the confirmed modification. However, this does not apply to modifications not confirmed.
遺伝型が改変型へテロの場合には、その改変型の組み合わせにより肺胞微石症の発症可能性は異なる。例えば、改変Aと改変Bのヘテロであれば肺胞微石症の発症可能性は極めて高いと判定できるが、改変Aと改変c(N末側の3つのTMドメインを欠く改変と仮定する。)のヘテロであれば改変Aと改変cの遺伝子産物がお互い補償し合い野生型のヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質と同等の機能を持ちえる可能性もある。この場合は、当該被験者は確認した改変に関しては肺胞微石症を発症する可能性はないと判定できる。したがって、改変型へテロの場合には臨床データ、若しくは実験データから得られる結果からのみ発症可能性を判定できる。 When the genotype is a modified heterogeneity, the possibility of developing alveolar microlithiasis differs depending on the combination of the modified types. For example, it can be determined that the possibility of alveolar microlithiasis is extremely high if the heterogeneity of modification A and modification B is present, but it is assumed that modification A and modification c (modification lacking the three TM domains on the N-terminal side). ), The modified A and modified c gene products may compensate each other and have the same function as the wild-type human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein. In this case, the subject can determine that there is no possibility of developing alveolar microlithiasis for the confirmed modification. Therefore, in the case of modified heterogeneity, the possibility of onset can be determined only from the results obtained from clinical data or experimental data.
<実施形態2の効果> 本実施形態によれば、被験者が肺胞微石症を発する可能性を遺伝型で判定できる。また、被験者が既に肺胞微石症を発症している場合、被験者のヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型が実質的な改変による改変型ホモ、若しくは改変型へテロであれば少なくとも当該遺伝子の改変が当該疾患の原因であると判定できる。 <Effect of Embodiment 2> According to this embodiment, the possibility that a subject develops alveolar microlithiasis can be determined by genotype. Further, if the subject has already developed alveolar microlithiasis, if the genotype of the human SLC34A2 gene of the subject is a modified homozygote or a modified heterogeneous by substantial modification, at least the modification of the gene It can be determined that it is the cause of the disease.
<<実施形態3>> << Embodiment 3 >>
<実施形態3:概要>実施形態3は、ヒト由来のタンパク質を抽出し、抽出したタンパク質に含まれ得るヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質がアミノ酸改変を有するかを検出することで肺胞微石症の発症可能性を判定する方法を基本とするものである。 <Embodiment 3: Overview> Embodiment 3 extracts human-derived protein and detects whether the human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein that can be contained in the extracted protein has an amino acid modification. The method is based on a method for determining the possibility of developing microcystiasis.
<実施形態3:処理の流れ> 図7に実施形態3の処理の流れを例示する。まず、「タンパク質抽出工程」(S0701)で試料から適当な方法によってヒト由来のタンパク質を抽出する。次に、「アミノ酸改変検出工程」(S0702)で前記タンパク質抽出工程にて得られたヒト由来のタンパク質に含まれ得るヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列が、既知のアミノ酸改変を有するかを検出する。以上の工程により得られた結果から肺胞微石症の発症可能性を判定するものである。以下、各工程について詳細に説明する。 <Third Embodiment: Process Flow> FIG. 7 illustrates a process flow of the third embodiment. First, in the “protein extraction step” (S0701), a human-derived protein is extracted from a sample by an appropriate method. Next, the amino acid sequence of the human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein that can be contained in the human-derived protein obtained in the protein extraction step in the “amino acid alteration detection step” (S0702) is a known amino acid alteration. Is detected. The onset possibility of alveolar microlithiasis is determined from the results obtained by the above steps. Hereinafter, each step will be described in detail.
「タンパク質抽出工程」(S0701)は、試料からヒト由来のタンパク質を抽出する工程である。試料は人体から得られるものが該当するが、ヒト以外の生物種で、かつヒト由来のタンパク質を産生する形質転換体であってもよい。試料は一個体由来のものを使用する。ただし、本発明の方法を用いて二人以上の複数単位でヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸改変の有無を調べる場合にはこの限りではない。試料が人体から得られるものの場合、当該試料は採取した個体のタンパク質を抽出できればその種類は問わないが、抽出されたタンパク質にヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質が含まれていなければならない。したがって、試料の種類は被験者の肺組織が好ましい。これは、当該タンパク質が肺や小腸に局在すると言う実験データに基づく(非特許文献8)。肺組織は、気管支鏡による肺生検等で採取すればよい。 The “protein extraction step” (S0701) is a step of extracting a human-derived protein from a sample. The sample corresponds to a sample obtained from the human body, but may be a transformant that is a biological species other than human and that produces a human-derived protein. Use a sample from one individual. However, this is not the case when the presence or absence of amino acid modification of the human IIb type sodium-phosphate cotransporter protein is examined using two or more units using the method of the present invention. In the case where the sample is obtained from the human body, the type of the sample is not limited as long as the protein of the collected individual can be extracted, but the extracted protein must contain human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein . Therefore, the sample type is preferably the lung tissue of the subject. This is based on experimental data that the protein is localized in the lung and small intestine (Non-patent Document 8). Lung tissue may be collected by bronchoscopic lung biopsy or the like.
タンパク質の抽出は、(A)細胞破砕ステップ、(B)可溶性画分採取ステップ、(C)目的とするタンパク質の精製ステップを経る方法が一般的である。以下各ステップについて説明するが、目的とするタンパク質を試料から抽出できる方法であれば特定の方法に限定はされない。 Protein extraction is generally performed by (A) a cell disruption step, (B) a soluble fraction collection step, and (C) a target protein purification step. Each step will be described below, but the specific method is not limited as long as the target protein can be extracted from the sample.
(A)細胞破砕ステップは試料に含まれる細胞を破砕して細胞質を外部に流出させるステップである。細胞を破砕は、例えばホモジェナイザーやソニケーター(超音波破砕装置)等を用いた機械的な破砕方法や、界面活性剤による細胞膜脂質構造の化学的破壊方法によって達成できる。いずれの方法も、低温下で行う等のようにタンパク質の分解を最小限に抑制した状態で細胞から抽出しなければならない。当該ステップで得られる破砕された細胞を含む溶液を細胞破砕液とする。 (A) The cell disruption step is a step of disrupting cells contained in the sample and causing the cytoplasm to flow out. Cell disruption can be achieved by, for example, a mechanical disruption method using a homogenizer, a sonicator (ultrasonic disruption device), or the like, or a chemical disruption method of a cell membrane lipid structure using a surfactant. Both methods must be extracted from cells with minimal protein degradation, such as at low temperatures. A solution containing the crushed cells obtained in this step is used as a cell lysate.
(B)可溶性画分採取ステップは、前記細胞破砕ステップで得られる細胞破砕液を可溶性画分と不溶性画分に分離し、可溶性画分を採取するステップである。可溶性画分の採取は、遠心操作によって達成できる。細胞破砕液を低温下で適当な重力加速度で遠心した後、上清を可溶性画分とする。注意すべきはアミノ酸改変を検出するヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質が、膜タンパク質であるという点である。膜タンパク質は疎水性の膜貫通ドメインを有することから基本的には可溶化しない。そこで、前記(A)のステップにおいて界面活性剤による化学的破壊方法以外の方法を用いた場合には、(B)ステップを実行する前に細胞破砕液に適当な界面活性剤を加えておく。これにより細胞膜脂質構造が破壊され、膜タンパク質も可溶化することができる。 (B) The soluble fraction collection step is a step of separating the cell lysate obtained in the cell disruption step into a soluble fraction and an insoluble fraction, and collecting the soluble fraction. Collection of the soluble fraction can be achieved by centrifugation. The cell lysate is centrifuged at an appropriate gravitational acceleration at a low temperature, and the supernatant is used as a soluble fraction. It should be noted that the human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein that detects amino acid modifications is a membrane protein. Membrane proteins are basically not solubilized because they have hydrophobic transmembrane domains. Therefore, when a method other than the chemical disruption method using a surfactant is used in the step (A), an appropriate surfactant is added to the cell disruption solution before the step (B) is executed. Thereby, the cell membrane lipid structure is destroyed, and the membrane protein can be solubilized.
(C)目的とするタンパク質の精製ステップは、アフィニティー精製やHPLC精製等により目的とするタンパク質を得るステップであるが、本実施形態におけるタンパク質の抽出においては、前記(B)可溶性画分採取ステップまでで十分であり、当該ステップは必ずしも必要ではない。 (C) The target protein purification step is a step of obtaining the target protein by affinity purification, HPLC purification or the like. In the protein extraction in the present embodiment, up to the (B) soluble fraction collection step. Is sufficient, and this step is not always necessary.
「アミノ酸改変検出工程」(S0702)は、前記タンパク質抽出工程で抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質(以下、アミノ酸改変検出タンパク質とする)の塩基配列が、配列番号2で表される野生型のアミノ酸配列からの既知のアミノ酸改変を有するかを検出する工程である。 In the “amino acid modification detection step” (S0702), the base sequence of human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein (hereinafter referred to as amino acid modification detection protein) that can be contained in the protein extracted in the protein extraction step is This is a step of detecting whether or not there is a known amino acid modification from the wild type amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
本実施形態において「アミノ酸改変」とは、アミノ酸改変検出タンパク質のアミノ酸配列が配列番号2で表される野生型ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列と一致しない状態を意味する。本実施形態のアミノ酸改変は、特に野生型のヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体としての機能を失う実質的なアミノ酸改変を意味する。 In the present embodiment, “amino acid modification” means a state where the amino acid sequence of the amino acid modification detection protein does not match the amino acid sequence of the wild-type human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein represented by SEQ ID NO: 2. The amino acid modification of this embodiment means a substantial amino acid modification that loses its function as a wild-type human type IIb sodium-phosphate cotransporter.
本実施形態において検出すべきアミノ酸改変の様態には、例えば、アミノ酸の欠失、置換、又は付加がある。「欠失」とは、アミノ酸改変検出タンパク質のアミノ酸配列を野生型ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列と比較した時に、野生型タンパク質のアミノ酸配列から一以上のアミノ酸が失われているアミノ酸改変を言う。また、本実施形態において「置換」とは、アミノ酸改変検出タンパク質のアミノ酸配列を野生型ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列と比較した時に、野生型タンパク質のアミノ酸配列から全部でない一以上の連続したアミノ酸が他の異なるアミノ酸と置き換えられたアミノ酸改変を言う。さらに、本実施形態において「付加」とは、アミノ酸改変検出タンパク質のアミノ酸配列をその野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較した時に、野生型ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列には見られない位置に一以上の連続したアミノ酸が新たに付加されているアミノ酸改変を言う。 Examples of the amino acid modification to be detected in the present embodiment include amino acid deletion, substitution, or addition. “Deletion” means that one or more amino acids are lost from the amino acid sequence of the wild-type protein when the amino acid sequence of the amino acid modification detection protein is compared with the amino acid sequence of the wild-type human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein. Amino acid modification. Further, in this embodiment, “substitution” is not all from the amino acid sequence of the wild-type protein when the amino acid sequence of the amino acid modification detection protein is compared with the amino acid sequence of the wild-type human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein. An amino acid modification in which one or more consecutive amino acids are replaced with other different amino acids. Furthermore, in this embodiment, “addition” means that the amino acid sequence of the wild-type human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein is compared with the amino acid sequence of the amino acid modification detection protein compared to the amino acid sequence of the wild-type protein. An amino acid modification in which one or more consecutive amino acids are newly added at positions that are not seen.
本実施形態において「既知のアミノ酸改変」とは、配列番号2で表される野生型ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列上に生じたアミノ酸改変であって、かつそれによって当該タンパク質としての活性を失うことが日本国内又は外国において頒布された刊行物に記載されたアミノ酸改変、あるいは電気通信回線を通じて公知となったアミノ酸改変を意味する。当該既知のアミノ酸改変の具体的な例としては前述のアミノ酸改変A、又はBが該当する。 In this embodiment, the “known amino acid modification” refers to an amino acid modification that occurs on the amino acid sequence of the wild-type human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein represented by SEQ ID NO: 2, and thereby Losing protein activity means amino acid modification described in a publication distributed in Japan or abroad, or amino acid modification that has become publicly known through a telecommunication line. The above-mentioned amino acid modification A or B corresponds as a specific example of the known amino acid modification.
当該工程で既知のアミノ酸改変を検出する方法は、抗原抗体反応法等を用いればよい。本実施形態における抗原抗体反応法は、既知のアミノ酸改変されたアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリペプチドを抗原として作成された抗体を用いて、アミノ酸改変検出タンパク質に対して抗原抗体反応を行い、既知のアミノ酸改変の有無を検出する方法である。例えば、ノザン・ブロッティング法のようなイムノ・ブロッティング法であってもよいし、ELISA法であってもよい。 As a method for detecting a known amino acid modification in this step, an antigen-antibody reaction method or the like may be used. In the antigen-antibody reaction method in the present embodiment, an antigen-antibody reaction is performed on an amino acid-modified detection protein using an antibody prepared by using a polypeptide having all or part of a known amino acid-modified amino acid sequence as an antigen. This is a method for detecting the presence or absence of a known amino acid modification. For example, an immunoblotting method such as a Northern blotting method or an ELISA method may be used.
本発明において「ポリペプチド」は、数アミノ酸〜10アミノ酸で構成されるオリゴペプチドの意味も含むものとする。 In the present invention, “polypeptide” also includes the meaning of an oligopeptide composed of several amino acids to 10 amino acids.
抗原として用いられるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号2で表される野生型ヒトIIB型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列からのアミノ酸改変に由来するアミノ酸配列の全部、又は連続する少なくとも5アミノ酸以上を一部として有する配列である。例えば、アミノ酸改変Aの場合には配列番号5で表される28アミノ酸配列の全部か、又は当該28アミノ酸のうち連続する5アミノ酸以上27アミノ酸以下の配列を有していればよい。また、アミノ酸改変Bの場合には配列番号6で表されるアミノ酸配列の全部か、又は当該アミノ酸配列のうち連続する5アミノ酸以上9アミノ酸以下の配列を有していればよい。 The amino acid sequence of the polypeptide used as the antigen is the entire amino acid sequence derived from the amino acid modification from the amino acid sequence of the wild-type human type IIB sodium-phosphate cotransporter protein represented by SEQ ID NO: 2, or at least continuous. It is a sequence having 5 amino acids or more as a part. For example, in the case of amino acid modification A, it is sufficient to have the entire 28 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or a sequence of 5 to 27 amino acids that are consecutive among the 28 amino acids. In the case of amino acid modification B, it is sufficient that the amino acid sequence has the entire amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 or a sequence of 5 amino acids or more and 9 amino acids or less in the amino acid sequence.
抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよいが、いずれの場合も当該抗原に特異的な免疫反応性を有する抗体であることが望ましい。抗体の作成は、ポリクローナル抗体の場合は通常行われるように、例えばウサギ等の実験用家畜に上記抗原を接種し免疫させることで作成すればよい。また、モノクローナル抗体の場合も一般に行われる方法でよい。例えば、マウス等に上記抗原を接種し免疫させた後、Bリンパ球とミエローマ細胞等との細胞融合を行い、スクリーニングによって目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を得ればよい。これらの抗体の作成は、時間と手間を要するため、ややコストはかかるが抗体作成の受託サービスを行っている各企業に委託すると便利である。 The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. In any case, the antibody is preferably an antibody having immunoreactivity specific to the antigen. In the case of polyclonal antibodies, antibodies may be prepared by inoculating and immunizing laboratory livestock such as rabbits with the antigen. In the case of a monoclonal antibody, a generally performed method may be used. For example, a mouse or the like is inoculated with the antigen and immunized, and then cell fusion between B lymphocytes and myeloma cells is performed, and a hybridoma cell producing the desired monoclonal antibody can be obtained by screening. Since the production of these antibodies requires time and labor, it is somewhat costly, but it is convenient to outsource them to companies that offer antibody production contract services.
抗体は標識されていてもよい。例えば、発色性物質、蛍光物質、酵素若しくはビオチン等による標識等が該当する。 The antibody may be labeled. For example, a labeling substance such as a chromogenic substance, a fluorescent substance, an enzyme or biotin is applicable.
抗体は、支持体に固定されていてもよい。支持体は抗体が直接結合できる素材、又は抗体が直接結合できる素材でコーティングされた素材であれば、形状、サイズは問わない。例えばガラスで構成された微粒子であってもよいし、プラスチックで構成されたプレートであってもよい。支持体の素材は抗体が固定によって変性しないものが好ましい。 The antibody may be immobilized on a support. The support may be of any shape and size as long as it is a material that can be directly bound by an antibody or a material that is coated with a material that can be directly bound by an antibody. For example, it may be fine particles made of glass or a plate made of plastic. The material of the support is preferably one in which the antibody is not denatured by fixation.
当該方法により、抗原抗体反応の結果がポジティブであった場合には、試料に含まれるヒトIIB型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列は、既知のアミノ酸改変に基づくアミノ酸配列を有していると判定される。 When the result of the antigen-antibody reaction is positive by the method, the amino acid sequence of the human type IIB sodium-phosphate cotransporter protein contained in the sample has an amino acid sequence based on a known amino acid modification. It is determined that
<実施形態3:処理の効果> 本実施形態によれば、被験者のヒトIIB型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質に既知のアミノ酸改変が存在するかを容易に判定できる。当該タンパク質に既知の実質的なアミノ酸改変が検出された場合には、当該被験者は肺胞微石症が未発症であっても「少なくとも50%の確率で発症する可能性を有する。」と判定できる。また、被験者の症状から肺胞微石症の疑いがある場合には、ヒトIIB型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質の既知のアミノ酸改変を確認することで当該疾患であることを確定できる。 <Embodiment 3: Effect of treatment> According to this embodiment, it is possible to easily determine whether a known amino acid modification is present in the human IIB sodium-phosphate cotransporter protein of the subject. If a known substantial amino acid modification is detected in the protein, the subject is determined to have “at least a 50% probability of developing” even if alveolar microlithiasis has not yet occurred. it can. In addition, when there is a suspicion of alveolar microlithiasis from the subject's symptoms, the disease can be confirmed by confirming a known amino acid modification of human type IIB sodium-phosphate cotransporter protein.
<<実施形態4>> << Embodiment 4 >>
<実施形態4:概要> 実施形態4はヒト由来のタンパク質を抽出し、抽出したタンパク質に含まれ得るヒトIIB型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号2で表される野生型のアミノ酸配列からアミノ酸改変されたかを検出することで、抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトIIB型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質をコードするヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型が、野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する方法を基本とするものである。 <Embodiment 4: Overview> In Embodiment 4, a human-derived protein is extracted, and the amino acid sequence of a human type IIB sodium-phosphate cotransporter protein that can be contained in the extracted protein is represented by SEQ ID NO: 2. By detecting whether the amino acid sequence has been modified from the type amino acid sequence, the genotype of the human SLC34A2 gene encoding the human type IIB sodium-phosphate cotransporter protein that can be contained in the extracted protein is a wild type homozygous, modified This method is based on a method for determining whether a heterozygous type, a wild type and a modified type of heterogeneity, or a modified type of heterogeneity.
<実施形態4の流れ> 図8に実施形態4の処理の流れを例示する。まず、「タンパク質抽出工程」(S0801)で試料から適当な方法によってヒト由来のタンパク質を抽出する。次に、「アミノ酸改変検出工程」(S0802)で前記タンパク質抽出工程にて得られたアミノ酸改変検出タンパク質に関して、そのアミノ酸配列が配列番号2で表される野生型のアミノ酸配列からアミノ酸改変されたかを検出する。最後に、「第二遺伝型判定工程」(S0803)で、前記アミノ酸改変検出工程にて得られた結果から試料を提供した被験者のヒトIIB型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質をコードするヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型を判定する。 <Flow of Embodiment 4> FIG. 8 illustrates a flow of processing of Embodiment 4. First, in the “protein extraction step” (S0801), a human-derived protein is extracted from a sample by an appropriate method. Next, regarding the amino acid modification detection protein obtained in the protein extraction step in the “amino acid modification detection step” (S0802), whether the amino acid sequence has been amino acid modified from the wild-type amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 To detect. Finally, in the “second genotype determination step” (S0803), human SLC34A2 encoding the human type IIB sodium-phosphate cotransporter protein of the subject who provided the sample from the result obtained in the amino acid modification detection step Determine the genotype of a gene.
本実施形態のうち「タンパク質抽出工程」(S0801)は実施形態3の「タンパク質抽出工程」(S0701)と同様であることからその説明は省略する。また、「アミノ酸改変検出工程」(S0802)も実施形態3の「アミノ酸改変検出工程」(S0801)を基本としていることから、ここでは本実施形態に特徴的な点についてのみ説明をする。さらに、「第二遺伝型判定工程」(S0803)は本実施形態に特徴的な工程であることから、以下で詳細に説明する。 In the present embodiment, the “protein extraction step” (S0801) is the same as the “protein extraction step” (S0701) of the third embodiment, and thus the description thereof is omitted. Further, since the “amino acid modification detection step” (S0802) is also based on the “amino acid modification detection step” (S0801) of the third embodiment, only the characteristic points of this embodiment will be described here. Furthermore, the “second genotype determination step” (S0803) is a step characteristic of the present embodiment, and will be described in detail below.
本実施形態の「アミノ酸改変検出工程」(S0802)で特徴的な点は、実施形態3がアミノ酸改変検出タンパク質のアミノ酸配列が既知のアミノ酸改変を有するかを検出することであったのに対して、本実施形態はアミノ酸改変検出タンパク質のアミノ酸配列が配列番号2で表される野生型のアミノ酸配列からアミノ酸改変されたかを検出する点である。即ち、既知のアミノ酸改変を有するかを検出するだけでなく、アミノ酸改変を有しないことも検出する点にある。 The characteristic point of the “amino acid modification detection step” (S0802) of the present embodiment is that the third embodiment detects whether the amino acid sequence of the amino acid modification detection protein has a known amino acid modification. This embodiment is to detect whether the amino acid sequence of the amino acid modification detection protein has been amino acid modified from the wild-type amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. That is, not only is it detected whether or not it has a known amino acid modification, but it is also detected that it has no amino acid modification.
本実施形態における「アミノ酸改変」、アミノ酸改変の様態、「既知のアミノ酸改変」、「アミノ酸改変に由来するもの」、そして「ポリペプチド」等の定義については実施形態3と同様である。 The definitions of “amino acid modification”, amino acid modification mode, “known amino acid modification”, “derived from amino acid modification”, “polypeptide” and the like in the present embodiment are the same as in the third embodiment.
当該工程でアミノ酸改変を検出する方法も、実施形態3のアミノ酸改変検出工程を基本とする。即ち、アミノ酸改変検出タンパク質に対して抗原抗体反応を行い、アミノ酸改変の有無を検出する方法を用いればよい。以下、抗原抗体反応法を用いたアミノ酸改変の検出方法で本実施形態に特徴的な点に関して説明する。その他の点に関しては、実施形態3と同様であるのでその説明は省略する。 The method for detecting an amino acid modification in this step is also based on the amino acid modification detection step of the third embodiment. That is, a method may be used in which an antigen-antibody reaction is performed on an amino acid modification detection protein to detect the presence or absence of amino acid modification. Hereinafter, a characteristic point of the present embodiment will be described in the detection method of amino acid modification using an antigen-antibody reaction method. Since the other points are the same as those of the third embodiment, the description thereof is omitted.
抗体を用いた抗原抗体反応による検出方法で本実施形態に特徴的な点は、検出に用いる抗体として改変型検出用抗体と野生型検出用抗体の2種を使用する点にある。 A characteristic feature of this embodiment in the detection method using an antigen-antibody reaction using an antibody is that two types of antibodies for detection, that is, a modified detection antibody and a wild type detection antibody are used as detection antibodies.
「改変型検出用抗体」は、実施形態3と同様に配列番号2で表される野生ヒトIIB型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列からのアミノ酸改変に由来するアミノ酸配列の全部、又は連続する少なくとも5アミノ酸以上を一部としたアミノ酸配列を有するポリペプチドを抗原として作成された抗体である。 The “modified antibody for detection” refers to the entire amino acid sequence derived from amino acid modification from the amino acid sequence of the wild human type IIB sodium-phosphate cotransporter protein represented by SEQ ID NO: 2 as in Embodiment 3, or It is an antibody prepared by using a polypeptide having an amino acid sequence including at least 5 consecutive amino acids as an antigen as an antigen.
「改変型検出用抗体」の作成にあたり抗原として用いられるポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸改変Aの場合であれば、配列番号5で表される28アミノ酸配列の全部か、当該28アミノ酸のうち連続する5アミノ酸以上を有していればよい。また、アミノ酸改変Bの場合であれば、配列番号6で表されるアミノ酸配列の全部か、又は当該アミノ酸配列のうち連続する5アミノ酸以上を有していればよい。 For example, in the case of amino acid modification A, the amino acid sequence of the polypeptide used as an antigen in the preparation of the “modified antibody for detection” may be the entire 28 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or the 28 amino acid sequence. Of these, it is only necessary to have 5 or more consecutive amino acids. In the case of amino acid modification B, the amino acid sequence may be the entire amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, or the amino acid sequence may have at least 5 consecutive amino acids.
「野生型検出用抗体」は、配列番号2で表される野生型ヒトIIB型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列の全部、又は連続する少なくとも5アミノ酸以上を一部としたアミノ酸配列を有するポリペプチドを抗原として作成された抗体であり、かつアミノ酸改変型検出用抗体の存在位置に対応する野生型のアミノ酸配列を検出可能な抗体である。 The “wild-type detection antibody” is an amino acid sequence comprising all of the amino acid sequence of the wild-type human type IIB sodium-phosphate cotransporter protein represented by SEQ ID NO: 2 or a part of at least 5 consecutive amino acids. It is an antibody prepared by using a polypeptide having an antigen as an antigen, and an antibody capable of detecting a wild-type amino acid sequence corresponding to the position of the amino acid-modified detection antibody.
「野生型検出用抗体」の作成にあたり抗原として用いられるポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸改変Aの場合であれば、配列番号5で表される28アミノ酸配列に置換される前の405アミノ酸配列(配列番号2で表される第286位のイソロイシン以降)のうち全部、又は5アミノ酸以上を有していればよい。また、アミノ酸改変Bの場合であれば、配列番号2で表される第350位のC以下のアミノ酸配列のうち全部、又は連続する5アミノ酸以上を有していればよい。 For example, in the case of amino acid modification A, the amino acid sequence of the polypeptide used as an antigen in the preparation of the “wild-type detection antibody” is 405 amino acids before being substituted with the 28 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5. It should suffice to have all of the sequences (after isoleucine at position 286 represented by SEQ ID NO: 2) or 5 amino acids or more. Further, in the case of amino acid modification B, it is sufficient that all or a continuous 5 amino acids or more in the 350th or lower amino acid sequence at position 350 represented by SEQ ID NO: 2 is included.
改変型検出用抗体と野生型検出用抗体はそれぞれ少なくとも一つずつ選択していれば、一度の検出で2種以上使用してもよい。例えば、一の改変型検出用抗体に対して、一以上の野生型検出用の抗体使用してもよい。 As long as at least one modified detection antibody and one wild type detection antibody are selected, two or more types may be used in one detection. For example, one or more wild-type detection antibodies may be used for one modified detection antibody.
「第二遺伝型判定工程」(S0803)は、前記アミノ酸改変検出工程において検出されたアミノ酸改変検出タンパク質におけるアミノ酸改変の結果に基づいて、当該試料のヒトIIB型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質をコードするヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型が、野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する工程である。 In the “second genotype determination step” (S0803), based on the result of amino acid modification in the amino acid modification detection protein detected in the amino acid modification detection process, the human IIB type sodium-phosphate cotransporter protein of the sample is determined. This is a step of determining whether the genotype of the encoded human SLC34A2 gene is wild-type homozygote, modified homozygote, wild-type and modified heterogeneity, or modified heterogeneity.
該工程での試料におけるヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型の判定方法は、前記実施形態2の「遺伝型判定工程」(S0703)に準ずる。すなわち、「野生型ホモ」と判定されるのは、アミノ酸改変検出タンパク質において検証したアミノ酸改変に関して全て野生型のみが検出された場合である。検証したアミノ酸改変の結果からのみ判定し、未検証のアミノ酸改変については判定に加えない。また、「野生型と改変型のヘテロ」と判定されるのは、アミノ酸改変検出タンパク質において検証したアミノ酸改変のうち一のアミノ酸改変で野生型と改変型の両方が検出された場合であり、他のアミノ酸改変は未検証か全て野生型が検出された場合である。当該判定も検証したアミノ酸改変の結果からのみ判定し、未検証のアミノ酸改変については判定に加えない。さらに、「改変型ヘテロ」と判定されるのは、アミノ酸改変検出タンパク質において検証したアミノ酸改変のうち二以上のアミノ酸改変で野生型と改変型の両方が検出された場合であり、他のアミノ酸改変は未検証か野生型が検出された場合である。当該判定も検証したアミノ酸改変の結果からのみ判定し、未検証のアミノ酸改変については判定に加えない。最後に、「改変型ホモ」と判定されるのは、アミノ酸改変検出タンパク質において検証したアミノ酸改変のうち少なくとも一以上のアミノ酸改変で改変型のみが検出された場合である。即ち、他のアミノ酸改変が「野生型のみ」、「野生型と改変型の両方」、又は「二以上のアミノ酸改変で野生型と改変型の両方」のいずれであっても「改変型のみ」が一つでも検出されれば必ず「改変型ホモ」と判定される。その他に関しては、前記実施形態2の「遺伝型判定工程」(S0703)と同様であることからその説明は省略する。 The method for determining the genotype of the human SLC34A2 gene in the sample in this step is in accordance with the “genotype determination step” (S0703) of the second embodiment. That is, “wild type homozygous” is determined when only the wild type is detected for all the amino acid modifications verified in the amino acid modification detection protein. Judgment is made only from the result of verified amino acid modification, and unverified amino acid modification is not included in the determination. Moreover, it is judged that both wild type and modified type are detected by one amino acid modification among the amino acid modifications verified in the amino acid modification detection protein. These amino acid modifications are unverified or all wild type is detected. This determination is also determined only from the verified amino acid modification result, and unverified amino acid modification is not added to the determination. Furthermore, “modified heterozygous” is determined when both wild type and modified type are detected by two or more amino acid modifications among the amino acid modifications verified in the amino acid modification detection protein. Is when unverified or wild type is detected. This determination is also determined only from the verified amino acid modification result, and unverified amino acid modification is not added to the determination. Finally, “modified homolog” is determined when only the modified type is detected by at least one amino acid modification among the amino acid modifications verified in the amino acid modification detection protein. That is, even if the other amino acid modification is either “wild type only”, “both wild type and modified type”, or “both wild type and modified type with two or more amino acid modifications”, “modified type only” If even one is detected, it is always determined as “modified homo”. Others are the same as the “genotype determination step” (S0703) of the second embodiment, and thus the description thereof is omitted.
本実施形態で判定された遺伝型から被験者の肺胞微石症を発する可能性は、前記実施形態2の「遺伝型判定工程」(S0703)と同様であることからその説明は省略する。 The possibility that the subject will develop alveolar microlithiasis from the genotype determined in the present embodiment is the same as that in the “genotype determination step” (S0703) of the second embodiment, and a description thereof will be omitted.
<実施形態4の効果> 本実施形態によれば、検出対象をタンパク質にすることが可能となり、かつ実施形態2とほぼ同様の効果を得ることができる。 <Effects of Embodiment 4> According to the present embodiment, the detection target can be a protein, and substantially the same effects as those of Embodiment 2 can be obtained.
<<実施形態5>> << Embodiment 5 >>
<実施形態5:概要> 実施形態5は、前記実施形態1、若しくは2の方法等で使用する肺胞微石症の発症可能性を判定するためのプローブ、若しくはプライマーとしてのポリヌクレオチドを用いる肺胞微石症発症判定用キットである。 <Embodiment 5: Overview> Embodiment 5 is a lung using a polynucleotide as a probe for determining the possibility of developing alveolar microlithiasis used in the method of Embodiment 1 or 2, or a primer. This is a kit for determining the onset of microlithiasis.
<実施形態5:構成> <Embodiment 5: Configuration>
実施形態5の構成を説明する。本実施形態の肺胞微石症発症判定用キットは、(1)プローブ、又はプライマーとしてのポリヌクレオチドを用いるキット。以下、(1)、(2)のそれぞれについて具体的に説明する。 The configuration of the fifth embodiment will be described. The kit for determining the onset of alveolar microlithiasis according to this embodiment is (1) a kit that uses a probe or a polynucleotide as a primer. Hereinafter, each of (1) and (2) will be described in detail.
本実施形態の肺胞微石症発症判定用キットは、前記実施形態1、又は2の方法等で肺胞微石症の発症可能性を判定する際に必要となる抗原、又はプライマーとしてのポリヌクレオチドを包含する。当該ポリヌクレオチドはヒトSLC34A2遺伝子の実質的な改変を検出する上ですぐに利用可能なように予め調製されている。例えば、改変の検出のために適当な塩基配列や塩基の長さを有するポリヌクレオチドが事前に合成、若しくはクローン化されていること、当該ポリヌクレオチドが検出時に必要となる蛍光物質等で事前に修飾されていること、及び/又は基板等に予め固定されていること等が該当する。当該キットは野生型検出用、各改変型検出用の前記ポリヌクレオチドのいずれか一方、又は両方を包含してもよい。好ましくは両方を包含することである。更に好ましくは既知の改変型が全て検出できるようにそれぞれの改変型検出用のポリヌクレオチドを全て包含することである。当該キットに包含されるポリヌクレオチドは、抗原として使用されるもの、プライマーとして使用されるもののいずれか一方、又は両方であってもよい。キットは前記ポリヌクレオチドだけでなく、当該ポリヌクレオチドを使用する検出方法に必要なバッファーや酵素等の試薬を包含していてもよい。また、プロトコルを添付していてもよい。当該キットに包含されるポリヌクレオチドや試薬は、所定の条件下では一定期間安定して保存可能なものであることが好ましい。所定の条件とは、低温、遮光、乾燥等が該当する。一定期間は、試薬の性質等によって異なるが、1ヶ月以上であることが好ましい。 The kit for determining the onset of alveolar microlithiasis according to the present embodiment is a polymorph as an antigen or primer required for determining the possibility of the onset of alveolar microlithiasis by the method of the first or second embodiment. Includes nucleotides. The polynucleotide is pre-prepared to be readily available for detecting substantial alterations in the human SLC34A2 gene. For example, a polynucleotide having an appropriate base sequence or base length for detection of alteration is synthesized or cloned in advance, and the polynucleotide is modified in advance with a fluorescent substance necessary for detection. And / or pre-fixed to a substrate or the like. The kit may include one or both of the polynucleotides for wild-type detection and each modified type detection. Preferably both are included. More preferably, all of the polynucleotides for detecting each modified type are included so that all known modified types can be detected. The polynucleotide included in the kit may be either one used as an antigen, one used as a primer, or both. The kit may include not only the polynucleotide but also reagents such as buffers and enzymes necessary for the detection method using the polynucleotide. A protocol may be attached. The polynucleotides and reagents included in the kit are preferably those that can be stably stored for a certain period under predetermined conditions. The predetermined conditions correspond to low temperature, light shielding, drying, and the like. The fixed period varies depending on the nature of the reagent and the like, but is preferably one month or longer.
<実施形態5:効果> 本実施形態によれば、肺胞微石症の発症判定等を行うためにヒトSLC34A2遺伝子の実質的な改変の検出を迅速、かつ容易に行う事ができる。また、添付のプロトコルに従うことで、一定の訓練を受けた者であれば特段の知識や技術を必要とせずに肺胞微石症の発症判定を実施することができる。 <Embodiment 5: Effects> According to this embodiment, it is possible to quickly and easily detect substantial alteration of the human SLC34A2 gene in order to determine the onset of alveolar microlithiasis and the like. Furthermore, by following the attached protocol, those who have undergone a certain amount of training can determine the onset of alveolar microlithiasis without the need for special knowledge or skills.
<<実施形態6>> << Embodiment 6 >>
<実施形態6:概要> 実施形態6は、ヒト由来の核酸を抽出し、抽出した核酸に含まれ得る肺胞微石症の原因遺伝子SLC34A2の発現制御領域が改変を有するかを検出することで肺胞微石症の発症可能性を判定する方法を基本とするものである。 <Embodiment 6: Overview> Embodiment 6 extracts human-derived nucleic acids and detects whether the expression control region of the alveolar microlithiasis gene SLC34A2 that may be contained in the extracted nucleic acids has a modification. This is based on a method for determining the possibility of developing alveolar microlithiasis.
<実施形態6:処理の流れ> 実施形態6の処理の流れは、まず、「核酸抽出工程」で試料から適当な方法によってヒト由来の核酸を抽出する。次に、「発現制御領域改変検出工程」で前記核酸抽出工程にて得られたヒト由来の核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子の発現制御領域の塩基配列が、配列番号7で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する。以上の工程により得られた結果から肺胞微石症の発症可能性を判定するものである。「核酸抽出工程」は、実施形態1の「核酸抽出工程」(S0301)と、また「発現制御領域改変検出工程」は実施形態1の「遺伝子改変検出工程」(S0302)とその大部分が同様である。したがって、各工程において本実施形態に特徴的な点に関してのみ以下で説明する。 <Sixth Embodiment: Process Flow> In the process flow of the sixth embodiment, first, a nucleic acid derived from human is extracted from a sample by an appropriate method in the “nucleic acid extraction step”. Next, the base sequence of the expression control region of the human SLC34A2 gene that can be contained in the human-derived nucleic acid obtained in the nucleic acid extraction step in the “expression control region modification detection step” is a wild type represented by SEQ ID NO: 7 It is detected from the base sequence of. The onset possibility of alveolar microlithiasis is determined from the results obtained by the above steps. The “nucleic acid extraction step” is almost the same as the “nucleic acid extraction step” (S0301) of the first embodiment, and the “expression control region alteration detection step” is mostly the same as the “gene alteration detection step” (S0302) of the first embodiment. It is. Therefore, only the features characteristic of this embodiment in each step will be described below.
本実施形態の「核酸抽出工程」に特徴的な点は、使用する核酸の種類がゲノムDNA、若しくはゲノムDNA由来の核酸である点にある。ゲノムDNA由来の核酸とは、ゲノムDNAのポリペプチド鎖の一部をコスミド等のベクターやYAC等の人工染色体に組み込んだ核酸を言う。核酸の抽出方法等は、ゲノムDNAであればゲノムDNAの抽出方法に準ずればよい。また、ゲノムDNA由来の核酸であればその種類に応じた抽出方法に準ずればよい。例えば、コスミドであればコスミド抽出方法に従って抽出すればよい。 A characteristic point of the “nucleic acid extraction step” of the present embodiment is that the type of nucleic acid used is genomic DNA or nucleic acid derived from genomic DNA. A nucleic acid derived from genomic DNA refers to a nucleic acid obtained by incorporating a part of a polypeptide chain of genomic DNA into a vector such as cosmid or an artificial chromosome such as YAC. The nucleic acid extraction method may be in accordance with the genomic DNA extraction method if it is genomic DNA. Moreover, if it is a nucleic acid derived from genomic DNA, what is necessary is just to follow the extraction method according to the kind. For example, if it is a cosmid, it may extract according to the cosmid extraction method.
「発現制御領域改変検出工程」は、前記核酸抽出工程で抽出された核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子の発現制御領域(以下検出対象遺伝子発現制御領域とする)の塩基配列が、配列番号7で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する工程である。 In the “expression control region modification detection step”, the nucleotide sequence of the expression control region of human SLC34A2 gene (hereinafter referred to as detection target gene expression control region) that can be contained in the nucleic acid extracted in the nucleic acid extraction step is SEQ ID NO: 7. This is a step of detecting whether or not the wild-type nucleotide sequence is modified.
「発現制御領域」とは、特定の遺伝子の発現を制御、又は調整するゲノム配列上の塩基配列としての領域である。例えば、エンハンサー領域やプロモーター領域等が該当する。当該発現制御領域は遺伝子によって位置や塩基配列に相違が見られることが多く、それらを特定するには困難を伴うが、少なくともプロモーターの場合には、通常制御する遺伝子の転写開始点から上流3Kb(Kb=1000塩基)の範囲内に含まれることが多い。したがって、本発明においては「発現制御領域」を配列番号7で示すようにヒトSLC34A2遺伝子の予想転写開始点(配列番号1の第1位)から上流2.7Kbとした。 The “expression control region” is a region as a base sequence on the genome sequence that controls or regulates the expression of a specific gene. For example, an enhancer region or a promoter region is applicable. The expression control region often has a difference in position and base sequence depending on the gene, and it is difficult to specify them. However, at least in the case of a promoter, 3 Kb upstream from the transcription start point of the gene to be normally controlled ( It is often included in the range of Kb = 1000 bases). Therefore, in the present invention, the “expression control region” is set to 2.7 Kb upstream from the predicted transcription start point (1st position of SEQ ID NO: 1) of the human SLC34A2 gene as shown by SEQ ID NO: 7.
発現制御領域の改変の様態、改変の検出方法等は実施形態1に準ずればよい。本実施形態で検出される改変には、その改変を有する発現制御領域の制御下にあるヒトSLC34A2遺伝子に対して、(1)発現を抑制させる場合と、(2)発現を増強させる場合と、そして(3)特に影響しない場合があるが、好ましくは(1)、又は(2)の改変を検出することである。
<実施形態6:効果> 本実施形態によれば、被験者のヒトSLC34A2遺伝子の発現制御異常から肺胞微石症の発症可能性を判定できる。仮にヒトSLC34A2遺伝子の発現制御領域に発現を抑制させる改変が検出された場合には、当該被験者は肺胞微石症が未発症であっても「少なくとも50%の確率で発症する可能性を有する。」と判定できる。
The modification mode of the expression control region, the detection method of the modification, and the like may be the same as in the first embodiment. Modifications detected in the present embodiment include (1) a case where expression is suppressed and (2) a case where expression is enhanced with respect to the human SLC34A2 gene under the control of an expression control region having the modification, And (3) Although there is no particular influence, it is preferable to detect the modification of (1) or (2).
<Embodiment 6: Effect> According to the present embodiment, the possibility of onset of alveolar microlithiasis can be determined from abnormal expression control of the human SLC34A2 gene in the subject. If a modification that suppresses the expression in the expression control region of the human SLC34A2 gene is detected, the subject may have “at least a 50% probability of developing alveolar microlithiasis even if the alveolar microlithiasis has not yet occurred. Can be determined.
以下の実施例をもって本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which are merely illustrative and the present invention is not limited thereto.
なお、肺胞微石症は稀な疾患であるため本発明の発症判定方法を通常の被験者に対して行ったとしても、ほとんどの場合は既知の改変に対して陰性でとなり、またヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型も野生型ホモとなる。つまり、被験者の中に本疾患発症前の肺胞微石症キャリアーが含まれていることは稀であるため、発症判定方法で改変型ホモ、ないしは野生型と改変型のヘテロ等のポジティブな結果を例示することは難しい。そこで、本実施例では臨床症状で肺胞微石症と診断された患者に対して本発症判定方法を行い、本発症判定方法が有効に働くことを示すポジティブ例とした。 In addition, since alveolar microlithiasis is a rare disease, even if the onset determination method of the present invention is performed on a normal subject, in most cases, it becomes negative for a known modification, and the human SLC34A2 gene The genotype is also a wild-type homozygote. In other words, since it is rare that the subject contains an alveolar microlithiasis carrier before the onset of this disease, positive results such as modified homozygos or wild type and modified heterozygous in the onset determination method It is difficult to illustrate. Therefore, in this example, the present onset determination method was performed on patients diagnosed with alveolar microlithiasis as clinical symptoms, and a positive example showing that this onset determination method works effectively was used.
<<実施例1>> << Example 1 >>
<肺胞微石症患者と健常人ボランティアとのヒトSLC34A2遺伝子における既知の改変の存在の検証> <Verification of existence of known alterations in human SLC34A2 gene between alveolar microlithiasis patients and healthy volunteers>
本実施例では、臨床症状から肺胞微石症と診断された検体(患者)、ならびに188人の健常人ボランティア検体が、ヒトSLC34A2遺伝子に既知の改変である改変A、又は改変Bを有するかを検証するために、実施形態1を基本とする本発明の肺胞微石症発症判定方法を行った。以下、本実施例について具体的に説明する。 In this example, whether specimens (patients) diagnosed with alveolar microlithiasis from clinical symptoms and 188 healthy volunteer specimens have modification A or modification B that is a known modification of the human SLC34A2 gene. In order to verify this, the alveolar microlithiasis onset determination method of the present invention based on Embodiment 1 was performed. Hereinafter, the present embodiment will be specifically described.
(核酸抽出工程) ゲノムDNAの抽出
まず、肺胞微石症と診断された検体、ならびに188人の健常人ボランティア検体から末梢血を得た。次に、各検体の末梢血5mlに溶解バッファー(終濃度:100μg/mlプロテイナーゼK、50mM Tris−HClpH 7.5、10mM CaCl2、1%SDS)を加えて、50℃で30分インキュベートして細胞を溶解した。続いて、前記細胞溶解液にTEバッファーで飽和させたフェノールを等量加えた後、容器を数回反転して混合した。次に、室温にて3000xgで10分間遠心処理を行い、水層とフェノール層に分離させた。続いて、上層の水層のみを採取して新たな容器に移した。次に、当該水層にフェノール・クロロホルム混合液(1:1混合比)を等量加え、再び容器を数回反転して混合した。室温にて3000xgで10分間再び遠心処理を行い、水層と中間層(変性タンパク質層)、そしてフェノール・クロロホルム層の3層に分離させた。中間層を構成する変性タンパク質を混入させないように水層のみを採取した後、中間層が確認できなくなるまで前記フェノール・クロロホルム混合液による処理を数回繰り返し行った。次に、最後に得られた水層サンプルに終濃度50μg/mlになるようRNase Aを加えて50℃で1時間ほどインキュベートしてRNAを分解した。続いて、前述の溶解バッファーを加えて再びプロテイナーゼK処理して水層サンプル中のRNase Aを失活させた。次に、前述のフェノール・クロロホルム混合液を等量加えて再びフェノール・クロロホルム処理を行った。処理後の水層の容量に対して3M 酢酸ナトリウムを1/10容量、及びイソ・プロパノールを等量加えて静かに撹拌した。最後に、析出してくるゲノムDNAをガラス棒で絡め取るか、室温にて3000xgで10分間遠心処理を行い、それぞれの検体から目的のゲノムDNAを得た。
(Nucleic acid extraction step) Extraction of genomic DNA First, peripheral blood was obtained from samples diagnosed as alveolar microlithiasis and 188 healthy volunteer samples. Next, lysis buffer (final concentration: 100 μg / ml proteinase K, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM CaCl 2 , 1% SDS) is added to 5 ml of peripheral blood of each specimen, and incubated at 50 ° C. for 30 minutes. Cells were lysed. Subsequently, an equal amount of phenol saturated with TE buffer was added to the cell lysate, and the container was inverted and mixed several times. Next, centrifugation was performed at 3000 × g for 10 minutes at room temperature to separate the aqueous layer and the phenol layer. Subsequently, only the upper water layer was collected and transferred to a new container. Next, an equal amount of a phenol / chloroform mixed solution (1: 1 mixing ratio) was added to the aqueous layer, and the container was inverted again and mixed several times. Centrifugation was again performed at 3000 xg for 10 minutes at room temperature to separate into three layers, an aqueous layer, an intermediate layer (denatured protein layer), and a phenol / chloroform layer. After collecting only the aqueous layer so as not to mix the denatured protein constituting the intermediate layer, the treatment with the phenol / chloroform mixed solution was repeated several times until the intermediate layer could not be confirmed. Next, RNase A was added to the finally obtained aqueous layer sample to a final concentration of 50 μg / ml, and the mixture was incubated at 50 ° C. for about 1 hour to degrade RNA. Subsequently, the above lysis buffer was added and the proteinase K was again treated to deactivate RNase A in the aqueous layer sample. Next, an equal amount of the above-mentioned phenol / chloroform mixed solution was added, and the phenol / chloroform treatment was performed again. 1/10 volume of 3M sodium acetate and an equivalent amount of iso-propanol were added to the volume of the aqueous layer after the treatment, and the mixture was gently stirred. Finally, the precipitated genomic DNA was entangled with a glass rod or centrifuged at 3000 × g for 10 minutes at room temperature to obtain the desired genomic DNA from each specimen.
(遺伝子改変検出工程)
前記核酸抽出工程で得られた検体のゲノムDNAを用いて既知の改変の検出を行った。改変Aの検出には、LNAプローブを用いた5'→3'ヌクレアーゼアッセイ・リアルタイムPCR法を、また改変Bの検出には、PNA−LNA−PCR clamp法を使用した。LNAプローブを用いた5'→3'ヌクレアーゼアッセイ・リアルタイムPCR法は、両末端が蛍光物質と消光物質とでそれぞれ修飾されたLNAを含むプローブを用いてTaq DNAポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性を利用してリアルタイムPCRを行うものであり、その原理はタカラ バイオのTaqManプローブ法と同じである。PNA−LNA−PCR clamp法は、非特許文献7に寄った。
(Gene alteration detection process)
Known alterations were detected using the genomic DNA of the specimen obtained in the nucleic acid extraction step. For detection of modification A, a 5 ′ → 3 ′ nuclease assay real-time PCR method using an LNA probe was used, and for detection of modification B, a PNA-LNA-PCR clamp method was used. 5 ′ → 3 ′ nuclease assay / real-time PCR method using LNA probe, 5 ′ → 3 ′ nuclease activity of Taq DNA polymerase using a probe containing LNA modified at both ends with a fluorescent substance and a quencher The principle is the same as that of Takara Bio's TaqMan probe method. The PNA-LNA-PCR clamp method was approached by Non-Patent Document 7.
A.リアルタイムPCR反応液の調製 A. Preparation of real-time PCR reaction solution
(1)PCR用基本反応液の調製 「PCR用基本反応液」として以下の試薬を混合して調製した。25mM TAPS(pH9.3)、50mM KCl、2mM MgCl2、1mM 2−mercaptoethanol、200μM 各dNTP(=dATP,dTTP,dGTP,dCTP)、1.25U TAKARA Ex Taq HS(タカラ バイオ)。 (1) Preparation of PCR basic reaction solution The "PCR basic reaction solution" was prepared by mixing the following reagents. 25 mM TAPS (pH 9.3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl 2 , 1 mM 2-mercaptoethanol, 200 μM each dNTP (= dATP, dTTP, dGTP, dCTP), 1.25 U TAKARA Ex Taq HS (Takara Bio).
(2)改変A検出用反応液の調製 上記「PCR基本反応液」に、改変A用増幅プライマーとしてフォワード側(F)プライマーとリバース側(R)プライマーをそれぞれ200mMずつ添加した。改変A用増幅プライマーのFプライマーの配列は、配列番号8で表される。改変A用増幅プライマーのRプライマーの配列は、配列番号9で表される。さらに、改変A検出用LNAプローブを100nM添加した。改変A検出用LNAプローブの塩基配列は配列番号12で表される。改変A検出用LNAプローブの塩基配列のうち第4位のT、7位のC、11位のT、15位のC、18位のCはLNAによって構成されている。また、当該LNAプローブの5'末端は蛍光色素6−FAMに、また3'末端は蛍光抑制物質BHQ1によって修飾されている。 (2) Preparation of modified A detection reaction solution 200 mM each of forward (F) primer and reverse (R) primer were added to the “PCR basic reaction solution” as modified A amplification primers. The sequence of the F primer of the modified A amplification primer is represented by SEQ ID NO: 8. The sequence of the R primer of the modified A amplification primer is represented by SEQ ID NO: 9. Furthermore, 100 nM of a modified A detection LNA probe was added. The base sequence of the modified A detection LNA probe is represented by SEQ ID NO: 12. Of the base sequence of the modified A detection LNA probe, the 4th T, 7th C, 11th T, 15th C and 18th C are composed of LNA. Further, the 5 ′ end of the LNA probe is modified with a fluorescent dye 6-FAM, and the 3 ′ end is modified with a fluorescence inhibitor BHQ1.
(3)改変B検出用反応液の調製 上記「PCR基本反応液」に、改変B用増幅プライマーとしてFプライマーとRプライマーをそれぞれ200mMずつ添加した。改変B用増幅プライマーのFプライマーの配列は、配列番号10で表される。改変B用増幅プライマーのRプライマーの配列は、配列番号11で表される。さらに、改変B検出用LNAプローブを100nMとPNAクランププライマーを5μM添加した。改変B検出用LNAプローブの塩基配列は配列番号13で表される。改変B検出用LNAプローブの塩基配列のうち第10位のTがLNAによって構成されている。また、当該LNAプローブの5'末端は蛍光色素6−FAMに、また3'末端は蛍光抑制物質BHQ1によって修飾されている。PNAクランププライマーの塩基配列は配列番号14で表される。PNAクランププライマーは全塩基がPNAで構成されている。 (3) Preparation of reaction solution for detection of modified B 200 mM each of F primer and R primer as amplification primers for modified B were added to the “PCR basic reaction solution”. The sequence of the F primer of the modified B amplification primer is represented by SEQ ID NO: 10. The sequence of the R primer of the modified B amplification primer is represented by SEQ ID NO: 11. Further, 100 nM of the modified B detection LNA probe and 5 μM of the PNA clamp primer were added. The base sequence of the modified B detection LNA probe is represented by SEQ ID NO: 13. In the base sequence of the modified B detection LNA probe, the 10th T is constituted by LNA. Further, the 5 ′ end of the LNA probe is modified with a fluorescent dye 6-FAM, and the 3 ′ end is modified with a fluorescence inhibitor BHQ1. The base sequence of the PNA clamp primer is represented by SEQ ID NO: 14. The PNA clamp primer is composed of PNA at all bases.
前記LNAプローブはいずれもIDT社に、またPNAクランププライマーはグライナージャパン社にそれぞれ合成委託した。 The LNA probes were outsourced to IDT, and the PNA clamp primer was outsourced to Greiner Japan.
前記(2)、(3)のそれぞれの改変検出用反応液に、前記核酸抽出工程で得られた検体のゲノムDNA25μgを加えて最終総量が25μlになるように調節した。続いて、それぞれの反応液について次のリアルタイムPCRを行った。 25 μg of genomic DNA of the sample obtained in the nucleic acid extraction step was added to each modified detection reaction solution of (2) and (3) to adjust the final total amount to 25 μl. Subsequently, the following real-time PCR was performed for each reaction solution.
B.リアルタイムPCR反応
Ex Taqの5'→3'ヌクレアーゼ活性を利用したリアルタイムPCRは、Smart Cycler II(Cepheid Sunnyvale社)を用いてモニタリングした。PCR反応のサイクルは、95℃で30秒保持した後、95℃3秒と56℃30秒のステップを45サイクルで行い、各サイクルにおける蛍光強度を測定した。リアルタイムPCR反応を各検体一人一人について行い、ヒトSLC34A2遺伝子における既知の改変について検出を行った。
B. Real-Time PCR Reaction Real-time PCR using the 5 ′ → 3 ′ nuclease activity of Ex Taq was monitored using Smart Cycler II (Cepheid Sunnyvale). The PCR reaction cycle was maintained at 95 ° C. for 30 seconds, and then a step of 95 ° C. for 3 seconds and 56 ° C. for 30 seconds was performed in 45 cycles, and the fluorescence intensity in each cycle was measured. A real-time PCR reaction was performed for each specimen, and known alterations in the human SLC34A2 gene were detected.
(結果)
図9にその結果を示す。各グラフの縦軸は蛍光強度であり、また横軸はPCRのサイクル数を示す。まず、188人の健常人ボランティア検体に関しては全員が同じ蛍光パターンを示したことから、ここではAにその一人の結果を代表図として提示する。改変検出用反応液は、改変A、改変BのいずれもPCRのサイクル数が増加しても蛍光強度に大きな変化は見られなかった。この結果は、当該188人の健常人ボランティア検体(376ゲノム中)のヒトSLC34A2遺伝子には改変A、Bとも存在しないことを意味している。
(result)
FIG. 9 shows the result. The vertical axis of each graph represents the fluorescence intensity, and the horizontal axis represents the number of PCR cycles. First, since all the 188 healthy volunteer samples showed the same fluorescence pattern, the result of one of them is shown in A here as a representative diagram. In the modification detection reaction solution, neither fluorescence modification A nor modification B showed a significant change in fluorescence intensity even when the number of PCR cycles increased. This result means that neither the modified A nor the B exists in the human SLC34A2 gene of the 188 healthy volunteer samples (in the 376 genome).
一方、臨床症状から肺胞微石症と診断された検体では、Bに示す蛍光パターンを示した。改変A検出用反応液ではPCRのサイクル数が増加しても蛍光強度に大きな変化は見られなかった。この結果は、当該検体のヒトSLC34A2遺伝子には改変Aが存在しないことを意味している。これに対して、改変B検出用反応液ではPCRのサイクル数が25サイクル以上で急激な蛍光強度の増加が観察された。この結果は、当該検体のヒトSLC34A2遺伝子には改変Bが存在することを意味している。 On the other hand, the specimen diagnosed as alveolar microlithiasis from the clinical symptoms showed the fluorescence pattern shown in B. In the modified A detection reaction solution, no significant change in fluorescence intensity was observed even when the number of PCR cycles was increased. This result means that the modified A does not exist in the human SLC34A2 gene of the sample. In contrast, in the modified B detection reaction solution, a rapid increase in fluorescence intensity was observed when the PCR cycle number was 25 cycles or more. This result means that the modified B exists in the human SLC34A2 gene of the sample.
(考察)
上記結果から、188人の健常人ボランティア検体(376ゲノム中)のヒトSLC34A2遺伝子に既知の改変である改変A,改変Bはいずれも存在しないことが判明した。これに対して、臨床症状から肺胞微石症と診断された当該検体のヒトSLC34A2遺伝子には改変Bがヘテロ、ないしはホモで存在することが明らかとなった。したがって、この検体は改変BによるヒトIIB型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質の機能の失活が肺胞微石症の発症原因である可能性が高いことが遺伝子レベルでも示唆された。
(Discussion)
From the above results, it was found that neither modification A nor modification B, which are known modifications, were present in the human SLC34A2 gene of 188 healthy volunteer samples (in the 376 genome). On the other hand, it has been clarified that the modified B is heterozygous or homozygous in the human SLC34A2 gene of the specimen diagnosed as alveolar microlithiasis based on clinical symptoms. Therefore, it was suggested at the gene level that inactivation of the function of human IIB type sodium-phosphate cotransporter protein by the modified B is highly likely to cause alveolar microlithiasis.
<<実施例2>> << Example 2 >>
<肺胞微石症患者のヒトSLC34A2遺伝子における遺伝型の確認> <Confirmation of genotype in human SLC34A2 gene in patients with alveolar microlithiasis>
前記実施例1の臨床症状から肺胞微石症と診断された検体は、既知の改変である改変Bを有することが判明した。そこで、改変B、及び改変Bに対応する野生型の塩基配列が決定可能な配列番号10で表されるプライマーを用いて、当該検体に対してヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列決定を行った。コントロールとして改変A,改変Bのいずれも存在しないことが判明した健常人ボランティア検体一人についても同様に行った。 It was found that the specimen diagnosed as alveolar microlithiasis from the clinical symptoms of Example 1 had modification B, which is a known modification. Therefore, the nucleotide sequence of the human SLC34A2 gene was determined for the specimen using the primer represented by SEQ ID NO: 10 capable of determining the modified B and the wild-type nucleotide sequence corresponding to the modified B. The same procedure was performed for one healthy volunteer sample that was found to contain neither modified A nor modified B as a control.
(PCR増幅産物の配列確認)
前記実施例1−BのリアルタイムPCR反応で得られた改変B検出用反応液のPCR増幅産物をWizard PCR Prep DNA purification Kit(プロメガ社)を用いて精製した後、クローニングで用いた前記配列番号10で表されるFプライマーをプライマーとして、BigDye Terminator v1.1 cycle sequencing Kit(ABI社)を用いて添付のプロトコルに従って反応を行った。自動DNAシークエンサー(ABI PRISM 310:ABI社)でこの反応産物の塩基配列を直接読んだ。
(Confirmation of sequence of PCR amplification product)
The PCR amplification product of the modified B detection reaction solution obtained by the real-time PCR reaction of Example 1-B was purified using Wizard PCR Prep DNA purification Kit (Promega), and then used for cloning. The reaction was carried out using BigDye Terminator v1.1 cycle sequencing Kit (ABI) according to the attached protocol using the F primer represented by The base sequence of this reaction product was directly read with an automatic DNA sequencer (ABI PRISM 310: ABI).
(結果)
図10にその結果を示す。まず、Aで示すように臨床症状から肺胞微石症と診断された検体の増幅産物の塩基配列は、改変Bの配列を表す波形のみが得られ、野生型の配列を表す波形との混合波形は観察できなかった。この結果は、臨床症状から肺胞微石症と診断された検体が改変Bをホモで有しており、野生型と改変型のヘテロではないことを示している。一方、Bで示すように健常人ボランティア検体の増幅産物の塩基配列は、野生型の配列を表す波形のみが得られた。これにより当該検体のヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型は改変型ホモであり、少なくとも改変Bをホモ接合で有することが、当該検体が肺胞微石症を発症した原因であることが確定された。
(result)
FIG. 10 shows the result. First, as shown by A, the base sequence of the amplification product of the specimen diagnosed as alveolar microlithiasis from clinical symptoms is obtained only as a waveform representing the modified B sequence, and mixed with the waveform representing the wild type sequence. The waveform could not be observed. This result indicates that the specimen diagnosed as alveolar microlithiasis from clinical symptoms has the modified B homozygous and is not a heterozygous of the wild type and the modified type. On the other hand, as indicated by B, only the waveform representing the wild type sequence was obtained as the base sequence of the amplification product of the healthy volunteer sample. As a result, it was determined that the genotype of the human SLC34A2 gene in the sample is a modified homozygote and that at least the modified B is homozygous is the cause of the alveolar microlithiasis.
Claims (36)
前記抽出された核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列が、配列番号1で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変を有するかを検出する遺伝子改変検出工程と、
からなる肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定方法。 A nucleic acid extraction step of extracting human-derived nucleic acid;
A genetic modification detection step for detecting whether the base sequence of the human SLC34A2 gene that can be contained in the extracted nucleic acid has a known modification derived from the modification from the wild-type base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
A method for determining the onset of alveolar microlithiasis, which comprises determining the possibility of the onset of alveolar microlithiasis.
前記抽出された核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列が、配列番号1で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する遺伝子改変検出工程と、
前記抽出された核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型が、野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する遺伝型判定工程と、
からなる肺胞微石症発症判定方法。 A nucleic acid extraction step of extracting human-derived nucleic acid;
A genetic modification detection step for detecting whether the base sequence of the human SLC34A2 gene that can be contained in the extracted nucleic acid is modified from the wild-type base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
Genotyping to determine whether the genotype of the human SLC34A2 gene that can be contained in the extracted nucleic acid is wild-type homo, modified homo, wild-type and modified hetero, or modified hetero Process,
A method for determining the onset of alveolar microlithiasis.
塩基の欠失、置換、又は付加である請求項1から4のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。 The mode of modification to be detected in the genetic modification detection step is:
The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to any one of claims 1 to 4, wherein the deletion, substitution, or addition is a base.
配列番号1で表される第13290位のTから第13304位のGまでの塩基配列が配列番号3で表される塩基配列で置換された改変である請求項1から4のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。 Known modifications to be detected in the genetic modification detection step are:
The base sequence from T at position 13290 to G at position 13304 represented by SEQ ID NO: 1 is a modification in which the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is substituted. Method for determining the onset of alveolar microlithiasis.
配列番号1で表される塩基配列において第8イントロンのスプライシングドナー部位のGがAに置換された改変に基づくものである請求項1から4のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。 Known modifications to be detected in the genetic modification detection step are:
The determination of the onset of alveolar microlithiasis according to any one of claims 1 to 4, which is based on a modification in which G in the splicing donor site of the eighth intron is substituted with A in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Method.
配列番号1で表される野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列からの改変に由来する既知の改変の塩基配列の全部、又は連続する少なくとも14塩基以上からなる一部を有するポリヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションにより検出する方法である請求項1から7のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。 The method for detecting a modification in the genetic modification detection step is:
A probe comprising a polynucleotide having the entire base sequence of a known modification derived from the base sequence modification of the wild-type human SLC34A2 gene represented by SEQ ID NO: 1 or a part consisting of at least 14 consecutive bases. The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to any one of claims 1 to 7, which is a method of detecting by hybridization.
配列番号1で表される野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列からの改変に由来する既知の改変の塩基配列が存在し得る領域の全部又は一部の塩基配列の決定により検出する方法である請求項1から7のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。 The method for detecting a modification in the genetic modification detection step is:
A method for detection by determining the base sequence of all or part of a region where a known modified base sequence can be present derived from a modification from the base sequence of the wild-type human SLC34A2 gene represented by SEQ ID NO: 1. The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to any one of 1 to 7.
配列番号1で表される野生型ヒトSLC34A2遺伝子の塩基配列の全部又は連続する少なくとも14塩基以上からなる一部を有するポリヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションにより検出する方法である請求項2に記載の肺胞微石症発症判定方法、又は請求項3若しくは4に記載の肺胞微石症発症判定方法のうち請求項2に従属する肺胞微石症発症判定方法のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。 The method for detecting a modification in the genetic modification detection step is:
The method according to claim 2, wherein the detection is carried out by hybridization using as a probe a polynucleotide having the entire nucleotide sequence of the wild-type human SLC34A2 gene represented by SEQ ID NO: 1 or a portion comprising at least 14 consecutive nucleotides. The lung according to any one of the method for determining the onset of alveolar microlithiasis or the method for determining the onset of alveolar microlithiasis dependent on claim 2 among the methods for determining the onset of alveolar microlithiasis according to claim 3 or 4. Cystolithiasis onset determination method.
前記核酸抽出工程で抽出された核酸においてヒトSLC34A2遺伝子が存在し得る領域の全部、又は一部の塩基配列を決定し、当該塩基配列と配列番号1で表される野生型遺伝子の塩基配列との比較により検出する方法である請求項2に記載の肺胞微石症発症判定方法、又は請求項3若しくは4に記載の肺胞微石症発症判定方法のうち請求項2に従属する肺胞微石症発症判定方法のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。 The method for detecting a modification in the genetic modification detection step is:
In the nucleic acid extracted in the nucleic acid extraction step, the whole or part of the region where the human SLC34A2 gene can exist is determined, and the base sequence and the base sequence of the wild-type gene represented by SEQ ID NO: 1 are determined. The alveolar microlithiasis onset determination method according to claim 2, or the alveolar microlithiasis onset determination method according to claim 3 or 4, which is a detection method by comparison. The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to any one of the methods for determining the onset of stone disease.
核酸増幅法によって目的とする核酸増幅産物が増加したかによって検出する方法である請求項1から7のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。 The method for detecting a modification in the genetic modification detection step is:
The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to any one of claims 1 to 7, which is a method of detecting whether the target nucleic acid amplification product has increased by the nucleic acid amplification method.
核酸増幅法によって増幅される野生型の核酸増幅産物と、改変型の核酸増幅産物の塩基数の比較によって検出するする方法である請求項2に記載の肺胞微石症発症判定方法、又は請求項3若しくは4に記載の肺胞微石症発症判定方法のうち請求項2に従属する肺胞微石症発症判定方法のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。 The method for detecting a modification in the genetic modification detection step is:
The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to claim 2, which is a method of detecting by comparing the number of bases of a wild-type nucleic acid amplification product amplified by a nucleic acid amplification method and a modified nucleic acid amplification product. 5. The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to any one of the methods for determining the onset of alveolar microlithiasis according to claim 2 among the methods for determining the onset of alveolar microlithiasis according to item 3 or 4.
RFLPを利用した制限酵素のよる野生型と改変型での切断パターンよって検出する方法である請求項2に記載の肺胞微石症発症判定方法、又は請求項3若しくは4に記載の肺胞微石症発症判定方法のうち請求項2に従属する肺胞微石症発症判定方法のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。 The detection of the modification in the genetic modification detection step,
5. The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to claim 2, or the alveolar microscopic disease according to claim 3 or 4, wherein the detection method is based on a cleavage pattern of wild type and modified type using a restriction enzyme utilizing RFLP. The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to any one of the methods for determining the onset of alveolar microlithiasis according to claim 2 among the methods for determining the onset of stone disease.
前記抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号2で表される野生型のアミノ酸配列からの既知のアミノ酸改変を有するかを検出するアミノ酸改変検出工程と、
からなる肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定方法。 A protein extraction step of extracting human-derived protein;
An amino acid for detecting whether the amino acid sequence of the human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein that can be contained in the extracted protein has a known amino acid modification from the wild-type amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A modification detection step;
A method for determining the onset of alveolar microlithiasis, which comprises determining the possibility of the onset of alveolar microlithiasis.
前記抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号2で表される野生型のアミノ酸配列からアミノ酸改変されたかを検出するアミノ酸改変検出工程と、
前記抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質をコードするヒトSLC34A2遺伝子の遺伝型が野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する第二遺伝型判定工程と、
からなる肺胞微石症発症判定方法。 A protein extraction step of extracting human-derived protein;
An amino acid modification detection step for detecting whether the amino acid sequence of the human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein that can be contained in the extracted protein has been modified from the wild-type amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; ,
The genotype of the human SLC34A2 gene encoding the human type IIb sodium-phosphate cotransporter protein that can be contained in the extracted protein is a wild type homozygote, a modified homozygote, a wildtype and a modified heterotype, or a modified type A second genotyping process to determine which is a heterogeneity,
A method for determining the onset of alveolar microlithiasis.
肺組織から抽出する請求項15又は16に記載の肺胞微石症発症判定方法。 The protein in the protein extraction step is
The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to claim 15 or 16, wherein the method is extracted from lung tissue.
アミノ酸の欠失、置換、又は付加である請求項15から17のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。 The mode of amino acid modification to be detected in the amino acid modification detection step is:
The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to any one of claims 15 to 17, which is deletion, substitution, or addition of an amino acid.
配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸改変である請求項15から17のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。 The amino acid modification to be detected in the amino acid modification detection step is:
The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to any one of claims 15 to 17, which is an amino acid modification having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸改変である請求項15から17のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。 The amino acid modification to be detected in the amino acid modification detection step is:
The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to any one of claims 15 to 17, which is an amino acid modification having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
既知のアミノ酸改変型ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列において、該アミノ酸配列のアミノ酸改変された全部又は連続する少なくとも5アミノ酸以上の一部を有するポリペプチドを抗原とした抗体を用いる抗原抗体反応法により検出する方法である請求項15から20のいずれか一に記載の肺胞微石症の発症可能性を判定する方法。 The method for detecting amino acid modification in the amino acid modification detection step,
An antibody comprising, as an antigen, a polypeptide having the amino acid sequence of a known amino acid-modified human type IIb sodium-phosphate symporter protein having all or a part of at least 5 consecutive amino acids modified in the amino acid sequence 21. The method for determining the possibility of developing alveolar microlithiasis according to any one of claims 15 to 20, which is a method of detection by an antigen-antibody reaction method used.
配列番号2で表される野生型ヒトIIb型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列の全部又は連続する少なくとも5アミノ酸以上の一部を有するポリヌクレオチドを抗原とした抗体を用いる抗原抗体反応法により検出する方法である請求項16に記載の肺胞微石症発症判定方法、又は請求項17若しくは18に記載の肺胞微石症発症判定方法のうち請求項16に従属する肺胞微石症発症判定方法のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。 The method for detecting an amino acid modification in the amino acid modification detection step is a method of detecting a polymorphism having the whole amino acid sequence of the wild-type human type IIb sodium-phosphate symporter protein represented by SEQ ID NO: 2 or a part of at least 5 consecutive amino acids. The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to claim 16, or the method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to claim 17 or 18, which is a method of detecting by an antigen-antibody reaction method using an antibody having nucleotides as antigens. The method for determining the onset of alveolar microlithiasis according to any one of the preceding claims.
前記抽出された核酸に含まれ得るヒトSLC34A2遺伝子の発現制御領域の塩基配列が、配列番号7で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する発現制御領域改変検出工程と、
からなる肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定方法。 A nucleic acid extraction step of extracting human-derived nucleic acid;
An expression control region modification detection step for detecting whether the base sequence of the expression control region of the human SLC34A2 gene that can be contained in the extracted nucleic acid is modified from the wild-type base sequence represented by SEQ ID NO: 7;
A method for determining the onset of alveolar microlithiasis, which comprises determining the possibility of the onset of alveolar microlithiasis.
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