JP2006516096A - RAC経路のモディファイヤーとしてのCSNKsおよび使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年11月25日出願の米国特許仮出願第60/428,874号の優先権を主張するものである。先行出願の内容は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
細胞移行は正常な発達と生理的プロセス(例えば、被包、嚢胚形成、および創傷治癒)を構成する重要な部分であり、また腫瘍の進行と転移、血管形成、炎症及びアテローム性動脈硬化症においても重要である。細胞移行のプロセスには、シグナルに応じた細胞間及び細胞−基質間の相互作用、並びにアクチン及び微小管細胞骨格の再編成が伴う。Rho/Racファミリーの小GTPaseは様々な分子と相互作用し、細胞運動性、細胞間接着及び細胞−基質間接着を制御する。Cdc42及びRacは、細胞移行を開始させるのに必要な膜状仮足及び糸状仮足の形成に関係しており、Rhoは張力繊維及び局所接着の形成を制御している。Rho/Racタンパク質はカドヘリン/カテニン媒介性の細胞間接着、及びインテグリンの下流の機能の効果器であり、細胞接着及び運動性に重要な細胞骨格の変化を制御する成長因子である。
線虫のRho/Racファミリーには5つのメンバーが存在する。rho−1は、ヒトRhoA及びRhoCに最も近いタンパク質をコードし、cdc−42はヒトCdc42のオルソログをコードし、そしてced−10、mig−2、及びrac−2はRac関連タンパク質をコードする。ced−10、mig−2及びrac−2は、虫の細胞数及び軸索移行の制御において一部重複する機能を有し、これら遺伝子の2つ又は全てを不活性化することにより、単一の突然変異と比較して遊走欠陥が亢進される。さらに、ced−10とmig−2の二重突然変異は、いずれの単一突然変異にも見られない肉眼的な形態上の欠陥と運動欠陥を有し、これは形態形成段階における細胞遊走又は細胞移行の欠陥の二次的な影響と考えられる。これらの欠陥には、完全貫通刺胞非協調表現型、並びに不定貫通刺胞遅成長欠陥、産卵口欠陥、萎縮した尾部、及び無菌性欠陥が含まれ、これらのいずれもが各単一突然変異には見られない。
本発明者らは、線虫でRAC経路を改変させる遺伝子を発見し、ヒトにおけるそのオルソログを同定し、本明細書中では以降これをカゼインキナーゼ(CSNK)と呼ぶ。本発明は、これらのRACモディファイヤー遺伝子およびポリペプチドを利用して、RAC機能及び/又はCSNK機能の欠陥又は不全に関連する疾患の治療に使用できる候補治療剤であるCSNK調節剤を同定する方法を提供する。好ましいCSNK調節剤(modulating agent)は、CSNKポリペプチドに特異的に結合してRAC機能を修復する。他の好ましいCSNK調節剤は、アンチセンスオリゴマーやRNAiなど、たとえば対応する核酸(すなわちDNAまたはmRNA)に結合してそれを阻害することによってCSNK遺伝子発現または生成物の活性を抑制する核酸モジュレーターである。
線虫における細胞遊走にも影響するRacシグナル伝達経路のモディファイヤーを同定するために遺伝子スクリーニングが設計され、様々な特異的遺伝子をced−10とmig−2の二重突然変異背景においてRNA干渉(RNAi)により沈黙させた。線虫の遺伝子を沈黙させるためのRNAiの使用方法は、従来技術に既知である(Fire A等、1998 Nature 391:806-811; Fire, A. Trends Genet. 15, 358-363 (1999); WO9932619)。線虫において表現型の変化をもたらす遺伝子をRAC経路のモディファイヤーとして同定した。B0205.7遺伝子が、RAC経路のモディファイヤーとして同定された。したがって、これらモディファイヤーの脊椎動物のオルソログ、好ましくはヒトのオルソログであるCSNK遺伝子(すなわち核酸およびポリペプチド)は、癌などのRACシグナル伝達経路の欠陥に関連する病変の治療における魅力的な薬剤標的である。
本発明で使用することができるCSNK核酸及びポリペプチドに関連する配列は、核酸はGI#4503094(配列番号1)、15079695(配列番号2)、599777(配列番号3)、29477069(配列番号4)、及び33876936(配列番号5)、ポリペプチドはGI#4503095(配列番号9)として、Genbankに開示されている(Genbank識別(GI)番号により参照)。さらに、配列番号6ないし8の核酸も本発明に使用できる。
CSNK核酸およびポリペプチドは、CSNK機能を調節する薬剤の同定および試験、ならびにRAC経路におけるCSNKの関与に関連する他の用途に有用である。CSNK核酸ならびにその誘導体およびオルソログは、利用可能な任意の方法を使用して得ることができる。たとえば、DNAライブラリをスクリーニングすることによって、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用することによって、目的のcDNAまたはゲノムDNA配列を単離する技術が、当分野で周知である。一般的に、タンパク質の具体的な使用により、発現、生成、および精製方法の詳細が規定される。たとえば、スクリーニングして調節剤を探すために使用するタンパク質を生成するには、これらタンパク質の特異的生物活性を保存する方法が必要であるかもしれないが、抗体を産生するためのタンパク質を生成するには、特定のエピトープの構造的な完全性が必要であるかもしれない。スクリーニングまたは抗体を産生するために精製すべきタンパク質を発現させるには、特定のタグの付加が必要であるかもしれない(たとえば融合タンパク質の生成)。細胞周期制御や低酸素性応答の関与などCSNK機能を評価するのに使用するアッセイのためのCSNKタンパク質を過剰発現させるには、これらの細胞活動が可能な真核細胞系中での発現が必要であるかもしれない。タンパク質を発現、生成、および精製する方法は当分野で周知であり、したがって、任意の適切な手段を使用することができる(たとえば、Higgins SJおよびHames BD編、Protein Expression:A Practical Approach、Oxford University Press Inc.、ニューヨーク、1999年;Stanbury PF他、Principles of Fermentation Technology、第2版、Elsevier Science、ニューヨーク、1995年;Doonan S編、Protein Purification Protocols、Humana Press、ニュージャージー、1996年;Coligan JE他、Current Protocols in Protein Science編、1999年、John Wiley&Sons、ニューヨーク)。具体的な実施態様では、組換えCSNKは、欠陥RAC機能を有することで知られている細胞系で発現される。この組換え細胞は、以下にさらに記載する本発明の細胞に基づくスクリーニングアッセイ系で使用する。
候補RAC調節剤の活性を試験するため、または細胞死や細胞増殖などRAC経路のプロセスにおけるCSNKの役割をさらに評価するために、CSNKの発現が変化するように遺伝子が改変された動物モデルを、インビボアッセイで使用することができる。好ましくは、変化したCSNKの発現により、正常なCSNK発現を有する対照動物に比べて低減または上昇した細胞増殖、血管新生、または細胞死のレベルなど、検出可能な表現型がもたらされる。この遺伝子改変動物はさらに、RAC発現が変化していてもよい(たとえばRACノックアウト)。好ましい遺伝子改変動物は、特に、霊長類、げっ歯類(好ましくはマウス又はラット)などの哺乳動物である。好ましい哺乳動物でない種には、ゼブラフィッシュ、線虫(C.elegans)、およびショウジョウバエが含まれる。好ましい遺伝子改変動物は、染色体外エレメントとして存在する異種核酸をその細胞の一部分内に有するトランスジェニック動物、すなわちモザイク動物(たとえば、Jakobovits、1994年、Curr.Biol.、4:761〜763によって記載されている技術参照)、または異種核酸が生殖系列DNA内(すなわち細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列中)に安定に組み込まれているトランスジェニック動物である。異種核酸は、たとえば宿主動物の胚または胚性幹細胞を遺伝子操作することによって、このようなトランスジェニック動物の生殖系列内に導入される。
本発明は、CSNKの機能および/またはRAC経路と相互作用しおよび/またはこれを調節する作用剤を同定する方法を提供する。本方法により同定された調節剤もまた本発明の一部である。このような作用剤は、RAC経路に関連する様々な診断および治療用途、ならびにCSNKタンパク質およびRAC経路におけるその寄与のより詳しい分析に有用である。したがって、本発明はまた、CSNK相互作用剤または調節剤を投与することによってCSNK活性を特異的に調節する工程を含む、RAC経路を調節する方法も提供する。
小分子は多くの場合、酵素機能を有しおよび/またはタンパク質相互作用ドメインを含むタンパク質の機能を調節することが好ましい。当分野で「小分子」化合物と呼ばれる化学剤は通常、分子量が10,000以下、好ましくは5,000以下、より好ましくは1,000以下、最も好ましくは500ダルトン以下である有機非ペプチド分子である。このクラスのモジュレーターには、化学的に合成した分子、たとえばコンビナトリアル化学ライブラリからの化合物が含まれる。合成化合物は、既知または推定CSNKタンパク質の特性に基づいて合理的に設計または同定する、あるいは化合物ライブラリをスクリーニングすることによっても同定することができる。このクラスの代わりの適切なモジュレーターは、天然産物、特に、やはり化合物ライブラリをスクリーニングしてCSNK変調活性を探すことによって同定することができる、植物や真菌類など生物由来の二次代謝産物である。化合物を作製して得る方法は、当分野で周知である(Schreiber SL、Science、2000年、151:1964〜1969; Radmann JおよびGunther J、Science、2000、151:1947〜1948)。
特異的なCSNK相互作用タンパク質は、RAC経路および関連疾患に関連する様々な診断上および治療上の用途、ならびに他のCSNK調節剤の検証アッセイにおいて有用である。好ましい実施態様では、CSNK相互作用タンパク質は、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含めた正常なCSNK機能に影響を与える。別の実施態様では、CSNK相互作用タンパク質は、癌などRACに関連する疾患に関連性があるので、CSNKタンパク質の機能に関する情報を検出および提供するのに有用である(たとえば診断上の手段用)。
別の実施態様では、このタンパク質モジュレーターはCSNKに特異的な抗体アゴニストまたはアンタゴニストである。この抗体は治療上および診断上の用途を有しており、CSNKモジュレーターを同定するスクリーニングアッセイで使用することができる。また、様々な細胞応答ならびにCSNKの通常のプロセッシングおよび成熟を担当するCSNK経路の部分の分析においても、この抗体を使用することができる。
他の好ましいCSNK調節剤としては、一般的にCSNK活性を阻害するアンチセンスオリゴマーや二本鎖RNA(dsRNA)などの核酸分子が含まれる。好ましい核酸モジュレーターは、DNAの複製、転写、タンパク質翻訳部位へのCSNK RNAの転位、CSNK RNAからのタンパク質の翻訳、CSNK RNAをスプライシングして1つまたは複数のmRNA種を得ること、またはCSNK RNAに関与しまたはそれによって促進され得る触媒活性など、CSNK核酸の機能を妨げる。
本発明は、CSNK活性の特異的なモジュレーターを同定するアッセイ系およびスクリーニング方法を提供する。本明細書中で使用する「アッセイ系」とは、具体的な事象を検出および/または測定するアッセイを実施してその結果を分析するのに必要なすべての構成要素を包含する。一般的に、一次アッセイを使用して、CSNK核酸またはタンパク質に関するモジュレーターの特異的な生化学的効果または分子効果を同定または確認する。一般的に、二次アッセイでは、一次アッセイによって同定されたCSNK調節剤の活性がさらに評価され、この調節剤がRAC経路に関連する方式でCSNKに影響を与えることが確認されることもある。場合によっては、CSNKモジュレーターを直接二次アッセイで試験する。
一般的に、試験するモジュレーターの種類によって一次アッセイの種類が決まる。
小分子モジュレーターには、候補モジュレーターを同定するためにスクリーニングアッセイを使用する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、またこの標的タンパク質に関連する生化学的反応を再度引き起こさせるまたは保持する無細胞系を使用してもよい(Sittampalam GS他、Curr Opin Chem Biol、1997年、1:384〜91および付随の参考文献に総説がある)。本明細書中で使用する用語「細胞に基づく」とは、生細胞、死滅細胞、または膜分画、小胞体分画、ミトコンドリア分画など特定の細胞分画を使用したアッセイを言う。用語「無細胞」とは、実質的に精製されたタンパク質(内因性または組換えによって生成された)、部分的に精製したまたは粗細胞抽出物を使用したアッセイを包含する。スクリーニングアッセイでは、タンパク質−DNA相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用(たとえば受容体−リガンド結合)、転写活性(たとえばレポーター遺伝子)、酵素活性(たとえば基質の特徴を介するもの)、セカンドメッセンジャーの活性、免疫原性、および細胞形態や他の細胞性特徴の変化を含めた様々な分子事象を検出することができる。適切なスクリーニングアッセイでは、蛍光、放射活性、比色、分光光度、および電流滴定を含めた広範囲の検出方法を使用して、検出する具体的な分子事象の読出しを行うことができる。
抗体モジュレーターでは、適切な一次アッセイ試験は、CSNKタンパク質に対する抗体の親和性および特異性を試験する結合アッセイである。抗体の親和性および特異性を試験する方法は当分野で周知である(HarlowおよびLane、1988年、1999年、上掲)。CSNKに特異的な抗体を検出する好ましい方法は酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)である。他の方法には、FACSアッセイ、ラジオイムノアッセイ、および蛍光アッセイが含まれる。
核酸モジュレーターでは、一次アッセイにより核酸モジュレーターがCSNK遺伝子の発現、好ましくはmRNAの発現を阻害または増強する能力を試験し得る。一般的に、発現分析には、核酸モジュレーター存在下または非存在下の細胞の類似集団(たとえば、内因的にまたは組換えによってCSNKを発現する2種の細胞プール)中のCSNK発現を比較することが含まれる。mRNAおよびタンパク質の発現を分析する方法は当分野で周知である。たとえば、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、RNA分解酵素保護、定量的RT−PCR(たとえばTaqMan(登録商標)、PE Applied Biosystemsを使用)、またはマイクロアレイ分析を使用して、核酸モジュレーターで処置した細胞中でCSNK mRNAの発現が低減していることを確認することができる(たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125; Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147; Blohm DHおよびGuiseppi-Elie、A Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47)。タンパク質の発現をモニターすることもできる。タンパク質は、最も一般的にはCSNKタンパク質または特異的なペプチドのどちらかに対する特異的な抗体または抗血清を用いて検出される。ウエスタンブロッティング、ELISA、インサイツ検出を含めた様々な手段が利用可能である(Harlow EおよびLane D、1988年および1999年、上掲)。
調節剤がRAC経路に関連する様式でCSNKに影響を与えることを確認するために、二次アッセイを使用して上記の任意の方法によって同定したCSNK調節剤の活性をさらに評価することができる。本明細書中で使用するCSNK調節剤は、以前に同定した調節剤から誘導した候補臨床化合物または他の作用剤を包含する。また、二次アッセイを使用して、特定の遺伝的または生化学的経路における調節剤の活性を試験するために、あるいは調節剤がCSNKと相互作用する特異性を試験することもできる。
細胞に基づいたアッセイでは内因性RAC経路活性を検出するか、あるいはこれはRAC経路構成要素の組換えによる発現に依存し得る。前述の任意のアッセイをこの細胞に基づいた形式で使用することができる。候補モジュレーターは、通常は細胞培地に加えるが、細胞に注入するまたは任意の他の有効な手段によって送達してもよい。
候補CSNKモジュレーターを試験するために、正常または欠陥のあるRAC経路の様々な非ヒト動物のモデルを使用することができる。通常、欠陥RAC経路のモデルでは、RAC経路に関与する遺伝子がミスエクスプレスされる(たとえば過剰発現または発現が欠けている)ように操作された遺伝子改変動物を使用する。一般的に、アッセイには、経口投与、注入などによって候補モジュレーターを全身に送達する必要がある。
特異的なCSNK調節剤は、疾病または疾病予後が血管新生、細胞死、または増殖疾患などRAC経路の欠陥に関連している様々な診断および治療用途に有用である。したがって、本発明は、CSNK活性を特異的に調節する作用剤を細胞に投与する工程を含む、細胞、好ましくはRAC機能の欠陥又は不全(例えば、RACの過剰発現、過少発現、又は誤発現、或いは遺伝子突然変異による)を有することが事前に確定されている細胞におけるRAC経路を調節する方法も提供する。好ましくは、調節剤は細胞中に検出可能な表現型の変化を生じさせ、これにより、RAC機能が修復されたことが示される。本明細書で使用する「機能が修復された」という表現、及びそれと同等の表現は、所望の表現型が達成されたか、又は未処理の細胞と比較した場合に正常に近づいたことを意味する。例えば、RAC機能が修復されると、細胞増殖及び/又は細胞周期の進行が正常化するか、又は未処理の細胞と比較した場合に正常に近づく。本発明はまた、RAC経路を調節するCSNK調節剤の治療的有効量を投与することによる、RAC機能不全に関連する疾患又は疾病の治療方法を提供する。さらに本発明は、CSNK調節剤を投与することによる、細胞、好ましくはCSNK機能の欠陥又は不全を有することが事前に決定されている細胞において、CSNK機能を調節する方法を提供する。これらに加えて、本発明は、CSNK調節剤の治療的有効量を投与することによる、CSNK機能不全に関連する疾患又は疾病の治療法を提供する。
線虫における細胞遊走にも影響するRacシグナル伝達経路のモディファイヤーを同定するために遺伝子スクリーニングを設計した。このスクリーニングは、ced−10及びmig−2の単一突然変異の形態及び運動が野生型虫に類似している一方、二重突然変異が大きな形態欠陥及び運動欠陥を有するという観察結果に基づいている。一次スクリーニングにおいて、L4段階にある野生型、ced−10及びmig−2の虫においてRNA干渉(RNAi)により個々の遺伝子の機能を不活性化した。その後、RNAで処理した動物の子孫を、ced−10及びmig−2の二重突然変異の形態上の欠陥と運動欠陥に類似する同欠陥について検査した。ced−10又はmig−2突然変異背景の表現型を示すが野生型背景の表現型を示さない遺伝子全てを直接細胞遊走アッセイにおいて試験した。細胞遊走アッセイでは、これらの細胞に発現されたGFPマーカーを用いて、AVM及びALMとして知られる機械感覚性のニューロンを、動物中のそれらの最終位置について採点した。この遊走アッセイは、野生型、及びced−10又はmig−2突然変異背景の両方で行った。AVM及びALM細胞は、第一幼生段階において通常その最終位置へ移動及び到達するので、位置の採点は後の幼生段階又は成虫段階で行った。野生型背景又はrac突然変異背景において不活性化したとき、これらニューロンの移動不足又は移動方向の間違いを起こす遺伝子を、細胞遊走に関連する疾病の治療に関連する可能性があるとした。B0205.7をエンハンサーとして同定した。B0205.7のオルソログを本明細書ではCSNKと呼ぶ。
BLAST分析(Altschul他、上掲)を行ってモディファイヤーのオルソログを同定した。 例えば、CSNK由来の代表的配列であるGI#4503095(配列番号9)は、線虫B0205.7と79%のアミノ酸同一性を有していた。
蛍光標識したCSNKペプチド/基質を、試験緩衝液(10mMのHEPES、10mMのNaCl、6mMの塩化マグネシウム、pH7.6)中の試験剤と共に96ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。Fluorolite FPM−2 Fluorescence Polarization Microtiter System(Dynatech Laboratories,Inc)を用いて決定した蛍光偏光の対照値に対する変化により、試験化合物がCSNK活性の候補モディファイヤーであることが示される。
33P標識のCSNKペプチドを、試験剤と共にアッセイ緩衝液(100mMのKCl、20mMのHEPES pH7.6、1mMのMgCl2、1%のグリセロール、0.5%のNP−40、50mMのβ−メルカプトエタノール、1mg/mlのBSA、プロテアーゼ阻害剤の反応混液)中で、Neutralite−アビジンでコーティングしたアッセイプレートのウェルに加え、25℃で1時間インキュベートした。その後、ビオチン標識した基質を各ウェルに加え、1時間インキュベートした。PBSで洗浄することによって反応を停止させ、シンチレーション計数器で計数した。試験剤を用いない対照に比べて活性に変化を引き起こさせる試験剤が、候補RAC調節剤として同定された。
形質移入させたタンパク質の共沈では、CSNKタンパク質を含む3×106個の適切な組換え細胞を10cmのディッシュに植え付け、発現用コンストラクトを用いて次の日に形質移入させた。空ベクターを加えることによって、それぞれの形質移入での総DNA量を一定に保った。24時間後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄し、50mMのHepes、pH7.9、250mMのNaCl、20mMのグリセロホスフェート、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム、5mMのp−ニトロフェニルリン酸、2mMのジチオスレイトール、プロテアーゼ阻害剤(complete、Roche Molecular Biochemicals)、および1%のノニデットP−40を含む溶解緩衝液1ml中、氷上で20分間溶解させた。15,000×g、15分間の遠心分離2回によって、細胞細片を取り除いた。細胞溶解物を25μlのM2ビーズ(Sigma)と共に2時間、4℃で緩やかに揺り動かしながらインキュベートした。
精製したか、部分的に精製したCSNKを、適切な反応緩衝液(例えば、塩化マグネシウムまたは塩化マンガン(1−20mM)、およびミエリン塩基性タンパク質またはカゼインなどのペプチドまたはポリペプチド基質(1−10μg/ml)を含むpH7.5のHepes50mM)に希釈する。キナーゼの最終的な濃度は1−20nMである。酵素反応をマイクロタイタープレートで行い、アッセイのスループットを増大させることにより反応条件の最適化を促進する。96ウェルのマイクロタイタープレートを用い、最終容量を30−100μlとする。33PガンマATP(0.5μCi/ml)を加えて反応を開始させ、0.5から3時間室温でインキュベートする。EDTA付加によりネガティブコントロールを行い、それにより酵素活性に必要な二価カチオン(Mg2+またはMn2+)をキレート化する。インキュベーション後、EDTAを使用して酵素反応を消光させる。反応物の試料を96ウェルのガラフファイバーフィルタリングプレート(MultiScreen,Millipore)に移す。続いてフィルタをリン酸緩衝整理食塩水、希釈したリン酸(0.5%)、またはその他適切な媒体で洗浄し、過剰なラジオ標識ATPを除去する。シンチレーションカクテルをフィルタリングプレートに添加し、シンチレーションカウンティングにより取り込まれた放射能を定量化する(Wallac/Perkin Elmer)。活性は、ネガティブコントロール反応値(EDTAクエンチ)の差引き後に検出される放射能の量と定義する。
以下の実験で使用したすべての細胞系はNCI(米国立癌センター)の系であり、ATCC(アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナサス、20110〜2209)から入手可能である。正常組織および腫瘍組織は、Impath、UC Davis、Clontech、Stratagene、Ardais、Genome CollaborativeおよびAmbionから得た。
表1
Claims (25)
- (a)CSNKポリペプチドまたは核酸を含むアッセイ系を提供する工程と、
(b)試験剤が存在しない場合に系により対照活性がもたらされる条件下で、アッセイ系を試験剤と接触させる工程と、
(c)試験剤の影響を受けたアッセイ系の活性を検出し、試験剤の影響を受けた活性と対照活性との差により試験剤を候補RAC経路調節剤として同定する工程と
を含む、候補RAC経路調節剤を同定する方法。 - アッセイ系がCSNKポリペプチドを発現する培養細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 培養細胞がさらに欠陥RAC機能を有する、請求項2に記載の方法。
- アッセイ系がCSNKポリペプチドを含むスクリーニングアッセイを含み、候補試験剤が小分子モジュレーターである、請求項1に記載の方法。
- アッセイがキナーゼアッセイである、請求項4に記載の方法。
- アッセイ系が、アポトーシスアッセイ系、細胞増殖アッセイ系、血管形成アッセイ系、および低酸素誘発アッセイ系からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- アッセイ系がCSNKポリペプチドを含む結合アッセイを含み、候補試験剤が抗体である、請求項1に記載の方法。
- アッセイ系がCSNK核酸を含む発現アッセイを含み、候補試験剤が核酸モジュレーターである、請求項1に記載の方法。
- 核酸モジュレーターがアンチセンスオリゴマーである、請求項8に記載の方法。
- 核酸モジュレーターがPMOである、請求項8に記載の方法。
- (d)(c)で同定された候補RAC経路調節剤を、RAC機能に欠陥がある細胞を含むモデル系に投与し、RAC機能が修復されたことを示すモデル系における表現型の変化を検出する工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - モデル系が欠陥RAC機能を有するマウスモデルである、請求項11に記載の方法。
- RAC機能に欠陥がある細胞を、CSNKポリペプチドと特異的に結合する候補モジュレーターと接触させることを含み、それによりRAC機能が修復される、細胞のRAC経路を調節する方法。
- RAC機能の欠陥に起因する疾病または疾患を有することが事前に確定されている脊椎動物に候補モジュレーターを投与する、請求項13に記載の方法。
- 候補モジュレーターが抗体および小分子からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- (e)CSNKを発現している非ヒト動物または培養細胞を含む二次アッセイ系を提供する工程と、
(f)二次アッセイ系を(b)の試験剤またはそれから誘導した作用剤と、試験剤またはそれから誘導した作用剤が存在しない場合に二次アッセイ系により対照活性がもたらされる条件下で接触させる工程と、
(g)作用剤の影響を受けた二次アッセイ系の活性を検出する工程
をさらに含み、作用剤の影響を受けた二次アッセイ系の活性と対照活性との差により試験剤またはそれから誘導した作用剤が候補RAC経路調節剤であることが同定され、
ここで第2アッセイが作用剤の影響を受けたRAC経路における変化を検出する、請求項1に記載の方法。 - 二次アッセイ系が培養細胞を含む、請求項16に記載の方法。
- 二次アッセイ系が非ヒト動物を含む、請求項16に記載の方法。
- 非ヒト動物がRAC経路の遺伝子をミスエクスプレスする、請求項18に記載の方法。
- 哺乳動物の細胞をCSNKポリペプチドまたは核酸と特異的に結合する作用剤と接触させることを含む、哺乳動物細胞内のRAC経路を調節する方法。
- RAC経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に作用剤を投与する、請求項20に記載の方法。
- 作用剤が小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体である、請求項20に記載の方法。
- (a)患者から生体試料を得る、
(b)試料をCSNK発現用のプローブと接触させる、
(c)工程(b)からの結果を対照と比較する、および
(d)工程(c)が疾病の可能性を示しているかどうかを決定する
ことを含む、患者の疾病を診断する方法。 - 前記疾病が癌である、請求項23に記載の方法。
- 前記癌が、表1に示すように25%より高い発現レベルである癌である、請求項24に記載の方法。
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