JP2006523093A - 翻訳後修飾活性を検出する方法およびこの方法を実施するための電子システム - Google Patents

Abstract

本発明は、生物細胞または試験化合物（chemicals）からの少量の液体試料での翻訳後修飾活性を定性的に検出する方法に関する。リン酸化酵素および脱リン酸化酵素によるタンパク質のリン酸化／脱リン酸化は、翻訳後修飾の例である。本方法は、タンパク質フラグメントまたはポリペプチドがセンサーとして合成されることを特徴とする。上記は、荷電アミノ酸基および１つまたは複数の修飾基（Ｘ）を有する認識部位を含む部分（１）および部分（２）を含む。センサーは、特別な静電電位分布および双極子モーメントを有する。酵素を加えると、分子静電電位分布のシフトおよび双極子モーメントの変化が伴うセンサーの修飾が生じる。電位シフトは翻訳後修飾活性の決定要因（determinator）である。本方法の実際に実行するためのいくつかの装置システムが開示される。本方法は、特に、生物学的多重検出システム（バイオチップおよび高スループットスクリーニング）に適した、各種の翻訳後活性を検出する、迅速で、高感度、かつ効率的な方法を提供し、そして特に医薬品開発、医療診断、基礎研究、および環境保護に応用を見いだす。

Description

本発明は、翻訳後修飾活性を定性的に検出する方法、すなわち、特定の基（例えば、リン酸基）の形成を通じて既に合成されたタンパク質を修飾し、それらの機能を改変する酵素活性を検出する方法に関する。

癌、糖尿病、関節炎、循環器疾患、高血圧症、および脳卒中などの重篤な疾患は、タンパク質活性の変化により引き起こされる。本発明は、各種の翻訳後活性を検出する、迅速で、高感度、かつ効率的な方法を提供する。本発明に従った本方法および電子システムは、基本的検査の高スループット用生物学的多重検出システムの分野に大きく貢献する。

より技術的な詳細の前に、一連の前置き事実が以下に挙げられる。

特に少量の液体試料中の、生物学的活性を有する分析物をすばやく検出するシステムおよび方法は、医薬および薬学の分野両方で、さらには環境保護の領域で非常に重要である。薬剤の開発に不可欠であることが既知の最も総合的かつ重要な細胞活性の群の１つは、翻訳後修飾によって有効な活性である。全ての生細胞に特徴的なこれらの活性は、修飾タンパク質の機能性の改変をもたらす。タンパク質またはポリペプチドの翻訳後修飾の主な機構には、リン酸化、メチル化、プレニル化、ユビキチン化、およびタンパク質分解が含まれる。細胞周期での変化および毒素の効果などの成長因子の存在または病理的状態の発展を含む様々な外的条件（刺激）は、複数の細胞内構成成分の翻訳後状態を一時的に修飾し得る。これは、特定の翻訳後活性の特異的かつ有効なインヒビターまたはアクチベーターの迅速な発生を余儀なくさせる。それゆえ、多重検出システム（マイクロアレイ、バイオチップ）でのこれらの活性の確実で高感度の検出を可能にする、対応する試料および方法の開発が重要である。

翻訳後修飾の例は、リン酸化酵素および脱リン酸化酵素によるタンパク質のリン酸化／脱リン酸化である。リン酸化酵素は、アミノ酸残基、主にセリン、スレオニン、またはチロシンにリン酸基を結合（リン酸化）させることによりタンパク質を修飾する。これに反して、タンパク質は、これらのリン酸基のリン酸化効果を逆転するように、脱リン酸化酵素を移動させる。タンパク質のリン酸化状態における変化は、生細胞中のタンパク質の局在およびタンパク質間の分子相互作用を通じて酵素活性を調節する。細胞におけるリン酸化酵素活性と脱リン酸化酵素活性との総合的バランスは、いかなる時点でもタンパク質リン酸化状態の基礎である。一般的に言って、タンパク質リン酸化酵素および脱リン酸化酵素の効果は、タンパク質機能の主な調節機構の１つである。タンパク質リン酸化酵素の遺伝子欠損を示す疾患の最新の発見および分析から、４００を超える、リン酸化酵素自身の活性変化が伴うとみなされ得る特異的病理的状態が浮き彫りになる。

異常なタンパク質リン酸化は、癌、糖尿病、関節炎、循環器疾患、高血圧症、および脳卒中などの重篤な疾患の発生原因であることから、タンパク質リン酸化酵素のリン酸化活性を阻害する能力があることが可能となり新規化合物は、製薬産業にとって非常に興味が持たれる。

新規の有効な薬剤の開発には、コンビナトリアル・ケミストリー（combinatory chemistry）の助けを借りて合成された大量の化合物を試験することが必要である。これらの目的のため、製薬産業は、高スループットフォーマットで必要な試験を促進する新規技術を必要とする。

さらに、既に開発された薬剤の効果を改善するために、それらがどの程度タンパク質リン酸化酵素および脱リン酸化酵素活性に影響を及ぼすかを試験することも必要である。例：シクロスポリンは、臓器移植に不可欠な免疫系インヒビターである。この薬剤がタンパク質脱リン酸化酵素ＰＰ２Ｂの阻害を通じて機能することが研究により実証されたのはごく最近のことである。

発明に関する最新報告
バイオチップ技法は、医療診断および薬剤開発に革命をもたらした、既知の、かつ極めて効率的な方法である。例えば、遺伝子チップの助けを借りて、１回の試験で腫瘍または他の組織の完全な転写パターンが記録され得る。遺伝子チップの開発および製造は、既に実用化段階に到達している。しかしながら、遺伝子チップは、先に記載された重篤な疾患を引き起こす修飾タンパク質活性を調査するのに用いることができない。この理由のため、有効なタンパク質チップ技法（多重検出フォーマットで修飾タンパク質活性を迅速評価するプロセス）を開発することが必要である。タンパク質チップ技法は非常に複雑なため、これらの技法は、現在では限られた範囲でしか利用できていない。

国際的な最新技術報告
リン酸化酵素活性を検出する現在の方法は、代表的に、放射性リン^３２Ｐをタンパク質基質に組み込むことを用いた測定に基づく。これらの方法を適用するためには、細胞内ＡＴＰプール全体を標識して標的タンパク質が放射能標識されたことを確認するために、細胞に非常に大量の放射能を用いることが必要である。標的タンパク質の相対的リン酸化を検出するためには、試験物質とともに細胞をインキュベートした後、それらを解剖して標的タンパク質を精製することが必要である。この方法は、多数の細胞、長いインキュベーション期間、および不正確なリン酸化／脱リン酸化結果を回避するための慎重な処理手順を必要とする。また、この種の手順は、標的タンパク質の精製を必要とする。標的タンパク質の最終的リン酸化が非常に低い場合もあり得ることから、この方法は効率が悪い。環境および健康問題に関して特に深刻であるのは、この方法による高スループット試験の間、放射性材料を大量に利用する必要があるということである。

リン酸化酵素活性を検出する代替的な方法は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットなど、リン酸化特異的抗体に基づく。この方法の不利な点は、抗体の産生およびタンパク質のリン酸化状態と脱リン酸化状態との識別が、困難かつ費用のかかるものであるということである。

質量分析法（ＭＡＬＤＩおよびＥＳＩ）は、１５年も前から、タンパク質分解されたタンパク質フラグメントの一次構造の検出に既に用いられていた。理論的には、この方法の質量分解能は、８０Ｄａの質量差があるリン酸化の検出に十分であるだろう。しかしながら、測定手順の間の、リン酸結合の不安定さおよびタンパク質残基からのその迅速な開裂に基づき、ＭＡＬＤＩＭＳは特定の状況下でリン酸化を検出するのに用いることのみが可能である。タンパク質リン酸化の質量分析法による検出は、しばしば誤ったネガティブな結果を導く。さらに、質量分析計は非常に高価である。

米国特許第６，４１０，２５５号は、リン酸化酵素活性の検出を可能にする方法を開示している。この方法は、リン酸化酵素特異的セクションおよびプロテアーゼ感受性セクションと一緒にポリペプチドに挿入された蛍光発光基を表すセンサーを含む。タンパク質の修飾は、プロテアーゼ切断点の接触性の改変および蛍光発光基の切断をもたらす。これは、蛍光顕微鏡を用いて検出される。リン酸化酵素に加えて、この方法は、相互作用を通じた人工産物の産生を促進するプロテアーゼの存在を必要とする。蛍光顕微鏡が高価なこと、および標的タンパク質の蛍光標識化が必要なことは、両方とも不利である。

リン酸化酵素活性および脱リン酸化酵素活性の検出でこれまでに記載された不利な点に加えて、数千の成分を含有する小型試料体積でのこれらの活性の検出には限られた可能性しか存在しないと、要約することができる。

以下、「バイオチップ」を記載した特許ＤＥ １００ ５１ ２５２ Ａ１号の簡潔な要約である。このＤＥ特許は、極性分子、特に分子の形で溶解した生体分子を示す分析物の定性的および／または定量的検出の手順を記載している。それぞれがキャパシター（コンデンサ）を表す多数の小型測定セル（＜１ｍｍの直径を有する）を有するセンサーは、基質が測定セルに含まれている限り、特定の容量を示す。補助物質が、検出されるべき分子を含有する基質に加えられたなら、これによりキャパシターの容量が変わるだろう。この容量の変化は分析物の濃度と連関している。正確な測定データの収集における問題が、測定セルへの生物活性物質の挿入で観測され得る。そのうえさらに、対応する測定電子システムを用いて評価するためのバネ付勢接点を備えた精密なシステムは、測定誤差を生じる場合がある。迅速な検出の論理的可能性はない。ＤＥ １００ ５１ ２５２ Ａ１号によるこの解決法は、タンパク質結合を測定するバイオチップを構成するものである。翻訳後修飾活性の検出は不可能である。

それゆえ、高感度であるがその機能は複雑ではなく、そして事実上全てのリン酸化酵素活性および脱リン酸化酵素活性に利用し得る、翻訳後活性を検出する自動化プロセスを開発することが本発明の課題である。顔料、蛍光物質、または放射性物質は、用いられないはずである。

翻訳後活性および数千の成分の迅速検出は、薬剤の調査および開発、環境技術および医薬分子診断の基礎研究の分野で顕著な寄与をもたらすことを可能にするはずである。その手順は、対応する電子システムの助けを借りて実施される。

本発明に従って、この課題は以下のように達成されるだろう。基本概念は、特許請求項１で見いだされ得る。本発明に関するさらなる情報は、特許請求項２〜９に含まれる。

本発明の説明は、補足情報を必要とする。技術的解決は、用いられた各センサーの物理化学的特性の変化に基づき、分析物または酵素を含有する液体試料中の、翻訳後活性の迅速かつ効果的な検出を可能にする。上記の液体試料は、細胞から採取された試料、または酵素がすでに加えられている試験物質含有試料である。

翻訳後修飾活性を検出するために開発されたセンサーは、タンパク質、リン酸化酵素、または他の酵素に対する「認識部位」を含有する合成タンパク質フラグメントまたはペプチドからなる。この種のセンサーは、本発明の実施形態の設計例で注釈とともに概略的に表されるだろう。「認識部位」は、０〜ｎの間のアミノ酸残基個数および一連の荷電残基を有する、アミノ酸残基の２つのグループである部分１と部分２との間に位置する。センサーは、分子静電電位および分子双極子モーメントμの特定の分布を有する三次元構造を有するように設計される。上記に記載の翻訳後活性の結果として、修飾残基は認識部位内で変換される。これに応じて、静電電位分布が変化し、センサー双極子モーメントμ^＊をもたらす。センサー双極子モーメントにおけるこれらの変化は、設計例で説明されるとおりに、電気的および光学的方法により検出される。

以下の表１は、タンパク質リン酸化酵素（ＰＫＡ）、タンパク質脱リン酸化酵素２Ｂ（ＰＰ２Ｂ）、チロシンリン酸化酵素（ＴＫ）、チロシン脱リン酸化酵素（ＴＰ）、およびタンパク質リン酸化酵素Ｃ（ＰＫＣ）活性の検出に利用し得るセンサーの例を示す。

要求される三次元構造を有するセンサーは、生物情報工学方法を用いた分子モデリングを用いて設計される（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよびＰＤＢデータベースの検索、ＭＯＥおよびＳＹＢＹＬを用いた構造最適化、未修飾および修飾ポリペプチドの分子静電電子および双極子モーメントの計算）。詳細については、以下を参照：
Brandt, W., Anders, A. and Vasilets, L.A. (2002) 「Ｓｅｔ２３の酸性置換またはＰＫＣ媒介性リン酸化により引き起こされるＮａ^＋／Ｋ^＋ＡＴＰアーゼαサブユニットのＮ末端の立体構造における変化の予測（Predicted alterations in tertiary structure of the N terminus of the Na⁺/K⁺-ATPase α subunit caused by acidic replacement or PKC-mediated phosphorylation of Set-23）」. Cell. Biochem. Biophys. 37:83-95。

例：表１による未リン酸化ＰＫＣセンサー５（Ｓ５）の双極子モーメントは、約２０３Ｄであるが、一方、セリンのリン酸化は、センサー双極子モーメントの方向の変化および１４４Ｄへの減少をもたらす。

上記の論法は、以下のように要約することができる。

本発明は、標的ペプチドを標識することのない、センサーの物理化学的特性の変化に従った液体試料中の翻訳後活性の検出に基づく。センサー双極子モーメントの変化を検出する実験的方法の例は、誘電定数（誘電率）、緩和電流（relaxation currents）、屈折率、および偏光の密度または強度の変化の測定である。

本発明は、ここで、設計例および補足の注釈を用いて説明されるだろう。

図１は、本発明による合成ポリペプチドを表すセンサーであり、タンパク質リン酸化酵素または他の酵素に対する「認識部位」を含む。図１Ａは、この型のセンサーの概略図である。１つまたは複数の修飾残基Ｘを有する「認識部位」は、一連の荷電残基を有するアミノ酸残基の２つのグループ（部分１および部分２）の間に位置する。部分１および部分２の両方ならびに認識部位は、それらが分子静電電位の特徴的分布を有する三次元構造を導くような様式で構築される。したがって、センサーは分子双極子モーメントμを有する。上記の翻訳後活性の結果、修飾残基Ｘは、認識部位の内側でＸ^＊に変換される。これは、静電電位分布およびセンサー双極子モーメントμ^＊における変化を伴う（図１Ｂ）。物理化学センサーの特性のこれらの変化は、電気的および光学的方法を通じて検出され得る（以下を参照）。

本発明の代替変形版では、センサーは柔軟性結合部３および結合基（Ｈｉｓタグ）の助けを借りてＮｉＮＴＡ樹脂でコーティングされた固形物５にマウントすることができ（図１）、固形物はガラス表面、プラスチックビーズ、または誘電体である。

本発明のさらなる変形例では、センサーは誘電体でコーティングされた固形物表面上で直接合成され得る。

第三の変形例では、センサーは分子の形で水に溶解し得る。

図２は、センサーを含有する試料の光学的特性の変化の結果として、翻訳後活性を検出する方法の概略図を示す。液体試料およびセンサーを入れた検出セル（測定セル８）は、偏光Ｐの源と光分析器９との間に位置する。２枚の薄いガラス板の内側を金の層および誘電体でコーティングする。これらは接触電極として機能する。検出される光の強度変化ΔＩは、ｃｏｓ^２αに比例する（αは偏光Ｐの旋光度(angle of rotation)である）：

電圧が無い場合、センサー双極子分子は熱運動のため無秩序な配向性を有する。電場Ｅは、ボルツマン統計に従って双極子の配向性が無秩序な分布に達することを目指す分子の熱運動と競合するので、双極子を部分的に整列させる。通常の測定条件μＥ＜＜ｋＴ下、電場方向の平均モーメントは、以下であるとして計算され得る：

式中（whereby）、μは個々の分子の双極子モーメント、μ_Ｅは電場方向の見かけ平均双極子モーメントであり、Ｅ電場強度、Ｔ絶対温度、およびｋ＝１．３８０７×１０^２３ＪＫ^１である。偏光の旋光度がセンサーを有する試料の光学的活性と比例するので、これは順に、電場方向に配向した分子の数に比例し、これから以下が導かれる：

翻訳後活性の結果としての分子双極子モーメントの変化は、検出される光強度の変化を導く。

翻訳後活性の検出のさらなる変形例に従って、センサーを有する液体試料の誘電定数（誘電率）が測定される。図３Ａから明らかなように、試料は、キャパシターとして機能する検出セル（測定セル１１）中に位置する。キャパシタープレートの間に分極誘電体を導入することで、真空中の電場強度Ｅ_０はＰ／ε_０に減少する：

式中、Ｅ_０＝Ｅ／ε、およびＰは誘電定数εを有する誘電体の誘導された分極である。
これから以下が導かれる：

分極は、単位体積あたりの双極子モーメントを意味するので、したがってＰは見かけ平均双極子モーメントμ_Ｅに比例し、これは、式（２）よりμ_Ｅ＝μ^２Ｅ／３ｋＴということであり、εについて以下を得る：

翻訳後修飾のため双極子モーメントが変化するなら、誘電定数は式（６）に従って変化する。

センサー分子（Ｓ）が水（Ｗ）または他の溶媒に溶解しているなら、後者の分子分極は以下のように見なされるべきである：

式中、ｘ_ｓはセンサーのモル分率、ｘ_ｓ＝ｎ_ｓ／（ｎ_ｗ＋ｎ_ｓ）、そしてｘ_ｗは水のモル分率、ｘ_ｗ＝ｎ_ｗ／（ｎ_ｗ＋ｎ_ｓ）である。

図３Ｂは、２つの合成モデルペプチドＳ１およびＳ２について、誘電定数の変化の例を示す（表１）。

水に溶解させたポリペプチド（Ｓ１）または（Ｓ２）を測定キャパシター（測定セル１１）の電極板の間に、誘電体として置いた（図３Ａを参照）。ポリペプチドＥＬＤＶＰＩＰＧＲＦＤＲＲＶＳＶＡＡＤ（Ｓ１）は、セリンのリン酸化を触媒するタンパク質リン酸化酵素Ａの特異的基質である。脱リン酸化酵素ＰＰ２Ｂは、ポリペプチドＥＬＤＶＰＩＰＧＲＦＤＲＲＶｐＳＢＡＡＤ（Ｓ２）のセリンの脱リン酸化を実行する。未リン酸化ポリペプチド（Ｓ１）の誘電定数ε_３は７６であるが、リン酸化ポリペプチド（Ｓ２）のそれは７０に減少する。したがって、これらの手順は、これらの酵素の活性の検出を可能にする。

相対誘電定数εの測定を通じた、試験でのペプチド修飾の検出に関して、以下が加えられるはずである：それぞれポリペプチドＳ１（未リン酸化）またはＳ２（リン酸化）を含有し（表１）、１．１４ｍＭの濃度で水に溶解させた４マイクロリットルの試料を、測定キャパシターの電極板の間に直接導入する。誘電定数εをｔ＝２３℃の温度で測定する。この例では、最小試料体積は４μｍより小さくはないはずである。タンパク質濃度はミリモルの範囲内だろう。このことは、この測定手順のバイオチップへの応用を制限する可能性がある。

この測定方法がバイオチップに用いられることを可能にするために、試料体積を０．５μＬ未満に、そしてタンパク質濃度を１０^５Ｍに減少させることを可能にする差動容量測定が開発されてきた。図４Ａおよび図４Ｂは、これらの差動測定の結果を示す。特に有利であるのは、ミリ秒範囲内であるこれらの電子測定の高時間分解能であり、これは主に試料導入速度に依存する。したがって、これらの方法は、少量の液体試料中の修飾活性の検出だけでなく、それらの動力学の記録も可能にする。

差動測定用装置の構造に関する詳細については、図４Ａを参照。測定装置は、周波数発生器１２、測定キャパシター１３および測定キャパシター１４（これらはチッププレート中に組み込まれている）、増幅器１５、および交流／直流変換器（ＡＣ／ＤＣ変換器）１６からなる。測定キャパシター１３および測定キャパシター１４の容量の差に比例する出力信号振幅は、ＡＣ／ＤＣ変換器を用いてＤＣ電圧差ΔＵに変換される。これは記録器を用いて記録される（図４Ｂおよび図４Ｃを参照）か、またはアナログ／デジタル変換器を用いてデジタル評価システムに送られる。

図４Ｂは、タンパク質リン酸化酵素Ａ活性に対するセンサー：ＥＬＤＶＰＩＰＧＲＦＤＲＲＶＳＶＡＡＤ（Ｓ１）および脱リン酸化酵素ＰＰ２Ｂ活性に対するセンサー：ＥＬＤＶＰＩＰＧＲＦＤＲＲＶｐＳＶＡＡＤ（Ｓ２）を用いた差動測定を示す。

図４Ｃは、チロシンリン酸化酵素活性に対するセンサーＥｌＹＥＴＤＹＹ（Ｓ３）およびチロシン脱リン酸化酵素活性に対するセンサーＥｌｐＹＥＴＤｐＹｐＹｐ（Ｓ４）を用いた差動測定を示す。全てのセンサーは、２０μＭの濃度で水に溶解させて、測定キャパシターＣ１ １３またはＣ２ １４のいずれかに塗布する（標識を参照）。試料体積は、０．５μＬである。全ての測定を周囲室温で行う。

翻訳後活性を検出する方法のさらなる変形例に従って、水に溶解させて基質として用いられるポリペプチド（Ｓ１）または（Ｓ２）は、オシレーターとして機能する誘導性Ｌおよび容量Ｃを有する測定セル中に位置する（図５）。周波数ωは、ω＝１／ＬＣで決定され得、これは高い精度（１０^５）で測定され得る。試料が未リン酸化ポリペプチドＳ１の代わりにリン酸化ポリペプチドＳ２を含有しているならば、周波数の明確な減少が観測され得る（図５）。

オシレーターの周波数シフトの測定を通したペプチド修飾の検出のため、以下のように実験を行った：未リン酸化ペプチドＳ１またはリン酸化ペプチドＳ２（水中１．１４Ｍ濃度）とともに１５０μＬの試料を含有する管を、オシレーターの誘導コイル中に核として置いた。温度ｔ＝２２℃、ｆ_０＝５３４２．９ｋＨｚで周波数ｆを測定した。

ペプチド修飾はまた、屈折率の測定を通じて決定され得る。マクスウェルの磁化理論に従って、同一周波数で測定した相対誘電率と屈折率ｎとの間に以下の関係が存在する：ε＝ε／ε_０＝ｎ^２。これは、翻訳後活性により誘導された分子双極子モーメントの変化が屈折率の変化を通じて検出されることを可能にする：

細胞または生物からの液体試料は非常に複雑であり、かつ多数のタンパク質および少数の分極分子を含んでいるので、このことは、これらの試料の上記の物理化学的特性に高い多様性を導く。複雑な液体試料での翻訳後活性の検出には、差動測定が行われることが必要不可欠である。誘電定数、屈折率、または光強度は、例えば、センサーを含む試料と含まない試料との間の、またはセンサーとのインキュベーション前および後での差異として検出され得る。

［概要］
上記の翻訳後修飾活性を検出する方法は、自由なまたはマウントしたセンサーもしくはタンパク質フラグメントを含有する溶液で、上記の電子システムを用いてタンパク質リン酸化酵素活性および脱リン酸化酵素活性を検出することを可能にする。

その修飾状態および未修飾状態で変化する分子双極子モーメントでの翻訳後修飾活性の差動容量測定を通じて、試料体積は、０．５μＬ未満に、およびセンサーペプチド濃度は１０^５Ｍに減少され得る。結果として、これらの方法は、複数の修飾活性の分類およびその動力学の記録を可能にする。

差動容量測定用に開発された電子システムは、翻訳後修飾活性が、効果的、簡単、迅速、かつ費用効果的な様式で検出されることを可能にする。

本発明の応用範囲は、製薬産業（大規模および中規模製薬企業）、医療診断、および基礎研究、ならびに以下の目的を有するバイオテクノロジー企業を包含する：
・新規合成された化合物および既存の化合物についての高スループット試験シリーズの改善および最適化；および
・前臨床試験におけるタンパク質リン酸化酵素活性および脱リン酸化酵素活性へのそれらの阻害効果の分析。

本発明による方法の以下の特別な特徴が強調され得る：
・複数の翻訳後修飾活性の動力学の測定が可能、および
・ヒスタミンおよびアルギニンアミノ酸残基のリン酸化などの非常に不安定な修飾を測定する前提条件の作成。

センサーの概略図である。 光学測定を用いた翻訳後活性を検出する装置の概略図である。 相対誘電定数εの測定を通じたペプチド修飾の検出を示す図である。 差動測定法を用いた翻訳後修飾活性の検出を示す図である。 オシレーター周波数シフトの測定を通じたペプチド修飾の検出を示す図である。

符号の説明

図１中、参照符号は以下を示す：
１ アミノ酸残基の連なり（部分１）
２ アミノ酸残基の連なり（部分２）
３ 化合物
４ 結合部位
５ 固形物
Ｘ 修飾残基
図２中、参照符号は以下を示す：
６ 光源
７ 偏光子
８ 測定セル
９ 光分析器
１０ 光検出器
Ｐ 偏光
図３Ａ中、参照符号は以下を示す：
１１ 測定セル
図４Ａ中、参照符号は以下を示す：
１２ 周波数発生器
１３ 測定キャパシターＣ１
１４ 測定キャパシターＣ２
１５ 差動増幅器
１６ 交流／直流変換器（ＡＣ／ＤＣ変換器）

Claims (9)

1. 一連の荷電残基を有するアミノ酸残基である部分１と部分２、及び一以上の修飾残基Ｘを含有する認識部位とから作成されて分子静電電位分布を表示するセンサとして、タンパク質フラグメント又はポリペプチドを利用して、翻訳後修飾活性を検出する検出方法であって、
   前記静電電位分布は、秒単位で測定されるとともに静電電位の変化として測定される双極子モーメントとして測定され、
   酵素が前記センサに加えられ、
   双極子モーメントの変化により翻訳後修飾活性を検出すること、
   を特徴とする翻訳後修飾活性の検出方法。
2. アミノ酸残基（部分１、部分２）は０〜ｎの個数で存在し、一連の荷電残基を有する、請求項１に記載の翻訳後修飾活性の検出方法。
3. 前記認識部位は、修飾残基／修飾残基（複数）（Ｘ）と組み合わせて、特異的タンパク質リン酸化酵素または脱リン酸化酵素を用いた修飾残基の変換のみを許容する認識基を表す、請求項１に記載の翻訳後修飾活性の検出方法。
4. 前記アミノ酸残基（部分１、部分２）は、前記認識部位および修飾残基／修飾残基（複数）（Ｘ）と組み合わせて、製造者により規定されるとおりの分子静電電位および分子双極子モーメントの分布を有する三次元構造を示す、請求項１に記載の翻訳後修飾活性の検出方法。
5. 前記合成タンパク質フラグメントは、溶液に溶解しているか、または固形物（５）上に置かれているかのいずれかである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の翻訳後修飾活性の検出方法。
6. 翻訳後修飾活性の結果としての前記タンパク質フラグメントの前記分子静電電位分布の変化は、異なる物理測定単位への該静電電位分布の変換により測定されるとともにそのように示され、かつ該異なる物理測定単位の変更された次元での該静電電位分布が測定および／または記録される、請求項１に記載の翻訳後修飾活性の検出方法。
7. 翻訳後修飾活性は、差動容量測定に基づき、該測定および／またはΔＵとしての変化の記録を通じて決定される、請求項１および６に記載の翻訳後修飾活性の検出方法。
8. 一体化部分は、前記変化での前記差を計算することができる差動測定結果の供給に適した測定機器からなり、必要であれば、これに差動増幅器（１５）、続いて直流／交流変換器（１６）が負荷側で接続され得る、請求項１、６、および７のいずれか一項に記載の電子システム。
9. 修飾活性からもたらされる変化は、存在する構成成分によってアナログの物理測定結果に変換され、かつこれらの構成成分はデジタル評価の目的のため、その負荷側でアナログ／デジタル変換器に接続される、請求項１、６、７、および８のいずれか一項に記載の方法の実施のための電子システム。

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