JP2007001788A - 結晶化プレートおよび自動結晶化システム - Google Patents

Abstract

【課題】結晶化プレート上に設けられたウェル内に、分析対象の蛋白質等の生体高分子を含む溶液を滴下することで前記生体高分子を結晶化させて抽出する際に、抽出された結晶を見逃すことなく撮像により観察することを可能にする、結晶化プレートおよび該結晶化プレートを用いた自動結晶化システムを提供すること。
【解決手段】所定の生体高分子を含む溶液が供給される１以上のウェルを備え、このウェル内で前記生体高分子を結晶化させる結晶化プレートにおいて、前記ウェルを、溶液を投入する開口部から下方に向けて前記溶液をウェル内部に導くように傾斜する壁面と、前記壁面に連続した底部とで形成するとともに、前記底部に連続した前記壁面の一部分を、前記底部よりほぼ鉛直上方に向かって立ち上がるように構成した。
【選択図】図２

Description

本発明は、蛋白質を中心とした生体高分子等の試料をウェル内で結晶化させて、その結晶化状態を観察するための結晶化プレートと、この結晶化プレートを用いて前記結晶を成長させるための自動結晶化システムに関するものである。

一般に、蛋白質を構成するアミノ酸は互いに結合（ペプチド結合）され、その種類・順序は全てゲノム上に遺伝情報として記憶されているが、これらの遺伝情報だけでは蛋白質の働き（分子機能）を知ることができない。それは、蛋白質の構造が一次元的な鎖状の結合により構成されているのではなく、三次元的に組み上がった立体的な分子構造を備えているためである。そして、このような蛋白質の分子機能は、その分子構造に大きく依存していると考えられている。

そこで近年、蛋白質の同士の結合（ペプチド結合）のもつ分子構造をＸ線解析等の手法を用いて解析することで、分子レベルで蛋白質の分子機能の働きを特定（スクリーニング）する研究が行われている。すなわち、蛋白質の基本構造と、その基本構造に対応した分子機能を特定することで、ターゲットとする蛋白質の構造を予想することが容易になる。このような蛋白質を初めとする生体高分子の分子機能を解明することで、例えば高齢化社会に対応できるゲノム創薬（ゲノム関連情報に基づいて新薬の開発）や、テーラーメイド医療（個人の遺伝的背景にあった薬の処方や治療）の早期実現といった実効を得ることができる。

ところで、前述のような蛋白質の立体構造（分子構造）を解析する際には、蛋白質を結晶化させ、その分子配列を３次元的に整列させた状態とする必要があり、そのための手法として、マイクロバッチ法と呼ばれる抽出法が知られている。このマイクロバッチ法は、解析対象となる蛋白質を、溶液に溶かし込んで結晶化プレート中に設けられた微小サイズのウェル内に滴下した後に、上部をパラフィンオイル等で封入し、所定条件下で一定時間経過させることで、ウェルの底部に蛋白質を結晶化した状態で成長させ、抽出するものである。

そして従来のウェルは、ノズル等の溶液供給手段から溶液を滴下し易くする等のために、図７に示すように、その開口部が底部よりも大きくなるような構造、すなわち、逆切頭円錐形状に構成されている。
特開２００１−２１３６９９号公報 特開２００４−３２３３３６号公報

ところで、蛋白質が構造解析に適した質のよい結晶化構造になる条件は極めて厳しく、まれにしか良好な結晶化が起こらない。そしてその結晶化条件を見出すためには、試料（結晶化させる対象の蛋白質）の種類と溶液の種類（溶液を構成する基本溶剤の種類やその成分比率で定まる）との組み合わせや温度等のパラメータを逐次変えなければならず、試すべき結晶化条件は膨大な数に上る。さらに各結晶化工程は、長時間かかり、また、所望する結晶化構造が得られるか否かを一つ一つ判定しなければならない。

具体的には、結晶化プレート上に形成された多数のウェル中に、組み合わせ条件の異なる溶液を滴下し、その溶液に含まれる蛋白質が質の良い結晶化構造を伴って抽出されるか否かを確認する作業を繰り返す必要がある。

そして従来は、その判定のために、上方から顕微鏡等を用いてウェルを撮像し、得られた画像から、ウェル内に抽出された結晶化構造の状態を目視乃至自動判別するという作業を行っている。

しかしながら、前述したように、従来の逆切頭円錐形状をなすウェルであると、結晶を見落とす恐れがある。その理由を以下に説明する。

従来型のウェルＷで結晶が析出した場合を示す画像の模式図を図８、実際の画像を図９に示す。この図から明らかなように、ウェル底面部分Ｗ１とその周囲（ウェル側周面部分Ｗ２）とで、厚みが異なることから明度にコントラストが付き、底面部分が明るくなる。図８（ａ）に示すように、結晶Ｃがウェル底面Ｗ１の直上部分に析出した場合は、明るいため問題なく結晶Ｃを自動乃至目視で検出できる。

ところが、同図（ｂ）あるいは図９に示すように、側周面部分Ｗ２に結晶Ｃが生成されたとき、上から見ると、暗い側周面部分Ｗ２に結晶Ｃが重なってしまい、これを見落とすことが生じ得る（図９では、画面右下、左、上等に結晶Ｃがあるが非常に見にくく、画像処理による自動判断では判別が難しい）。もちろん、これを画像処理などで回避すべく図った例もあるが、複雑なソフトウェアが必要となるうえに、抜本的な解決が難しい。

そして、このような見落としは、上述したように結晶化がまれにしか起こらず、結晶化させるまでの煩雑な作業とその時間を考えれば、大きなロスとなる。

本発明は、上述のような問題点を鑑みてなされたものであり、簡単でかつ確実に、ウェル内で生成した試料の結晶状態を検出できるようにすることをその主たる所期課題としたものである。

すなわち、本発明に係る結晶化プレートは、上面を開口部とする１以上の有底ウェルを有し、溶液に溶かし込んだ試料を前記ウェル内で結晶化させる結晶化プレートであって、前記ウェルの側周面のうち、ウェル底面から所定高さに至るまでの部分を、ほぼ鉛直上方に向かって立ち上がるように形成していることを特徴とする。

このようなものであれば、溶液をウェルの前記所定高さまで入れることにより、ウェルを開口部上方から見た際に、結晶がどこに生成されようとも、ウェルの側周面と重なることが無く、確実に結晶を検出し、その結晶化構造を確認すること等ができる。また、画像処理などに複雑なソフトウェアは必要なく、簡単で製造にも負担とならないウェル形状の改造だけで実現できる。

溶液の滴下を容易化するためには、前記ウェルの側周面のうち、前記所定高さより上方部分を傾斜させ、ウェルの横断面が、開口部に向かうに連れ、大きくなるように構成しておけばよい。

前記ウェルが複数設けられている場合に、異なる結晶化条件で作成された試料を含む溶液が、滴下されるべきウェルを超えて、他のウェルに混入することを防止するには、各ウェルの開口部の間において、前記溶液を隣のウェル内に混入させないための遮蔽部を設けておくことが望ましい。

より具体的には、前記遮蔽部は、各開口部を囲むように形成された溝部により形成されていることが好ましい。このように、プレート上面に各ウェルを囲むように溝部を設けることで、ウェルから溢れた溶液等が、プレート上面を伝って拡がる場合でも、まず溝部と上面とのエッジ部分で、それ以上拡がることなく停止する。さらに、それ以上の溶液等があふれ出た場合でも、溝部に入って、隣のウェルに混入することを防止できる。

また、ウェル底面の周縁形状は、略円形であることが好ましい。ウェル底面を略円上にすることによって、滴下された溶液が底面において略均一に拡がり易くなるとともに、底面形状が矩形である場合に比して、結晶化した試料が底面の周縁形状に影響され難くなるという効果がある。

また、本発明は、前述のような結晶化プレートを用いて、試料の結晶を成長させるための自動結晶化システムであって、前記ウェル内に前記溶液及び試料を供給する供給装置と、前記ウェル内を前記開口部上方より撮像する撮像装置と、前記ウェル内で析出した試料の結晶が、特定の結晶状態であるか否かを、撮像装置で撮像した画像に基づいて判断する判断部と、を備えていることを特徴とする自動結晶化システムに係るものである。

このような自動結晶化システムであれば、前述したウェル形状の特徴によって、撮像された画像から析出した結晶を確実に検出して、それが所望の結晶状態であるか否かを正確に判別することができる。また、自動化により、結晶化させる対象である試料の種類と、その溶液の種類（溶液を構成する基本溶剤の成分比率）との膨大な組み合わせについて、所望の結晶構造が得られるか否かを判別する作業を高速に処理することができる。

その結晶構造が得られたときの条件を記録して再現させることを可能ならしめるには、前記判断部で特定の結晶状態であると判断された場合に、そのときの溶液の種類、結晶構造等を示す結晶化条件データを少なくとも記録する結晶化条件記録部をさらに備えているものが好適である。

上述のように、本願発明に係る結晶化プレートおよび自動結晶化システムによれば、簡単な構成でありながら、ウェル内で析出した試料の結晶化構造を見逃すことなく確実に検出できるという効果が得られる。

以下、本願発明の一実施形態について、図１から図６を参照して説明する。

図１は、本実施形態に係る結晶化プレート１を上方から見た概略図であり、図２はその部分縦断面図、図３は斜視図である。また、図４は、結晶化プレート１に含まれるウェル１０の断面を拡大して示す断面図である。図５は、この結晶化プレート１で析出した蛋白質の結晶化した様子を示す画像データである。図６は、この結晶化プレート１を用いて自動で結晶を成長させる自動結晶化システムの概要を表した概略斜視全体図である。

図１〜図３に示すように、結晶化プレート１は、厚肉の矩形板状をなすプレート本体２と、そのプレート本体２の周縁からほぼ垂直に立ち上がる壁部３と、その壁部３の外周面の所定高さ位置に周設された鍔部４とを備えたものである。プレート本体１には、互いに同形状をなす複数（例えばここでは９６個）のウェル１０を、等間隔で縦横に形成している。鍔部４は、当該結晶化プレート１を後述するプレート保管庫２３に収納する際に、そのプレート保管庫２３の内部に設けられた溝にスライド係合させるためのものである。

しかして、前記ウェル１０は、上面を開口部１３とする有底穴であり、特に図４に詳細に示すように、底面１１と、その底面１１から上方に向かって立ち上がる側周面１２とから形成されている。詳述すれば、底面１１は、平らな円形状をなすものである。側周面１２は、所定高さに至るまでの部分１２ａでは、ウェル底面１１から実質的に鉛直上方に向かって立ち上がる鉛直面であり（実際には製造の都合上、わずかに傾斜している）、さらにそこから開口部１３に至る部分１２ｂは、ウェル１０の横断面が、開口部１３に向かうに連れ大きくなるように傾斜させた傾斜面としている。

そして、ウェル底面１１から所定高さまでの円柱状の部分を、後述する試料である蛋白質及びその蛋白質を溶かし込む溶液（以下試薬ということもある）が供給される溶液収容部Ａとしている。また、この溶液収容部Ａより上の部分逆円錐状の部分を、後述する封入オイルが注がれる封入部Ｂとしている。なお、傾斜面１２ｂは、試薬やオイルの供給ノズル（後述する）とウェル１０との軸が多少ずれても、ウェル１０に確実に試薬や封入オイルが注入されるようにするためのものであり、その傾斜角度は、ウェル開口部１３の大きさ等に応じて適宜定めればよい。

また、ウェル開口部１３の周囲には、滴下される試薬が溢れ出して他のウェル内に入らないように防止するための遮蔽部である溝部５を形成している。この溝部５においてプレート本体２の上面２ａとの間で段差が形成され、仮に試薬等がウェル１０から溢れても、上面２ａを伝って拡がる力がこの段差部分で断ち切られるように作用する。また試薬等がそれ以上あふれ出た場合でも、溝部５に入って、隣接するウェル１０内に混入することを防止する。

このように構成したウェル１０には、上述したように、まず、所定蛋白質とその蛋白質を溶かし込む試薬とを、前記溶液収容部Ａまで入れ、その後、封入部Ｂにパラフィンオイルやシリコンオイル等を注いで封入する。そして、温度等を一定にした所定環境内におき、数週間をかけて結晶を成長させる。

このようにして試薬中で蛋白質が結晶化したときのウェル１０を、上方から顕微鏡を介して撮像し、得られた画像例を図５に示す。

この画像例から明らかなように、結晶Ｃがどこに生成されようとも、溶液収容部Ａの側周面が鉛直に起立しているため、結晶Ｃがウェル１０の側周面１２と重なること無く、明度が十分に得られるウェル底面１１上に必ず存在することとなる。したがって、例えば結晶状態を画像から自動判別する場合でも、画像処理などに複雑なソフトウェアを用いることなく、確実に結晶を検出し、その結晶化構造等を確認することができる。もちろん顕微鏡等を介して目視した場合でも同様の効果が得られる。

次に、前述の結晶化プレート１を用いて結晶を成長させるための自動結晶化システム２０について、図６を用いて簡単に付言説明しておく。

図６に示す自動結晶化システム２０は、結晶化プレート１のウェル１０に対して試薬や試料（蛋白質）、封入オイルを自動注入するとともに、その結晶化プレート１を保管し、一定期間毎に結晶化プレート１を取り出してウェル１０を観察し、結晶状態を判別して、所望の結晶が得られたものについて、その結晶化条件を記録するものであって、それら工程全てが自動で行われる。

具体的にこの自動結晶化システム２０は、結晶化プレート１等を搬送する搬送装置２４と、その搬送装置２４によって搬送されてきた結晶化プレート１の各ウェル１０に対して溶液、試料（蛋白質）、封入オイル）を供給する供給装置２２と、溶液等を供給済みの結晶化プレート１を所定時間収納するプレート保管庫２３と、プレート保管庫２３から搬送装置２４によって所定期間毎に搬送されてきた結晶化プレート１について、その各ウェル１０内の状態を観察する観察装置２１と、前記各装置を収容している温度調整室２５と、前記各装置の制御や情報授受を行う情報処理装置２６とを備えている。

搬送装置２４は、３軸搬送ロボットであり、情報処理装置２６からの指令で、結晶化プレート１を、その鍔部４に記載されたバーコードなどから特定し、把持して、観察装置２１、プレート保管庫２３、供給装置２２間で移動させる。

供給装置２２は、載置台２２３に置かれている複数の試薬、蛋白質、封入オイルについて、どれを用いるかを、情報処理装置２６からの指令信号に基づいて選択して吸入し、搬送装置２４によって載置台２２３に載せられた結晶化プレート１の各ウェル１０に、ノズル２２１から注入するものである。なお、試薬は、複数の基本試薬を異なる比率で試薬プレート７から取り込んで混ぜ合わせることで各種類を生成する。ノズル２２１は、試薬用、蛋白質用、封入オイル用の３本がひとまとめにしてあり、アーム２２２に支持されて三次元的に動くように構成してある。そして、例えば異なる結晶化条件となるように、試薬と蛋白質とを種類、比率等を変えるなど適宜調整して滴下し、その後、パラフィンオイルやシリコンオイル、またはこれらの混合したもの（この割合等も結晶成長に影響する）を滴下して封入する。

プレート保管庫２３は、棚であり、結晶化プレート１や、前記基本試薬を入れた試薬プレートを収納するための複数の収納部２３１を有している。

観察装置２１は、ＸＹステージ２１１や顕微鏡付き撮像装置２１２等を有し、搬送装置２４によってＸＹステージ２１１上に載置された結晶化プレート１の各ウェル１０を、当該ＸＹステージを移動させることで、その上方から撮像装置２１２で撮像するとともに、その画像データを情報処理装置２６に送信するものである。画像データは情報処理装置２６で２値化等の処理が施され、結晶状態が自動判定され、また随時ディスプレイ上で、その画像を見ることができるようにしてある。

情報処理装置２６は、ＣＰＵ、メモリ、入出力部等からなるコンピュータであり、メモリに記録した所定プログラムにしたがってＣＰＵやその周辺機器が協働することにより、上述した各装置の駆動制御を行う制御部２６１、判別部２６２、結晶化条件記録部２６３等としての機能を発揮する。判断部２６２は、画像データから特定の結晶状態であるか否かを例えば基準となる基準画像データとの比較により判断する。また、この判断部２６２は、条件絞り込みの高速化とハイスループットを実現すべく、結晶成長途中で明らかに結晶化しないものを画像データから自動判別し、それらを途中でアボートするようにしている。結晶化条件記録部２６３は、各ウェル１０における結晶成長条件のデータや、画像データを記録管理するもので、少なくとも判断部で特定の結晶状態となったものについて、その条件パラメータを記録保管する。このことにより、従来あまりにパラメータの組み合わせ数が膨大で、再現性に乏しいとされてきた蛋白質の結晶化条件を確実に記録し、再現させることができる。

このような自動結晶化システムによれば、前記結晶化プレート１のウェル１０中に析出した蛋白質の結晶を撮像し、その撮像結果によって抽出された結晶が所望の結晶状態であるか否かを見落とすことなく、正確に判別することができる。しかも、結晶化させる対象の蛋白質の種類と、その溶液の種類との膨大な組み合わせについて、所望の結晶構造が得られるか否かを判別する作業を高速かつ正確に自動処理することができる。

なお、本発明は、前記実施形態に限られるものではない。

例えば、ウェルの形状は、横断面円形状に限られないし、封入部の形状は部分逆円錐形状に限られず、例えばその部分の側周面が鉛直であっても構わない。

また、本発明は、蛋白質にのみ適用されるものではなく、薬剤を結晶化させてその形状から性質を判別したり、人工生成したペプチド、リボザイム等に炭酸カルシウムを混ぜて結晶化し、その形状によってスクリーニングを行うといった用途にも用いることができる。

その他、本発明はその主旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。

本発明の一実施形態に係る結晶化プレートの平面図。 同実施形態における結晶化プレートの部分側断面図。 同実施形態における結晶化プレートの斜視図。 同実施形態における結晶化プレートの部分拡大断面図。 同実施形態におけるウェルでの、蛋白質が結晶化した状態を示す上方から撮像した画像。 同実施形態における自動結晶化システムの模式的全体斜視図。 従来のウェル形状を示す断面図。 従来のウェル中で結晶化した蛋白質を示す模式図。 従来のウェル中で結晶化した蛋白質を示す画像。

符号の説明

１・・・ 結晶化プレート
１０・・・ ウェル
１１・・・ 底面
１２・・・ 側周面
２０・・・ 自動結晶化システム
２２・・・ 供給装置
２５・・・ 撮像装置
２６２・・・判別部
２６３・・・結晶化条件記録部

Claims (8)

1. 上面を開口部とする１以上の有底ウェルを有し、溶液に溶かし込んだ試料を前記ウェル内で結晶化させる結晶化プレートであって、
   前記ウェルの側周面のうち、ウェル底面から所定高さに至るまでの部分を、ほぼ鉛直上方に向かって立ち上がるように形成していることを特徴とする結晶化プレート。
2. 前記ウェルの側周面のうち、前記所定高さより上方部分を傾斜させ、ウェルの横断面が、開口部に向かうに連れ、大きくなるように構成している請求項１に記載の結晶化プレート。
3. 前記ウェルが複数設けられているとともに、これらの各ウェルの開口部が各々略同一平面上に形成されており、かつ、各開口部の間において、ウェル内に供給された前記溶液及び試料を、隣りのウェル内に混入させないための遮蔽部を備えている請求項１又は２に記載の結晶化プレート。
4. 前記遮蔽部が、各開口部を囲むように形成された溝部である請求項３に記載の結晶化プレート。
5. ウェル底面の周縁形状が、略円形である請求項１、２、３又は４に記載の結晶化プレート。
6. 前記試料が蛋白質等の生体高分子である請求項１、２、３、４又は５に記載の結晶化プレート。
7. 請求項１から５のいずれかに記載の結晶化プレートを用いて、試料の結晶を成長させるための自動結晶化システムであって、
   前記ウェル内に前記溶液及び試料を供給する供給装置と、
   前記ウェル内を前記開口部上方より撮像する撮像装置と、
   前記ウェル内で析出した試料の結晶が、特定の結晶状態であるか否かを、撮像装置で撮像した画像に基づいて判断する判断部と、を備えていることを特徴とする自動結晶化システム。
8. 前記判断部で特定の結晶状態であると判断された場合に、そのときの溶液の種類、結晶構造等を示す結晶化条件データを少なくとも記録する結晶化条件記録部をさらに備えている請求項７記載の自動結晶化システム。