JP2006517573A - ニューロン組織の再生のための組成物 - Google Patents
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Abstract
生物学的組織もしくは細胞の制御された成長、再生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および上記スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して位置する成長因子の受容体もしくは成長因子結合フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物。上記組織または細胞は、好ましくはニューロンであり、その場合には、上記受容体は、好ましくは受容体チロシンキナーゼ(Trk)もしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体である。かかる組成物は、上記Trkもしくはフラグメントまたはそれらの相同体に結合された1つまたはそれ以上のニューロトロフィンを含んでもよい。
Description
本発明は、生物学的組織の再生および修復に関する。特に、限定的ではないが、本発明は、ニューロン組織の成長、再生および/または修復を促進するための生体適合性の組成物の使用に関する。
自家移植片材料を用いた神経修復は、ドナー部位病的疾患、機能の不適切な再発、および異常再生を含む幾つかの欠点を有する。自家移植片に代わる代替物が、神経間隙を埋めるのに使用するために求められている。多くのエンチューブレーション(entubulation)材料が研究されているが、自家移植片と比較して、一般的に期待に反する結果を伴う。近年、末梢神経の研究は、これらの問題を克服し得る合成神経誘導管の生成に焦点を当てている。様々な研究室では、分岐状末梢神経の修復用の優れたプロテーゼを創出するために、加水分解および分解生成物の溶解により操作(engineered)組織から除去される合成生分解性ポリマーがシュワン細胞と併用して使われている(Hadlock et al (1998) Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 124: 1081; Hadlock et al (2000) Tissue Eng, 6: 119; Bryan
et al (2000) Tissue Eng, 6:129)。神経および血管のような組織の機能は、細胞の制御された配向性に依存しており、多くの組織細胞型に関して、細胞対細胞の相互作用が確実に行われるように、空間構築が必要とされる。合成材料は、自然の発達中に遭遇する細胞微小環境を模倣するように操作され得る。例えば、生分解性ポリマー表面は、アミノ酸配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)を含有するペプチドを提示するように操作することができる。この配列は、細胞表面上のインテグリン受容体に結合し、細胞接着、伸展および細胞内シグナル伝達を誘導し、したがって細胞対細胞外マトリックスの相互作用を模倣する。
et al (2000) Tissue Eng, 6:129)。神経および血管のような組織の機能は、細胞の制御された配向性に依存しており、多くの組織細胞型に関して、細胞対細胞の相互作用が確実に行われるように、空間構築が必要とされる。合成材料は、自然の発達中に遭遇する細胞微小環境を模倣するように操作され得る。例えば、生分解性ポリマー表面は、アミノ酸配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)を含有するペプチドを提示するように操作することができる。この配列は、細胞表面上のインテグリン受容体に結合し、細胞接着、伸展および細胞内シグナル伝達を誘導し、したがって細胞対細胞外マトリックスの相互作用を模倣する。
生体分子をミクロンスケールの精度で表面上に固定化することができる一連の技法が存在する。これらの技法としては、光、イオンまたは電子のビームと表面の間の相互作用の位置を制限するようにパターン化されたマスクを使用するリソグラフィック方法、およびマイクロコンタクトプリンティング法が挙げられる。しかしながら、これらの技法は、リガンドのタイプおよびパターン化され得る表面を制限し得る。
WO99/36107号に示されるように、生分解性ブロックコポリマーの表面上に、ビオチン化したリガンドのミクロンスケールパターンを生成することが可能であり、ナノメートルの精度での生体分子の堆積の制御を達成する。これは、原子間力顕微鏡を用いたパターン化された表面上のタンパク質分子の分子解析により確認される。この系は、培養ウシ大動脈内皮細胞およびPC12神経細胞で試験されており、細胞発生に関して空間的制御を示す。ポリマー表面上のPC12細胞の神経突起伸長は、IKVAV配列を含有するペプチドから構成されるパターンの特徴により方向付けることができる(Patel et al (1998) FASEB J, 12: 1447; Cannizaro et al (1998) Biotechnol Bioeng, 58: 529)。
上記系で使用されるポリマーは概して、成形(fabrication)後の表面操作としてビオチン−アビジンの高親和性カップリングを使用するビオチン化ポリエチレングリコール(PEG)とポリ乳酸(PLA)とのブロックコポリマーである。これらのポリエステルは、酸を触媒とする加水分解に感受性であり、したがって生分解性である。生分解性の速度は制御することができ、したがってポリマーは、治療薬の制御された送達に使用することができる。関連種類のポリマーであるポリオルトエステルのpH感度もまた、この目的で研究されている(Leadley et al (1998) Biomaterials, 19: 1353-60)。
しかしながら、これまでに使用される方法すべてに短所が存在する。ニューロンは、そ
れらの維持および神経突起伸長のために、様々な成長因子の存在を必要とする。細胞培養条件下で実施される実験は概して、ウシ胎児血清または添加した成長因子の存在下である。しかしながら、体内での正常な条件下では、循環する成長因子のレベルが低すぎて、神経再生に有効でない。
れらの維持および神経突起伸長のために、様々な成長因子の存在を必要とする。細胞培養条件下で実施される実験は概して、ウシ胎児血清または添加した成長因子の存在下である。しかしながら、体内での正常な条件下では、循環する成長因子のレベルが低すぎて、神経再生に有効でない。
神経成長因子(NGF)は、ニューロトロフィンのファミリーの1つであり、他のファミリーの成員としては、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−3(NT3)およびニューロトロフィン−4(NT4、NT4/5またはNT5として称されることもある)が挙げられる。ニューロトロフィンはすべて、共通の受容体であるp75NGFRに結合する。特異性は、受容体チロシンキナーゼ(Trk)とのそれらの相互作用により規定され、その相互作用のKdは、およそ10-10〜10-11Mである。
TrkAの特性は、WO99/53055号に記載されている。TrkA構造の略図を図1として添付する。免疫グロブリン(Ig)様結合ドメイン2(TrkAIg2)のヌクレオチド配列およびヌクレオチドから由来するアミノ酸配列を図2として添付する。
NGFは、TrkAに結合し、BDNFおよびNT4は、TrkBに結合し、NT−3は、TrkCおよびあるいはそのIg様結合ドメイン2において6個のアミノ酸VSFSPV(図2中で下線を付してある)の挿入を有するTrkAのスプライシングされた形態に結合する。
末梢神経および脊髄神経の大部分は、生存のために1つまたはそれ以上のニューロトロフィンの存在を必要とする。最近の研究により、神経栄養因子は、発達するのを助長するのに有意な役割を果たし、成体神経系が軸索切断後に生存することが示されている。再生前に、ニューロンは、まず軸索切断を生き延びる必要がある。ニューロトロフィンは、退行性細胞死から、未熟(Diener and Bregman (1994) Neuroreport, 5: 1913)および成熟(Shibayama et al (1998), J Comp Neurol, 390: 102)軸索が切断された中枢神経系(CNS)ニューロンを救出する。末梢神経系(PNS)におけるニューロンの軸索切断は、頻繁に再生関連遺伝子のアップレギュレーションを招き、再生を助長する。これらの遺伝子におけるほんの一過性の増加が、軸索切断後に細胞体に近接してCNSで見られるが、損傷がより遠位である場合には見られない。再生関連遺伝子の延長された誘導が、この状況で再生に必要とされ得る。ニューロトロフィンは、再生関連遺伝子(例えば、c−Jun、GAP−43、Ta1チューブリン)の発現を増加させる。培養した成体後根神経節細胞(DRG)では、軸索成長のタイプ(分岐または伸長)は、遺伝子発現の種々のパターンに依存する(Smith and Skene (1997) J Neurosci, 17: 646)。例えば、BDNFは、GAP−43を増強して、分岐プロセスを支持する。
研究者等によっては、損傷部位でNGFのような成長因子を分泌するように遺伝的に改変された細胞を移植してきたものもいる(Grill et al (1997) Exp Neurol, 148:444)のに対して、他の研究者等には、PLGA 50/50、PLGA 85/15、PCLおよびPCL/PLGA 50/50のブレンドから調製されるミクロスフェアのような生分解性ポリマーミクロスフェアからのオボアルブミンと同時封入したNGFの放出プロファイルを観察したものもいる(Cao and Schoichet (1999) Biomaterials, 20: 329)。NGFは、少なくとも3ヶ月間放出され、かつ生理活性であることがわかった。
他の研究者等は、脊髄における損傷部位に胎児細胞を移植することを試みてきた。脊髄損傷および移植後のin vivoでの軸索突出のリモデリングは、神経栄養因子の利用可能性により調節される。成体では、外因性NGFは、脊髄への軸索切断された後根軸索の成長を増加させる(Oudega and Hagg (1996) Exp Neurol, 140: 218; Oudega et al (1994) Exp Neurol, 129; 194)。成体における脊髄半側切断および胎児索移植後に、BDN
F、NT3およびNT4の外因性投与は、胎児移植片への脊柱上の成長量を増加させた。繊毛由来神経栄養因子(CNTF)は、これを行うことができなかった。BDNFおよびNT3はまた、成体ラットにおいて胸郭部レベルの損傷へ配置されたシュワン細胞移植片への脳幹線維の再成長を支持する(Xu et al (1995) Exp Neurol, 134:261)。NGFおよびNT3を分泌するように改変し、脊髄へ移植した細胞は、脊髄に関して突出するニューロンの軸索成長に影響を及ぼし(Tuszynski et al (1996) Exp Neurol, 137:157, Grill et al (1997) J Neurosci, 17: 5560)、運動機能の改善に関連する(Grill et al (1997) J Neurosci, 17: 5560)。
F、NT3およびNT4の外因性投与は、胎児移植片への脊柱上の成長量を増加させた。繊毛由来神経栄養因子(CNTF)は、これを行うことができなかった。BDNFおよびNT3はまた、成体ラットにおいて胸郭部レベルの損傷へ配置されたシュワン細胞移植片への脳幹線維の再成長を支持する(Xu et al (1995) Exp Neurol, 134:261)。NGFおよびNT3を分泌するように改変し、脊髄へ移植した細胞は、脊髄に関して突出するニューロンの軸索成長に影響を及ぼし(Tuszynski et al (1996) Exp Neurol, 137:157, Grill et al (1997) J Neurosci, 17: 5560)、運動機能の改善に関連する(Grill et al (1997) J Neurosci, 17: 5560)。
NT3およびBDNFはまた、挫傷損傷後の脊髄において軸索を再生するオリゴデンドロサイトの増殖および髄鞘形成を誘導する(McTigue et al (1998) J Neurosci, 18: 5354)。
最近の研究により、急性損傷のほかに、ニューロトロフィンは慢性損傷での再成長を助長し得ることが示されている(Ye and Houle (1997) Exp Neurol,143: 70; Houle et al (1997) Restorative Neurol Neurosci, 10: 205; Houle and Ye (1997) Neuroreport, 8:751)。
上述の従来技術は、ニューロンの生存、修復および再生における神経栄養成長因子の重要性を示しているが、in vivoでの生分解性ポリマースカフォールド(scaffold)上でニューロン組織を成長させる可能性は、低い優勢成長因子濃度の条件下でどのようにしてニューロン細胞が効率的に成長し得るかという疑問を残したままである。さらに、ニューロン成長の速度および方向の制御については取り組まれていない。
本発明の目的は、ニューロン組織および他の組織ならびに細胞の成長、再生および/または修復を支持することが可能であり、かつ従来技術に関して確認される問題にさほど悩まない製品およびそれらの使用を提供することである。
したがって、本発明の第一の態様は、制御されたニューロンの成長、再生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、およびこのスカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して位置する受容体チロシンキナーゼ(Trk)もしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物を提供する。
本明細書中で使用する場合の「生分解性」という用語は、pH6.0〜pH8.0および温度25〜37℃で、生理学的または生理学的タイプの培地に暴露すると、破壊、断片化および/または溶解されることが可能であることを意味する。かかる破壊、断片化および/または溶解が起こる期間は、組成物の対象とする用途に依存する。典型的な期間は、約5年以下、大抵、1週間〜1年である。本明細書中で使用する場合の「生体適合性」という用語は、該用語が指す材料およびその生分解生成物が、in vivoで使用される場合に、許容不可能に毒性でない、免疫原性でない、アレルギー原性でない、あるいは炎症誘発性でないことを意味する。本明細書中で使用する場合の「スカフォールド」という用語は、細胞がその上で、その内部でまたはそれを介して、成長、再生または修復のために支持され得る任意の構造を指す。
好ましくは、本発明の組成物は、TrkもしくはTrkフラグメントまたは相同体に結合された1つまたはそれ以上のタイプのニューロトロフィンを含む。ニューロトロフィンは、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−3およびニューロトロフィン−4から選択され得る。
組成物のTrkは、TrkA、BもしくはC、あるいはそれらのオルターナティブスプライシングされた形態、pan−Trk(すなわち、ニューロトロフィンすべてを結合することが可能なTrk)、Trkの機能的相同体または複数のタイプのTrkの組合せであり得る。Trk相同体のフラグメント、Trkフラグメントの相同体もまた包含される。好ましい実施形態では、Trkのニューロトロフィン結合フラグメントは、TrkAの免疫グロブリン(Ig)様サブドメイン、好ましくはIg様サブドメイン2(TrkAIg2またはTrkAIg2.6、アミノ酸22〜150として図2に示す、6個のアミノ酸130〜135は、TrkAIg2.6スプライス変異体のみに存在)。あるいは、またはさらに、Trkのニューロトロフィン結合フラグメントは、TrkAのIg様サブドメインの両方(TrkAIg1、2)を含んでもよい。TrkAのかかるフラグメントはまた、好ましくはプロリンリッチ領域を含む。単独で、あるいはIg様サブドメイン1とともに、TrkAのIg様サブドメイン2を使用する場合、好ましくはアミノ酸VSFSPVの挿入を含む(TrkAIg2.6、挿入物は、図2ではアミノ酸130〜135として示される)。Trkのニューロトロフィン結合フラグメントは、図2に示す完全配列(TrkAIg2.6−6His)を含んでもよく、または図2に示す完全配列(TrkAIg2.6−6His)から構成されてもよい。
組成物が1つまたはそれ以上のタイプのニューロトロフィンを含む際に、TrkAまたはそれらのニューロトロフィン結合フラグメントを使用する場合、ニューロトロフィンは、NGFおよびNT3から選択されることが好ましい。TrkBまたはそれらのニューロトロフィン結合フラグメントを使用する場合、ニューロトロフィンは、好ましくはBDNFおよびNT4から選択される。TrkCまたはそれらのニューロトロフィン結合フラグメントを使用する場合、NT3が好ましい。
本発明の幾つかの実施形態では、組成物は、スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して位置する1つまたはそれ以上の細胞外マトリックス成分を含む。これらの細胞外マトリックス成分は、インテグリンまたは他の細胞表面受容体媒介性のニューロン伸長および成長因子応答を促進するために、配列RGD、YIGSRおよび/またはIKVAVを含有するペプチドを含んでもよい。
PLA−PEG−ビオチンのような主に親水性の生体材料上で培養される細胞は、細胞を細胞表面に接着するのに、細胞外マトリックス分子のさらなる存在を必要とする。
かかる細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、プロテオグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸および糖タンパク質(例えば、フィブロネクチン(FN)、ビトロネクチン(VN)およびラミニン(LN))が挙げられる。これらの分子間で見出される短ペプチドドメインが、インテグリンとして知られる細胞表面接着受容体との相互作用を担う。これらの受容体の結合は、細胞接着を容易とするだけでなく、遊走、伸展および表現型発現のような細胞内事象を誘発する。全細胞外分子を成長因子修飾した表面と併用することができるが、インタクトの接着分子は通常、様々な特異性度で、広範囲の細胞型と相互作用する。したがって、標的とする細胞型と特異的に相互作用して、所定の応答を生じる材料を創出するために、単離した短ペプチド配列を使用することが好ましい。
インテグリン結合ペプチド配列の例としては、ほとんどの細胞型と相互作用する遍在性アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)配列、ならびにラミニンから単離され、かつニューロン発達を容易とすることが実証されているイソロイシン−リシン−バリン−アラニン−バリン(IKVAV)、ロイシン−アルギニン−グルタミン酸(LRE)およびチロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン(YIGSR)フラグメントが挙げられる。これらのペプチド配列は、組み合わせて使用してもよく、それらの活性は、配列の到達性(accessibility)を改善するための隣接ペプチド配列を使用すること
により増強され得る。
により増強され得る。
接着ペプチド修飾表面を設計する際、表面濃度を最適化しなくてはならない。最小密度の接着リガンドが、細胞接着および遊走に必須であり、高密度のペプチドは、接着の強度に起因して、細胞遊走を阻害する(Huttenlocher, Sandborg, Horwitz (1995) Adhesion in cell migration. Curr. Opin. Cell Biol., 7:697-706)。したがって、最大の細胞遊走速度を誘導するには、中間レベルの結合力が必要となる(Schense, Hubbell (2000) (Three-dimensional migration of neurites is mediated by adhesion site density and affinity). J. Biol. Chem., 275: 6813-6818; Palecek, Loftus, Ginsberg, Lauffenburger, Horwitz (1997) (Integrin-ligand binding properties govern cell migration speed through cell-substratum adhesiveness). Nature, 385:537-540)。
スカフォールドの材料は、好ましくは生分解性かつ生体適合性のポリマーである。生分解性かつ生体適合性のポリマーは、ポリヒドロキシ酸(例えば、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリε−カプロン酸、ポリε−カプロラクトン、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼンおよびポリリン酸塩);多糖(例えば、ヒアルロン酸);タンパク質(例えば、コラーゲン);ポリアミノ酸;ポリ擬似アミノ酸(poly pseudo amino acids);およびこれらのポリマーのいずれかのモノマーから調製されるコポリマーから選択され得る。乳酸またはグリコール酸のポリマー、あるいはこれらのモノマーのコポリマーが好ましい。上述のポリマーのいずれかと、ポリアルキレングリコール(例えば、ポリエチレングリコール(PEG))とのブロックコポリマーが特に好ましい。PEGとポリ乳酸、ポリグリコール酸またはポリ乳酸−グリコール酸共重合体とのブロックコポリマーが最も好ましい。これらの各種ポリマーの特性および利点は、WO99/36107号に見出され得る。
Trkまたはそれらのフラグメントは、スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して、より好ましくは、ブロックコポリマーがスカフォールドを含む場合ポリアルキレングリコール鎖の末端に、生体適合性の生分解性の材料およびTrkと適合性の任意の手段により位置され得る。かかる手段としては、共有結合、吸着または物理的捕捉が挙げられ得る。しかしながら、Trkまたはフラグメントは、1つまたはそれ以上の特異的分子相互作用によって、表面に、またはその表面に隣接して結合されることが好ましい。「特異的分子相互作用」とは、2つまたはそれ以上の結合成分の1つと、例えば細胞培養でまたはin vivoで、該結合成分の1つが遭遇し得る別の分子との間の相互作用の親和性よりも、少なくとも100倍高い親和性、好ましくは少なくとも500倍、少なくとも1000倍または少なくとも2000倍高い親和性を有する2つまたはそれ以上の結合成分間の相互作用を意味する。スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接してTrkを結合する1つまたはそれ以上の特異的分子相互作用は、好ましくは、スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して結合された1つまたはそれ以上のアンカー分子と、Trkもしくはフラグメントに結合された1つまたはそれ以上のタグ分子との間で行われる。
アンカー分子およびタグ分子は、同じであってもよく、あるいは異なってもよい。ある特定の実施形態では、アンカーは、抗体またはそれらのフラグメントであり、タグは、相当する抗原またはハプテンであるか、あるいはその逆である。好ましくは、タグはビオチンであり、アンカーは、アビジンまたはストレプトアビジンであるか、あるいはその逆である。最も好ましくは、タグおよびアンカーの両方に同時に結合することが可能なアダプター分子もまた使用される。かかる場合では、タグおよびアンカーの両方は同じであり得る。好ましい実施形態では、タグおよびアンカーの両方がビオチンであり、アダプターがアビジンまたはストレプトアビジンである(アビジンおよびストレプトアビジンは、ビオチンに対してそれらの結合において結合価4を有する)。
組成物が特異的分子相互作用に関連した利点から利益を得るために、スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して、Trkまたはフラグメントの結合において、1つの特異的分子相互作用のみを使用する必要があることが理解されよう。したがって、任意の他の分子相互作用(例えば、タグが特異的分子相互作用によりアダプターに結合する場合のアンカーとアダプター分子との間)は、特異的である必要はない。
スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接してアンカー分子を共有結合するのに、およびタグ分子をTrkまたはフラグメントに共有結合するのに適した方法論は、当該技術分野で既知であり、WO99/36107号およびそこで引用される参照文献を参照とし得る。
本発明の組成物は、好ましくは管状スカフォールドを有し、ニューロンの再生は、好ましくは管状構造の管腔に沿って行われる。Trkまたはフラグメントは、Trkまたはフラグメントの溶液を、Trkまたはフラグメントを結合することが可能であるように予め処理したスカフォールドを通して流動させることにより、管腔壁上に位置され得る。したがって、特異的分子相互作用の場合では、管腔壁がアンカー分子で標識されるように、スカフォールドを予め処理し、溶液中のTrkをタグ分子で標識する。アダプター分子を使用する場合、タグ付けしたTrkの前に、これをスカフォールドに提示する。
スカフォールドの表面上に、またはその表面に隣接して位置するべき任意のさらなる成分は、Trkまたはフラグメントと同じ様式で結合され得る。組成物が1つまたはそれ以上のニューロトロフィンを含む場合、これらは、Trkまたはフラグメントに結合されているか、あるいは先のTrkまたはフラグメントの位置付けに続く別個の工程として、スカフォールドに導入される。Trk、タグ、アダプター、アンカー、ニューロトロフィンまたは組成物の任意の他の成分が溶液中でスカフォールドに導入される各場合では、一般に結合部位の適正な負荷を保証するために過剰量を導入することが有用である。続いて、過剰量(当然のことながら、それらの幾らかは、スカフォールドまたは他の構成成分に非特異的に結合されるようになっている)を流し出し得る。本発明で使用され得る調製法と類似した表面の調製法は、WO99/36107号に記載されている。特に、スカフォールドの表面上での、またはその表面に隣接したTrkのパターン化は、WO99/36107号で使用される方法に類似した方法を用いて達成され得る。
組成物はまた、成長、再生もしくは修復中の神経細胞、あるいは神経細胞前駆体または多能性幹細胞を含んでもよい。
本発明の組成物は、ニューロン取込みに利用可能なニューロトロフィンの供給の準備が整っているという利点を有する。ニューロトロフィンは、スカフォールドに非共有結合的に結合され、したがって、ニューロンによる使用のために放出可能である。これは、予め想定されない形で、ニューロン用の神経栄養支持体を提供する。さらに、特に、空間的に配列されたか、もしくはパターン化されたTrkまたはフラグメントの位置が使用される実施形態では、指向性のニューロン伸長が達成され得る。本発明の組成物は、in vitroまたはin vivoのいずれかで、ニューロンへの続く供給のためのニューロトロフィンの隔離物(sequesterer)として(最初にわずかなニューロトロフィンを結合しているか、またはニューロトロフィンを全く結合していない組成物が使用され得る場合)、およびニューロン用のニューロトロフィンの供給源として(組成物が、より高い比率のニューロトロフィンに結合したTrk分子またはフラグメントを含み得る場合)使用され得る。
循環するニューロトロフィンのレベルは低すぎて、生存を支持することができない。ニ
ューロトロフィンは通常、神経支配された組織から放出され、Trk受容体への結合後に、ニューロンにより内部移行される。続いて、この複合体は、細胞体へ輸送され、そこでその細胞生存効果を発揮すると考えられている。in vivoで神経を再生するためには、ニューロトロフィンの局部的な供給を提供することが必要である。本発明は、Trk分子またはフラグメントを介してスカフォールドに非共有結合されたニューロトロフィンを供給することが可能である。
ューロトロフィンは通常、神経支配された組織から放出され、Trk受容体への結合後に、ニューロンにより内部移行される。続いて、この複合体は、細胞体へ輸送され、そこでその細胞生存効果を発揮すると考えられている。in vivoで神経を再生するためには、ニューロトロフィンの局部的な供給を提供することが必要である。本発明は、Trk分子またはフラグメントを介してスカフォールドに非共有結合されたニューロトロフィンを供給することが可能である。
本発明の第2の関連する態様では、治療における使用のための第1の態様の組成物が提供される。
第3の態様では、神経成長、再生または修復を促進するための薬剤であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および上記スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して位置する上記Trkもしくはフラグメントまたは相同体を含む薬剤の調製におけるTrkもしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体の使用が提供される。
本発明はまた、第4の態様では、神経成長、再生または修復を促進する方法であって、スカフォールドの表面上で、またはその表面に隣接してTrk−ニューロトロフィン複合体を形成するように、本発明の第1の態様による組成物をニューロトロフィンの供給源と接触させ、上記組成物を幹細胞、神経前駆細胞、ニューロン細胞または組織と接触させ、そして上記幹細胞、神経前駆細胞、ニューロン細胞または組織を、上記スカフォールドの上記表面上で、またはその表面に隣接して成長、再生または修復させることを含む方法を提供する。
第4の態様の方法は、in vivoまたはin vitroで実施され得る。ニューロトロフィンの供給源は、組成物が上記方法のin vivo実施形態で配置される神経支配された部位を含んでもよい。しかしながら、より好ましくは、in vivoおよびin vitro実施形態の両方で、ニューロトロフィンの供給源は、位置するTrkまたはフラグメントを有するスカフォールドの表面を通って、またはその表面上を流されるニューロトロフィンの溶液を含む。上記方法は、好ましくはin vivoでの切断された神経の再生に使用される。
本発明はまた、本発明の第4の態様による方法により得られるか、または得られ得る幹細胞、神経前駆細胞、ニューロン細胞または組織を提供する。
第5および関連の態様では、本発明は、幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞または組織を移植する方法であって、ドナー幹細胞、神経前駆細胞、または神経細胞のサンプルを、適切なドナー培養物または被験体から採取し、スカフォールドの表面上で、またはその表面に隣接してTrk−ニューロトロフィン複合体を有する本発明の第1の態様による組成物と接触させて、上記ドナー細胞を成長、再生または修復させ、そしてかかるドナー細胞を必要とするレシピエント被験体に、上記ドナー細胞および組成物を配置することを含む方法を提供する。
ドナー被験体およびレシピエント被験体は、同じ個体(すなわち、自己移植片)であってもよく、あるいは異なる個体(すなわち、異種移植片)であってもよい。
記載する本発明の組成物、方法および使用は、これまでのところこの分野の従来技術に関連した不足の幾つかを少なくとも部分的に回避する。かかる不足としては、自家移植片材料を用いた末梢神経修復の場合では、ドナー部位病的疾患、機能の不適切な再発、および異常再生が挙げられる。シュワン細胞と併用した合成生分解性ポリマーの使用は、細胞
培養のさらなるラウンドの必要性により、および治療されるべき部位への細胞の組み込みの必要性により限定される。神経移植片は、それらが患者を変異型クロイツフェルト・ヤコブ病の危険性の増加に曝し得るため、可能であれば回避されるべきである。RGD型ペプチドを提示する生分解性ポリマー表面に関する従来技術は、細胞伸展および再生を導く方法を提供するが、特にin vivo設定で、不可欠な成長因子がどのように提供され得るかについては取り組んでいない。ニューロンを成長、修復および/または再生することに必要とされる成長因子は、取り込みのためニューロン細胞表面で利用可能である必要がある。本発明を用いて、スカフォールド表面上で、またはその表面に隣接して、Trkまたはフラグメントのパターンを形成し、それにより成長中のニューロンへの提示のための1つまたはそれ以上の各種ニューロトロフィンを保持することが可能である。
培養のさらなるラウンドの必要性により、および治療されるべき部位への細胞の組み込みの必要性により限定される。神経移植片は、それらが患者を変異型クロイツフェルト・ヤコブ病の危険性の増加に曝し得るため、可能であれば回避されるべきである。RGD型ペプチドを提示する生分解性ポリマー表面に関する従来技術は、細胞伸展および再生を導く方法を提供するが、特にin vivo設定で、不可欠な成長因子がどのように提供され得るかについては取り組んでいない。ニューロンを成長、修復および/または再生することに必要とされる成長因子は、取り込みのためニューロン細胞表面で利用可能である必要がある。本発明を用いて、スカフォールド表面上で、またはその表面に隣接して、Trkまたはフラグメントのパターンを形成し、それにより成長中のニューロンへの提示のための1つまたはそれ以上の各種ニューロトロフィンを保持することが可能である。
本発明の第6の態様では、Trkもしくはフラグメントまたはそれらの相同体の制御放出用の生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるリザーバ、および上記リザーバと密接に結合され、かつ/または上記リザーバの表面に、またはその表面に隣接して位置するTrkもしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物が提供される。
リザーバは、上述のスカフォールドの好ましい特徴のいずれかを有し得る。Trkは、上述のように、リザーバ表面に結合され得る。組成物は、表面に結合されたTrkまたはフラグメント、およびリザーバの材料内に包埋したTrkまたはフラグメントの両方を含有する。かかる混合系は、Trk放出速度の制御においてより優れた柔軟性を提供し得る。組成物は、in vitroおよび/またはin vivoでの使用に適切であり得る。
本発明はまた、治療における使用のための第6の態様による組成物を提供する。
第7および関連の態様では、本発明は、上昇したニューロトロフィンレベルと関連した疾患の治療用の制御放出薬剤であって、生分解性かつ生体適合性材料から形成されるリザーバ、および上記リザーバと密接に結合され、かつ/または上記リザーバの表面に、またはその表面に隣接して位置するTrkもしくはフラグメントまたは相同体を含む薬剤の調製におけるTrkもしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体の使用を提供する。
本発明はまた、被験体における上昇したニューロトロフィンレベルと関連した疾患の治療方法であって、本発明の第6の態様による組成物を上記被験体へ投与することを含む方法を提供する。
治療されるべき前記疾患は、アルツハイマー病または疼痛障害であり得る。疼痛は突発性神経性尿意促迫(idiopathic sensory urgency)(ISC)、間質性膀胱炎、帯状疱疹、末梢炎症、慢性炎症、腫瘍学的疾患またはヘルペス後神経痛の症状であり得る。
第8の態様では、本発明は、生物学的組織もしくは細胞の制御された成長、再生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および上記スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して位置する成長因子もしくは成長因子結合フラグメントまたはそれらの相同体に対する受容体を含む組成物を提供する。
成長因子は、ニューロトロフィンであり得る。
さらに、第9の態様では、本発明は、生物学的組織もしくは細胞の制御された成長、再
生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および上記スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して位置する成長因子もしくは機能的フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物を提供する。成長因子(これは、ニューロトロフィンであり得る)は、スカフォールドに共有結合的にまたは非共有結合的に結合され得る。本発明はまた、治療における使用のための第9の態様による組成物を提供する。
生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および上記スカフォールドの表面に、またはその表面に隣接して位置する成長因子もしくは機能的フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物を提供する。成長因子(これは、ニューロトロフィンであり得る)は、スカフォールドに共有結合的にまたは非共有結合的に結合され得る。本発明はまた、治療における使用のための第9の態様による組成物を提供する。
本発明はここで、ほんの一例として添付の図面を参照して、より詳細に記載する。
実施例1−TrkAIg2およびTrkAIg2.6の構造
TrkAおよびそれらの単離ドメインは、WO99/53055号(この開示は、参照により援用される)にさらに記載されている。添付の図1は、その構造を模式的に示す(同様に、Robertson et al (2001) BBRC, 282:131)。黒丸は、グリコシル化部位を表す。TrkAIg2は、Ig様サブドメイン2およびプロリンリッチ領域を含むものとしてこの実施例で定義される。図2に示す配列(TrkAIg2.6−6His)は、6×Hisタグを有するTrkAIg2のヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列由来のアミノ酸配列を示す。ヒトTrkA由来の配列を太字で示し、6個のアミノ酸の挿入された変異体には下線を付してある。この配列は、ヒトTrkA配列(アミノ酸22〜150)およびN末端6×HisタグもコードするpET15bベクター由来の隣接配列(アミノ酸1〜21)を含む。ベクター配列(コドン452〜468、図2)はまた、停止コドンも提供する。ヒトTrkAの推定細胞外ドメインは、6個のアミノ酸VSFSPVの挿入が存在するかどうかに依存して、375アミノ酸長または381アミノ酸長であると捉えられている。
TrkAおよびそれらの単離ドメインは、WO99/53055号(この開示は、参照により援用される)にさらに記載されている。添付の図1は、その構造を模式的に示す(同様に、Robertson et al (2001) BBRC, 282:131)。黒丸は、グリコシル化部位を表す。TrkAIg2は、Ig様サブドメイン2およびプロリンリッチ領域を含むものとしてこの実施例で定義される。図2に示す配列(TrkAIg2.6−6His)は、6×Hisタグを有するTrkAIg2のヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列由来のアミノ酸配列を示す。ヒトTrkA由来の配列を太字で示し、6個のアミノ酸の挿入された変異体には下線を付してある。この配列は、ヒトTrkA配列(アミノ酸22〜150)およびN末端6×HisタグもコードするpET15bベクター由来の隣接配列(アミノ酸1〜21)を含む。ベクター配列(コドン452〜468、図2)はまた、停止コドンも提供する。ヒトTrkAの推定細胞外ドメインは、6個のアミノ酸VSFSPVの挿入が存在するかどうかに依存して、375アミノ酸長または381アミノ酸長であると捉えられている。
近年、2つの免疫グロブリン様ドメインおよび単独のプロリンリッチ領域から構成されるタンパク質が、完全な細胞外ドメインの親和性と類似した親和性でNGFを結合することが可能であることが示されている(Holden et al (1997) Nature Biotechnology, 15: 668)。この領域は、本明細書ではTrkAIg1、2として定義される。さらに、TrkAIg2と称されるTrkAのさらに小さなドメイン(アミノ酸22〜150として図2に示す)は、完全な細胞外ドメインまたはTrkAIg1、2領域に類似した多親和性でNGFを結合することが可能であり、したがってこれらのより大きな物体(entities)の結合特性を主として担うことが見出されている。アミノ酸130〜135として図2に示す6個のアミノ酸VSFSPVの挿入を含有するTrkAIg2は、本明細書ではTrkAIg2.6と称する。
実施例2−Trkを用いたNGFの固定化によるニューロン成長の増強
この研究は、生体材料表面へNGFを固定化し、したがって末梢神経再生を刺激するための局在的環境を提供するためにTrkフラグメントを使用することの実現可能性を実証する。リガンドの容易な表面パターン化が組織再生を空間的に制御することが可能であることがすでに実証されている(WO99/36107号)PLA−PEG−ビオチンを基礎材料として使用して、実験を行った。この実施例では、使用したTrkフラグメントは、TrkIgA2.6の6−Hisタグ付き形態(TrkIgA2.6−6His)であった。
この研究は、生体材料表面へNGFを固定化し、したがって末梢神経再生を刺激するための局在的環境を提供するためにTrkフラグメントを使用することの実現可能性を実証する。リガンドの容易な表面パターン化が組織再生を空間的に制御することが可能であることがすでに実証されている(WO99/36107号)PLA−PEG−ビオチンを基礎材料として使用して、実験を行った。この実施例では、使用したTrkフラグメントは、TrkIgA2.6の6−Hisタグ付き形態(TrkIgA2.6−6His)であった。
PC12細胞を、10%ウマ血清、5%ウシ胎児血清、抗生物質/抗真菌剤およびL−グルタミンを補充したRPMI−1640培地中で、2〜5×105個の細胞/mlの密度で成長させ、T75フラスコはそれぞれ、培地10〜20mlを含有していた。
神経突起伸長を可能にするためには、PC12細胞は表面結合を必要とするため、組織培養プラスチックへそれらの非接着は、表面をコラーゲンまたはラミニンのような細胞外
マトリックス物質でプレコーティングしなくてはならないことを意味する。T−75フラスコおよび24ウェルプレートは、蒸留滅菌水中の0.01%コラーゲンIV型溶液を表面上に2時間置いた状態にしておき(それぞれ10mlおよび0.5ml)、続いて一晩風乾させることによりコラーゲンコーティングした。
マトリックス物質でプレコーティングしなくてはならないことを意味する。T−75フラスコおよび24ウェルプレートは、蒸留滅菌水中の0.01%コラーゲンIV型溶液を表面上に2時間置いた状態にしておき(それぞれ10mlおよび0.5ml)、続いて一晩風乾させることによりコラーゲンコーティングした。
TrkAIg2.6神経突起伸長研究の前に、コラーゲンでコーティングしたフラスコ上で成長させたPC−12細胞をNGF(50ng/ml)で5日間準備刺激して(primed)、新鮮な培地およびNGFを24時間毎に添加した。
TrkA2.6−6His(20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)、100mM塩化ナトリウムおよび10%グリセロール中)をWO99/53055号および係属中の出願等PCT/GB02/04214号の方法を使用して調製し、Sigmaキットを用いて、標準的な手順を用いてビオチン化した。およそ250μg/mlのストック溶液を調製した。
PLA−PEG−ビオチンコーティングされたIwaki Non−Treated 24ウェルプレートは、2,2,2−トリフルオロエタノール(TFE)中に溶解した2mg/mlポリマー0.25mlを用いて、ウェルプレート上にドロップキャストして(dropcast)調製し、炉中で60℃にて1時間乾燥させた。次に、プレートをPBSで洗浄して、冷蔵庫で一晩保管した。ビオチン化したTrkAIg2.6のバッチそれぞれに関して、3枚の試験プレートを用意した。
アビジンをPLA−PEG−ビオチンコーティングされたプレートへ、蒸留水中の500μg/ml溶液0.5mlを用いて、37℃で45分間結合させた後、再びPBSでプレートを洗浄した。
次に、上述のように調製したビオチン化TrkA1mlを、蒸留水中0〜250μg/mlの濃度で37℃で1時間、プレートに添加した。続いて、プレートをPBSで洗浄した。次に、PBS中の0〜50ng/ml(=0〜1μl/ml)のNGF0.5mlを37℃で45分間添加した後、最終的なPBS洗浄を行った。これに続いて、蒸留水中の0.0025%コラーゲンIV型0.25mlで1時間、すべてのウェルをコーティングした後、洗浄した。対照ウェルは、PLA−PEG−ビオチンまたは0.01%コラーゲンの存在下でNGF培地を含有するが、TrkAIg2.6は含有しなかった。
細胞(継代18)をウェル1つ当たり2.0×104個の細胞/mlで播種した。24時間後に、培地を新たな供給(NGF0、0.1または1μlを含有する)と取り替えた。
細胞に、37℃/5%CO2に設定したインキュベータ中で48時間かけて、神経突起を結合および伸長させた後、培地を吸引して、いかなるゆるく接着した細胞も除去して、再び取り替えた。次に、Nikon Eclipse TS100顕微鏡およびDN100デジタルカメラを用いて、0.45倍Cマウントを用いて20倍の倍率で画像を撮った。突起長および細胞数を、Leica Qwin画像解析ソフトウェアを用いて測定した。
図3は、Trkおよび続いてNGF修飾した一連の表面上での培養後のPC12神経細胞系からの神経突起伸長を示す。データは、表面固定化されたNGFの量が増加するとともに、神経突起伸長が増加すること、および使用した範囲内に最適なTrk濃度が存在するようであることを示す。
この研究は、成長因子を表面に結合させるために受容体フラグメントを用いてNGFを提示させることにより、修飾PLA−PEG−ビオチン表面上で培養した細胞から神経突起伸長を誘導することができることを示している。細胞外マトリックス分子もまた、細胞表面結合を増強するために、表面で提示されることが好ましい。
このデータ内では、Trk濃度依存性効果が、それぞれ異なるNGF濃度で見られ、最適なTrk濃度が存在するようである。TrkAIg2.6に関して、これは、実験条件に応じて2.5〜250μg/mlであってもよく、およそ25μg/mlであってもよい。より高濃度での神経突起伸長の減少は、毒性効果、または固定化された受容体フラグメントと細胞自体との間のNGFに関する競合の増加に起因し得る。
実施例3−神経再生スカフォールド
図4は、本発明による組成物に適したスカフォールドがどのようにして生成され得るかを模式的に示す。スカフォールドは、リガンドのパターン化されたチャネルを含むように(A)、あるいはリガンドのパターン化された内層を有する管を含むように(B)成形され得る。図5は、本発明による組成物がどのようにして構築され(assembled)得るかを模式的に示す。簡潔に述べると、図4のポリマースカフォールドまたはマトリックス(ポリ乳酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体のようなポリエステル、またはこれらのポリエステルとPEGとのブロックコポリマー)を、ビオチン分子を用いてパターン化する(WO99/36107号に記載するように)。続いて、アビジンをスカフォールドに導入して、アビジンでパターン化された表面を生じる。次に、ビオチンで標識したTrkAIg2.6をスカフォールドに通して、ビオチン標識物は、アビジン分子上の非占有結合部位に結合し、したがって、Trkでパターン化された表面を生じる。最終的に、ニューロトロフィンを導入し、これらはTrkAIg2.6に結合し、したがって、ニューロトロフィンでパターン化された生分解性ポリマースカフォールドを生じる。
図4は、本発明による組成物に適したスカフォールドがどのようにして生成され得るかを模式的に示す。スカフォールドは、リガンドのパターン化されたチャネルを含むように(A)、あるいはリガンドのパターン化された内層を有する管を含むように(B)成形され得る。図5は、本発明による組成物がどのようにして構築され(assembled)得るかを模式的に示す。簡潔に述べると、図4のポリマースカフォールドまたはマトリックス(ポリ乳酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体のようなポリエステル、またはこれらのポリエステルとPEGとのブロックコポリマー)を、ビオチン分子を用いてパターン化する(WO99/36107号に記載するように)。続いて、アビジンをスカフォールドに導入して、アビジンでパターン化された表面を生じる。次に、ビオチンで標識したTrkAIg2.6をスカフォールドに通して、ビオチン標識物は、アビジン分子上の非占有結合部位に結合し、したがって、Trkでパターン化された表面を生じる。最終的に、ニューロトロフィンを導入し、これらはTrkAIg2.6に結合し、したがって、ニューロトロフィンでパターン化された生分解性ポリマースカフォールドを生じる。
図5に(およびさらに明確には図6に)示す例では、スカフォールドは、多数の管または導管(そのうちの1つを図示している)を含む構造を有する。神経細胞は、神経細胞が管/導管の管腔に沿って成長するように、調製した表面からニューロトロフィンを得て、管/導管の管腔に沿って成長することが可能である。図5では、ニューロトロフィンは、細胞の表面上で発現されるTrk分子を用いて、神経細胞により採取されることが分かる。本発明の組成物は、特に急性脊髄損傷、急性末梢損傷および慢性損傷後の神経再生に使用され得る。
実施例4−Trkの制御放出配合物
TrkAIg2.6の移植可能なポリマー(ポリ乳酸−グリコール酸共重合体)リザーバを、ニューロン修復スカフォールドに関して実施例3で記載するように調製したが、但し、ニューロトロフィンを添加する最終工程は除いた。リザーバを、神経障害性疼痛のin vivoモデルに移植した。Trkの持続性放出および得られる痛覚脱失を観察した。
TrkAIg2.6の移植可能なポリマー(ポリ乳酸−グリコール酸共重合体)リザーバを、ニューロン修復スカフォールドに関して実施例3で記載するように調製したが、但し、ニューロトロフィンを添加する最終工程は除いた。リザーバを、神経障害性疼痛のin vivoモデルに移植した。Trkの持続性放出および得られる痛覚脱失を観察した。
Claims (37)
- 制御されたニューロンの成長、再生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および前記スカフォールドの表面に、または該表面に隣接して位置する受容体チロシンキナーゼ(Trk)もしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物。
- 前記Trkが、TrkA、BまたはC、またはそれらのオルターナティブスプライシングされた形態、pan−Trk、Trkの機能的相同体、あるいは複数のタイプのTrkの組合せである、請求項1に記載の組成物。
- 前記Trkの前記フラグメントが、Ig様サブドメインを含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記フラグメントが、TrkAのIg様サブドメイン2を含む、請求項3に記載の組成物。
- 前記Ig様サブドメイン2が、アミノ酸VSFSPVの挿入を含む、請求項4に記載の組成物。
- 前記フラグメントが、図2に示される配列またはそれらの機能的相同体を含む、請求項5に記載の組成物。
- 前記Trkまたはフラグメントまたは相同体へ結合された1つまたはそれ以上のタイプのニューロトロフィンを含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ニューロトロフィンが、NGF、BDNF、NT3およびNT4から選択される、請求項7に記載の組成物。
- 前記スカフォールドの表面に、または該表面に隣接して位置する1つまたはそれ以上の細胞外マトリックス構成成分を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記細胞外マトリックス構成成分が、コラーゲンを含む、請求項9に記載の組成物。
- 前記細胞外マトリックス構成成分が、配列RGD、YIGSRおよび/またはIKVAVを含有するペプチドを含む、請求項9または10に記載の組成物。
- 前記スカフォールドの前記材料は、生分解性かつ生体適合性のポリマーである、前述の請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ポリマーが、ポリヒドロキシ酸、多糖、ポリ(アミノ酸)、ポリ(擬似アミノ酸)、およびこれらのポリマーの任意のモノマーから調製されるコポリマーから選択される、請求項12に記載の組成物。
- 前記ポリマーが、ポリ(アルキレングリコール)とのブロックコポリマーである、請求項13に記載の組成物。
- 前記ポリマーが、ポリエチレングリコールと、ポリ乳酸、ポリグリコール酸または乳酸−グリコール酸共重合体とのブロックコポリマーである、請求項14に記載の組成物。
- 前記Trkもしくはフラグメントまたは相同体が、1つまたはそれ以上の特異的分子相互作用によって、前記スカフォールドの前記表面に、または該表面に隣接して位置する、前述の請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つまたはそれ以上の特異的分子相互作用が、前記スカフォールドの表面に、または該表面に隣接して結合された1つまたはそれ以上のアンカー分子と前記Trkもしくはフラグメントまたは相同体に結合された1つまたはそれ以上のタグ分子との間で行われる、請求項16に記載の組成物。
- タグ分子がビオチンであり、アンカー分子がアビジンまたはストレプトアビジンであるか、あるいはそれらの逆である、請求項17に記載の組成物。
- 前記タグおよび前記アンカーの両方に同時に結合することが可能であるアダプター分子が使用された、請求項17に記載の組成物。
- 前記タグおよび前記アンカーの両方がビオチンであり、前記アダプターが、アビジンまたはストレプトアビジンである、請求項19に記載の組成物。
- 前記スカフォールドが、形状が管状である、前述の請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記Trkが、約2.5〜250μg/mlの濃度で存在する、前述の請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 生物学的組織もしくは細胞の制御された成長、再生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および前記スカフォールドの表面に、または該表面に隣接して位置する成長因子の受容体もしくは成長因子結合フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物。
- 前記成長因子が、ニューロトロフィンである、請求項23に記載の組成物。
- 前記Trkまたは他の成長因子受容体が、前記ニューロンもしくは他の生物学的組織または細胞の成長、再生または修復の方向の制御を提供するように、前記スカフォールドの表面に、または該表面に隣接して配置された、前述の請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 治療における使用のための前述の請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 神経成長、再生または修復を促進するための薬剤であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および前記スカフォールドの表面に、または該表面に隣接して位置する前記Trkもしくはフラグメントまたは相同体を含む薬剤の調製におけるTrkもしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体の使用。
- 神経成長、再生または修復を促進する方法であって、前記スカフォールドの表面上で、または該表面に隣接してTrk−ニューロトロフィン複合体を形成するように、請求項1ないし22のいずれか1項に記載の組成物をニューロトロフィンの供給源と接触させ、前記組成物を幹細胞、神経前駆細胞、ニューロン細胞または組織と接触させ、そして前記幹細胞、神経前駆細胞、ニューロン細胞または組織を、前記スカフォールドの表面上で、または該表面に隣接して成長、再生または修復させることを含む方法。
- 幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞または組織を移植する方法であって、ドナー幹細胞、神経前駆細胞、または神経細胞のサンプルを、適切なドナー培養物または被験体から採取し、前記スカフォールドの表面上で、または該表面に隣接してTrk−ニューロトロフィン複合体を有する請求項1ないし22のいずれか1項に記載の組成物と接触させて、前記ドナー細胞を成長、再生または修復させ、そしてかかるドナー細胞を必要とするレシピエント被験体に、前記ドナー細胞および組成物を配置することを含む方法。
- Trkもしくはフラグメントまたはそれらの相同体の制御された放出用の生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるリザーバ、および前記リザーバと密接に結合し、かつ/または前記リザーバの表面に、または該表面に隣接して位置するTrkもしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物。
- 治療における使用のための請求項30に記載の組成物。
- 上昇したニューロトロフィンレベルと関連した疾患の治療用の制御された放出薬剤であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるリザーバ、および前記リザーバと密接に結合され、かつ/または前記リザーバの表面に、または該表面に隣接して位置するTrkもしくはフラグメントまたは相同体を含む薬剤の調製におけるTrkもしくはニューロトロフィン結合フラグメントまたはそれらの相同体の使用。
- 治療されるべき前記疾患が、アルツハイマー病または疼痛障害である、請求項32に記載の使用。
- 前記疼痛障害が、突発性神経性尿意促迫、間質性膀胱炎、関節炎、帯状疱疹、末梢性炎症、慢性炎症、腫瘍学的状態またはヘルペス後神経痛と関連する、請求項33に記載の使用。
- 請求項28に記載の方法により得られるか、もしくは得られ得る幹細胞、神経前駆細胞、ニューロン細胞または組織。
- 生物学的組織もしくは細胞の制御された成長、再生または修復を促進するための生体適合性の生分解性組成物であって、生分解性かつ生体適合性の材料から形成されるスカフォールド、および前記スカフォールドの表面に、または該表面に隣接して位置する成長因子もしくは機能的フラグメントまたはそれらの相同体を含む組成物。
- 治療における使用のための請求項36に記載の組成物。
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